ES2272069T3 - Metodos y productos para inducir inmunidad en mucosas. - Google Patents
Metodos y productos para inducir inmunidad en mucosas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2272069T3 ES2272069T3 ES99925754T ES99925754T ES2272069T3 ES 2272069 T3 ES2272069 T3 ES 2272069T3 ES 99925754 T ES99925754 T ES 99925754T ES 99925754 T ES99925754 T ES 99925754T ES 2272069 T3 ES2272069 T3 ES 2272069T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- antigen
- oligonucleotide
- administered
- use according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55544—Bacterial toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/5555—Muramyl dipeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Uso de un oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye al me- nos la siguiente fórmula: 5'' X1X2CGX3X43'' en donde C no está metilada y X1, X2, X3 y X4 son nucleótidos, para la preparación de una composición para administrar a una superficie mucosa de un individuo que tam- bién está expuesto a un antígeno, para inducir una respuesta inmune mucosa frente a dicho antígeno en dicho individuo.
Description
Métodos y productos para inducir inmunidad en
mucosas.
La presente invención se refiere a productos y a
composiciones para uso en la inducción de la inmunidad mucosa. En
particular, la invención se refiere al uso de oligonucleótidos
inmunoestimuladores que contienen un motivo CpG aislado o en
combinación con otros aditivos de la mucosa para inducir la
inmunidad mucosa.
Se han identificado dos componentes diferentes
del sistema inmune: (i) el sistémico, que comprende la médula ósea,
el bazo y los nódulos linfáticos y (ii) el mucoso, que comprende el
tejido linfoide asociado con las superficies mucosas y las glándulas
secretoras externas (McGhee y col., 1992). Las superficies mucosas
se asocian con los conductos gastrointestinal (GI), genitourinario
(GU) y respiratorio. Cada componente está asociado con respuestas
humorales (anticuerpos) y respuestas mediadas por células
(linfocitos T citotóxicos), sin embargo, existen diferencias en la
naturaleza de las respuestas inmunes inducidas en cada componente.
Los anticuerpos asociados con el componente sistémico, son
predominantemente del isotipo IgG, que actúa neutralizando agentes
patógenos en el sistema circulatorio. Por el contrario, los
anticuerpos en las mucosas, son principalmente IgA secretora
(S-IgA) que actúa para evitar la entrada del
patógeno en el cuerpo a través de la superficie mucosa (Lamm y col.,
1992). La inmunidad sistémica no puede evitar la entrada de
organismos patógenos en las superficies mucosas.
Una inmunización sistémica eficaz (es decir, la
entrega del antígeno al componente sistémico) inducirá una inmunidad
sistémica, pero esto generalmente no produce respuestas inmunes
mucosas. Por el contrario, el antígeno entregado a las superficies
mucosas, desencadena las respuestas mucosas (en sitios cercanos y a
veces distantes) y las respuestas sistémicas (Haneberg y col., 1994,
Gallichan y Rosenthal, 1995).
La mayoría de las vacunas desarrolladas hasta la
fecha, se administran parenteralmente, por ejemplo, por inyección
intramuscular (IM) o intradérmica (ID), y de este modo inducen
principalmente inmunidad sistémica. Sin embargo, el área de la
superficie mucosa combinada es 200 veces mayor que el área de la
piel y es el sitio principal para la transmisión de numerosas
enfermedades infecciosas. Por ello, las estrategias convencionales
de vacunación permiten que el patógeno entre en el cuerpo y sólo lo
combaten cuando está en circulación. Las tasas de infección y de
morbilidad se podrían reducir si se pudiera inducir una inmunidad
mucosa eficaz. Además, existen evidencias de que vacunas de la
mucosa pueden tener receptores con un intervalo de edad más amplio.
Finalmente, las vacunas de la mucosa se administran frecuentemente
por medios no invasivos (p. ej., gotas nasales, vaporizador nasal,
nebulizador inhalador) de modo que son más fáciles de administrar y
menos costosas, tienen menos necesidad de un personal especializado
y no hay riesgo de lesión por el pinchazo con la aguja o de
contaminación cruzada (para una revisión, véase Mestecky y col.,
1992, Staats y col., 1994, O'Hagan 1994).
Tal y como se ha mencionado anteriormente, la
característica distintiva de la inmunidad mucosa es la producción
local de anticuerpos S-IgA. Estos constituyen
>80% de todos los anticuerpos en los tejidos asociados con
mucosas y se inducen, se transportan y se regulan por mecanismos muy
distintos a los de la respuesta sistémica. La IgA tiene una
importancia primordial para la defensa del hospedador, debido a que
actúa no sólo para la defensa contra agentes patógenos estrictamente
de la mucosa, sino también contra muchos microorganismos que
colonizan inicialmente las superficies de la mucosa pero que
posteriormente producen una enfermedad sistémica. Parece que existen
tres sitios para la defensa de la mucosa mediada con IgA: (i) el
lumen, en donde S-IgA puede neutralizar los virus,
las toxinas bacterianas y las enzimas y actúa como una barrera
mucosa para evitar la fijación vírica, la adherencia microbiana y la
adsorción del antígeno; (ii) las células epiteliales en donde la IgA
dimérica se puede unir al antígeno intracelular; (iii) en la lámina
propia en donde la IgA dimérica puede formar un complejo con el
antígeno y el complejo inmune formado de este modo, se transporta
hasta el lumen (Lamm y col., 1992).
Muchas vacunas en desarrollo están compuestas
por antígenos sintéticos o recombinantes (péptidos o polipéptidos).
Estos se consideran más seguros que los agentes patógenos completos
tradicionales, atenuados o inactivados, sin embargo, frecuentemente
son poco inmunógenos y requieren aditivos para mejorar la inmunidad
específica. Para la administración sistémica se pueden añadir
precipitados de aluminio (alum) a los antígenos, para aumentar las
respuestas inmunes. El alum es generalmente el único aditivo
admitido para el uso en seres humanos en la mayoría de los países,
incluyendo los EE.UU., sin embargo, no es adecuado para la entrega a
superficies mucosas. Por ello, la mayoría de las vacunas de la
mucosa empleadas en la actualidad, contienen organismos vivos
atenuados y se ha obtenido poco éxito en la administración en la
mucosa de vacunas de subunidades.
La toxina colérica (CT) es el aditivo de la
mucosa que se emplea más generalmente en modelos animales. La CT es
la enterotoxina principal producida por el Vibrio cholerae.
Es una proteína polimérica de 84 kilodalton que consta de dos
subunidades, una subunidad A monómera y una subunidad B pentámera
con forma de anillo. La subunidad B se une a gangliósidos GM1 en la
superficie de células eucariotas y permite la inserción de la
subunidad A en el citosol, en donde ribosila con ADP la proteína
reguladora de la unión de GTP asociada con la adenilato ciclasa
(Spangler,
1992).
1992).
La CT mejora la presentación de antígenos en
macrófagos, células epiteliales y linfocitos B, favorece la
diferenciación y el cambio de isótopo en los linfocitos B y tiene
efectos inhibidores y estimuladores complejos sobre la proliferación
de linfocitos T y la producción de linfoquinas (Snider, 1995).
Algunos grupos han descrito que la CT puede activar selectivamente
linfocitos T CD4+ del tipo Th2, a la vez que inhibe linfocitos del
tipo Th1 (Takahasni y col., 1996), mientras que otros describen la
activación de ambos linfocitos T CD4+ de tipo Th1 y Th2 (Homquist y
Lycke, 1993). Las diferencias pueden ser debidas a una variedad de
factores que incluyen la vía de inmunización y la naturaleza del
antígeno.
La enterotoxina termolábil de Escherichia
coli (toxina lábil, LT) está estrechamente relacionada
estructural y funcionalmente con CT y tiene propiedades auxiliares
similares (Lycke y col., 1992). LT puede conferir inmunidad a
antígenos administrados conjuntamente que, por sí mismos, no son
inmunógenos cuando se administran por vías mucosas; este efecto
auxiliar se observa cuando LT se mezcla simplemente con el antígeno
o se acopla físicamente con el mismo (Holmgren y col., 1993).
Aunque son muy eficaces como aditivos mucosos en
modelos animales, la CT y la LT son muy tóxicas y muy especialmente
en los seres humanos. Se han desarrollado mutantes destoxificados
genéticamente de CT y LT, empleando mutagénesis dirigida al sitio
que, al menos en modelos animales, parecen ser menos tóxicos aunque
conservan alguna propiedad auxiliar (p. ej., LTK63 es LT con una
sola sustitución en la serina-63) (Rappuoli y col.,
1995, Douce y col., 1994, Pizza y col., 1994, De Haan y col., 1996).
Sin embargo, el nivel potenciador parece ser proporcional al nivel
de toxicidad mantenida y, por tanto, existe una clara necesidad de
un aditivo para la mucosa alternativo que sea eficaz y seguro.
Lipford y col., (Eur. J. Immunol. 1997,
27:2340-2344) indican que los oligonucleótidos que
contienen CpG pueden actuar como aditivos para las respuestas
inmunes humorales y celulares. Los oligonucleótidos y los antígenos
(OVA y el péptido sintético SIINFEKL) se inyectaron en las patas
traseras de múridos. Se estudió la actividad de los anticuerpos
séricos y de los CTL de los nódulos linfáticos.
El documento de solicitud de patente PCT
publicado, nº WO 98/14210 se refiere a métodos para tratar el asma
alérgica, empleando ácidos nucleicos que codifican los antígenos que
inician el asma. Estos ácidos nucleicos se administran a tejidos que
contienen altas concentraciones de células presentadoras de
antígenos. La capacidad para expresar, pero no secretar los
antígenos codificados en las células presentadoras de antígenos,
incrementa según la información, la tolerancia hacia el
antígeno.
