ES2276406T3 - Nueva proteina lst-1 inmunoreguladora. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UNA NUEVA PROTEINA INMUNOREGULADORA LST 1, DE SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN PARA ESTA PROTEINA, DE UN PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE ESTA PROTEINA, ASI COMO SU UTILIZACION PARA LA PRODUCCION DE UN AGENTE TERAPEUTICO. EL ADN Y LAS SECUENCIAS DE LAS PROTEINAS SE MUESTRAN EN LAS SEC ID N :1 A 4.
Description
Nueva proteína LST-1
inmunorreguladora.
Esta invención está relacionada con una proteína
inmunorreguladora específica de leucocitos (LST1) y con la proteína
correspondiente producida mediante técnicas recombinantes, así como
ácidos nucleicos que codifican proteínas con actividad LST1,
métodos de utilización y de producción.
Las citocinas son proteínas con un peso inferior
a 50 kDa, que intervienen en el intercambio de señales autocrinas,
paracrinas o endocrinas entre los componentes celulares de tejidos o
entre tejidos diferentes. Las citocinas identificadas hasta el
momento incluyen factores de crecimiento, interleucinas e
interferones y actúan sobre células en una variedad de sistemas del
organismo: el sistema hematopoyético, el sistema inmunitario, el
sistema nervioso, el sistema esquelético, tejidos conjuntivos y,
probablemente, la mayoría del resto de tejidos y órganos del
organismo (véanse las referencias A. Thompson ed. [1991], The
Cytokine Handbook, London, Academic Press y A. Miyajima et
al., Annual Reviews Immunol. 10 [1992] 295-331).
Los siguientes son ejemplos de citocinas: EGF, NGF, PDGF, FGF,
IL-1 a IL-7, GM-CSF,
G-CSF, MCSF, IFN, TNF-\alpha,
TGF-\alpha y -\beta.
Hasta el momento se han identificado más de 100
citocinas. No obstante, es necesario buscar otras citocinas nuevas
que puedan ser importantes para posibles avances en la asistencia
médica.
Holzinger, I., et al. (Immunobiology 191
[1994] 149) y el número de Acceso a la base de datos EMBL Primate
Databank u00921 describen la secuencia completa de DNA de la
LST-1 humana. El número de Acceso a la base de
datos EMBL Primate Databank u67841 describe una secuencia de DNA que
posee una identidad del 99,7% en los 2633 pb superpuestos con el
ID. de SEC. núm.: 1.
Consecuentemente, es objeto de la presente
invención proporcionar una nueva citocina que muestra nuevas
propiedades biológicas.
Otro objeto de la presente invención es obtener
la nueva proteína utilizando moléculas de DNA recombinante con
capacidad para expresar dicha proteína para que así la proteína de
unión tenga una mayor disponibilidad. Tanto este como otros objetos
de la invención se han conseguido mediante la obtención de una
proteína purificada según la invención, seleccionada de un grupo
formado por una proteína con una homología de al menos el 85% con la
secuencia aminoacídica del ID. de SEC. núm.: 3 y fragmentos de la
misma, siendo dicha proteína capaz de unirse a un anticuerpo
específico para dicha proteína o a su receptor de superficie de
membrana en los leucocitos.
La invención comprende composiciones
terapéuticas especialmente novedosas que contienen proteínas
recombinantes producidas utilizando secuencias de ácidos nucleicos
que codifican proteínas que tienen actividad LST-1.
El cDNA de LST1 que puede utilizarse para la producción de la
proteína recombinante se aisló inicialmente a partir de células
U-397 (DSM ACC 5) estimuladas con
IFN-\gamma. La clonación mediante
RT-PCR de mRNA de estas células dio lugar a un clon
de cDNA designado pLST1 y con una longitud de 636 pb. El análisis
del cDNA de LST-1 muestra que está formado por seis
exones. Estos exones se denominan: 1A (pb 48-162),
1B (pb 544-652), 2 (pb 1044-1162),
3 (pb 1475-1567), 4 (pb 1775-1797) y
5 (pb 2325-2709). En el exón 5, tras la posición
2345, hay un sitio interno de empalme 5'. Por tanto, mediante corte
y empalme alternativo se pueden obtener dos isoformas de la proteína
LST-1 con una longitud respectiva de 104 y 97
aminoácidos (véanse los ID. de SEC. núms.: 3 y 4). El clon de cDNA
humano pLST-1 contiene una región extendida en 5'
que codifica codones de parada.
La invención está basada en una nueva proteína
del tipo de las citocinas (denominada a partir de este momento
proteína LST-1 o LST-1) cuya
producción es estimulada en las células U-937 por el
INF-\gamma en un factor mayor de 100,
preferiblemente 1000; que se une a la superficie de los leucocitos y
que:
a) está codificada por la secuencia de DNA
mostrada en el ID. de SEC. núm.: 2 en el caso de la proteína madura,
o por la secuencia genómica mostrada en el ID. de SEC. núm.: 1;
b) está codificada por las secuencias de DNA que
hibridan bajo condiciones de astringencia con las secuencias de DNA
mostradas en los ID. de SEC. núms.:1 o 2, o fragmentos de las
secuencias de DNA de la región que codifica la proteína madura,
o
c) está codificada por secuencias de DNA que, si
no hubiera degeneración del código genético, hibridarían con las
secuencias definidas en a) y b) y que codifican un polipéptido con
secuencia aminoacídica,
d) y el marco de lectura de dicha proteína está
definido por un ATG que parte de la posición 1144 del ID. de SEC.
núm.: 1 y a partir del cual no puede haber cambio alguno en el marco
de lectura de la región codificante de la proteína.
