CZ247199A3 - Rekombinantní molekula DNA, kódující nový IFNAR1 receptor-vazebný protein, hostitelská buňka pro expresi zmíněné rekombinantní DNA, způsob prodloužení přežívání tkáňového štěpu a způsob zvýšení buněčné odpovědi na exogenní IFN terapii, nové IFNAR1 vazebné proteiny, způsob jejich přípravy a molekula s protilátkovou aktivitou - Google Patents

Description

Oblast techniky » Navrhovaný vynález se obecně zabývá molekulárními mechanizmy působení interferonů. Konkrétně se vynález zabývá novými proteiny vážícími se na IFN receptor typu I, rekombinantními DNA molekulami, které kódují zmíněné proteiny a dále způsoby modulace buněčné odpovědi na interferon.

Dosavadní stav techniky

Interferony typu I (podtypy IFN-α a IFN-β) ovlivňují buňky nejrůznějšími způsoby. Příkladem může být inhibice růstu virů (antivirové účinky), inhibice buněčné proliferace (protinádorové účinky) a ovlivnění imunitní odpovědi (imunoregulační účinky). Tyto účinky interferonů (IFN) jsou spojeny s biochemickou a morfologickou modifikací buněk (Revel, 1984).

Interferony působí na buňky pomocí druhově specifických receptorů. Pro interferony typu I byly identifikovány dva transmembránové receptory: IFNAR1 (Uze a kol., 1990) a IFNAR2-2 (nebo IFNAR2-C Domanski a kol., 1995). Přenos signálu IFN-α, β nebo ω do buňky zahrnuje protein tyrozin kinázy z rodiny Janus kináz (Jak) a transkripční faktory z rodiny Stát (Darnell a kol., 1994). Proteiny Jak-Stat biochemických drah jsou aktivovány vazbou k intracytoplazmatickým (IC) doménám IFN AR 1 a IFNAR2 receptorů. Mezi proteiny, vážící se k IFNAR1 IC doméně patří tyk2 a Stat2 (Abramovich a kol., 1994). Stat2 poté umožní Stati vytvořit IFN-indukovaný ISGF3 transkripční komplex, který aktivuje IFN indukované geny (Leung a kol., 1995).

Transkripční komplexy obsahující Stat3 jsou také indukované IFN-β (Harroch a kol., 1994). Byla popsána vazba Stat3 k IFNAR1 IC, závislá na IFN (Yang a kol., 1996). Protein-tyrozin fosfatázy PTP1C a D po přidání IFN reverzibilně • ·«» « 0 0 0 « · · · • · » 0 « 0 00 ♦' '0 0 0 ··· « · 0 0 0 « ·«« ·»· ·· ·· 0 '·· asociují s IFNAR1 IC (David a kol., 1995a). Navíc bylo zjištěno, že se dvě serin/threonin protein kinázy, 48 kDa ERK2 MAP kináza (David a kol., 1995b) a cAMP aktivovaná proteinkináza A (David a kol., 1996) váží k izolované membránové proximální části (50 aminokyselinových zbytků) IFNAR1 IC. Ze zmíněného vyplývá, že IC domény IFN receptorů I typu slouží jako zásahové místo mnohých proteinů, které zprostředkují a regulují biologické účinky IFN na buňky.

Two-hybrid systém na kvasničném modelu je účinnou metodou identifikace to nových proteinů, které se váží na definovanou polypeptidovou sekvenci (Fields a Song, 1989). Zkráceně zahrnuje tato metoda transfekci kvasničných buněk a) plazmidovou DNA, kde je definovaný polypeptid („bait“, neboli návnada) fúzován s DNA-vazebnou doménou Gal4 transkripčního faktoru a b) cDNA knihovnou fúzovanou s aktivační doménou Gal4 v plazmidu pACT. Buňky kvasinek transfektované cDNA, kódující protein, který se váže k polypeptidové návnadě (bait) vykazují Gal4 aktivitu. Přítomnost takového polypeptidu, který vaze polypeptidovou návnadu (bait), je prokázána expresí enzymatické aktivity, například β-galaktozidázy z GAL-l-lacZ konstruktu, který je s výhodou vložen do genomu kvasinky. Z těch klonů, které byly ve zmíněném testu pozitivní, je možné dále vyizolovat pACT plazmid, určit nukleotidovou sekvenci inzertu a identifikovat protein, který je tímto inzertem kódován. Tato metoda již umožnila identifikaci nových proteinů, které interagují s IC doménou receptorů pro cytokiny (Boldin a kol., 1995).

Citace kteréhokoliv dokumentu zde nemusí nutně znamenat, že takový dokument odpovídá dosavadnímu stavu techniky, nebo že je nutné uvažovat ť tento materiál ve vztahu k patentovatelnosti kteréhokoliv nároku navrhovaného vynálezu. Všechny údaje týkající se data nebo obsahu dokumentů jsou

- založeny na informacích, dostupných žadatelům v době podání patentové přihlášky a nejsou zárukou že zmíněné údaje jsou správné.

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález se zabývá dvěma novými lidskými proteiny, označovanými zde jako IR1B1 a IR1B4, které byly identifikovány jako IFN receptor I (IFNAR1) vazebné proteiny. Dále se vynález zabývá DNA, kódující

r »··♦ *· 4 »44 4

9·4 444 zmíněné dva proteiny. Oba zmíněné proteiny IR1B1 i IR1B4 interagují s intracytoplazmatickou (IC) doménou IFNAR1 a zprostředkují buněčnou odpověď na interferon.

Navrhovaný vynález se dále zabývá rekombinantní molekulou DNA, obsahující nukleotidovou sekvenci kódující jeden z proteinů IR1B1 nebo IR1B4, nebo jejich fragmenty, stejně jako proteiny, kódovanými zmíněnou DNA. V rekombinantních molekulách DNA je nukleotidová sekvence kódující jeden z proteinů IR1B1 nebo IR1B4, nebo jejich fragmenty, operativně spojena s promotorem v orientaci „sense“ nebo „anti-sense“ (tj. promotor může být umístěn na kódujícím i na nekódujícím řetězci DNA).

Vnesením rekombinantní DNA molekuly, obsahující promotor, operativně spojený s nukleotidovou sekvencí, kódující nový IFNAR1 vážící protein v orientaci „sense“, přímo do nádoru je odpověď na exogenní interferonovou terapii při léčbě nádoru zvýšena.

Dále se navrhovaný vynález týká způsobu prodloužení přežití tkáňových štěpů pomocí vnesení rekombinantní DNA molekuly, obsahujíc! promotor, operativně spojený s nukleotidovou sekvencí, kódující nový IFNAR1 vážící protein nebo jeho fragment v orientaci „anti-sense“ do tkáňového štěpu ještě před transplantací štěpu pacientovi.

Navrhovaný vynález se tedy zabývá také farmaceutickými prostředky s obsahem takové DNA, RNA nebo proteinu a terapeutickými metodami jejich použití.

Navrhovaný vynález se konečně Zabývá také protilátkami, specificky vážícími nové proteiny podle navrhovaného vynálezu.

Stručný popis obrázků

Obr. 1: Interakce IR1B1 s IFNAR1-IC doménou, stanovená pomocí „twohybrid“ analýzy genetických interakcí v kvasinkách. V rámečku ve spodní části obrázku jsou popsány jednotlivé kombinace cDNA inzertu v pACT s různými návnadami (bait).

Obr. 2: Interakce IR1B4 s IFNAR1-IC doménou, stanovená pomocí „twohybrid“ analýzy genetických interakcí v kvasinkách. V rámečku ve spodní části obrázku jsou popsány jednotlivé kombinace cDNA inzertu v pACT s různými návnadami (bait).

• ··«· w* *· ·* » · · ♦ · * ·*« 4 4 9 4 « 4 '4 4 4 94 4

4 4 4 4

444 444·· 44 94

4 4

Obr. 3: Nukleotidová (SEQ ID NO:1) a aminokyselinová (SEQ ID NO:2) sekvence IR1B1.

Obr. 4; Homologie a porovnání (alignment) aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO;2) IR1B1 s aminokyselinovými sekvencemi dvou kalcium-vazebných proteinů, kalcineurinu B (zkracováno CALB, SEQ ID NO;3) a kalcitraktinu (zkracováno CATR, SEQ ID NO:4). Aminokyseliny, identické v sekvencích IR1B1 a CALB nebo CALB a CATR jsou označeny symbolem „|“ spojujícím zmíněné aminokyseliny. Identita mezi IR1B1 a CATR, ale nikoliv s CALB je označena symbolem Tučně jsou označeny kalcium-vazebné domény „helixsmyčka-helix EF-hand“.

Obr. 5; Northern blot IR1B1 mRNA a 18S rRNA (spodní řádek) v lidských myelomových U266S buňkách po hybridizaci s IR1B1 c DNA a rychlé a přechodné indukci IR1B1 po aplikaci IFN-a8 nebo IFN-β po dobu 2 hodin nebo 18 hodin. V první dráze je kontrolní vzorek bez aplikace IFN po 2 hodinách.

Obr. 6A a 6B: SDS-PAGE zobrazující in vitro interakce IR1B4 s izolovanou IFNAR1-IC doménou (Obr. 6A) a s extrakty z buněčných membrán lidských U266S a U266R buněčných linií.

o C

Obr. 6A; [ Sjmethioninem značené translační produkty s nebo bez flagIR1B1 invitro transkriptů byly buď imunoprecipitovány (10 μΐ) s anti-flag M2 kuličkami (dráhy 1 a 4), nebo reagovaly s glutathionovými kuličkami s navázaným GST fúzovaným se 100 aminokyselin dlouhou IFNAR1-IC doménou (dráhy 2 a 5), a nebo s navázaným samotným GST (dráhy 3 a 6). Po inkubaci při 4 °C přes noc (finální objem 100 μΐ) byly kuličky promyty, proteiny byly uvolněny SDS a před SDS-PAGE byly vzorky ještě za redukujících podmínek povařeny.

Obr. 6B: U266S (dráha 1) a U266R (dráha 2) byly extrahovány Brij pufrem s inhibitorem proteáz (Abramovich a kol., 1994) a 0,35 ml (10 ⁷) buněk bylo přes noc při 4 °C inkubováno se 75 μΐ [³⁵S]methioninem značených translačních produktů flag-IRlBl transkriptů.

Anti-IFNARl mAb R3, imobilizovaná na kuličkách potažených proteinem G (25 μΐ), byla přidána a směs byla inkubována po dobu 2,5 hod. Dále byla směs promyta Brij pufrem, proteiny byly uvolněny pomocí SDS, povařeny v redukujícím prostředí a analyzovány SDS-PAGE. Kontrolní vzorek, ve kterém »•♦1 ♦ ·· ·· ·♦* ··

9'9· 9 '··

9 byly použity anti-flag M2 kuličky byla také analyzován (dráha 3). Vysušené gely byly zviditelněny pomocí přístroje Phosphor-Imager. V prvních třech drahách na obr. 6A nebyla k in vitro translační reakci přidána žádná IR1B4 mRNA. Dráhy 4 až 6 obr. 6A zobrazují vzorky, kde byla k in vitro translační reakci přidána mRNA kódující IR1B4 fúzovaná s flag proteinem.

Obr. 7; Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO:7) a odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO:8) IR1B4.

Obr. 8; Porovnání aminokyselinových sekvencí IR1B4 (SEQ ID NO;8) a PRMT1 (SEQ ID NO:9) a jejich odlišnosti.

Obr. 9: Porovnání aminokyselinových sekvencí IR1B4 (SEQ ID NO:8) a HCP-1 (SEQ ID NO: 10) ajejich odlišnosti.

Obr. 10: Methyltransferázový test. Extrakt z U266S buněk byl inkubován s kuličkami, potaženými proteinem A a anti-IFNARl protilátkou (dráha 1) nebo pouze proteinem A (dráha 2). Methyltransferázová aktivita byla stanovena pomocí značení histonů ¹⁴C(methyl)-S-adenosyl methioninem a analýzou TadioaktiVity v pruhu, odpovídajícím histonu, na SDS-PAGE.

Obr. 11: Stanovení protein-arginin methyltransferázové aktivity u U266S buněk. Protein-arginin methyltransferázová aktivita u lidských U266S buněk byla stanovena pomocí methylace proteinu Rl, který má sekvenci SEQ ID NO: 11 (dráha 1). V dráze 2 byl přidán anti-sense oligonukleotid se sekvencí SEQ ID NO:12, komplementární k sekvenci nukleotidů 12-33 v blízkosti iniciačního kodonu IR1B4 cDNA. V dráze 3 byl přidán odpovídající sense oligonukleotid. Je zřejmé, že anti-sense oligonukleotid významně inhibuje protein-arginin methyltransferázovou aktivitu, zatímco kontrolní sense oligonukleotid vykazuje jen malý efekt.

Obr. 12: Graf zobrazující inhibici růstu lidských U266S buněk v odpověď na působení IFN-β v přítomnosti či v nepřítomnosti anti-sense oligonukleotidů, popsaného v legendě k obrázku 11 (AS-1), odpovídajícího sense oligonukleotidů (S-3) a dalšího anti-sense oligonukleotidů, komplementárního se střední částí sekvence IR1B4 cDNA (AS-2). Buněčný nárůst (denzita) byl kvantifikován za použití Almar Blue (viz. příklad 7) a pokles hustoty buněk byl přepočten na procenta kontrolního (neošetřeného) vzorku a vynesen do grafu jako stupeň inhibice růstu.

* »·® ι«· ··<

'♦ · <· · ·♦<

·· '·♦ ·' 5’ ··

Navrhovaný vynález se zabývá objevem dvou nových lidských proteinů, které interagují s intracytoplazmatickou doménou (IC) IFNAR1 řetězce receptorů pro interferiny I typu (IFN-α, β nebo ω). Zmíněné proteiny jsou zde popsány jako IFN receptor vazebný protein 1 (IR1B1) a IFN receptor vazebný protein 4 (IR1B4). Interakce zmíněných nových proteinů s IFNAR1 byla prokázána pomocí genetického two-hybrid testu na kvasničném modelu. Transfekce kvasinek reportérového kmene SFY526 (Bartel a kol., 1993) IR1B1 nebo IR1B4 c DNA fúzovanou s Gal4 aktivační doménou měla za následek obnovení β-galaktozidázové aktivity je v případě, kdy byla jako návnada (bait) použita IFNAR1-IC doména (fúzovaná z Gal4 DNA-vazebnou doménou).

