KR20000070181A

KR20000070181A - 신규한 아이에프엔 수용체 1 결합 단백질들, 이들을 코딩하는

Info

Publication number: KR20000070181A
Application number: KR1019997006407A
Authority: KR
Inventors: 레벨마이클; 아브라모비트취캐롤리나; 쉐배즈주디스이.
Original assignee: 폴리나 벤-아미, 야코브 코헨; 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2000-11-25
Also published as: CZ299096B6; EE9900272A; BG64829B1; KR20050046779A; ES2275297T3; DK1019500T3; IL130960A; CA2276111A1; EP1019500A2; CN1243544A; NO993412L; DE69836226T2; NO993412D0; EE04819B1; KR100591988B1; CZ247199A3; CN1212398C; WO1998031796A1; EA199900663A1; AU731206C

Abstract

타입 I 의 IFN수용체인 IFNAR1에 결합할 수 있는, 신규한 단백질 IR1B1 및 IR1B4가 분리되었으며, 이러한 신규한 단백질들은 IFN에 대한 세포성반응에서 기능을 수행한다. 이러한 단백질들을 코딩하는 DNA는 센스방향 또는 안티센스방향 중 어느 하나의 방향으로 투여되시켜, IFN에 대한 세포성 반응을 강화하거나 억제할 수 있다. 상기 단백질들에 대한 항체들은 신규한 단백질을 분리하거나 면역학적으로 검출하는데 사용될 수 있다.

Description

신규한 아이에프엔 수용체 1 결합 단백질들, 이들을 코딩하는 디엔에이 및 인터페론에 대한 세포성 반응을 조절하는 방법{NOVEL IFN RECEPTOR 1 BINDING PROTEINS, DNA ENCODING THEM, AND METHODS OF MODULATING CELLULAR RESPONSE TO INTERFERONS}

타입I 인터페론(IFN-α 및 IFN-β서브타입)은, 바이러스 복제의 억제(안티바이러스 효과), 세포 증식 억제(안티-종양 효과) 및 면역세포 활성들의 조절(면역 조절 효과)와 같이, 세포에서 다면적인 효과들을 제공한다. 이러한 인터페론(INF)들의 다중 효과는 세포를 형태학적으로 그리고 생화학적으로 조절하는 것과 관련있다(Revel, 1984, for review).

인터페론들은 종-특이성 수용체들을 통해 그들의 활성을 발휘한다. 타입I 의 IFN에 대한, 두 개의 막관통 수용체 사슬 IFNAR1(Uze et al, 1990) 및 IFNAR2-2(또는 IFNAR2-c, Domanski et al, 1995)이 동정되었다. IFN-α,β,ω에 발생하는 신호전달에는, Janus 키나제(Jak) 패밀리의 단백질 타이로신 키나제들 및 Stat 패밀리의 전사인자들이 관여한다(Darnell et al, 1994). Jak-Stat 경로의 단백질들은, IFNAR1 및 IFNAR2 수용체 사슬들의 세포내(IC) 도메인들에 결합함으로써 활성화된다. IFNAR1 IC 도메인에 결합하는 단백질중에는 tyk2 및 Stat2가 있다(Abramovich et al, 1994). 그리고나서, Stat2는 Stat1에 더해져, IFN-유도 유전자들을 활성화시키는 IFN-유도 ISGF3 전사 복합체를 형성한다(Leung et al, 1995). 또한, INF-β에 의해 Stat3을 함유하는 전사 복합체들이 유도될 수 있으며(Harroch et al, 1994), IFNAR1-IC에 대한 Stat3의 INF-의존성 결합이 관찰되었다(Yang et al, 1996). IFN을 첨가하면, 단백질-타이로신 포스파타제 PTP1C 및 D가 가역적으로 IFNAR1에 결합한다(David et al, 1995a). 더욱이, 세린/트레오닌 단백질 키나제인, 두 개의 48kDa ERK2 MAP 키나제(David et al, 1995b) 및 cAMP-활성화된 단백질 키나제 A(David et al, 1996)가 IFNAR1-IC의 분리된 막-인접 50잔기들에 결합한다. 그러므로, 타입 I IFN 수용체 IC 도메인들은, 세포에서 IFN의 생물학적인 효과를 발생시키고 조절하는 여러 단백질들의 도킹사이트로서 역할한다.

효모에서의 이중-하이브리드 스크리닝은, 밝혀진 폴리펩티드 서열들에 결합하는 신규한 단백질들을 동정하는 유력한 방법이다(Fields and Song, 1989). 간단히 말하자면, (a) Gal-4 전사인자의 DNA-결합 도메인에 융합된 밝혀진 폴리펩티드(미끼)가 그 안에 있는 플라스미드 DNA와 (b) pACT 플라스미드 안에서 GAL4의 활성화 도메인과 융합된 cDNA 라이브러리로 효모 세포들을 형질감염시킴으로써, 이중-하이브리드 스크리닝을 수행한다. 그러면, 상기 폴리펩티드 미끼에 결합하는 단백질을 코딩하는 cDNA로 형질감염된 효모 세포들은, Gal4 활성을 재구성시킬 것이다. 상기 폴리펩티드 미끼에 결합하는 단백질이 존재하는지 여부는, 효모 게놈안으로 바람직하게 도입되어 있는 GAL1-lacZ 구조물로부터 β-갈락토시다제와 같은 효소활성이 발현되는냐에 의해 밝혀진다. 이러한 시험에서 양성반응을 나타내는 효모클론들로부터, pACT 플라스미드를 분리할 수 있고, 플라스미드의 삽입체의 뉴클레오타이드 서열을 결정할 수 있으며, 그 삽입체가 코딩하는 단백질을 동정할 수 있다. 이러한 방법에 의해, 사이토킨 수용체들의 IC 도메인들과 결합하는 신규한 단백질들을 동정할 수 있다(Boldin et al, 1995).

인용된 문헌들은, 본원의 임의의 청구항들의 톡허성에 대해서 관련된 선행기술 또는 숙고될 자료로서 받아들일려고 인용된 것은 아니다. 문헌들의 내용 및 날짜들에 대해 언급한 것은 출원일에 출원인이 입수할 수 있는 정보에 기초한 것이고, 이러한 언급의 정확성을 인정하는 것은 아니다.

본 발명은 일반적으로 인터페론 작용의 분자적 메카니즘에 관련된 것으로, 더욱 자세하게는, 신규한 인터페론 수용체 1-결합 단백질들, 상기 단백질들을 코딩하는 재조합 DNA 분자들, 및 인터페론에 대한 세포성 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.

도 1은, 효모에서의 유전적인 이중-하이브리드 상호작용 분석에 의해 측정된, IR1B1과 IFNAR1-IC 도메인간의 상호작용을 나타낸다. 도 아래에 박스로 표시된 부분에는, 다양한 미끼와 결합된 pACT내의 cDNA 삽입체가 표시되어 있다.

도 2는, 효모에서의 유전적인 이중-하이브리드 상호작용 분석에 의해 측정된, IR1B4와 IFNAR1-IC 도메인간의 상호작용을 나타낸다. 도 아래에 박스로 표시된 부분에는, 다양한 미끼와 결합된 pACT내의 cDNA 삽입체가 표시되어 있다.

도 3은, IR1B1의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)를 나타낸다.

도 4는, IR1B1의 아미노산 서열(서열번호 2)과, 두개의 칼슘-결합 단백질인 칼시뉴린 B(CALB로 약칭; 서열번호 3) 및 칼트랙틴(CATR로 약칭됨; 서열번호 4)의 아미노산 서열들간의 상동성 및 배열을 나타낸다. IR1B1 및 CALB안에서, 또는 CALB와 CALR사이에서 동일한 아미노산은, 이들간에 "｜"기호로 표시되어 있다. IR1B1과 CATR사이에서는 일치성이 있으나, CALB와는 일치성이 없는 것은 그들 사이에 ":"기호로 표시되어 있다. 굵은 타입으로 표시한 부분들은 칼슘 결합 헬릭스-루프-헬릭스 EF-핸드(helix-loop-helix EF-hand) 도메인들이다.

도 5는, 사람 골수종 U266S 세포들에서 IR1B1 cDNA와 하이브리드 된 IR1B1 mRNA 및 18S rRNA(아래쪽 라인)의 노던 블럿을 보여주고 있으며, 2시간 또는 18시간동안 IFN-α8 또는 IFN-β중 어느 하나로 상기 세포들에 처리한 후 IR1B1이 신속하고 순간적으로 유도되는 것을 보여주고 있다. 첫 번째 라인은 대조군으로서 IFN를 처리하지 아니한 것으로서 2시간 후의 것이다.

도 6A 및 6B는 SDS-PAGE 래인으로서, 도 6A는 분리된 IFNAR1-IC와 IR1B4의 시험관내 상호작용을 보여주고 있으며, 도 6B는 사람 U266S 및 U266R 세포막들의 세포추출물과 IR1B4의 시험관내 상호작용을 보여주고 있다. 도 6A에서는, flag-IR1B4 시험관내 전사체들과 함께 또는 이들 없이, [³⁵S]메티오닌-표지된 번역 생산물들을, 항-flag M2 비드들과 (10㎕) 면역침강시키거나(래인 1), 100아미노산 길이의 IFNAR1-IC 도메인에 융합된 GST와 연결된 글루타티온 비드들(래인 2 및 5) 또는 GST단독과 연결시킨 글루타티온 비드들(래인 3 및 6)과 (50㎕) 반응시켰다. 4℃(최종 부피 100㎕)에서 밤새도록 항온배양한 후, 비드들을 세척하고, SDS-용출된 단백질들을 환원시키는 반응조건에서 끓이고 난 후, SDS-PAGE을 하였다. 도 6B에서는, U266S(래인 1) 또는 U266R(래인 2)를 Brij 완충액 및 항단백분해효소(Abramovich et al., 1994)로 추출하고, 0.35㎖(10⁷세포)를 flag-IR1B4 전사체의 [³⁵S]메티오닌-표지된 번역생산물 75㎕과 함께 4℃에서 밤새도록 항온배양하였다. 단백질 G 비들상에 고정된 항-IFNAR1 mAb R3(25㎕)을 2.5시간동안 첨가하고, Brij 완충액으로 세척하고, SDS-용출하고, 끓이고, 환원시킨 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다. 항-flag M2 비드들을 대조군으로 하여 상기와 같은 방법으로 수행하였다(래인 3). 건조시킨 겔을 Phosphor-Imager로 시각화시켰다. 도 6A 중 처음 3개의 래인에는, 시험관내 번역반응에 IR1B4 mRNA를 첨가하지 않았다. 도 6A 중 두번째 3개의 래인에는, flag 단백질에 융합된 IR1B4 단백질을 코딩하는 mRNA를 시험관내 시스템에서 번역시켰다.