\newpage
La proteína se puede definir mediante su
secuencia de DNA (preferiblemente por su secuencia de cDNA deducida
del ID. de SEC. núm.: 1) y por la secuencia aminoacídica derivada de
la misma. La proteína LST-1 puede presentar
variaciones alélicas naturales diferentes entre individuos. Estas
variaciones de los aminoácidos normalmente son sustituciones de
aminoácidos. Sin embargo, también pueden ser deleciones, inserciones
o adiciones de aminoácidos de la secuencia completa. La proteína
LST-1 según la invención, cuyos tipos y extensión
dependen de la célula y del tipo celular en el que se exprese,
puede estar en su forma glicosilada o no glicosilada. Las proteínas
LST-1 de acuerdo con el ID. de SEC. núm.: 3 y el ID.
de SEC. núm.: 4 son las que se prefieren.
El mRNA de LST-1 es expresado de
forma constitutiva en los linfocitos T, macrófagos,
U-937 y a niveles bajos en la amígdala faríngea,
pulmón e hígado humanos, lo cual puede deberse a los linfocitos y
macrófagos presentes en estos tejidos. La proteína muestra una
actividad inmunorreguladora. El IFN-\alpha puede
potenciar de forma importante su transcripción en células
U-937. Al estimular la línea de linfocitos T Jurkat
(ATCC TIB 152) con TPA
(12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato)
solamente se observó una pequeña inducción del mRNA de
LST-1. Se inicia un incremento de la expresión de
mRNA pasadas cuatro horas de la estimulación, con un pico a las 8
horas, y un posterior descenso tras 24 horas después de la
estimulación.
El término "actividad inmunorreguladora"
significa que la proteína modula de forma directa o indirecta la
cooperación de los linfocitos T con los macrófagos.
Preferiblemente, la unión a la superficie de los
leucocitos se estima in vitro y se realiza mediante métodos
ampliamente conocidos en el campo.
La expresión "hibridar bajo condiciones de
astringencia" significa que dos fragmentos de ácido nucleico
presentan la capacidad de hibridar entre sí en las condiciones
estándar de hibridación descritas en Sambrook et al.,
"Expression of cloned genes in E. coli" en Molecular
Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, EE. UU., 9.47-9.62 y 11.45 -
11.61.
De forma más específica, las condiciones de
astringencia tal como aquí se utilizan se refieren a la hibridación
en NaCl a 1 mol/l, SDS al 1% y sulfato de dextrano al 10%. A
continuación se realizan dos lavados del filtro a temperatura
ambiente de 5 minutos en 2 x SSC y un lavado final de 30 minutos.
Este lavado final se puede realizar a 65ºC en 0,5 x SSC, SDS al
0,1%; más preferiblemente en 0,2 x SSC, SDS al 0,1%; y más
preferiblemente en 0,1 x SSC, SDS al 0,1%. Los expertos en la
materia reconocerán que hay otras condiciones que confieren el
mismo grado de astringencia y que están englobadas dentro de la
expresión "bajo condiciones de astringencia" así como dentro
de la invención.
La proteína LST-1 se encuentra
activa en su forma glicosilada y en su forma no glicosilada. Esta
última puede producirse mediante tecnología recombinante en células
procariotas.
La expresión "proteínas con actividad
LST-1" también incluye proteínas con variaciones
menores de aminoácidos, pero con sustancialmente la misma actividad
LST-1. Con "sustancialmente la misma" nos
referimos a que la actividad de las diferentes proteínas posee las
mismas propiedades biológicas y que las proteínas presentan una
homología en cuanto a la secuencia aminoacídica de al menos el 85%.
Más preferiblemente, las secuencias aminoacídicas son idénticas en
un 90%. Es posible purificar LST-1 a partir de
células U-937 por cromatografía de afinidad
utilizando un anticuerpo monoclonal frente a LST-1.
También se prefiere la utilización de otras técnicas de
purificación de proteínas, como las siguientes: inmunoprecipitación,
filtración en gel, intercambio de iones, cromatografía,
cromatoenfoque, isoelectroenfoque, precipitación selectiva,
electroforesis y similares. La fracción aislada durante los
procesos de purificación puede analizarse en busca de la presencia
de actividad LST-1 mediante el uso de anticuerpos
específicos para LST-1.
La proteína de acuerdo con la invención también
puede producirse mediante métodos recombinantes. La proteína
LST-1 se obtiene en su forma no glicosilada cuando
se produce de forma recombinante en procariotas. Con ayuda de las
secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas por la invención, es
posible buscar el gen de la LST-1, o sus variantes,
en los genomas de cualquier célula que se desee (p. ej. además de
las células humanas, también en células de otros animales), para
identificarlo y aislar el gen deseado que codifique la proteína
LST-1. Los expertos en la materia conocen muy bien
tanto estos procesos como las condiciones adecuadas de hibridación
y, por ejemplo, se describen en Sambrook, J., et al.,
"Expression of cloned genes in E. coli" en Molecular
Cloning: A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, EE. UU.; y B.D. Hames, S.G. Higgins, Nucleic acid
hybridisation - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford,
Inglaterra. En este caso, para los experimentos normalmente se
utilizan los protocolos estándar descritos en estas
publicaciones.
La utilización de tecnología de DNA recombinante
permite la producción de una gran cantidad de derivados de la
proteína LST-1. Estos derivados pueden modificarse,
por ejemplo, en un único aminoácido o en varios mediante
sustitución, deleción o adición. La formación de derivados puede,
por ejemplo, llevarse a cabo mediante mutagénesis dirigida.