La presente invención se refiere a productos
para inducir respuestas inmunes que emplean de forma
inmunoestimuladora oligonucleótidos que contienen dinucleótidos CpG.
En un aspecto, la invención es una composición para inducir una
respuesta inmune mucosa. Este aspecto comprende el uso de un
oligonucleótido que tiene una secuencia que incluye al menos la
siguiente fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, para la
preparación de una composición para administrar a una superficie
mucosa de un individuo que también está expuesto a un antígeno, para
inducir una respuesta inmune mucosa a dicho antígeno en dicho
individuo.
En una realización, el antígeno no está
codificado en un vector de ácido nucleico. En otra realización, el
antígeno está codificado por un vector de ácido nucleico.
En algunas realizaciones de la invención, el
oligonucleótido tiene un esqueleto seleccionado entre el grupo
consistente en un esqueleto fosfodiéster y un esqueleto quimérico.
En otras realizaciones, el oligonucleótido tienen un esqueleto
fosforotioato. En las realizaciones en las que el oligonucleótido
tiene un esqueleto fosforotioato y en donde el antígeno está
codificado por un vector de ácido nucleico y el CpG es un
oligonucleótido, es una realización preferida pero no limitada, que
el plásmido y los oligonucleótidos se administren con un sistema de
dispersión coloidal. En algunas realizaciones, el sistema de
dispersión coloidal se selecciona entre el grupo consistente en
complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas y
sistemas basados en lípidos. En otras realizaciones, el plásmido y
el oligonucleótido se revisten sobre partículas de oro y se entregan
con una pistola génica.
Un producto para inducir una respuesta inmune
mucosa en un individuo, se proporciona en otros aspectos. Este
aspecto es un producto que comprende un oligonucleótido que tiene
una secuencia que incluye al menos la siguiente fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, un antígeno y
una hormona para el uso simultáneo, separado o secuencial para
inducir una respuesta inmune mucosa en un individuo frente a dicho
antígeno.
En una realización, el antígeno y el
oligonucleótido se administran a una superficie mucosa del
individuo. En otra realización, la hormona se administra
sistémicamente. En una realización, la hormona está codificada por
un vector de ácido nucleico.
En otros aspectos, la invención implica
composiciones para inducir una respuesta inmune. Estos aspectos
comprenden el uso de un oligonucleótido que tiene una secuencia que
incluye al menos la siguiente fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, para la
preparación de una composición para administrar a una superficie
mucosa de un individuo que también está expuesto a un antígeno, para
inducir una respuesta inmune mucosa frente a dicho antígeno en dicho
individuo. Las composiciones se pueden administrar oral, intranasal,
ocular, vaginal o
rectalmente.
En algunas realizaciones el antígeno se
administra oral, intranasal, ocular, vaginal o rectalmente. En otras
realizaciones, el antígeno se administra simultáneamente con el
oligonucleótido. Preferentemente, el oligonucleótido se administra
en una cantidad eficaz para inducir inmunidad en la mucosa.
La administración de composiciones y productos
de la invención da como resultado una inducción de la inmunidad de
la mucosa. La inmunidad de la mucosa se puede inducir en un sitio
local y/o distante. En algunas realizaciones la inmunidad de la
mucosa se induce en un sitio local y en otras la inmunidad de la
mucosa se induce en un sitio distante, o en ambos.
Para inducir una respuesta inmune mucosa, el
oligonucleótido CpG se puede administrar con una dosis de
sensibilización, con una dosis de refuerzo o con ambas. Por ejemplo,
el oligonucleótido CpG se puede administrar con una dosis de
sensibilización del antígeno. En otra realización, el
oligonucleótido CpG se administra con una dosis de refuerzo del
antígeno. En algunas realizaciones, al individuo se le administra
una dosis de sensibilización de antígeno y oligonucleótido CpG antes
de la dosis de refuerzo. En todavía otras realizaciones, al
individuo se le administra una dosis de refuerzo y de
oligonucleótido CpG antes de la dosis de sensibilización.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de una composición para inducir una respuesta inmune sistémica. Este
aspecto implica el uso de un oligonucleótido que tiene una secuencia
que incluye al menos la siguiente fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos y un antígeno,
que no está codificado en un vector de ácido nucleico, para la
preparación de un medicamento para la administración simultánea,
separada o secuencial a una superficie mucosa de un individuo, para
inducir una respuesta inmune sistémica frente a dicho antígeno. En
otra realización, el antígeno no produce una respuesta inmune
sistémica cuando se administra aislado a la superficie
mucosa.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporciona un producto para inducir una respuesta inmune sistémica.
Este aspecto implica un oligonucleótido que tiene una secuencia que
incluye al menos la siguiente fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y un aditivo no
oligonucleótido, para la administración simultánea, separada o
secuencial a una superficie mucosa de un individuo que está expuesto
a un antígeno, para inducir una respuesta inmune sistémica frente a
dicho
antígeno.
En una realización, el antígeno se entrega a una
superficie mucosa. En otra realización, el antígeno no está
codificado en un vector de ácido nucleico.
El individuo puede estar expuesto activamente al
antígeno o estar expuesto pasivamente al antígeno. En una
realización del uso de los productos y las composiciones descritas
en esta memoria, el individuo está expuesto activamente al antígeno
y el antígeno se entrega a una superficie mucosa. En otras
realizaciones, el antígeno se administra junto con el
oligonucleótido. El antígeno se puede entregar solo o junto con un
sistema de dispersión coloidal. En algunas realizaciones, el sistema
de dispersión coloidal se selecciona entre el grupo consistente en
complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas y
sistemas basados en lípidos. Los sistemas basados en lípidos
incluyen opcionalmente emulsiones de
aceite-en-agua, micelas, micelas
mixtas o liposomas.
En otras realizaciones, el individuo se expone
pasivamente al antígeno a través de contacto con el entorno. El
individuo que se expone pasivamente al antígeno en algunas
realizaciones, es un individuo con riesgo de desarrollar una
reacción alérgica, una enfermedad infecciosa o un cáncer. En otras
realizaciones, el individuo tiene una enfermedad infecciosa, un
cáncer, una alergia o es asmático.
El antígeno que se administra pasiva o
activamente al individuo es cualquier tipo de antígeno conocido en
la técnica e incluye, por ejemplo, células, extractos celulares,
proteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados de
polisacáridos, miméticos peptídicos de polisacáridos, lípidos,
glicolípidos, carbohidratos, alérgenos, virus y extractos víricos y
organismos pluricelulares, tales como parásitos. En una realización,
el antígeno se obtiene a partir de un organismo infeccioso
seleccionado entre el grupo consistente en bacterias infecciosas,
virus infecciosos, parásitos infecciosos y hongos infecciosos.
El uso de los productos o las composiciones de
la invención puede incluir también la etapa de administrar un
aditivo no oligonucleótido de la mucosa, junto con el antígeno. Los
aditivos no oligonucleótidos de la mucosa pueden incluir, por
ejemplo, la toxina del cólera, derivados de la toxina del cólera, la
toxina lábil, derivados de la toxina lábil, alum, MLP, MDP,
saponinas tales como QS21, citoquinas, formulaciones de emulsiones
de aceite-en-agua y otras, tales
como MF59, SAF, Montanide ISA 720 y PROVAX, polímeros PCPP e
ISCOMS.
En otras realizaciones, el uso de los productos
o las composiciones incluye la etapa de administrar una citoquina o
una molécula coestimuladora B-7 al individuo.
En otras realizaciones, el oligonucleótido se
administra al individuo por vía oral, mucosa, ocular, vaginal,
rectal o por inhalación.
El oligonucleótido puede estar modificado. Por
ejemplo, en algunas realizaciones, al menos un nucleótido tiene una
modificación en el esqueleto de fosfatos. La modificación en el
esqueleto de fosfatos puede ser una modificación fosforotioato o
fosforoditioato. En algunas realizaciones la modificación del
esqueleto de fosfato tiene lugar en el lado 5' del oligonucleótido o
en el lado 3' del oligonucleótido.
El oligonucleótido puede tener cualquier tamaño.
Preferentemente, el oligonucleótido tiene 8 a 100 nucleótidos. En
otras realizaciones, el oligonucleótido tiene 8 a 40 nucleótidos de
longitud.
En algunas realizaciones, X_{1}X_{2} son
nucleótidos seleccionados entre el grupo consistente en: GpT, GpG,
GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT y TpG; y X_{3}X_{4}
son nucleótidos seleccionados entre el grupo consistente en: TpT,
CpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA y CpA.
Preferentemente, X_{1}X_{2} son GpA o GpT y X_{3}X_{4} son
TpT. En otras realizaciones preferidas X_{1} o X_{2} o ambas,
son purinas y X_{3} o X_{4} o ambas son pirimidinas o
X_{1}X_{2} son GpA y X_{3} o X_{4} o ambas son pirimidinas.
En una realización X_{2} es una T y X_{3} es una pirimidina. El
oligonucleótido se puede aislar o ser sintético.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido
tiene una secuencia que incluye al menos la siguiente fórmula:
5'
TCNTX_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde X_{1}, X_{2}, X_{3}
y X_{4} son nucleótidos, N es una secuencia de ácido nucleico
compuesta por aproximadamente 0-25
nucleótidos.
En otros aspectos, la invención engloba
composiciones farmacéuticas para la administración de
oligonucleótidos CpG por vía oral, intranasal, ocular, vaginal o
rectal. En un aspecto, la composición es una formulación oral de un
oligonucleótido CpG en un tampón para neutralizar ácidos biológicos.