도 7은, IR1B4의 뉴클레오타이드(서열번호 7) 및 이로부터 도출된 아미노산서열(서열번호 8)을 보여주고 있다.

도 8은, IR1B4(서열번호 8)과 PRMT1(서열번호 9)의 아미노산 배열 및 그 차이를 보여주고 있다.

도 9는, IR1B4(서열번호 8)과 HCP-1(서열번호 10)의 아미노산 배열 및 그 차이를 보여주고 있다.

도 10은, 메틸트랜스퍼라제 분석을 보여주고 있다. U266S 세포의 추출물을, 단백질 A 및 항-IFNAR1 항체로 피복한 비드들과 반응시키거나(래인 1), 단백질 A로만 피복한 비드들과 반응시켰다(래인 2). 메틸트랜스퍼라제 활성을 측정하기위해,¹⁴C(메틸)-S-아데노실 메티오닌으로 히스톤을 표지화하고, SDS-PAGE상에서의 전기영동을 통해 히스톤 밴드에서의 방사능을 분석하였다.

도 11은, U266S 세포에서의 단백질-아르지닌 메틸트랜스퍼라제 활성에 관한 분석을 보여주고 있다. 래인 1에서는, 사람 U266S 세포의 단백질-아르지닌 메틸트랜스퍼라제 활성을, 서열번호 11의 서열을 가지고 있는 펩티드 R1의 메틸화로서 측정하였다. 래인 2에는, IR1B4 cDNA의 시작코돈 근처에 있는 뉴클레오타이드 12-33의 서열과 상보성이 있는, 서열번호 12의 안티-센스 올리고뉴클레오타이드를 첨가하였다. 래인 3에는, 상응하는 센스 올리고뉴클레오타이드를 첨가하였다. 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 단백질-아르지닌 메틸트랜스퍼라제 활성을 실질적으로 억제하는 반면, 대조군인 센스 올리고뉴클레오타이드는 거의 효과가 없는 것처럼 보인다.

도 12는, 도 11에서 사용된 안티-센스 올리고뉴클레오타이드(AS-1), 이에 대응하는 센스 올리고뉴클레오타이드(S-3) 및 IR1B4 cDNA 중간에 대한 또다른 안티-센스 올리고뉴클레오타이드가 존재하거나 부존재할 때, IFN-β 처리에 반응하는 사람 U266S 세포의 성장 억제를 보여주는 그래프이다. 알라마르 블루를 사용한 색채시험(실시예 7 참조)을 통해 세포 밀도를 수량화하였으며, 세포 밀도에 있어서의 감소를, 처리되지 않은 웰 대조군에 대한 퍼센트로 계산하고, 성장억제를 플럿팅하였다.

[발명의 요약]

본 발명은, IFN 수용체 1(IFNAR1) 결합 단백질로 동정되고, 본원에서 IR1B1 및 IR1B4로 지칭된, 두 개의 신규한 사람 단백질들 및 이러한 단백질들을 코딩하는 DNA에 관한 것이다. IR1B1 및 IR1B4 단백질 각각은 IFNAR1의 세포질내(IC) 도메인에 결합하고, 인터페론에 대한 세포성 반응을 매개한다.

본 발명은, IR1B1 또는 IR1B4 단백질중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 단편들을 함유하는 재조합 DNA 분자 뿐만 아니라, 이들에 의해 코딩되는 단백질들을 제공한다. 재조합 DNA 분자에서, IR1B1 또는 IR1B4 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편들은, 센스 방향 또는 안티-센스 방향으로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다.

신규한 IFNAR1 결합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 센스 방향으로 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 종양들에 직접 투여함으로써, 암치료에 있어서 외인성 인터페론 요법에 대한 반응이 강화시킨다.

나아가, 본 발명은, 환자에게 이식하기 전에 이식 조식안으로, 신규한 IFNAR1 결합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편을 안티-센스 방향으로 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 도입시킴으로써, 조직이식 생존을 지속시키는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 DNA, RNA 또는 단백질을 함유하는 약제학적 조성물 및 같은 것을 사용한 치료학적 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 신규한 단백질에 특이성이 있는 항체들에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은, 인터페론 타입 1(IFN-α, β 또는 ω) 수용체의 IFNAR1 사슬의 세포질내 도메인(IC)와 상호작용할 수 있는 두 개의 신규한 단백질들의 발견에 관한 것으로서, 본원에서는 상기 단백질들을 IFN 수용체 결합 단백질 1(IR1B1) 및 IFN 수용체 결합 단백질 4(IR1B4)으로 명명하였다. 효모에서의 유전학적 이중-하이브리드 시험에 의해서, IFNAR1와 상기 두 개의 신규한 단백질간의 상호작용이 확인 되었는데, Gal4 활성화 도메인과 융합된 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA로 형질감염된 효모 리포터 균주 SFY526(Bartel et al., 1993)은, 오직 IFNAR1-IC 도메인(Gal4 DNA-결합 도메인과 융합되어 있음)이 미끼로 사용될 경우에만 β-갈락토시다제 활성을 나타내었다.

IR1B1 cDNA의 서열은 191개의 아미노산 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 데이타베이스에 대한 컴퓨터 조사에 따르면, IR1B1은, 예를들면, 칼슘 결합 단백질, 칼시뉴린 β(calcineurin β) 또는 칼트랙틴(caltractin)에 대한 칼슘 결합 사이트들(E-F 핸들)과 상당한 동종성을 보여주고 있다. 칼시뉴린 β(Guerini et al., 1989)는, 세린/트레오닌 포스파타제의 19kDa 서브유니트로서, 전사 인자 NAFT가 T-림포사이트의 핵으로 이동하는 것을 활성화시키는데 중요한 역할을 하며 사이클로스포린과 같은 면역억제용 약물에 의해 억제된다. 칼트랙틴(Lee and Huang, 1993)은 21kDa단백질로서, 중심체에서 발견되는 세포골격-관련 단백질이고, 유사분분열동안 중심체의 이동에 관여하며, 더 일반적으로는 미세소관 구성 중심에 관여한다. 따라서, 신규한 IR1B1 단백질은, 칼슘에 의해 조절된 단백질인 칼시뉴린 및 칼트랙틴 패밀리의 새로운 일원이다.

놀랍게도, IR1B1의 유전자는 IFN처리에 의해 사람 세포들에서 신속하게 활성화된다는 것을 알게되었다. 따라서, 이것은 IFN에 의해 유도되는 칼슘-결합 단백질의 첫번째 예이다. 칼슘이온은 세포 모폴로지, 접착 및 분열을 조절하기 때문에, 세포에서 IR1B1 활성의 조정은, 정상 또는 악성 세포의 IFN에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있다. 세포에서 IFN의 활동을 매개하는 IR1B1의 역할은, IFN 수용체 사슬의 IC-도메인과 IR1B1간의 상호작용에 의해 뒷받침된다.

IR1B1과 같이 IR1B4도 서열데이타의 컴퓨터 조사에 의해 확인된 바와 같이 신규한 단백질이라는 것을 알게되었으며, 또한, IR1B4는, S-아데노실 메티오닌을 이용하여 단백질에 있는 아르지닌 잔기를 메틸화시키는 효소로서 단백질 아르지닌메틸트랜스라제라고 명명된 효소들(PRMT1: Kagan and Clarke, 1994; Lin et al., 1996)과 서열 동종성을 갖고 있다는 것도 알게되었다. IR1B4는 시험관내 IFNAR1의 IC-도메인에 직접 결합하며, 사람 세포에서 분리된 IFN-α,β 수용체의 IFNAR 사슬과 PRMT 활성간에 구조상 연관성이 있다는 것이 히스톤의 메틸화에 의해 입증되었다. IR1B4 cDNA의 안티-센스 올리고디옥시뉴클레오타이드를 사람 배양세포에 첨가하면, 배양세포에서 PRMT의 활성이 감소된다는 것이 관찰되었다. 이러한 방법으로 처리된 사람 골수종 세포들은, 성장-억제에 의해 측정된 것과 같은 정도로 IFN에 대한 반응이 감소되었다. 그러므로, IR1B4/PRMT는, 종양세포에서 IFN 수용체가 성장-억제를 야기시키는 경로에 관여하며, 또한, IFN 수용체의 다른 기능에 관여한다. PRMT의 알려진 기질들로는 많은 수의 RNA 및 DNA 결합 단백질, 및 특히 비정형핵 라이보핵단백질(hnRNPs)를 포함하고 있다. hnRNP들은 핵으로부터 세포질로의 mRNA 수송, 프리-mRNA의 얼터너티브 스플라이싱 및 전사후 제어에 관여한다(Liu and Dreyfuss, 1995). 따라서, IFN 수용체와의 연관성에 의해 발견된 신규한 사람 IR1B4/PRMT cDNA 및 단백질은, IFN에 대한 사람 또는 동물 세포들의 반응을 수정하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 DNA 분자는, IR1B1 또는 IR1B4 단백질 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 단편을 포함하며, IR1B1 또는 IR1B4 cDNA의 발현을 증가시킴으로서 IFN에 대한 세포성 반응을 증가시키거나, 안티-센스 RNA 분자로 IR1B1 또는 IR1B4 단백질의 발현을 감소시킴으로서 IFN에 대한 세포성 반응을 감소시키는데 사용될 수 있다.

IR1B1 또는 IR1B4 cDNA의 증가된 생체내 발현은, 암치료에 유용한데, IFN에 대한 증가된 세포성 반응이 악성세포 성장을 감소시키며 외인성 IFN 치료에 대한 강화된 반응을 나타낸다. IFN에 대한 세포성 반응을 증가시키도록 표적 위치에서 IR1B1 및 IR1B4의 생체내 발현을 증가시키기 위해, 강력한 구조의 프로모터에 센스 방향으로 작동가능하게 연결된 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA를 포함하는 발현 벡터들을, 표적 위치로 예를들면 뇌종양 또양 전이성 종양 소결절(예를들면, 흑색종 또는 흉부암)안으로 직접 주입할 수 있다.

