CZ20022139A3 - Regenerace a transformace cukrové řepy - Google Patents
Regenerace a transformace cukrové řepy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20022139A3 CZ20022139A3 CZ20022139A CZ20022139A CZ20022139A3 CZ 20022139 A3 CZ20022139 A3 CZ 20022139A3 CZ 20022139 A CZ20022139 A CZ 20022139A CZ 20022139 A CZ20022139 A CZ 20022139A CZ 20022139 A3 CZ20022139 A3 CZ 20022139A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- leaf
- sugar beet
- nucleic acid
- agrobacteria
- uterine
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 title claims abstract description 61
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 title claims abstract description 47
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title description 40
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 32
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 10
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- IRYMDURTWYFRBH-UHFFFAOYSA-N 2-(7h-purin-2-ylmethyl)aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1CC1=NC=C(NC=N2)C2=N1 IRYMDURTWYFRBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 claims description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims 2
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 59
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 4
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 4
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 description 3
- IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC(S(N)(=O)=O)=C(C)C=C1N IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N (3ar,7as)-2-(trichloromethylsulfanyl)-3a,4,7,7a-tetrahydroisoindole-1,3-dione Chemical compound C1C=CC[C@H]2C(=O)N(SC(Cl)(Cl)Cl)C(=O)[C@H]21 LDVVMCZRFWMZSG-OLQVQODUSA-N 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000005745 Captan Substances 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229940117949 captan Drugs 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- YREOLPGEVLLKMB-UHFFFAOYSA-N 3-methylpyridin-1-ium-2-amine bromide hydrate Chemical compound O.[Br-].Cc1ccc[nH+]c1N YREOLPGEVLLKMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 235000021533 Beta vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N Fenclonine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701484 Figwort mosaic virus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 240000009200 Macaranga tanarius Species 0.000 description 1
- 235000000487 Macaranga tanarius Nutrition 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N [(2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)[C@@]1(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DVKFVGVMPLXLKC-PUGXJXRHSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000019577 caloric intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N chlorsulfuron Chemical compound COC1=NC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)Cl)=N1 VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000012577 media supplement Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 microelements Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 101150072645 pea gene Proteins 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 description 1
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Seasonings (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká přípravy geneticky transformovaných rostlin cukrové řepy. Zejména se popisují způsoby a materiály pro transformaci rostlin cukrové řepy pomocí Agrobacterium tumefaciens zprostředkující přenos genů.
Dosavadní stav techniky
Sacharóza, obecně známá jako cukr, tvoří ve světovém měřítku asi 11 % kalorického příjmu lidí. Cukrová řepa (Beta vulgaris) je jedním ze dvou hlavních zemědělských zdrojů jedlého cukru. Přibližně 40 % světového zásobování cukrem je získáváno z cukrové řepy, s cukrovou třtinou jako dalším hlavním zemědělským zdrojem cukru, tvořícího téměř 60 %. Státy v Evropě a bývalém Sovětském svazu produkují téměř všechen svůj cukr z rostlin cukrové řepy. Ve Spojených státech přibližně 30 % spotřebovaného cukru je získáváno z cukrové řepy.
Rostliny cukrové řepy podléhají řadě patogenů a škůdců. Poškození viry, plísněmi, bakteriemi a hmyzem může značně snížit výtěžek a kvalitu sklizeného cukru. Zvýšení odolnosti k těmto faktorům pomocí klasických metod křížení bylo pomalé. Transformace rostlin cukrové řepy moderními technikami molekulární biologie je atraktivní, avšak cukrová řepa se donedávna ukazovala jako velmi odolná vůči transformaci.
Lindsey a Jones (Plant Cell Rep. 8: 71-74, 1989) popisují transformaci protoplastů cukrové řepy elektroporací.
Catlin (Plant Cell Rep. 9: 285-288, 1990) oznamují účinek antibiotik na inhibici indukce kalu a regeneraci rostlin z cotyledonů cukrové řepy. Zjistilo se, že vznik kalu je závislý na genotypu. Zjistilo se, že antibiotika inhibují tvorbu výhonků. Catlin navrhuje, že regenerace přes výpěstky z děloh, kombinovaná s antibiotickými skreeningovými protokoly by mohla být užitečná při selekci transformovaného kalu cukrové řepy.
Jacq a kol. (Plant Cell Rep. 12: 621-624, 1993) popisují účinky genotypu, acetosyringonu, trvání předkultury a společné kultury na transformaci cukrové řepy zprostředkovanou Agrobacteriem. Podděložní a děložní explantáty se vykrojily ze sazenic a pěstovaly se s Agrobacterii. Transformanty se kvantifikovaly histochemickými a fluorometrickými GUS testy. Transformované rostliny nebyly demonstrovány.
• · · · • · ·
· · ···· **·* *·· 9 9 9 9 · * * «·· ·· ·· ·· ·· ····
Halí a kol. (WO 95/10178) popisují způsob transformace protoplastů cukrové řepy postupem s polyethylenglykolem, následovaným selekcí a regenerací. Transformační frekvence byly mezi 2,5 x 10'5 a 6,1 x 1θΛ
Lindsey a Gallois (J. Exp. Botany, 41: 529-536, 1990) popisují transformaci cukrové řepy Agrobacteriem tumefaciens obsahujícím binární vektor. Řezy tkáně ze základů výhonků se očkovaly ponořením do suspenze bakterií v kapalině, indukovaly se s
6-aminobenzylpurinem, aby vznikly výhonky, a selektovaly podle antibiotické resistence. Výhonky se přenesly na médium indukující kořeny obsahující 1-naftalenoctovou kyselinu a kanamycin. Při regeneraci výhonků z tkáně listů se dosáhl malý nebo žádný úspěch.
Halí a kol. (Nátuře Biotechnol. 14: 1133-1138, 1996) popisují způsob generace transgenních rostlin cukrové řepy z protoplastů ochranných buněk průduchů. Transformace DNA polyethylenglykolem se provedla na protoplastech odvozených z ochranných buněk průduchů. Selekce transformantů se dosáhla podle odolnosti k bialaphosu. Stabilní transformační účinnosti protoplastů byly mezi 1,2 a 5,2 x 10'4. Protoplasty se regenerovaly do kalů a rostlin.
Hayakawa a kol. (Proč. Jap. Sugar Beet Technol. 36: 130-135, 1994) popisují způsob transformace cukrové řepy zprostředkovaný Agrobacterium. Semena se nechala vyklíčit a odstranily se dělohy. Dělohy rostly, dokud se neobjevily listy. Kousky listů se nařezaly a přenesly se na médium, aby se umožnila tvorba výhonků. Výhonky se použily k tvorbě explantátů, které se následovně transformovaly s Agrobacterium. Transformované explanty se nechaly tvořit výhonky a následně se zakořenily na vhodných médiích.
Fry a kol. (Poster, Gordon Research Conference on Plant Cell and Tissue Culture, 11.-16.června 1989) popisují transformaci a regeneraci explantátů děloh cukrové řepy očkovaných Agrobacteriem tumefaciens se zakotvenými exogenními sekvencemi nukleové kyseliny.
Přes řadu způsobů dostupných pro transformaci cukrové řepy existuje potřeba způsobu, který je účinnější, dává stálý zdroj rostlinného materiálu pro následné pokusy a zajišťuje alternativu k existujícím způsobům. Tento vynález používá explantátů listů při způsobu transformace zprostředkované Agrobacteriem, který umožňuje, aby se zbylý rostlinný materiál propagoval in vitro pro další transformační pokusy. Tento vynález zajišťuje zlepšené způsoby pro produkci transgenních rostlin cukrové řepy, aby získala žádané vlastnosti genetickým inženýrstvím.
Podstata vynálezu
Při úsilí vyvinout metody pro účinnou transformaci rostlin cukrové řepy byla objevena řada vynálezeckých kroků, které jsou velmi prospěšné ke zlepšení výsledků a pro experimentální jednoduchost.
