SK8042002A3 - Sugarbeet regeneration and transformation - Google Patents
Sugarbeet regeneration and transformation Download PDFInfo
- Publication number
- SK8042002A3 SK8042002A3 SK804-2002A SK8042002A SK8042002A3 SK 8042002 A3 SK8042002 A3 SK 8042002A3 SK 8042002 A SK8042002 A SK 8042002A SK 8042002 A3 SK8042002 A3 SK 8042002A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- leaf
- region
- sugar beet
- agrobacteria
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 title claims abstract description 62
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 title claims abstract description 48
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title description 43
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 31
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 28
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 10
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 4
- IRYMDURTWYFRBH-UHFFFAOYSA-N 2-(7h-purin-2-ylmethyl)aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1CC1=NC=C(NC=N2)C2=N1 IRYMDURTWYFRBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 claims description 2
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 60
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 16
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 4
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 4
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N (3ar,7as)-2-(trichloromethylsulfanyl)-3a,4,7,7a-tetrahydroisoindole-1,3-dione Chemical compound C1C=CC[C@H]2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)[C@H]21 LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N 0.000 description 3
- 239000005745 Captan Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 229940117949 captan Drugs 0.000 description 3
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000959521 Passion fruit mosaic virus Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 1
- IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC(S(N)(=O)=O)=C(C)C=C1N IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710166809 ADP-glucose phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N Fenclonine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701484 Figwort mosaic virus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 240000009200 Macaranga tanarius Species 0.000 description 1
- 235000000487 Macaranga tanarius Nutrition 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019577 caloric intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N chlorsulfuron Chemical compound COC1=NC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)Cl)=N1 VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- -1 microelements Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 101150072645 pea gene Proteins 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Spôsob prípravy transgénových buniek cukrovej repy
Oblasť techniky
Vynález sa týka prípravy geneticky transformovaných rastlín cukrovej repy. Opisujú sa najmä spôsoby a materiály na transformáciu rastlín cukrovej repy pomocou Agrobacterium tumefaciens sprostredkujúcej prenos génov.
Doterajší stav techniky
Sacharóza, všeobecne známa ako cukor, tvorí vo svetovom meradle asi 11 % kalorického príjmu ľudí. Cukrová repa (Beta vulgaris) je jedným z dvoch hlavných poľnohospodárskych zdrojov jedlého cukru. Približne 40 % svetového zásobovania cukrom sa získava z cukrovej repy, z cukrovej trstiny ako ďalším hlavným poľnohospodárskym zdrojom cukru, tvoriaceho takmer 60 %. Štáty v Európe a bývalom Sovietskom zväze produkujú takmer všetok svoj cukor z rastlín cukrovej repy. V Spojených štátoch približne 30 % spotrebovaného cukru sa získava,z cukrovej repy.
Rastliny cukrovej repy podliehajú radu patogénov a škodcov. Poškodenie vírusmi, plesňami, baktériami a hmyzom môže značne znížiť výťažok a kvalitu pozberaného cukru. Zvýšenie odolnosti k týmto faktorom pomocou klasických metód kríženia bolo pomalé. Transformácia rastlín cukrovej repy modernými technikami molekulárnej biológie je atraktívna, avšak cukrová repa sa donedávna ukazovala ako veľmi odolná voči transformácii.
Lindsey a Jones (Plánt Celí Rep. 8: 71-74, 1989) opisujú transformáciu protoplastov cukrovej repy elektroporáciou.
Catlin (Plánt Celí Rep. 9: 285-288, 1990) oznamujú účinok antibiotík na inhibíciu indukcie kalu a regeneráciu rastlín zkotyledónov cukrovej repy. Zistilo sa, že vznik kalu závisí na genotype. Zistilo sa, že antibiotiká inhibujú tvorbu výhonkov. Catlin navrhuje, že
I regenerácia cez kotyledónové výpestky, kombinovaná s antibiotickým skreeningovými protokolmi, by mohla byť užitočná pri selekcii transformovaného kalu cukrovej repy.
Jacq a kol. (Plánt Celí Rep. 12: 621-624, 1993) opisujú účinky genotypu, acetosyringónu, trvanie predkultúry a spoločnej kultúry na transformáciu cukrovej repy sprostredkovanou Agrobacteriom. Hypokotylové a kotyledónové explantáty sa vykrojili zo sadeníc a pestovali sa s Agrobacteriou. Transformáty sa kvantifikovali histochemickými a fluorometrickými GUS testami. Transformované rastliny sa nedemonštrovali.
-2Hall akoi. (WO 95/10178) opisujú spôsob transformácie protoplastov cukrovej repy postupom s polyetylénglykolom nasledovaným selekciou a regeneráciou. Transformačné frekvencie boli medzi 2,5 x 10'5 a 6,1 x ÍO-4
Lindsey aGallois (J.Exp.Botany, 41: 529-536, 1990) opisujú transformáciu cukrovej repy Agrobacteriom tumefaciens obsahujúcim binárny vektor. Rezy tkaniva zo základov výhonkov sa očkovali ponorením suspenzie baktérií 'v kvapaline, indukovali sa s 6aminobenzylpurínom, aby vznikli výhonky a selektovali sa podľa antibiotickej rezistencie. Výhonky sa preniesli na médium indukujúce korene obsahujúce 1-naftalenooctovú kyselinu a kanamycín. Pri regenerácii výhonkov z tkaniva listov sa dosiahol malý, alebo žiadny úspech.
Halí akol. (Náture Biotechnol. 14: 1133-1138, 1996) opisujú spôsob generácie transgénových rastlín cukrovej repy z protoplastov ochranných buniek prieduchom. Transformácia DNA polyetylénglykolom sa urobila na protoplastoch odvodených z ochranných buniek prieduchov. Selekcia transformantov sa dosiahla podľa odolnosti k bialapozu. Stabilná transformačná účinnosť protoplastov bola medzi 1,2 a 5,2 x ΚΓ*. Protoplasty sa regenerovali do kalov a rastlín.
Hayakawa akol. (Proc. Jap. Sugar Beet Technol. 36: 130-135, 1994) opisujú spôsob transformácie cukrovej repy sprostredkovaný Agrobacteriom. Semená sa nechali vyklíčiť a odstránili sa kotyledóny. Kotyledóny rástli, pokiaľ sa neobjavili listy. Kúsky listov sa narezali a preniesli sa na médium, aby sa umožnila tvorba výhonkov. Výhonky sa použili na tvorbu explantátov, ktoré sa nasledovne transformovali s Agrobacteriom. Transformované explantáty sa nechali, aby vytvorili výhonky a následne sa zakorenili na vhodných médiách.
Fry a kol. (Poster, Gordon Research Conference on Plánt Celí and Tissue Culture, 11.16.06.1989) opisujú transformáciu a regeneráciu kotyledónových explantátov cukrovej repy očkovaných Agrobacteriom tumefaciens so zakotvenými exogénnymi sekvenciami nukleovej kyseliny.
Napriek radu spôsobov dostupných pre transformáciu cukrovej repy, existuje potreba spôsobu, ktorý je účinnejší, dáva stály zdroj rastlinného materiálu pre následné pokusy a zabezpečuje alternatívu k existujúcim spôsobom. Tento vynález používa explantáty listov pri spôsobe transformácie sprostredkovanej. Agrobacteriom, ktorý umožňuje, aby sa zvyšný rastlinný materiál propagoval in vitro pre ďalšie transformačné pokusy. Tento vynález zabezpečuje zlepšené spôsoby pre produkciu transgénových rastlín cukrovej repy, aby získala požadované vlastnosti genetickým inžinierstvom.
-3Podstata vynálezu
Pri úsilí vyvinúť metódy pre účinnú transformáciu rastlín cukrovej repy sa objavil rad vynálezeckých krokov, ktoré sú veľmi prospešné na zlepšenie výsledkov a na experimentálnu jednoduchosť.