Sekvence IR1B1 cDNA kóduje 191 aminokyselin dlouhý polypeptid. Počítačová analýza sekvence odhalila po porovnání s dostupnými databázemi sekvencí, že IR1B1 je nový protein, který vykazuje znatelnou homologii, tj. kalcium vazebná místa, s kalcium vazebnými proteiny kalcineurinem β a kalcitraktinem. Kalcineurin β (Guerini a kol., 1989) je 19 kDa podjednotka_ serin/threonin fosfatázy, která hraje klíčovou úlohu při aktivaci translokace transkripčního faktoru NFAT k jádru T-lymfocytů a která je inhibována imunosupresivními léčivy jako například cyklosporinem. Kalcítraktin (Lee a Huang, 1993), je 21 kDa protein asociovaný s cytoskeletem, nachází se v centrozómu a účastní se pohybu chromozómů v průběhu mitózy, ještě obecněji je součástí organizačního centra mikrotubulů. Nový IR1B1 protein je tedy novým členem rodiny Ca²⁺ regulovaných proteinů, do které patří i zmiňovaný kalcineurin a kalcítraktin.

Překvapivě bylo zjištěno, že gen pro IR1B1 je v lidských buňkách po ošetření IFN velmi rychle aktivován. Jedná se o první známý případ kalcium vazebného proteinu, který je indukován interferonem. Vzhledem k tomu, že vápenaté ionty regulují buněčnou morfologii, adhezi a buněčné dělení, mohla by modulace IR1B1 aktivity v buňkách ovlivnit odpověď normálních i maligních buněk na interferon. Mechanizmem funkce IR1B1 ve zprostředkování účinků interferonů na buňky je interakce IR1B1 s IC doménou IFN receptorů.

Stejně jako IR1B1, i IR1B4 byl po porovnání sekvence s dostupnými databázemi shledán novým. Bylo také zjištěno, že IR1B4 vykazuje sekvenční homologii s enzymy, které využívají S-adenozylmethionin pro methylaci argininových zbytků u proteinů (protein arginin methyltransferázy, neboli φφφ φφφ

ΦΦ

PRMT1; Kagan a Clarke, 1994; Lin a kol., 1996). Bylo zjištěno, že IR1B4 se in vitro váže přímo na IC doménu IFNAR1 a methylace histonů prokázala konstitutivní asociaci PRMT aktivity s IFNAR řetězcem IFN-α,β receptoru, izolovaného z lidských buněk. Po přidání anti-sense (tj. komplementárních s kódující sekvencí) oligodeoxynukleotidů z IR1B4 cDNA ke kultuře lidských buněk dochází k poklesu PRMT aktivity v buňkách. Lidské myelomové buňky, které byly tímto způsobem ošetřeny, vykazovaly značně sníženou odpověď na interferon (měřeno jako inhibice růstu). Z toho vyplývá, že IR1B4/PRMT je součástí biochemické dráhy, pomocí které interferonový receptor působí na inhibici růstu nádorových buněk a která je i součástí dalších funkcí IFN receptoru. Mezi známé substráty PRMT patří celá řada RNA a DNA vazebných proteinů a především heterologní skupina jaderných ribonukleoproteinů (hnRNP). hnRNP se účastní transportu mRNA z jádra do cytoplazmy , alternativního sestřihu pre-mRNA a post-transkripční kontroly (Liu a Dreyfuss, 1995). V souladu s tím mohou být nová IR1B4/PRMT cDNA i protein, jež byly objeveny— díky—sv-é—schopnosti—váϊat^-1FΝ“Ίγeceptoř, použity pro ”módifikácí odpovědi lidských nebo živočišných buněk na interferon.

Rekombinantní DNA molekula podle navrhovaného vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje IR1B1 nebo IR1B4 protein, nebo fragment některého z nich, a může být použita buď pro zlepšení buněčné odpovědi na interferon, a to zvýšením exprese IR1B1 nebo IR1B4 cDNA, nebo pro potlačení buněčné odpovědi na interferon snížením exprese IR1B1 nebo IR1B4 proteinů s použitím anti-sense RNA molekul.

Zvýšená in vivo exprese IR1B1 nebo IR1B4 cDNA by mohla být užitečná pro nádorovou terapii, kde by intenzivnější buněčná odpověď na IFN měla za následek zpomalení růstu maligních buněk a zvýšenou citlivost k exogenní protinádorové IFN terapii. Zvýšení exprese IR1B1 nebo IR1B4 in vivo v cílovém místě, a tím i zintenzivnění buněčné odpovědi na interferon lze dosáhnout injekcí expresního vektoru, který obsahuje IR1B1 nebo IR1B4 cDNA, operativně spojenou v sense orientaci se silným konstitutivním promotorem, přímo do cílového místa, například do oblasti mozkového nádoru nebo do metastatických nádorových uzlin (například melanom nebo nádor prsu).

< ♦ · · t ,· » · ·»«' 4 <· * ·

·· ·»

Naopak snížení exprese IR1B1 nebo IR1B4 proteinu in vivo lze využít pro prodloužení přežívání tkáňových štěpů, neboť odhojení zmíněných štěpů hostitelem je zprostředkováno histokompatibilitními antigeny (MHC I třídy), jejíchž syntéza je závislá na IFN podnětech. Je-li cDNA IR1B1 nebo IR1B4, nebo jejich fragmentů, ve vhodném vektoru operativně spojena s odpovídajícím promotorem v anti-sense orientaci a takto vnesena do buněk tkáňového štěpu, vede exprese anti-sense RNA k degradaci mRNA IR1B1 nebo IR1B4 (nebo „sense“ RNA pro IR1B1/IR1B4) a následně k poklesu hladiny IR1B1 nebo IR1B4 proteinu v buňce.

Anti-sense RNA je transkribována z promotoru, umístěného proti směru transkripce, operativně spojeného s kódující sekvencí v anti-sense orientaci, tj. v ‘orientaci opačné k normální, neboli sense orientaci DNA a její transkribované sense RNA (mRNA). Exprese anti-sense RNA, komplementární k sense RNA, je účinným způsobem regulace biologické funkce RNA molekul. Obě komplementární molekuly RNA (sense a anti-sense) vytvoří stabilní duplex a normální (sense) RNA transkript je takto inaktivován (tj. nemůže být translatován).

Rekombinantní DNA molekuly jako předměty navrhovaného vynálezu obsahují cDNA IR1B1 nebo IR1B4, nebo její fragmenty, operativně spojené s promotorem v sense nebo anti-sense orientaci. Termínem „promotor“ je označována dvouřetězcová DNA nebo RNA sekvence, která je schopná vázat RNA polymerázu a započít tak transkripci „operativně připojené“ nukleotidové sekvence. DNA sekvence je tedy operativně spojena s promotorem, pokud je promotor schopen zajistit transkripci zmíněné DNA sekvence, nezávisle na její orientaci.

Pro kontrolu transkripce může být použit kterýkoliv promotor, který je funkční v hostitelské/cílové buňce. Mezi promotory, které jsou funkční v savčích buňkách, patří například SV40 časný promotor, hlavní pozdní promotor adenovirů, promotor thymidinkinázy z viru herpes simplex (HSV), RSV LTR promotor, okamžitý časný promotor lidského cytomegaloviru (CMV), LTR promotor myšího viru MMTV, promotor interferonu-β, promotor „heat shock“ proteinu 70 (hsp70), stejně jako mnoho dalších, odborníkům dobře známých promotorů.

• ···»· A* *· *· t · ♦ · « • »·* · ·· · » · « · · »Φ· • · ,· · * ·«···· ·· «· ·· ·· « * · ♦.

• · β · ·»· ···

Promotor, operativně spojený s IR1B1 nebo IR1B4 cDNA v orientaci „sense“, určený pro expresi IR1B1 nebo IR1B4 proteinu, je nejraději silný konstitutivní promotor. Tak je zajištěna vysoká hladina IR1B1 nebo IR1B4 nezávisle na přítomnosti endogenního buněčného mechanizmu, regulujícího expresi IR1B1 nebo IR1B4.

Podobně promotor operativně spojený s IR1B1 nebo IR1B4 cDNA v orientaci „anti-sense“, je s výhodou silný promotor, například jako promotor z regulační oblasti viru Epstein-Barrové (EBV), který zajišťuje vysoké hladiny exprese anti-sense RNA (Deiss a Kimchi, 1991).

Anti-sense sekvence je s výhodou upravena tak, aby její exprese byla možná jen v hostitelské/cílové buňce, což je nejraději lidská buňka. Exprimovaná anti-sense RNA by měla být v hostitelské buňce stabilní (tj. neměla by podléhat rychlé degradaci). Anti-sense RNA by měla specificky hybridizovat pouze se sense mRNA, která je exprimována v hostitelské/cílové buňce, a spolu by potom obě molekuly měly tvořit stabilní dvojřetězcovou molekulu RNA, která je v zásadě „nepřeložitelná“, tj. nemůže podle ní proběhnout translace. Jinými slovy, anti-sense RNA, exprimovaná v hostitelské/cílové buňce, zabraňuje translaci exprimované sense mRNA, tj. brání expresi IR1B1 nebi IR1B4 proteinů. Do odpovídajícího vektoru může být jako anti-sense sekvence vnesena buď úplná cDNA sekvence IR1B1 nebo IR1B4, nebo pouze některá její část, neboť i část komplementární sekvence může hybridizovat s kódující (sense) mRNA a může tak zabránit její translaci na IR1B1 nebo IR1B4 protein. V souladu s tím označuje termín „anti-sense“ sekvence, tak jak je použit v popisu vynálezu a v patentových nárocích, celou anti-sense sekvenci, nebo takovou její část, která může být exprimována v transformovaných/transfektovaných buňkách a která je schopna specificky hybridizovat se sense IR1B1 nebo IR1B4 mRNA za vzniku dvojřetězcové RNA molekuly, která již nemůže být dále translatována.

Anti-sense sekvence nemusí hybridizovat s celou délkou IR1B1 nebo IR1B4 mRNA. Může hybridizovat pouze s vybranými oblastmi, jako jsou například 5 -nepřepisovaná nekódující sekvence, kódující sekvence, nebo 3'nepřepisovaná sekvence sense mRNA. Nejraději je anti-sense sekvence zvolena tak, aby hybridizovala s 5'-kódující sekvencí a/nebo s 5'-nekódující oblastí například v místě čepičky nebo v oblasti iniciačního kodonu, neboť bylo na • •toto ♦ toto •to toto *· *· • φ · 9 · to to · « to · · · · · · to to toto· · '.··· toto* • to* * · «· «to *· ·· mnoha příkladech potvrzeno, že hybridizace v oblasti iniciačního kodonu je velmi účinná, zatímco hybridizace s interní sekvencí v kódující oblasti je neefektivní (Wickstorm, 1991). Účinnost anti-sense sekvence při prevenci translace z IR1B1 sense mRNA lze snadno testovat metodou stanovení proteinarginin methyltransferázové aktivity v U266S buňkách tak, jak je to popsáno v příkladu 7. Vzhledem k velikosti savčího genomu je s výhodou, je-li anti-sense IR1B1 nebo IR1B4 sekvence dlouhá nejméně 17, ještě raději pak nejméně 30 párů bází. Ovšem i kratší sekvence mohou být použity v případě, kdy nehybridizují s dalšími savčími sekvencemi nebo kdy taková „křížová hybridizace“ neinterferuje s buněčným metabolismem takovým způsobem a v takové míře, aby snižovala účinnost navrhovaného vynálezu.

Jak cílová sekvence pro hybridizaci, tak i vhodná délka hybridizující antisense sekvence, mohou být snadno experimentálně stanoveny. Pro systematické odstraňování stále větších částí anti-sense sekvence z vektoru mohou být použity standardní metody, jaké byly popsány například v Ausbel a kol., eds. -Gurrent^Protoco 1 s~in-^vío 1 ecu 1 ar^bŤologyTGrěenPuhliJlfihgTAssoc.. Ňew York. N.Y., 1987-1996; a Sambrook a kol.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Kromě anti-sense sekvencí plné délky mohou být připraveny soubory postupných delecí, a to nejraději na 5 -konci anti-sense sekvence.Tímto způsobem je vytvořen soubor zkrácených anti-sense sekvencí, které jsou komplementární nejraději k 5'-konci sense mRNA a dohromady vytvářejí RNA molekulu, která je na 5 -konci sense mRNA dvojřetězcová (komplementuje s 3'-koncem anti-sense RNA) a tudíž nemůže být přepisována a je tak zabráněno vzniku odpovídajícího proteinu. Navíc tyto anti-sense oligonukleotidy, jako například oligonukleotid AS-1 (SEQ ID NO:12) mohou být snadno syntetizovány chemickou cestou a poté vneseny do vektoru tak, aby byly operativně spojeny s vhodným promotorem. Takto připravený vektor je vhodný pro použití pro snížení in vivo exprese IR1B1 a IR1B4 proteinů v buňkách. Vektorem pro použití podle vynálezu může být kterýkoliv vhodný eukaryotický nebo prokaryptický vektor, používaný pro transfekci savčích buněk, jako například epizómové vektory, replikativní vektory nebo vektory integrující se do chromozómu, které jsou v oboru běžně známé. Zvláště vhodným vektorem pro expresi IR1B1 nebo IR1B4 anti-sense RNA je epizómový plazmid nesoucí φφφφ

ΦΦ* • ΦΦ φ

ΦΦΦ φ

ΦΦ

EBV (virus Epstein-Barrové) regulační oblast (Deiss a Kimchi, 1991), sloužící jako promotor, operativně spojený s IR1B1 nebo IR1B4 cDNA, která je vzhledem ke zmíněné regulační oblasti v orientaci anti-sense. Použití antisense vektorů a oligonukleotid fosforothioátů je popsáno v Annals of the New York of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, eds. B.E. Hubber a J.S. Lazo, Vol. 716, 1994 (např. Milligan a kol., str. 228-241).