Cualquier experto en la materia puede realizar fácilmente estas
variaciones (J. Sambrook, B.D. Hames, loc. cit.). Sencillamente se
debe asegurar que se conservan las propiedades características de la
proteína LST-1 (la inhibición de las líneas
celulares antes mencionadas). Por lo tanto, la invención concierne
además a una proteína LST-1 que es producto de la
expresión procariótica o eucariótica de un DNA exógeno.
\newpage
La invención implica el uso de una molécula de
ácido nucleico que sirve para asegurar la expresión en una célula
huésped procariota o eucariota de una proteína LST-1
y que se selecciona del grupo formado por:
a) las secuencias de DNA mostradas en los ID. de
SEC. núm.: 1 y 2, o las secuencias complementarias,
b) secuencias de ácido nucleico que hibridan
bajo condiciones de astringencia con una de las secuencias de
a),
c) secuencias de ácido nucleico que hibridarían
con una de las secuencias de a) o b) si no hubiera degeneración del
código genético,
d) y el marco de lectura de dicha proteína está
definido por un ATG que parte de la posición 1144 del ID. de SEC.
núm.: 1 y a partir del cual no puede haber cambio alguno en el marco
de lectura de la región codificante de la proteína.
Gracias a estos ácidos nucleicos que codifican
una proteína LST-1, es posible obtener la proteína
de acuerdo con la invención de forma repetida y en grandes
cantidades. Para la expresión en organismos procariotas o
eucariotas, como células huésped procariotas o células huésped
eucariotas, el ácido nucleico se integra en vectores de expresión
adecuados siguiendo los métodos conocidos por los expertos en el
campo. Dichos vectores de expresión deben contener preferiblemente
un promotor regulable o inducible. Entonces, estos vectores se
introducen en células huésped adecuadas para que se expresen como,
p. ej., E. coli como célula huésped procariota; o
Saccaromyces cerevesiae, la línea celular de teratocarcinoma
PA-1 sc 9117 (Büttner et al., Mol. Cell Biol.
11 [1991] 3573-3583), células de insecto, células
CHO o COS como células huésped eucariotas; y las células huésped
transformadas o transducidas se cultivan bajo unas condiciones que
permitan la expresión del gen heterólogo. El aislamiento de la
proteína puede llevarse a cabo siguiendo los métodos conocidos a
partir de la célula huésped o del sobrenadante del cultivo de
células huésped. Estos métodos están descritos, por ejemplo, en
Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol. Biol. (1992),
John Wiley and Sons, New York. También es posible que sea necesaria
la reactivación in vitro de la proteína.
Además, la invención implica un proceso de
obtención de una proteína LST-1 mediante aislamiento
del sobrenadante del cultivo de la línea celular
U-p937 a través de la separación cromatográfica en
gel y la purificación de una fracción.
La detección de células huésped transformadas o
transducidas que producen de forma recombinante la proteína
LST-1 y la purificación de la proteína se llevan a
cabo mediante anticuerpos de unión a esta proteína. Estos
anticuerpos se pueden obtener de forma sencilla mediante métodos
conocidos utilizando la proteína de la invención como un antígeno o
un inmunógeno.
Por tanto, la invención también engloba la
utilización de la proteína con actividad LST-1 de
acuerdo con la invención para la producción de anticuerpos de unión
a esta proteína.
Los anticuerpos
anti-LST-1 se producen por
inmunización de un huésped vertebrado adecuado con
LST-1 purificada o con derivados polipeptídicos de
la misma, preferiblemente con un adyuvante. Estas técnicas se
conocen ampliamente en la literatura médica y están descritas, por
ejemplo, en Harlow and Lane eds., Antibodies: A laboratory manual
(1988), Cold Spring Harbor Laboratories Press.
Este proceso consiste en la inmunización de
animales de uso habitual con esta finalidad, en concreto ovejas,
conejos o ratones, con la proteína según la invención y
posteriormente aislar el antisuero de los animales inmunizados
siguiendo los métodos conocidos; o bien, fusionar células esplénicas
de los animales inmunizados con células inmortalizadas, como p. ej.
células de mieloma, de acuerdo con el método de Köhler y Milstein
(Nature 256 (1975) 495-497). Entre las células de
hibridoma obtenidas de esta forma, se seleccionan las células que
producen un anticuerpo monoclonal frente a la proteína
LST-1 y se clonan. Los anticuerpos monoclonales o
policlonales obtenidos de esta forma pueden estar unidos a un
material de soporte, como p. ej. celulosa, para la purificación por
inmunoabsorción de la proteína inhibidora de melanoma. Además, los
anticuerpos de este tipo pueden utilizarse para la detección de la
proteína LST-1 en muestras como, p. ej., secciones
de tejido o líquidos corporales.
Por consiguiente, la invención engloba también
anticuerpos frente a la proteína LST-1 que se pueden
obtener mediante la inmunización de un animal con una proteína
LST-1 y el aislamiento de los anticuerpos a partir
del suero o de las células esplénicas de los animales
inmunizados.
Ha resultado, además, que la proteína
LST-1 presenta una actividad inmunorreguladora.
La invención también incluye la utilización de
una proteína de acuerdo con la invención para la producción de un
agente terapéutico que puede utilizarse en el tratamiento
antitumoral o como un agente inmunorregulador.