V jednom aspekte tohto vynálezu sa zistilo, že explantáty listov sú prospešné pre následnú transformáciu a také explantáty sa ľahko pripravili z listov mikropropagovaných výhonkov. Mikropropagované kultúry umožňujú vedcovi udržiavať kontinuálnu kultúru, čo významne znižuje čas na prípravu transgénových rastlín cukrovej repy. Pretože sa mikropropagované kultúry ľahko udržiavajú, vedec nemusí klíčiť semená zakaždým, keď chce začať transformačnú procedúru. Mikropropagácia je okrem toho prospešná na zníženie alebo odstránenie nežiaducich chimémych tkanív.
Znaky a podrobnosti vynálezu budú zrejmejšie vo svetle nasledujúceho podrobného opisu vynálezu.
Tento vynález opisuje spôsob pre účinnú transformáciu rastlín cukrovej repy pomocou baktérií Agrobacterium tumefaciens ako prípravku dodávajúceho exogénnu sekvenciu nukleovej kyseliny. Exogénna sekvencia nukleovej kyseliny je výhodne vo forme vektora transformujúceho rastlinu. V tomto vynáleze možno použiť akýkoľvek vektor vhodný na transformáciu rastlín. Vhodný plazmid alebo vektor transformujúci rastliny typicky obsahuje marker, ktorý možno vybrať alebo skreenovať a spojené regulačné prvky, ako sa opisuje, spolu s jednou, či viac nukleovými kyselinami schopnými expresie v rastline spôsobom dostatočným, aby dodal zvláštny žiaduci rys alebo fenotyp rastline. Príklady vhodných * štruktúrnych génov predvídaných týmto vynálezom by zahŕňali, avšak neobmedzujú sa na nich, gény tolerancie voči hmyzu alebo škodcom (baktérie, huby, nematocídy), toleranciu voči herbicídom, gény na zlepšenie kvality, ako výťažky nutričných zlepšení, toleranciu voči okoliu alebo stresu, alebo akékoľvek žiaduce zmeny fyziológie rastlín, rastu, vývoja, morfológia, alebo rastlinných produktov.
Alternatívne, kódujúce sekvencie DNA môžu ovplyvniť tieto fenotypy kódovaním nepreložiteľnej RNA molekuly, ktorá spôsobuje cielenú inhibíciu, expresiu endogénového génu, napríklad cez mechanizmy sprostredkované protismerne alebo kosupresne (pozri napríklad Bird a kol. Gen. Engin. Re. 9: 207, 1991), RNA by tiež mohla byť katalytickou RNA molekulou (napríklad ribozým) pripravenou, aby štiepila žiadaný endogénový mRNA produkt (pozri napríklad Gibson a Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125, 1997). Teda akýkoľvek gén, ktorý produkuje proteín alebo mRNA ktorý exprimuje požadovanú zmenu fenotypu alebo morfológie, je užitočný pre prax tohto vynálezu.
-4Priklady nukleových kyselín, ktoré možno zaviesť metódami zamýšľanými týmto vynálezom, zahŕňajú napríklad sekvencie DNA alebo gény z iných druhov, alebo gény, alebo sekvencie, ktoré pochádzajú, alebo sú prítomné v rovnakom druhu, ale vkladajú sa do prijímajúcich buniek postupmi genetického inžinierstva skôr, než klasickými technikami reprodukcie, alebo šľachtenia. Avšak výrazom exogénny sa tiež myslí, aby sa týkal génov, ktoré nie sú normálne prítomné v bunke, ktorá sa transformuje; alebo asi proste nie sú prítomné vo forme, štruktúre, atď., ako sa nachádzajú v DNA segmente alebo géne, ktorý sa transformuje; alebo gény, ktoré sú normálne prítomné, ale ktoré si niekto praje, aby sa napríklad nadmerne exprimovali. Teda výraz „exogénny“ gén alebo DNA má znamenať každý gén alebo DNA segment, ktorý je zavedený do prijímajúcej bunky bez ohľadu na to, či podobný gén môže byť už prítomný v takej bunke. Typ DNA zahrnutý v exogénnej DNA môže zahŕňať DNA, ktorá je už prítomná v bunke rastliny, DNA z inej rastliny, DNA z iného organizmu alebo DNA generovanú externe, ako je sekvencia DNA obsahujúca protizmyselnú správu o géne alebo sekvencií DNA kódujúcu syntetickú alebo modifikovanú verziu génu.
Transformujúce vektory rastlín všeobecne obsahujú jednu, či viac žiadaných kódujúcich sekvencií nukleových kyselín pod transkripčnou kontrolou 5' a 3' regulačných sekvencií. Také vektory všeobecne obsahujú, operatívne spojené v sekvencií v smere 5' k 3', sekvenciu promótora, ktorá usmerňuje transkripciu po smere štruktúrnej sekvencie nukleových kyselín v rastline, prípadne 5' nepreloženú vedúcu sekvenciu, sekvenciu nukleových kyselín, ktorá kóduje daný proteín a 3' nepreloženú oblasť, ktorá kóduje polyadenylačný signál, ktorý pôsobí v rastlinných bunkách, aby ukončil. transkripciu a pridanie polaydenylačných nukleotídov k 3' koncu nRNA kódujúci proteín. Promótor môže byť homológny alebo heterológny k štruktúrnej sekvencií nukleových kyselín. Typické 5' a 3' regulačné sekvencie zahŕňajú začiatočné miesto iniciácie transkripcie, miesto na viazanie ribozómov, signál spracovávajúci RNA, miesto terminácie transkripcie alebo polyadenylačný signál.
Transformujúce vektory rastliny tiež všeobecne obsahujú markér, ktorý možno vybrať alebo skreenovať. Expresia sekvencie markéra, ktorý možno vybrať alebo skreenovať, vedie k fenotypu, ktorý umožňuje diferenciáciu transgénových a netransgénových tkanív cukrovej repy.
Akýkoľvek markér, ktorý možno vybrať, vhodný pre transformáciu rastlín, sa môže použiť v tomto vynáleze. Príklady markérov, ktoré možno vybrať, o ktorých sa uvádza, že v rastlinách fungujú, zahŕňajú EPSPS (Klee akol., Mol. Gen. Genet. 210(3): 437, 1987), neomycinfosfotransferázu (Loopstra akol, Plánt Mol. Biol. 15(1): 1, 1990),
- 5 hydromycínfosfotransferázu (Meijer a kol., Plánt Mol. Biol. 16(5): 807, 1991), odolnosť voči metotrexátu (Irdani a kol., Plánt Mol. Biol. (37(6): 1079, 1998, fosfinotricínacetyltransferázu (Shen a kol., J. Gen. Virol. 76: 965, 1995) a odolnosť voči chlórsulfuronu (Lee a kol., Plánt Celí 2(5): 415, 1990). Markery, ktoré možno skreenovať, a o ktorých sa uvádza, že v rastlinách fungujú, zahŕňa GFP (Niwa a kol., Plánt J. 18(4): 455, 1999), GUS (Suzuki a kol.. Plánt Celí. Physiol. 40(3)3: 289, 1999), CAT (Leisy a kol., Plánt Mol. Biol. 14(1): 41, 1990) aluciferázu (Macknight a kol., Plánt Mol. Biol. 27(3): 457, 1995). V niektorých prípadoch kódujúca štruktúrna sekvencia nukleových kyselín tiež pôsobí ako sekvencia markéra, ktorý možno vybrať alebo skreenovať.
Vo svetle tohto opisu budú odborníkom zrejmé mnohé iné možné gény markéra, ktorý možno vybrať alebo skreenovať, regulačné · prvky inej požadovanej sekvencie. Predchádzajúca diskusia sa teda myslí ako príkladná a nie vyčerpávajúca.