En otro aspecto, la composición es una formulación intranasal de un
oligonucleótido CpG en un aerosol. En otros aspectos, la composición
es una formulación vaginal o rectal de un oligonucleótido CpG en un
supositorio u otro vehículo adecuado para la entrega al tejido
vaginal y rectal. En otro aspecto, la composición es una formulación
ocular de un oligonucleótido CpG en una solución compatible con el
ojo. Tales formulaciones se describen en esta memoria así como en
"Remingtons Pharmaceutical Sciences".
Cada una de las limitaciones de la invención
puede incluir diversas realizaciones de la invención. Por ello, se
espera que cada una de las limitaciones de la invención que implica
cualquier elemento o combinaciones de elementos, se pueda incluir en
cada aspecto de la invención.
La Figura 1 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes aditivos sobre los títulos totales
de IgG de anti-HBS, en donde ratones BALB/c se
habían inmunizado por inhalación IN de HBsAg (1 o 10 \mug) con o
sin toxina colérica (CT) y/o aditivos de oligonucleótido CpG (motivo
nº 1826, SEQ ID NO. 90).
La Figura 2 es un diagrama que describe el
efecto de diferentes aditivos sobre los títulos totales de IgG de
anti-HBs, en donde los ratones BALB/c se habían
inmunizado por inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina
colérica (CT) y/o aditivos de oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO. 90) y a las 8 semanas, los ratones se reforzaron del
mismo modo que la sensibilización.
La Figura 3 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes aditivos sobre el isotipo IgG de
anti-HBs, en donde los ratones BALB/c se habían
inmunizado por inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina
colérica (CT) y/o aditivos de oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO. 90) (1 \mug) y a las 8 semanas, se reforzaron del mismo
modo que la sensibilización.
La Figura 4 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes aditivos sobre la respuesta de los
CTL específicos de HBsAg, en donde los ratones BALB/c se habían
inmunizado por inhalación IN de HBsAg (10 \mug) con o sin toxina
colérica (CT) y/o aditivos de oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO. 90), con diversas dosis (1 o 10 \mug) y cuatro semanas
después de la inmunización, se mataron los ratones mediante
sobredosis de halotano, se aislaron los esplenocitos y se midió la
actividad de los CTL específicos de HBsAg.
La Figura 5 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes aditivos sobre los títulos de IgA
anti-HBs en lavados pulmonares, en donde los ratones
BALB/c se habían inmunizado por inhalación IN de HBsAg (1 o 10
\mug) con o sin toxina colérica (CT) y/o aditivos de
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) con diversas
dosis (1 o 10 \mug) y cuatro semanas después de la inmunización (o
después del refuerzo para el grupo marcado con *), los ratones se
mataron mediante sobredosis de halotano y los pulmones se lavaron
con 1 ml de TBS.
La Figura 6 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes aditivos sobre los títulos de IgA
anti-HBs en soluciones de sedimentos fecales, en
donde los ratones BALB/c se habían inmunizado por inhalación IN de
HBsAg (1 o 10 \mug) con o sin toxina colérica (CT) y/o
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) con diversas
dosis (1 o 10 \mug) y cuatro semanas después de la inmunización (o
después del refuerzo para el grupo marcado con *), los ratones se
aislaron durante 24 h y se recogieron los sedimentos fecales y se
resuspendieron en TBS con 0,1 mg/ml.
La Figura 7 es un diagrama que describe el
efecto de diferentes aditivos sobre los títulos totales de IgG de
anti-HBs, en donde los ratones BALB/c se habían
inmunizado por inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina
colérica (CT), enterotoxina termolábil de Escherichia coli
(LT), la subunidad B de la toxina colérica (CTB), un mutante
destoxificado de la enterotoxina termolábil de Escherichia
coli (LTK63), el oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO.
90) o un oligonucleótido testigo no CpG (motivo nº 1982, SEQ ID NO.
90) como aditivos (1, 10 o 500 \mug). En los grupos que respondían
al tratamiento, todos los ratones tenían títulos >10, excepto en
el caso de 10 \mug de LT, en donde sólo respondían 1/5
ratones.
La Figura 8 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes estrategias de
sensibilización/refuerzo sobre los títulos totales de IgG de
anti-HBs, en donde los ratones BALB/c se habían
inmunizado: (i) por inyección IM de HBsAg (1 \mug) junto con alum
más oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) y se
reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización, o mediante
inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica (CT) y/o
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO.90); o (ii) por
inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica (CT)
y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) y se reforzó
a las 4 semanas de la sensibilización o mediante inyección IM de
HBsAg (1 \mug) junto con alum más oligonucleótido CpG (motivo nº
1826, SEQ ID NO. 90). Los números en la parte superior de cada barra
representan la proporción de IgGa/IgG1.
La Figura 9 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes estrategias de
sensibilización/refuerzo con diferentes aditivos, sobre la respuesta
de los CTL específicos de HBsAg, en donde los ratones BALB/c se
habían inmunizado: (i) por inyección IM de HBsAg (1 \mug) junto
con alum más oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) y
se reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización, o mediante
inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica (CT) y/o
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90); o (ii) por
inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica (CT) y/o
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) y se reforzó a
las 4 semanas de la sensibilización o mediante inyección IM de HBsAg
(1 \mug) junto con alum más oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO. 90) y 4 semanas después del refuerzo se mataron los
ratones mediante sobredosis de halotano, se aislaron los
esplenocitos y se midió la actividad de los CTL específicos de
HBsAg.
La Figura 10 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes estrategias de
sensibilización/refuerzo con diferentes aditivos, sobre la
proliferación de los linfocitos T específicos de HBsAg, en donde los
ratones BALB/c se habían inmunizado: (i) por inyección IM de HBsAg
(1 \mug) junto con alum más oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO.90) y se reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización,
o mediante inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina
colérica (CT) y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO.
90); o (ii) por inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina
colérica (CT) y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO.90)
y se reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización o mediante
inyección IM de HBsAg (1 \mug) junto con alum más oligonucleótido
CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) y cuatro semanas después del
refuerzo, se mataron los ratones mediante sobredosis de halotano, se
aislaron los esplenocitos y se midió la actividad de los CTL
específicos de HBsAg.
La Figura 11 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes estrategias de
sensibilización/refuerzo con diferentes aditivos sobre los títulos
de IgA anti-HBs en lavados pulmonares, en donde los
ratones BALB/c se habían inmunizado: (i) por inyección IM de HBsAg
(1 \mug) junto con alum más oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO.90) y se reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización,
o mediante inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina
colérica (CT) y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO.
90); o (ii) por inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina
colérica (CT) y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO.
90) y se reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización o mediante
inyección IM de HBsAg (1 \mug) junto con alum más oligonucleótido
CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90). Cuatro semanas después del
refuerzo, se mataron los ratones mediante sobredosis de halotano y
los pulmones se lavaron con 1 ml de TBS.
La Figura 12 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes estrategias de
sensibilización/refuerzo con diferentes aditivos sobre los títulos
de IgA anti-HBs en la saliva, en donde los ratones
BALB/c se habían inmunizado: (i) por inyección IM de HBsAg (1
\mug) junto con alum más oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ
ID NO. 90) y se reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización, o
mediante inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica
(CT) y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90); o (ii)
por inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica (CT)
y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) y se
reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización o mediante
inyección IM de HBsAg (1 \mug) junto con alum más oligonucleótido
CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90). Cuatro semanas después del
refuerzo, se inyectó a los ratones 100 \mul de solución de
hidrocloruro de pilocarpina al 0,5% y se recogió la saliva.
La Figura 13 es un diagrama de barras que
describe el efecto de diferentes estrategias de
sensibilización/refuerzo con diferentes aditivos sobre los títulos
de IgA anti-HBs en soluciones de sedimento fecal, en
donde los ratones BALB/c se habían inmunizado: (i) por inyección IM
de HBsAg (1 \mug) junto con alum más oligonucleótido CpG (motivo
nº 1826, SEQ ID NO. 90) y se reforzaron a las 4 semanas de la
sensibilización, o mediante inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o
sin toxina colérica (CT) y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO. 90); o (ii) por inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o
sin toxina colérica (CT) y/o oligonucleótido CpG (motivo nº 1826,
SEQ ID NO. 90) y se reforzaron a las 4 semanas de la sensibilización
o mediante inyección IM de HBsAg (1 \mug) junto con alum más
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90). Cuatro semanas
después del refuerzo, los ratones se aislaron durante 24 h y se
recogieron los sedimentos fecales y se resuspendieron en TBS con 0,1
mg/ml.
La Tabla 1 lista las secuencias
inmunoestimuladoras de oligonucleótidos.
La Tabla 2 lista el efecto de diferentes
aditivos sobre isotipos de anticuerpos específicos de HBsAg.
^{a} Ratones BALB/c fueron inmunizados por
inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica (CT),
enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LT), la
subunidad B de la toxina colérica (CTB), un mutante destoxificado de
la enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTK63) y/o el
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) (1 o 10 \mug)
como aditivos.
^{b} Los valores representan la media
geométrica del grupo (GMT) del título de la dilución de punto final
con ELISA para los anticuerpos IgG1 o IgG2 específicos de HBsAg en
el plasma, tomados 4 semanas después de la inmunización. Los títulos
se definieron como la mayor dilución en plasma resultante de un
valor de absorbancia dos veces superior al valor del plasma no
inmune, con un valor de punto de corte de 0,05.
^{c} Las proporciones de IgG2a frente a IgG1
(IgG2a:IgG1) se describen, indicando un valor >1 una respuesta
predominantemente similar a Th-1.
^{d} N/A: no aplicable, puesto que no se
detectaron respuestas de los anticuerpos.
^{e=}: Todos los ratones inmunizados con estas
combinaciones de aditivos murieron en 96 horas.
La Tabla 3 lista el efecto de los diferentes
aditivos sobre las respuestas de IgA específica de HBsAg.