Podle navrhovaného vynálezu může být přežívání tkání a orgánů, transplantovaných pacientu, v případě nutnosti prodlouženo potlačením buněčné odpovědi na IFN. Odhojení tkáňového štěpu je zprostředkováno histokompatibilitními antigeny, přičemž syntéza MHC antigenů I třídy je závislá podnětech, zprostředkovaných IFN. Potlačením buněčné odpovědi na IFN lze tedy dosáhnout prodloužení přežívání tkáňových štěpů. Způsob prodloužení přežívání tkáňových štěpů podle navrhovaného vynálezu zahrnuje vnesení rekombinantní DNA molekuly, obsahující IR1B1 nebo IR1B4 cDNA sekvenci nebo její část, operativně spojenou s promotorem v orientaci antisense, do buněk tkáně nebo orgánu, určeného pro transplantaci pacientovi a tedy zajištění exprese anti-sense IR1B1 nebo IR1B4 RNA v takto transfektovaných/transformováných buňkách.

Rekombinantní DNA může být do buněk tkáně nebo orgánu vnesena kterýmkoliv v oboru známým způsobem, vhodným pro tento účel. Poté co bylá rekombinantní DNA molekula vnesena do buněk tkáně nebo orgánu může následovat transplantace zmíněné tkáně nebo orgánu pacientu, který takovou transplantaci potřebuje.

Farmaceutický prostředek s obsahem rekombinantní DNA molekuly, která je expresním vektorem a-která obsahuje IR1B1 nebo IR1B4 cDNA operativně spojenou s promotorem v sense orientaci, může být injikován přímo do tkáně nádoru, tj. do mozkového nádoru a metastazujících nádorových uzlin. Buňky takto ošetřeného nádoru se tak stávají citlivějšími k IFN a lépe odpovídají na exogenní IFN terapii, kteráje součástí léčby rakoviny. Zvýšená odpověď buněk na exogenní IFN terapii vede k inhibici růstu maligních buněk.

Přenos genů in vivo nebo ex vivo je dobře popsán například v Annals of the New York Academy of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, vol.

716, 1994; viz. například G.E. Plautz, „Direct Gene Transfer for the

Understanding and Treatment of Human Disease“ na str. 144-153 a Roemer a ··· ···· ···· • · φ · · · · · φ · · · ··· · ··· ··· • · · · · · ··· ··€ ·· ·· ·· ·· kol., Mechanisms of Action of the p53 Tumor supressor and Prospects for Cancer Gene Therapy by Reconstitution of p53 function“ na str. 265-282. Rekombinantní DNA molekuly jsou vkládány do buněk tkání nebo orgánů, určených pro transplantaci nebo do nádorové tkáně pomocí adenovirových vektorů, retrovirových vektorů, vektorů na bázi adenovirus-asociovaného viru (AÁV), stejně jako pomocí přímých DNA injekcí nebo oligonukleotidlipozómových injekcí. Jsou známy klinické pokusy, kdy byly vektory na bázi retrovirů injikovány do mozkových nádorů nebo kdy byly adenoviry použity pro infekci buněk horních cest dýchacích.

Farmaceutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují rekombinantní DNA molekuly, nesoucí IR1B1 nebo IR1B4 cDNA, nebo její fragment, operativně spojený s promotorem v sense nebo anti-sense orientaci vzhledem ke zmíněnému promotoru, v množství dostatečném pro dosažení požadovaných účinků. Navíc mohou farmaceutické prostředky obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče nebo pomocné látky, které ^rekombŤnantirrDNAnhble^kulu stabilizují nebo usnadňují její podávání.

Další z provedení navrhovaného vynálezu se týká molekul, obsahujících antigen-vazebné místo protilátky, specifické pro IFNAR1 vazebné proteiny IR1B1 nebo IR1B4 nebo jejich fragmenty. Takové molekuly jsou určeny pro použití v diagnostice. Příkladem mohou být imunodetekční metody pro stanovení hladin IR1B1 nebo IR1B4 proteinů v nádorové tkáni získané biopsií, nebo pro použití pro purifikaci proteinů pomocí afinitní chromatografie.

Termínem „protilátka“ jsou zde označeny polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), chimérní protilátky, anti-idiotypové (anti-Id) protilátky, protilátky s jedním řetězcem a rekombinantní cestou získané lidské protilátky, stejně jako aktivní frakce zmíněných protilátak, získaná kteroukoliv známou metodou, jako například (ale nikoliv pouze) enzymatickým štěpením, syntézou peptidů nebo rekombinantními technikami.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populací protilátkových molekul, získanou ze séra živočichů, imunizovaných antigenem. Monoklonální protilátka je v zásadě homogenní populace protilátkových molekul, specifických k danému antigenu, která obsahuje v podstatě podobná epitopvazebná místa. Způsoby přípravy monoklonálních protilátek (mAb) jsou v oboru dobře známé. Viz. například Kohler a Milstein, Nátuře 256: 495-497 • · • · · · · · · • · · · · · · ··· · · · · · · · · ·· (1975); US Patent No. 4,376,110; Ausubel a kol., eds., supra, Harlow and lané ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan a kol., eds. CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Green Publishing Association and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Obsah zmíněných publikací je zde zahrnut odkazem. Zmíněné protilátky mohou být protilátkami kterékoliv imunoglobulinové třídy včetně IgM, IgG, IgA, IgE a GILD a kterékoliv jejich podtřídy. Hy/bridomy produkující protilátky podle vynálezu mohou být kultivovány in vitro, in šitu nebo in vivo. Metody in šitu nebo in vivo jsou díky produkci vyšších titrů mAb používány nejčastěji. Chimérní protilátky jsou takové molekuly, jejichž různé části pocházejí z různých živočišných druhů, například variabilní oblast je myšího původu a konstantní oblast je z lidského imunoglobulinu. Chimérní protilátky jsou používány především pro snížení imunogenicity při aplikaci a pro zvýšení výtěžků při jejich produkci. Pokud mají například myší protilátky vyšší výtěžky při produkci v hybridomech, ale zároveň vyšší imunogenicitu při použití u líclí^ používají se chimérní lidské/myší monoklonální protilátky.Chimérní protilátky i způsoby jejich přípravy jsou již v oboru známé (Cabilly a kol., Proč Nati. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison a kol., Proč Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne a kol., Neture 321: 643-646 (1984); Cabilly a kol., European Patent Application 125023 (publikováno 14. listopadu 1984); Neuberger a kol., Nátuře 314:268270 (1985); Taniguchi a kol., European Patent Application 171496 (publikováno 19. února 1985); Morrison a kol., European Patent Application 173494 (publikováno 5. března 1986), Neuberger a kol., PTC Application WO 8601533 (publikováno 13. března 1986), Kudo a kol., European Patent Application 184187 (publikováno 11. června 1986); Morrison a kol., European Patent Application 173494 (publikováno 5. března 1986); Sahagan a kol., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson a kol., International Patent

Publication, WO 9702671 (publikováno 7. května 1987); Liu a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better a kol., Science 240: 1041-1043 (1988); a Harlow a Lané, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.

Anti-idiotypová (anti-Id) protilátka je protilátka, rozeznávající unikátní determinanty, obecně asociované s antigen-vazebným místem protilátky. Anti• ·

Id protilátka může být připravena imunizací živočicha stejného druhu a genetického typu (například myší kmen), jaký byl zdrojem protilátky, proti které je anti-Id protilátka připravována. Imunizovaný živočich rozeznává idiotypové determinanty imunizující protilátky a odpovídá na ně produkcí protilátek, namířených proti těmto ídiotypovým determinantám (anti-Id Ab). Viz. například U.S. Patent No. 4,699,880.

Anti-Id protilátky mohou být použity také jako „imunogen“ pro indukci imunitní odpovědi u ještě dalšího živočicha, který poté produkuje tzv. antianti-Id protilátky. Anti-anti-Id protilátky mohou být specifické vůči stejnému epitopu, jako původní mAb, která indukovala tvorbu anti-Id protilátek. S použitím protilátek proti ídiotypovým determinantám mAb lze identifikovat další klony, které exprimují protilátky identické specifity.

Protilátkou podle navrhovaného vynálezu může být intaktní protilátka jako například mAb, ale je to jen epitop-vazebné místo protilátky, které má ^požadovanou funkci. Proto mohou být namísto intaktní protilátky použity -proteolytické-fragmenty^_protiláTelrjakb”Falrhebd”F(aF')T”fřagmehty(

Navíc DNA, kódující variabilní oblast protilátky, může být vložena do genu pro jinou protilátku a tak mohou být produkovány chimérní protilátky (viz. například U.S. Patent 4,816,567), nebo do genu pro receptory T buněk, čímž vznikají klony T buněk se stejnou specifitou (viz. Eshhar Z. a kol., Br. J. Cancer Suppl., 10:27-29, 1990; Gross G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 86:10024-10028, 1989). Stejně tak mohou být připraveny a použity i protilátky s jediným řetězcem. Jednořetězcové protilátky mohou být složené jednořetězcové polypeptidy s antigen-vazebnými schopnostmi, obsahující pár aminokyselinových sekvencí, homologických nebo analogických s variabilními oblastmi lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu (spojení Vh-Vl nebo jediný řetězec Fy). Oba řetězce, Vh i V_L, mohou kopírovat sekvence přirozených monoklonálních protilátek, nebo jeden z řetězců nebo i oba mohou obsahovat CDR-FR konstrukt takového typu, jaký byl popsán U.S. Patentu 5,091,513. Jednotlivé polypeptidy, analogické variabilním oblastem lehkého a těžkého řetězce, jsou navzájem spojeny polypeptidovou spojkou. Přípravya takových protilátek, především v případě, kdy je DNA kódující polypeptidové struktury V_H a V_L řetězců známá, může probíhat v souladu se způsoby, popsanými například v US Patentech 4,946,778; 5,091,513 a 5,096,815.

• · ·

Termín „molekula, která obsahuje antigen-vazebné místo protilátky“ tedy zahrnuje nejen intaktní molekulu imunoglobulinu kteréhokoliv isotypu a produkovanou kteroukoliv živočišnou buněčnou linií nebo mikroorganismem, ale také jen reaktivní frakci zmíněné molekuly včetně (ale nikoliv výhradně) Fab fragmentu, Fab' fragmentu, F(ab')2 fragmentu, variabilní oblasti těžkého a/nebo lehkého řetězce zmíněné protilátky a chimérní nebo jednořetězcové protilátky obsahující zmíněnou reaktivní frakci, stejně jako i další typy molekul nebo buněk, do nichž byla zmíněná reaktivní frakce protilátky fyzicky vložena. Příkladem mohou být chimérní receptory T-buněk nebo T-buňky, nesoucí na svém povrchu zmíněný receptor, nebo molekuly, vyvinuté jako transportéry terapeutických jednotek, tedy tak, že část molekuly obsahuje zmíněnou reaktivní frakci.

Přestože byl vynález nyní úplně popsán, budou jeho jednotlivé aspekty snáze pochopitelné, budou-li vysvětleny na příkladech. Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci a v žádném případě nejsou limitující ve smyslu omezení rozsahu-navrhOvamého^vynálezír

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Dva lidské proteiny, IR1B1 a IR1B4, se váží na receptor pro 1FN.

Do vektoru BluesScript (BS-SK+, Stratagene) byl klonován cDNA fragment kódující celou IFNAR1-IC doménu, amplifikovaný pomocí PCR s použitím BamHI-sense primeru (5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC (SEQ ID NO;5)) a EcoRI-anti-sense primeru (5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC (SEQ ID NO:6)). BamHI-SalI fragment tohoto BS-IFNAR1-IC konstruktu byl vnesen do pGBTio vektoru (CloneTech) a fúzován ve fázi za Gal4 DNA-vazebnou doménu (pGBTi₀-IFNARl-IC) za účelem testování pomocí two-hybrid systému. Two-hybrid testovací metoda (Fields a Song, 1989) byla použita v modifikované podobě podle Durfee a kol. (1993) s použitím pACT plazmidové cDNA knihovny z lidských B-buněk, transformovaných virem Epstein Barrové (EBV) pro kotransformaci kvasinkového reportérového kmene Y153 spolu s pGBTio-IFNARl-IC. Kvasinkový kmen Y153 nese má reportérové geny pod kontrolou GAL1 upstream aktivační sekvence (UAS), které mohou být • · · ·

transkribovány pouze pokud je obnovena aktivita Gal4 transkripčního faktoru. K tomu dojde, pokud má fúzní protein, kódovaný pACT plazmidem, který byl vnesen do tohoto konkrétního kvasinkového klonu, afinitu k IFNAR1-IC doméně z pGBTio plazmidu. Jedním z reportérových genů je GAL1 His3, který umožňuje růst na médiu postrádajícím histidin; druhý reportérový gen je GALLacZ, který zajišťuje β-galaktosidázovou aktivitu. Navíc nesou pACT plazmidy gen Leu2, umožňující růst na médiu postrádajícím leucin a pGBTjo plazmidy nesou gen TRPÍ, který umožňuje růst na médiu bez tryptofanu. Kolonie byly selektovány na syntetickém médiu SC bez Trp, Leu a His v přítomnosti 25 mM 3-aminotriazolu (který umožňuje selekci na His prototrofii). Rostoucí kolonie byly dále testovány na β-galaktosidázovou aktivitu pomocí testu s X-gal filtrem (Breeden a Naysmith, 1985).