반대로, IR1B1 또는 IR1B4 단백질들의 생체내 발현을 감소시키는 것이 조직이식의 생존을 연장시키는데 유용한데, 피이식자에 있어서 조직 이식의 거부는 조직적합성 항원(MHC 클라스 I)에 의해 매개되고, 상기 항원의 합성은 IFN 자극에 좌우되기 때문이다. IR1B1 또는 IR1B4의 cDNA 또는 이들의 단편들을 적절한 벡터에 운반시키고 프로모터에 안티-센스 방향으로 작동가능하게 연결시켜, 이식되는 조직의 세포들안으로 도입시키면, 안티-센스 RNA의 발현이 IR1B1 또는 IR1B4의 mRNA(또는 IR1B1/IR1B4에 대한 센스 RNA)를 감소시키고 결과적으로 IR1B1 또는 IR1B4 단백질의 세포내 수준을 감소시킨다.

안티-센스 방향으로, 즉 DNA의 정상 또는 센스 방향 및 그것의 전사된 센스 RNA(mRNA)과 반대방향으로 배치되어 있는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 업스트림 프로모터로부터 안티-센스 RNA가 전사된다. 센스 RNA에 상보성이 있는 안티-센스 RNA을 발현시키는 것은, RNA 분자의 생물학적 기능들을 강력하게 조절하는 방법이다. 센스 RNA와 안티-센스 RNA 사이에 안정된 이중체가 형성됨으로써, 정상 또는 센스 RNA 전사체가 불활성화되고 번역되지 못하게 된다.

본 발명의 실시예와 같이, 재조합 DNA 분자들은, 센스 방향 또는 안티-센스방향 중 어느 한 쪽으로 프로모터에 작동-가능하게 연결된 IR1B1 또는 IR1B4의 cDNA 또는 그들의 단편들을 함유한다. "프로모터"란, RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 "작동가능하게 연결된" 핵산 서열의 전사를 촉진시킬 수 있는, 이중-쇄 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 따라서, 프로모터가 DNA 서열의 전사에 영향을 줄 수 있는 한, DNA 서열의 방향과 관계없이, DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

전사를 제어하는데 사용되는 프로모터들은, 숙주/표적 세포들에서 기능을 수행할 수 있는 것이면 된다. 포유류 세포들에서 기능이 있는 프로모터들의 예로는 SV40 초기 프로모터, 아데노바이러스 매이저(major) 후기 프로모터, 단순 포진(HSV) 티미딘 키나제 프로모터, 로우스 육종(RSV) LTR 프로모터, 사람 사이토 메갈로바이러스(CMV) 중간 초기 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) LTR 프로모터, 인터페론 β 프로모터, 열쇼크 단백질 70(hsp70) 프로모터뿐만아니라, 관련업계에 잘 알려진 다른 많은 프로모터들을 포함한다.

IR1B1 또는 IR1B4 단백질 발현을 위해 센스 방향으로 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 강력한 구성 프로모터가 바람직하다. 이러한 프로모터는, IR1B1 또는 IR1B4의 발현을 조절하는 내인성 세포메카니즘 존재여부와 관계없이, 높을 수준으로 IR1B1 또는 IR1B4을 발현시킬 수 있다.

마찬가지로, 안티-센스 방향으로 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터도 강력한 프로모터가 바람직하며, 예를들면, 엡스타인-바르 바이러스(EBV) 조절영역에 존재하는 프로모터는 높은 수준으로 안티-센스 RNA 발현시킬 수 있다(Deiss and Kimchi, 1991).

안티-센스 서열은 숙주/표적 세포들에서만 발현할 수 있는 것이 바람직하며, 특히 사람 세포가 바람직하고, 발현된 안티-센스 RNA는 안정하여야 한다(즉, 빨리 분해되지 않아야 한다). 안티-센스 RNA는 숙주/표적 세포에서 발현된 센스 mRNA하고만 특이성있게 하이브리드하여야 하며, 본질적으로 번역될 수 없는 안정된 이중-쇄의 RNA분자를 형성하여야 한다. 다시말하자면, 숙주/표적세포에서 발현된 안티-센스 RNA는, 발현된 센스 mRNA가 IR1B1 또는 IR1B4 단백질로 번역되는 것을 방해한다. 벡터에 의해 운반된 안티-센스 서열은, 전체 IR1B1 또는 IR1B4를 운반할 수 있고, 또한 안티-센스 부위가 센스 mRNA와 하이브리드하여 IR1B1 또는 IR1B4 단백질로의 번역을 방해할 수 있는 한, IR1B1 또는 IR1B4의 일부분만을 운반할 수 있다. 따라서, 명세서 및 청구범위에 사용된 "안티-센스" 서열은, 형질전환/형질감염된 세포에서 발현될 수 있고 또한 "센스" IR1B1 또는 IR1B4 mRNA와 특이성있게 하이브리드하여 번역될 수 없는 이중-쇄 RNA분자를 형성할 수 있는, 전체 안티-센스서열 또는 그 일부로 정의된다.

안티-센스 서열은 IR1B1 또는 IR1B4 mRNA 전체길이와 하이브리드할 필요는 없다. 그 대신, "센스" mRNA의 5'-비번역 비코딩 서열, 코팅 서열 또는 3'-비번역 서열과 같은, 선택된 영역과 하이브리드될 수 있다. 안티-센스 서열은, cap 및 시작코돈 위치와 같은, 5'-코딩 서열 및/또는 5'-비코딩 영역과 하이브리드하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 많은 안티-센스 올리고뉴클레오타이드 예들에서, 시작코돈에 표적화하는 것이 더욱 효과적인 반면, 코딩 영역안에 인는 내부 서열들에 표적화하는 것은 그다지 효과적이지 않다고 관찰되었기 때문이다(Wicstrom, 1991). IR1B4 센스 mRNA의 번역을 방해하는데 있어서의 안티-센스 서열의 효율성은, 실시예 7에 기재된 바와 같이 U266S 세포에 있어서 단백질-아르지닌-메틸트랜스퍼라제활성에 대한 측정에 의해 용이하게 검정될 수 있다. 포유류 게놈 크기의 관점에서 볼 때, 안티-센스 IR1B1 또는 IR1B4 서열의 길이는 적어도 17염기쌍이 바람직하며, 적어도 30염기쌍인 것이 더욱 바람직하다. 그러나, 서열이 짧을수록 더 유용한데, 즉, 그들은 우연하게 다른 포유류 서열들과는 하이브리드하지 않거나, 본 발명의 목적을 이루는데 방해할 정도로 "교차-하이브리드화"와 같은 것이 세포메카니즘을 방해하지는 않는다.

바람직한 하이브리드화 표적 및 바람직한 안티-센스 서열 길이 모두는 체계적인 실험에 의해 즉시 결정된다. Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, N.Y., 1987-1996, 및 Sambrook et al,, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Clod Spring Harbor, NY(1989)에 기재된 알반적인 방법들에 의해, 벡터로부터 점점 더 커지는 안티-센스 서열의 부위를 체계적으로 제거할 수 있다. 전체길이 안티-센스 서열외에도, 일련의 갈짓자모양의 결실(staggered deletions)이 바람직하게는 안티-센스 서열의 5'-말단에 생길 수 있다. 이것은 일조의 끝이-잘린 안티-센스 서열을 만들어 내는데, 바람직하게는 센스 mRNA의 5'-말단과 상보적이고, 결과적으로는, 센스 mRNA의 5'-말단(안티-센스 RNA의 3'-말단과 상보적인 것)에서 이중-쇄를 형성하여 번역될 수 없는 RNA 분자를 형성한다. 게다가, 올리고뉴클레오타이드 AS-1(서열번호 12)와 같은 안티-센스 올리고뉴클레오타이드는 용이하게 화학적으로 합성될 수 있으며, IR1B1 또는 IR1B4 단백질의 생체내 세포 발현을 감소시킬 용도로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 벡터 상으로 도입될 수 있다.

본 발명의 벡터들로는, 포유류 세포들을 형질감염시키는데 일반적으로 사용되는 진핵 또는 원핵 벡터들이면 되고, 예를들면, 관련업계에 잘 알려진 것으로 에피솜으로 복제가능한 벡터 또는 염색체에 통합될 수 있는 벡터들이 있다. IR1B1 또는 IR1B4 안티-센스 RNA의 발현에 바람직한 벡터로는, 엡스테인-바르 바이러스 조절성 영역(Deiss and Kimchi, 1991)을 함유하는 에피솜 플라스미드가 있는데, 상기 조절성 영역은 프로모터 역할을 하고, 상기 조절성 영역에 대하여 안티-센스 방향으로 배열된 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA에 작동가능하게 연결된다. 안티-센스 벡터들 및 올리고뉴클레오타이드 포스포로티오에이트(phosphorothioates)의 용도는, Annals of the New York of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, eds. B.E. Huber and J.S. Lazo, Vol.716, 1994(예를들면, Milligan et al., pp.228-241)에 소개되어 있다.

이식이 필요한 환자에게 이식된 조직 또는 기관의 생존을 연장시키기 위해, 본 발명에 따라, IFN에 대한 세포성 반응을 감소시킬 수 있다. 이식 조식의 거부반응은 조직적합성 항원에 의해 매개되며, 이러한 MHC 클래스 I 항원의 합성은 IFN 자극에 좌우된다. 따라서, IFN 자극에 대한 세포성 반응을 감소시키면, 이식 조직의 생존이 연장된다. 본 발명에 따라 조직 이식 생존을 연장시키는 방법은, 환자에게 이식될 조직 또는 기관 세포들안으로, 안티-센스 방향으로 프로모터에 작동가능하게 연결된 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA 서열 또는 이들의 단편을 함유하는 재조합 DNA 분자를 도입하는 단계 및 안티-센스 IR1B1 또는 IR1B4 RNA를 형질감염/형질전환된 세포들에서 발현시키는 단계를 포함한다. 이러한 목적에 적당하며 관련업계에 잘 알려진 방법으로, 재조합 DNA분자가 조직 또는 기관의 세포안으로 도입될 수 있다. 조직 또는 기관의 세포안으로 재조합 DNA 분자를 도입시킨 후, 조직 또는 기관은 이식이 필요한 환자에게 이식될 수 있다.

발현벡터이면서, 센스 방향으로 프로모터에 작동가능하게 연결된 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA를 운반하는 재조합 DNA분자을 함유하는 약제학적 조성물은, 종양안으로 예를들면, 뇌종양 또는 전이성 종양 소결절안으로 직접 투입되어, 이러한 종양안에 있는 세포들이 암치료를 위한 외인성 IFN 요법에 더 잘 반응하도록 할 수 있다. 외인성 IFN 요법에 대한 강화된 세포성 반응은 악성 세포 성장을 억제할 수 있다.

