ES2275297T3 - Proteinas de union a receptor 1 de interferon adn que las codifica y metodos para modular la respuesta celular a los interferones. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a receptor IFNAR1 que es capaz de ser inducida por IFN-a o por IFN-/3, y que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 8.

Description

Proteínas de unión a receptor 1 de interferón, ADN que las codifica y métodos para modular la respuesta celular a los interferones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a los mecanismos moleculares de la acción de interferón y, más específicamente, a nuevas proteínas de unión a receptor 1 interferón, a moléculas de ADN recombinante que las codifican, y a métodos para modular la respuesta celular al interferón.

Antecedentes de la invención

Los interferones de tipo I (subtipos IFN-\alpha y -\beta) producen efectos pleiotrópicos en las células, tales como la inhibición de la replicación vírica (efecto antiviral), la inhibición de la proliferación celular (efectos antitumorales), y la modulación de las actividades celulares inmunes (efectos inmunorreguladores). Estos efectos múltiples de los interferones (IFNs) se correlacionan con modificaciones morfológicas y bioquímicas de las células (Revel, 1984, para una revisión).

Los interferones ejercen sus actividades a través de receptores específicos de especie. Para los IFNs de tipo I se han identificado dos cadenas receptoras transmembranales: IFNAR1 (Uze y col., 1990) e IFNAR2-2 (o IFNAR2-c, Domanski y col., 1995). La transducción de la señal generada mediante IFN-\alpha, \beta, \omega, implica proteína tirosina quinasas de la familia de las quinasas Janus (Jak) y factores de transcripción de la familia Stat (Darnell y col., 1994). Las proteínas de los mecanismos Jak-Stat se activan mediante unión a los dominios intracitoplásmicos (IC) de las cadenas receptoras IFNAR1 e IFNAR2. Entre las proteínas que se unen al dominio IC de IFNAR1 están tyk2 y Stat2 (Abramovich y col., 1994). Entonces el Stat2 reclutaría Stat1 para formar el complejo de transcripción ISGF3 inducido por IFN que activa genes inducidos por IFN (Leung y col., 1995). Los complejos de transcripción que contienen Stat3 también son inducidos por IFN-\beta (Harroch y col., 1994) y se observó una unión dependiente de IFN de Stat3 a IFNAR1-IC (Yang y col., 1996). Proteína-tirosina fosfatasa PTP1C y D se asocian reversiblemente con IFNAR1 mediante adición de IFN (David y col., 1995a). Además, dos serina/treonina proteína quinasas, la quinasa ERK2 MAP de 48 kDa (David y col., 1995b) y proteína quinasa A activada por cAMP (David y col., 1996) se unen a los 50 residuos de IFNAR1-IC próximos a la membrana aislada. Por tanto, los dominios IC de receptor de IFN de tipo I sirven como posiciones de alojamiento para múltiples proteínas que sirven para generar y regular los efectos biológicos de los IFNs en las células.

La monitorización de dos híbridos en la levadura es un potente método para la identificación de nuevas proteínas que se unen a secuencias de polipéptido definidas (Fields y Song, 1989). En resumen, la monitorización de dos híbridos se lleva a cabo transfectando células de levadura con (a) un ADN de plásmido en el que se fusiona el polipéptido definido (cebo) con el dominio de unión de ADN del factor de transcripción Gal4, y con (b) una biblioteca de cADN fusionada al dominio de activación de Gal4 en el plásmido pACT. Las células de levadura transfectadas con un cADN que codifica una proteína que se une al cebo polipéptido reconstituirán a continuación la actividad de Gal4. La presencia de dicha proteína que se une al cebo polipéptido se revela mediante la expresión de una actividad enzimática, tal como \beta-galactosidasa, procedente de un constructo GAL1-lacZ que preferiblemente se introduce en el genoma de la levadura. Es posible aislar el plásmido pACT, a partir de clones de levadura que den positivo en este ensayo, para determinar la secuencia de nucleótidos de su injerto y para identificar la proteína que codifica. Este método ha posibilitado la identificación de nuevas proteínas que interaccionan con el dominio IC de los receptores de citoquina (Boldin y col., 1995). La cita de cualquier documento en la presente memoria no pretende ser una admisión de que dicho documento es pertinentemente técnica anterior, o que sea considerado materia para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier sentencia relativa al contenido o a la fecha de cualquier documento se basa en la información disponible para los solicitantes en el momento de la presentación, y no constituye una admisión de la corrección de dicha sentencia.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a dos proteínas humanas nuevas, denominadas en la presente memoria IR1B1 e IR1B4, que han sido identificadas como proteínas de unión del Receptor IFN 1 (IFNAR1), y al ADN que codifica dichas proteínas. Cada una de las proteínas IR1B1 e IR1B4 interacciona con el dominio intracitoplásmico (IC) de IFNAR1 y media en las respuestas celulares al interferón.

La presente invención está dirigida a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína IR1B1 o la IR1B4, o a fragmentos de la misma, así como a las proteínas codificadas por la misma. En las moléculas de ADN recombinantes, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína IR1B1 o la IR1B4, o sus fragmentos, está ligada operativamente a un promotor tanto con una orientación sentido como con una orientación anti-sentido.

Administrando directamente en tumores la molécula de ADN recombinante que contiene un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de unión de IFNAR1 en la orientación sentido, se potencia la respuesta a la terapia de interferón exógeno en el tratamiento del cáncer.

Adicionalmente, la presente invención también se refiere a un método para prolongar la supervivencia de injertos de tejido mediante la introducción de la molécula recombinante que contiene un promotor ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica una nueva proteína de unión a IFNAR1, o un fragmento suyo, en la orientación anti-sentido en el injerto de tejido antes de la aplicación del mismo al paciente.

Por tanto, la presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen dicho ADN, dicho ARN ó dicha proteína, y a los métodos terapéuticos para usarlos.

La presente invención también se refiere a anticuerpos específicos de las nuevas proteínas de la presente inven-
ción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la interacción de IR1B1 con el dominio IFNAR1-IC medida mediante el análisis en levadura de la interacción genética de dos híbridos. En la porción inferior recuadrada de la figura, se indica el injerto de cADN en pACT combinado con varios "cebos".

La Figura 2 muestra la interacción de IR1B4 con el dominio IFNAR1-IC medida mediante el análisis en levadura de la interacción genética de dos híbridos. En la porción inferior recuadrada de la figura, se indica el injerto de cADN en pACT combinado con varios "cebos".

La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la IR1B1.

La Figura 4 muestra la homología y el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de IR1B1 (SEQ ID NO: 2) con las secuencias de aminoácidos de dos proteínas de unión de calcio, calcineurina B (en abreviatura CALB; SEQ ID NO: 3) y caltractina (en abreviatura CATR; SEQ ID NO: 4). Los aminoácidos idénticos en IR1B1 y CALB o entre CALB y CATR se muestran mediante el símbolo "|" entre medias. La identidad entre IR1B1 y CATR, aunque no con CALB, se muestra mediante el símbolo ":" entre medias. Las regiones mostradas en negrita son los dominios de mano EF hélice-giro-hélice de unión de calcio.

La Figura 5 muestra manchas Northern de mARN de IR1B1 y de rARN de 18S (línea inferior) en células U266S de mieloma humano hibridadas con cADN de IR1B1, y la inducción rápida y temporal de IR1B1 tras el tratamiento de las células con IFN-\alpha8 o con IFN-\beta durante 2 horas o durante 18 horas. La primera línea es un control sin tratamiento con IFN tras 2 horas.