Bylo získáno 9 pozitivních klonů kvasinek a pACT plazmidy byly z těchto klonů získány transfekcí do E. coli HB101 buněk a selekcí leu+ transformantů. Pro každou kvasinkovou DNA byly izolovány dva E. coli HB101 klony. Xástečne sekvenování DNA pACT plazmidů z těchto klonů prokázalo, že patří do dvou skupin cDNA sekvencí, které byly popsány jako IRIBI a IR1B4. pACT plazmidy z IR1B1 a IR1B4 skupin byly podrobeny testům specificity kotransformací kvasinkového reportérového kmene SFY526 (Bartel a kol., 1993) s pAS plazmidy, nesoucími lamin, cdk2 a p53, nebo jiné kontrolní inzerty (CloneTech). Kolonie, které rostly na SC -trp, -leu médiu, byly testovány na expresi β-galaktosidázy. Ze specificky pozitivních pACT plazmidů byly inzerty vystřiženy Xhol, klonovány do BS KS (Stratagene) a sekvenovány z T7 a T3 promotorů s použitím DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit na přístroji 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems). Na obrázku 1 jsou vidět výsledky kotransfekce kvasinek kmene SFY526 plazmidem pA-TC nesoucím IR1B1 a různými pAS nebo pGBTio návnadami („bait“). Kvasinky byly pěstovány na selektivním SC médiu -trp, -leu na filtru v proužcích 1 až 9. Barvení činidlem X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl^-Dgalaktopyranosid) bylo pozitivní jen u proužků 2 a 4. Jak je vidět z obrázku 1, proužek 4 je kontrolní vzorek kvasinky nesoucí aktivní lacZ gen. V kvasinkách proužku 2 byly spojeny IR1B1 a IFNAR1-IC fúzní protein. IR1B1 samotný (proužek 9) ani jakákoliv jiná kombinace, kromě zmíněné IR1B1 a IFNAR1-IC, • · • · • · · 4 • •4 444 • · • 4 · 4 nevykazovaly β-galaktosidázovou aktivitu. Proto je možné říci, že IR1B1 protein je schopen specificky vázat IC doménu IFNAR1 řetězce IFN receptoru. Obrázek 2 podobně ukazuje výsledky kotransfekce kvasinek kmene SFY526 plazmidem pATC nesoucím IR1B4 a různými pAS nebo pGBTjo návnadami („bait“). Kvasinky byly pěstovány na selektivním SC médiu -trp, -leu na filtru v proužcích 1 až 8. Barvení činidlem X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-Dgalaktopyranosid) bylo pozitivní jen u proužků 3 a 7. Jak je vidět z popisu v rámečku pod obrázkem, proužek 7 je kontrolní vzorek kvasinky nesoucí aktivní lacZ gen. V kvasinkách proužku 3 byly spojeny IR1B4 a IFNAR1-IC fúzní protein. Stejně jako v předchozím případě se samotným IR1B1 ani IR1B4, ani jakákoliv jiná kombinace, kromě zmíněné IR1B4 a IFNAR1-IC, nevykazovaly β-galaktosidázovou aktivitu. Proto je možné říci, že i IR1B4 protein je schopen specificky vázat IC doménu IFNAR1 řetězce IFN receptoru.

Příklad 2: Sekvence IR1B1 proteinu vykazuje kalcium-vazebná „EF Hand“ _m,_sta.

Inzerty cDNA byl z plazmidů pACT-IRlBl vystřiženy restrikčním enzymem Xhol, nakloňovány do vektoru Bluescript BS-KS a sekvenovány z T7 a T3 promotorů s použitím DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit na přístroji 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems). Nejdelší plazmid měl sekvenci 830 nukleotidů (obr. 3), následovanou Gal4 aktivační doménou a spojovací sekvencí pACT plazmidu a byl zde nalezen ORF (otevřený čtecí rámec) o délce 191 aminokyselin (obr. 3). Byl proveden on-line průzkum proteinových databází s pomocí algoritmu BlastP (Altschul a kol., 1990) a Bioaccelerator alignment (Heinkoff a Heinkoff, 1992). Nejvyšší podobnost byla nalezena pro kalcitraktin (CATRHUMAN, accession Swiss Protein SW New P41208) a to 62,1% podobnost a 32,4% identita aminokyselin 52 až 173. Druhým nalezeným velmi podobným proteinem byl kalcineurin B (CALBNAEGR, Accession Swiss Protein P42322; CALBHUMAN, accession P06705) vykazující 59,8% podobnost a 32,5% identitu aminokyselin 50 až 171.

Na obrázku 4 je znázorněno porovnání sekvence IR1B1 se sekvencemi lidského kalcineurinu B (CALB) a kalciteaktinu (CATR). Kalcium vazebné helixsmyčka-helix „EF-hand domény jsou vyznačeny tučně a podtržené. IR1B1 má

14« ·' dvě EF-hand místa, ale první dvě EF-hand domény nejsou konzervativní. IR1B1 vykazuje homologii s oběma proteiny; s kalcineurínem B (na obr. 4 znázorněno vertikálními linkami) i s kalcitraktinem (na obr. 4 vyznačeno dvojtečkami). Ovšem IR1B1 je zcela zřejmě nový, odlišný lidský protein, který dosud nebyl popsán.

Příklad 3: IR1B1 je interferonem indukovaný genový produkt.

Buňky lidské myelomové linie U266S (suspenze asi 3 x 10⁶ buněk v 5 ml kultury) byly ošetřeny rekombinantním IFN-a8 (2 x 10⁸ IU/mg z bakterií) nebo rekombinantním IFN-β (3 x 10⁸ IU/mg z CHO buněk) v množství 750 IU/ml po dobu 2 nebo 18 hodin. Poté byly buňky sklizeny a extrahovány Tri reagencií (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio), což je produkt, obsahující guanidium thiokyanát a fenol. Extrahovaná RNA byla přesrážena methanolem,denaturována formaldehydem a analyzována na elektroforéze ve formaldehyd-agarózových gelech (10 pg RNA/dráhu) a přenesena na GeneScreen Plus (Dupont, New England Nuclear, Billerica, MA). Northern blot byl dále zpracován reakcí s 10⁶ cpm IR1B1 cDNA značené pomocí soupravy Rediprime kit (Ammersham, UK) za použití ³²P-dCTP a náhodných primerů.

Na obrázku 5 je vidět že IR1B1 cDNA hybridizovala s 1,1 kb fragmentem RNA. Množství IR1B1 mRNA se znatelně zvýšilo 2 hodiny po aplikaci IFN-β na kulturu U266S buněk. Ovšem 18 hodin po aplikaci IFN IR1B1 mRNA z buněk vymizela, z čehož vyplývá, že indukce IFN je rychlá a přechodná.

« Mnoho IFN indukovaných mRNA se v buňce akumuluje i více než 24 hodin po aplikaci IFN (Revel a Chebath, 1986).

* Bylo ověřeno, že se stejné množství RNA nachází ve všech dráhách. Jak je vidět ve spodní části obrázku 5, hybridizace U266S (bohaté na IFN receptory) RNA s 18S ribozomální cDNA sondou ukazuje stejné množství 18S rRNA v každé dráze (zobrazena je pouze ta část blotu, obsahující 18S rRNA). V dalším experimentu, kde bylo pro indukci použito 1200 U/ml IFN, byla IR1B1 mRNA pozorována 2 hodiny po indukci IFN-a8, ale nikoliv 30 minut po indukci (není zobrazeno).

β · • ·

Bylo zjištěno, že IR1B1 mRNA má stejnou velikost 1,1 kb v různých lidských buněčných liniích (U266S, Daudi a THP-1 buňky). Tato velikost je blízká velikosti mRNA lidského kalcitraktinu, ale liší se výrazně od velikosti mRNA lidského kalcineurinu B (2,5 kb), malá velikost mRNA je v dobré shodě s malou velikostí proteinu IR1B1 (20 kDa).

Příklad 4: IR1B4 protein váže IFNAR1 in vitro.

Byla testována vazba IR1B4 k IC-doméně IFNAR1. IR1B4 protein byl syntetizován i s krátkou proteinovou značkou („tag“, „flag“ sekvence) pomocí in vitro translace v lyzátech retikulocytů a takto připravený protein byl zreagován s rekombinantním IFNAR1 IC fúzním proteinem v E. coli. pACT IR1B4 DNA z příkladu 1, vystřižená Xhol a doplněná na tupé konce Klenowovým fragmentem byla klonována do PECE-flag exptesního vektoru (Ellis a kol., 1986), rozštěpeného EcoRI a doplněného na tupé konce. NotlBamHI—fragment—obsahující—ve—správném—čtecím—rámci—flagHRTB4—fúznf sekvenci byl znovu nakloňován do plazmidu Bluescript BS-SK, rozštěpeného Notl-BamHI, a to po směru transkripce od T3 promotoru. Fúzovaná sekvence byla ověřena sekvenací z T3 promotoru. S pomocí T3 polymerázy a 1 pg BamHI linearizované BS-flag-lR 1B4 DNA byla provedena in vitro transkripce (Promega kit). Translace in vitro byla provedena v lyzátu králičích retikulocytů (Promega kit) s [³⁵S]methioninem (Amersham) a 5 pg RNA transkriptů (1 hodina, 30 °C). Produkty byly před použitím ošetřeny RNázou. GST-IFNAR1-IC fúzní protein byl připraven klonováním BamHI-EcoRI inzertu BS-IFNAR1-IC (viz výše) do stejného místa pGEX2 (Pharmacia Biotech). GST a GST-IFNAR1-IC byly exprimovány v E. coli a vyčištěny vazbou na glutathion-agarózu (Sigma).

Anti-flag M2 agarózové kuličky pocházely od Kodak Scientific Imaging Systems. Monoklonální protilátky IFNaR3 proti α-složče IFN receptoru (IFNAR1) byly laskavě poskytnuty Dr. O. Colamonici (Colamonici a kol., 1990) a byly použity v ředění 1:100. Králičí protilátky proti C-terminálnímu peptidu IFNAR1-IC (Ab 631) byly připraveny a použity pro imunoprecipitaci IFNAR1 z Brij extraktů (0,75 ml) z 2 χ 10⁷ lidských myelomových U266S a U266R buněk s inhibitory proteáz (detailní popis viz výše) (Ambrovich a kol., • · ··

I · · « ι · · I ·· · ··«

1994) s tím rozdílem, že kuličky s navázaným proteinem G (Pharmacia) byly použity s mAb IFNaR3. SDS-PAGE a analýza na přístroji FUJIX BAS1000 Phosphor-Imager byly provedeny stejně, jako již bylo popsáno (Harroch a kol., 1994).

Nejprve bylo ověřeno, že je imunoprecipitací translačních produktů pomocí anti-flag protilátek získán proteinový produkt o velikosti asi 32 kDa (Obrázky 6A a 6B). Použití anti-flag protilátek je na obrázcích 6A a 6B znázorněno značkou + a znamená to, že radioaktivní translační produkt IRlB4-flag fúzní mRNA (in vitro transkribované z odpovídajícího DNA konstruktu) reagoval s anti-flag M2 protilátkou navázanou na agarózové kuličky (produkt Kodak Scientific Imaging Systems). Translatovaný protein, obsahující IR1B4 sekvenci fúzovanou s flag aminokyselinovou sekvencí, byl navázán na zmíněnou antiflag protilátku na povrchu agarózových kuliček, a po oddělení kuliček centrifugací byl protein eluován pufrem s obsahem SDS a nanesen na SDSPAGE. Zmíněná reakce slouží jako kontrola, že je očekávaný fúzní protein o'pr avdíTpr í to men.

Kuličky Glutathion-Sepharose (Sigma) s navázaným fúzním proteinem GST (glutathion S-transferáza) s IFNAR1-IC byly přidány k lyzátu retikulocytů, ve kterém probíhala translační reakce. Kuličky byly zcentrifugovány, promyty a navázané proteiny byly uvolněny 1% SDS a analyzovány na SDS polyakrylamidové gelové elektroforéze (PAGE). Bylo zjištěno, že se 32 kDa protein, značený ³⁵S-methioninem váže pouze ke GST-IFNAR1-IC, ale nikoliv ke GST samotnému (obr. 6A). To je důkazem, že se IR1B4 váže přímo na izolovaný IFNAR1-IC peptid.

V dalším experimentu byla ověřena interakce IR1B4 s IFNAR1 proteinem tak, jak je přítomen v membránách lidských buněk, detergentové extrakty lidských myelomových .buněk U266 byly smíchány s translačním produktem IR1B4 mRNA, značeným ³⁵S-methioninem, získaným translací v lyzátech retikulocytů. IFNAR1 protein byl imunoprecipitován pomocí monoklonální protilátky IFNaR3, specificky reagující s vnější doménou IFNAR1 (od Colamonici a kol., 1990). Analýza na SDS-PAGE prokázala přítomnost 32 kDa pruhu odpovídajícího IRlB4-flag fúznímu proteinu (obr. 6B) tam, kde buněčné extrakty pocházely z U266S buněk (bohatých na IFN receptory), ale nikoliv u extraktů z U266R buněk, které jsou mutantní IFN-a,P-rezistentní linií U266, οι · · · · · · i ««···* ·· ·· ·* která na svém povrchu postrádá IFN receptory (Abramovich a kol., 1994). Stejný pruh, odpovídající proteinu o velikosti 32 kDa byl pozorován po reakci U266S extraktu s Ab 631, která specificky reaguje s C-terminální doménou IFNAR1 a IFNAR1 protein byl precipitován pomocí anti-flag Ab, když byly Cos-7 buňky transfektovány flag-IRlB4 a lidskou IFNAR1 cDNA. Tyto výsledky prokázaly, že IR1B4 specificky váže intaktní IFNAR1 z lidských buněk.

Příklad 5: IR1B4 cDNA a proteinové sekvence.

Nukleotidová sekvence IR1B4 cDNA obsahuje otevřený čtecí rámec, kódující 361 aminokyselin dlouhý protein (obr. 7). Tato lidská cDNA kóduje 1,5 kb dlouhou konstitutivně exprimovanou poly-A+ mRNA v nejrůznějších lidských buňkách včetně U266 myelomových buněk. Pomocí počítačových programů BlastP (Altschul a kol., 1990) a Bioaccelerator Alignment (Heinkoff a Heinkoff, 1992) byly prohledány on-line proteinové databáze a bylo zjištěno, že IR1B4 je jedinečným členem rodiny protein-arginin methyltransferáz. Při porovnávání programem AL1GN bylo zjištěno, že krysí PRMT1 cDNA, popsaná Lin a kol. (1996, GenBank sequence I.D. 1390024; Accession U60882) je jedinou homologickou sekvencí (81,4 %). Na úrovni aminokyselinové sekvence (obr. 8) se IR1B4/PRMT od PRMT1 na N-konci výrazně liší; prvních 19 aminokyselin je zcela odlišných. N-terminální sekvenování IR1B4 by bylo nebylo poskytlo žádný náznak homologie IR1B4 s PRMT1. Byla zjištěna homologie i dalšího již popsaného lidského proteinu HCP-1 (Nikawa a kol., 1996; GenBank accession D66904) s IR1B4. Ovšem HCP-1 se liší v aminokyselinové sekvenci aminokyselin v polohách 147-175 (obr. 9). HCP-1 byl původně popsán na základě své schopnosti komplementovat mutaci irel5 u kvasinek a jeho enzymatická funkce nebyla dříve popsána (Nikawa a kol., 1996). Proto je IR1B4 považován za nový lidský protein.

vazbě na IFNAR1-IC

Příklad 6: IR1B4 protein vykazuje po methyltransferázovou aktivitu.