V jednom aspektu tohoto vynálezu bylo zjištěno, že explantáty listů jsou prospěšné pro následnou transformaci a takové explantáty se snadno připravily z listů mikropropagovaných výhonků. Mikropropagované kultury umožňují vědci udržovat kontinuální kulturu, což významně snižuje čas pro přípravu transgenních rostlin cukrové řepy. Poněvadž se mikropropagované kultury snadno udržují, vědec nemusí klíčit semena pokaždé, když chce zahájit transformační proceduru. Mikropropagace je mimo to prospěšná při snížení nebo odstranění nežádoucích chimérních tkání.
Znaky a podrobnosti vynálezu budou zřejmější ve světle následujícího podrobného popisu vynálezu.
Tento vynález popisuje způsob pro účinnou transformaci rostlin cukrové řepy pomocí bakterií Agrobacterium tumefaciens jako činidla dodávajícího exogenní sekvenci nukleové kyseliny. Exogenní sekvence nukleové kyseliny je výhodně ve formě vektoru transformujícího rostlinu. V tomto vynálezu lze použít jakýkoliv vektor vhodný pro transformaci rostlin. Vhodný plasmid nebo vektor transformující rostliny typicky obsahuje markér, který lze vybrat nebo skreenovat, a spojené regulační prvky, jak je popsáno, spolu s jednou či více nukleovými kyselinami schopnými exprese v rostlině způsobem dostatečným, aby dodal zvláštní žádoucí rys nebo fenotyp rostlině. Příklady vhodných strukturních genů předvídaných tímto vynálezem by zahrnovaly, avšak nejsou na ně omezeny, geny tolerance vůči hmyzu nebo škůdcům (bakterie, houby, nematocidy), tolerance vůči herbicidům, geny pro zlepšení kvality, jako výtěžky, nutričních zlepšení, tolerancí vůči okolí nebo stresu, nebo jakékoliv žádoucí změny fysiologie rostlin, růstu, vývoje, morfologie, nebo rostlinných produktů.
Alternativně, kódující sekvence DNA mohou ovlivnit tyto fenotypy kódováním nepřeložitelné RNA molekuly, která způsobuje cílenou inhibici exprese endogenního genu, například přes mechanismy zprostředkované protisměrně nebo kosupresně (viz například Bird a kol. Gen. Engin. Rev. 9: 207, 1991). RNA by také mohla být katalytickou RNA molekulou (například ribozym) připravenou, aby štěpila žádaný endogenní mRNA produkt (viz například Gibson a Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125, 1997). Tedy jakýkoliv gen, který produkuje protein nebo mRNA, který exprimuje požadovanou změnu fenotypu nebo morfologie, je užitečný pro praxi tohoto vynálezu.
• · · · · · • ·
Příklady nukleových kyselin, které lze zavést metodami zamyšlenými tímto vynálezem, zahrnují například sekvence DNA nebo geny z jiných druhů, nebo geny nebo sekvence, které pocházejí nebo jsou přítomné ve stejném druhu, ale jsou vloženy do přijímajících buněk postupy genetického inženýrství spíše než klasickými technikami reprodukce nebo šlechtění. Avšak výraz exogenní je také zamýšlen, aby se týkal genů, které nejsou normálně přítomné v buňce, která se transformuje; nebo snad prostě nejsou přítomné ve formě, struktuře atd., jak se nacházejí v DNA segmentu nebo genu, který se transformuje; nebo geny, které jsou normálně přítomné, ale které si někdo přeje, aby například byly nadměrně exprimovány. Tedy výraz exogenní gen nebo DNA má znamenat každý gen nebo DNA segment, který je zaveden do přijímající buňky bez ohledu na to, zda podobný gen může být již přítomný v takové buňce. Typ DNA zahrnutý v exogenní DNA může zahrnovat DNA, která je již přítomná v buňce rostliny, DNA z jiné rostliny, DNA z jiného organismu nebo DNA generovanou externě, jako je sekvence DNA obsahující protismyslnou zprávu o genu nebo sekvence DNA kódující syntetickou nebo modifikovanou verzi genu.
Transformující vektory rostliny obecně obsahují jednu či více žádaných kódujících sekvencí nukleových kyselin pod transkripční kontrolou 5' a 3' regulačních sekvencí. Takové vektory obecně obsahují operativně spojené v sekvenci ve směru 5' k 3' sekvenci promotoru, která usměrňuje transkripci po směru strukturní sekvence nukleových kyselin v rostlině, případně 5' nepřeloženou vedoucí sekvenci, sekvenci nukleových kyselin, která kóduje daný protein, a 3' nepřeloženou oblast, která kóduje polyadenylační signál, který působí v rostlinných buňkách, aby ukončil transkripci a přidání polyadenylačních nukleotidů k 3' konci nRNA kódující protein. Promotor může být homologní nebo heterologní ke strukturní sekvenci nukleových kyselin. Typické 5' a 3' regulační sekvence zahrnují výchozí místo iniciace transkripce, místo pro vázání ribosomů, signál zpracovávající RNA, místo terminace transkripce anebo polyadenylační signál.
Transformující vektory rostliny také obecně obsahují markér, který lze vybrat nebo skreenovat. Exprese sekvence markéru, který lze vybrat nebo skreenovat vede k fenotypu, který umožňuje diferenciaci transgenních a netransgenních tkání cukrové řepy.
Jakýkoliv markér, který lze vybrat, vhodný pro transformaci rostlin, se může použít v tomto vynálezu. Příklady markérů, které lze vybrat, o kterých se uvádí, že v rostlinách fungují, zahrnují EPSPS (Klee a kol., Mol. Gen. Genet. 210(3): 437, 1987), neo5 mycinfosfotransferázu (Loopstra a kol., Plant Mol. Biol. 15(1): 1, 1990), hygromycinfosfotransferázu (Meijer a kol., Plant Mol. Biol. 16(5): 807, 1991), odolnost vůči methotrexátu (Irdani a kol., Plant Mol. Biol. 37(6): 1079, 1998), fosfinothricinacetyltransferázu (Shen a kol., J. Gen. Virol. 76: 965, 1995) a odolnost vůči chlorsulfuronu (Lee a kol., Plant Cell 2(5): 415, 1990). Markéry, které lze skreenovat, a o kterých se uvádí, že v rostlinách fungují, zahrnují GFP (Niwa a kol., Plant J. 18(4): 455, 1999), GUS (Suzuki a kol., Plant Cell.Physiol. 40(3): 289, 1999), CAT (Leisy a kol., Plant Mol. Biol. 14(1): 41, 1990) a luciferázu (Macknight a kol., Plant Mol. Biol. 27(3): 457, 1995). V některých případech kódující strukturní sekvence nukleových kyselin také působí jako sekvence markéru, který lze vybrat nebo skreenovat.
Ve světle tohoto popisu budou odborníkům zřejmé četné jiné možné geny markéru, který lze vybrat nebo skreenovat, regulační prvky a jiné požadované sekvence. Předcházející diskuse je tedy zamýšlena jako příkladná, a nikoliv vyčerpávající.
Jedno provedení vynálezu je zaměřeno na způsob přípravy transgenních buněk cukrové řepy. Způsob zahrnuje: výběr sazenice cukrové řepy, přičemž sazenice obsahuje děložní oblast a podděložní oblast; odstranění děložní oblasti a horní poloviny podděložní oblasti ze sazenice; styk děložní oblasti a horní poloviny podděložní oblasti s mikropropagačním médiem, aby vznikl mikropropagovaný výhonek; přičemž mikropropagovaný výhonek obsahuje alespoň jeden list nebo jeho část včetně listové báze nebo více listů; odstranění listu z mikropropagovaného výhonku oddělením listu u listové báze a styk explantátu listu u oblasti listové báze s Agrobacteria. List se může oddělit u listové báze před očkováním Agrobacteriem řadou metod, avšak výhodně se list odřízne u listové báze s použitím vhodného nástroje, jako je skalpel, a řezná plocha listu se uvede ve styk s kulturou Agrobacterium. Explantát se pěstuje spolu s Agrobacteria, kde Agrobacteria obsahují vektor, přičemž vektor obsahuje operativně spojený v orientaci 5' ke 3': promotor, který řídí transkripci strukturní sekvence nukleových kyselin v rostlině; strukturní sekvencí nukleových kyselin a 3' transkripční terminátor a po inkubaci s Agrobacteriem obsahuje infikovaný explantát listu transgenní buňku cukrové řepy.