생체내 또는 시험관내 유전자 전이는, Annals of the New York Academy of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, Vol.716, 1994에 잘 기재되어 있다; 예를 들면, G.E. Plautz에 의해 쓰여진 "Direct Gene Transfer for the Understanding and Treatment of Human Kisease" 제144쪽 내지 제153쪽 및 Roemer et al.,에 의해 쓰여진 "Mechanisms of Action of the p53 Tumor suppressor and Prospects for Cancer Gene Therapy by Reconstitution of p53 Function" 제265쪽내지 제282쪽을 참조하라. 이식될 조직이나 기관의 세포 또는 종양의 세포들안으로 재조합 DNA 분자를 삽입하는 방법은, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스-관련 바아러스(AAV) 벡터를 포함할 뿐만아니라, 직접적인 DNA 삽입 또는 올리고뉴클레오타이드-리포솜 삽입을 포함한다. 레트로바이러스 벡터를 뇌종양안으로 삽입하거나 아데노바이러스를 낭포성섬유증 환자의 호흡관안으로 감염시키는데 사용하는 임상적인 시도는 잘 알려져 있다.

작동가능하게 연결된 프로모터에 대하여 센스 또는 안티-센스 방향으로 IR1B1 또는 IR1B4 cDNA 또는 이들의 단편을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 함유하는 약제학적 조성물은, 의도하는 목적을 성취하는데 유효한 양의 재조합 DNA 분자를 함유하는 모든 조성물을 포함한다. 나아가, 약학적 조성물은, 재조합 DNA 분자를 안정화시키거나 투약을 용이하게 하는, 약학적으로 적절한 운반체 또는 부형제를 함유할 수 있다.

본 발명의 또다른 실시예는, 생검으로부터 얻은 종양 조직에 있는 IR1B1 또는 IR1B4 단백질의 수준을 분석하는 면역검출 방법과 같이 진단에 사용하기 위해 또는 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제에 사용하기 위해, IFNAR1-결합 단백질인 IR1B1 또는 IR1B4, 또는 이들의 단편에 특이성이 있는 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 분자들을 제시한다.

"항체"란 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(mAbs), 키메라 항체, 항-이디오타입(anti-Id) 항체, 단일-사슬 항체, 및 재조합기술에 의해 제조되고 인체에 적용시킨 항체뿐만아니라, 효소에 의한 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기법(그러나 여기에 한정되는 것은 아님)과 같은 알려진 기법에 의해 제공되는 이들의 활성 단편들도 포함하는 것을 의미한다.

폴리클로날 항체는, 하나의 항원으로 면역시킨 동물들의 혈청으로부터 유래된 불균질 집단의 항체 분자들이다. 모노클로날 항체는 항원에 특이성이 있으면서 실질적으로 균질한 집단의 항체을 포함하며, 이러한 집단은 실질적으로 유사한 에피토프 결합 위치를 포함하고 있다. MAbs는 당업자에게 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를들면, 본원에 참조문헌으로 통합되어 있는 내용인, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975); 미국특허 제4,376,110호; Ausubel et al, eds., supra, Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory(1988); 및 Colligan et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y.,(1992, 1993)을 참조하라. 이러한 항체들은, IgG, IgM, IgE, IgA, GILD 및 이들의 서브클래스를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스일 수 있다. 본 발명에 따른 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내에서, 그 위치 그대로, 또는 생체내에서 배양될 수 있다. 생체내 또는 그 위치 그대로 mAbs를 높은 역가로 생산하는 것은 바람직한 생산 방법이다.

키메라 항체는 다른 종의 동물들로부터 유래된 각기 다른 부위들을 갖는 분자로서, 예를들면, 쥐 mAb유래의 가변 영역와 사람 면역글로불린의 불변 영역을 갖는 항체가 있다. 키메라 항체는, 적용에 있어선 면역원성 감소시키고 생산성에 있어선 수득율을 증가시키는데 주로 사용되는데, 예를들면, 쥐 mAbs는 하이브리도마로부터 더 높은 수득율을 갖으나 사람에 있어서는 더 높은 면역원성을 갖기 때문에, 사람/쥐 키메라 mAbs가 사용된다. 키메라 항체 및 이들의 생산방법은 관련업계에 알려져 있다[Cabilly et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277(1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646(1984); Cabilly et al., 유럽특허출원 제125023호(1984. 11. 14. 공개됨); Neubnerger et al., Nature 314:268-270(1985); Taniguchi et al., 유럽특허출원 제171496호(1985. 2. 19. 공개됨); Morrison et al., 유럽특허출원 제173494호(1986. 3. 5. 공개됨); Neuberger et al., PCT 출원 WO8601533(1986. 3. 13. 공개됨); Kudo et al., 유럽특허출원 제184187호(1986. 6. 11. 공개됨); Morrison et al., 유럽특허출원 제173494호(1986. 3. 5. 공개됨); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074(1986); Robinson et al., 국제특허 공개, WO 9702671(1987. 5. 7. 공개됨); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443(1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218(1987); Better et al., Science 240:1041-1043(1988); 및 Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.].

항-이디오타입(anti-Id) 항체는, 항체의 항원-결합 위치와 일반적으로 연관된 유일한 결정기를 인식하는 항체이다. Id 항체는, 준비될 항-Id에 대한 mAb로, mAb과 같은 출처로써 종 및 유전자 타입(예를들면, 마우스 스트래인)이 같은 동물을 면역시킴으로써 준비될 수 있다. 면역된 동물은, 면역시킨 항체의 이디오타입 결정기들은 인식하고 반응하여, 이러한 이디오타입 결정기들에 대한 항체(항-Id 항체를 생산할 것이다. 예를들면, 미국 특허 제4,699,880호 참조하라.

또한, 항-Id 항체는 "면역항원"으로 사용되어 또다른 동물에 있어서 면역반응을 유도하여, 소위 항-항-Id 항체를 생산할 수 있다. 항-항-Id는, 항-Id를 유도시킨 원래 mAb와 에피토프가 동일할 것이다. 따라서, mAb의 이디오타입 결정기에 대한 항체들을 사용하여, 동일한 특이성을 갖는 항체를 발현하는 다른 클론들을 동정하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체들은, 모노클로날 항체와 같은 자연그대로의 항체들일 수 있으나, 원하는 기능을 제공하는 것은 에피토프 결합 위치이다. 따라서, 자연그대로의 항체외에도, Fab 또는 F(ab')₂단편들과 같은 이들의 단백분해 단편들도 사용될 수 있다. Fab 또는 F(ab')₂단편들은, 순환 중 더 빨리 제거되는 자연그대로의 항체중 Fc 단편을 결실한 것으로, 자연그대로의 항체보다 조직 결합에 대한 비특이성이 덜하다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)). 일반적으로, 이러한 단편들은 파파인(Fab 단편을 제공하기 위해) 또는 펩신(F(ab')₂단편을 제공하기 위해)과 같은 효소를 이용하여 단백분해 절단을 통해 얻어진다.

나아가, 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA는, 다른 항체에 삽입되어 키메라 항체를 생산하거나(예를들면, 미국 특허 제4,816,567호 참조), T-세포 수용체안으로 삽입되어 동일하고 넓은 범위의 특이성을 갖는 T-세포를 생산할 수 있다(Eshhar, Z. et al., Br. J. Cancer Suppl., 10:27-9, 1990; Gross, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10024-8, 1989 참조). 또한, 단일 사슬의 항체들이 생산되고 이용될 수 있다. 단일 사슬 항체들은 단일 사슬 혼성 폴리펩티드로서, 항체 결합 능력을 갖으며, 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 가변 부위(연결된 V_H-V_L또는 단일 사슬 Fv)와 동종성이 있거나 유사한 한 쌍의 아미노산 서열을 포함할수 있다. V_H또는 V_L모두는 자연적인 모노클로날 항체 서열을 모사할 수 있으며, 상기 사슬 중 하나 또는 모두는 미국특허 제5,091,513호에 기재된 타입의 CDR-FR 구조물을 이룰 수 있다. 경쇄와 중쇄의 가변부위들과 유사한 분리된 폴리펩티드들은 폴리펩티드 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일 항체들을 생산하는 방법은, 특히 V_H또는 V_L사슬들의 폴리펩티드 구조들을 코딩하는 DNA가 알려져 있어서, 예를들면, 미국특허 제4,946,778호, 제5,091,513호 및 제5,096,815호에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다.

따라서, "항체의 항원-결합부위를 포함하는 분자"는, 임의의 동물 세포주 또는 미생물에 의해 만들어진 임의의 아이소타입의 자연그대로의 면역글로불린 분자뿐만아니라, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂단편, 이들의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변부위을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 그들의 반응성 있는 분획도 포함하며, 상기 반응성 있는 분획을 통합하고 있는 키메라 항체 또는 단일-사슬 항체뿐만 아니라 이러한 항체의 반응성 있는 분획이 물리적으로 삽입된 다른 타입의 분자나 세포 예를들면, 키메라 T-세포 수용체 또는 상기 수용체를 갖는 T-세포, 또는 상기 반응성있는 분획을 함유하는 분자의 부위에 의해 치료용 조각을 배달하도록 개발된 분자도 포함한다.

지금 본 발명은 완전히 기술되어 있으나, 실례에 의해 제공된 하기의 실시예를 통해 동일한 것이 쉽게 이해될 것이나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 두개의 사람 단백질, IR1B1 및 IR1B4는 IFN 수용체에 결합한다.]

전체 IFNAR1-IC 도메인을 코딩하는 cDNA 단편을, BamH1-센스프라이머(5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC(서열번호 5)) 및 EcoR I 안티-센스프라이머(5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC(서열번호 6))을 이용하여 PCR로 증폭하고, 블루스크립트(BlueScript) 벡터(BS-SK⁺, Stragene)에 클로닝시켰다. 이중-하이브리드 스크리닝을 하기 위해, 상기 BS-IFNAR1-IC로부터 나온 BamH I -Sal I 단편을 pGBT₁₀벡터(CloneTech)에 도입시키고, Gal4 DNA결합 도메인 후단에 동상(in-phase)로 융합시켰다(pGBT₁₀-IFNAR1-IC). Durfee et al(1993)의 변형된 공정에 따라, 사람 엡스테인-바르 바이러스(EBV)-형질전환된 B-림포사이트로부터 나온 pACT 플라스미드 cDNA 라이브러리를 이용하여, 효모 리포터 스트래인 Y153에 pGBT-IFNAR1-IC와 함께 형질전환시켜, 이중-하이브리드 스크리닝 방법(Fields and Song, 1989)을 수행하였다. 효모 Y153 스트래인은 GAL1 업스트림 활성화 서열(UAS)조절하에 있는 두 개의 리포터 유전자를 가지고 있고, Gal4 전사 인자의 활성이 재구성될 경우에만 상기 유전자가 전사될 수 있다. 상기 전사인자가 재구성되려면, 상기 특정 효모 클론안으로 도입된 pACT 플라스미드에 의해 코딩되어 있는 융합 단백질이, pGBT₁₀플라스미드로부터 나온 IFNAR1-IC 도메인과 친화성이 있어야 한다. 리포터 유전자 중 하나는 GAL1 His3이며, 이것은 히스티딘이 없는 배지에서 성장할 수 있도록 한다; 다른 리포터 유전자는 GAL-LacZ로서, 이것은 β-갈락토시다제 활성을 제공한다. 더욱이, pACT 플라스미드는 Leu 유전자를 갖으며, pGBT₁₀플라스미드는 TRP1 유전자를 갖고 있어서, 각각 루이신 및 트립토판이 없은 배지에서만 성장할 수 있도록 한다. 25mM 3-아미노트리아졸의 존재하에 Trp, Leu, His이 없는 합성 배지 SC에서 클론들을 선별하였다(이것은 히스티딘 프로토트로피(prototropy)에 의해 더 선별된다). 그리고 나서, X-gal 필터 분석을 사용하여 성장하고 있는 클론들에 대하여 β-갈락토시다제 활성을 시험하였다(Breeden and Naysmith, 1985).