^{a} Ratones BALB/c fueron inmunizados por
inhalación IN de HBsAg (1 \mug) con o sin toxina colérica (CT),
enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LT), la
subunidad B de la toxina colérica (CTB), un mutante destoxificado de
la enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTK63) y/o el
oligonucleótido CpG (motivo nº 1826, SEQ ID NO. 90) (1 o 10 \mug)
como aditivos. Todos los grupos contenían 5 ratones, a no ser que se
indique de otro modo.
^{b} Los valores representan la media
geométrica del título \pm el error típico de la media (GMT \pm
SEM) del título de la dilución de punto final con ELISA para los
anticuerpos IgA específicos de HBsAg en soluciones de lavados
pulmonares o en soluciones fecales, tomados 4 semanas después de la
inmunización.
^{c} Los títulos de IgA en los lavados
pulmonares se definieron como la mayor dilución resultante de un
valor de absorbancia (DO 450) dos veces superior al valor del lavado
pulmonar no inmune, con un valor de punto de corte de 0,05.
^{d} Los títulos de IgA en extractos fecales
se expresaron como la DO 450 x 10^{3} por encima del ruido de
fondo (extracto fecal no inmune). La seroconversión se definió como
un título de punto final para IgG total >100
^{e=}: Todos los ratones inmunizados con estas
combinaciones de aditivos murieron en 96 horas.
La Tabla 4 muestra las diferentes estrategias de
sensibilización/refuerzo de tipo mucoso/parenteral, empleadas para
inmunizar ratones BALB/c y resume los resultados como qué
planteamiento inducía las respuestas inmunes sistémicas y mucosas
específicas del antígeno.
La invención se refiere a productos y a
composiciones para uso en la inmunidad inducida, que comprende
oligonucleótidos CpG inmunoestimuladores. Un aspecto de la invención
se basa en el descubrimiento de que los oligonucleótidos CpG actúan
como potentes aditivos de la mucosa para inducir respuestas inmunes
en sitios locales y distantes, contra un antígeno administrado al
tejido mucoso. Este descubrimiento es sorprendente, incluso de cara
a descubrimientos previos de que el oligonucleótido CpG es un
aditivo potente para la administración sistémica, debido a que con
la administración sistémica la proteína aislada induce respuestas
inmunes detectables pero con la administración en la mucosa, la
proteína aislada no induce una respuesta inmune. Tal y como se
muestra en los Ejemplos siguientes, la inmunidad sistémica y mucosa
son inducidas por la administración en la mucosa de los
oligonucleótidos CpG. La inmunidad sistémica inducida como respuesta
a los oligonucleótidos CpG, incluía las respuestas humorales y las
mediadas por células, frente a antígenos específicos que no eran
capaces de inducir una inmunidad sistémica cuando se administraban
de forma aislada en la mucosa. Además, los oligonucleótidos CpG y la
toxina colérica (CT, un aditivo de la mucosa que induce una
respuesta similar a Th2), inducían los CTL. Esto es sorprendente
puesto que con la inmunización sistémica, la presencia de
anticuerpos similares a Th2 se asocia generalmente con una carencia
de CTL (Schirmbeck, y col., 1995).
Adicionalmente, se observó que los
oligonucleótidos CpG inducían una respuesta mucosa en sitios de la
mucosa local (p. ej., pulmones) y distantes (p. ej., tracto
digestivo inferior). Aunque el oligonucleótido CpG era similar a la
CT para inducir los anticuerpos sistémicos (IgG) y los anticuerpos
de la mucosa local (IgA), se indujeron niveles significativos de
anticuerpos IgA en un sitio de la mucosa distante sólo con
oligonucleótido CpG y no con CT. Esto era sorprendente porque CT se
considera generalmente que es un aditivo de la mucosa muy eficaz.
Otro aspecto en el que el oligonucleótido CpG era superior a la CT
era en relación con el tipo de respuesta Th. Tal y como se había
informado previamente (Snider, 1995), la CT induce predominantemente
el isotipo IgG1 de los anticuerpos, lo que es indicativo de una
respuesta de tipo Th2. Por el contrario, el oligonucleótido CpG era
más Th1, predominantemente con anticuerpos IgG2a, especialmente
después de un refuerzo o cuando se combinaban los dos aditivos. Los
anticuerpos de tipo Th1 tienen generalmente mejores capacidades de
neutralización y, además, una respuesta Th2 en el pulmón es muy poco
deseable porque está asociada con asma (Kay, 1996, Hogg, 1997). Por
tanto, el uso del oligonucleótido CpG como aditivo de la mucosa
tiene unas ventajas que no pueden conseguir otros aditivos de la
mucosa.
El descubrimiento del oligonucleótido CpG como
un aditivo de la mucosa seguro y eficaz también es ventajoso debido
a que, aunque CT es un aditivo de la mucosa muy eficaz, es demasiado
tóxico para el uso en humanos. Un ratón (\sim20 g de peso
corporal) puede tolerar los efectos tóxicos de hasta 10 \mug de
CT, sin embargo, una dosis tan pequeña como 1-5
\mug puede causar una diarrea grave en un ser humano (\sim70 kg
de peso corporal) (Jertborn y col., 1992). Los animales que inhalan
el oligonucleótido CpG no mostraban a corto plazo signos de
sufrimiento, frente a los que recibían sólo HBsAg, y todos se
recuperaban rápidamente sin efectos aparentes a largo plazo. El
oligonucleótido CpG se tolera bien en dosis muy elevadas (p. ej.,
superiores a 100 \mug) cuando se administra sistémicamente o en la
mucosa. Por tanto, en un aspecto la invención es una composición
para inducir una respuesta inmune mucosa en un individuo. Este
aspecto implica el uso de oligonucleótido que tiene una secuencia
que incluye al menos la fórmula
siguiente:
siguiente:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, para la
preparación de una composición para administrar a una superficie
mucosa de un individuo que también está expuesto a un antígeno, para
inducir una respuesta inmune mucosa en dicho individuo frente a
dicho antígeno. El oligonucleótido, denominado en esta memoria el
oligonucleótido o el nucleótido CpG, no es un vector plasmídico.
Estas distinciones se aclaran en las definiciones
siguientes.
El oligonucleótido CpG es particularmente útil
como una vacuna profiláctica para inducir inmunidad en la mucosa de
un individuo con riesgo de desarrollar una infección con un
organismo infeccioso o de un individuo con riesgo de desarrollar una
alergia o un cáncer. Un "individuo con riesgo" tal y como se
emplea en esta memoria, es un individuo que tiene cualquier riesgo
de exposición a un agente patógeno infeccioso que cause una
infección o a un alérgeno, o de desarrollar un cáncer. Por ejemplo,
un individuo con riesgo puede ser un individuo que está planeando
viajar a un área en la que se encuentra un tipo particular de agente
infeccioso o alérgeno o puede ser un individuo que, debido a su
estilo de vida o a procesos médicos, está expuesto a fluidos
corporales que pueden contener organismos infecciosos o incluso
cualquier individuo que viva en un área en la que se ha identificado
un organismo infeccioso o un alérgeno. Los individuos con riesgo de
desarrollar una infección también incluyen poblaciones generales a
las que una agencia médica recomienda una vacunación con un antígeno
de un organismo infecciosos particular. Si el antígeno es un
alérgeno y el individuo desarrolla respuestas alérgicas a este
antígeno en particular, y el individuo está expuesto al antígeno, es
decir, durante la temporada del polen, entonces este individuo
tiene un riesgo de exponerse al antígeno. Los individuos con riesgo
de desarrollar un cáncer, incluyen los que tienen una predisposición
genética o los que se han tratado previamente contra el cáncer, y
los que se exponen a carcinógenos, tales como el tabaco, el asbesto
y otras toxinas químicas o a una luz solar excesiva y otros tipos de
radiación.
Además del uso del oligonucleótido CpG para el
tratamiento profiláctico, la invención también incluye el uso del
oligonucleótido CpG para el tratamiento de un individuo que tiene
una infección, una alergia o un cáncer.
Un "individuo que tiene una infección" es
un individuo que se ha expuesto a un agente patógeno infeccioso y
que tiene niveles detectables agudos o crónicos del patógeno en el
cuerpo. El oligonucleótido CpG se puede emplear con un antígeno para
aumentar una respuesta inmune mucosa específica de un antígeno que
es capaz de reducir el nivel del patógeno infeccioso o de
erradicarlo. Una enfermedad infecciosa, tal y como se emplea en esta
memoria, es una enfermedad que surge de la presencia en el cuerpo de
un microorganismo ajeno. Es particularmente importante desarrollar
estrategias eficaces de vacunas y tratamientos para proteger las
superficies de la mucosa corporal que son el sitio principal de
entrada de los agentes patógenos.
Un "individuo que tiene una alergia" es un
individuo que tiene una reacción alérgica o que tiene el riesgo de
desarrollar una reacción alérgica como respuesta a un alérgeno. Una
"alergia" se refiere a una hipersensibilidad adquirida frente a
una sustancia (alérgeno). Las condiciones alérgicas incluyen, pero
no están limitadas a las mismas, los eczemas, la rinitis alérgica o
coriza, la fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria
y alergia a alimentos y otras condiciones atópicas.
Generalmente, las enfermedades alérgicas se
tratan habitualmente con la inyección de dosis pequeñas del
antígeno, seguidas de una dosificación incrementada posterior del
antígeno. Se cree que este procedimiento induce tolerancia frente al
alérgeno para evitar reacciones alérgicas posteriores. Estos
métodos, sin embargo, pueden durar varios años para que sean
efectivos y están asociados con el riesgo de efectos secundarios,
tales como el choque anafiláctico. Los métodos de la invención
evitan estos problemas.