Explantát listu obsahuje zde popsanou listovou bázi jako dolní část listu, kde se list stýká se základní oblastí explantátu (viz Obrázky 5 a 6 pro ilustraci mikropropagované kultury cukrové řepy). V tomto vynálezu lze použít jakýkoliv list obsahující listovou bázi. Celý list nebo jakákoliv jeho část obsahující listovou bázi se může použít. List se výhodně odřízne u listové báze a celý list obsahující základnu listu se použije pro transformační proces. Listová báze obsahuje spodní část listů, kde jsou listy připojeny k mikropropagovanému výhonku. Explantát listu tedy obsahuje jakýkoliv list nebo část listu, která obsahuje listovou bázi. Explantát listu podle toho může obsahovat, avšak není tím omezen, dolních 10 % listu, dolních 20 %, 50 % nebo celý list či jeho části, všechny obsahující listovou bázi. Mikropropagovaná kultura cukrové řepy obsahuje četné vrstvy listů, které jsou připojeny u listové báze. Podle toho lze použít list v kterékoliv vrstvě, včetně kteréhokoliv vnitřního nebo vnějšího listu obsahujícího listovou bázi (viz Obrázky 5 a 6). Výhodně se vybírají vnější listy, takže vnitřní vrstva zůstává nedotčena. Zbylé listy se mohou mikropropagovat nebo skladovat a pěstovat in vitro. Zbylé listy a nově vzniklé listy se mohou později použít jako zdroj explantátů pro budoucí pokusy.
Agrobacteria může být obecně kterákoliv Agrobacteria a výhodně je to Agrobacterium tumefaciens. Výhodné kmeny zahrnují, avšak nejsou na ně omezeny, Agrobacterium tumefaciens kmen C58, kmen nopalinového typu, který se používá ke zprostředkování přenosu DNA do buňky rostliny, kmen oktopinového typu, jako je LBA4404 nebo kmeny sukcinamopinového typu, například EHA101 či EHA105. Použiti těchto kmenů k transformaci rostlin bylo uváděno a metody jsou odborníkům známé. Strukturní sekvence nukleových kyselin může být transkribovatelná sekvence, která dodává rostlině žádané vlastnosti. Výhodně strukturní sekvence nukleových kyselin kóduje protein nebo antimédiátorovou RNA sekvenci.
Alternativní provedení je zaměřeno na způsoby přípravy transgenních buněk cukrové řepy z mikropropagované kultury. Mikropropagovaná kultura se pěstuje, aby tvořila mikropropagovaný výhonek, přičemž mikropropagovaný výhonek obsahuje alespoň jeden explantát listu včetně listové báze, odstranění listu u listové báze z mikropropagovaného výhonku; a styk explantátů listu u oblasti listové báze s Agrobacteria, kde Agrobacteria obsahuje vektor, který obsahuje operativně spojený v orientaci 5' ke 3': promotor, který řídí transkripci strukturní sekvence nukleových kyselin; strukturní sekvenci nukleových kyselin a 3' transkripční terminátor. Po inkubaci s Agrobacterium infikovaný explantát listu obsahuje transgenní buňku cukrové řepy. Agrobacteria může být obecně kterákoliv Agrobacteria a výhodně je to Agrobacterium tumefaciens. Strukturní sekvence nukleových kyselin může být kterákoliv transkribovatelná sekvence, která dodává rostlině žádané vlastnosti. Výhodně strukturní sekvence nukleových kyselin kóduje protein nebo antimédiátorovou RNA sekvenci.
• » · ·
Vynález je také zaměřen na způsoby přípravy transgenních rostlin cukrové řepy. Způsoby výhodně zahrnují výběr sazenic cukrové řepy, přičemž sazenice obsahují děložní oblast a podděložní oblast; odstranění děložní oblasti a horní poloviny podděložní oblasti ze sazenice; styk děložní oblasti a horní poloviny podděložní oblasti s mikropropagačním médiem, aby vznikl mikropropagovaný výhonek, přičemž mikropropagovaný výhonek obsahuje alespoň jeden list obsahující listovou bázi, odstranění listu z mikropropagovaného výhonku u listové báze a styk listu v oblasti listové báze s Agrobacteria, aby se vytvořil infikovaný list, kde Agrobactería obsahují vektor, který obsahuje operativně spojený v orientaci 5' ke 3'; promotor, který řídí transkripci strukturní sekvence nukleových kyselin; strukturní sekvenci nukleových kyselin a 3' transkripční terminátor; kultivaci infikovaného explantátu listu, aby se vytvořil transgenní výhonek; kultivaci transgenniho výhonku, aby se vytvořil transgenní zakořeněný výhonek; a růst transgenniho zakořeněného výhonu, aby se vytvořila transgenní rostlina cukrové řepy. Agrobacteria mohou být obecně kterákoliv Agrobacteria a výhodně je to Agrobacterium tumefaciens. Strukturní sekvence nukleových kyselin může být kterákoliv transkribovatelná sekvence, která dodává rostlině žádané vlastnosti. Výhodně strukturní sekvence nukleových kyselin kóduje protein nebo antimédiátorovou RNA sekvenci, Semena cukrové řepy se mohou sterilovat jakoukoliv přijatelnou metodou a výhodně stykem semena cukrové řepy s hydroxidem sodným, chlornanem sodným, ethanolem nebo kaptanem. Semena cukrové řepy výhodně klíčí v temnu nebo při slabém světle. Mikropropagačním médiem může být obecně kterékoliv mikropropagační médium, které je v oboru přijímané. Příklady vhodných médií by zahrnovaly, ale nejsou omezeny na média založená na MS (Murashige a Skoog Physiol. Plant. 15:473, 1962) nebo média založená na N6 (Chu a kol., Scientia Sinica, 18: 659, 1975) doplněná additivy média, která mohou zahrnovat, ale nejsou na ně omezeny, aminokyseliny, makroelementy, železo, mikroelementy, vitamíny a organické látky, uhlovodíky, nedefinované složky média, jako jsou hydrolyzáty kaseinu, vhodné želatinizující činidlo, jako je forma agaru, jako je agaróza s nízkým bodem tání nebo Gelrite, pokud je to žádoucí. Odborníci znají různá tkáňová kultivační média, která, když se vhodně doplní, podporují růst a rozvoj tkání rostlin a jsou vhodná pro transformaci a regeneraci rostlin. Tato tkáňová kultivační média se buď mohou získat jako komerční preparáty nebo se mohou připravit a modifikovat dle potřeby. Vybraná média se mohou doplnit vhodnými additivy v závislosti na stupni procesu transformace. Například pro mikropropagaci se může použít médium zde označované jako mikropropagační médium, které podporuje růst a udržení tkání rostlin in vitro. Také v jiných stupních procesu transformace, včetně, ne však pouze, klíčení, indukce výhonků a indukce kořenů, se používají média doplněná vhodnými additivy a mohou zahrnovat, ale nejsou na ně omezeny, média jako Linsmaier a Skoog (Linsmaier a Skoog, Physiol. Plant 18: 100, 1965), Uchimiya a Murashige (Uchimiya a Murashige, Plant Physiol. 54: 936, 1974), Gamborgovo médium (Gamborg a kol., Exp. Cell Res., 50: 151, 1968), McCown's Woody Plant Média (McCown a Loyd, Hort. Science, 16: 453, 1981), Nitsch a Nitsch (Nitsch a Nitsch, Science, 163: 85-87, 1969) a Schenk a Hildebrandt (Schenk a Hildebrandt, Can. J. Bot. 50:166, 1972) nebo obměny těchto médií vhodně doplněné. Odborníci jsou si vědomi, že média a doplňky médií jako živiny a regulátory růstu pro použití v různých stupních udržování rostlin a v různých stupních transformace a regenerace vedle jiných podmínek kultivace, jako je intenzita světla během inkubace, pH a teplota inkubace, se mohou optimalizovat pro danou varietu rostlin.