9개의 양성 효모 클론들을 수득하였고, E.coli HB101 안으로 형질감염하고 leu⁺형질감염체를 선별함으로써, 이들의 pACT플라스미드를 회수하였다. 효모 DNA 각각에 대하여, 두개의 E.coli HB101 클론들이 분리되었다. 상기 E.coli 클론들로부터 나온 pACT플라스미드의 부분적인 DNA 서열화에 의해, IR1B1 및 IR1B4로 명명된 두 개의 그룹의 cDNA 서열로 나타났다. IR1B1 및 IR1B4 그룹의 pACT 플라즈미드에 대한 특이성 시험을 하기 위해, 라민, cdk2 및 p53 또는 다른 대조군 삽입체를 갖고 있는 pAS 플라스미드로 SFY526 효모 리포터 스트래인(Bartel et al, 1993)에 함께 형질전환시켰다(CloneTech). SC -trp, -leu에서 자란 콜로니들에 대하여 β-갈락토시다제 발현 시험을 수행하였다. 양성 pACT 플라스미드로부터 Xho I 으로 삽입체를 잘라내고, BS-KS(Stratgene)안으로 클로닝시키고 난 후, 373A DNA 서열기에서 다이디옥시 종결자 순환 서열화 기기(DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit)를 이용하여 T7 및 T3 프로모터로부터 서열화하였다(Applied Biosystem).

도 1은, 효모 SFY526안으로, 다른 pAS 또는 pGBT10 플라스미드 미끼와 함께 형질감염된, pACT 클론 IR1B1에 대한 결과를 보여주고 있다. 필터상의 1 내지 9 스트리크(streaks)에 있는 trp 및 leu이 없는 선별성 SC 배지에서 효모를 성장시켰다. X-gal 시약(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-칼락토피라노사이드)으로 염색시키면, 오직 2 및 4 스트리크에서만 양성반응을 보였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 스트리크 4는 활성있는 lacZ 유전자를 갖고 있는 대조군 효모이다. 스트리크 2는 IR1B1 및 IFNAR1-IC 융합 단백질들의 조합이다. IR1B1 단독(스트리크 9), 또는 IR1B1과 IFNAR1-IC의 조합을 제외한 다른 조합들은 β-갈락토시다제 활성을 나타내지 않았다. 그러므로, IR1B1은, IFNAR1 IFN수용체 사슬의 IC도메인에 특이성있게 결합할 수 있다.

마찬가지로, 도 2는 효모 SFY526안으로, 다른 pAS 또는 pGBT₁₀플라스미드 미끼와 함께 형질전환된 pACT 클론 IR1B4에 대한 결과를 보여주고 있다. 효모는, 필터상의 1 내지 8 스트리크에 있는 trp 및 leu가 없는 SC 배지에서 성장시켰고, X-gal시약으로 염색하면, 오직 스트리크 3 및 7에서만 양성반응을 나타내었다. 도 2의 아래 상자부위에 나타난 바와 같이, 스트리크 7은 활성이 있는 lacZ 유전자를 갖는 대조군 효모이다. 스트리크 3은 IR1B4 및 IFNAR1-IC 융합 단백질들의 조합이다. IR1B1에서 얻은 결과와 마찬가지로, IR1B4 단독으로(스트리크 1), 또는 IR1B4와 IFNAR1-IC의 조합을 제외한 다른 조합들은 β-갈락토시다제 활성을 나타내지 않았다. 그러므로, IR1B4도 IRNAR1 IFN 수용체 사슬의 IC도메인에 특이성있게 결합할 수 있다.

[실시예 2: IR1B1 단백질 서열은 칼슘-결합 EF 핸드 위치들을 보여주고 있다]

pACT-IR1B1 플라스미들의 cDNA 삽입체를 제한효소 Xho I 로 잘라, 블루스크립트 BS-KS 벡터에 클로닝시키고 난 후, 373A DNA 서열기에 있는 염색디옥시 결정자 사이클 서열기(Biosystems를 응용한 것임)를 이용하여, T7 및 T3 프로모터로부터 서열화하였다. 가장 긴 플라스미드는, Gal4 활성화 도메인 및 pACT 플라스미드의 링커 서열뒤에, 830개의 뉴클레오타이드 서열(도 3)을 갖고 있으며, 그 안에 191개 아미노산의 해독틀을 갖고 있다(도 3). BlastP 알코리틈(algorithm; Altschul et al, 1990)뿐만아니라, 바이오액셀레이터 얼라인먼트(Bioaccelerator Alignment; Henikoff and Heikoff, 1992)를 이용하여, 단백질 데이터베이스의 온라인 조사를 하였다. 가장 높은 점수는, 아미노산 52 내지 173에서 62.1%의 유사성과 32.4%의 동일성을 갖는 칼트랙틴(CATR_HUMAN, accession Swiss Protein SW New P41208) 및 아미노산 50 내지 171에서 59.8%의 유사성과 32.5%의 동일성을 갖는 칼시뉴린 B(CATB_HUMAN, accession Swiss Protein P42322)에서 받았다.

도 4는 사람 칼시뉴린 B(CALB) 및 칼트랙틴(CATR)과 IR1B1의 배열을 보여준다. 칼슘 결합, 헬릭스-루프-헬리스 EF-핸드 도메인은 굵고 밑줄친 문자로 표시되어 있다. IR1B1은 두 개의 EF-핸드 위치를 가지고 있으나, 첫 번째 두 개의 EF-핸드 도메인은 보존적이지 않다. IR1B1은 칼시뉴린 B(도 4의 수직선으로 표시되어 있음) 및 칼시트랙틴(도 4의 콜론으로 표시되어 있음) 양쪽과 동종성을 보여주고 있다. 그러나, IR1B1는 확실히 전에는 동정되지 아니한 신규하고 다른 사람 단백질이다.

[실시예 3: IR1B1은 IFN-유도성 유전자 생성물이다]

사람 골수종 U266S 세포들(5㎖ 현탁액 배지에 약 3×10⁶개의 세포가 있음)을 재조합 IFN-α8(2×10⁸IU/mg 박테리아 출처) 또는 재조합 IFN-β(3×10⁸IU/mg CHO세포 출처) 750IU/㎖으로 2시간 또는 18시간동안 처리하였다. IFN처리후, 세포들을 수집하고, 구아니디늄 티오시아네이트 및 페놀을 포함하고 있는 제품인, Tri-시약(Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio)으로 추출하였다. 추출된 RNA를 에탄올로 침전시키고, 포름알데하이드로 변성시키고, 포름알데하이드-아가로스겔(10㎍RNA/slot)에서 전기영동하여 분석하고 난 후, 유전자스크린 플러스(GeneScreen Plus)로 블럿팅하였다(Dupont, New England Nuclear, Billeriac, MA). 노던 블럿을,³²P-dCTP 및 무작위 프라이밍을 이용한 레디프라임 키트(Rediprime kit; Amersham, UK)로 표지된, 10⁶cpm의 IR1B1 cDNA과 반응시켰다.

도 5는 IP1B1 cDNA가 1.1kb RNA와 하이브리드하였다는 것을 보여주고 있다. U266S세포를 IFN-β로 처리하고 2시간 후 IR1B1 mRNA의 양이 현저히 증가하였다. 그러나, IFN처리하고 18시간후, IR1B1 mRNA가 세포로부터 사라졌으며, 이는 신속하고 순간적으로 유도된다는 것을 의미한다. IFN에 의해 유도되는 많은 mRNA는 IFN으로 처리하고 24시간이상동안 세포안에 계속 축적된다(Revel and Chebath, 1986).

동일양의 RNA가 각 레인에 존재하는 것이 확인되었다. 도 5의 아래 부분에서 보여주는 바와 같이, 같은 U266S(IFN 수용체가 풍부함) RNA가 18S 라이보솜 cDNA 프로브와 하이브리드한 것은, 각 레인에 동일양의 18S rRNA가 있음을 보여준다(18S rRNA로 수행한 블럿의 일부에만 나타나 있다). 1,200U/㎖의 IFN로 유도시킨 또다른 실험에서, IR1B1 mRNA도 2시간에 IFN-α8과 함께 관찰되었으나, 30분에는 관찰되지 않았다(도에는 나타나 있지 아니함).

IR1B1 mRNA는 다른 사람 세포에서도 1.1kb로 동일 크기를 갖는다고 밝혀졌다(U266, Daudi and THP-1 세포들). 상기 크기는 칼트랙틴 mRNA와 가까우나, 칼시뉴린 B mRNA(2.5kb)와는 그렇지 않다는 것은 주목할 만하다. 작은 크기의 mRNA는 IR1B1이 20kDa의 작은 단백질인 것과 일치한다.