Las Figuras 6A y 6B son bandas de SDS-PAGE que muestran la interacción in vitro de IR1B4 con el dominio aislado IFNAR1-IC (Figura 6A) y con extractos celulares procedentes de membranas celulares humanas U266S y U266R (Figura 6B). En la Figura 6A, los productos de traducción marcados con metionina [^{35}S] con o sin tránscritos in vitro de IR1B4 fueron inmunoprecipitados (10 \muL) con gotas de M2 anti-bandera (bandas 1 y 4), o se hicieron reaccionar (50 \muL) con gotas de glutationa acopladas a GST fusionado al dominio IFNAR1-IC de 100 aminoácidos de longitud (bandas 2 y 5), o fueron acoplados únicamente a GST (bandas 3 y 6). Después de incubar durante una noche a 4ºC (volumen final 100 \muL), las gotas fueron lavadas y las proteínas eluidas con SDS fueron hervidas en condiciones reductoras antes de ser sometidas a SDS-PAGE. En la Figura 6B, se extrajeron células U266S (banda 1) o U266R (banda 2) con tampón Brij y antiproteasas (Abramovich y col., 1994) y se incubaron 0,35 mL (10^{7} células) con 75 \muL de productos de traducción marcados con metionina [^{35}S] de tránscritos de IR1B4 durante toda la noche a 4ºC. Se añadió mAb R3 anti-IFNAR1 inmovilizado sobre gotas de proteína G (25 \muL) durante 2,5 h, se lavó en tampón Brij y se eluyó con SDS, se llevó a ebullición y se analizaron las proteínas reducidas mediante SDS-PAGE. Se llevó a cabo un control con gotas anti-bandera M2 como el anterior (banda 3). Los geles secados fueron visualizados en un Phosphor-Imager. En las primeras tres bandas de la Figura 6A, no se añadió nada de mARN de IR1B4 a la reacción de traducción in vitro. En las segundas tres bandas de la Figura 6A, el mARN que codifica IR1B4 fusionado a la proteína bandera se tradujo en un sistema in vitro.

La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 8) de IR1B4.

La Figura 8 muestra el alineamiento de aminoácidos de IR1B4 (SEQ ID NO: 8) y de PRMT1 (SEQ ID NO: 9) y sus diferencias.

La Figura 9 muestra el alineamiento de aminoácidos de IR1B4 y de HCP-1 (SEQ ID NO: 10) y sus diferencias.

La Figura 10 muestra un ensayo de metiltransferasa. Se hizo reaccionar extracto de células U266S con gotas recubiertas con Proteína A y con anticuerpo anti-IFNAR1 (banda 1) o sólo con Proteína A (banda 2). Se midió la actividad de metiltransferasa marcando histonas con ^{14}C (metil)-S-adenosil-metionina y analizando la radiactividad de la banda de histonas mediante electroforesis sobre SDS-PAGE.

La Figura 11 muestra un ensayo de actividad de proteína-arginina metiltransferasa en células U266S. En la banda 1, la actividad de proteína-arginina metiltransferasa de células U266S humanas se midió mediante mutilación de péptido R1, que tiene la secuencia SEQ ID NO: 11. En la banda 2 se añadió un oligonucleótido antisentido de SEQ ID NO: 12, complementario a la secuencia de nucleótidos 12-33 alrededor del codón de iniciación del cADN de IR1B4. En la banda 3 se añadió el correspondiente oligonucleótido sentido. Se observa que el oligonucleótido antisentido inhibe sustancialmente la actividad de proteína-arginina metiltransferasa, mientras que el oligonucleótido sentido de control tiene poco efecto.

La Figura 12 es un gráfico que muestra la inhibición del crecimiento de células U266S humanas como respuesta al tratamiento de IFN-\beta en presencia o en ausencia del oligonucleótido anti-sentido usado en la Figura 11 (AS-1), del correspondiente oligonucleótido sentido (S-3) y de otro oligonucleótido anti-sentido dirigido al medio del cADN de IR1B4 (AS-2). La densidad celular se cuantificó mediante un ensayo de color con Azul de Alamar (véase el Ejemplo 7), y se calculó la reducción de la densidad celular en el porcentaje de pocillos de control no tratados, y se representó como inhibición del crecimiento.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de dos nuevas proteínas humanas que interactúan con el dominio intracitoplásmico (IC) de la cadena IFNAR1 del receptor de interferón de tipo 1 (IFN-\alpha, \beta ó \omega), y se designan en la presente memoria como Proteína de Unión a Receptor IFN 1 (IR1B1) y Proteína de Unión a Receptor IFN 4 (IRB1B4). La interacción de estas dos nuevas proteínas con IFNAR1 se demostró mediante un ensayo genético de dos híbridos en levadura en la que la transfección de la cepa informadora de levadura SFY526 (Bartel y col., 1993) con cADN de IR1B1 o de IR1B4 fusionado con el dominio de activación Gal4 dio como resultado actividad de \beta-galactosidasa, sólo cuando se usó como cebo el dominio IFNAR1-IC (fusionado con el dominio de unión de ADN Gal4).

La secuencia de cADN de IR1B1 codifica un polipéptido de 191 aminoácidos. La búsqueda por ordenador en bases de datos de secuencias reveló que el IR1B1 es una proteína nueva que muestra homología marcada, por ejemplo, posiciones de unión de calcio (manillas E-F), con las proteínas de unión de calcio, calcineurina \beta y caltractina. La calcineurina \beta (Guerini y col., 1989) es una subunidad de 19 kDa de una serina/treonina fosfatasa que desempeña un papel clave en la activación de la translocalización del factor de transcripción NFAT al núcleo de linfocitos T, y que se inhibida mediante fármacos inmunosupresivos tales como la ciclosporina. La caltractina (Lee y Huang, 1993), una proteína de 21 kDa, es una proteína asociada a citoesqueleto que se encuentra en centrosomas, y que está involucrada en el movimiento de cromosomas durante la mitosis, y de forma más general en los centros de organización de microtúbulos. Por tanto, la nueva proteína IR1B1 es un nuevo miembro de la familia de la calcineurina y de la caltractina de proteínas reguladas por calcio.

Sorprendentemente, se descubrió que el gen correspondiente a IR1B1 era activado rápidamente en células humanas mediante tratamiento con IFN. Por tanto, este es el primer ejemplo de una proteína de unión de calcio que es inducida por IFN. Puesto que los iones calcio regulan la morfología, la adhesión y la división celulares, la modulación de la actividad de IR1B1 en células podría afectar a la respuesta de células normales y malignas al IFN. El papel de IR1B1 en la mediación de la acción de IFN en células está apoyado por la interacción de IR1B1 con el dominio IC de una cadena receptora de IFN.

Aunque se descubrió que la IR1B4, como la IR1B1, es una nueva proteína determinada por las búsquedas con ordenador en bases de datos de secuencias, también se descubrió que la IR1B4 presenta una homología de secuencia con las enzimas que utilizan S-adenosil metionina para los residuos de arginina metilantes en las proteínas, y se designan como proteína arginina metiltransferasas (PRMT1; Kagan y Clarke, 1994; Lin y col., 1996). Se descubrió que la IR1B4 se unía directamente al dominio IC de IFNAR1 in vitro, y mediante mutilación de histonas se demostró la asociación constitutiva de la actividad PRMT con la cadena IFNAR del receptor IFN-\alpha, \beta, aislado a partir de células humanas. Cuando se añadieron oligodesoxinucleótidos anti-sentido procedentes de cADN de IR1B4 a cultivos celulares humanos, se observó un agotamiento de la actividad PRMT en el cultivo celular. Las células de mieloma humano tratadas de esta manera mostraron una respuesta mucho más reducida a IFN, medida a través de la inhibición del crecimiento. Por lo tanto, IR1B4/PRMT participa en el mecanismo mediante el cual el receptor de IFN provoca la inhibición del crecimiento en células tumorales, y también está involucrado en otras funciones del receptor de IFN. Los sustratos conocidos de PRMT incluyen un número de proteínas de unión de ARN y de ADN, y en concreto ribonucleoproteínas nucleares heterólogas (hnRNPs). Las hnRNPs están involucradas en el transporte de mARN desde el núcleo hasta el citoplasma, en la división alternativa del pre-mARN, y en los controles post-transcripcionales (Liu y Dreyfuss, 1995). Del mismo modo, el nuevo cADN y proteína humanos IR1B4/PRMT, que se descubrieron por su asociación con el receptor IFN, se pueden usar para modificar la respuesta de células humanas o animales al IFN.

Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la presente invención contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína IR1B1 o la IR1B4, o un fragmento de las mismas, y que puede ser usada para aumentar la respuesta celular al IFN mediante el aumento de la expresión de cADN de IR1B1 o de IR1B4 o para reducir la respuesta celular al IFN mediante un descenso de la expresión de las proteínas IR1B1 o IR1B4 con moléculas de ARN anti-sentido.