Následující experimentální protokol osvětluje vynález. Běžný odborník ocení, že lze provést různé modifikace materiálů, médií, trvání procesů, teploty a podmínek osvětlení, aniž by se odchýlilo od vynálezu.
Sterilizace semen
Semena se mohou sterilizovat jakoukoliv přijatelnou metodou. Zjistilo se, že následující způsob je účinný.
Semena cukrové řepy se dají do roztoku hydroxidu sodného obsahujícího asi 1N hydroxid sodný a míchají se asi jednu hodinu při teplotě místnosti. Kapalina se dekantuje a semena se opláchnou destilovanou vodou, aby se odstranil zbylý hydroxid sodný. Přidá se studená voda a semena se míchají asi jednu hodinu. Semena se z kapaliny vyjmou a malá část povlaku semene se odstraní z každého zárodku, aby se část zárodku semena exponovala. Semena se krátce opláchnou 95% ethanolem. Roztok ethanolu se dekantuje a semena se míchají asi dvacet minut ve zředěném roztoku (2,5 % hmotn./obj.) chlornanu sodného. Kapalina se odstraní a semena se opláchnou třikrát sterilní destilovanou vodou. Přidají se kaptan (smáčivý prášek používaný jako vodný roztok ke kontrole jistých plísňových onemocněni, Micro Flo Co., Lakeland, FL) a malé množství sterilní vody, které stačí k zakrytí semen. Semena se nasáknou alespoň jednu hodinu. Nasakování může pokračovat přes noc, pokud je to žádoucí.
Klíčení semen
Semena mohou klíčit jakoukoliv přijatelnou metodou. Zjistilo se, že následující způsob je výhodný. Jiné formulace médií, včetně, avšak ne pouze, těch popsaných dříve, mohou být vhodné pro podporu klíčení místo formulací médií popsaných níže.
Semena se přenesou z kaptanové suspenze na destičky obsahující MSMO médium (Tabulka 1). Přibližně 15 semen se dá na každou 100 x 25 mm destičku ke klíčení. Destičky se dají do pytlíků, výhodně do plastikových sáčků bez děr. Výhodně semena klíčí v temnu a sáčky se dají do temna při asi 20°C až 25°C, výhodně při asi 23°C až 24°C. Inkubaci v temnu lze provádět jakýmkoliv způsobem, včetně, ne však pouze, umístění sáčků v uzavřené lepenkové krabici. Optimální délka uložení v temnu se mění podle genotypu cukrové řepy, avšak bude typicky mezi dvěma a čtyřmi týdny. Povlak semene se odstraní z vyklíčených sazenic a sazenice se pak přenesou do nádob obsahujících MSMO médium. Sazenice se inkubují při asi 23°C až 24°C asi 1-5 dní, výhodně asi 2 dny. Fotoperioda během inkubace se udržuje při cyklu světlo:tma asi 16:8.
Tabulka 1 MSMO médium
| Složka | Koncentrace |
| MSMO soli (Sigma M-6899) | 4,4 g/l |
| sacharóza | 30 g/l |
| Phytagar | 7 g/l |
Iniciace a udržování kultur mikropropagovaných výhonků
Mikropropagované kultury výhonků se mohou iniciovat jakoukoliv přijatelnou metodou. Zjistilo se, že následující způsob je výhodný v laboratoři. Jiné formulace médií popsané dříve mohou být vhodné pro iniciaci kultur mikropropagovaných výhonků místo formulací médií popsaných níže.
Dolní polovina podděložní oblasti se opatrně odstraní z vyklíčených sazenic. Část sazenic obsahující dělohy a horní část poddělohy se přenese do MSMO média obsahujícího 0,1 mg/l 6-benzylaminopurinu. Po 3 týdnech inkubace s osvětlením jako shora se výhonky přenesou do čerstvého média. Po dalších 3 týdnech se listy mohou použít pro transformaci. Výhodně se použijí vnější listy a nejvnitřnější listy se použijí pro udržování tkáně in vitro. Pro udržování mikropropagovaných kultur poté, co se listy odstraní pro následující transformaci, se přenese do čerstvého média vrcholová a nejvnitřnější oblast listu (obecně asi 0,5-3,0 cm), aby se udržovala kultura mikropropago• ·
váných výhonků (viz Obrázky 5 a 6). Obrázek 5 znázorňuje pohled shora na mikropropagovanou kulturu cukrové řepy. Obrázek 6 znázorňuje pohled z boku, který ukazuje vnější listy, vnitřní listy, oblast listové báze a oblast řezu nebo zranění, kde se listy odejmou z listové báze. Mikropropagované kultury cukrové řepy se výhodně přenesou do čerstvého média alespoň jednou za měsíc, aby se udržovaly zdravé kultury a pohotový zdroj tkání pro transformaci. Udržováním tkání cukrové řepy tímto způsobem je stále k dispozici vhodný materiál explantátu pro transformaci bez nutnosti iniciovat kultury ze semen, což uspoří alespoň jeden měsíc procesu.
Příprava bakteriálních kultur
Bakteriální kultury se mohou připravit jakoukoliv přijatelnou metodou. Zjistilo se, že následující způsob je výhodný v laboratoři. Jiné formulace médií mohou být vhodné pro přípravu bakteriálních kultur místo formulací médií popsaných níže. Může být použit jakýkoliv kmen Agrobacterium, který je vhodný pro způsoby podle vynálezu, a výhodný je Agrobacterium tumefaciens. Způsoby růstu a udržování kultur Agrobacterium jsou odborníkům známy.
Agrobacterium tumefaciens obsahující exogenní sekvenci DNA, která se má přenést do cukrové řepy, se typicky pěstují na LB médiu obsahujícím selektivní antibiotika (viz například LBsck médium obohacené spektinomycinem, chloramfenikolem a kanamycinem, Tabulka 2). Bakterie se pěstují při teplotě místnosti asi dva až tři dny. Bakterie se použijí pro iniciaci kapalných kultur v LBsck dva dny před transformací, aby se dosáhla vhodná hustota buněk. Bakterie se zředí asi lOOkrát do ABsck (Tabulka 3) nebo YEP (Tabulka 4) média. Na kulturu se použije asi 2 ml média, ačkoliv odborník ví, že změny v měřítku kultury nebudou mít významný vliv na růst bakterií. Kultury se ponechají inkubovat přes noc v orbitální třepačce. Kultury bakterií se zředí asi 12,5krát do ABsck média nebo do ABsck média obohaceného 200 μΜ acetosyringonu, výhodně na celkový objem asi 50 ml. Kultury se dají do orbitální třepačky a inkubují se přes noc asi při 26 °C. Kultura se sleduje, dokud nedosáhne hustota buněk asi 3,0 x 109 buněk/ml, což odpovídá OD60o asi 1. Objem se upraví TXD médiem (Tabulka 5), aby se dostala hustota buněk asi 1,0 x 109 buněk/ml.