Si se desea, la proteína de acuerdo con la
invención se procesa, si se desea junto con coadyuvantes,
excipientes de relleno o aditivos habitualmente utilizados, en una
formulación farmacéutica para las aplicaciones terapéuticas
mencionadas.
Por lo tanto, la invención también comprende una
composición terapéutica que contiene una proteína
LST-1 según la invención y, si se desea, junto con
coadyuvantes, excipientes de relleno o aditivos que se utilizan
habitualmente.
La invención también implica el uso de
secuencias del gen de la LST-1, preferiblemente
moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con
actividad LST-1, o la activación de polinucleótidos
de la región 5' no traducida, en la terapia génica y, en
particular, para la producción de medicamentos para la terapia
génica.
La terapia génica en células somáticas se puede
conseguir utilizando, p. ej., vectores retrovirales, otros vectores
víricos o mediante transferencia de genes no víricos (para mayor
claridad véase T. Friedmann, Science 244 [1989] 1275; Morgan 1993,
RAC DATA MANAGEMENT REPORT, junio 1993).
Los vectores adecuados para la terapia génica
son, por ejemplo, retrovirus (Mulligan, R.C. [1991] en Nobel
Symposium 8: Ethiology of human disease at the DNA level, Lindsten,
J. & Pattersun Editors, 143-189, Raven Press),
virus adenoasociados (McLughlin, J. Virol. 62 [1988] 1963), virus
vaccinia (Moss et al., Ann. Rev. Immunol. 5 [1987] 305),
virus del papiloma bovino (Rasmussen et al., Methods Enzymol.
139 [1987] 642) o virus del grupo herpes como el virus de Epstein
Barr (Margolskee et al., Mol. Cell. Biol. 8 [1988] 2937) o el
virus herpes simplex.
También se conocen sistemas de administración no
víricos. En esos casos se utilizan normalmente ácidos nucleicos
"desnudos", preferiblemente DNA, o ácido nucleico junto con un
auxiliar como, p. ej., reactivos de transferencia (liposomas,
dendrímeros, conjugados de polilisina-transferrina)
(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 [1987]
7413).
Otro método preferido de terapia génica está
basado en la recombinación homóloga. Este sistema consiste en; o
bien, insertar una o varias copias del gen que codifica la proteína
LST-1 en el genoma de células somáticas; o bien,
modular, preferiblemente activar, el gen de la LST-1
que está presente de forma endógena en las células.
Los métodos de recombinación homóloga están
descritos en, p. ej., Kucherlapati, Proc. in Nucl. Acids Res. and
Mol. Biol. 36 (1989) 301; Thomas et al., Cell 44 (1986)
419-428; Thomas and Capecchi, Cell 51 (1987)
503-512; Doetschman et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85 (1988) 8583-8587 y Doetschman
et al., Nature 330 (1987) 576-578. En estos
métodos, una porción de DNA que tiene que integrarse en un lugar
específico del genoma (fragmento génico de LST-1)
se une a un DNA de reconocimiento. Este DNA de reconocimiento es un
DNA complementario (homólogo) a una región (preferiblemente
comprendida en el gen de la LST-1 o proximal al
mismo) del DNA genómico. Cuando dos porciones homólogas de un DNA
de cadena única (p. ej. el DNA de reconocimiento y el DNA genómico)
se encuentran muy próximos entre sí hibridarán y formarán una
hélice de doble cadena. Por tanto, el fragmento del gen de la
LST-1 y el DNA de reconocimiento pueden integrarse
en el genoma a través de la recombinación. Esta recombinación
homóloga puede realizarse tanto in vitro como in vivo
(en el paciente).
Se utiliza preferiblemente un DNA que codifique
una proteína que tenga actividad LST-1, un fragmento
que inhiba la expresión LST-1 (secuencia knock
out) o un fragmento capaz de activar, tras la integración del
genoma de una célula, la expresión en esta célula de una proteína
que tenga actividad LST-1. Este fragmento puede ser
un promotor o una región activadora, por ejemplo, que sea heterólogo
respecto a la región LST-1 correspondiente o que,
tras la integración en el gen de la LST-1, active la
transcripción o la traducción del gen de la LST-1
que en ese momento se encuentra silente o se expresa muy poco.
Por tanto, mediante este DNA, se introducen
nuevamente uno o más genes de LST-1 dentro de la
célula diana, o bien el gen que básicamente es silente a nivel
transcripcional en el genoma de una célula de mamífero se activa de
tal forma que la célula adquiere la capacidad de producir proteína
LST-1 endógena. Para conseguir esto, se inserta un
constructo de DNA en el genoma mediante recombinación homóloga; el
constructo de DNA contiene: un elemento regulador del DNA con
capacidad para estimular la expresión de este gen si está unido
funcionalmente al mismo y uno o varios segmentos diana de DNA que
son homólogos a una región en este genoma, región que está dentro
de este gen o próxima al mismo. Este constructo se inserta en el
genoma de la célula de mamífero de tal forma que el segmento
regulador está unido funcionalmente al gen que codifica la proteína
con actividad LST-1. Preferiblemente, el constructo
también contiene secuencias de amplificación, especialmente si los
genes que codifican proteínas con actividad LST-1
se insertan dentro de la célula.
Para la introducción de genes de
LST-1 dentro de las células diana, el constructo
contiene un elemento regulador, uno o varios genes de
LST-1 y uno a varios segmentos diana. Los segmentos
diana se escogen en función de que hibriden con una región
apropiada del genoma donde se expresan los genes exógenos de
LST-1 inseridos tras la recombinación homóloga.