La expresión in vivo aumentada de cADN de IR1B1 o de IR1B4 sería útil en la terapia contra el cáncer en la que la respuesta celular aumentada al IFN daría como resultado un descenso del crecimiento celular maligno y una respuesta aumentada a la terapia de IFN exógeno. Para obtener una expresión in vivo aumentada de IR1B1 o de IR1B4 en la posición objetivo para una respuesta celular aumentada a IFN, se pueden inyectar vectores de expresión que contienen cADN de IR1B1 o de IR1B4 ligado operativamente en una orientación sentido a un promotor constitutivo fuerte directamente en la posición objetivo, tal como en tumores cerebrales o en nódulos tumorales metastáticos (por ejemplo, melanoma o cáncer de pecho).

Y a la inversa, la expresión in vivo disminuida de proteínas IR1B1 o IR1B4 sería útil para prolongar la supervivencia de injertos de tejido ya que el rechazo a dichos injertos por el hospedante está mediado por los antígenos de histocompatibilidad (MHC de clase I), cuya síntesis depende del estímulo de IFN. Si se introduce cADN de IR1B1 o de IR1B4, o de fragmentos de los mismos, transportados en un vector adecuado y ligados operativamente en una orientación anti-sentido a un promotor, en células del tejido que va a ser injertado, la expresión de ARN anti-sentido conduce a la degradación de mARN de IR1B1 o de IR1B4 (o de ARN sentido correspondiente a IR1B1/IR1B4) y al consiguiente descenso de los niveles celulares de proteína IR1B1 ó IR1B4.

El ARN anti-sentido se transcribe desde un promotor por encima ligado operativamente a una secuencia codificadora orientada en la dirección anti-sentido, es decir, opuesta a la dirección normal o sentido del ADN y a su ARN sentido transcrito (mARN). La expresión de ARN anti-sentido complementario al ARN sentido es una potente vía para regular la función biológica de las moléculas de ARN. A través de la formación de un dúplex estable entre el ARN sentido y el ARN anti-sentido, el tránscrito de ARN normal o sentido se vuelve inactivo e intraducible.

Las moléculas de ADN recombinante, como realizaciones de la presente invención, contienen el cADN de IR1B1 o de IR1B4, o fragmentos de los mismos, ligados operativamente a un promotor en una orientación sentido o anti-sentido. El término "promotor" pretende comprender una secuencia de ADN o de ARN de doble cadena que es capaz de unirse a polimerasa de ARN y de promover la transcripción de una secuencia de ácido nucleico "ligada operativamente". Por tanto, una secuencia de ADN estaría ligada operativamente a una secuencia de promotor si el promotor es capaz de efectuar la transcripción de la secuencia de ADN, independientemente de la orientación de la secuencia de ADN.

Los tipos de promotores usados para controlar la transcripción pueden ser cualquiera de los que son funcionales en las células hospedante/objetivo. Los ejemplos de promotores funcionales en células de mamífero incluyen el promotor temprano SV40, el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor de timidina quinasa de herpes simple (HSV), el promotor LTR de sarcoma de rous (RSV), el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV), el promotor LTR de virus tumoral mamario de ratón (MMTV), el promotor de interferón \beta, el promotor de proteína 70 de golpe de calor (hsp70), así como otros muchos bien conocidos en la técnica.

Un promotor ligado operativamente a cADN de IR1B1 o de IR1B4 en la orientación sentido para la expresión de proteína IR1B1 o IR1B4 preferiblemente es un promotor constitutivo fuerte. Esto permite un elevado nivel de IR1B1 o de IR1B4 independientemente de la presencia de mecanismos celulares endógenos para regular la expresión de IR1B1 o de IR1B4.

Del mismo modo, el promotor, que está ligado operativamente a cADN de IR1B1 o de IR1B4 en la orientación anti-sentido, preferiblemente es un promotor fuerte, tal como el promotor presente en el Virus de Epstein-Barr (EBV), que regula la región que permite niveles elevados de expresión de ARN anti-sentido (Deiss y Kimchi, 1991).

La secuencia anti-sentido preferiblemente sólo es expresable en las células hospedante/objetivo, que preferiblemente son células humanas y el ARN anti-sentido expresado debería ser estable (es decir, no sufrir una rápida degeneración). El ARN anti-sentido sólo debería hibridarse específicamente con el mARN sentido expresado en las células hospedante/objetivo, y formar una molécula de ARN de doble cadena estable que sea esencialmente no traducible. En otras palabras, el ARN anti-sentido expresado en las células hospedante/objetivo evita que el mARN sentido expresado sea traducido en proteínas IR1B1 o IR1B4. La secuencia anti-sentido transportada por vector puede portar la secuencia de cADN de IR1B1 o de IR1B4 completa o simplemente una porción de las mismas, siempre que la porción anti-sentido sea capaz de hibridarse con mARN sentido y de evitar su traducción en proteína IR1B1 o IR1B4. Del mismo modo, una secuencia "anti-sentido", tal como se usa a lo largo de la especificación y de las reivindicaciones, se define como la secuencia anti-sentido completa, o una porción de la misma, que es capaz de ser expresada en células transformadas/transfectadas, y que también es capaz de hibridarse específicamente con mARN "sentido" de IR1B1 o de IR1B4 para formar un molécula de ARN de doble cadena no traducible.

La secuencia anti-sentido no necesita hibridarse con todo el mARN completo de IR1B1 o de IR1B4. En su lugar, se puede hibridar con regiones seleccionadas, tales como la secuencia 5' no codificadora sin traducir, la secuencia codificadora, o la secuencia 3' sin traducir del mARN "sentido". Preferiblemente, la secuencia anti-sentido se hibrida con la secuencia 5' codificadora y/o con la región 5' no codificadora, tal como en las posiciones de codón de iniciación y de tapa, puesto que se ha observado con muchos ejemplos de oligonucleótidos anti-sentido que dirigirse al codón de iniciación es más efectivo, mientras que dirigirse a secuencias internas dentro de la región de codificación no es tan efectivo (Wickstrom, 1991). La eficacia de una secuencia anti-sentido para evitar la traducción de mARN sentido de IR1B4 puede evaluarse fácilmente en un ensayo de determinación de la actividad de proteína-arginina metiltransferasa en células U266S tal como se describe en el Ejemplo 7. En vista del tamaño del genoma de mamíferos, la secuencia anti-sentido de IR1B1 o de IR1B4 preferiblemente presenta una longitud de al menos 17 pares base, más preferiblemente de al menos 30 pares base. Sin embargo, cadenas cortas también pueden seguir siendo útiles, es decir, o no se hibridan fortuitamente con otras secuencias de mamífero, o dicha "hibridación cruzada" no interfiere con el metabolismo de la célula de un modo y un grado que evite el cumplimiento de los objetivos de esta invención.

Tanto el objetivo de hibridación preferido como la longitud preferida de la secuencia anti-sentido se determinan fácilmente mediante un experimento sistemático. Se pueden usar métodos estándar como los descritos en Ausubel y col., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., Nueva Cork, N.Y., 1987-1996, y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), para eliminar sistemáticamente del vector una porción cada vez mayor de la secuencia anti-sentido. Además de la secuencia anti-sentido de longitud completa, se puede generar una serie de eliminaciones escalonadas, preferiblemente en el extremo 5' de la secuencia anti-sentido. Esto crea un conjunto de secuencias anti-sentido truncadas que todavía permanecen complementarias preferiblemente al extremo 5' del mARN sentido, y como resultado, todavía forman una molécula de ARN que es de doble cadena en el extremo 5' del mARN sentido (complementa el extremo 3' de un ARN anti-sentido) y permanece intraducible. Además, los oligonucleótidos anti-sentido, tales como los oligonucleótidos AS-1 (SEQ ID NO: 12), pueden sintetizarse químicamente fácilmente y ser introducidos en un vector con enlace operativo con un promotor para su uso en la disminución de la expresión celular in vivo de proteína IR1B1 o IR1B4.