Tabulka 2: LBsck médium
| Složka | Koncentrace |
| Pepton | 10 g/l |
| Extrakt z kvasnic | 5 g/l |
| Chlorid sodný | 5 g/l |
| Difco bacto agar | 15 g/l |
| Spektinomycin | 100 mg/l |
| Chloramfenikol | 25 mg/l |
| Kanamycin | 50 mg/l |
Tabulka 3: ABsck médium
| Složka | Koncentrace |
| Glukóza | 5 g/l |
| Phytagar | 7,5 g/l |
| AB soli | 25 ml/l |
| AB pufr | 25 ml/l |
| Spektinomycin | 0,1 mg/l |
| Chloramfenikol | 0,025 mg/l |
| Kanamycin | 0,05 mg/l |
AB soli (500 ml): 10 g NH4CI, 12,5 g MgSO4.7H2O, 1,5 g KCI, 0,1 g CaCI2 nebo 0,132 g CaCI2.2H2O, 25 mg FeSO4 nebo 45,55 mg FeSO4.7H2O.
AB pufr (500 ml): 39,33 g K2HPO4.3H2O nebo 30,0 g K2HPO4, 11,5 g NaH2PO4.2H2O.
Tabulka 4: YEP médium
| Složka | Koncentrace |
| Extrakt z kvasnic | 10 g/l |
| Pepton | 10 g/l |
| Chlorid sodný | 5 g/l |
| pH = 7 |
Tabulka 5: TXD médium
| Složka | Koncentrace |
| MS soli s vitaminy B5 (Sigma M-6899) | 4,4 g/l |
| PCPA | 4 mg/l |
| Kinetin | 5 pg/l |
| Sacharóza | 30 g/l |
| pH upraveno na 5,8 |
Příprava destiček pro směsné kultury
Destičky pro směsné kultury se mohou připravit s použitím jakékoliv formulace médií. Formulace médií jiné než ty, které jsou popsány níže, mohou být vhodné.
• ·
Nalijí se destičky obsahující 1/10 MS médium (Tabulka 6), s výhodou obohacené 200μΜ acetosyringonem a 1mM galakturonovou kyselinou. Acetosyringon a galakturonová kyselina se přidají k MS médiu po autoklávování. Sterilní filtrační papír se dá navrch pevného média a zvlhčí se TXD médiem před použitím s explantáty.
Tabulka 6: MS médium
| Složka | Koncentrace |
| MS soli (Sigma) | 4,4 g/l |
| Sacharóza | 30 g/l |
| SB vitamín #1 | 2 ml/l |
| SB vitamín #2 | 1 ml/l |
| pH = 5,95 |
Explantování listové báze
Explantování lze provést jakoukoliv přijatelnou metodou. Zjistilo se, že následující způsob je účinný. Jiné formulace médií popsané dříve mohou být vhodné pro explantování místo formulací médií popsaných níže.
Listy z mikropropagovaných výhonků se vyříznou a přenesou se na Petriho misku obsahující sterilní filtrační papír zvlhčený TXD médiem. Listy z kterékoliv části mikropropagovaného výhonku se mohou použít v tomto vynálezu. Tedy kterýkoliv vnitřní nebo vnější list se může použít pro následnou transformaci. Výhodně se používají vnější listy. List se skládá z listové čepele a listové báze a může se odříznout jakýmkoliv způsobem. S výhodou se listy odstraní odříznutím u základny listu (viz Obrázek 6), takže list je primárně nedotčený a řezné místo je u základny listu. Po odříznutí asi 25 listů z mikropropagovaných výhonků se explantáty přenesou do zředěné bakteriální kultury a inkubují se. Inkubace explantátů listů s Agrobacterium může trvat jakkoliv dlouhou dobu. Výhodně je doba inkubace s Agrobacterium až šedesát minut, výhodněji asi patnáct až dvacet minut, a inkubace se provádí způsobem, který vystavuje řezné místo kultuře Agrobacterium. Výhodně je spodní řezné místo explantátů listu u listové báze ve styku s kulturou Agrobacterium. Explantáty se přenesou z bakteriální kultury, dají se na sterilní filtrační papír, jako je sterilní Whatman filtrační papír a přenesou se na destičky pro směsné kultury.
Doba směsného kultivování může trvat jakkoliv dlouhou dobu. Výhodně je doba směsného kultivování až pět dnů. Výhodněji je doba směsného kultivování od dvou do pěti dnů. Ještě výhodněji je doba směsného kultivování čtyři dny. Destičky se směsnou • · · · • · • · kulturou se dají do zatavených plastikových sáčků a inkubují se při asi 22 °C až 24 °C asi čtyři dny. Fotoperioda během inkubace se použije světlo:tma asi 16:8.
Listy z mikropropagovaných výhonků se případně mohou vyříznout, jak je popsané shora, a přenesou se přímo na destičky pro směsné kultury na před kultivační období přes noc při asi 22 °C až 24 °C před přidáním bakteriální kultury. Ačkoliv se dává přednost předkultivaci přes noc, předkultivace po alespoň šest hodin je také účinná. Po období předkultivace se explantáty infikují Agrobacteriem přidáním bakteriální suspenze přímo k explantátům na destičkách pro směsné kultury. Po inkubaci asi dvacet minut se bakterie mohou odstranit jakýmkoliv způsobem včetně odsátí a explantáty mohou zůstat na stejných destičkách po trvání období směsné kultivace.
Kultura a podmínky selekce
Explantáty se mohou kultivovat jakoukoliv přijatelnou metodou. Zjistilo se, že následující způsob je účinný. Jiné formulace médií popsané dříve mohou být vhodné pro kultivaci a selekci místo formulací médií popsaných níže.
Explantáty se přenesou ze destiček pro směsnou kultivaci do kultivačního média. Výhodně je kultivační médium založeno na MS médiu doplněném 0,5 mg/l benzylaminopurinu (BAP) nebo benzyladeninu (BA), 0,05 mg/l 1-naftalenoctové kyseliny, 500 mg/l karbenicillinu a 100 mg/l cetofaximu. Podmínky směsné kultivace se mohou měnit v závislosti na volitelném markéru. Pro selekci glyfosátu (N-fosfonomethylglycin) se infikované rostliny dají na zpožďovací médium bez přidání selektivního činidla glyfosátu. Délka zpožďovací periody bude závislá na použitém genotypu. Provedou se pokusy s každým genotypem, aby se stanovilo optimální trvání zpožďovací periody. Zpožďovací perioda se může vyskytovat typicky až po deset dnů. Výhodně je zpožďovací perioda bez selekce asi dva až sedm dnů. Ještě výhodněji je zpožďovací perioda bez selekce asi šest dnů při asi 24 °C, s výhodou v plastikových sáčcích s děrami. Provedou se pokusy s každým genotypem, aby se stanovila optimální hladina selekčního činidla. Pro selekci glyfosátu se infikované rostliny po zpožďovací periodě přenesou ze zpožďovacího média (bez glyfosátu) do média založeném na MS médiu doplněném 0,50 mg/l benzyladeninu, 0,05 mg/l 1-naftalenoctové kyseliny, 500 mg/l karbenicillinu, 100 mg/l cetofaximu a 0,05-0,10 mmol glyfosátu (výhodně asi 0,075 mmol glyfosátu). Explantáty se mohou kultivovat na selekčním médiu asi dva až čtyři týdny. Výhodně se explantáty kultivují asi tři týdny při asi 24 °C, s výhodou v plastikových sáčcích bez děr. Použije se fotoperioda pro kultivaci asi 16:8 světlo:tma. Explantáty se přenesou do stejného mé14 ·· ·· ·· ·· • * · · · · · · • · · · · · · dia obsahujícího vhodné selekční činidlo každé tři týdny. Obecně postačují dva až tři přenosy, aby se identifikovala transgenní rostlina.
Mikropropagační a zakořeňovací postupy
Mikropropagace a zakořeňování lze provádět jakoukoliv přijatelnou metodou. Zjistilo se, že následující způsob je účinný. Jiné formulace médií popsané dříve mohou být vhodné pro mikropropagaci a zakořeňování místo formulací médií popsaných níže.