Las alergias son causadas generalmente por la
generación de anticuerpo IgE contra alérgenos inofensivos. Las
citoquinas que se inducen mediante la administración en la mucosa de
oligonucleótidos CpG no metilados, son predominantemente de una
clase denominada "Th1" (ejemplos son la IL-12 y
el IFN-\gamma) y estas inducen respuestas inmunes
tanto humorales como celulares. Los tipos de anticuerpos asociados
con una respuesta Th1 son generalmente más protectores debido a que
tienen gran capacidad de neutralización y de opsonización. El otro
tipo principal de respuesta inmune, que está asociada con la
producción de citoquinas IL-4, IL-5
e IL-10, se denomina respuesta inmune Th2. Las
respuestas Th2 implican sólo anticuerpos y éstos tienen menos efecto
protector contra la infección y algunos isotipos de Th2 (p. ej.,
IgE) están asociados con la alergia. En general parece que las
enfermedades alérgicas están mediadas por las respuestas inmunes de
tipo Th2, mientras que las respuestas Th1 proporcionan la mejor
protección contra la infección, aunque un exceso de respuestas Th1
está asociado con la enfermedad autoinmune. Basándose en la
capacidad de los oligonucleótidos CpG de desviar la respuesta inmune
en un individuo de una respuesta Th2 (que está asociada con la
producción de anticuerpos IgE y alergia) a una respuesta Th1 (que es
protectora frente a reacciones alérgicas), una dosis eficaz para
inducir una respuesta inmune en la mucosa, de un oligonucleótido CpG
se puede administrar a un individuo para tratar o prevenir una
alergia.
Por tanto, el oligonucleótido CpG tiene una
utilidad terapéutica significativa en el tratamiento de estados
alérgicos tales como el asma. Las citoquinas Th2, especialmente
IL-4 e IL-5 aumentan en las vías
respiratorias de individuos asmáticos. Estas citoquinas favorecen
importantes aspectos de la respuesta inflamatoria asmática,
incluyendo el cambio del isótopo IgE, la quimiotaxis eosinófila y la
activación del crecimiento de los mastocitos. Las citoquinas Th1,
especialmente IFN-\gamma e IL-12,
pueden inhibir la formación de clones Th2 y la producción de
citoquinas Th2. "Asma" se refiere a una enfermedad del sistema
respiratorio, caracterizada por la inflamación, el estrechamiento de
las vías respiratorias y una reactividad incrementada de las vías
respiratorias frente a agentes inhalados. El asma está asociada
frecuentemente, aunque no exclusivamente, con síntomas atópicos o
alérgicos.
Un "individuo que tiene un cáncer" es un
individuo que tiene células cancerosas detectables. El cáncer puede
ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen,
sin estar limitados a los mismos, el cáncer del conducto biliar;
cáncer cerebral; cáncer de mama; cáncer de útero; coriocarcinoma;
cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer
gástrico; neoplasmas intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado;
cáncer de pulmón (p. ej., de célula pequeña y de célula no pequeña);
melanoma; neuroblastomas; cáncer oral; cáncer de ovarios; cáncer de
páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de
piel; cáncer de testículos; cáncer de tiroides y cáncer renal; así
como otros carcinomas y sarcomas.
Un "individuo" debe significar un ser
humano o un animal vertebrado que incluye, pero no está limitado a,
un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, una
cabra, un pollo, un primate, p. ej., un mono, un pez (especies de
acuicultura), p. ej., salmón, una rata y un ratón.
Un oligonucleótido CpG es un oligonucleótido que
induce al menos un dinucleótido CpG no metilado. Un oligonucleótido
que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es una
molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia dinucleotídica
de citosina-guanina no metilada (es decir, "ADN
CpG" o ADN que contiene una citosina 5' seguida de guanosina 3' y
ligada por un enlace fosfato) y activa el sistema inmune. Los
oligonucleótidos CpG pueden ser monocatenarios o bicatenarios.
Generalmente, las moléculas bicatenarias son más estables in
vivo, mientras que las moléculas monocatenarias tienen una
actividad inmune incrementada.
Las expresiones "ácido nucleico" y
"oligonucleótido" se emplean de forma intercambiable y
significan nucleótidos múltiples (es decir, moléculas que comprenden
un azúcar (p. ej., ribosa o desoxirribosa) ligado a un grupo fosfato
y a una base orgánica permutable, que es una pirimidina sustituida
(p. ej., citosina (C), timina (T) o uracilo (U)) o una purina
sustituida (p. ej., adenina (A) o guanina (G)). Tal y como se emplea
en esta memoria, los términos se refieren a oligorribonucleótidos
así como a oligodesoxirribonucleótidos. Los términos también pueden
incluir polinucleósidos (es decir, polinucleótido menos el fosfato)
y cualquier otra base orgánica que contiene polímero. Las moléculas
de ácido nucleico se pueden obtener a partir de fuentes de ácido
nucleico existentes (p. ej., ADN genómico o ADNc), pero son
preferentemente sintéticas (p. ej., producidas por síntesis de
oligonucleótidos). El oligonucleótido CpG completo puede estar no
metilado o algunas partes pueden no estar metiladas, pero al menos
la C de 5'CG3' no debe estar metilada.
Algunos aspectos de la invención se pueden
realizar administrando oligonucleótido que contiene CpG al
individuo, para inducir una respuesta inmune mucosa. Tal y como se
emplea en esta memoria, las expresiones un "oligonucleótido
CpG" y un "vector de expresión plasmídico" son
incompatibles. Las expresiones "oligonucleótido CpG" o "ácido
nucleico CpG" se emplean para referirse a cualquier ácido
nucleico que contenga CpG, excepto un vector plasmídico que contenga
CpG. Un vector de expresión plasmídico es una molécula de ácido
nucleico que incluye al menos un promotor y un gen que codifica un
péptido o un fragmento peptídico. El vector de expresión plasmídico
incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido que
está ligado funcionalmente con una secuencia de expresión génica que
dirige la expresión del péptido en una célula eucariota. La
"secuencia de expresión génica" es cualquier secuencia
nucleotídica reguladora, tal como una secuencia de promotor o una
combinación de promotor-potenciador que facilita la
transcripción y la traducción eficaz del péptido al que está ligada
funcionalmente. La secuencia de expresión génica puede ser, por
ejemplo, un promotor de mamífero o vírico, tal como un promotor
constitutivo o inducible. Tales estructuras artificiales son bien
conocidas por los expertos en la técnica.
En una realización preferida, la invención
proporciona un oligonucleótido CpG representado por al menos la
fórmula:
5'N_{1}X_{1}CGX_{2}N_{2}3'
en donde al menos un nucleótido
separa las CpGs consecutivas; X_{1} es adenina, guanina o
timidina; X_{2} es citosina, adenina o timina; N es cualquier
nucleótido y N_{1} y N_{2} son secuencias de ácidos nucleicos
compuestas por aproximadamente 0-25 nucleótidos cada
una.
En otra realización, la invención proporciona un
oligonucleótido CpG aislado, representado por al menos la
fórmula:
5'N_{1}X_{1}X_{2}CGX_{3}N_{2}3'
en donde al menos un nucleótido
separa las CpGs consecutivas; X_{1}X_{2} son nucleótidos
seleccionados entre el grupo consistente en: GpT, GpG, GpA, ApA,
ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT y TpG; y X_{3}X_{4} son
nucleótidos seleccionados entre el grupo consistente en: TpT, CpT,
ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA y CpA; N es cualquier
nucleótido y N_{1} y N_{2} son secuencias de ácido nucleico
compuestas por aproximadamente 0-25 nucleótidos cada
una. Preferentemente, X_{1}X_{2} son GpA o GpT y X_{3}X_{4}
son TpT. En otras realizaciones preferidas, X_{1} o X_{2} o
ambas, son purinas y X_{3} o X_{4} o ambas son pirimidinas o
X_{1}X_{2} son GpA y X_{3} o X_{4} o ambas son pirimidinas.
En una realización preferida N_{1} y N_{2} del ácido nucleico
no contienen un tetrámero CCGG o CGCG o más de un trímero CCG o CGG.
El efecto de un tetrámero CCGG o CGCG o más de un trímero CCG o CGG,
depende en parte del estado del esqueleto de oligonucleótidos. Por
ejemplo, si el oligonucleótido tiene un esqueleto fosfodiéster o un
esqueleto quimérico, la inclusión de estas secuencias en el
oligonucleótido sólo afectará de forma mínima a la actividad
biológica del oligonucleótido, si es que afecta de algún modo. Si el
esqueleto es completamente de fosforotioato o significativamente de
fosforotioato, entonces la inclusión de estas secuencias puede tener
más influencia sobre la actividad biológica o sobre las cinéticas de
la actividad biológica. Cuando el oligonucleótido CpG se administra
junto con un antígeno que está codificado en un vector de ácido
nucleico, se prefiere que el esqueleto del oligonucleótido CpG sea
fosfodiéster o quimérico. Puede ser completamente fosforotioato si
el oligonucleótido se entrega directamente a la célula. La célula
puede tener un problema si toma un oligonucleótido de fosforotioato
completamente en presencia de un vector plasmídico. Por tanto,
cuando un vector y un oligonucleótido se entregan a un individuo, es
preferible que el oligonucleótido tenga un esqueleto de fosfodiéster
o quimérico o que tenga un esqueleto de fosforotioato pero esté
asociado con un vehículo que lo entregue directamente en la célula.
Tales vehículos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo,
los liposomas y las pistolas
génicas.
En otra realización preferida, el
oligonucleótido CpG tiene la secuencia
5'TCN_{1}TX_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'.