Los vectores de la presente invención pueden ser cualquier vector eucariótico o procariótico adecuado usado normalmente para transfectar células de mamífero, tal como vectores episomales, reproducibles o cromosomalmente integrables bien conocidos en la técnica. Un vector particularmente preferido para la expresión de ARN anti-sentido de IR1B1 o de IR1B4 es el plásmido episomal que contiene la región reguladora del Virus de Epstein-Barr (Deiss y Kimchi, 1991) para servir como el promotor que está ligado operativamente al cADN de IR1B1 o de IR1B4 dispuesto en una orientación anti-sentido en relación con esta región de regulación. El uso de vectores anti-sentido y de fosforotioatos de oligonucleótido se describe en Annals of the New York Academy of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, eds. B.E. Huber y J.S. Lazo, Vol. 716, 1994 (por ejemplo, Milligan y col., pág. 228-241).

De acuerdo con la presente invención, la supervivencia de los tejidos u órganos injertados a un paciente que necesite de dicho injerto se puede prolongar disminuyendo la respuesta celular a IFN. El rechazo de tejido injertado está mediado por los antígenos de histocompatibilidad, siendo la síntesis de dichos antígenos de MHC de clase I dependiente de estímulo de IFN. Por tanto, un descenso en la respuesta celular al estímulo de IFN prolongará la supervivencia del tejido injertado. El método para prolongar el injerto de tejido de acuerdo con la presente invención incluye la introducción en las células de un tejido u órgano que va a ser injertado en un paciente de una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de cADN de IR1B1 o de IR1B4, o de un fragmento de los mismas, ligada operativamente a un promotor en la orientación anti-sentido, mediante la cual se expresa el ARN anti-sentido de IR1B1 o de IR1B4 en dichas células transfectadas/transformadas. La molécula de ADN recombinante se puede introducir en las células de un tejido u órgano mediante cualquier modo conocido en la técnica que sea adecuado para este propósito. Después de la introducción de la molécula de ADN recombinante en las células del tejido u órgano, el tejido u órgano puede ser injertado en el paciente que necesite dicho injerto.

Se puede inyectar una composición farmacéutica que contiene una molécula de ADN recombinante, que es un vector de expresión y que porta cADN de IR1B1 o de IR1B4 ligado operativamente a un promotor en una orientación sentido, directamente en tumores, por ejemplo, tumores cerebrales y tumores metastáticos, para hacer que las células de estos tumores sean más sensibles a la terapia de IFN exógeno como tratamiento contra el cáncer. La respuesta celular aumentada a la terapia de IFN exógeno conduciría a una inhibición de crecimiento celular maligno.

La transferencia génica in vivo o ex vivo se conoce bien, por ejemplo, en Annals of the New York Academy of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, Vol. 716, 1994; véase, por ejemplo, "Direct Gene Transfer for the Understanding and Treatment of Human Disease" por G.E. Plautz en las páginas 144-153, y "Mechanisms of Action of the p53 Tumor supresor and Prospects for Cancer Gene Therapy by Reconstitution of p53 Function" por Roemer y col., en las páginas 265-282. Los métodos para insertar moléculas de ADN recombinante en células de un tejido u órgano que va a ser injertado o de un tumor, incluyen vectores de adenovirus, retrovirus y asociados a adenovirus (AAV), así como la inyección directa de ADN o la inyección de oligonucleótido-liposoma. Los ensayos clínicos en los que los vectores retrovirales se inyectan en tumores cerebrales, o en los que se usa adenovirus para infectar células del tracto respiratorio superior de un paciente con fibrosis cística, son bien conocidos.

Se pretende que las composiciones farmacéuticas que comprenden la molécula de ADN recombinante que codifica cADN de IR1B1 o de IR1B4, o un fragmento del mismo, tanto en una orientación sentido como anti-sentido con respecto a un promotor ligado operativamente, incluyan todas las composiciones en las que la molécula de ADN recombinante está contenida en una cantidad eficaz para alcanzar el propósito pretendido. Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables que estabilizan la molécula de ADN recombinante o que facilitan su administración.

Otra realización de la presente invención está dirigida a moléculas que incluyen la porción de unión a antígeno de un anticuerpo específico de unión de IFNAR1 a proteínas IR1B1 o IR1B4, o a fragmentos de las mismas, para su uso en diagnosis, tal como los métodos de inmunodetección para determinar el nivel de proteínas IR1B1 o IR1B4 en el tejido tumoral obtenido mediante biopsias, o para su uso en purificación de la proteína por cromatografía de afinidad.

El término "anticuerpo" pretende incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), anticuerpos de cadena sencilla, y anticuerpos humanizados producidos recombinantemente, así como fracciones activas de los mismos, proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como, aunque sin que suponga una limitación, rotura enzimática, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos de antígenos, población que contiene posiciones de unión de epítopo sustancialmente similares. Se pueden obtener MAbs mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Patente de EE.UU. Nº 4.376.110; Ausubel y col., eds., ver anteriormente, Harlow y Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan y col., eds., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, N. Y., (1992, 1993), cuyos contenidos se incorporan por completo a la presente memoria a modo de referencia. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de los mismos. Se puede cultivar un hibridoma que produce un mAb de la presente invención in vitro, in situ o in vivo. La producción de altos valores de mAbs in vivo o in situ hacen que este sea el método de producción actualmente preferido.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas con diferentes porciones que derivan de diferentes especies animales, tales como las que presentan la región variable derivada de una murina mAb y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad durante la aplicación, y para aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando mAbs de murina tienen mayores rendimientos a partir de hibridomas pero mayor inmunogenicidad en humanos, de tal modo que se usan mAbs quiméricos humano/murina. Los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne y col., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada el 14 de Noviembre de 1984); Neuberger y col., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi y col., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de Febrero de 1985); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo de 1986); Neuberger y col., Solicitud PCT WO 8601533, (publicada el 13 de Marzo de 1986); Kudo y col., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de Junio de 1986); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de Marzo de 1986); Sahagan y col., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson y col., Publicación de Patente Internacional, WO 9702671 (publicada el 7 de Mayo de 1987); Liu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better y col., Science 240:1041-1043 (1988); y Harlow y Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, ver anteriormente.

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados generalmente con la posición de unión de antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-Id se puede preparar mediante la inmunización de un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) que la fuente del mAb con el mAb para el que se está preparando el anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante mediante la producción de un anticuerpo para dichos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.699.880.

El anticuerpo anti-Id también se puede usar como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitopicalmente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. De este modo, usando anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.

Debería comprenderse que los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos intactos, tal como anticuerpos monoclonales, pero que es la posición de unión del epítopo del anticuerpo la que proporciona la función deseada. Por tanto, además del anticuerpo intacto, se pueden usar fragmentos proteolíticos del mismo tales como los fragmentos Fab o F(ab')_{2}. Los fragmentos Fab o F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, desaparecen más rápidamente de la circulación, y pueden presentar menos unión no específica de tejido que un anticuerpo intacto (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Dichos fragmentos se producen normalmente por rotura proteolítica, usando enzimas tales como la papaína (para producir fragmentos Fab) o la pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}).

Además, el ADN que codifica la región variable del anticuerpo se puede insertar en otros anticuerpos para producir anticuerpos quiméricos (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567) o en receptores de células T para producir células T con la misma amplitud de especificidad (véase Eshhar, Z. y col., Br. J. Cancer Suppl., 10:27-9, 1990; Gross, G. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10024-8, 1989). Los anticuerpos de cadena sencilla también se pueden producir y usar. Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser polipéptidos compuestos de cadena sencilla que presenten capacidades de unión a antígenos y que comprendan un par de secuencias de aminoácidos homólogas o análogas a las regiones variables de una cadena pesada y ligera de inmunoglobulina (V_{H}-V_{L} ligadas o cadena F_{v} sencilla). Tanto V_{H} como V_{L} pueden copiar secuencias de anticuerpos monoclonales naturales, o una o ambas cadenas pueden comprender un constructo CDR-FR del tipo descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.091.513. Los polipéptidos separados análogos a las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas se mantienen juntos a través de un ligando de polipéptido. Los métodos de producción de dichos anticuerpos sencillos, particularmente en los que se conoce el ADN que codifica las estructuras de polipéptido de las cadenas V_{H} y V_{L}, se pueden llevar a cabo de acuerdo con los métodos descritos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.946.778, 5.091.513 y 5.096.815.