Jedno uskutočnenie vynálezu sa zameriava na spôsob prípravy transgénových buniek cukrovej repy. Spôsob zahŕňa: výber sadenice cukrovej repy, pričom sadenica obsahuje kotyledónovú oblasť a hypokotylovú oblasť; odstránenie kotyledónovej oblasti a hornej polovice hypokotylovej oblasti zo sadenice; styk kotyledónovej oblasti a hornej polovice hypokotylovej oblasti s mikropropagačným médiom, aby vznikol mikropropagovaný výhonok; pričom mikropropagovaný výhonok obsahuje aspoň jeden list alebo jeho časť, vrátane listovej báze, alebo viac listov; odstránenie listu z mikropropagovaného výhonku oddelením listu pri listovej báze a styk explantátu listu v oblasti listovej báze s Agrobacteria. List sa môže oddeliť pri listovej báze pred očkovaním Agrobacteriom radom metód, avšak výhodne sa list odreže pri listovej báze použitím vhodného nástroja, ako je skalpel, a rezná plocha listu sa uvedie do styku s kultúrou Agrobacterium. Explantát sa pestuje spolu s Agrobacteria, kde Agrobacteria obsahujú vektor, pričom vektor obsahuje operatívne spojený s orientáciou 5' k 3' : promótor, ktorý riadi transkripciu štruktúrnej sekvencie nukleových kyslin v rastline; štruktúrnu sekvenciu nukleových kyselín a 3' transkripčný terminátor a po inkubácii s Agrobacteriom obsahuje infikovaný explantát listu transgénovú bunku cukrovej repy.
Explantát listu obsahuje tu opísanú listovú bázu ako dolnú časť listu, kde sa list stýka so základnou oblasťou explantátu (pozri Obr. 5 a 6 na ilustráciu mikropropagovanej kultúry cukrovej repy). V tomto vynáleze možno použiť akýkoľvek list obsahujúci listovú bázu. Celý list, alebo akákoľvek jeho časť obsahujúca listovú bázu, sa môže použiť. List sa výhodne odreže pri listovej báze a celý list obsahujúci základňu list sa použije na transformačný proces. Listová báza obsahuje spodnú časť listov, kde sú listy pripojené
-6k mikropropagovanému výhonku. Explantät listu teda obsahuje akýkoľvek list alebo časť listu, ktorá obsahuje listovú bázu. Explantát listu podľa toho môže obsahovať, avšak neobmedzuje sa tým, dolných 10 % listu, dolných 20 %, 50 % alebo celý list, či jeho časti, všetky obsahujúce listovú bázu. Mikropropagovaná kultúra cukrovej repy obsahuje mnohé vrstvy listov, ktoré sú pripojené pri listovej báze. Podľa toho možno použiť list v ktorejkoľvek vrstve, vrátane ktoréhokoľvek vnútorného alebo vonkajšieho listu obsahujúceho listovú bázu (pozri Obr. 5 a 6). Výhodne sa vyberajú vonkajšie listy, takže vnútorná vrstva zostáva nedotknutá. Zvyšné listy sa môžu mikropropagovať alebo skladovať a pestovať in vitro. Zvyšné listy a novo vzniknuté listy sa môžu neskôr použiť ako zdroj explantátov pre budúce pokusy.
Agrobacteriou môže byť všeobecne ktorákoľvek Agrobacteria a výhodne je to Agrobacterium tumefaciens. Výhodné kmene zahŕňajú, avšak neobmedzujú sa na nich, Agrobacterium tumefaciens kmeň C58, kmeň nopalínového typu, ktorý sa používa na sprostredkovanie prenosu DNA do bunky rastliny, kmeň oktopínového typu, ako je LBA4404 alebo kmene sukcínamopínového typu, napríklad EHA101, či EHA105. Použitie týchto kmeňov na transformáciu rastlín sa uvádzalo a metódy sú odborníkom známe. Štruktúrna sekvencia nukleových kyselín môže byť transkribovateľná sekvencia, ktorá dodáva rastline žiadané vlastnosti. Výhodne štruktúrna sekvencia nukleových kyselín kóduje proteín alebo antimediátorovú RNA sekvenciu.
Alternatívne uskutočnenie sa zameriava na spôsoby prípravy transgénových buniek cukrovej repy z mikropropagovanej kultúry. Mikropropagovaná kultúra sa pestuje, aby tvorila mikropropagovaný výhonok, pričom mikropropagovaný výhonok obsahuje aspoň jeden explantát listu, vrátane listovej báze, odstránenie listu pri listovej báze z mikropropagovaného výhonku a styk explantátu listu v oblasti listovej báze s Agrobacteria, kde Agrobacteria obsahuje vektor, ktorý obsahuje operatívne spojený v orientácii 5' k 3' : promótor, ktorý riadi transkripciu štruktúrnej sekvencie nukleových kyselín; štruktúrnu sekvenciu nukleových kyselín a 3' transkripčný terminátor. Po inkubácii s Agrobacteriom infikovaný explantát listu obsahuje transgénovú bunku cukrovej repy. Agrobacteriou môže byť všeobecne ktorákoľvek Agrobacteria a výhodne je to Agrobacterium tumefaciens. Štruktúrna sekvencia nukleových kvslín môže bvť ktorákoľvek transkribovateľná sekvencia. ktorá dodáva rastline žiadané vlastnosti. Výhodne štruktúrna sekvencia nukleových kyselín kóduje proteín alebo antimediátorovú RNA sekvenciu.
Vynález sa tiež zameriava na spôsoby prípravy transgénových rastlín cukrovej repy. Spôsoby výhodne zahŕňajú výber sadeníc cukrovej repy, pričom sadenice obsahujú
-Ί kotyledónovú oblasť a hypokotylovú oblasť; odstránenie kotyledónovej oblasti a hornej polovice hypokotylovej oblasti zo sadeníc; styk kotyledónovej oblasti a hornej polovice hypokotylovej oblasti s mikropropagačným médiom, aby vznikol mikropropagovaný výhonok, pričom mikropropagovaný výhonok obsahuje aspoň jeden list obsahujúci listovú bázu, odstránenie listu z mikropropagovaného výhonku pri listovej báze a styk listu v oblasti listovej báze s Agrobacteria, aby sa vytvoril infikovaný list, kde Agrobacterie obsahujú vektor, ktorý obsahuje operatívne spojený v orientácii 5' k 3': promótor, ktorý riadi transkripciu štruktúrnej sekvencie nukleových kyslín; štruktúrnu sekvenciu nukleových kyselín a 3' transkripčný terminátor; kultiváciu infikovaného explantátu listu, aby sa vytvoril transgénový výhonok; kultiváciu transgénového výhonku, aby sa vytvoril transgénový zakorenený výhonok a rast transgénového zakoreneného výhonu, aby sa vytvorila transgénová rastlina cukrovej repy. Agrobacteriami môžu byť všeobecne ktorékoľvek Agrobacterie a výhodne je to Agrobacterium tumefaciens. Štruktúrna sekvencia nukleových kyselín môže byť ktorákoľvek transkribovateľná sekvencia. ktorá dodáva rastline žiadané vlastnosti. Výhodne štruktúrna sekvencia nukleových kyselín kóduje proteín alebo antimédiatorovú RNA sekvenciu. Semená cukrovej repy sa môžu sterilizovať akoukoľvek prijateľnou metódou a výhodne stykom semena cukrovej repy s hydroxidom sodným, chlórnanom sodným, etanolom alebo kaptánom. Semená cukrovej repy výhodne klíčia v temne alebo pri slabom svetle. Mikropropagačným médiom môže byť všeobecne ktorékoľvek mikropropagačné médium, ktoré je v obore prijateľné. Príklady vhodných médií by zahŕňali, ale neobmedzujú sa na ne, média založené na MS (Murashige a Skoog Physiol. Plánt. 15:473, 1962), alebo média založené na N6 (Chu a kol., Scientia Sinica, 18:659, 1975) doplnené aditivami média, ktoré môžu zahŕňať, ale neobmedzujú sa na nich, aminokyseliny, makroelementy, železo, mikroelementy, vitamíny a organické látky, uhľovodíky, nedefinované zložky média, ako sú hydrolyzáty kazeínu, vhodný želatínujúci prípravok, ako je forma agaru, ako je agaróza s nízkou teplotou topenia alebo Gelrite, pokiaľ sa to žiada. Odborníci poznajú rôzne tkanivové kultivačné médiá, ktoré, keď sa vhodne doplnia, podporujú rast a rozvoj tkanív rastlín a sú vhodné na transformáciu a regeneráciu rastlín. Tieto tkanivové kultivačné médiá sa môžu získať buď ako komerčné preparáty, alebo sa môžu pripraviť a modifikovať podľa potreby. Vybrané médiá sa môžu doplniť vhodnými aditivami v závislosti na stupni procesu transformácie. Napríklad na mikropropagáciu sa môže použiť médium tu označované ako mikropropagačné médium, ktoré podporuje rast a udržanie tkanív rastlín in vitro. Tiež v iných stupňoch procesu transformácie, vrátane nie však iba, klíčenie, indukcia výhonkov a indukcia koreňov, sa používajú médiá doplnené vhodnými aditivami
-8a môžu zahŕňať, ale neobmedzujú sa na nich, médiá ako Linsmaier a Skoog (Linsmaier a Skoog, Physiol. Plánt 18: 100, 1965), Uchimiya aMurashige (Uchimiya aMurashige, Plánt Physiol. 54: 936, 1974), Gamborgovo médium (Gamborg a kol., Exp. Celí Res., 50: 151, 1968), McCown's Woody Plánt Média (McCown aLoyd, Hort. Science, 16: 453, 1981), Nitsch aNitsch (Nitsch aNitsch, Science, 163: 85-87, 1969) a Schenk aHildebrandt (Schenk a Hildebrandt, Can. J. Bot. 50: 166, 1972) alebo obmeny týchto médií vhodne doplnené. I Odborníci sú si vedomí, že médiá a doplnky médií ako živiny a regulátory rastu na použitie v rôznych stupňoch udržiavania rastlín a v rôznych stupňoch transformácie a regenerácie vedľa iných podmienok kultivácie, ako je intenzita svetla počas inkubácie, pH a teplota inkubácie, sa môžu optimalizovať pre daný variant rastlín.