Se conocen una gran cantidad de procesos
mediante los que es posible iniciar la recombinación homóloga.
Preferiblemente, la recombinación homóloga ocurre durante la
replicación del DNA o mitosis de las células. Un DNA de este tipo
puede utilizarse para la producción de un agente destinado al
tratamiento terapéutico de tumores o para la producción de proteína
LST-1 homóloga o heteróloga en un organismo
huésped.
Cabe la posibilidad de suministrar un ensayo
basado en las secuencias de ácido nucleico de la proteína
LST-1 proporcionada por la invención, que puede
utilizarse para detectar ácidos nucleicos que codifiquen proteínas
LST-1. Una prueba de este tipo puede llevarse a
cabo, por ejemplo, en células o lisados celulares utilizando
diagnósticos mediante ácidos nucleicos. En este caso, la muestra a
examinar se pone en contacto con una sonda que hibridaría con la
secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína
LST-1. Una hibridación entre la sonda y los ácidos
nucleicos de la muestra indica la presencia de proteínas
LST-1 expresadas. Estos métodos son muy conocidos
por los expertos en el campo y se describen, por ejemplo, en WO
89/06698, EP-A 0 200 362, USP 2915082,
EP-A 0 063 879, EP-A 0 173 251,
EP-A 0 128 018. En una realización preferida de la
invención, el ácido nucleico de la muestra que codifica una
proteína LST-1 se amplifica previamente a la
realización de la prueba mediante, por ejemplo, la conocida técnica
de la PCR. En el campo del diagnóstico mediante ácidos nucleicos
habitualmente se utiliza una sonda de ácido nucleico derivada
(marcada). Esta sonda se pone en contacto con un DNA o RNA
desnaturalizado unido a un transportador y, en este proceso, se
seleccionan la temperatura, fuerza iónica, valor del pH y otras
condiciones de tampón de tal forma que, en función de la longitud de
la muestra de ácido nucleico y de la temperatura de fusión
resultante del híbrido esperado, el DNA o RNA marcado puede unirse a
DNA o RNA homólogo (hibridación, véase también Southern, EM., J.
Mol. Biol. 98 (1975), 503-517; Wahl, G.M., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979),
3683-3687). Los transportadores adecuados son
membranas o materiales transportadores cuyo componente principal es
la nitrocelulosa (p. ej. Schleicher and Schüll, BA 85, Amersham
Hybond, C.), nitrocelulosa reforzada o unida en forma de polvos o
membranas de nylon modificadas con varios grupos funcionales
(p. ej. el grupo nitro) (p. ej. Schleicher and Schüll, Nytran; NEN,
Gene Screen; Amersham Hybond M.; Pall Biodyne).
El DNA o RNA hibridado se detecta entonces
mediante la incubación del transportador, tras un lavado y
saturación exhaustivos para evitar la unión inespecífica, con un
anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de
anticuerpo se dirige hacia la sustancia incorporada en la sonda de
ácido nucleico durante la modificación. A su vez, el anticuerpo
también está marcado. Sin embargo, también es posible utilizar un
DNA marcado de forma directa. Tras la incubación con los
anticuerpos, se lava de nuevo para detectar solamente los
conjugados de unión específica del anticuerpo. La determinación se
lleva a cabo a través del marcador del anticuerpo o fragmento de
anticuerpo según los métodos estándar.
La detección de la expresión de
LST-1 se puede realizar, por ejemplo, de cualquiera
de las siguientes maneras:
- - hibridación in situ con células
completas inmovilizadas utilizando frotis de tejidos inmovilizados y
cromosomas metafásicos aislados,
- - hibridación de colonias (células) e
hibridación de calvas (fagos y virus),
- - hibridación Northern (detección de
RNA),
- - análisis sérico (p. ej. análisis del
tipo celular de las células del suero mediante análisis de
transferencia slot-blot),
- - tras la amplificación (p. ej. técnica
de la PCR).
La invención incluye por tanto un método para la
detección de ácidos nucleicos que codifiquen una proteína
LST-1, que se caracteriza porque la muestra a
examinar es incubada con una sonda de ácido nucleico seleccionada
del grupo formado por:
a) las secuencias de DNA mostradas en los ID. de
SEC. núms.: 1 y 2, o una secuencia complementaria a estas;
b) ácidos nucleicos que hibridan bajo
condiciones de astringencia con una de las secuencias de a).
Se incuba la sonda de ácido nucleico con los
ácidos nucleicos de la muestra y se detecta la hibridación de los
ácidos nucleicos de la muestra con la sonda de ácidos nucleicos, si
se desea, mediante otra pareja de unión.
Así, la proteína LST-1 es un
marcador pronóstico en el diagnóstico tumoral (metástasis, progreso)
y un marcador de la actividad en la proliferación celular,
especialmente para los linfocitos T leucémicos.
A la línea celular U-937 de
linfoma histiocítico humano se le asignó el número de depósito DSM
ACC 5 y se encuentra desde el 3 de abril de 1990, donde está a
libre disposición del público, en la colección pública de
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig.
Boehringer Mannheim GmbH depositó el plásmido
pLST-1 que contiene el gen de la
LST-1 en la Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig el 24 de mayo de 1995 y se le
asignó el número DSM 10011.
La lista de secuencias junto con los ejemplos
que vienen a continuación explican con más detalle la invención. En
este caso:
- ID. de SEC. núm. 1
- denota la secuencia nucleotídica de la región genómica de LST-1.