Por tanto, el término "una molécula que incluye la porción de unión de antígeno de un anticuerpo" pretende incluir no sólo las moléculas de inmunoglobulina intactas de cualquier isotipo y generadas por cualquier línea celular animal o microorganismo, sino también la fracción reactiva de las mismas, incluyendo, aunque sin limitación, el fragmento Fab, el fragmento Fab', el fragmento F(ab')_{2}, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de las mismas, y los anticuerpos quiméricos o de cadena sencilla que incorporan dicha fracción reactiva, así como cualquier otro tipo de molécula o célula en la que se haya insertado físicamente dicha fracción reactiva de anticuerpo, tal como un receptor de células T quimérico o una célula T que tenga dicho receptor, o moléculas desarrolladas para suministrar restos terapéuticos a través de una porción de la molécula que contenga dicha fracción reactiva.

Habiendo descrito completamente la invención, la misma será más fácilmente comprendida haciendo referencia a los siguientes Ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y que no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplo 1 Dos proteínas humanas, IR1B1 y IR1B4, se unen al receptor de IFN

Un fragmento de cADN que codifica el dominio IFNAR1-IC completo amplificado mediante PCR usando un prímero sentido BamH1 (5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC (SEQ ID NO: 5)) y un prímero anti-sentido EcoRI (5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC (SEQ ID NO: 6)), fue clonado en un vector BlueScript (BS-SK+, Stratagene). El fragmento BamHI-SalI procedente de este BS-IFNAR1-IC fue introducido en el vector pGBT_{10} (CloneTech) y fusionado en fase después del dominio de unión de ADN Gal4 (pGBT_{10}-IFNAR1-IC) para la monitorización de dos híbridos. El método de monitorización de dos híbridos (Fields y Song, 1989) se llevó a cabo con el procedimiento modificado de Durfee y col. (1993) usando la biblioteca de cADN de plásmido pACT procedente de linfocitos B transformados con el Virus de Epstein-Barr humano (EBV) para cotransformar la cepa informadora de levadura Y153 con pGBT_{10}-IFNAR1-IC. La cepa de levadura Y153 tiene dos genes informadores bajo el control de las Secuencias Activantes Superiores GAL1 (UAS), que se transcriben únicamente si la actividad del factor de transcripción Gal4 es reconstituida. Esto requiere que la proteína de fusión codificada por el plásmido pACT que fue introducida en este clon de levadura en concreto tenga afinidad por el dominio IFNAR1-IC del plásmido pGBT_{10}. Uno de los genes informadores es GAL1 His3, que permite el crecimiento en un medio que carezca de histidina; el otro gen informador es GAL-LacZ, que proporciona actividad de \beta-galactosidasa. Adicionalmente, los plásmidos pACT tienen el gen Leu2 y el plásmido pGBT_{10} tiene el gen TRP1 que permite el crecimiento en un medio que carezca de leucina y de triptófano, respectivamente. Se seleccionaron las colonias en medio sintético SC menos Trp, Leu, His en presencia de 3-aminotriazol 25 mM (que selecciona aún más la prototrofia de histidina). A continuación se evaluó la actividad de \beta-galactosidasa de las colonias usando el ensayo de filtro X-gal (Breeden y Naysmith, 1985).

Se obtuvieron nueve clones positivos de levadura y sus plásmidos pACT fueron recuperados mediante transfección en HB101 de E. coli y selección de transformantes leu+. Para cada ADN de levadura, se aislaron dos clones HB101 de E. coli. El secuenciamiento parcial de ADN de los plásmidos pACT a partir de estos clones de E. coli mostró que se dividían en dos grupos de secuencias de cADN que fueron designados IR1B1 y IR1B4. Los plásmidos pACT de los grupos IR1B1 y IR1B4 fueron sometidos a ensayos de especificidad mediante cotransformación de la cepa informadora SFY526 de levadura (Bartel y col., 1993) con plásmidos pAS que alojan lamina, cdk2 y p53 u otros injertos de control (CloneTech). Las colonias que crecieron en SC -trp, -leu fueron evaluadas para determinar la expresión de \beta-galactosidasa. A partir de los plásmidos pACT específicamente positivos, se escindieron injertos con XhoI, se clonaron en BS-KS (Stratagene) y se sometieron a secuenciamiento desde los promotores T7 y T3 usando el Kit "DyeDeoxy Terminador Cycle Sequencing Kit" en un Secuenciador de ADN 373A (Applied Biosystems).

La Figura 1 muestra los resultados correspondientes al clon pACT IR1B1 co-transfectado en levadura SFY526 con diferentes cebos de pAS o de plásmido pGBT_{10}. Las células de levadura crecieron en el medio SC selectivo -trp, -leu en las bandas 1 a 9 del filtro. La tinción con reactivo X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido) fue positiva sólo en las bandas 2 y 4. Como se indica en la Figura 1, la banda 4 es una levadura de control con un gen lacZ activo. La banda 2 es la combinación de las proteínas de fusión IR1B1 y IFNAR1-IC. La IR1B1 por sí sola (banda 9), o cualquier otra combinación aparte de IR1B1 y IFNAR1-IC, no presentó actividad de \beta-galactosidasa. Por tanto, la IR1B1 es capaz específicamente de combinarse con el dominio IC de la cadena de receptor IFN IFNAR1.

De un modo similar, la Figura 2 muestra los resultados correspondientes al clon pACT IR1B4 co-transfectado en levadura SFY526 con diferentes cebos de pAS o de plásmido pGBT_{10}. Las células de levadura crecieron en medio SC trp, leu en las bandas 1 a 8 del filtro, y la tinción mediante reactivo X-gal fue positiva sólo en las bandas 3 y 7. Como se indica en la porción recuadrada inferior de la Figura 2, la banda 7 es una levadura de control con un gen lacZ activo. La banda 3 es la combinación de las proteínas de fusión IR1B4 y IFNAR1-IC. Como los resultados obtenidos con la IR1B1, la IR1B4 por sí sola, o cualquier otra combinación aparte de IR1B4 y IFNAR1-IC, no presentó actividad de \beta-galactosidasa. Por lo tanto, la IR1B4 también es capaz específicamente de combinarse con el dominio IC de la cadena de receptor IFN IFNAR1.

Ejemplo 2 La secuencia de la proteína IR1B1 muestra posiciones EF Hand de unión de calcio

El injerto de cADN de los plásmidos pACT-IR1B1 se escindió con enzima de restricción XhoI, se clonó en un vector Bluescript BS-KS y se sometió a secuenciamiento desde los promotores T7 y T3 usando el kit "DyeDeoxy Terminador Cycle Sequencing" en un secuenciador de ADN 373A (Applied Biosystems). El plásmido más largo presentó una secuencia de 830 nucleótidos (Figura 3) después del dominio de activación Gal4 y de la secuencia ligando del plásmido pACT, y se encontró un marco de lectura abierto de 191 aminoácidos (Figura 3). Se llevó a cabo una búsqueda en línea en bases de datos de proteínas usando el algoritmo BlastP (Altschul y col., 1990), así como el Alineamiento de Bioacelerador (Henikoff y Henikoff, 1992). Los mayores valores se obtuvieron para la caltractina (CATR_HUMAN, Proteína Suiza con accesión SW Nuevo P41208) con un 62,1% de similitud y con un 32,4% de identidad desde los aminoácidos 52 a 173, y para la calcineurina B (CALB NAEGR, Proteína Suiza con accesión P42322; CALB_HUMAN, accesión P06705) con un 59,8% de similitud y con un 32,5% de identidad desde los aminoácidos 50 a 171.

La Figura 4 muestra el alineamiento de IR1B1 con calcineurina B humana (CALB) y con caltractina (CATR). Los dominios de unión de calcio, hélice-lazo-hélice EF-hand se muestran con caracteres en negrita y subrayados. La IR1B1 tiene dos posiciones EF-hand pero los dos primeros dominios EF-hand no se conservan. La IR1B1 muestra homología con las dos calcineurinas B (representadas por líneas verticales en la Figura 4). Sin embargo, la IR1B1 es claramente una proteína humana nueva y diferente que no ha sido identificada previamente.