Nasledujúci experimentálny protokol osvetľuje vynález. Bežný odborník ocení, že možno uskutočniť rôzne modifikácie materiálov, médií, trvania procesov, teploty a podmienok osvetlenia napriek tomu, aby sa odchýlilo od vynálezu.
Sterilizácia semien
Semená sa môžu sterilizovať akoukoľvek prijateľnou metódou. Zistilo sa, že nasledujúci spôsob je účinný.
Semená cukrovej repy sa dajú do roztoku hydroxidu sodného obsahujúceho asi IN hydroxid sodný a miešajú sa asi jednu hodinu pri teplote miestnosti. Kvapalina sa dekantuje a semená sa opláchnu destilovanou vodou, aby sa odstránil zvyšný hydroxid sodný. Pridá sa studená voda a semená sa miešajú asi jednu hodinu. Semená sa z kvapaliny vyberú a malá časť povlaku semena sa odstráni z každého zárodku, aby sa časť zárodku semena exponovala. Semená sa krátko opláchnu 95 % etanolom. Roztok etanolu sa dekantuje a semená sa miešajú asi 20 minút v zriedenom roztoku (2,5 % hmot./obj.) chlornanu sodného. Kvapalina sa odstráni a semená sa opláchnu trikrát sterilizovanou destilovanou vodou. Pridá sa kaptán (zmáčaný prášok používaný ako vodný roztok na kontrolu istých plesňových chorôb, Micro Flo Co., Lakeland, Fl) a malé množstvo sterilizovanej vody, ktoré stačí na zakrytie semien. Semená nasakujú aspoň jednu hodinu. Nasakovanie môže pokračovať cez noc, pokiaľ sa to žiada.
Klíčenie semien
Semená môžu klíčiť akoukoľvek prijateľnou metódou. Zistilo sa, že nasledujúci spôsob je výhodný. Iné formulácie médií, vrátane, avšak nie iba tých skôr opísaných , môžu byť vhodné na podporu klíčenia miesto formulácií médií opísaných nižšie.
-9Semená sa prenesú z kaptánovej suspenzie na doštičky obsahujúce MSMO médium (Tabuľka 1). Približne 15 semien sa dá na každú 100 a 25 mm doštičku na klíčenie. Doštičky sa dajú do vreciek, výhodne do plastikových vrecúšok bez dier. Výhodne semená klíčia v temne a vrecúška sa dajú do temna pri asi 20 °C až 25 °C, výhodne pri asi 23 °C až 24 °C. Inkubáciu v temne možno robiť akýmkoľvek spôsobom, vrátane, nie však iba, umiestnenie vreciek v uzatvorenej lepenkovej škatuli. Optimálne dĺžka uloženia v temne sa mení podľa genotypu cukrovej repy, avšak bude typicky medzi 2 a 4 týždňami. Povlak semena sa odstráni z vyklíčených sadeníc a sadenice sa potom prenesú do nádob obsahujúcich MSMO médium. Sadenice sa inkubujú pri asi 23 °C až 24 °C asi 1-5 dní, výhodne asi 2 dni. Fotoperióda počas inkubácie sa udržiava pri cykle svetlo : tma asi 16:8.
Tabuľka 1
MSMO médium
| Zložka | Koncentrácia |
| MSMO soli (Sigma M-68-99) | Δ .4 rrn •9 · cr ‘ |
| Sacharóza | 30 g/1 |
| Pytagar | 7 g/1 |
Iniciácia a udržiavanie kultúr mikropropagovaných výhonkov
Mikropropagované kultúry výhonkov sa môžu iniciovať akoukoľvek prijateľnou metódou. Zistilo sa, že nasledujúci spôsob je výhodný v laboratóriu. Iné formulácie médií skôr opísané môžu byť vhodné na iniciáciu kultúr mikropropagovaných výhonkov miesto formulácie médií opísaných nižšie.
Dolná polovica hypokotylovej oblasti sa opatrne odstráni z vyklíčených sadeníc. Časť sadenie obsahujúca kotyledóny a horná časť hypokotyly sa prenesie do MSMO média obsahujúceho 0,1 mg/1 6-benzylaminopurínu. Po 3 týždňoch inkubácie s osvetlením ako zhora sa výhonky prenesú do čerstvého média. Po ďalších 3 týždňoch sa listy môžu použiť na transformáciu. Výhodne sa použijú vonkajšie listy a najvnútornejšie listy sa použijú na udržiavanie tkaniva in vitro. Na udržiavanie mikropropagovaných kultúr potom, čo sa listy odstránia na nasledujúcu transformáciu, prenesie sa do čerstvého média vrcholová a najvnútornejšia oblasť listu (všeobecne asi 0,5 - 3,0 cm), aby sa udržiavala kultúra mikropropagovaných výhonkov (pozri Obr. 5 a 6). Obr. 5 znázorňuje pohľad zhora na mikropropagovanú kultúru cukrovej repy. Obr. 6 znázorňuje pohľad z boku, ktorý ukazuje vonkajšie listy, vnútorné listy, oblasť listovej báze a oblasť rezu alebo zranenia, kde sa listy
- 10odoberú pri listovej báze. Mikropropagované kultúry cukrovej repy sa výhodne prenesú do čerstvého média aspoň raz za mesiac, aby sa udržiavali zdravé kultúry a pohotový zdroj tkanív na transformáciu. Udržiavaním tkanív cukrovej repy týmto spôsobom je stále k dispozícii vhodný materiál explantátu na transformáciu bez potreby iniciovať kultúry zo smien, čo ušetrí aspoň jeden mesiac procesu.
Príprava bakteriálnych kultúr
Bakteriálne kultúry sa môžu pripraviť akoukoľvek prijateľnou metódou. Zistilo sa, že nasledujúci spôsob je výhodný v laboratóriu. Iné formulácie médií môžu byť vhodné na prípravu bakteriálnych kultúr miesto formulácií médií opísaných nižšie. Môže sa použiť akýkoľvek kmeň Agrobacterium, ktorý je vhodný na spôsoby podľa vynálezu a výhodné je Agrobacterium tumefaciens. Spôsoby rastu a udržiavania kultúr Agrobacterium sú odborníkom známe.