Mikropropagace je prospěšná při snížení nebo odstranění nežádoucích chimérních tkání. Použití mikropropagace je zvláště prospěšné pro získání transgenních rostlin a šetří čas tím, že eliminuje nutnost získávat rostlinný materiál vycházeje ze semen.
Tkáně lze udržovat v řadě nádob pro tkáňové kultury, včetně, ne však pouze, Petriho misek nebo pohárů sundae.
Transformované výhonky se přenesou na mikropropagační médium obsahující médium založené na MS médiu doplněném 0,5 mg/l benzyladeninu, 500 mg/l karbenicillinu a 100 mg/l cetofaximu. Výhonky rostou a dělí se v tomto médiu, dokud se nezíská žádaný počet výhonků. Pro selekci glyfosátu lze s výhodou přidat do mikropropagačního média glyfosát, aby se napomohlo selekci klonovaného materiálu. Klonovaným materiálem, jak se zde používá, se míní, že celý výhonek se transformuje a neobsahuje žádný chimérní rostlinný materiál, který se skládá jak z transformované, tak netransformované tkáně. Jednotlivé výhonky se zakoření na 1/2 MS médiu doplněném 5 mg/l indolmáselné kyseliny, 100 mg/l cetofaximu a 500 mg/l karbenicillinu. Kořeny by se měly objevit asi za 4-12 týdnů. Zakořeněné výhonky se mohou přesadit do zeminy, výhodně Metro-Mix 350 (Metro-Mix je zapsaná ochranná známka Scotts Company, Marysville, OH).
Přehled obrázků na výkresech
Následující obrázky tvoří část tohoto popisu a jsou zahrnuty, aby dále demonstrovaly jisté aspekty tohoto vynálezu. Vynález lze lépe pochopit s odkazem na jeden nebo více výkresů v kombinaci s podrobným popisem zde uvedených specifických provedení.
| Obrázek | Popis |
| 1 | Mapa plasmidu pMON17303 |
| 2 | Mapa plasmidu pMON13819 |
| 3 | Mapa plasmidu pMON13835 |
| 4 | Mapa plasmidu pMON13851 |
| 5 | Pohled shora na mikropropagovanou kulturu cukrové řepy |
| 6 | Pohled z boku na mikropropagovanou kulturu cukrové řepy |
·· ·· • · · · • t ·
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady jsou zahrnuty, aby demonstrovaly výhodná provedení vynálezu. Odborníci by měli ocenit, že techniky popsané v příkladech, které následují, představují techniky objevené vynálezcem, které mají dobře fungovat v provádění vynálezu, a tedy se mohou považovat za výhodné způsoby pro jeho praxi. Avšak odborníci by měli ve světle tohoto popisu ocenit, že lze provést řadu změn ve specifických provedeních, která jsou popsána, a ještě získat stejný nebo podobný výsledek, aniž by došlo k odchýlení od ducha a rozsahu vynálezu.
Příklad 1
Konstrukty plasmidů
Všechny konstrukty popsané v příkladech jsou vektory transformace rostlin s dvojitým okrajem obsahující počátek replikace E. coli (ori322), široký rozsah hostitelského počátku replikace E. coli (ori-V) a kódující oblast (Spc/Str) pro Tn7 adenyltransferázu, což dodává odolnost vůči spektinomycinu a streptomycinu. Pro transformaci rostlin se použil hostitelský bakteriální kmen Agrobacterium tumefaciens kmen ABI. Promotor, kódující oblast a 3' terminátory jsou znázorněny v závorkách.
P-e35S je promotor pro 35S RNA z CaMV obsahující duplikaci oblasti -90 až 300, jak se popisuje v US patentu č. 5,424,200, P-FMV je promotor 35S z mozaikového viru Figwort, jak se popisuje v US patentu č. 5,378,619, P-aa-chit je promotor pro kyselou chitinázu z Arabinopsis, jak se popisuje v Samac a Shah (Plant Cell 3: 1063, 1991), AEPSPS/CTP2 je oblast transitního peptidu z Arabinopsis EPSPS (syntéza 5enopyruvyl-3-fosfoshikimové kyseliny), jak se popisuje v US patentu č. 5,633,435; CP4syn je kódující oblast pro CP4-EPSPS (syntetická sekvence), jak se popisuje v US patentu č. 5,633,435; fbp je kódující sekvence pro E. coli 1,6-bifosfatázu fruktózy, jak se popisuje v Hamilton a kol. (Nucleic Acids Pes. 16: 8707, 1988); glgC16 je gen E. coli pro gen ADP fosforylázy glukózy, jak se popisuje v US patentu č. 5,648,249; mz SPS je kódující oblast pro fosfát syntézu sacharózy kukuřice, jak se popisuje v US patentu č. 5,750,869; E9 3'je 3' konec genu hrachu E9 rbc, který má funkci polyadenylačního signálu; 7S je 3' terminační signál 7S zásobního proteinu semene sóji; GUS:1 je kódující sekvence pro gen beta-glukuronidázy z E. coli (Jefferson, R.A.,Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83:8447-8451, 1987) modifikovaný, aby obsahoval restrikční místo Ncol (CCATGG) ve výchozím kodonu.
• · · * ·· · · ·»··
Příklad 2
Transformace s ABI pMON 17303
Vnější listy se vyřízly přímo z mikropropagovaných výhonků cukrové řepy a použily se jako explantáty pro transformaci. Listy se odřízly u listové báze a inkubovaly se s Agrobacterium tak, že listová báze byla ve styku s kulturou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmen ABI obsahoval konstrukt pMON 17303 (P-e35S/mz SPS/E9 3', P-FMV/CP4syn/E9 3'; Obrázek 1) a metoda transformace byla stejná, jak je popsána v části Podstata vynálezu. Při transformaci tohoto konstruktu se nepoužila žádná předkultura. Selekce transformovaných buněk se provedla s použitím 0,075mM glyfosátu. Z 573 explantátů se získaly 3 transformované rostliny s transformační účinností 0,5 %.
Příklad 3
Transformace s konstruktem ABI pMON13819
Vnější listy se přímo vyřízly z mikropropagovaných výhonků cukrové řepy a použily se jako explantáty pro transformaci. Listy se odřízly u listové báze a inkubovaly se s Agrobacterium tak, že oblast listové báze byla ve styku s kulturou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmen ABI obsahoval konstrukt pMON 13819 (P-e35S/fbp/E9 3', P-FMV/CP4syn/E9 3'; Obrázek 2). Transformace a selekce se provedly stejně, jak je popsáno v příkladě 2 a v části Podstata vynálezu. Z 1875 explantátů se získalo 52 transformovaných rostlin s transformační účinností 3 %.
Příklad 4
Transformace s konstruktem ABI pMON 13835
Vnější listy se přímo vyřízly z mikropropagovaných výhonků cukrové řepy a použily se jako explantáty pro transformaci. Listy se odřízly u listové báze a inkubovaly se s Agrobacterium tak, že oblast listové báze byla ve styku s kulturou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmen ABI obsahoval konstrukt pMON13835 (P-e35S/mz SPS/E9 3', P-FMV/CP4syn/E9 3'; Obrázek 3). Transformace a selekce se provedly stejně, jak je popsáno v příkladě 2 a v části Podstata vynálezu. Z 2580 explantátů se získalo 12 transformovaných rostlin s transformační účinností 0,5 %.