- \quad
- En la posición 2841 se encuentra un sitio de restricción polimórfico de Pvu II. La caja TATA, el sitio de activación mediante IFN-\gamma (Fc\gammaR1) y el elemento que responde al factor génico 2 inducido por interferón (ISGF-2) se inician en las posiciones 279, 1509 y 1814, respectivamente. Se ha presentado la secuencia de DNA a la base de datos GenBank (número de acceso U00921).
- ID. de SEC. núm. 2
- denota proteína y cDNA de LST-1.
- ID. de SEC. núm. 3
- denota la secuencia de la proteína LST-1 (104 aminoácidos).
- ID. de SEC. núm. 4
- denota la secuencia de la proteína LST-1 (isoforma de 97 aminoácidos)
- Abreviaturas:
- BAT, transcrito asociado a HLA-B; MHC, complejo principal de histocompatibilidad; LST-1, transcrito específico de leucocitos 1; pLst1, clon de cDNA de LST-1; MER, repeticiones de la frecuencia media de reiteración; TNF-\alpha, factor de necrosis tumoral \alpha; TNFA, gen que codifica el TNF-\alpha; TNFB, gen que codifica el factor de necrosis tumoral \beta; LTB, gen que codifica la linfotoxina \beta.
La línea de linfocitos B humanos CAH se
estableció a partir de un individuo homocigótico de tipo
HLA-A3,
-Bw47, -Cw6 y -DR7. Se utilizó DNA genómico para generar la biblioteca de cósmidos cah en el vector pTCF como se ha descrito previamente (EH. Weiss et al., Immunobiology 170 [1985] 367-380). Se aislaron varios cósmidos mediante hibridación con una sonda de TNFA. Se obtuvo un subclón derivado del cósmido cah5 que contenía la región anterior al extremo 5' del gen LTB mediante restricción por la endonucleasa Hind III de cah5. La religación del producto de la digestión dio lugar a un clon truncado (cah5dH3) de 18 kb de longitud. Se aislaron cinco fragmentos PstI adyacentes de 1,5 kb, 0,8 kb, 3,1 kb, 0,4 kb y 0,7 kb denominados Pst6, Pst4, Pst11, Pst400 y Pst700, respectivamente, y se subclonaron en el vector pUC19.
-Bw47, -Cw6 y -DR7. Se utilizó DNA genómico para generar la biblioteca de cósmidos cah en el vector pTCF como se ha descrito previamente (EH. Weiss et al., Immunobiology 170 [1985] 367-380). Se aislaron varios cósmidos mediante hibridación con una sonda de TNFA. Se obtuvo un subclón derivado del cósmido cah5 que contenía la región anterior al extremo 5' del gen LTB mediante restricción por la endonucleasa Hind III de cah5. La religación del producto de la digestión dio lugar a un clon truncado (cah5dH3) de 18 kb de longitud. Se aislaron cinco fragmentos PstI adyacentes de 1,5 kb, 0,8 kb, 3,1 kb, 0,4 kb y 0,7 kb denominados Pst6, Pst4, Pst11, Pst400 y Pst700, respectivamente, y se subclonaron en el vector pUC19.
Los subclones Pst4, Pst6 y Pst11, y dos
fragmentos PstI 5' de 400 y 700 pb respectivamente (Pst400 y
Pst700), se secuenciaron en ambas direcciones con el método de
terminación de cadena mediante didesoxinucleótidos utilizando bien
la Sequenase 2.0 (USB, Braunschweig, Alemania) o la T7 polimerasa
(Pharmacia, Freiburg, Alemania). La organización genómica de estos
fragmentos se determinó mediante la secuenciación directa de cah5dH3
a lo largo de los sitios de restricción de PstI empleando
oligonucleótidos. Esto confirmó el orden y descartó la posibilidad
de que cualquier fragmento pequeño estuviera situado entre los
fragmentos de restricción Pst6, Pst4, Pst11, Pst400 y Pst700.
Se cultivaron linfocitos T Jurkat humanos no
adherentes, la línea celular U-937 histiocítica
humana y la línea celular monocítica humana MonoMac6 en medio de
cultivo RPMI 1640. Las líneas adherentes de carcinoma epitelial
A431 y HeLa se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco
(DMEM). En ambos medios se utilizó como complemento suero fetal
bovino al 10% inactivado por calor, penicilina/estreptomicina al 1%
y L-glutamina al 1% (todos adquiridos en
Gibco-BRL, Berlín, Alemania). Todas las células se
cultivaron en CO_{2} al 5% y a 37ºC en atmósfera humidificada. La
estimulación de las células Jurkat se realizó con 50 ng/ml de
12-O-tetradecanoilforbol-l3-acetato
(TPA) (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y 5 \mug/ml de
fitohemaglutinina (PHA) (Sigma). La línea de células monocíticas
humanas MonoMac6 se estimuló con 1 mg/ml de lipopolisacáridos
(preparados a partir de Salmonella minnesota; Sigma) durante
4 horas. La línea celular histiocítica U-937 se
estimuló con 200 U/ml de interferón \gamma durante 48 horas.
La transcripción inversa de RNA, seguida de la
reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) de mRNA
aislado de células U-937 estimuladas con
interferón-\gamma, dio lugar a un clon de cDNA
designado pLst1 de 636 pb de longitud. Esto concuerda con el tamaño
del mRNA detectado mediante transferencia Northern de unos 800 pb
de longitud, debido a una longitud esperada de la cola de
poli(A) de unos 200 pb. La secuencia de cDNA de pLst1 era
idéntica a las regiones codificantes de la secuencia genómica
clonada a partir de una línea celular humana diferente. El análisis
de secuencias reveló tres regiones bien conservada entre la
LST-1 humana y el transcrito B144 murino, y que
podrían asignarse al exón 2-4 del gen humano.