Agrobacterium tumefaciens obsahujúce exogénnu sekvenciu DNA, ktorá sa má preniesť do cukrovej repy, typicky sa pestujú na LB médiu obsahujúcom selektívne antibiotiká (pozri napríklad LBsck médium obohatené spektinomycínom, chloramfenikolom a kanamycínom, Tabuľka 2). Baktérie sa pestujú pri teplote miestnosti asi 2 až 3 dni. Baktérie sa použijú na iniciáciu kvapalných kultúr v LBsck 2 dni pred transformáciou, aby sa dosiahla vhodná hustota buniek. Baktérie sa zriedia asi 100 krát do ABsck (Tabuľka 3) alebo YEP (Tabuľka 4) média. Na kultúru sa použije asi 2 ml média, hoci odborník vie, že zmeny v mierke kultúry nebudú mať významný vplyv na rast baktérií. Kultúry sa ponechajú inkubovať cez noc v orbitálnej trepačke. Kultúry baktérií sa zriedia asi 12,5 krát do ABsck média alebo do ABsck média obohateného 200 μΜ acetosyringónu, výhodne na celkový objem asi 50 ml. Kultúry sa dajú do orbitálnej trepačky a inkubujú sa cez noc asi pri 26 °C. Kultúra sa sleduje, pokiaľ nedosiahne hustota buniek asi 3,0 x 109 buniek/ml, čo odpovedá ODňoo asi L Objem sa upraví TXD médiom (Tabuľka 5), aby sa dosiahla hustota buniek asi 1,0 x 109 buniek/ml.
Tabuľka 2
LBsck médium
Zložka
Koncentrácia
Peptón
Extrakt z kvasníc
Chlorid sodný g/1
2/1 g/1
| Difco bacto agar Spektinomycín Chloramfenikol Kanamycín | 15 g/1 100 mg/'l 25 mg/1 50 mg/1 |
| Tabuľka 3 f | ABsck médium |
| Zložka | Koncentrácia |
| Glukóza Pytagar AB soli AB pufor Spektinomycín Chloramfenikol Kanamycín | 5 g/1 7,5 g/1 25 ml/1 25 mí/i 0,1 mg/1 * 0,025 mg/1 0,05 mg/1 |
AB soli (500 ml): lOgNHíCl, 12,5 g MgSO4.7H2O, 1,5 KC1, 0,1 g CaCl2 alebo 0,132 g CaC12.2H2O, 25 mg FeS04 alebo 45,55 mg FeSO4.7H2O.
AB pufbr (500 ml): 39,33 g K2HPO4.3H2O alebo 30,0 g K2HPO4, 11,5 g NaH2PO4.2H2O
| Tabuľka 4 | YEP médium |
| Zložka | Koncentrácia |
| Extrakt z kvasníc Peptón Chlorid sodný pH = 7 | 10 g/1 10 g/1 5 g/1 |
| Tabuľka 5 | TXD médium |
| Zložka | Koncentrácia |
| MS soli s vitamínmi B5 (Sigma M-6899) PCPA Kinetín Sacharóza pH upravené na 5,8 | 4,4 g/1 4 mg/1 5 Mg/1 30 g/1 |
- 12Priprava doštičiek pre kultúry zmesí
Doštičky pre kultúry zmesí sa môžu pripraviť použitím akejkoľvek formulácie médií. Formulácie médií iné, než tie, ktoré sú opísané nižšie, môžu byť vhodné.
Nalejú sa doštičky obsahujúce 1/10 MS médium (Tabuľka 6) s výhodou obohatené 200 μΜ acetosyringónom a 1 μΜ galakturónovou kyselinou. Acetosyringón a galakturónová kyselina sa pridajú k MS médiu po autoklávovaní. Sterilný filtračný papier sa dá navrch tuhého média a zvlhčí sa TXD médiom pred použitím s explantátmi.
| Tabuľka 6 | MS médium |
| Zložka | Koncentrácia |
| MS soli (Sigma) | 4,4 g/1 |
| Sacharóza | 30 g/1 |
| SB vitamín #1 | 2 ml/1 · |
| SB vitamín #2 | 1 ml/1 |
| pH = 5,95 |
Explantovanie listovej báze
Explantovanie možno uskutočniť akoukoľvek prijateľnou metódou. Zistilo sa, že nasledujúci spôsob je účinný. Iné formulácie médií skôr opísané môžu byť vhodné na explantovanie miesto formulácií médií opísaných nižšie.
Listy z mikropropagovaných výhonkov sa vyrežú a prenesú sa na Petriho misku obsahujúcu sterilný filtračný papier zvlhčený TXD médiom. Listy z ktorejkoľvek časti mikropropagovaného výhonku sa môžu použiť v tomto vynáleze. Teda ktorýkoľvek vnútorný alebo vonkajší list sa môže použiť na následnú transformáciu. Výhodne sa používajú vonkajšie listy. List sa skladá z listovej čepele a listovej báze a môže sa odrezať akýmkoľvek spôsobom. S výhodou sa listy odstránia odrezaním pri základni listu (pozri Obr. 6), takže list je primárne nedotknutý a rezné miesto je pri základni listu. Po odrezaní asi 25 listov z mikropropagovaných výhonkov sa explantáty prenesú do zriedenej bakteriálnej kultúry a inkubujú sa. Inkubácia explantátov listov s Agrobacteriom môže trvať akúkoľvek dlhú dobu. Výhodne je doba inkubácie s Agrobacteriom až 60 minút, výhodnejšie asi 15 až 20 minút a inkubácia sa robí spôsobom, ktorý vystavuje rezné miesto kultúre Agrobacterium. Výhodne je spodné rezné miesto explantátu listu, v listovej báze v styku s kultúrou
- 13Agrobacterium. Explantáty sa prenesú z bakteriálnej kultúry, dajú sa na sterilný filtračný papier, ako je sterilný Whatman filtračný papier, a prenesú sa na doštičky pre kultúry zmesi.
Doba kultivovania zmesí môže trvať akúkoľvek dlhú dobu. Výhodne je doba kultivovania zmesí až 5 dní. Výhodnejšie je doba kultivovania zmesí od 2 do 5 dní. Ešte výhodnejšie je doba kultivovania zmesi 4 dni. Doštičky s kultúrou zmesi sa dajú do zatavených plastikových vreciek a inkubujú sa pri asi 22 °C až 24 °C asi 4 dni. Fotoperióda počas inkubácie sa použije svetlo : tma asi 16:8.
Listy z mikropropagovaných výhonkov sa prípadne môžu vyrezať, ako sa opisuje zhora a prenesú sa priamo na doštičky pre kultúry zmesí na predkultivačné obdobie cez noc pri asi 22 °C až 24 °C pred pridaním bakteriálnej kultúry. Hoci sa dáva prednosť predkultivácii cez noc, predkultivácia po aspoň 6 hodín je tiež účinná. Po obdobie predkultivácie sa explantáty infikujú Agrobacteriom pridaním, bakteriálnej suspenzie priamo k explantátom na doštičkách pre kultúry zmesí. Po inkubácii asi 20 minút sa baktérie môžu odstrániť akýmkoľvek spôsobom, vrátane odsatia a explantáty môžu zostať na rovnakých doštičkách po trvanie obdobia kultivácie zmesí.
Kultúra a podmienky selekcie
Explantáty sa môžu kultivovať akoukoľvek prijateľnou metódou. Zistilo sa, že nasledujúci spôsob je účinný. Iné formulácie médií skôr opísané môžu byť vhodné na kultiváciu a selekciu miesto formulácií médií opísaných nižšie.