Ejemplo 3 La IR1B1 es un producto génico inducido por IFN

Se trataron células U266S de mieloma humano (aproximadamente 3 x 10^{6} células en 5 mL de cultivo de suspensión) con IFN-\alpha8 (2 x 10^{8} UI/mg de bacterias) o con IFN-\beta (3 x 10^{8} UI/mg de células CHO) a 750 UI/mL durante 2 horas o durante 18 horas. Tras el tratamiento con IFN, las células fueron recogidas y extraídas con reactivo Tri (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio), que es un producto que contiene tiocianato de guanidinio y fenol. El ARN extraído fue precipitado con etanol, desnaturalizado con formaldehído, analizado mediante electroforesis en geles de formaldehído-agarosa (10 \mug de ARN/ranura), y teñido sobre GeneScreen Plus (Dupont, New England Nuclear, Billerica, MA). La tinción Northern se hizo reaccionar con 10^{6} cpm de cADN de IR1B1 marcado con el kit Rediprime (Amersham, RU) usando ^{32}P-dCTP e imprimación aleatoria.

La Figura 5 muestra que el cADN de IR1B1 se hibridó con un ARN de 1,1 kb. La cantidad de mARN de IR1B1 se incrementó drásticamente 2 horas después del tratamiento con IFN-\beta de células U266S. Sin embargo, a las 18 horas del tratamiento con IFN, el mARN de IR1B1 había desaparecido de las células, lo que indica que la inducción es rápida y transitoria. Muchos mARNs inducidos por IFN continúan acumulándose en las células a lo largo de 24 horas después del tratamiento con IFN (Revel y Chebath, 1986).

Se verificó que en cada banda había la misma cantidad de ARN. Tal como se muestra en la parte inferior de la Figura 5, la hibridación del mismo ARN de U266S (rico en receptor de IFN) con una sonda de cADN ribosomal 18S revela la misma cantidad de rARN 18S en cada banda (solo se muestra la parte de la mancha en la que aparece rARN 18S). En otro experimento realizado usando 1.200 U/mL de IFN para la inducción, también se observó mARN de IR1B1 con IFN-\alpha8 a 2 horas, pero no a los 30 minutos (no mostrado).

Se descubrió que el mARN de IR1B1 tenía el mismo tamaño de 1,1 kb en diferentes células humanas (células U266, Daudi y THP-1). Cabe destacar que dicho tamaño es próximo al del mARN de caltractina, pero no al del mARN de calcineurina B (2,5 kb). El pequeño tamaño del mARN es consistente con que la IR1B1 sea una proteína pequeña de aproximadamente 20 kDa.

Ejemplo 4 La proteína IR1B4 se une a IFNAR1 in vitro

Se evaluó la unión de IR1B4 al dominio IC de IFNAR1 sintetizando la proteína IR1B4 con un marcador de proteína (secuencia bandera), usando traducción in vitro en lisatos de reticulocito y haciendo reaccionar dicha proteína con una proteína de fusión IFNAR1-IC recombinante en E. coli. El ADN de pACT-IR1B4 del Ejemplo 1, cortado con XhoI y rellenado con enzima Klenow, se clonó en el vector de expresión del PECE-bandera (Ellis y col., 1986) cortado con EcoRI y rellenado. El fragmento NotI-BamHI que contiene la fusión bandera-IR1B4 en marco fue reclinado en BS-SK cortado con NotI-BamHI y por debajo de los promotores T3. La secuencia de la fusión bandera se verificó mediante el secuenciamiento a partir del promotor T3. La transcripción in vitro (kit Promega) se realizó con polimerasa T3 y con 1 \mug de ADN de BS-bandera-IR1B4 linealizado con BamHI. La traducción in vitro se llevó a cabo en lisatos de reticulocito de conejo (kit Promega) con metionina [^{35}S] (Amersham) y con 5 \mug de transcritos de ARN durante 1 h a 30ºC. Los productos fueron tratados con ARNasa antes de ser usados. La proteína de fusión GST-IFNAR1-IC se preparó mediante clonación del BamHI-EcoRI, injerto de BS-IFNAR1-IC (ver anteriormente), en los mismos sitios de pGEX2 (Pharmacia Biotech). GST y GST-IFNAR1-IC se expresaron en E. coli y se recuperaron ligados a gotas de glutationina-agarosa (Sigma).

Las gotas de azarosa M2 anti-bandera procedían de Kodak Scientific Imaging Systems. Los anticuerpos monoclonales IFNaR3 del componente \alpha del receptor de IFN (IFNAR1) fueron un amable obsequio del Dr. O. Colamonici (Colamonici y col., 1990) y fueron usados con una dilución 1:100. Los anticuerpos de conejo del péptido C-terminal de IFNAR1-IC (Ab 631) se prepararon y usaron para la inmunoprecipitación de IFNAR1 de extractos de Brij (0,75 mL) de 2 x 10^{7} células U266S y U266R de mieloma humano con antiproteasas detallados previamente (Ambrovich y col., 1994), con la excepción de que se usaron gotas de proteína G (Pharmacia) con mAb IFNaR3 SDS-PAGE y el análisis en un aparato Fujix BAS1000 Phosphor-Imager fue como se ha indicado anteriormente (Harroch y col., 1994).

Primero se verificó que se obtiene un producto proteico de aproximadamente 32 kDa cuando se inmunoprecipitan los productos de traducción mediante anticuerpos anti-bandera (Figuras 6A y 6B). En las Figuras 6A y 6B, cuando se denota el uso de anticuerpos anti-bandera (con el signo +), significa que el producto de traducción radioactivo del mARN de fusión IR1B4-bandera (transcrito in vitro a partir del constructo de ADN correspondiente) se hizo reaccionar con anticuerpo M2 anti-bandera unido a gotas de agarosa (producto de Kodak Scientific Imaging Systems). La proteína traducida que contiene IR1B4 fusionada con la secuencia de aminoácidos bandera se unió a estas gotas de anticuerpo anti-bandera y tras centrifugación de las gotas, se eluyó la proteína con tampón SDS y se aplicó a SDS-PAGE. Estas reacciones sirven como un control para demostrar que la proteína fusionada esperada está presente.

Se añadieron gotas de Glutationa-Sefarosa (Sigma), a las que se ligó Glutationa S-transferasa (GST) fusionada con IFNAR1-IC, a la reacción de traducción de lisato de reticulocito. Las gotas fueron centrifugadas y lavadas, y las proteínas ligadas a gotas GST se liberaron con dodecilsulfato sódico (SDS al 1%), y fueron analizadas mediante SDS-electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE). Se observó que la proteína de 32 kDa marcada con metionina ^{35}S estaba unida a GST-IFNAR1-IC, pero no a GST solo (Figura 6A). Esto demuestra que la IR1B4 se une directamente a la región de péptido de IFNAR1-IC aislada.

Para verificar que la IR1B4 interactúa con la proteína IFNAR1 tal como se encuentra en las membranas celulares humanas, se mezclaron extractos detergentes de células U266 de mieloma humano con los productos de traducción marcados con metionina ^{35}S del mARN de IR1B4 procedente de lisatos de reticulocito. La proteína IFNAR1 fue inmunoprecipitada con un anticuerpo monoclonal de IFNaR3 específico del ectodominio de IFNAR1 (de Colamonici y col., 1990). El análisis mediante SDS-PAGE mostró la presencia de la banda IR1B4-bandera de 32 kDa (Figura 6B) cuando los extractos detergentes procedían de células U266S (ricas en receptor IFN), pero no cuando procedían de células U266R (una línea celular derivada resistente a IFN-\alpha, \beta mutante procedente de U266 deficientes en receptores IFN (Abramovich y col., 1994)). Del mismo modo, la banda de 32 kDa se observó cuando los extractos de U266S se hicieron reaccionar con Ab 631 frente al péptido C-terminal de IFNAR1, y el IFNAR1 fue precipitado con anti-bandera cuando se transfirieron células Cos-7 mediante cADNs flg-IR1B4 e IFNAR1 humano. Estos resultados demostraron que la IR1B4 se une a IFNAR1 intacto procedente de células humanas de un modo específico.