Methyltransferázová aktivita může být koimunoprecipitována z lidských buněčných extraktů spolu s IFNAR1 receptorem. Extrakty, získané pomocí činidla Brij z lidských U266S buněk reagovaly přes noc při teplotě 4 °C s a nebo bez anti-IFNARl Ab 631 (Abramovich a kol., 1994). Po dobu 1 hodiny byla poté směs inkubována s kuličkami potaženými proteinem A (40 μΐ 50% IPA 400 fast flow, Repligen). Kuličky byly poté promyty a inkubovány po dobu 30 min. při teplotě 30 °C v 0,1 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 μΜ (0,25 pCi) ¹⁴C-(methyl)-S-adenosyl methioninu (Ammersham) a 100 μg histonů (typ IIA z telecího thymu, Sigma). In vitro methylace histonů byla provedena v podmínkách popsaných Lin a kol. (1996). Radioaktivita histonového pruhu byla analyzována po SDS-PAGE (15% akrylamid) na přístroji Phosphor-imager. Histony značené ¹⁴C-methylem byly zjištěny ve vzorku, kde byly kuličky potaženy anti-IFNARl Ab, ale nikoliv v případě kontrolní reakce (obr. 10). Proto lze říci, že protein methýltransferázová aktivita je konstitutivně asociována s IFN receptorovým řetězcem zmíněných lidských buněk. Podobná enzymová aktivita byla prokázána po imunoprecipitaci IFN ARI pět minut po přidání IFN-β k U266S buňkám.

Příklad 7: Účast IR1B4/PRMT1 na působení IFN.

Chemickou cestou byl syntetizován anti-sense oligodeoxynukleotid fosforothionát (Stein a kol., 1989), komplementární k sekvenci nukleotidů v poloze 12-33 v blízkosti iniciačního kodonu IR1B4 cDNA (AS-1; anti-sense sekvence 5 -GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3SEQ ID NO: 12). Oligonukleotidy byly v den 0 přidány k U266S buňkám, rozpipetovaným v 96 jamkové mikrotitrační destičce (8000 buněk/jamku/0,2 ml RPMI 10% FCS), a to ve finální koncentraci 10 μΜ. V den 2 byly oligonukleotidy přidány ještě jednou a to ve finální koncentraci 5 μΜ. V den 0 byl přidán ještě IFN-β v koncentracích 64 nebo 125 IU/ml. Po 3 dnech kultivace bylo přidáno do každé jamky 20 μΐ Almar Blue, kolorimetrického indikátoru hustoty buněk, jehož

funkce je založena oxidačně redukční reakci (Biosource, Camarillo, CA) a buňky byly s barvivém inkubovány dalších 6-7 hodin. Intenzita barevné reakce byla měřena spektrofotometricky (microplate ELISA reader) s použitím testovacího filtru 530 nm a referenčního filtru 630 nm. Měření bylo provedeno opakovaně a v paralelách. Byla ověřena korelace růstové křivky s počtem živých buněk a optickou denzitou (OD). Methyltransferázová aktivita byla měřena následujícím způsobem. Buňky z odpovídajících jamek byly lyžovány několikanásobným zmražením a opětovným rozmražením v 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 (25 μΐ/jamku), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 40 pg/ml leupeptinu a aprotoninu, 20 pg/ml pepstatinu a ΙμΜ PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid). Reakce probíhala v 50 μΐ s 25 μΐ buněčného extraktu, 100 μΜ peptidů Rl (Najbauer a kol., 1993, získaný z Genosis, Cambridge, UK), 3 pCi [³H]methyl-S-adenosylmethioniu (Ammersham, 73 Ci/mmol) po dobu 30 min. při ‘teplotě 30 °C. Po elektroforéze v 16% SDS polyakrylamidovém gelu, fixaci v 50% methanolu a 10% kyselině octové a po opracování Amplify® (Ammersham) byla provedena autoradiografie (8 dnů). Měřením inkorporace triciem značených methylových skupin do Rl peptidového substrátu bylo zjištěno, že zmíněná AS-1 anti-sense DNA je schopna velmi silně snížit protein-arginin methyltransferázovou aktivitu v U266S buňkách (obr. 11). Výsledky tohoto pokusu byly použity pro další studium úlohy, kterou zmíněný enzym zastává při působení IFN. Působení interferonu jako inhibitoru růstu bylo vybráno, neboť v tomto případě je nejsnazší přímá kvantifikace v buňkách a také proto, že již byla popsána interakce krysího PRMT1 s genovým produktem ovlivňujícím růst (Lin a kol., 1996). Přidání anti-sense oligonukleotidů 1 (AS-1), který je komplementární k sekvenci poblíž iniciačního kodonu IR1B4/PRMT cDNA, snížilo inhibiční efekt IFN-β na růst lidských myelomových buněk U266S (obr. 12). To znamená, že v přítomnosti anti-sense AS-1 vykazovaly interferonem ošetřené buňky intenzivnější růst (což vylučuje jakýkoliv toxický efekt fosforothionátů). Růst v nepřítomnosti IFN nebyl nijak znatelně ovlivněn. Sense oligonukleotid S-3, odpovídající stejné cDNA oblasti, měl ve srovnání s AS-1 jen malý vliv (S-3, obr. 12). Sense S-3 oligonukleotid měl také jen malý efekt na úrovni inhibice enzymové akrtivity (obr. 11). Další anti-sense fosfotothioát oligonukleotid AS-2 (SEQ ID NO: 13) směrovaný proti střední části cDNA sekvence a komplementární k ·' · , · · · · · ft · » · * ft · · · · ftft · · '· · · • · · · ft ftftft · ftftft ftftft 'JA · · · · · ··

Z»·· ftftft ftftft ·· ·· ftft ** nukleotidům 572-592 sekvence SEQ ID NO:7 neměl téměř žádný účinek (obr.

12). Až pětinásobná redukce inhibičního účinku IFN-β na myelomové buňky, částečně deficientní v PRMT aktivitě, anti-sense 1 oligonukleotidem je důkazem že asociace IR1B4/PRMT enzymu s IC doménou IFNAR1 receptorů má funkční význam pro působení interferonú na buňky.

Zmíněné experimenty také prokázaly, že IR1B4 protein methyluje peptidové substráty enzymů třídy PRMT, jakým je například RI peptid Gly-Gly-PheGly-Gly-Arg- Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:11; Najbauer a kol., 1993), který byl použit v pokusu, jehož výsledky jsou zobrazeny na obr. 11. Methylace proteinů na argininových skupinách v sousedství glycinových zbytků (tj. jako u výše uvedeného peptidů) by mohla být takovým typem modifikace proteinů, jaká, stejně jako fosforylace, slouží k přenosu signálu do buňky. Skupina hnRNP proteinů je cílem působení PRMT enzymů a protože tyto enzymy ovlivňují úpravu RNA, sestřih, transport a stabilitu RNA (Liu a Dreyfuss, 1995), může jejich methylace sehrát roli v post-transkripění kontrole genové exprese. IRTTT47PRMT protein, vážícírétězec IFN receptorů, jak zdebylo prokázáno, může zprostředkovat změny v expresi genů v závislosti na IFN signálu. Prostřednictvím IFN receptorů mohou být methylovány další proteinové substráty včetně dalších složek komplexu IFN receptorů a transkripčních faktorů. Lin a kol. (1996) prokázal, že vazba krysího PRMTl na růstovým faktorem indukované proteiny aktivuje PRMTl a modifikuje jeho substrátovou specifitu, dost možná odstraněním některých inhibujících proteinů asociovaných s PRMTl v buněčné cytoplazmě. Lze očekávat podobnou aktivaci, způsobenou vazbou IR1B4 na IFNAR1 řetězec IFN receptorů.

ZÁVĚR

Byl popsán nový IR1B1 protein, který interaguje s intracytoplazmatickou doménou IFNAR1 řetězce IFN receptorů I typu. Exprese tohoto proteinu je indukována velmi rychle a zároveň jen na přechodnou dobu působením IFN na lidské buňky. Pro IR1B1 je typická přítomnost helix-smyčka-helix EF-hand míst, která jsou společným znakem kalcium-vazebných proteinů. Tok Ca²⁺ iontů je součástí mechanizmu působení interferonú, především prvotní buněčné odpovědi a změn v buněčné morfologii a v organizaci cytoskeletu (Tamm a

ΐ· · · ··· ··· kol., 1987). Ca²⁺ aktivované enzymy mohou v odpověď na IFN produkovat tzv. druhé posly („second messenger“), jako například diacylglycerol. Dále, kalmodulinu podobné proteiny regulují množství proteinkináz a aktivita zmíněných drah byla pozorována v buňkách ošetřených IFN (Tamm a kol., 1987). Je pravděpodobné, že je IFN receptor vazebný protein IR1B1 součástí podobných Ca²⁺ dependentních účinků IFN na buňku.

Pomocí metody two-hybrid systém byl nalezen a identifikován další protein, reagující s IFNAR1IC doménou, IR1B4. Ukázalo se, že je IR1B4 protein členem enzymové rodiny protein-arginin methyltransferáz (PRMT1; Lin a kol 1996). Je známo, že tento protein methyluje celou řadu RNA a DNA vazebných proteinů, především heterologní jaderné ribonukleoproteiny (hnRNP). hnRNP se účastní transportu mRNA z jádra do cytoplazmy, alternativního sestřihu premRNA a post-transkripční kontroly (Liu a Dreyfuss, 1995). IR1B1 a

IR1B4/PRMT1 proteiny, které se váží na IFNAR1-IC doménu, představují nový signální mechanizmus interferonů, který existuje vedle již známé Jak-Stat drahy, popsáné~Darne 1 l~a“ko 17/T994)3

Poté co byl vynález takto detailně popsán je jistě odborníkům zřejmé, že podobných výsledků lze dosáhnout v širokém rozmezí ekvivalentních parametrů, koncentrací a podmínek, aniž bychom se odchýlili od původní myšlenky a rozsahu vynálezu. . .. .

Přestože byl navrhovaný vynález popsán ve spojitosti s konkrétními způsoby provedení, je nutné podotknout, že vynález může být dále modifikován. Tato patentová přihláška by měla pokrýt všechny variace, způsoby použití a adaptace vynálezu, které obecně splňují principy navrhovaného vynálezu, a to včetně odchylek od navrhovaného znění vynálezu, které jsou v souladu s běžnou praxí v oboru, kterého se vynález týká a které se mohou týkat základních vlastností vynálezu tak jak zde byly popsány a tak jak jsou vymezeny dále v patentových nárocích.

Všechny citované odkazy, včetně článků v časopisech a abstraktů, publikovaných nebo podaných U.S. nebo jiných zahraničních patentových přihlášek, přijatých U.S. nebo zahraničních patentů a jakýchkoliv dalších referencí jsou zde uvedeny výhradně jako literární odkazy včetně veškerých dat, tabulek, obrázků a textů, uvedených v citovaných odkazech. Navíc i ·'* ·* ·' · · ♦ · · ·’ · « • * * · · · ^ι;· · · • · · · · ··· » ··· ··· *·)£ · · · · · · · celkový obsah odkazů, citovaných v odkazech, citovaných zde je součástí navrhovaného patentu výhradně ve smyslu literárního odkazu.

Odkazy na známé metodologické postupy, běžné metodologické postupy, známé způsoby nebo běžné způsoby v žádném případě neznamenají, že by byl některý z aspektů, vysvětlení nebo způsobů provedení navrhovaného vynálezu byl obsažen, navržen nebo alespoň předpokládán při součastném stavu techniky. Předchozí popis specifických způsobů provedení vynálezu natolik podrobně odhaluje obecnou povahu vynálezu, že může kdokoliv na základě aplikace běžných znalostí z oboru (včetně obsahu literárních odkazů, citovaných zde) snadno modifikovat a/nebo přizpůsobit jednotlivá konkrétní provedení vynálezu pro nejrůznější aplikace bez zbytečného experimentování a aniž by se odchýlil od základního konceptu navrhovaného vynálezu. Z toho důvodu jsou zmíněné adaptace a modifikace také považovány za předmět navrhovaného vynálezu. Je nutné zde uvést, že terminologie a frazeologie, použitá zde, byla zvolena pro účelu popisu vynálezu, nikoliv z důvodu jeho vymezení, a tudíž by měla být použitá terminologie a frazeologie interpretována odborníky ve světle popisu a vysvětlení, prezentovaných zde v kombinaci se znalostmi dosavadního stavu techniky.

9

LITERÁRNÍ ODKAZY:

Abramovich, C., Shulman L.M., Ratovitski E., Harroch S., Tony M., Eid P. and

Revel M. (1994) Differential tyrosine phosphorylation of the IFNAR chain of the type I ínterferon receptor and of an associated surface protein in response to IFN-α and IFN-β. EMBO J. 13: 5871-5877.

Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W. and Lipman D.J. (1990) Basic local alignment research tool. J. Mol, Biol,, 215: 403-410.

Barter P.L., Chien C.T., Sternglanz R. and Fields S. (1993) Elimination of falše positives thartarise in using the two-hybrid systém. BioTechniques, 14: 920-924.

Boldin M.P., Varfolomeev E.E., Pancéř Z., Mett I.L., Camonis J.H. and Wallach D. (1995) A novel protein that interacts with the death domain of Fas/APOlcontains a sequence motif related to the death domain. J, Biol. Chem,, 270: 7795-7798.

Breeden L. and Naysmith K., (1995) Regulation of the yeast HO gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 50: 643-650.

Colamonici O.R., D'Alessandro F., Diaz M.O., Gregory S.A., Necker L.M. and Nordan R. (1990) Characterization of three monoclonal antibodies thar recognize the Inteřferon-a2 receptor? Proč, Nati Acad Sci USA 87: 72307234.

Darnell J.E., Kerr I.M. and Stark G.R. (1994) Jak-Stat pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science 15: 1721-1723.

David M., Chen H.E., Goelz S., Larner A.C. and Neel F.G. (1995a) Differential regulation of the alpha/beta ínterferon stimulated Jak-Stat pathway by the SH2 domain-containing tyrosine phosphataseSHPTPl. Mol, Cell. Biol., 15: 7050-7058.