Explantáty sa prenesú z doštičiek pre kultiváciu zmesí do kultivačného média. Výhodne je kultivačné médium založené na MS médiu doplnenom 0,5 mg/1 benzylaminopurínu (BAP) alebo benzyladenínu (BA), 0,05 mg/1 I-naftalénoctovej kyseliny, 500 mg/1 karbenicilínu a 100 mg/1 cetofaxímu. Podmienky kultivácie zmesí sa môžu meniť v závislosti na voliteľnom markery. Na selekciu glyfosátu (N-fosfonometylglycín) sa infikované rastliny dajú na oneskorovacie médium bez pridania selektívneho prípravku glyfosátu. Dĺžka oneskorovacej periódy bude závislá na použitom genotype. Urobia sa pokusy s každým genotypom, aby sa stanovilo optimálne trvanie oneskorovacej periódy. Oneskorovacia perióda sa môže vyskytovať typicky až po 10 dní. Výhodne je oneskorovacia perióda bez selekcie asi 2 až 7 dni. Ešte výhodnejšie je oneskorovacia perióda bez selekcie asi 6 dní pri asi 24 °C, s výhodou v plastikových vreckách s dierami. Urobia sa pokusy s každým genotypom, aby sa stanovila optimálna hladina selekčného prípravku. Na selekciu glyfosátu f
sa infikované rastliny po oneskorovacej perióde prenesú z oneskorovacieho média (bez glyfosátu) do média založenom na MS médiu doplnenom 0,50 mg/1 benzyladenínu, 0,05 mg/1
- 14l-naftalénoctovej kyseliny, 500 mg/1 karbenicilínu, 100 mg/1 cetofaxímu a 0,05 - 0,10 mmol glyfosátu (výhodne asi 0,075 mmol glyfosátu). Explantáty sa môžu kultivovať asi 3 týždne pri asi 24 °C, s výhodou v plastikových vreckách bez dier. Použije sa fotoperióda pre kultiváciu asi 16:8 svetlo : tma. Explantáty sa prenesú do rovnakého média obsahujúceho vhodný selekčný prípravok každé 3 týždne. Všeobecne stačia 2 až 3 prenosy, aby sa identifikovala transgénová rastlina.
Mikropropagačné a zakoreňovacie postupy
Mikropropagáciu a zakoreňovanie možno uskutočňovať akoukoľvek prijateľnou metódou. Zistilo sa, že nasledujúci spôsob je účinný. Iné formulácie médií skôr opísané môžu byť vhodné pre mikropropagáciu a zakoreňovanie miesto formulácií médií opísaných nižšie.
Mikropropagácia je prospešná pri znížení alebo odstránení nežiaducich chimérnych tkanív. Použitie mikropropagácie je zvlášť prospešné na získanie transgénových rastlín a šetrí čas tým, že eliminuje potrebu získavať rastlinný materiál vychádzajúci zo semien.
Tkanivá možno udržiavať v rade nádob pre tkanivové kultúry, vrátane, nie však iba, Petriho misiek alebo pohárov sundae.
Transformované výhonky sa prenesú na mikropropagačné médium obsahujúce médium založené na MS médiu doplnenom 0,5 mg/1 benzyladenínu, 500 mg/1 karbenicilínu a 100 mg/1 cetofaxímu. Výhonky rastú a delia sa v tomto médiu, pokiaľ sa nezíska žiadaný počet výhonkov. Pre selekciu glyfosátu možno s výhodou pridať do mikropropagačného média glyfosát, aby sa napomohlo selekcii klonovaného materiálu. Klonovaným materiálom, ako sa tu používa, sa myslí, že celý výhonok sa transformuje a neobsahuje žiadny chimérny rastlinný materiál, ktorý sa skladá tak z transformovaného, ako aj netransformovaného tkaniva. Jednotlivé výhonky sa zakorenia na 'Λ MS médiu doplnenom 5 mg/1 indolmaslovej kyseliny, 100 mg/1 cetofaxímu a 500 mg/1 karbenicilínu. Korene by sa mali objaviť asi za 412 týždňov. Zakorenené výhonky sa môžu presadiť do zeminy, výhodne Metro-Mix 350 (Metro-Mix je zapísaná ochranná známka Scotts Company, Marysville, OH).
Prehľad obrázkov na výkresoch
Nasledujúce obrázky tvoria časť tohto opisu a sú zahrnuté, aby ďalej demonštrovali isté aspekty tohto vynálezu. Vynález možno lepšie pochopiť s odkazom na jeden alebo viac výkresov v kombinácii s podrobným opisom tu uvedených špecifických vyhotovení.
| Obrázok | Opis |
| 1 2 j 4 5 6 | Mapa plazmidu pMON17303 Mapa plazmidu pMON13819 Mapa plazmidu pMON13835 Mapa plazmidu pMON13851 Pohľad zhora na mikropropagovanú kultúru cukrovej repy Pohľad z boku na mikropropagovanú kultúru cukrovej repy |
Príkladv uskutočnenia vynálezu
Nasledujúce príklady sú zahrnuté, aby demonštrovali výhodné uskutočnenia vynálezu. Odborníci by mali oceniť, že techniky opísané v príkladoch, ktoré nasledujú, predstavujú techniky objavené vynálezcom, ktoré majú dobre fungovať pri uskutočňovaní vynálezu, a teda sa môžu považovať za výhodné spôsoby pre jeho prax. Avšak odborníci by mali vo svetle tohto opisu oceniť, že možno uskutočniť rad zmien v špecifických uskutočneniach, ktoré opisujeme, a ešte získať rovnaký alebo podobný výsledok napriek tomu, aby došlo k odchýleniu od ducha a rozsahu vynálezu.
Príklad 1
Konštrukty plazmidu
Všetky konštrukty opísané v príkladoch sú vektory transformácie rastlín s dvojitým okrajom obsahujúcim začiatok replikácie E. coli (ori322), široký rozsah hostiteľského začiatku replikácie E. coli (ori-V) a kódujúcu oblasť (Spc/Str) pre Tn7 adenyltransferázu, čo dodáva odolnosť voči spektinomycínu a streptomycínu. Pre transformáciu rastlín sa použil hostiteľský bakteriálny kmeň Agrobacterium tumefaciens kmeň ABI. Promótor, kódujúci oblasť a 3' terminátory, sú znázornené v zátvorkách.
P-e35S je promótor pre 35S RNA z CaMV obsahujúci duplikáciu oblasti -90 až -300, ako opisuje USA patent 5 424 200, P-FMV je promótor 35S z mozaikového vírusu Figwort, ako opisuje USA patent 5 378 619, P-aa-chit je promótor pre kyslú chitinázu z Arabinopsis, ako opisuje Samac a Shah (Plánt Celí 3: 1063, 1991), AEPSPS/CTP2 je oblasť tranzitného peptidu z Arabinopsis EPSPS (syntéza 5-enopyruvyI-3-fosfosikimovej kyseliny), ako opisuje USA patent 5 633 435; CP4syn je kódujúca oblasť pre CP4-EPSPS (syntetická sekvencia), ako opisuje USA patent 5 633 435; fbp je kódujúca sekvencia pre E. coli 1,6-bifosfatázu fruktózy, ako opisuje Hamilton a kol. (Nucleic Acids Res. 16: 8707, 1988), glgC16 je gén E. coli pre gén ADP fosforylázy glukózy, ako opisuje USA patent 5 648 249; mz SPS je
- 16kódujúca oblasť pre fosfát syntézy sacharózy kukurice, ako opisuje USA patent 5 750 869; ED 3 ' je koniec génu hrachu E9 rbc, ktorý má funkciu polyadenylačného signálu; 7S je 3' terminačný signál 7S zásobného proteínu semena sóje; GUS;1 je kódujúca sekvencia pre gén beta-glukuronidázy z E. coli (Jefferson, R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83; 8447-8451, 1987) modifikovaný, aby obsahoval reštrukčné miesto Ncol (CCATGG) v začiatočnom
I kodóne.
Príklad 2
Transformácia s ABI pMON173Q3
Vonkajšie listy sa vyrezali priamo z mikropropagovaných výhonkov cukrovej repy a použili sa ako explantáty na transformáciu. Listy sa odrezali pri listovej báze a inkubovali sa a Agrobacteriom tak, že listová báza bola v styku s kultúrou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmeň ABI obsahoval konštrukt pMON17303 (P-e35S/mz SPS/E9 3', PFMV/CP4syn/E9 3', Obr. 1) a metóda transformácie bola rovnaká, ako sa opisuje v časti Podstata vynálezu. Pri transformácii tohto konštruktu sa nepoužila žiadna predkultúra. Selekcia transformovaných buniek sa urobila s použitím 0,075 mM glyfosátu. Z 573 explantátov sa získali 3 transformované rastliny s transformačnou účinnosťou 0,5 %.
Príklad 3
Transformácia s konštruktom ABI pMON13819
Vonkajšie listy sa vyrezali priamo z mikropropagovaných výhonkov cukrovej repy a použili sa ako explantáty na transformáciu. Listy sa odrezali pri listovej báze a inkubovali sa a Agrobacteriom tak, že listová báza bola v styku s kultúrou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmeň ABI obsahoval konštrukt pMON13819 (P-e35S/fbp/E9 3', PFMV/CP4syn/E9 3', Obr. 2). Transformácia a selekcia sa urobili rovnako, ako sa opisuje v príklade 2 av časti Podstata vynálezu. Z 1875 explantátov sa získalo 52 transformovaných rastlín s transformačnou účinnosťou 3 %.