Příklad 5
Transformace s konstruktem ABI pMON 13851
Vnější listy se přímo vyřízly z mikropropagovaných výhonků cukrové řepy a použily se jako explantáty pro transformaci. Listy se odřízly u listové báze a inkubovaly se s ·« ·· ·* ·· • «« · · ·· · • · »· · · · * ·» ··· · · • · * ··»» ··· ·«· ·· ·· ·· ·· ····
Agrobacterium tak, že oblast listové báze byla ve styku s kulturou Agrobacterium. Agrobacterium tumefaciens kmen ABI obsahoval konstrukt pMON13851 (P-e35S/mz SPS/E9 3'/P-FMV/CP4syn/E9 3’; Obrázek 4). Transformace a selekce se provedly stejně, jak je popsáno v příkladu 2 a v části Podstata vynálezu, navíc s krokem předkultivace přes noc, před stykem tkáně rostlin s Agrobacteria. Z 2890 explantátů se získalo 14 transformovaných rostlin s transformační účinností 0,5 %.
Všechny kompozice a způsoby zde popsané a nárokované lze udělat a provádět bez zbytečného experimentování ve světle tohoto popisu. Ačkoliv kompozice a způsoby tohoto vynálezu byly popsané ve smyslu výhodných provedení, odborníkům bude zřejmé, že se mohou uplatnit variace ke kompozicím a způsobům a krokům nebo pořadí kroků způsobů, aniž by došlo k odchýlení od konceptu, ducha a rozsahu vynálezu. Konkrétněji, bude zřejmé, že jistá činidla, která jsou jak chemicky, tak fyziologicky příbuzná, mohou nahradit činidla zde popsaná, přičemž se získají stejné nebo podobné výsledky. Všechny takové podobné substituce a modifikace zřejmé odborníkům, jsou zamýšleny za náležející do rozsahu ducha, rozsahu a konceptu vynálezu.
Claims (15)
1. Způsob přípravy transgenních buněk cukrové řepy, vyznačující se tím, že se vybere sazenice cukrové řepy, která obsahuje děložní oblast a podděložní oblast; děložní oblast a horní polovina podděložní oblasti se ze sazenice odstraní; děložní oblast a horní polovina podděložní oblasti se uvedou do styku s mikropropagačním médiem za vzniku mikropropagovaného výhonku, který obsahuje alespoň jeden list nebo jeho část včetně listové báze; list se z mikropropagovaného výhonku odstraní u listové báze; a explantát listu se uvede do styku s Agrobacteria u oblasti listové báze tak, aby vznikla tkáň, která obsahuje transgenní buňku cukrové řepy schopnou exprese exogenní sekvence nukleové kyseliny, kde Agrobacteria obsahuje vektor; a vektor obsahuje operativně spojený v orientaci 5' ke 3': promotor, který řídí transkripci exogenní strukturní sekvence nukleové kyseliny; exogenní strukturní sekvenci nukleové kyseliny; a 3' transkripční terminátor.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Agrobacteria je Agrobacterium tumefaciens.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že list nebo jeho část obsahuje vnější list.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že list nebo jeho část obsahuje vnitřní list.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že strukturní sekvence nukleové kyseliny kóduje protein nebo protismyslnou RNA sekvenci.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že list nebo jeho část se předkultivuje před stykem s Agrobacteria.
7. Způsob přípravy transgenních buněk cukrové řepy, vyznačující se tím, že se vybere sazenice cukrové řepy, která obsahuje děložní oblast a podděložní oblast; děložní oblast a horní polovina podděložní oblasti se ze sazenice odstraní; děložní oblast a horní polovina podděložní oblasti se uvedou do styku s mikropropagačním « ·»·» »· ·· ·* ·· Λ ·« · · · « · · · · · • * · · · · · · · « · « 1··· ··* *·· ·ι li ·* »♦ 0··· médiem, vzniku mikropropagovaného výhonku, který obsahuje alespoň jeden list nebo jeho část včetně listové báze; list se z mikropropagovaného výhonku odstraní u listové báze; listová báze se uvede do styku s Agrobacteria tak, aby vznikla tkáň obsahující transgenní buňku cukrové řepy; tkáň se kultivuje za vzniku transgenního výhonku, který se kultivuje za vzniku zakořeněného transgenního výhonku, který se nechá růst za vzniku transgenní rostliny cukrové řepy schopné exprese exogenní sekvence nukleové kyseliny, kde Agrobacteria obsahuje vektor, který obsahuje operativně spojený v orientaci 5' ke 3': promotor, který řídí transkripci exogenní strukturní sekvence nukleové kyseliny; exogenní strukturní sekvenci nukleové kyseliny; a 3' transkripční terminátor.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že list nebo jeho část obsahuje vnější list nebo jeho část.
9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že list nebo jeho část obsahuje vnitřní list nebo jeho část.
10. Způsob podle nároku, vyznačující se tím, že semeno cukrové řepy klíčí v temnu.
11. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že mikropropagační médium obsahuje MSMO médium a 0,1 mg/l 6-aminobenzylpurínu.
12. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že selekční činidlo obsahuje glyfosát.
13. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že Agrobacteria je Agrobacterium tumefaciens.
14. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že strukturní sekvence nukleové kyseliny kóduje protein nebo protismyslnou RNA sekvenci.
15. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že list nebo jeho část obsahující listovou bázi se předkultivuje před stykem s Agrobacteria.
Obr. 1
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16951299P | 1999-12-07 | 1999-12-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022139A3 true CZ20022139A3 (cs) | 2002-10-16 |
Family
ID=22616009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022139A CZ20022139A3 (cs) | 1999-12-07 | 2000-12-06 | Regenerace a transformace cukrové řepy |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20010042257A1 (cs) |
| EP (1) | EP1235921B1 (cs) |
| AT (1) | ATE356882T1 (cs) |
| AU (1) | AU2575701A (cs) |
| CA (1) | CA2395365A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20022139A3 (cs) |
| DE (1) | DE60033959T2 (cs) |
| DK (1) | DK1235921T3 (cs) |
| ES (1) | ES2281373T3 (cs) |
| PL (1) | PL356025A1 (cs) |
| PT (1) | PT1235921E (cs) |
| SK (1) | SK8042002A3 (cs) |
| WO (1) | WO2001042480A2 (cs) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3985474B2 (ja) * | 2001-07-24 | 2007-10-03 | 日本製紙株式会社 | 遺伝子導入効率を向上させたユーカリ属の植物への遺伝子導入方法 |
| US8097712B2 (en) | 2007-11-07 | 2012-01-17 | Beelogics Inc. | Compositions for conferring tolerance to viral disease in social insects, and the use thereof |
| WO2010002984A1 (en) | 2008-07-01 | 2010-01-07 | Monsanto Technology, Llc | Recombinant dna constructs and methods for modulating expression of a target gene |
| US8962584B2 (en) | 2009-10-14 | 2015-02-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem, Ltd. | Compositions for controlling Varroa mites in bees |
| CA2790211C (en) | 2010-03-08 | 2020-06-09 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delivering polynucleotides into plants |
| US8816153B2 (en) | 2010-08-27 | 2014-08-26 | Monsanto Technology Llc | Recombinant DNA constructs employing site-specific recombination |
| US9840715B1 (en) | 2011-09-13 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for delaying senescence and improving disease tolerance and yield in plants |
| MX361938B (es) | 2011-09-13 | 2018-12-19 | Monsanto Technology Llc | Métodos y composiciones para el control de malezas. |
| MX362810B (es) | 2011-09-13 | 2019-02-13 | Monsanto Technology Llc | Metodos y composiciones para controlar malezas. |
| AU2012308659B2 (en) | 2011-09-13 | 2017-05-04 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10760086B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-09-01 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| WO2013040057A1 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10829828B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-11-10 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US10806146B2 (en) | 2011-09-13 | 2020-10-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| US9920326B1 (en) | 2011-09-14 | 2018-03-20 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for increasing invertase activity in plants |