David M., Petricoin E. III, Benjamin C., Pine R., Weber M.J. and Larner A.C. (1995b) Requirement for MAP kinase (ERK2) activity in Interferon-aand Interferon-p-stimulated gene expression through Stát proteins. Science. 269: 1721-1723.

flfl flfl flfl ·· • flfl · · «· fl

David M., Petricoin Ε III and Larner A.C. (1996) Activation of protein kinase A inhibits interferon induction of the Jak/Stat pathway in U266 cells. J.Biol.Chem., 271:4585-4588.

Deiss L.P. and Kimchi A. (199) A genetic tool ušed to identify thioredoxin as a mediator of a growth onhibitory signál. Science, 252: 117-120.

Domanski P., White M., Kellum M., Rubinstein M., Hackett R., Pitha P. and Colaminici O.R. (1995) Cloning and expression of a long form of the beta subunit of the Interferon alpha beta receptor, that is required for signaling. J. Biol. Chem., 270: 21606-21611.

Durfee T., Becherer K., Chen P.L., Yeh S.H., Yang Y., Kalburn A.E., Lee W.H. and Elledge S. (1993) The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type I catalytic subunit. Genes & Devpt., 7: 555569.

Ellis L., Clauser E., Morgan D.O., Edery M., Roth R.A. and Rutter W.J. (1986) Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 compromises insulin-stimulated kinase activity and uptake of 2deoxyglucose. Cell, 45: 721-731.

Fields S. and Song O. (1989). A novel genetic systém to detect protein-protein interactions. Nátuře 340: 245-246.

Guerini D. et al (1989). DNA 8: 675-682.

Harroch S., Revel M. and Chebath J. (1994). Interleukin-6 signaling via four transcription factors binding palindromic enhancers of different genes. L Biol, Chem., 269: 26191-26195.

Henikoff S. and Henikoff J.G. (1992) Proč Nati, Acad. Sci. USA, 89: 1091510919.

Kagan R.M. and Clarke S. (1994) Widespread occurrence of three sequence motifs in diverse S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferases suggests a common structure for these enzymes. Arch. Biochem Biophys., 310: 417-427.

Lee V.D. and Huang B. (1993) Proč Nati. Acad. Sci. USA, 90:11039-11043.

Leung S., Qureshi S.A., Kerr I.M., Darnell J.E. and Stark G.R. (1995) Role of

Stat2 in the alpha Interferon signaling pathway. Mol, Cell. Biol. 15:13121317.

• ·«·· ι·« · t »·· » · ·· · • · · • ·« «

Lin W.J., Gary J.D., Yang M.C., ClarkeS. and Herschman H.R. (1996). The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with the protein-arginin methyltransferase. J. Biol, Chem,, 271: 15034-15044.

Liu Q. and Dreyfuss G. (1995). in vivo and in vitro arginin methylation of RNA binding proteins. Mol. Cell Biol., 15:2800-2808.

Najbauer J., Johnson B.A., Young A.L. and Asward D.W. (1993). Peptides with sequences similar to glycine arginine rich motifs in proteins interacting with RNA are efficiently recognized by methyltransferases modifying arginin in numerous proteins. J. Biol, Chem., 268: 10501-10509.

Nikawa J.I., Nakano H. and Ohi N. (1996) Structural and functional conservation of human yeast HCPI genes which can supress the groxth defect of the sacharomyces cerevisiae irel5 mutant. Gene, 171: 107-111.

Revel M. (1984). The interferon systém in man: nátuře of the interferon molecules and mode of action. In Becker I. (ed.), Antiviral Drugs avd Interferon. The Molecular Basis of their Activity. Martinus Nijhoff Publ., Boston, pp. 357-433.

Revel M. and Chebath J. (1986). Interferon Activated Genes. Trends Biochem Sci., 11: 166-170.

Stein C.A., Subasinghi C., Shinozuka K. and Cohen J.S. (1989). Physicochemical properties of phosphorothionate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221.

Tamm I., Lin S.L., Pfeffer L.M. and Sehgal P.B. (1987). Interferons alpha nad beta as cellular regulátory molecules. In Gresser, I. (ed.), Interferon 9, Acad. Press, London, pp. 14-74.

Uze G., Lutfalla G. a Gresser I (1990). Genetic transfer of a functional human Interferon α receptor into mouše cells: cloning and expression of its cDNA. Cell, 60: 225-234.

Wickstorm E. (1991). In: Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of cancer and AIDS, pp. 7-24, Wiley-Liss, New York.

Yang C.H., Shi W., Basu L., Murti A., Constantinescu S.N., Blatt L., Croze E.,

Mullersman J.E. and Pfeffer L.M. (1996). Direct association of Stat3 with the TFNAR-1 chain of the human type I Interferon receptor J, Biol.

Chem., 271:8057-8061.

t ··«

0« 0

4 00 • 0

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: REVEL, Michael

CHEBATH, Judith ABRAMOVICH, Carolina (ii) Název vynálezu: NOVÉ PROTEINY VÁŽÍCÍ IFN RECEPTOR I, DNA KÓDUJÍCÍ ZMÍNĚNÉ PROTEINY A ZPŮSOB MODULACE BUNĚČNÉ ODPOVĚDI NA INTERFERONY.

(iii) Počet sekvencí: 13 ' (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) ADRESA: BROWDY AND NEIMARK (B) Ulice: 419 Seventh Street, N.W., Suitě 300 (C) MĚSTO: Washington (D) Stát: D.C.

___(E) Země: USA __—(F) Zip: 20004 (v) Počítačově zpracovatelná forma:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verze #1.30 (vi) Data o součastné žádosti:

(A) Číslo žádosti: US (B) Datum podání: Klasifikace:

(vii) Data o předchozí žádosti:

(Á) Číslo žádosti: 08/667184 (B) Datum podání: 20, ledna 1996 (vii) Data o předchozí žádosti:

(A) ČÍSLO žádosti: US 60/035,636 (B) DATUM PODÁNÍ: 15. ledna 1997 (viii) ÚDAJE O PRÁVNÍM ZASTOUPENÍ:

f (A) Jméno: BROWDY, Rpger J>.

···* • ·· «

*· ·· « · · · • · · · • · » ··· • · * ·· ♦ ♦ ·· ·· · V · • · · · ··· ··· « 9 «· ·· (B) ČÍSLO registrace: 25,618 (C) Reference/číslo spisu: REVEL-14 PCT (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 202-628-5197 (B) Telefax: 202-737-3528 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 830 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) NÁZEV/KLÍČOVÉ SLOVO: CDS _(B) LOKALIZACE: 43 , , , 615_ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

CGTCTCGAGG CGAGTTGGCG GAGCTGTGCG CGCGGCGGGG CG ATG GGG GGC TCG 54

Met Gly Gly Ser

GGC

AGT

CGC

CTG

TCC

AAG

GAG

CTG

CTG

GCC

GAG

TAC

CAG

GAC

TTG

ACG

102

Gly 5

Ser

Arg

Leu

Ser

Lys 10

Glu

Leu

Leu

Ala

Glu 15

Tyr

Gin

Asp

Leu

Thr 20

TTC

CTG

AGG

AAG

CAG

GAG

ATC

CTC

CTA

GCC

CAC

AGG

CGG

TTT

TGT

GAG

150

Phe

Leu

Thr

Lys

Gin 25

Glu

lle

Leu

Leu

Ala 30

His

Arg

Arg

Phe

Cys 35

Glu

CTG

CTT

CCC

CAG

GAG

CAG

CGG

AGC

GTG

GAG

TCG

TCA

CTT

CGG

GCA

CAA

198

Leu

Leu

Pro

Gin 40

GlU

Gin

Arg

Eer

Val 45

Glu

Ser

Ser

Leu

Arg 50

Ala

Gin

GTG

CCC

TIC

GAG

CAG

ATT

CTC

AGC

CTT

CCA

GAG

CTC

AAG

GCC

AAC

CCC

246

Val

Pro

Phe 55

Glu

Gin

zle

Leu

Ser 60

Leu

Pro

Glu

Leu

Lye 65

Ala

Asn

Pro

TTC

AAG

GAG

CGA

ATC

TGC

AGG

GTC

TTC

TCC

ACA

TCC

CCA

GCC

AAA

GAC

294

Phe

Lye 70

Glu

Arg

lle

Cys

Arg 75

Val

Phe

Ser

Thr

Ser ' '80

. Pro

Ala

Lys

Aep

AGC

CTT

AGC

TTT

GAG

GAC

TTC

CTG

GAT

CTC

CTC

AGT

GTG

TTC

AGT

GAC

342

Ser 85

Leu

Ser

Phe

Glu

Asp 90

Phe

Leu. Asp

Leu

Leu 95

Ser

Val

Phe

Ser

Asp 100

ACA

GCC

ACG

CCA

GAC

ATC

AAG

TCC

CAT

TAT

GCC

TTC

CGC

ATC

TTT

GAC

390

Thr

Ala

Thr

Pro

Asp 105

Zle

Lye ·»'»

Ser

His

Tyr 110

Ala

Phe

Arg

zle

Phe .115

Asp

TTT

GAT

GAT

GAC

GGA

ACC

TTG

AAC

AGA

GAA

GAC

CTG

AGC

CGG

CTG

GTG

438

Phe

Asp

Aep

Asp 120

Gly

Thr

Leu

Asn

Arg 125

Glu

Aep

Leu

Ser

Arg 130

Leu

Val

AAC

TGC

CTC

ACG

GGA

GAG

GGC

GAG

GAC

ACA

CGG

CTT

AGT

GCG

TCT .GAG

486

Asn

Cys

Leu 135

Thr

Gly

Glu

Gly

Glu 140

Asp

Thr

Arg

Leu

Seř 145

Ala

Ser

Glu

ATG

AAG

CA3

CTC

ATC

GAC

TAC

ATC

CTG

GAA

GAG

TCT

GAC

ATT

GAC

AGG

534

Met

Lys

Gin

Leu

lle

Aep

Tyr

Zle

Leu

Glu

Glu

Ser

Asp

Zle

Aep

Arg

150 155 160 • ···· ·· · • ··· ·· ·· ·· ·· • ·· · · · · · »··· ···· • · ··· · ··· ··· • ·. · · · ·· ·· ·* ··

GAT

GGA

ACC

ATC

AAC

Ctc

tct

GAG

TTC

CAG

CAC

GTC

ATC

TCC CGT TCT

582

Asp

Gly

The

lle

Asn

Leu

ser

Glu

Phe

Gin

His

Val

lle

Ser Arg Ser

165

170

175

160

CCA

GAC

ΤΤΓ

GCC

AGC

TCC

TTT

AAG

ATT

GTC

CTG

TGACAGCAGC CCCAGCGTGT

635

Pro

Asp

Phs

Ala

Ser

Ser

Phe

Lys

ne

Val

Leu

185

190

GTCCTGGCAC CCTGTCCAAG AACCTTTCTA CTGCTGAGCT QTGGCCAAGG TCAAGCCTGT GTTGCCAGTG CGGGCCAAGC TGGCCCAGCC TGGAGCTGGC GCTGTGCAGC CTCACCCCGG GCAGGGGCGG ccctcgttgt cagggcctct cctcactgct gttgtcattg ctccgtttgt GGGCCTTCGT GGCCA (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO;2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 191 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

695

755

615

830

Met

Gly

Gly ser

Gly

Ser

Arg

Leu

Ser

Lys

Glu

Leu

Leu

Ala

Glu

Tyr

1

5

10

15

Gin

Asp

Leu Thr

Phe

Leu

Thr

Lys

Gin

Glu

lle

Leu

Leu

Ala

His

Arg

20

25

30

Arg

Phe

Cys Glu

Leu

Leu

Pro

Gin

Glu

Gin

Arg

Ser

val

Glu

Ser

Ser

:· 5

40

45

Leu

Arg

Ala Gin

Val

Pro

Phe

Glu

Gin

lle

Leu

Ser

Leu

Pro

Glu

Leu

50

SS

60

Lys

Ala

AOn Pro

Phe

Lys

Glu

Arg

He

Cys

Arg

Val

Phe

Ser

Thr

Ser

65

70

75

80

Pro

Ala

Lys Asp

Ser

Leu

Ser

phe

Glu

Asp

Phe

Leu

Asp

Leu

Leu

Ser

85

A SO

.· .-·

•95

Val

Phe

Ser Asp

Thr

Ala

Thr

Pro

Asp

lle

Lys

Ser

His

Tyr

Ala

Phe

100

105

··

11Ú

Arg

lle

Phe Asp

Phe

Asp

Asp

Asp

Gly

Thr

Leu

Asn

Arg

Glu

Asp

Leu

13.5

120

125

Ser

Arg

Leu Val

Asn

Cys

Leu,

Thr

Gly

Glu

Gly

Glu

Asp

Thr

Arg

Leu

130

135

'· ·

140

Ser

Ala

St:r Glu

Met

Lys

Gin

Leu

lle

Asp

Ty*

lle

Leu

Glu

Glu

Ser

145

150

155

160

Asp

lle

Aop Arg

Asp

Gly

Thr

lle

Asn

Leu

Ser

Glu

Phe

Gin

His

Val

165

170

175

lle

ser

Arg Ser

Pro

ASp

Phe

Ala

Ser

Ser

Phe

Lys

lle

Val

Leu

180

165

190

(2) INFORMACE 0 SEKVENCI SEQ ID N0:3: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 170 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

Met	Oly	Aen	Glu	Ala	Ser	Tyr	pro	Leu	Glu Met	Cys Ser His Phe	Asp
1				5					10	15
Ala	Asp	Glu	lle	Lys	Arg	Leu	Gly	Lys	Arg Phe	Lys Lys Leu Asp	Leu
			20					25		30
Αερ	Asn	Ser	Gly	Ser	Leu	Sex	Val	Glu	Glu Phe	Met Ser Leu Pro	Glu
		35		.			.4 0			45 · · ·/ ’· f	-
Leu	Gin	Gin	Asn	Pro	Leu	Val	Gin	Arg	Val lle	Asp lle Phe Asp	.Thr,
	no					55			• <:: ·'.<·: US	É0 ·’ί .ίΚΑ·: -	' ’
Aep	Oly	Asn	Gly	Glu	Val	Asp	Phe	Lys.	.Glu-.PheT-.Ile.Glu-Glý Val	Ser
65					70				.- ' ,:75' '	•r·.· , .. · í/':	80
				·.> - . »·					·ί?**>β.·ς>·	l‘
Gin	:?he	Šer	Val	Lys	Gly	Aep	Lye	Glu	fGln. Lys.	Leu-Arg,Phe Ala	Phe
				BS .		' ' ' '			'90 nnn', ?'	: itooryivr·: gs
Arg	lle	Tyr	Aep	Met	Asp	Lys	Aep	Gly	Tyr lle	Ser Asn Gly Glu	Leu
			100					105		110
Phe	Gin	Val	Leu	Lys	Met	Met	Val	Gly	Asn Asn	Leu Lye Asp Thr	Gin
		115					120			125
Leu	Gin	Gin	lle	Val	Asp	Lye	Thr	lle	lle Afin	Ala Asp Lys Αερ	Gly
	130					135				140
Asp	31y	Axg	lle	Ser	Phe	Glu	Glu	Phe	Cys Ala	Val Val Gly Gly	Leu
145					150				155		160
Aep	lle	His	Lys	Lys	Met	Val	Val	Asp	Val
				165					170

(2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:4: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 172 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO.4:

Met 1

Ala

Ser

Asn

Phe 5

£ys

Lys

Ala

Asn

Met 10

Ala

Ser

Ser

Ser

Gin 15 .