Príklad 4
Transformácia s konštruktom ABI pMON13835
Vonkajšie listy sa vyrezali priamo z mikropropagovaných výhonkov cukrovej repy a použili sa ako explantáty na transformáciu. Listy sa odrezali pri listovej báze a inkubovali sa a Agrobacteriom tak, že listová báza bola v styku s kultúrou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmeň ABI obsahoval konštrukt pMON13835 (P-e35S/mzSPS/E9 3', P
- 17FMV/CP4syn/E9 3', Obr. 3). Transformácia a selekcia sa urobili rovnako, ako sa opisuje v príklade 2 a v časti Podstata vynálezu. Z 2580 explantátov sa získalo 12 transformovaných rastlín s transformačnou účinnosťou 0,5 %.
Príklad 5
Transformácia s konstruktom ABI pMON13851
Vonkajšie listy sa vyrezali priamo z mikropropagovaných výhonkov cukrovej repy a použili sa ako explantáty na transformáciu. Listy sa odrezali pri listovej báze a inkubovali sa a Agrobacteriom tak, že listová báza bola v styku s kultúrou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmeň ABI obsahoval konštrukt pMON13851 (P-e35S/mzSPS/E9 37PFMV/CP4syn/E9 3', Obr. 4). Transformácia a selekcia sa urobili rovnako, ako sa opisuje v príklade 2 a v časti Podstata vynálezu, navyše s krokom predkultivácie cez noc, pred stykom tkaniva rastlín s Agrobacteria. Z 2890 explantátov sa získalo 14 transformovaných rastlín s transformačnou účinnosťou 0,5 %.
Všetky kompozície a spôsoby tu opísané a nárokované možno urobiť a uskutočňovať bez zbytočného experimentovania vo svete tohto opisu. Hoci kompozícia a spôsoby tohto vynálezu sa opísali v zmysle výhodných uskutočnení, odborníkom bude zrejmé, že sa môžu uplatniť variácie ku kompozíciám a spôsobom a krokom, alebo poradie krokov spôsobov napriek tomu, aby sa odchýlilo od konceptu, ducha a rozsahu vynálezu. Konkrétnejšie bude zrejmé, že isté prípravky, ktoré sú tak chemicky, ako aj fyziologicky príbuzné, môžu nahradiť prípravky tu opísané, pričom sa získajú rovnaké alebo podobné výsledky. Všetky také podobné substitúcie a modifikácie zrejmé odborníkom, sa myslia, že patria do rozsahu ducha, rozsahu a konceptu vynálezu.
Claims (15)
- PATENTOVE NÁROKY1. Spôsob prípravy transgénových buniek cukrovej repy, vyznačujúci sa tým, že sa vyberie sadenica cukrovej repy, ktorá obsahuje kotyledónovú oblasť a hypokotylovú oblasť; kotyledónová oblasť a horná polovica hypokotylovej oblasti sa zo sadenice odstráni, kotyledónová oblasť a horná polovica hypokotylovej oblasti sa uvedú do styku s mikropropagačným médiom pri vzniku mikropropagovaného výhonku, ktorý obsahuje aspoň jeden list alebo jeho časť, vrátane listovej báze; list sa z mikropropagovaného výhonku odstráni pri listovej báze a explantát listu sa uvedie do styku s Agrobacteria pri oblasti listovej báze tak, aby vzniklo tkanivo, ktoré obsahuje transgénovú bunku cukrovej repy schopnú expresie exogénnej sekvencie nukleovej kyseliny, kde Agrobacteria obsahuje vektor a vektor obsahuje operatívne spojený v orientácii 5' ku 3' : promótor, ktorý riadi transkripciu exogénnej štruktúrnej sekvencie nukleovej kyseliny; exogénnu štruktúrnu sekvenciu nukleovej kyseliny a 3' transkripčný terminátor.
- 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že Agrobacteria je Agrobacterium tumefaciens.
- 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že list alebo jeho časť obsahuje vonkajší list.
- 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že list alebo jeho časť obsahuje vnútorný list.
- 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že štruktúrna sekvencia nukleovej kyseliny kóduje proteín alebo protizmyslovú RNA sekvenciu.
- 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že list alebo jeho Časť sa predkultivuje pred stykom s Agrobacteria.
- 7. Spôsob prípravy transgénových buniek cukrovej repy vyznačujúci sa tým, že sa vyberie sadenica cukrovej repy, ktorá obsahuje kotyledónovú oblasť a hypokotylovú oblasť; kotyledónová oblasť a horná polovica hypokotyloyej oblasti sa zo sadenice odstráni; kotyledónová oblasť a horná polovica hypokotylovej oblasti sa uvedú do styku s mikropropagačným médiom pri vzniku mikropropagovaného výhonku, ktorý obsahuje aspoň jeden list alebo jeho časť, vrátane listovej báze; list sa z mikropropagovaného výhonku odstráni pri listovej báze; listová báza sa uvedie do styku s Agrobacteria tak, aby vzniklo tkanivo obsahujúce transgénovú bunku cukrovej repy; tkanivo sa kultivuje pri vzniku transgénového výhonku, ktorý sa kultivuje pri vzniku zakoreneného transgénového výhonku, ktorý sa nechá rásť pri vzniku transgénovej rastliny cukrovej repy schopnej expresie exogénnej sekvencie nukleovej kyseliny, kde Agrobacteria obsahuje vektor, ktorý obsahuje operatívne spojený v orientácii 5' ku 3': promótor, ktorý riadi transkripciu exogénnej štruktúrnej sekvencie nukleovej kyseliny; exogénnu Štruktúrnu sekvenciu nukléovej kyseliny a 3' transkripčný terminátor.
- 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že list alebo jeho časť obsahuje vonkajší list alebo jeho časť.
- 9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že list alebo jeho časť obsahuje vnútorný list alebo jeho časť.
- 10. Spôsob podľa nároku, vyznačujúci sa tým, že semeno cukrovej repy klíči v tme.
- 11. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že mikropropagačné médium obsahuje MSMO médium a 0,1 mg/l 6-aminobenzylpurínu.
- 12. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že selekčný prípravok obsahuje glyfosát.
- 13. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že Agrobacteria je Agrobacterium . tumefaciens.
- 14. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že štruktúrna sekvencia nukleovej kyseliny kóduje proteín alebo protizmyselnú RNA sekvenciu.