Ejemplo 5 cADN de IR1B4 y secuencias de proteína

La secuencia de nucleótidos del cADN de IR1B4 tiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 361 aminoácidos de longitud (Figura 7). Este cADN humano reconoció un mARN poli-A+ expresado constitutivamente de 1,5 kb en diversas células humanas, incluyendo células de mieloma U266. Se realizó una búsqueda en línea en las bases de datos de proteínas usando el algoritmo BlastP (Altschul y col., 1990), así como el Alineamiento de Bioacelerador (Henikoff y Henikoff, 1992), y se descubrió que la IR1B4 es un miembro único de la familia de la proteína-arginina metiltransferasa. El cADN PRMT1 de rata descrito por Lin y col. (1996, secuencia de Genbank I.D. 1390024; Acceso U60882) tan sólo es homólogo en un 81,4% cuando se analiza mediante el programa de ordenador ALIGN. Al nivel de aminoácidos (Figura 8), el IR1B4/PRMT humano claramente difiere en su extremo amino del PRMT1, siendo los primeros 19 aminoácidos completamente diferentes. El secuenciamiento N-terminal de IR1B4 es homólogo al PRMT1. Otra proteína humana que ha sido descrita, HCP-1 (Nikawa y col., 1996; acceso de Genbank D66904) también presentó homología con respecto a la IR1B4. Sin embargo, la HCP-1 tiene una secuencia de aminoácidos diferente en los residuos 147-175 (Figura 9). La HCP-1 se identificó originalmente en base a su capacidad para complementar la mutación ire15 en la levadura y su función enzimática no estaba identificada previamente (Nikawa y col., 1996). Por tanto, la IR1B4 es una nueva proteína humanal.

Ejemplo 6 La proteína IR1B4 unida a IFNAR1 presenta actividad de metil-transferasa

La actividad de metiltransferasa podría ser co-inmunoprecipitada a partir de extractos celulares con el receptor IFNAR1. Los extractos de detergente Brij de células U266 se hicieron reaccionar toda la noche a 4ºC con o sin anticuerpo anti-IFNAR1 Ab 631 (Abramovich y col., 1994). Se añadieron gotas de proteína A (40 \muL de un 50% de flujo rápido IPA-400, Repligen) durante 1 hora. Las gotas se lavaron y se incubaron en 0,1 mL de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, ^{14}C-(metil)-S-adenosil-metionina 50 \muM (0,25 \muCi) (Amersham) y 100 \mug de histonas (Tipo IIA procedente de timo de becerro, Sigma) durante 30 minutos a 30ºC. Se llevó a cabo la mutilación in vitro de histonas en las condiciones descritas por Lin y col. (1996). La radioactividad de la banda de histona se analizó tras SDS-PAGE (15% de archilamida) y tras exposición en el Phosphor-imager. Se observó un marcado de ^{14}C-metilo de las histonas con las gotas que fueron recubiertas con anti-IFNAR1, pero no con las de la reacción de control (Figura 10). Por tanto, la actividad de proteína metil-transferasa está asociada constitutivamente con la cadena del receptor IFN de dichas células humanas. Se recuperó una actividad enzimática similar cuando se inmunoprecipitó IFNAR1 cinco minutos después de la adición de IFN-\beta a las células U266S.

Ejemplo 7 Participación de IR1B4/PRMT1 en la acción de IFN

Se sintetizó químicamente un fosforotioato de oligodesoxinucleótido anti-sentido (Stein y col., 1989) complementario a la secuencia de nucleótidos 12-33 alrededor del codón de inicio del cADN de IR1B4 (AS-1, secuencia anti-sentido 5'-GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3'; SEQ ID NO: 12). Se añadieron los oligonucleótidos a células U266S sembradas en microplacas de 96 pocillos (8000 células/pocillo/0,2 mL de RPMI, FCS al 10%) con una concentración final 10 \muM en el día 0, y se volvieron a añadir a 5 \muM en el día 2. Se añadió IFN-\beta a 64 o a 125 UI/mL en el día 0. Tras 3 días de cultivo, se añadieron 20 \muL de Azul Alamar, un indicador celular colorimétrico basado en oxidación-reducción (Biosource, Camarillo, CA), a cada pocillo y se continuó con la incubación durante 6-7 h. Se midió el color en un lector ELISA de microplacas (filtro de ensayo a 530 nm, filtro de referencia a 630 nm) con lectura múltiple de pocillos duplicados. Se verificó la correlación de las curvas de crecimiento mediante el número de células vivas y mediante OD. Para medir la metiltransferasa, se sometió a lisis a células de varios pocillos reunidos mediante congelación-descongelación en 25 \muL/pocillo de Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 40 \mug/mL de leupeptina y de aprotinina, 20 \mug/mL de pepstatina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 \muM. Las reacciones se realizaron en 50 \muL con 25 \muL de extractos celulares, péptido R1 100 \muM (Najbauer y col., 1993; obtenido en Genosys, Cambridge, RU), 3 \muCi de [^{3}H] (metil)S-adenosilmetionina (Amersham, 73 Ci/mmol) durante 30 minutos a 30ºC. Después de electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida (16%), fijación en metanol al 50%, ácido acético al 10% y tratamiento mediante Amplify® (Amersham), se llevó a cabo la autorradiografía durante 8 días. Este ADN anti-sentido AS-1 fue capaz de reducir intensamente la actividad de proteína-arginina metiltransferasa en células U266S, según se midió mediante la incorporación de grupos metilo tritiados en el sustrato de péptido R1 (Figura 11), y se usó para investigar el papel que puede desempeñar esta enzima en la acción de IFN. Se eligió la actividad de inhibición del crecimiento del IFN porque se puede cuantificar casi directamente sobre las células debido a que se ha observado una interacción de PRMT1 de rata con productos génicos relacionados con el crecimiento (Lin y col., 1996). La adición del oligonucleótido antisentido-1 AS-1, que es complementario a la secuencia que rodea al codón de inicio del cADN de IR1B4/PRMT, redujo el efecto inhibidor del crecimiento del IFN-\beta sobre células U266S de mieloma humano (Figura 12). Esto significa que, en presencia del AS-1 anti-sentido, las células tratadas con IFN presentaron un mayor crecimiento (excluyendo cualquier efecto tóxico de los fosforotioatos). El crecimiento en ausencia de IFN no se vio afectado significativamente. El oligonucleótido sentido S-3 correspondiente a la misma región de cADN sólo presentó un pequeño efecto (S-3, Figura 12) en comparación con el antisentido-1. El sentido S-3 también presentó únicamente un pequeño efecto inhibidor sobre el nivel de la actividad enzimática (Figura 11). Otro oligonucleótido de fosforotioato anti-sentido AS-2 (SEQ ID NO: 13), dirigido al medio del cADN y complementario a los nucleótidos 572-592 de la SEQ ID NO: 7, casi no presentó efecto alguno (Figura 12). La reducción en un factor de hasta 5 del efecto inhibidor del crecimiento del IFN-\beta sobre células de mieloma, que resultaron parcialmente deficientes en actividad PRMT por el oligonucleótido antisentido-1, demuestra que la asociación de la enzima IR1B4/PRMT con el dominio IC del receptor IFNAR1 es funcionalmente significativa para la acción de IFN sobre las células.

Estos experimentos también demuestran que la proteína IR1B4 metila sustratos de péptido de clase PRMT de enzimas, tales como el péptido R1 Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO: 11; Najbauer y col., 1993), que fue usado en el experimento ilustrado en la Figura 11. La mutilación de proteínas sobre los residuos de arginina próximos a los residuos de glicina (por ejemplo, como en péptido anterior) podría ser un tipo de modificación proteica que, como la fosforilación, sirve para transducir señales al interior de la célula. El grupo hnRNP de proteínas es un objetivo para las enzimas PRMT, y puesto que dichas proteínas afectan al procesado, separación, transporte y estabilidad del mARN (Liu y Dreyfuss, 1995), su mutilación puede desempeñar un papel en los controles post-transcripcionales de la expresión génica. La proteína IR1B4/PRMT, con propiedades de unión a una cadena del receptor IFN según lo observado, podría mediar en los cambios de la expresión génica de respuesta a IFN. Otros sustratos de proteína se pueden metilar a través del receptor IFN, incluyendo otros componentes del complejo de receptor IFN y de los factores de transcripción. Lin y col. (1996) han observado que la unión de PRMT1 de rata con proteínas inducidas por factor activa al PRMT1 y modifica su especificidad de sustrato, posiblemente mediante la eliminación de algunas proteínas inhibidoras asociadas al PRMT1 en el citoplasma celular. Puede esperarse una activación similar de la IR1B4 unida a la cadena de IFNAR1 del receptor IFN.