Preferentemente, los oligonucleótidos CpG de la
invención incluyen X_{1}X_{2} seleccionadas entre el grupo
consistente en GpT, GpG, GpA y ApA y X_{3}X_{4} se selecciona
entre el grupo consistente en TpT, CpT y TpC. Para facilitar la
entrada en las células, los oligonucleótidos que contienen CpG se
prefieren en el intervalo de longitud de 8 a 30 bases. Sin embargo,
los ácidos nucleicos de un tamaño mayor a 8 nucleótidos (incluso de
muchas kb de longitud) son capaces de inducir una respuesta inmune
de acuerdo con la invención, si tienen presentes suficientes motivos
inmunoestimuladores, puesto que los ácidos nucleicos más largos se
degradan en oligonucleótidos en el interior de las células. Los
oligonucleótidos sintéticos preferidos no incluyen un tetrámero CCGG
o CGCG o más de un trímero CCG o CGG en los extremos terminales 5'
y/o 3' o cerca de los mismos. Los oligonucleótidos estabilizados, en
los que en el oligonucleótido se incorpora una modificación del
esqueleto de fosfato, tal y como se describe con más detalle a
continuación, también se prefieren. La modificación puede ser, por
ejemplo, una modificación de fosforotioato o de fosforoditioato.
Preferentemente, la modificación del esqueleto de fosfato tiene
lugar en el extremo 5' del ácido nucleico, por ejemplo, en los dos
primeros nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido. Además, la
modificación del esqueleto de fosfato puede tener lugar en el
extremo 3' del ácido nucleico, por ejemplo, en los cinco últimos
nucleótidos del extremo 3' del ácido nucleico. Alternativamente, el
oligonucleótido puede estar modificado parcial o totalmente.
Preferentemente, el oligonucleótido CpG está en
el intervalo de tamaño de 8 a 100 nucleótidos y más preferentemente
entre 8 y 30 nucleótidos. Alternativamente, los oligonucleótidos CpG
se pueden producir a gran escala en los plásmidos y degradarlos a
oligonucleótidos.
El oligonucleótido CpG se puede administrar
directamente al individuo o se puede administrar junto con un
complejo de entrega del ácido nucleico. Un "complejo de entrega
del ácido nucleico" significará una molécula de ácido nucleico
asociada con (p. ej., unida iónica o covalentemente a; o encapsulada
en) unos medios que dirigen a la diana (p. ej., una molécula que
favorece una unión con afinidad superior a la célula diana (p. ej.,
superficies de células dendríticas y/o una absorción celular
incrementada en las células diana)). Ejemplos de complejos de
entrega de ácidos nucleicos incluyen ácidos nucleicos asociados con:
un esterol (p. ej., colesterol), un lípido (p. ej., lípido
catiónico, virosoma o liposoma) o un agente que se une
específicamente a la célula diana (p. ej., un ligando reconocido
por el receptor específico de la célula diana). Los complejos
preferidos pueden ser suficientemente estables in vivo para
evitar un desacoplamiento significativo antes de la internalización
en la célula diana. Sin embargo, el complejo se puede escindir bajo
condiciones adecuadas dentro de la célula, de modo que se libera el
ácido nucleico de forma
funcional.
funcional.
Se han descrito vehículos de entrega para
entregar el antígeno a las superficies mucosas. El oligonucleótido
CpG y/o el antígeno se pueden administrar de forma aislada (p. ej.,
en solución salina o tampón) o empleando cualquier vehículo para
entrega, conocido en la técnica. Por ejemplo, los siguientes
vehículos de entrega se han descrito: cocleatos
(Gould-Fogerite y col., 1994, 1996); emulsomas
(Vancott y col., 1998, Lowell y col., 1997); ISCOMs (Mowat y col.,
1993, Carlsson y col., 1991, Hu y col., 1998, Morein y col., 1999);
liposomas (Childers y col., 1999, Michalek y col., 1989, 1992, de
Haan 1995a, 1995b); vectores bacterianos vivos (p. ej.,
Salmonella, Escherichia coli, Bacillus
calmatte-guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone
y col., 1996, Pouwels y col., 1998, Chatfield y col., 1993, Stover y
col., 1991, Nugent y col., 1998); vectores víricos vivos (p. ej.,
virus vaccinia, adenovirus, Herpes simplex) (Gallichan y col., 1993,
1995, Moss y col., 1996, Nugent y col., 1998, Flexner y col., 1988,
Morrow y col.,1999); microesferas (Gupta y col., 1998, Jones y col.,
1996, Maloy y col., 1994, Moore y col., 1995, O'Hagan y col., 1994,
Eldridge y col., 1989); vacunas de ácidos nucleicos (Fynan y col.,
1993, Kuklin y col., 1997, Sasaki y col., 1998, Okada y col., 1997,
Ishii y col., 1997); polímeros (p. ej., carboximetilcelulosa,
quitosán) (Hamajima y col., 1998, Jabbal-Gill y
col., 1998); anillos de polímeros (Wyatt y col., 1998); proteosomas
(Vancott y col., 1998, Lowell y col., 1988, 1996, 1997); fluoruro
sódico (Hashi y col., 1998); plantas transgénicas (Tacket y col.,
1998, Mason y col., 1998, Haq y col., 1995); virosomas (Gluck y
col., 1992, Mengiardi y col., 1995, Cryz y col., 1998); partículas
similares a virus (Jiang y col., 1999, Leibl y col., 1998). Otros
vehículos de entrega se conocen en la técnica y algunos ejemplos
adicionales se proporcionan a continuación en la exposición de los
vectores.
"Secuencia palindrómica" significará una
repetición invertida (es decir, una secuencia tal como
ABCDEE'D'C'B'
A' en donde A y A' son bases capaces de formar los pares de bases convencionales de Watson-Crick. In vivo, dichas secuencias pueden formar estructuras bicatenarias. En una realización, el oligonucleótido CpG contiene una secuencia palindrómica. Una secuencia palindrómica empleada en este contexto se refiere a un palíndromo en el que la CpG es parte del palíndromo y preferentemente es el centro del palíndromo. En otra realización, el oligonucleótido CpG no tiene palíndromo. Un oligonucleótido CpG que no tiene palíndromo es uno en el que el dinucleótido CpG no forma parte de un palíndromo. Un oligonucleótido tal, puede incluir un palíndromo en el que la CpG no forma parte del palíndromo.
A' en donde A y A' son bases capaces de formar los pares de bases convencionales de Watson-Crick. In vivo, dichas secuencias pueden formar estructuras bicatenarias. En una realización, el oligonucleótido CpG contiene una secuencia palindrómica. Una secuencia palindrómica empleada en este contexto se refiere a un palíndromo en el que la CpG es parte del palíndromo y preferentemente es el centro del palíndromo. En otra realización, el oligonucleótido CpG no tiene palíndromo. Un oligonucleótido CpG que no tiene palíndromo es uno en el que el dinucleótido CpG no forma parte de un palíndromo. Un oligonucleótido tal, puede incluir un palíndromo en el que la CpG no forma parte del palíndromo.
Una "molécula de ácido nucleico
estabilizada" significará una molécula de ácido nucleico que es
relativamente resistente a la degradación in vivo (p. ej.,
mediante una exonucleasa o una endonucleasa). La estabilización
puede ser una función de la longitud o una estructura secundaria.
Los oligonucleótidos CpG no metilados que tienen desde decenas a
centenares de kbs de longitud, son relativamente resistentes a la
degradación in vivo. Para los oligonucleótidos CpG más
cortos, la estructura secundaria puede estabilizar e incrementar su
efecto. Por ejemplo, si el extremo 3' de un oligonucleótido es
autocomplementario con una región aguas arriba, de modo que se puede
plegar y formar una especie de estructura en forma de lazo, entonces
el oligonucleótido se estabiliza y muestra de este modo más
actividad.
Los oligonucleótidos estabilizados preferidos de
la presente invención, tienen un esqueleto modificado. Se ha
observado que la modificación del esqueleto del oligonucleótido
proporciona una actividad mayor de los oligonucleótidos CpG, cuando
se administra in vivo. Las estructuras artificiales de CpG
que incluyen al menos dos enlaces fosforotioato en el extremo 5' del
oligonucleótido en múltiples enlaces fosforotioato en el extremo 3',
preferentemente 5, proporcionan una actividad máxima y protegen al
oligonucleótido de la degradación por exonucleasas y endonucleasas
intracelulares. Otros oligonucleótidos modificados incluyen el
oligonucleótido modificado fosfodiéster, combinaciones de
oligonucleótido fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato,
metilfosforotioato, fosforoditioato y combinaciones de los mismos.
Cada una de estas combinaciones y sus efectos particulares sobre las
células inmunes se describe con más detalle en el documento de
publicación de la solicitud de patente PCT nº WO 98/18810, que
reivindica la prioridad de los documentos de patentes de EE.UU. con
nº de serie 08/738.652 y 08/960.774, presentadas el 30 de octubre de
1996 y el 30 de octubre de 1997, respectivamente. Se cree que estos
oligonucleótidos modificados mostrarán más actividad estimuladora
debido a una mayor resistencia a las nucleasas, mayor absorción
celular, una unión de la proteína incrementada y/o una localización
intracelular alterada.
Los oligonucleótidos fosforotioato y
fosfodiéster que contienen motivos CpG son activos en células
inmunes. Sin embargo, basándose en la concentración necesaria para
inducir efectos específicos de CpG, los oligonucleótidos CpG con
esqueleto de fosforotioato resistentes a nucleasas, son más potentes
(2 \mug/ml para el fosforotioato frente a un total de 90 \mug/ml
para el fosforodiéster).
Otros oligonucleótidos estabilizados incluyen;
análogos de ADN no iónicos, tales como fosfatos de alquilo y de
arilo (en los que el oxígeno fosfonato cargado se sustituye por un
grupo alquilo o arilo), el fosfodiéster y los fosfotriésteres de
alquilo, en los que el resto de oxígeno cargado está alquilado. Los
oligonucleótidos pueden contener diol, tal como tetraetilenglicol o
hexaetilenglicol, tanto en uno como en ambos extremos, también se ha
observado que son sustancialmente resistentes a la degradación con
nucleasas.