| AU2013264742B2 (en) | 2012-05-24 | 2018-10-04 | A.B. Seeds Ltd. | Compositions and methods for silencing gene expression |
| WO2014062989A2 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-24 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
| US20150307894A1 (en) | 2012-11-28 | 2015-10-29 | Monsanto Technology Llc | Transgenic Plants With Enhanced Traits |
| US10683505B2 (en) | 2013-01-01 | 2020-06-16 | Monsanto Technology Llc | Methods of introducing dsRNA to plant seeds for modulating gene expression |
| US10041068B2 (en) | 2013-01-01 | 2018-08-07 | A. B. Seeds Ltd. | Isolated dsRNA molecules and methods of using same for silencing target molecules of interest |
| US10000767B2 (en) | 2013-01-28 | 2018-06-19 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for plant pest control |
| US10609930B2 (en) | 2013-03-13 | 2020-04-07 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| EP2967082A4 (en) | 2013-03-13 | 2016-11-02 | Monsanto Technology Llc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR WEED CONTROL |
| US20140283211A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Monsanto Technology Llc | Methods and Compositions for Plant Pest Control |
| US10568328B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-02-25 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for weed control |
| EP3030663B1 (en) | 2013-07-19 | 2019-09-04 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for controlling leptinotarsa |
| US9850496B2 (en) | 2013-07-19 | 2017-12-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling Leptinotarsa |
| WO2015054106A1 (en) | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants with enhanced traits |
| EP3054765A4 (en) | 2013-10-09 | 2017-06-14 | Monsanto Technology LLC | Interfering with hd-zip transcription factor repression of gene expression to produce plants with enhanced traits |
| NZ719544A (en) | 2013-11-04 | 2022-09-30 | Beeologics Inc | Compositions and methods for controlling arthropod parasite and pest infestations |
| UA119253C2 (uk) | 2013-12-10 | 2019-05-27 | Біолоджикс, Інк. | Спосіб боротьби із вірусом у кліща varroa та у бджіл |
| BR112016016337A2 (pt) | 2014-01-15 | 2017-10-03 | Monsanto Technology Llc | Composição e métodos para controlar crescimento, desenvolvimento ou a capacidade de reprodução de uma planta, e para sensibilizar uma planta para um herbicida inibidor de epsps |
| WO2015153339A2 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling insect pests |
| EP3158067B1 (en) | 2014-06-23 | 2020-08-12 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for regulating gene expression via rna interference |
| EP3161138A4 (en) | 2014-06-25 | 2017-12-06 | Monsanto Technology LLC | Methods and compositions for delivering nucleic acids to plant cells and regulating gene expression |
| RU2754955C2 (ru) | 2014-07-29 | 2021-09-08 | Монсанто Текнолоджи Ллс | Композиции и способы борьбы с насекомыми-вредителями |
| WO2016118762A1 (en) | 2015-01-22 | 2016-07-28 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for controlling leptinotarsa |
| CN107750125A (zh) | 2015-06-02 | 2018-03-02 | 孟山都技术有限公司 | 用于将多核苷酸递送至植物中的组合物和方法 |
| AU2016270913A1 (en) | 2015-06-03 | 2018-01-04 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants |
| CN109475124B (zh) | 2015-08-27 | 2021-11-19 | 孟山都技术公司 | 新型昆虫抑制蛋白 |
| CN111118055A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-08 | 鲁东大学 | 高糖品种甜菜转基因体系的建立方法 |
| CA3206159A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Monsanto Technology Llc | Novel insect inhibitory proteins |
| UY39585A (es) | 2020-12-23 | 2022-07-29 | Monsanto Technology Llc | Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas |
| PE20240230A1 (es) | 2020-12-31 | 2024-02-16 | Monsanto Technology Llc | Novedosas proteinas inhibidoras de insectos |
| CA3232591A1 (en) | 2021-09-17 | 2023-03-23 | University Of Freiburg | Proteins for regulation of symbiotic infection and associated regulatory elements |
| US20230143932A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-05-11 | University Of Freiburg | Pin6 proteins for the formation of nodule-like structures |
| WO2023223268A1 (en) | 2022-05-19 | 2023-11-23 | Cambridge Enterprise Limited | Proteins for regulation of symbiotic nodule organ identity |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5034323A (en) * | 1989-03-30 | 1991-07-23 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
| GB9321183D0 (en) * | 1993-10-14 | 1993-12-01 | Zeneca Ltd | A method of plant transformation |
| US6204436B1 (en) * | 1997-10-31 | 2001-03-20 | Novartis Ag | Transgenic plants |
-
2000
- 2000-12-06 PL PL00356025A patent/PL356025A1/xx unknown
- 2000-12-06 PT PT00989221T patent/PT1235921E/pt unknown
- 2000-12-06 DK DK00989221T patent/DK1235921T3/da active
- 2000-12-06 ES ES00989221T patent/ES2281373T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 CZ CZ20022139A patent/CZ20022139A3/cs unknown
- 2000-12-06 EP EP00989221A patent/EP1235921B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 SK SK804-2002A patent/SK8042002A3/sk unknown
- 2000-12-06 DE DE60033959T patent/DE60033959T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-06 US US09/731,210 patent/US20010042257A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-06 CA CA002395365A patent/CA2395365A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-06 AT AT00989221T patent/ATE356882T1/de active
- 2000-12-06 AU AU25757/01A patent/AU2575701A/en not_active Abandoned
- 2000-12-06 WO PCT/US2000/033101 patent/WO2001042480A2/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2281373T3 (es) | 2007-10-01 |
| PT1235921E (pt) | 2007-06-19 |
| ATE356882T1 (de) | 2007-04-15 |
| US20010042257A1 (en) | 2001-11-15 |
| EP1235921A2 (en) | 2002-09-04 |
| DE60033959D1 (de) | 2007-04-26 |
| CA2395365A1 (en) | 2001-06-14 |
| WO2001042480A2 (en) | 2001-06-14 |
| DK1235921T3 (da) | 2007-04-23 |
| PL356025A1 (en) | 2004-05-31 |
| SK8042002A3 (en) | 2003-02-04 |
| WO2001042480A3 (en) | 2002-01-03 |
| AU2575701A (en) | 2001-06-18 |
| DE60033959T2 (de) | 2007-11-22 |
| EP1235921B1 (en) | 2007-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1235921B1 (en) | Sugarbeet regeneration and transformation | |
| JP4744512B2 (ja) | ダイズの改良された形質転換法 | |
| US20120192318A1 (en) | Transformation system for Camelina sativa | |
| AU2848800A (en) | Soybean transformation method | |
| Thu et al. | In vitro regeneration and transformation of pigeonpea [Cajanus cajan (L.) Millsp] | |
| JPH0216986A (ja) | トランスジェニック植物の作製方法 | |
| WO2008112267A2 (en) | Transformation of immature soybean seeds through organogenesis | |
| NZ537237A (en) | Method of transforming soybean using agrobacterium | |
| KR101497774B1 (ko) | 형질전환 동안 ｂｂｍ의 유도를 통해 가임 식물을 제공하는 방법 | |
| EP0249432A2 (en) | Transformation and foreign gene expression with plant species | |
| US6255559B1 (en) | Methods for producing genetically modified plants, genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby | |
| US6133035A (en) | Method of genetically transforming banana plants | |
| Ibrahim et al. | Highly efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of elite Egyptian barley cultivars | |
| Pawar et al. | Effect of explants, bacterial cell density and overgrowth-control antibiotics on transformation efficiency in tomato (Solanum lycopersicum L.) | |
| US7026529B2 (en) | Methods for Agrobacterium-mediated transformation of dandelion | |
| AU6127099A (en) | Methods for producing genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby | |
| US20040210958A1 (en) | A Novel Culture Method for Corn Transformation | |
| Wan et al. | Wheat (Triticum aestivum L.) | |
| WO2007064037A1 (ja) | サトイモ科植物の形質転換方法 | |
| KR100533448B1 (ko) | 민들레의 아그로박테리움-매개 형질전환 방법 | |
| US20100251415A1 (en) | Composition and Method for Modulating Plant Transformation | |
| WO2022079927A1 (ja) | 植物細胞の培養方法 |