Conclusiones

Se describe una nueva proteína IR1B1 que interacciona con el dominio intracitoplásmico de la cadena IFNAR1 del receptor interferón de tipo I. Dicha proteína es inducida muy rápidamente y temporalmente después de un tratamiento con IFN de células humanas. La IR1B1 se caracteriza por la presencia de posiciones EF-handle hélice-lazo-hélice que son típicas de proteínas de unión de calcio. Los flujos de iones calcio han sido implicados en el mecanismo de acción de los IFNs, y en particular en las respuestas celulares iniciales y en los cambios de morfología celular y en la organización del citoesqueleto (Tamm y col., 1987). Las enzimas activadas por iones calcio podrían producir segundos mensajeros, tales como el diacil-glicerol, en respuesta a los IFNs. Adicionalmente, las proteínas de tipo calmodulina regulan una serie de proteína quinasas y se ha observado que dichos mecanismos funcionan en células tratadas con IFNs (Tamm y col., 1987). Es probable que el receptor IFN que se une a la proteína IR1B1 esté implicado en dichos efectos dependientes de C^{++} de los IFNs sobre las células.

La monitorización de dos híbridos correspondiente a proteínas que interaccionan con el dominio IFNAR1-IC también identificó otra proteína IR1B4, que resultó ser un miembro de la familia de enzimas proteína-arginina metil transferasa (PRMT1; Lin y col., 1996). Se sabe que esta enzima metila una serie de proteínas de unión de ARN y ADN, en concreto ribonucleoproteínas nucleares heterólogas (hnRNPs). Las hnRNPs heterólogas están implicadas en el transporte de mARN desde el núcleo hasta el citoplasma, en la división alternativa de pre-mARN, y en los controles post-transcripcionales (Liu y Dreyfuss, 1995). Las proteínas IR1B1 y IR1B4/PRMT1 que se alojan sobre el dominio IFNAR1-IC revelan nuevos mecanismo de señalización de los IFNs que existen además de los mecanismos Jak-Stat conocidos descritos por Darnell y col. (1994).

Habiendo descrito completamente esta invención, aquellos expertos en la técnica apreciarán que se puede llevar a cabo la misma dentro de un amplio intervalo de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes, sin alejarse del espíritu y del alcance de la invención, y sin experimentación indebida.

Aunque esta invención se ha descrito en relación a realizaciones específicas de la misma, debe entenderse que se pueden realizar modificaciones adicionales.

La referencia a etapas de métodos conocidos, a etapas de métodos convencionales, a métodos conocidos o a métodos convencionales, no supone en modo alguno una admisión de que cualquier aspecto, descripción o realización de la presente invención se describe, muestra o sugiere en la técnica relevante.

Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: REVEL, Michael

\hskip4cm

CHEBATH, Judith

\hskip4cm

ABRAMOVICH, Carolina

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS DE UNIÓN A RECEPTOR 1 DE INTERFERÓN, ADN {}\hskip4,7cmQUE LAS CODIFICA Y MÉTODOS PARA MODULAR LA RES- {}\hskip4,7cm PUESTA CELULAR A LOS INTERFERONES

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: BROWDY AND NEIMARK

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 419 Seventh Street, N.W., Suite 300

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: D.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20004

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SISTEMA LÓGICO: PatentIn Release #1.0 Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/035.636

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-ENE-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BROWDY, Roger L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 25.618

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: REVEL=14 PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 202-628-5197

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 202-737-3528

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 830 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 43..615

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 191 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 170 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 172 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAGGATCC AAAGTCTTCT TGAGATGCAT C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGACGAATTC CTATCATACA AAGTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1308 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 16..1098

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

6

7

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 361 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 353 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 360 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTACAAAA TTCTCCATGA TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCCGTCAC ATACAGCGTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Yeda Research and Development Co., LTD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNAS DE UNIÓN A RECEPTOR 1 DE INTERFERÓN, ADN QUE
{}\hskip4,6cm LAS CODIFICA Y MÉTODOS PARA MODULAR LA RESPUESTA CE-
{}\hskip4,6cm LULAR A LOS INTERFERONES

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US98/00671

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-8-11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/035.636

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-1-15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 830

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 43..615

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAGGATCC AAAGTCTTCT TGAGATGCAT C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGACGAATTC CTATCATACA AAGTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1308

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16..1098

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

21

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 361 s

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 353 s

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360 s

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10 s

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTACAAAA TTCTCCATGA TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCCGTCAC ATACAGCGTG G

\hfill

21

Claims (19)

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión a receptor IFNAR1 que es capaz de ser inducida por IFN-\alpha o por IFN-\beta, y que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 8.

2. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un promotor ligado operativamente a dicha secuencia que codifica una proteína de unión de receptor IFNAR1 en una orientación sentido de tal modo que dicho promotor es capaz de expresar dicha proteína cuando la molécula de ADN recombinante se encuentra en un hospedante de expresión apropiado.

3. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicho promotor es un promotor constitutivo fuerte en células humanas.

4. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 7.

5. Un ADN recombinante que comprende una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 7, tanto en orientación sentido como anti-sentido, o un fragmento de la misma capaz de hibridarse con mARN que codifica un receptor IFNAR1 inducible por interferón que se une a la proteína impidiendo con ello su expresión.

6. Un ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Un ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha secuencia se encuentra en la orientación sentido.

8. Un ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha secuencia se encuentra en la orientación anti-sentido.

9. Un ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende una molécula de ADN recombinante que además comprende un promotor ligado operativamente a dicha secuencia con una orientación anti-sentido, de tal modo que dicho promotor es capaz de expresar un ARN anti-sentido complementario al total o a una parte del ARN sentido que codifica una proteína de unión a receptor IFNAR1 inducida por interferón.

10. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha secuencia de nucleótidos es un segmento desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 1 o de la SEQ ID NO: 7.

11. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2, 9 y 10, en la que dicho promotor es un promotor inducible por interferón.

12. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 7-10, que es un vector de expresión.

13. Una célula hospedante capaz de expresar un ARN anti-sentido complementario a un ARN sentido que codifica una proteína de unión a receptor IFNAR1 inducible por interferón, célula que incluye un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 12.

14. El uso de un vector de expresión que comprende la molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para la preparación de una composición farmacéutica para prolongar la supervivencia de un injerto de tejido mediante la introducción de dicho vector de expresión en las células de un tejido u órgano que vaya a ser injertado a un paciente que lo necesite.

15. El uso de un vector de expresión que comprende la molécula de ADN recombinante de la reivindicación 3 o de la reivindicación 4 y de interferón exógeno para la preparación de un kit farmacéutico para el tratamiento del cáncer, permitiendo la administración consecutiva del vector de expresión y del interferón exógeno con el fin de potenciar la respuesta al interferón exógeno.

16. Una proteína de unión de IFNAR1 que presenta la secuencia SEQ ID NO: 2 ó SEQ ID NO: 8.

17. Una molécula que comprende el antígeno que se une a la porción de un anticuerpo específico para la proteína de unión de IFNAR1 de acuerdo con la reivindicación 16.

18. Una molécula de acuerdo con la reivindicación 17, que consiste en un anticuerpo monoclonal.

\newpage

19. Un método para proporcionar una proteína de unión de receptor IFNAR1 que comprende colocar un ADN de acuerdo con la reivindicación 1 en un hospedante de expresión apropiado, de un modo mediante el cual la expresión de dicha proteína se puede obtener mediante cultivo de dicho hospedante, y cultivar dicho hospedante de tal modo que se obtenga la expresión de dicha proteína.