Las secuencias de ácido nucleico de la invención
que son útiles como aditivos de la mucosa, son las descritas
ampliamente más arriba y descritas en el documento de la publicación
de la solicitud de patente PCT nº WO 98/18810, que reivindica la
prioridad de los documentos de patentes de EE.UU. con nº de serie
08/738.652 y 08/960.774, presentadas el 30 de octubre de 1996 y el
30 de octubre de 1997, respectivamente. Secuencias a modo de
ejemplo, incluyen las secuencias inmunoestimuladoras mostradas en la
Tabla 1, sin estar limitadas a las mismas.
El índice de estimulación de un ADN de CpG
inmunoestimulador en particular se puede someter a diversos ensayos
celulares inmunes. Preferentemente, el índice de estimulación del
oligonucleótido CpG en relación con la proliferación de linfocitos
B, es al menos aproximadamente 5, preferentemente al menos
aproximadamente 10, más preferentemente al menos aproximadamente 15
y lo más preferible al menos aproximadamente 20, tal y como se
determina por la incorporación de ^{3}H-uridina,
en un cultivo de linfocitos B de múridos que se había puesto en
contacto con 20 \muM de oligonucleótido durante 20 h a 37ºC y que
se había sometido a impulsos con 1 \muCi de
^{3}H-uridina; se recolectó y se contó 4 h
después, tal y como se describe con más detalles en el documento de
la publicación de la solicitud de patente PCT nº WO 98/18810, que
reivindica prioridad de los documentos de patentes de EE.UU. con nº
de serie 08/738.652 y 08/960.774, presentadas el 30 de octubre de
1996 y el 30 de octubre de 1997, respectivamente. Para el uso in
vivo, por ejemplo, es importante que el oligonucleótido CpG sea
capaz de inducir eficazmente la expresión de IgA.
El oligonucleótido CpG se puede administrar
junto con otro aditivo de la mucosa. Se ha descubierto de acuerdo
con la invención, que la combinación de un oligonucleótido CpG y un
aditivo de la mucosa producen una respuesta inmune sinérgica. Cuando
el oligonucleótido CpG se administra junto con otro aditivo, el
oligonucleótido CpG se puede administrar antes, después y/o
simultáneamente con el otro aditivo de la mucosa. Por ejemplo, el
oligonucleótido CpG se puede administrar con una dosis de
sensibilización de antígeno. Uno o ambos aditivos se pueden
administrar a continuación con la dosis de refuerzo.
Alternativamente, el oligonucleótido CpG se puede administrar con
una dosis de refuerzo del antígeno. Uno o ambos aditivos se pueden
administrar entonces con la dosis de sensibilización.
Adicionalmente, se ha descubierto que la
inmunidad de la mucosa se puede inducir mientras que se administre
una de las dosificaciones de oligonucleótido CpG a la superficie
mucosa. Otras dosis se pueden administrar sistémicamente o a través
de la mucosa, sin afectar a la inducción de la respuesta inmune. Por
ejemplo, se puede sensibilizar al individuo mediante la entrega del
antígeno y del oligonucleótido CpG en la mucosa, con o sin otros
aditivos de la mucosa y se puede reforzar por vía parenteral (p.
ej., intramuscular, intradérmica o subcutánea) de entrega del
antígeno aislado, con oligonucleótidos CpG, con un aditivo no
oligonucleótido o una combinación de aditivos que pueden incluir o
no al oligonucleótido CpG. Alternativamente, la dosis de
sensibilización se puede entregar parenteralmente y el refuerzo a
través de la mucosa, empleando la invención. Todos estos
acercamientos pueden inducir fuertes respuestas inmunes sistémicas y
mucosas. Por tanto, los métodos de la invención incluyen la
administración de al menos una dosis, de sensibilización o de
refuerzo o ambas, a la superficie de la mucosa. Las otras dosis de
oligonucleótido CpG se pueden administrar a través de la mucosa o
sistémicamente.
Una "dosis de sensibilización" es la
primera dosis de antígeno administrada al individuo. En el caso de
un individuo que tiene una infección, la dosis de sensibilización
puede ser la exposición inicial del individuo al microbio infeccioso
(exposición pasiva) y de este modo, la administración posterior
intencionada de antígeno (exposición activa) con oligonucleótido
CpG, se convierte en la dosis de refuerzo. Una "dosis de
refuerzo" es una segunda, tercera, etc. dosis de antígeno,
administrada a un individuo que ya se ha expuesto al antígeno. En
algunos casos, la dosis de sensibilización administrada con el
oligonucleótido CpG es tan eficaz, que no es necesaria una dosis de
refuerzo para proteger a un individuo con riesgo de infección, de
ser infectado.
El individuo está expuesto al antígeno. Tal y
como se emplea en esta memoria, el término "expuesto a" se
refiere a la etapa activa de puesta en contacto del individuo con un
antígeno o a la exposición pasiva del individuo con el antígeno
in vivo. Los métodos para la exposición activa de un
individuo a un antígeno son bien conocidos en la técnica. En
general, un antígeno se administra directamente al individuo a
través de cualquier medio, tal como la administración intravenosa,
intramuscular, oral, transdérmica, mucosa, intranasal, intratraqueal
o subcutánea. El antígeno se puede administrar sistémica o
localmente. Los métodos para administrar el antígeno y el
oligonucleótido CpG se describen a continuación con más detalle. Un
individuo está expuesto pasivamente a un antígeno, si un antígeno
está disponible para exponerlo a las células inmunes del cuerpo. Un
individuo se puede exponer pasivamente a un antígeno, por ejemplo,
por la entrada de un agente patógeno extraño en el cuerpo o por el
desarrollo de una célula tumoral que expresa un antígeno extraño en
su superficie. Cuando un individuo está expuesto pasivamente a un
antígeno, se prefiere en ciertas realizaciones que el
oligonucleótido CpG sea un oligonucleótido de 8-100
nucleótidos de longitud y/o que tenga un esqueleto modificado de
fosfato.
Los métodos en los que un individuo se expone
pasivamente a un antígeno pueden depender particularmente de la
sincronización del oligonucleótido CpG. Por ejemplo, a un individuo
con riesgo de desarrollar un cáncer o una enfermedad infecciosa o
una respuesta alérgica o asmática, se le puede administrar el
oligonucleótido CpG de forma regular, cuando el riesgo es mayor, es
decir, durante la época de la alergia o después de una exposición a
un agente cancerígeno. Adicionalmente, el oligonucleótido CpG se
puede administrar a viajeros antes del viaje a países extraños, en
donde existe el riesgo de exposición a agentes infecciosos. De forma
similar, el oligonucleótido CpG se puede administrar a soldados o a
civiles con riesgo de exposición a armas biológicas, para inducir
una respuesta inmune mucosa frente al antígeno cuando el individuo
se exponga a las mismas y en el caso de que se exponga.
Un "antígeno" tal y como se emplea en esta
memoria, es una molécula capaz de provocar una respuesta inmune. Los
antígenos incluyen, sin estar limitados a los mismos, células,
extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos,
polisacáridos, conjugados de polisacáridos, miméticos peptídicos de
polisacáridos, lípidos, glicolípidos, carbohidratos, virus y
extractos víricos y organismos multicelulares, tales como parásitos
y alérgenos. El término antígeno incluye ampliamente cualquier tipo
de molécula que sea reconocida como extraña por el sistema inmune de
un hospedador. Los antígenos incluyen, sin estar limitados, a los
mismos antígenos del cáncer, antígenos microbianos y alérgenos.
Un "antígeno del cáncer" tal y como se
emplea en esta memoria, es un compuesto, tal como un péptido o una
proteína, asociado con una superficie de célula cancerígena o
tumoral y que es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se
expresa en la superficie de una célula presentadora de antígenos, en
el contexto de una molécula del MHC. Los antígenos del cáncer se
pueden preparar a partir de células cancerígenas, preparando
extractos en bruto de células cancerígenas, por ejemplo, tal y como
describen Cohen y col., 1994, Cancer Research, 54:1055,
purificando parcialmente los antígenos, por tecnología recombinante
o por síntesis de nuevo de antígenos conocidos. Los antígenos del
cáncer incluyen antígenos que son recombinantemente una parte
inmunogénica de un tumor o cáncer completo. Tales antígenos se
pueden aislar o preparar de forma recombinante o mediante cualquier
otro medio conocido en la técnica.
Un "antígeno microbiano" tal y como se
emplea en esta memoria, es un antígeno de un microorganismo e
incluye, sin estar limitado a los mismos, los virus infecciosos, las
bacterias infecciosas, los parásitos infecciosos y los hongos
infecciosos. Tales antígenos incluyen el microorganismo intacto así
como material aislado natural y fragmentos o derivados del mismo y
también compuestos sintéticos que son idénticos o similares a los
antígenos de microorganismos naturales e inducen una respuesta
inmune específica para ese microorganismo. Un compuesto es similar a
un antígeno natural del microorganismo, si éste induce una respuesta
inmune (humoral y/o celular) frente a un antígeno natural del
microorganismo. Tales antígenos se emplean de forma rutinaria en la
técnica y son bien conocidos por los expertos en la materia.