[실시예 4: IR1B4 단백질은 시험관내 IFNAR1에 결합한다]

IFNAR1의 IC-도메인에 IR1B4가 결합하는지 여부를 시험하기 위해, 망상적혈구 용해물안에서 시험관내 번역을 이용하여 단백질 꼬리표(flag 서열)를 갖는 IR1B4 단백질을 합성하고, 상기 단백질을 E.coli.에서 재조합 IFNAR1-IC 융합 단백질과 반응시켰다. 실시예 1로부터 나온 pACT-IR1B4 DNA를, Xho-I로 자르고 클루나우 효소로 채워넣은 후, EcoR I으로 자르고 채워넣은 PEGE-flag 발현 벡터(Ellis et al., 1986)안에 클로닝시켰다. 프래임 안에 flag-IR1B4 융합을 포함하고 있는 Not I -BamH I 단편을, Not I -BamH I 으로 자른 BS-SK에 재클로닝하였으며, 상기 단편은 T3프로모터 다운스트림에 위치한다. flag 융합의 서열이, T3 프로모터로부터 서열화됨으로써 밝혀졌다. T3 폴리머라제와 1㎍ BamH I -선형화된 BS-flag-IR1B4 DNA를 가지고 시험관내 전사(Promega kit)를 수행하였다. 토끼 망상적혈구 용해물(Promega kit)에서 [³⁵S]메티오닌(Amersham) 및 5㎍ RNA 전사체를 가지고 30℃에서 1시간동안 시험관내 전사를 수행하였다. 사용하기 전에 생성물을 RNase로 처리하였다. BS-IFNAR1-IC(상기 참조)의 삽입체 BamH I -EcoR I 을 pGEX2의 같은 위치안으로 클로닝하여, GST-IFNAR1-IC 융합 단백질을 준비하였다(Pharmacia Biotech). GST 및 GST-IFNAR1-IC를 E.coli에서 발현시키고 글루타티오닌-아가로스 비드에 결합된 것을 회수하였다(Sigam).

항-flag M2 아가로스 비드는 Kodak Scientific Imaging System으로부터 구입한 것이다. IFN 수용체의 α구성요소(IFNAR1)에 대한 모노크로날 항체들인 IFNaR3은 일종의 Dr. O. Colamonici(Colamonici et al., 1990)의 선물이며, 상기 항체들을 1:100 희석비로 사용하였다. IFNAR1-IC의 C-말단 펩티드에 대한 토끼 항체들(Ab 631)을 준비하였다. 단백질 G 비드(Pharmacia)를 mAb IFNaR3 SDS-PAGE와 함께 사용하고 Fujix BAS1000 Phosphor-Imager 분석은 이전 것(Harroch et al., 1994)과 같이 수행하는 것을 제외하고는, 이전에 설명한 바와 같이(Ambrovich et al., 1994), 항-단백분해효소에 의한, 2×10⁷사람 골수종 U266S 및 U266R 세포들의 Brij 추출물(0.75㎖)로부터 나온 IFNAR1의 면역침강반응에 상기 토끼 항체들을 사용하였다.

항-flag 항체들로 번역 생성물들을 면역침강시켰을 때, 32kDa의 단백질 생성물이 얻어졌다는 것이 처음으로 확인되었다(도 6A 및 6B). 도 6A 및 도 6B에 있어서, 항flag 항체들의 사용이 기록될 때마다(+기호로 표시), IR1B4-flag 융합 mRNA(대응하는 DNA 구조물로부터 시험관내 전사된 것임)의 방사성 번역 생성물이, 아가로스 비드들에 결합된 항-flag M2항체들(Kodak Scientific Imaging Systems의 제품임)과 반응한다는 것을 의미한다. flag 아미노산 서열과 융합된 IR1B4를 함유하는 번역된 단백질은 상기 항-flag 항체 비드에 결합하였고, 원심분리하여 비드들을 떨어뜨린 후 상기 단백질을 SDS 완충액으로 용출시키고 SDS-PAGE하였다. 이러한 반응들은, 예상되는 융합 단백질이 존재하는지 확인하기 위한, 대조군의 역할을 한다.

IRNAR1-IC에 융합된 글루타디온 S-트랜스퍼라제(GST)이 결합되어 있는 글루타티온-세파로스의 비드들(Sigma)을, 망상적혈구 번역 반응에 첨가하였다. 비드들을 원심분리하고 세척하고, GST 비드에 결합된 단백질들을 소듐 도데실 설페이트(SDS 1%)로 분리하고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)로 분석하였다.³⁵S-메티오닌으로 표지된 32kDa 단백질들이 GST-IFNAR1-IC에는 결합되어 있으나 GST-단독에는 결합되지 않는다는 것이 관찰되었다(도 6A). 이것은, IR1B4가 분리된 IFNAR1-IC 펩티드 영역에 직접 결합한다는 것을 확인시켜주는 것이다.

사람 세포막에 존재하는 IFNAR1 단백질과 IR1B4가 반응하는 것을 입증하기 위해, 사람 골수종 U266 세포의 세정제 추출물을, 망상적혈구 용해물로부터 나온 IR1B4 mRNA의³⁵S-메티오닌 표지된 번역 생성물과 혼합하였다. IFNAR1 단백질을, IFNAR1의 외측-도메인(ectodomain)에 특이성이 있는 모노클로날 항체 IFNaR3(Colamonici et al., 1990으로부터 나온 것임)로 면역침강반응시켰다. SDS-PAGE 분석에 의하면, 세정제의 출처가 U266S(IFN 수용체가 많음)인 경우에는 32kDa IR1B4-flag 밴드가 존재하나(도 6B), 세정제의 출처가 U266R 세포(IFN 수용체가 없으며 U266D로 만들어진 IFN-α,β-저항성 유도체 세포주 돌연변이; Abramovich et al., 1994)인 경우에는 존재하지 아니한다는 것을 보여주고 있다. 마찬가지로, U266S추출물을 IFNAR1의 C-말단 펩티드에 대한 Ab와 반응시킨 경우에도 32kDa 밴드가 나타났으며, Cos-7 세포들이 flg-IR1B4 및 사람 IFNAR1 cDNA로 형질전환된 경우에도 IFNAR1이 항-flag에 의해 침강되었다. 이러한 결과는, 사람 세포로부터 나온 자연그대로의 IFNAR1에 IR1B4가 특이성있는 방법으로 결합한다는 것을 확인시켰다.

[실시예 5: IR1B4 cDNA 및 단백질 서열]

IR1B4 cDNA의 뉴클레오타이드 서열은 361 아미노산 길이의 단백질을 코딩하는 해독틀을 가지고 있다(도 7). U266 골수종 세포들을 포함한 다양한 사람 세포들에서 지속적으로 발현되는 1.5kb 폴리-A⁺mRNA를, 상기 사람 cDNA가 인식하였다. BlastP 알코리틈(Altshul et al., 1990)뿐만아니라, 바이오액셀래이터 얼라인먼트(Henikoff and Henikoff, 1992)을 이용하여 단백질 데이터베이스에 대한 온라인 조사를 하였고, 이로부터 IR1B4은 단백질-아르지닌 메틸트랜스퍼라제 패밀리의 독특한 일원이라는 것이 밝혀졌다. Lin et al.에 의해 기술된 쥐 PRMT1 cDNA(1996, 유전자은행 서열번호 제1390024호; 접수번호 U60882)는 ALIGN 컴퓨터 프로그램에 의해 분석하여보니, 오직 81.4%의 동종성이 있다. 아미노산 수준에서는(도 8), 처음 19 아미노산이 완전히 다르기 때문에 사람 IR1B4/PRMT는 PRMT1의 아미노 말단과는 현저하게 다르다. IR1B4의 N-말단만을 서열화하면, IR1B4가 PRMT1과 동종성이 있다는 표시를 전혀 제공하지 못한다. HCP-1으로 기술되었던 또다른 사람 단백질(Nikawa et al., 1996; 유전자은행 접수번호 D66904)도, IR1B4와 동종성을 가지고 있다고 밝혀졌다. 그러나, HCP-1은 잔기 147-175의 아미노산 서열이 다르다(도 9). 원래 HCP-1은, 효모에서 ire15 돌연변이를 보완하는 능력에 기초하여 동정되었으며, 그 효소학적 기능은 이전에 동정된 바 없었다(Nikawa et al., 1996). 그러므로, IR1B4는 신규한 사람 단백질이다.

[실시예 6: IFNAR1-IC에 결합된 IR1B4는 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는다]

메틸트랜스퍼라제 활성은, IFNAR1 수용체를 가지고 있는 사람 세포 추출물로 부터 함께 면역침강될 수 있다. U266S 세포의 Brij-세정제 추출물들을 항-IFNAR1 항체 Ab 631(Abramovich et al., 1994)과 함께 또는 이것없이 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 1시간동안 단백질 A 비드들(40㎕의 50% IPA-400를 빠른 유속으로, Repligen)을 첨가하였다. 비드들을 세척하고, 0.1㎖의 25mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 50μM(0.25μCi)¹⁴C-(메틸)-S-아데노실-메티오닌(Amersham) 및 100㎍ 히스톤(송아지 흉선에서 나온 타입ⅡA, Sigma)에서 30분동안 30℃에서 항온 배양하였다. Lin et al(1996)에 기술되어 있는 반응조건하에서 히스톤의 시험관내메틸화를 수행하였다. SDS-PAGE(15% 아크릴아마이드)하고 Phosphor-imager에 노출시킨 후, 히스톤 밴드의 방사능을 분석하였다. 히스톤의¹⁴C-메틸 라벨링은, 항- IFNAR1로 피복된 비드에서는 관찰되었으나 대조군 반응에 있는 비드에서는 관찰되지 않았다(도 1O). 그러므로, 메틸-트랜스퍼라제 활성은 상기 사람 세포들의 IFN 수용체와 구조적으로 연결되어 있다. IFN-β를 U266S 세포에 첨가하고 5분 후, IFNAR1을 면역침강하였을 때에도 유사한 효소 활성이 회복되었다.