Arg

Lye

Arg

Met

Ser 20.

Pro

Lys

Pro

Glu

Leu 25

Thr

GlU

Glu

Gin

Lys 30

Gin

Glu

lle

Arg

Glu 35

Ala

Phe

Asp

Leu

Phe 40

Aep

Ala

Asp

Gly

Thr 45

Gly

Thr

lle

Asp

Val 50

Lys

Glu

Leu

Lye

Val 55

Ala

Met

Arg

Ala

Leu 60

Gly

Phe

Glu

Pro

Lys 65

Lye

Glu

Glu

lle

Lys 70

Lys

Met

lle

Ser

Glu 75

lle

Asp

Lys

Glu

Gly 80

Thr

Gly

Lys

Met

Asn 85

Phe

Gly

Asp

Phe

Leu 90

Thr

val

Met

Thr

Gin 95

Lys

Met

Ger

Glu

Lys 100

Asp

Thr

Lys

Glu

Glu 105

lle

Leu

Lys

Ala

Phe 110

Lys

Leu

Phe

hsp

Asp 115

Asp

Glu

Thr

Gly

Lyp 120

Ile

Ser

Phe

Lys

Asn 125

Leu

Lye Arg

val

Ala 130

Lys

Glu

Leu

Gly

Glu 135

Asn

Leu

Thr

Asp

Glu 140

Glu

Leu

Gin

Glu

Met 145

Tle

Asp

Glu

Ala

Asp 150

Arg

Asp

Gly

Asp

Gly 155

Glu

Val

Ser

Glu

Gin 160

Glu

Phe

Leu

Arg

Ile 165

Met

Lys

Lys

Thr

Ser 170

Leu

Tyr

(2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:5: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 31 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

CTGAGGATCC AAAGTCTTCT TGAGATGCAT A (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:6: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 25 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

TGACGAATTC CTATCATACA AAGTC (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:7: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 1308 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová ř

ή • · • · <* (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

GCCGCGAACT GCATC ATG GAG AAT TTT GTA GCC ACC TTG GCT AÁŤ GGG ÁTG Sl

Met Glu Asn Phe Val Ala Thr Leu Ala Asn Gly Met

195 200

AGC

CTC

CAG

CCG

CCT

CTTGAA‘GAA GTG

TCC

TGT

GGC

CAG GCG

GAA

AGC

99

Ser

Leu

Gin

Pro

Pro

Leu Glu Glu Val

Ser'Cye

Gly

Gin Ala

Glu

Ser

20S

210

215

agt

GAG

AAG

CCC

AAC

GCT GAG GAC ATG

ACA

TCC

AAA

GAT TAC

TAC

TTT

147

Ser

Glu

lys

Pro

Asn

Ala Glu A3p Met

Thr

ser

Lys

Aep Tyr

Tyr

Phe

220

225

230

23S

GAC

TCC

TAC

GCA

CAC

TTT GGC ATC CAC

GAG

GAG

ATG

CTG AAG

GAC

GAG

195

Asp

Ser

Tyr

Ala

His

Phe Gly lle His

Glu

GlU

Met

Leu Lye

ASp

Glu

240

245

250

GTG

CGC

J.CC

ctc

ACT

TAC CGC AAC TCC

ATG

TTT

CAT

AAC CGG

CAC

CTC

243

Val

Arg

Thr

Leu

Thr

Tyr Arg Asn Ser

Met

Phe

His

A6n Arg

His

Leu

255

.260

265

TTC

AAG

CíAC

AAG

GTG

GTG CTG GAC GTC

GGC

TCG

GGC

ACC GGC

ATC

CTC

291

Phe

Lys

Jvsp

Lys

val

Val Leu. Aep · Val ..Gly

Ser

Gly

Thr Gly

lle

Leu

;:70

275 -

280 ··'·

..TGC

ATG OTT

GCT

GCC

AAG ;GCC: GGG GCC -.CGC

AAG

;gtč

•ATC GGG

'-ÁTC

GAG· : ·

' '339

' Cyé

Met

’ Phe

Ala

Ala

Lys Ala Gly Ala

Arg

Lys

Val

lle Gly

lle

Glu

' i - ·,'

2B5

*71* £’»?

W £

:·> i Λ *

•295

«'·♦ ·'· · ··.·*··

, TGT

TCC

sAGT

..-ATC

iTCT <\GAT>TAT /GCG ':GTG

'.'AAG

ATCA3TC

vAAÁ'%CC

-AAC

'•'aag ·:Γ· ·'

• A:i'ě7

CyS

Ser

.Ser

lle

Ser

Asp Tyr.Ala.Val

Lys

.lle

Val

-Lys Ala

.Asn

„Lys,

yrr.'-AT·

300

305

310

·;· /·!

.. . ··..1

315' -

TTA GAC

CAC H:.e

GTG Val

GTG Val 320

ACC ATC ATC AAG GGG AAG GTG GAG GAG GTG GAG

435

Leu

Asp

Thr

lle

lle

Lys

Gly 325

Lys

Val

Glu Glu

Val 330

Glu

ctc

CCA

gtg

GAG

AAG

GTG

GAC

ATC

ATC

ATC

AGC

GAG

TGG

ATG

GGC

TAC

4 83

Leu

Pro

Val

Glu

Lys

Val

Asp

lle

lle

lle

Ser

Glu

Trp

Met

Gly

Tyr

335

340

345

TGC

CTC

TTC

TAC

GAG

TCC

ATG

CTC

AAC

ACC

GTG

CTC

TAT

GCC

CGG

GAC

531

Cye

Leu

Phe

Tyr

Glu

Ser

Met

Leu

Asn

Thr

Val

Leu

Tyr

Ala

Arg

Asp

350

355

360

AAG

TGG

CTG

GCG

CCC

GAT

GGC

CTC

ATC

TTC

CCA

GAC

CGG

GCC

ACG

CTG

579

LyS

Trp

Lť;u

Ala

Pro

Asp

Gly

Leu

lle

Phe

Pro

Asp

Arg

Ala

Thr

Leu

365

370

375

TAT

GTG

ACG

GCC

ATC

GAG

GAC

CGC

CAG

TAC

AAA

GAC TAC

AAG

ATC

CAC

627

Tyr

Val

Thr

Ala

lle

Glu

Asp

Arg

Gin

Tyr

Lys

Asp Tyr

Lys

lle

His

380

385

390

-'

395

TGG

TGG

GAG

AAC

GTG

TAT

GGC

TTC

GAC

ATG

TCT-

TGC ATC

AAA

GAT

GTG

675

Trp

Trp

G3u

Asn

Val

Tyr

Gly

Phe. Asp

Met

Ser

Cye lle

Lys

Asp

Val

400

405

:

410 .

GCC

ATT

AÍ.G

GAG

CCC

CTA

GTG

GAT

GTC

GTG

GAC

CCC AAA

CAG

CTG

GTC

723

Ala

lle

Lys

Glu

Pro

Leu

Val

Asp

Val

Val

Aep

Pro Lys'

Gin

Leu

Val

415

420

425

ACC

AAC

GCC

TGC

CTC

ATA

AAG

GAG

GTG

GAC

ATC

TAT ACC

GTC

AAG

GTG

771

Thr

Asn

Ala

Cys

Leu

lle

Lye

Glu

Val

Asp

lle

Tyr Thr

Val

Lys

Val

430

435

440

GAA

GAC

CTG

ACC

TTC

ÁCC

TCC

CCG

TTC

TGC

CTG

CAA GTG

AAG

CGG

AAT

819

Glu

Asp

Leu

Thr

Phe

Thr

Ser

Pro

Phe

Cys

Leu

Gin Val

Lys

Arg

Asn

445

450

455

GAC

TAC

GTG

CAC

GCC

CTG

GTG

GCC

TAC

TTC

AAC

ATC GAG

TTC

ACA

' CGČ

867

Asp

Tyr

Val

His

Ala

Leu

Val

Ala

Tyr

Phe

Asn

lle Glu

Phe

Thr

Arg

460

465

470

475

TGC

CAC

AÍG

AGG

ACC

GGC

TTC

TCC

ACC

AGC

CCC

GAG'TCC

CCG

TAC

ACG

915

Cye

His

Lys

Arg

Thr

Gly

Phe

Ser

Thr

Ser

Pro

Glu Ser

Pro

Tyr

Thr

480

485

490

• · · ·

CAC

TGG

A2G

CAG

ACG

GTG

TTC

TAC

ATG

GAG

GAC TAC

CTG

ACC

GTG

AAG

963

His

Trp

Ly s

Gin

Thr

Val

Phe

Tyr

Met

Glu

Asp Tyr

Leu

Thr

Val

Lys

495

500

505

ACG

GGC

GAG

GAG

ATC

TTC

GGC

ACC

ATC

GGC

ATG CGG

CCC

AAC

GCC

AAG

1011

Thr

Gly

Glu

Glu

Ile

Phe

Gly

Thr

Ile

Gly

Met Arg

Pro

Asn

Ala

Lys

510

515

520

AAC

AAC

CGG

GAC

CTG

GAC

TTC

ACC

ATC

GAC

CTG GAC

TTC

AAG

GGC

CAG

1059

Asn.

Aen

Axg

Asp

Leu

Aep

Phe

Thr

Ile

Aep

Leu 'Aep

Phe

Lys

Gly

Gin

525

53D

535

CTG

TGC

GAG

CTG

tcc

TGC

TCC

ACC

GAC

TAC

CGG ATG

CGC

TGAGGCCCGG

1108

Leu

Cys

Glu

Leu

Ser

Cys

Ser

.Thr Aep

Tyr

Árg Met

Arg

540

545

r;

550

CTCTCCCGCC „ CTGCACGAGC -.CCAGGGGCTG AGCGTTCCTA' GGCGGTTTCG GGGCTCCČCC' . , >.·;···; ··.!:' i'.\' λ·λ.< 'l·'·' -------- ·^;·-· · ' '

TTCCTCTCCC TCCCTCCCGC ÁGÁÁGGGGGT TTTAGGGGCC TGGGCTGGGG GGATGGGGAG

JSGCACATTGG

TAAATCCTCň .GACTGTGTTT -TTCATAAATT, r » ,· «*. r'. - .. .·£>* 2/Λ )

CCTGGGGAAA ^y ' £<ť atgtttttatíatggttgcat -TtáátgČčáa' \ -i

1Ϊ68

1228

9 8

08 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:8: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 361 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Met 1

Glu

Α3Π

Phe

Val 5

Ala

Thr

Leu

Ala

Λβπ 10

Gly

Met

Ser

Leu

Gin 15

Pro

Pro

Leu

Glu

Glu 20

Val

Ser

Cye

Gly

Gin 25

Ala

Glu

Ser

Ser

Glu 30

Lye

Pro

Abií

Ala

G lu 35

Aep

Met

Thr

Ser

Lye 40

Aep

Tyr

Tyr

Phe

Asp' 45

Ser

Tyr

Ala

Hle

Phe 50

Gly

Ile

Hie

Glu

Glu 55

Mef-

Leu

Lys

Asp .Glu 60

Val

Arg

•Thr

Leu

Thr 65

Tyr

Aeg

Aan

Ser

Met 70

Phe

Hie

Asn

Arg

Hle 75

Leu·

Phe

Lye

Asp

-Lys 80

Val

val

Lsu

Asp

Val 85

Gly

•i ’’ Ser

Gly

Thr

Gly 90

ile

Leu

Cye

Met

Phe 95

Ala

Ala

Lye

Ala

Gly 100

Ala

Arg

Ly8

Val

Ile 105

Gly

Ile

Glu

Cye

Ser 110

Ser

Ile

Ser

Aep

Tyr 115

Ala

val

Lye

Ile

Val 120

Lys

Ala

ASn

Lys

Leu 125

Asp

His

Val

Val

Thr 130

ile

Ile

Lys

Gly

Lys 135

Val

Glu

Glu

Val

GlU 140

Leu

Pro

Val

Glu

Lys 145

Val

Asp

Ile

Ile

Ile 150

Ser

Glu

Trp

Met

Gly Tyr 155

Cys

Leu

Phe

Tyr 160

Glu

Ser

Met

Leu

Asn 165

Thr

Val

Leu

Tyr

Ala 170

Arg

Aep

Lys

Trp

Leu 175

Ala

Pro

Αβρ

Gly

Leu 180

Ile

Phe

Pro

Aep

Arg 185

Ala

Thr

Leu

Tyr

Val 190

Thr

Ala

Ile

Glu

Abp 195

Arg

Gin

Tyr

Lys

Aep 200

Tyr

Lye

Ile

His

Trp 205

Trp

Glu

Asn

• · • · · ·

Val

Tyr 210

Gly

Phe

Asp

Met

Ser 215

Cys

lle

Lys

Asp Val 220

Ala

lle

Lys

Glu

Pro 225

LeU

Val

Asp

Val

Val 230

Aap

Pro

Lys

Gin

Leu Val 235

Thr

Asn

Ala

Cys 240

Leu

lle

I.ye

Glu

Val 245

Asp

lle

Tyr

Thr

Val 250

Lys Val

Glu

Asp

Leu 255

Thr

Phe

Thr

í er

Pro

Phe

Cys

Leu

Gin

Val

Lys

Arg Asn

Asp

Tyr

Val

His

t

, :.