Igual que en el caso del resto de genes de la
región TNF, LST-1 consta de seis exones (1A, 1B, 2,
3, 4, 5) y cinco intrones. La orientación de su transcripción es la
misma que la de TNFA y TNFB, pero la contraria al gen LTB
adyacente. Este resultado no concuerda con la orientación del gen
del B144 murino tal como especifica la organización de la región
H-2D^{b} publicada por J.M. Wroblewski et
al., Immunogenetics 32 (1990) 200-204. El clon
de cDNA pLst1 humano contiene una región 5' extendida que codifica
codones de parada en los tres marcos de lectura y por tanto puede
considerarse como completo. El cDNA de LST-1
posiblemente codifica una proteína de transmembrana.
El cDNA de LST-1 puede
expresarse en procariotas, preferiblemente en E. coli,
utilizando un vector apropiado (p. ej. pBR 322). La proteína puede
aislarse tras la secreción o bien a partir de cuerpos de inclusión
citoplasmáticos acumulados y posteriormente madurados.
El mRNA de LST-1 se expresa de
forma constitutiva en los linfocitos T, macrófagos,
U-937 y a niveles bajos en la amígdala faríngea,
pulmón e hígado humanos, lo cual puede deberse a los linfocitos y
macrófagos presentes en estos tejidos. En las líneas celulares
epiteliales como las células HeLa y A431, no se detectaron
transcritos de LST-1 (datos no mostrados). Este
patrón de expresión nos impulsó a nombrar al gen correspondiente
como transcrito específico de leucocitos 1 (LST-1,
del inglés Leucocyte Specific Transcript-1).
Los niveles de transcripción pueden potenciarse de forma importante
en las células U-937 mediante la estimulación con
interferón-\gamma, pero no con lipopolisacáridos
en la línea celular de macrófagos MonoMac6. Al estimular la línea de
linfocitos T Jurkat con TPA
(12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato)
se indujo la expresión transitoria del mRNA de LST-1
por encima del nivel constitutivo. Tras la inducción, el nivel de
expresión del mRNA aumentó pasadas cuatro horas, con un pico a las
8 horas y descendió tras 24 horas después de la estimulación.
Ausubel, I., Frederick, M.,
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Weiss, E.H., et al., Immunobiology
170 (1985) 367-380
WO 89/06698
Wroblewski, J.M., et al.,
Immunogenetics 32 (1990) 200-204.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Str. 116
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): D-68305
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0885660-3446
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0885660-3451
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nueva proteína LST-1 inmunorreguladora
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- MODO DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn copia núm. 1.0, versión núm. 1.30B (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. de SEC. núm.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5581 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 48..162
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 544..652
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1044..1162
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1475..1567
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1775..1797
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 2325..2709
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. de SEC. núm.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 312 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..312
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. de SEC. núm.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 104 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DEL ID. de SEC. núm.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 97 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGY: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm. : 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Una proteína inmunorreguladora con un
tamaño de unos 97 a 104 aminoácidos; cuya producción está estimulada
en células U-937 por el IFN-\gamma
en un factor mayor de 100; que se une a la superficie de los
leucocitos; y que:
a) está codificada por la secuencia de DNA
mostrada en el ID. de SEC. núm.: 2 en el caso de la proteína madura
o por la secuencia genómica mostrada en el ID. de SEC. núm.: 1,
o
b) está codificada por secuencias de DNA que
hibridan con las secuencias de DNA mostradas en los ID. de SEC.
núm.: 1 o 2 o con fragmentos de estas secuencias de DNA de la región
que codifica la proteína madura.
2. Una proteína como la reivindicada en la
reivindicación 1, que se puede obtener del sobrenadante del cultivo
celular de la línea celular U-937 tras la
estimulación de la línea celular mediante
IFN-\gamma y la purificación mediante
cromatografía en gel y HPLC en fase inversa.
3. Una proteína como la reivindicada en las
reivindicaciones 1 o 2, que
a) es producto de una expresión procariota o
eucariota de un DNA exógeno,
b) está codificada por
- i)
- la secuencia de DNA mostrada en el ID. de SEC. núm.: 2, en el caso de la proteína madura o en el de la proteína con una presecuencia N-terminal, o por la secuencia genómica mostrada en el ID. de SEC. núm.: 1,
- ii)
- las secuencias de DNA que hibridan con las secuencias de DNA mostradas en los ID. de SEC. núm.: 1 o 2 o con fragmentos de estas secuencias de DNA de la región que codifica la proteína madura, o
- iii)
- las secuencias de DNA que, si no hubiera degeneración del código genético, hibridarían con las secuencias definidas en i) e ii) y que codifican un polipéptido con la misma secuencia aminoacídica,
c) se une a la superficie de los leucocitos,
d) y el marco de lectura de dicha proteína está
definido por un ATG que comienza en la posición 1144 del ID. de SEC.
núm.: 1.
4. Una proteína como la reivindicada en las
reivindicaciones 1 a 3, que posee la secuencia aminoacídica de los
ID. de SEC. núm.: 3 o 4.