[실시예 7: IFN 활동에 있어서 IR1B4/PRMT1의 관여]

IR1B4 cDNA의 시작코돈 주위에 있는 뉴클레오타이드 12-33의 서열(AS-1, 안티-센스 서열 5'-GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3'; 서열번호 12)에 상보성이 있는 안티-센스 올리고디옥시뉴클레오타이드 포스포로티오에이트(phosphorothioate)(Stein et al., 1989)를 화학적으로 합성하였다. 데이 0(day 0)에, 96-웰 마이크로플래이트에서 시드(seed)된 U266S 세포(8000세포/웰/0.2㎖ RPMI, 10% FCS)에 최종 농도 10μM로 상기 뉴클레오타이드를 첨가하였으며, 데이 2에 5μM을 더 첨가하였다. 데이 0에 IFN-β를 64 또는 125 IU/㎖첨가하였다. 배양하고 3일 후, 20㎕의 알라마르 블루(Alamar Blue), 즉 산화-환원에 기초한 색채계 세포밀도 지시약(BioSource, Camarillo, CA)을 각 웰에 첨가하고 6-7시간동안 계속해서 항온배양하였다. 마이크로플래이트 ELISA판독기로 색채를 측정하였으며, 복제된 웰을 여러 번 판독하였다. 살아있는 세포수에 대한 성장곡선의 상호관계 및 OD에 대한 성장곡선의 상호관계가 확인되었다. 메틸트랜스퍼라제를 측정하기위해, 수집된 웰로부터의 세포들을, 25mM TRIS-HCl, pH7.4, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 40㎍/㎖ 류펩신(leupepsin) 및 아프로티닌(aprotinin), 20㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin), 1μM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)에 있는 25㎕/웰에서 동결융해에 의해 용해시켰다. 25㎕의 세포 추출물, 100μM 펩타이드 R1(Najbauer et al., 1993; obtained from Genosys, Cambridge, UK), 3μCi의 [³H](메틸)S-아데노실메티오닌(Amersham, 73Ci/mmol)을 함유하는 50㎕에서 30분동안 30℃에서 반응시켰다. SDS-폴리아크릴아마이드(16%) 겔에서 전기 영동하고, 50%메탄올, 10%아세트산에서 고정시키고, Amplify^R(Amersham)으로 처리한 후, 8일동안 오토레이디오그래피를 수행하였다. 3중 수소화된(tritiated)-메틸기들이 R1 펩티드 기질에 통합되는지에 의해 측정된 바와 같이, 상기 AS-1 안티-센스 DNA는 U266S 세포에서 단백질-아르지닌 메틸트랜스퍼라제 활성을 강력하게 감소시킬 수 있었으며, IFN 활동에 있어서 이러한 효소들의 역할을 조사하기 위해 상기 AS-1 안티-센스 DNA가 사용되었다. IFN의 성장-억제 활성이 세포에서 직접적으로 수량화될 수 있고 쥐 PRMT1와 성장-관련 유전자 생성물과의 상호작용이 관찰되었기 때문에(Lin et al., 1996), IFN의 성장-억제 활성을 선택하였다. IR1B4/PRMT cDNA의 시작코돈 근처에 있는 서열과 상보성이 있는, 안티센스-1 올리고뉴클레오타이드 AS-1을 첨가하여, 사람 골수종 U266S 세포에서 IFN-β의 성장 억제 효과를 감소시켰다(도 12). 이것은, 안티-센스 AS-1이 존재하면, IFN-처리된 세포들이 높은 성장율을 나타낸다는 것(포스포로티오에이트의 독성효과는 배제됨)을 의미한다. IFN이 없을 때의 성장에는 큰 영향을 주지 않았다. 안티센스-1과 비교할 때, 같은 cDNA 영역에 상응하는, 센스 올리고뉴클레오타이드 S-3은 오직 작은 영향력만 가지고 있다(S-3, 도 12). 또한, 센스 S-3은 효소 활성 수준에 억제 효과를 오직 조금만 갖고 있다(도 11). cDNA의 중간에 해당하고 서열번호 7의 뉴클레오타이드 572-592에 상보성이 있는, 또다른 안티-센스 포스포로티오에이트올리고뉴클레오타이드 AS-2(서열번호 13)는 거의 효과가 없었다(도 12). 안티센스-1 올리고뉴클레오타이드에 의해 PRMT 활성이 부분적으로 결핍된, 골수종 세포에서 IFN-β의 성장억제 효과가 5배까지 감소하는 것은, IR1B4/PRMT 효소와 IFNAR1수용체의 IC도메인 사이의 연합이 세포상 IFN활동에 기능적으로 중요하다는 것을 입증시켜준다.

또한, 이러한 실험결과는, IR1B4 단백질이, 도 11에 나타난 실험에서 사용된 R1 펩티드 Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly(서열번호 11; Najbauer et al., 1993)과 같은, 효소의 PRMT 클래스의 펩티드 기질들을 메틸화시킨다는 것을 확인시켜준다.(예를들면, 상기 펩티드에서와 같이) 글리신 잔기 옆에 있는 아르지닌 잔기에서 메틸화되는 것은, 인산화와 같이, 세포안으로 신호전달 역할하는 단백질을 수식(modification)하는 방법의 일종일 수 있다. hnRNP 그룹의 단백질들은 PRMT 효소의 표적이고, 이러한 단백질들은 mRNA 프로세싱, 스플라이싱, 수송 및 안정화에 영향을 주기 때문에(Liu and Dreyfuss, 1995), 이들 단백질의 메틸화는 유전자 발현에 있어서 전사-후 제어에서 그 역할을 수행할 수 있다. 본원에서 IFN수용체의 사슬에 결합한다고 밝혀진 IR1B4/PRMT 단백질은, IFN에 반응하여 유전자발현에 있어서의 변화를 매개할 수 있다. 다른 단백질 기질들은, IFN 수용체 복합체의 다른 구성요소 및 전사인자들을 포함한 IFN수용체에 의해 메틸화될 수 있다. Lin et al.(1996)은 성장인자-유도된 단백질에 쥐 PRMP1이 결합하면 PRMT1을 활성화시키고, 그것의 기질 특이성을 수정할 수 있다(아마도 세포의 세포질에 있는 PRMT1과 연결되어 있는 억제성 단백질을 제거함으로서 가능할 것이다)는 것을 발견하였다. IFN 수용체의 IFNAR1 사슬에 결합한 IR1B4의 활성화도 이와 유사하다고 예측될 수 있다.

[결론]

신규한 단백질 IR1B1은 타입 I인터페론 수용체의 IFNAR1 사슬의 세포질내 도메인과 상호작용한다. 이러한 단백질은, 사람세포를 IFN으로 처리한후 신속하고 순간적으로 유도된다. IR1B1은, 칼슘-결합 단백질들의 특징인 헬릭스-루프-헬릭스 EF-핸들 위치를 갖고 있는 특성이 있다. 칼슘 이온의 흐름은 IFN의 활동메카니즘과 관련되어 있으며, 특히, 세포 모폴로지 및 세포골격 조직화에 있어서 세포의 초기반응 및 변화와 관련되어 있다(Tamm et al, 1987). 칼슘 이온-활성화된 효소들은, IFN에 반응하여, 다이아실-글리세롤과 같은 제2차 전령자를 생산할 수 있다. 더욱이, 칼모듈린-유사 단백질은 많은 단백질 키나제를 조절하고, 이러한 경로는 IFN-처리된 세포에서 기능을 수행한다고 알려졌다(Tamm et, 1987). IFN 수용체 결합 단백질인 IR1B1은 세포에서 IFN에 대한 상기 Ca⁺⁺-의존성 효과에 관련된 것처럼 보인다.

또한, IFNAR1-IC 도메인과 상호작용하는 단백질에 대한 이중-하이브리드 스크리닝을 통해, 또다른 단백질인 IR1B4를 동정하였으며, 이 단백질은 단백질-아르지닌 메틸 트랜스퍼라제 패밀리의 효소(PRMT1; Lin et al, 1996)의 일원이라고 밝혀졌다. 상기 효소는 많은 RNA 및 DNA 결합 단백질, 특히 비균질 핵리보핵단백질(hnRNPs)를 메틸화한다고 알려졌다. hnRNP는 핵으로부터 세포질로의 mRNA 수송, 프리-mRNA의 얼터너티브 스플라이싱 및 전사후 제어(Liu and Kreyfuss, 1995)에 관여한다. IFNAR1-IC 도메인에 도킹하는 IR1B1 및 IR1B4/PRMT1단백질은, Darnell et al(1994)에서 기술된 알려진 Jak-Stat 경로외의, 신규한 신호전달 메카니즘이 있다는 것을 알려주고 있다.

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참조문헌

Abramcvich, C., Shulman, L.M, Ratovitski, E., Harroch, S., Tovey, M, Eid, P. and Revel, M. (1994) IFN-α 및 IFN-β에 반응한, 타입 I 인터페론 수용체 및 관련된 표면 단백질의 특징적인 티로신 인산화. EMBO J., 13:5871-5877.

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W.,Myers, E.W. and Lipman, D.J. (1990) 기본적이고 국소적인 배열 조사 방법. J. Mol. Biol., 215:403:410.

Barter, P.L., Chien, C. T., Sternglanz, R. and Fields, S. (1993) 이중-하이브리드 시스템을 이용하여 잘못된 양성 타타라이즈의 제거. BioTechniques, 14:920-924.

Boldin, M.P. Varfolomeev, E.E. Pancer, Z. Mett, I. L. Camonis J. H. and Wallach D. (1995) Fas/APO1의 사멸도메인과 반응하는 신규한 단백질은 사멸도메인과 관련된 서열 모티프를 포함한다. J Biol Chem, 270:7795-7798.

Breeden, L. and Naysmith K., (1995) 효모 HO 유전자의 조절. Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol., 50;643-650.

Colamonici, O.R., D'Allessandro, F., Diaz, M.O., Gregory, S.a., Necker, L.M. and Nordan, R. (1990) 인터페론-α2 수용체를 인식할 수 있는 세 개의 항체들의 특성화. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7230-7234.

Darnell, J. E., Kerr, I. M. and Stark, G. R.(1994) IFN에 반응하는 Jak-Stat 경로와 전사 활성화, 및 다른 세포외 신호전달 단백질. Science, 264:1415-1421.

David, M., Chen, H.E., Goelz, S., Larner, A.C. and Neel, B.G. (1995a) SH 2 도메인을 함유하는-티로신 포스파타제 SHPTP1에 의해서, 알파/베타 인터페론에 의해 자극된 Jak-Stat 경로가 독특하게 조절됨. Mol. Cell. Biol., 15:7050-7058.

David, M., Petricoin, E. Ⅲ, Benjamin, C., Pine, R., Weber, M. J. and Larner, A.C. (1995b) Stat 단백질을 통해 인터페론α 및 인터페론β에 의해 자극된 유전자 발현에 있어서, MAP 키나제 (ERK2) 활성의 필요성. Science, 269:1721-1723.

David, M., Petricoin, E. Ⅲ. And Larner, A.C. (1996) 단백질 키나제 A의 활성화는 U266 세포에 있어서 Jak/Stat 경로의 인터페론 유도를 억제한다. J. Biol. Chem., 271:4585-4588.

Deise, L.P. and Kimchi, A. (199 ) 성장 방해성 신호의 매개자로서 티로레독신을 동정하는데 사용된 유전적 방법. Science 252, 117-20.

Domanski, P., Witte, M., Kellum, M., Rubinstein, M., Hackett, R., Ritha, P. And Colamonici, O.R. (1995) 신호전달에 필요한 인터페론 알파 베타 수용체의 베타 서브유니트의 긴 형태의 클로닝 및 발현. J. Biol. Chem., 270:21606-21611.