260.

· ·

1

,265..

• ! -

”270

• · ;e

Ala

Leu

Val S75

Ala’

Tyr

Phe

Asn .· ,,«.

lle .280,

•i<· J. Glu

Phe

Thr Arg / 5.-r»n c*—'

Cys ).-285

*·«·< ' Hifl ? T 7. Γ ?

Lys * &».

Arg A. d

Thr	Gly 290	Phe	Ser	Thr	Ser	Pro 295	Glu
Thr 305	Val	Phe	Tyr	Met	Glu 310	Asp	Tyr
He	Phe	Gly	Thr	lle 325	Gly	Met	Arg
Leu	Asp	Phe	Thr 340	lle	Asp	Leu	Asp
Ser	Cys	Ser 355	Thr	Asp	Tyr	Arg	Met 360

Ser	Pro	Tyr	Thr 300	His	Trp	Lys	Gin
Leu	Thr	Val 315	Lys	Thr	Gly	Glu	Glu 320
Pro	Asn 330	Ala	Lys	Asn	Asn	Arg 335	Asp
Phe 345	Lys	Gly	Gin	Leu	Cys 350	Glu	Leu

Axg (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:9: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 353 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

xi) POPIS SEKVENCE: Met Ala Ala Ala Glu Ala	SEQ ID NO:9:
Ala	Asn Cys lle 10	Met	Glu Val Ser	Cys 15	Gly
1	5
Gin Ala Glu Ser 20	.Ser Glu	Lys	Pro Asn Ala 25	Glu	Aep Met Thr 30	Ser	Lys
Aap T/r Tyr phe 35	Asp Ser	Tyr	Ala His Phe 40	Gly	lle His Glu 45	G3.U	Met
Leu Lys Asp Glu 53	Val Arg	Thr 55	Leu Thr Tyr	Arg	Asn Ser Met 60	Phe	His
Asn Arg Hie Leu 65	Phe Lys 70	Asp	Lys Val Val	Leu 75	Asp Val Gly	Ser	Gly 80
Thr GLy lle Leu	Cys Met 85	Phe	Ala Ala Lys 90	Ala	Gly Ala Arg	Lys 95	Val
lle GLy lle Glu 100	Cys ser	Ser	lle Ser Asp 105	Tyr	Ala Val Lye 110	lle	Val
Lys Ala Asn Lye 115	Leu Asp	His	Val Val Thr 120	lle	lle Lys Gly 125	Lys	Val
Glu Glu Val Glu 110	Leu Pro	Val 135	Glu Lys Val	Asp	lle lle lle 140	Ser	Glu
Trp Met Gly Tyr 145	Cys Leu 150	Phe	Tyr Glu Ser	Met 155	Leu Asň Thr	Val	Leu 160
His A'la Arg Asp	Lye Trp 165	Leu	Ala Pro Asp 170	čiy	Leu lle Phe	Pro 175	Asp r .Í-V<
·· : ? ϊ'Λι	·· .· .C «* · 1 t. í »··.·;· ·· *	<·. P7.í	·.·.: Ch·’» n.·-'	·· via σ·'<7 a··:>·. m-	2'j-'
Arg Ala Thr Leu Tyr Val 1Θ0	Thr r » . ··	Ala lle Glu 185 '·' ·'·> Asn Val'Tyr 200	Asp Arg Gin Tyr . . 19.0 >· .·;··, !·..< ,	LyB Asp
Tyr Lys llě His 195	Trp'Trp	Glu	' Gly	Phé Ásp Met 205 .	Ser	;Cys'

lle

Lyť: 21C

Asp

Val

Ala

lle

LyS 215

Glu

Pro

Leu

Val

Asp Val 220

Val

Asp

Pro

Lys 225

Gin

Leu

Val

Thr

Aon 230

Ala

Cys

Leu

Xle

Lye 23Ξ

Glu Val

Asp

lle

Tyr 240

Thr

Val

Lys

Val

Glu 245

Asp

Leu

Thr

Phe

Thr 250

Ser

Pro Phe

Cys

Leu 255

Gin

Val

Lysí

Arg

Asn 260

Asp

Tyr

Val

His

Ala 265

Leu

Val

Ala Tyr

Phe 270

Asn

lle

Glu

Ph«»

Thr 275

Arg

Cys

Hle

Lys

Arg 280

Thr

Gly

Phe

Ser Thr 285

Ser

Pro

Glu

ser

Pro 230

Tyr

Thr

His

Trp

Lys 235

Gin

Thr

Val

Phe

Tyr Met 300

Glu

Asp

TyT

Leu 305

Thr

Val

Lys

Thr

Gly 310

Glu

Glu

lle

Phe

Gly 315

Thr Xle

Gly

•Met

Arg 320

Pro

ab.i

Ala

Lys

Asn 325

Asn

Arg. Asp

Leu

Asp 330

Phe

Thr-lle

Asp

Leu- 335

Asp

Phe

Lys

Gly

Gin 340

Leu

CyS

Glu

Leu

Ser 345

Cys

Šer

Thr Aep

Tyr 350

Arg

Met

Arg (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:10: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 360 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

Met 1

Glu

Asn

Phe

Val 5

Ala

Thr

Leu

Ala

Asn 10

Gly

Met Ser

Leu

Gin 15

Pro

Pro

Leu

Glu

Glu 20

Val

Ser

Cys

Gly

Gin 25

Ala·

Glu

Ser Ser

Glu 30

lys

Pro

Asn

Al.a

Glu 35

Asp

Met

Thr

Ser

Lys 40

Asp

Tyr

Tyr

Phe Aep 45

Ser

Tyr

Ala

Hie

Phe 50

Gly

lle

His

Glu

Glu 55

Met

Leu

Lys

Asp

Glu Val 60 -

Arg

Thr

Leu

Thr 65

Tyr

Arg

Asn

Ser

Met 70

Phe

His

Asn

Arg

His 75 ,

Leu Phe

LyB

Asp

Lyš 80

Val

Val

Leu

Asp

val 85

Gly

Ser

Gly Thr

Gly 90 i' »

lle • ·*·5

< Leu -'Cys t - C ·ΐ* <

Met U ;·:;

Phe 95

Ala

Ala

Lys

Ala

Gly 100

Ala

Arg

Lys

Val

Xle 105

Gly

xle >í

Val Cys

Ser 110

Ber νυ<?·;ι ř' ·

lle .? <

Ser

Asp

Tyr 115

Ala

Val

Lys

lle

Val 120

Lys

Ala vlpn

rAsn, ILysí/Leu^Ašp λλ ; í>ť.rtCL3.25*»í,- '* ?·

His .

Val

Val

Thr 130

lle

lle

Lys

Gly

Lys 135

Val

Glu

Glu

Val

Glu Leu 140

Pro

Val

Glu

Lys 145

Vel

Ala

Ber

Ser

Ser 150

Ala

Ser

Gly

Trp

Ala XS5

Thr Ala

Ser

Ser

Thr 160

Ser

Pro

Cys

Ber

Thr

Pro

Cys

Ser

Met

Pro

Gly

Thr Ser

Val

Ala

pro

165 170 175

Asp Gly

Leu

lle 180

Phe

Pro Asp

Arg

Ala 185

Thr

Leu

Tyr Val

Thr 190

Ala

lle

Glu Aep

Arg 195

Gin

Tyr

Lys Asp

Tyr 200

Lys

lle

His

Trp

Trp 205

Glu

Asn

val

Tyr

Gly 210

Phe

Αερ

Met

Ser

Cys 215

Zle

Lys

Asp

Val

Ala 220

lle

Lys

Glu

Pro

Leu 225

Val

Aap

Val

Val

Asp 230

Pro

Lyp

Gin'

Leu

Val 235

Thr

Asn

Ala

Čys

Leu 240

xie.

Lya

Glu

Val

Asp 245

lle.

Tyr.

Thr.

Val·

Lys· 250

Val7

•Glu'

Asp

Leu'

Thr' 255

Phe'

Thr

Be c

Pro

Phe 260

Cys

Leu

.Gin

Val

Lys 265

Arg

Asn

Asp

Tyr

Val 270

His

Ala

Leu

Val

Ala 275

Tyr

Phe

*7 1 Asn

lle

Glu 280

Phe

Thr

Arg

Cys

His 285

Lys

Arg

Thr

Gly

Phs 29 D

Ser

Thr

Ser

PřO

Glu 295

Ser

Pro

Tyr

Thr

His 300

Trp

Lys

Gin

Thr

val 305

Phs

Tyr

Met

Glu

Asp 310

Tyr

Leu

Thr

val

Lya 315

Thr’

Gly

Glu

Glu

lle 320

Phe

Gly

Thr

lle

Gly 325

Met

Arg

Pro

Asn

Ala 330

Lys

Asn

Ásn

Arg

Asp 335

Leu

Αερ

Phií

Thr

Xle 34 0

Asp

Leu

Asp

Phe

Lys 345

Gly

Gin

Leu

Cys

Glu 350

Leu

Ser

Cys

Se:r

Thr 355

Asp

Tyr

Arg

Met

Arg 360

(2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO; 11: (i) Charakteristiky sekvence;

(A) DÉLKA; 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly 1 5 10 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:12: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární ·· ·· >·· (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

GGCTACAAAA TTCTGCATGA TG (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 13: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

TGGCCGTCAC ATACAGCGTG G

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY •4 44 4· 44 • · · 4 4 · · 4

   4 44 » 4 44 4 • · ···· ··· «44

   4 4 4 4 · ·· ·· 4 4 4 4

   IVWl-TI

   1. Rekombinantní molekula DNA vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci kódující IFNAR1 receptor-vazebný protein, který může být indukován IFN-α nebo IFN-β a který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:8.
2. 2. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále obsahuje promotor, operativně spojený se zmíněnou sekvencí kódující IFNAR1 receptor-vazebný protein v „sense“ orientaci tak, že po vnesení rekombinantní molekuly do vhodného hostitele zmíněný promotor zajistí expresi zmíněné sekvence.
3. 3. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 2 vyznačující se tím, že zmíněný promotor je v lidských buňkách jako silným konstitutivním promotorem.
4. 4. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 1 vyznačující se tím, ž e zmíněná sekvence je nukleotidová sekvence SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:7.
5. 5. Rekombinantní DNA nebo RNA molekula vyznačující se tím, ž e obsahuje DNA molekulu obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO.T nebo SEQ ID NO:7 v orientaci „sense“ nebo „anti-sense“, nebo fragment některé ze zmíněných molekul schopný hybridizovat s mRNA kódující interferonem indukovaný IFNAR1 receptor-vazebný protein a tak zabraňující jeho expresi; nebo tím, že obsahuje RNA molekulu se sekvencí odpovídající zmíněné DNA molekule.

   6. Rekombinantní DNA nebo RNA molekula podle nároku 5 vyznačujíc í _ř s e tím, ž e obsahuje RNA molekulu. 7. Rekombinantní DNA nebo RNA molekula podle nároku 5 vyznačujíc í s e t í m , ž e zmíněná sekvence je v orientaci „sense“. 8. Rekombinantní DNA nebo RNA molekula podle nároku 5 vyznačujíc í s e tím, ž e zmíněná sekvence je v orientaci „ anti- sense“. 9. Rekombinantní DNA nebo RNA molekula podle nároku 8 vyznačujíc í s e tím, ž e obsahuje rekombinantní DNA molekulu

   která dále obsahuje promotor, operativně spojený se zmíněnou sekvencí v orientaci „anti-sense“ tak, že zmíněný promotor zajistí expresi „anti-sense“ RNA, komplementární k celé nebo k části RNA kódující interferonem indukovaný IFNAR1 receptor-vazebný protein.
6. 10. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 9 vyznačující se tím, že zmíněná sekvence je nukleotidová sekvence je částí 5'- konce sekvence SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:7.
7. 11. Rekombinantní molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 2, 9 a 10 vyznačující se tím, že zmíněný promotor je inducibilní promotor jehož induktorem je interferon.
8. 12. Rekombinantní molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a 7 až lOvyznačující se tím, že je expresním vektorem.
9. 13. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 12 a že umožňuje expresi „anti-sense“ RNA komplementární k „sense“ RNA kódující IFN-indukovaný IFNAR1 receptorvazebný protein.
10. 14. Způsob prodloužení přežívání tkáňového štěpu vyzn ač u j í c í se tím, že zahrnuje následující kroky:

    - vnesení expresního vektoru s obsahem rekombinantní DNA molekuly podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10 do buněk tkáně nebo orgánu, určeného pro transplantaci pacientu, jehož stav takovou transplantaci vyžaduje a

    - transplantace zmíněné tkáně nebo orgánu pacientovi.
11. 15. Způsob zvýšení odpovědi na exogenní interferonovou terapii při léčbě rakoviny vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    - podání farmaceutického přípravku s obsahem expresního vektoru, nesoucího rekombinantní DNA molekulu podle nároku 3 nebo 4, a farmaceuticky přijatelného vehikula přímo do nádorové tkáně a

    - následně započetí exogenní interferonové terapie.
12. 16. IFNAR1 vazebný protein vyznačující se tím, že má sekvenci SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:8.
13. 17. Molekula vyznačující se tím, že obsahuje antigenvazebnou část protilátky, specifické proti IFN AR 1 vazebnému proteinu podle nároku 16.

    * , -, .

    • · ·· · •'-i. · · ' • · · · · · • · · · · ···

    ·.··' «· · · · ···· ···· ·· ··
14. 18. Molekula podle nároku 17 vyznačující se tím, že je monoklonální protilátkou.
15. 19. Způsob přípravy IFNAR1 vazebného proteinu vyznačující se tím, že zahrnuje vnesení DNA podle nároku 1 do odpovídajícího expresního hostitele tak, aby bylo možné při kultivaci zmíněného hostitele dosáhnout exprese zmíněného proteinu, a dále kultivaci zmíněného hostitele tak, aby bylo dosaženo exprese zmíněného proteinu.