5. Una molécula de cDNA que sirve para
asegurar la expresión en una célula huésped procariota o eucariota
de una proteína como la reivindicada en una de las reivindicaciones
1 a 4, la secuencia de la cual se selecciona del grupo formado
por:
a) las secuencias de DNA mostradas en los ID. de
SEC. núm.: 1 o 2 o las secuencias de DNA complementarias,
b) secuencias de ácido nucleico que hibridan con
una de las secuencias de a),
c) secuencias de ácido nucleico que, en caso de
que no haya degeneración del código genético, hibridarían con una de
las secuencias enunciadas en a) o b),
y en la que el marco de lectura de dicha
proteína está definido porque el ATG comienza en la posición 1144
del ID. de SEC. núm.: 1.
6. El plásmido DSM 10011.
7. Una molécula de DNA que tiene la secuencia
mostrada en el ID. de SEC. núm.: 2.
8. Un vector recombinante de expresión que
contiene un ácido nucleico que codifica una proteína como las
reivindicadas en las reivindicaciones 1 a 4 y que expresa el ácido
nucleico que codifica la proteína en un microorganismo transformado
o en una célula eucariota transformada.
9. Una célula huésped procariota o eucariota
que es transfectada con un cDNA que codifica una proteína como las
reivindicadas en las reivindicaciones 1 a 4 y que puede producir la
proteína mencionada.
10. La célula huésped reivindicada en la
reivindicación 9, que es E. coli o una línea celular de
mamífero.
\newpage
11. La utilización de una molécula de cDNA que
codifica una proteína como las reivindicadas en las reivindicaciones
1 a 4, para la transfección de una célula huésped procariota o
eucariota.
12. Un proceso para la obtención de una
proteína según la reivindicación 1, de unión a la superficie de los
leucocitos, mediante su aislamiento a partir del sobrenadante del
cultivo de la línea celular U-937 estimulada con
IFN-\gamma, su separación por cromatografía en gel
y la purificación de una fracción del sobrenadante que corresponde a
una proteína de unos 97 a 104 aminoácidos.
13. Un proceso de producción por recombinación
de una proteína de unión a la superficie de leucocitos mediante la
expresión de un cDNA como el reivindicado en una de las
reivindicaciones 5 o 7 en una célula huésped adecuada y el
aislamiento de la proteína a partir de la célula huésped o del
sobrenadante del cultivo de la célula huésped.
14. El uso de una proteína, que se une a la
superficie de los leucocitos como la reivindicada en una de las
reivindicaciones 1 a 4, como antígeno o inmunógeno para la
producción de anticuerpos que se unan a esta proteína.
15. Un anticuerpo frente a una proteína según
las reivindicaciones 1 a 4, que se puede obtener mediante la
inmunización de un animal con una proteína como las reivindicadas en
una de las reivindicaciones 1 a 4 y el aislamiento de los
anticuerpos del suero o las células esplénicas de los animales
inmunizados.
16. Un método para la detección de ácidos
nucleicos que codifican una proteína según las reivindicaciones 1 a
4, en el que la muestra a examinar se incuba con una sonda de ácido
nucleico seleccionada del grupo formado por:
a) DNA con las secuencias mostradas en los ID.
de SEC. núm.: 1 o 2 o sus secuencias complementarias,
b) ácidos nucleicos que hibridan bajo
condiciones de astringencia con una de las secuencias de a).
La sonda de ácido nucleico se incuba con el
ácido nucleico de la muestra y la hibridación del ácido nucleico de
la muestra con la sonda de ácido nucleico se detecta, si se desea,
mediante otra pareja de unión diferente.
17. El método de la reivindicación 16, en el
que se amplifica el ácido nucleico a detectar antes del paso de
detección.
18. Un proceso para la producción de una
proteína según las reivindicaciones 1 a 4, que comprende los
siguientes pasos: expresar en una célula de mamífero el gen endógeno
para esta proteína mediante la inserción de un constructo de DNA
dentro del genoma de la célula mediante recombinación homóloga,
conteniendo dicho constructo de DNA un elemento regulador del DNA
con capacidad de estimular la expresión de dicho gen si está unido
funcionalmente a él, además de uno o varios segmentos diana de DNA
homólogos a una región de este genoma que se encuentra dentro de
dicho gen o está próximo a él; cultivar las células; y recuperar
dicha proteína de las células o del sobrenadante del cultivo
celular.
19. Un proceso para la producción de una
proteína según las reivindicaciones 1 a 4, que comprende los
siguientes pasos: expresar en una célula de mamífero al menos un gen
exógeno que codifica esta proteína mediante la inserción de un
constructo de DNA dentro del genoma de la célula mediante
recombinación homóloga, conteniendo dicho constructo de DNA un
elemento regulador del DNA con capacidad de estimular la expresión
de dicho gen si está unido funcionalmente a él, un elemento de DNA
que codifique dicha proteína y además uno o varios segmentos diana
de DNA homólogos a una región de este genoma; cultivar las células;
y recuperar dicha proteína de las células o del sobrenadante del
cultivo celular.
20. La utilización de un constructo de DNA que
puede introducirse dentro del genoma de células de mamífero mediante
recombinación homóloga, que contiene:
- un elemento regulador de DNA con capacidad de
modular la expresión de un gen si está unido funcionalmente al
mismo,
siendo un gen que codifica una proteína de
acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4,
- y uno o varios segmentos diana de DNA
homólogos a una región de este genoma,
estando la región dentro de dicho gen o próxima
al mismo,
y que puede ser inserido dentro de dicho genoma
de la célula de mamífero de tal forma que el elemento regulador esté
unido funcionalmente al gen que codifica dicha proteína,
para la preparación de un agente terapéutico
antitumoral o un agente inmunorregulador.
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