- 15. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že list alebo časť.obsahujúca listovú bázu sa predkultivuje pred stykom s Agrobacteria.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16951299P | 1999-12-07 | 1999-12-07 | |
| PCT/US2000/033101 WO2001042480A2 (en) | 1999-12-07 | 2000-12-06 | Sugarbeet regeneration and transformation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK8042002A3 true SK8042002A3 (en) | 2003-02-04 |
Family
ID=22616009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK804-2002A SK8042002A3 (en) | 1999-12-07 | 2000-12-06 | Sugarbeet regeneration and transformation |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20010042257A1 (sk) |
| EP (1) | EP1235921B1 (sk) |
| AT (1) | ATE356882T1 (sk) |
| AU (1) | AU2575701A (sk) |
| CA (1) | CA2395365A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20022139A3 (sk) |
| DE (1) | DE60033959T2 (sk) |
| DK (1) | DK1235921T3 (sk) |
| ES (1) | ES2281373T3 (sk) |
| PL (1) | PL356025A1 (sk) |
| PT (1) | PT1235921E (sk) |
| SK (1) | SK8042002A3 (sk) |
| WO (1) | WO2001042480A2 (sk) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3985474B2 (ja) * | 2001-07-24 | 2007-10-03 | 日本製紙株式会社 | 遺伝子導入効率を向上させたユーカリ属の植物への遺伝子導入方法 |
| US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
| WO2010002984A1 (en) | 2008-07-01 | 2010-01-07 | Monsanto Technology, Llc | Recombinant dna constructs and methods for modulating expression of a target gene |
| US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
| CA2790211C (en) | 2010-03-08 | 2020-06-09 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delivering polynucleotides into plants |
| US8816153B2 (en) | 2010-08-27 | 2014-08-26 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA constructs employing site-specific recombination |
| US9840715B1 (en) | 2011-09-13 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants |
| MX361938B (es) | 2011-09-13 | 2018-12-19 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para el control de malezas. |
| MX362810B (es) | 2011-09-13 | 2019-02-13 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para controlar malezas. |
| AU2012308659B2 (en) | 2011-09-13 | 2017-05-04 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10760086B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-09-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| WO2013040057A1 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10829828B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10806146B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-10-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US9920326B1 (en) | 2011-09-14 | 2018-03-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for increasing invertase activity in plants |
| AU2013264742B2 (en) | 2012-05-24 | 2018-10-04 | A.B. Seeds Ltd. | Compositions and methods for silencing gene expression |
| WO2014062989A2 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-24 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
| US20150307894A1 (en) | 2012-11-28 | 2015-10-29 | Monsanto Technology Llc | Transgenic Plants With Enhanced Traits |
| US10683505B2 (en) | 2013-01-01 | 2020-06-16 | Monsanto Technology Llc | Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression |
| US10041068B2 (en) | 2013-01-01 | 2018-08-07 | A. B. Seeds Ltd. | Isolated dsRNA molecules and methods of using same for silencing target molecules of interest |
| US10000767B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-06-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
| US10609930B2 (en) | 2013-03-13 | 2020-04-07 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| EP2967082A4 (en) | 2013-03-13 | 2016-11-02 | Monsanto Technology Llc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR WEED CONTROL |
| US20140283211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and Compositions for Plant Pest Control |
| US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| EP3030663B1 (en) | 2013-07-19 | 2019-09-04 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling leptinotarsa |
| US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
| WO2015054106A1 (en) | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants with enhanced traits |
| EP3054765A4 (en) | 2013-10-09 | 2017-06-14 | Monsanto Technology LLC | Interfering with hd-zip transcription factor repression of gene expression to produce plants with enhanced traits |
| NZ719544A (en) | 2013-11-04 | 2022-09-30 | Beeologics Inc | Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations |
| UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
| BR112016016337A2 (pt) | 2014-01-15 | 2017-10-03 | Monsanto Technology Llc | Composição e métodos para controlar crescimento, desenvolvimento ou a capacidade de reprodução de uma planta, e para sensibilizar uma planta para um herbicida inibidor de epsps |
| WO2015153339A2 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
| EP3158067B1 (en) | 2014-06-23 | 2020-08-12 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
| EP3161138A4 (en) | 2014-06-25 | 2017-12-06 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression |
| RU2754955C2 (ru) | 2014-07-29 | 2021-09-08 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями |
| WO2016118762A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling leptinotarsa |
| CN107750125A (zh) | 2015-06-02 | 2018-03-02 | 孟山都技术有限公司 | 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法 |
| AU2016270913A1 (en) | 2015-06-03 | 2018-01-04 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants |
| CN109475124B (zh) | 2015-08-27 | 2021-11-19 | 孟山都技术公司 | 新型昆虫抑制蛋白 |
| CN111118055A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-08 | 鲁东大学 | 高糖品种甜菜转基因体系的建立方法 |
| CA3206159A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Monsanto Technology Llc | Novel insect inhibitory proteins |
| UY39585A (es) | 2020-12-23 | 2022-07-29 | Monsanto Technology Llc | Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas |
| PE20240230A1 (es) | 2020-12-31 | 2024-02-16 | Monsanto Technology Llc | Novedosas proteinas inhibidoras de insectos |
| CA3232591A1 (en) | 2021-09-17 | 2023-03-23 | University Of Freiburg | Proteins for regulation of symbiotic infection and associated regulatory elements |
| US20230143932A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-05-11 | University Of Freiburg | Pin6 proteins for the formation of nodule-like structures |
| WO2023223268A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Cambridge Enterprise Limited | Proteins for regulation of symbiotic nodule organ identity |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5034323A (en) * | 1989-03-30 | 1991-07-23 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
| GB9321183D0 (en) * | 1993-10-14 | 1993-12-01 | Zeneca Ltd | A method of plant transformation |
| US6204436B1 (en) * | 1997-10-31 | 2001-03-20 | Novartis Ag | Transgenic plants |
-
2000
- 2000-12-06 PL PL00356025A patent/PL356025A1/xx unknown
- 2000-12-06 PT PT00989221T patent/PT1235921E/pt unknown
- 2000-12-06 DK DK00989221T patent/DK1235921T3/da active
- 2000-12-06 ES ES00989221T patent/ES2281373T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CZ CZ20022139A patent/CZ20022139A3/cs unknown
- 2000-12-06 EP EP00989221A patent/EP1235921B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 SK SK804-2002A patent/SK8042002A3/sk unknown
- 2000-12-06 DE DE60033959T patent/DE60033959T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 US US09/731,210 patent/US20010042257A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-06 CA CA002395365A patent/CA2395365A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-06 AT AT00989221T patent/ATE356882T1/de active
- 2000-12-06 AU AU25757/01A patent/AU2575701A/en not_active Abandoned
- 2000-12-06 WO PCT/US2000/033101 patent/WO2001042480A2/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2281373T3 (es) | 2007-10-01 |
| PT1235921E (pt) | 2007-06-19 |
| ATE356882T1 (de) | 2007-04-15 |
| US20010042257A1 (en) | 2001-11-15 |
| EP1235921A2 (en) | 2002-09-04 |
| DE60033959D1 (de) | 2007-04-26 |
| CA2395365A1 (en) | 2001-06-14 |
| WO2001042480A2 (en) | 2001-06-14 |
| DK1235921T3 (da) | 2007-04-23 |
| PL356025A1 (en) | 2004-05-31 |
| WO2001042480A3 (en) | 2002-01-03 |
| AU2575701A (en) | 2001-06-18 |
| DE60033959T2 (de) | 2007-11-22 |
| EP1235921B1 (en) | 2007-03-14 |
| CZ20022139A3 (cs) | 2002-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1235921B1 (en) | Sugarbeet regeneration and transformation | |
| US8592212B2 (en) | Soybean transformation method | |
| CA1341481C (en) | Transformation and foreign gene expression in brassica species | |
| US20120192318A1 (en) | Transformation system for Camelina sativa | |
| Thu et al. | In vitro regeneration and transformation of pigeonpea [Cajanus cajan (L.) Millsp] | |
| NZ537237A (en) | Method of transforming soybean using agrobacterium | |
| US6255559B1 (en) | Methods for producing genetically modified plants, genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby | |
| US6133035A (en) | Method of genetically transforming banana plants | |
| Pawar et al. | Effect of explants, bacterial cell density and overgrowth-control antibiotics on transformation efficiency in tomato (Solanum lycopersicum L.) | |
| US7026529B2 (en) | Methods for Agrobacterium-mediated transformation of dandelion | |
| US7057090B1 (en) | Agrobacterium-mediated transformation of turfgrass | |
| CA2341781A1 (en) | Methods for producing genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby | |
| US20040210958A1 (en) | A Novel Culture Method for Corn Transformation | |
| WO2003009673A1 (en) | Transformation of plants by electroporation of cultured explants | |
| Koul | Cisgenics and Transgenics: Strategies for Sustainable Crop Development and Food Security | |
| US20060225155A1 (en) | Method for the production of stably transformed, fertile gramineae employing agrobacterium-mediated transformation of isolated gramineae zygotes | |
| KR100533448B1 (ko) | 민들레의 아그로박테리움-매개 형질전환 방법 | |
| WO2007064037A1 (ja) | サトイモ科植物の形質転換方法 | |
| JP2009523021A (ja) | 陽性選択に基づくヒマワリおよび脂肪種子の新規で効果的な形質転換法 | |
| KR100447921B1 (ko) | 참외 형질전환체의 제조방법 및 형질전환 참외 | |
| US20100251415A1 (en) | Composition and Method for Modulating Plant Transformation | |
| Koul | Cisgenics and Transgenics |