Durfee, T., Bechere, K, Chen, P.-L., Yeh, S-H, Yang, Y., Kilburn, A.E., Lee, W.-H, and Elledge, S. (1993). 망막아세포종 단백질은 단백질 포스파타제타입 1 촉매활성 서브유니트와 연결되어 있다. Genes & Devpt., 7:555-569.

Ellis, L., Clauser, E., Morgan, D.O., Edery, M., Roth, R.A. and Rutter, W.J. (1986) 인슐린 수용체 티로신 잔기 1162 및 1163을 치환하면, 키나제 활성을 절충하고 2-디옥시글루코스의 이해를 돕는다. Cell, 45, 721-731.

Fields, S. and Song, O. (1989). 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 신규한 유전적 시스템. Nature, 340:245-246.

Guerini, D. et al (1989). DNA 8:675-682.

Harroch, S., Revel, M. and Chebath, J. (1994). 다른 유전자들의 회문식 인헨서에 결합하는 4개의 전사 인자를 통한, 인터루킨-6의 신호전달. J. Biol. Chem., 269:26191-26195.

Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919.

Kagan, R.M. and Clarke, S. (1994) 다양한 S-아데노실 메티오닌-의존성 메틸트랜스퍼라제에 있는 3 개의 서열 모티브들이 광범위하게 존재한다는 것은 이러한 효소들의 일반적이 구조라는 것을 제시한다. Arch. Biochem. Biophys., 310, 417-427.

Lee, V.D. and Huang, B. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11039-11043.

Leung, S., Qureshi, S.A., Kerr, I.M., Darnell, J.E. and Stark, G.R. (1995). 알파 인터페론 신호전달 경로에 있어서 Stat2의 역할. Mol. Cell. Biol., 15:1312-1317.

Lin, W.-J., Gary, J.D., Yang, M.C., Clarke, S. and Herschman, H.R. (1996). 포유류 중간-초기 TIS21 단백질 및 백혈병-관련 BTG1 단백질은 단백질-아르지닌 메틸트랜스퍼라제와 반응한다. J.Biol Chem., 271:15034-15044.

Liu, Q. And Dreyfuss, G. (1995). RNA-결합 단백질들의 생체내 및 시험관내아르지닌 메틸화. Mol. Cell. Biol., 15:2800-2808.

Najbauer, J., Johnson, B.A., Young, A.L. and Asward, D.W. (1993) RNA와 반응하는 단백질에 있는 글리신 아르지닌-풍부한 모티브와 유사한 서열을 갖고 있는 펩티드은, 많은 단백질에 있어서 아르지닌을 수정하는 메틸트랜스퍼라제에 의해 효율적으로 인식된다. J. Biol. Chem., 268, 10501-10509.

Nikawa, J.-I., Nakano, H. and Ohi, N. (1996) 맥주효모균 ire15 돌연변이체가 없는 성장을 억제할 수 있는 사람 효모 HCPI 유전자는 구조적 및 기능적으로 보존되어 있음. Gene, 171, 107-111.

Revel, M. (1984). 사람의 인터페론 시스템: 인터페론 분자의 특성 및 활동방식(The Interferon system in man: nature of the Interferon molecules and mode of action). In Becker, I. (ed.), 항바이러스 약제 및 인터페론, 그들 활성의 분자적 기초. Martinus Nijhoff Publ., Boston, pp 357-433.

Revel, M. and Chebath, J. (1986) 인터페론에 의해 활성화된 유전자. Trends Biochem. Sci., 11:166-170.

Stein, C.A., Subasinghi, C., Shinozuka, K. and Choen, J.S. (1989) 포스포로티오네이드 올리고디옥시뉴클레오타이드의 물리화학적 성질. Nucleic Acids Res., 16, 3209-3221.

Tamm, I., Lin, S.L., Pfeffer, L.M. and Sehgal, P.B. (1987). 세포성 조절분자로서의 인터페론 α 및 β. In Gresser, I. (ed.), Interferon 9, Acad. Press, London, pp 14-74.

Uze, G., Lutfalla, G. and Gresser, I. (1990). 기능성있는 사람 인터페론α를 쥐 세포안으로의 유전적인 전이: 그 cDNA의 클로닝 및 발현, Cell, 60:225- 234.

Wickstrom, E. (1991). In : Prospects for Antisense Nucleic Acid Thereby of Cancer and AIDS, pp. 7-24, Wiley-Liss, New York.

Yang, C.H., Shi, W, Basu, L., Murti, A., Constantinescu, S.N., Blatt, L., Croze, E., Mullersman, J.E. and Pfeffer, L.M. (1996). 사람 타입 I 인터페론 수용체의 TFNAR-1 사슬과 Stat3의 직접적인 연결. J. Biol. Chem., 271:8057.

<서열 리스트>

(1) 일반정보:

(i) 출원인: 레벨, 마이클

쉐배스, 주디스.

아브라모비쉬, 캘롤리나

(ii) 발명의 명칭: 신규한 IFN 수용체 I 결합 단백질들, 이들을 코딩하는 DNA, 및 인터페론에 대한 세포성 반응을 조절하는 방법.

(iii) 서열수: 13

(iv) 통신주소

(A) 수신인: 브라우디 앤드 네이마크

(B) 스트리트: 419 세븐스 스트리트, N.W., 슈트 300

(C) 도시: 워싱턴

(D) 주: D.C.

(E) 국가: 미합중국

(F) 우편번호(ZIP): 2004

(v) 읽기 가능한 컴퓨터 형식:

(A) 매체 타입: 프로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환 기종

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30

(vi) 본원 출원 데이터:

(A) 출원번호: 미합중국

(B) 출원일:

(ⅶ) 우선권 출원 데이터:

(A) 출원번호: 미합중국 60/035,636

(B) 출원일: 1997. 1. 15.

(ⅷ) 대리인 데이타:

(A) 이름: 브라우디, 로저 L.

(B) 등록번호: 25,618

(C) 참조번호: REVEL=14 PCT

(ix) 통신 정보

(A) 전화: 202-628-5197

(B) 텔레팩스: 202-737-3528

(2) 서열번호 1에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 830개 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 43..615

(xi) 서열: 서열번호 1

[서열 1]

(2) 서열번호 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 191개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 단백질

(xi) 서열: 서열번호 2

[서열 2]

(2) 서열번호 3에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 170개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 3

[서열 3]

(2) 서열번호 4에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 172개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 4

[서열 4]

(2) 서열번호 5에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 31개 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(xi) 서열: 서열번호 5

[서열 5]

(2) 서열번호 6에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 25개 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(xi) 서열: 서열번호 6

[서열 6]

(2) 서열번호 7에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 1308개 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(ix) 특징 :

(A) 이름/키 : CDS

(B) 위치 : 16..1098

(xi) 서열: 서열번호 7

[서열 7]

(2) 서열번호 8에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 361개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 단백질

(xi) 서열: 서열번호 8

[서열 8]

(2) 서열번호 9에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 353개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 단백질

(xi) 서열: 서열번호 9

[서열 9]

(2) 서열번호 10에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 360개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 단백질

(xi) 서열: 서열번호 10

[서열 10]

(2) 서열번호 11에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 10개 아미노산

(B) 서열의 형: 아미노산

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 펩티드

(xi) 서열: 서열번호 11

[서열 11]

(2) 서열번호 12에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 22개 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(xi) 서열: 서열번호 12

[서열 12]

(2) 서열번호 13에 대한 정보:

(i) 서열 특성

(A) 길이: 21개 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: cDNA

(xi) 서열: 서열번호 13

[서열 13]

Claims

IFN-α 또는 IFN-β에 의해 유도될 수 있으며 서열번호 2 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는, IFNAR1 수용체 결합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제1항에 있어서, 센스 방향으로 IFNAR1 수용체 결합 단백질을 코딩하는 상기 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함하되,

상기 프로모터는 적당한 발현 숙주에 재조합 DNA 분자가 존재할 때 상기 단백질의 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA분자.
제2항에 있어서, 상기 프로모터는 사람 세포에 있어서 강력한 구조 프로모터인 것을 특징을 하는 재조합 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 7인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
센스 또는 안티-센스 방향중 한 방향으로, 서열번호 1 또는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나,

인터페론-유도성 IFNAR1 수용체 결합 단백질을 코딩하는 mRNA에 하이드리드 할 수 있고 이로인해 상기 mRNA의 발현을 억제할 수 있는, 이들의 단편을 포함하는 DNA 분자; 또는

상기 DNA 분자의 서열에 상응하는 서열의 RNA 분자를

포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자.
제5항에 있어서, RNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자.
제5항에 있어서, 상기 서열은 센스방향으로 있는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자.
제5항에 있어서, 상기 서열은 안티-센스 방향으로 있는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자.
제8항에 있어서, 재조합 DNA 분자는, 상기 서열에 안티-센스방향으로 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함하되,

이로인해 상기 프로모터가 인터페론-유도성 IFNAR1 수용체 결합 단백질을 코딩하는 센스 RNA 전체 또는 일부와 상보성이 있는 안티-센스 RNA를 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자.
제9항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 7의 5'-말단으로부터 나온 단편들인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제2항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 인터페론-유도성 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 발현벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
인터페론-유도성 IFNAR1 수용체 결합 단백질을 코딩하는 센스 RNA에 상보성이 있는 안티-센스 RNA를 발현할 수 있되, 제12항에 따른 발현벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 DNA분자를 포함하는 발현벡터를, 환자에게 이식할 조직 또는 기관의 세포안으로 도입하는 단계; 및

상기 환자에게 상기 조직 또는 기관을 이식하는 단계를

포함하는 것을 특징으로 하는 이식 조직 생존을 연장시키는 방법.
제3항 또는 제4항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 발현벡터 및 적용할 수 있는 약제학적 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 종양안으로 직접 투여하는 단계; 및

그 이후 외인성 인터페론 치료법을 적용하는 단계를

포함하는 것을 특징으로 하는, 암을 치료하는 외인성 인터페론 치료법에 대한 반응을 강화시키는 방법.
서열번호 2 또는 서열번호 8의 서열을 가지고 있는 IFNAR1-결합 단백질.
제16항에 따른 IFNAR1-결합 단백질에 특이성이 있는 항체의 항원 결합부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자.
제17항에 있어서, 모노클로날 항체로 이루어진 것을 특징으로 하는 분자.
숙주를 배양하므로써 단백질을 발현시킬 수 있는 방식으로, 제1항에 따른 DNA를 적절한 발현 숙주안으로 위치시키는 단계; 및

상기 단백질의 발현시키기 위해 상기 숙주를 배양하는 단계를

포함하는 것을 특징으로 하는 IFNAR1 수용체 결합 단백질을 제공하는 방법.