Ejemplos de virus infecciosos que se han
encontrado en seres humanos incluyen, sin limitarse a los mismos:
Retroviridae (p. ej., los virus de la inmunodeficiencia
humana, tales como VIH-1 (también denominado
HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o
VIH-III); y otros materiales aislados, tales como
VIH-LP; Picornaviridae (p. ej., los virus de
la polio, el virus de la hepatitis A; enterovirus, los virus de
Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (p.
ej., cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (p. ej.,
virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola);
Flaviridae (p. ej., los virus del dengue, los virus de la
encefalitis, los virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae
(p. ej., coronavirus); Rhabdoviridae (p. ej., virus de la
estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (p.
ej., los virus ébola); Paramyxoviridae (p. ej., virus de la
parainfluenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus
respiratorio sincitial); Orthomyxoviridae (p. ej., los virus
de la gripe); Bungaviridae (p. ej., virus de Hantaan, virus
bunga, flebovirus y virus de Nairo); Arenaviridae (p. ej.,
virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (p. ej.,
reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae;
Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B); Parvoviridae
(parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma virus del
polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus);
Herpesviridae (virus herpes simplex (VHS) 1 y 2, virus de la
varicela zoster, citomegalovirus (CMV), herpesvirus;
Poxviridae (virus de la variola, virus vaccinia, virus de la
viruela); e Iridoviridae (p. ej., virus de la fiebre del
cerdo africano); y virus sin clasificar (p. ej., agentes etiológicos
de la encefalitis espongiforme, el agente de la hepatitis delta (se
piensa que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B),
los agentes de la hepatitis no A y no B (clase 1 = transmitido
internamente; clase 2 = transmitido parenteralmente (es decir,
hepatitis C); virus Norwalk y virus relacionados, y astrovirus).
Las bacterias gram negativas y las gram
positivas sirven como antígenos en animales vertebrados. Tales
bacterias gram positivas incluyen, sin estar limitadas a las mismas,
la especie Pasteurella, la especie Staphylococci y la
especie Streptococcus. Las bacterias gram negativas incluyen,
sin estar limitadas a las mismas, Escherichia coli, especies
de Pseudomonas y especies de Salmonella. Ejemplos
específicos de bacterias infecciosas incluyen, sin estar limitados a
los mismos: Helicobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella
pneumophilia, Mycobacteria sps (p. ej., M. tuberculosis, M.
avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae)
Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria
meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes
(grupo A de Streptococcus), Streptococcus agalactiae
(grupo B de Streptococcus), Streptococcus (grupo
viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis,
Streptococcus (sps. Anaeróbica), Streptococcus
pneumoniae, Campylobacter sp. patógeno,
Entero-coccus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus
antracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp.,
Erysipelo-thrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers,
Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae,
Pasteurella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum,
Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema
partenus, Leptospira, Rickettsia y Actinomyces
israelli.
Ejemplos de hongos infecciosos incluyen
Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum,
Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis,
Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Otros
organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen:
Plasmodium, tal como Plasmodium falciparum,
Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium
vivax y Toxoplasma gondii.
Otros microorganismos de importancia médica se
han descrito a fondo en la bibliografía, p. ej., véase C. G. A
Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Reino Unido
1983.
Aunque muchos de los antígenos microbianos
descritos anteriormente se refieren a enfermedades humanas, la
invención también es útil para tratar a otros vertebrados no
humanos. Los vertebrados no humanos también son capaces de
desarrollar infecciones que se pueden evitar o tratar con los
oligonucleótidos CpG, descritos en esta memoria. Por ejemplo, además
del tratamiento de enfermedades humanas infecciosas, los métodos de
la invención son útiles para tratar infecciones de animales.
Tal y como se emplea en esta memoria, el término
"tratar", cuando se emplea en relación con una enfermedad
infecciosa, se refiere a un tratamiento profiláctico que incrementa
la resistencia de un individuo (un individuo con riesgo de
infección) frente a la infección con un agente patógeno o, con otras
palabras, disminuye la probabilidad de que el individuo se infecte
con el agente patógeno, así como un tratamiento después de que el
individuo (un individuo que está infectado) se haya infectado, para
combatir la infección, p. ej., reducir o eliminar la infección o
evitar que empeore.
Muchas vacunas para el tratamiento de
vertebrados no humanos están descritas por Bennett K., Compendium
of Veterinary Products, 3ª ed. North American Compendiums, Inc.,
1995. Tal y como se ha descrito anteriormente, los antígenos
incluyen microbios infecciosos tales como virus, bacterias y hongos
y fragmentos de los mismos, obtenidos a partir de fuentes naturales
o de forma sintética. Los virus infecciosos de vertebrados humanos y
no humanos incluyen los retrovirus, los virus de ARN y los virus de
ADN. Este grupo de retrovirus incluye los retrovirus simples y los
retrovirus complejos. Los retrovirus simples incluyen los subgrupos
de los retrovirus de tipo B, los retrovirus de tipo C y los
retrovirus de tipo D. Un ejemplo de retrovirus de tipo B es el virus
del tumor de mama de ratón (MMTV). Los retrovirus de tipo C incluyen
los subgrupos del grupo A tipo C (que incluyen el virus del sarcoma
de Rous (RSV), el virus de la leucemia aviar (AVL) y el virus de la
mieloblastosis aviar (AMV)) y del grupo B tipo C (que incluyen el
virus de la leucemia de múridos (MLV), el virus de la leucemia de
felinos (FeLV), el virus del sarcoma de múridos (MSV), el virus de
la leucemia del primate gibón (GALV), el virus de la necrosis del
bazo (SNV), el virus de la reticuloendoteliosis (RV) y el virus del
sarcoma de simios (SSV)). Los retrovirus de tipo D incluyen el virus
de mono Mason-Pfizer (MPMV) y el retrovirus de simio
de tipo 1 (SRV-1). Los retrovirus complejos
incluyen los subgrupos de lentivirus, los virus de la leucemia de
linfocitos T y los espumavirus. Los lentivirus incluyen el
VIH-1, pero también incluyen el
VIH-2, VIS, el virus Visna, el virus de la
inmunodeficiencia felina (VIF) y los virus de la anemia infecciosa
de équidos (EIAV). Los virus de la leucemia de linfocitos T incluyen
HTLV-1, HTLV-II, el virus de la
leucemia de linfocitos T de simios (STLV) y el virus de la leucemia
bovina (BLV). Los espumavirus incluyen el espumavirus humano (HFV),
el espumavirus de simio (SFV) y el espumavirus bovino (BFV).
Ejemplos de otros virus de ARN que son antígenos
en animales vertebrados incluyen los siguientes, sin estar limitados
a los mismos: los miembros de la familia Reoviridae que incluye el
género Orthoreovirus (serotipos múltiples de retrovirus de mamíferos
y aviar), el género Orbivirus (virus de la lengua azul, virus de
Eugenangee, virus de Kemerovo, virus de la náusea de caballo
africano y virus de la fiebre de garrapata de Colorado), el género
Rotavirus (rotavirus humanos, virus de la diarrea de ternera de
Nebrasca, rotavirus de múridos, rotavirus de simios, rotavirus
bovinos u ovinos, rotavirus aviares); la familia Picornaviridae que
incluye el género Enterovirus (poliovirus, virus A y B de Coxsackie,
echovirus, virus de la hepatitis A, enterovirus de simio, virus de
la encefalomielitis de múrido (ME), poliovirus muris, enterovirus
bovino, enterovirus porcino, el género Cardiovirus (virus de la
encefalomiocarditis (EMC), Mengovirus), el género Rinovirus
(rinovirus humanos que incluyen al menos 113 subtipos; otros
rinovirus), el género Aftovirus (fiebre aftosa (FMDV); la familia
Caliciviridae, que incluye el virus vesicular del exantema de cerdo,
el virus del león marino de San Miguel, el picornavirus felino y el
virus de Norwalk; la familia Togaviridae que incluye el género
Alfavirus (virus de la encefalitis equina americana oriental, virus
del bosque Semliki, virus Sindbis, virus Chikungunya, virus
O'Nyong-Nyong, virus del río Ross, virus de la
encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina
americana occidental), el género Flavivirus (virus de la fiebre
amarilla de mosquitos, virus del dengue, virus de la encefalitis
japonesa, virus de la encefalitis de St Louis, virus de la
encefalitis del valle de Murray, virus del Nilo occidental, virus
Kunjin, virus de garrapatas de Europa central, virus de garrapatas
de lejano oriente, virus del bosque Kyasanur, virus del mal de
Louping III, virus Powassan, virus de la fiebre hemorrágica de
Omsk), el género Rubivirus (virus de la rubéola), el género
Pestivirus (virus de la enfermedad mucosa, virus del cólera Hog,
virus de la enfermedad de Border); la familia Bunyaviridae que
incluye el género Bunyvirus (virus Buyamwera y virus relacionados,
virus del grupo de la encefalitis de California), el género
Flebovirus (virus siciliano de la fiebre de la mosca de los
arenales, virus de la fiebre del valle del Rift), el género
Nairovirus (virus de la fiebre hemorrágica de
Crimea-Congo, virus de la enfermedad bovina de
Nairobi) y el género UUkuvirus (virus UUkuniemi y virus
relacionados); la familia Orthomyxoviridae que incluye el género
influenzavirus (virus de la influenza de tipo A, muchos subtipos
humanos); virus de la influenza porcina y virus de la influenza
aviar y equina; influenza de tipo B (muchos subtipos humanos) e
influenza de tipo C (género posiblemente separado); la familia
paramyxoviridae que incluye el género Paramyxovirus (virus de la
parainfluenza de tipo 1, virus Sendai, virus de la hemoadsorción,
virus de la parainfluenza de tipo 2 a 5, virus de la enfermedad de
Newcastle, virus de las paperas), el género Morbillivirus (virus del
sarampión, virus de la panencefalitis esclerosante subaguda, virus
del moquillo, virus de la peste vacuna), el género Pneumovirus
(virus respiratorio sincitial (RSV), virus respiratorio sincitial
bovino y virus de la neumonía de ratones); la familia Rhabdoviridae
que incluye el género Vesiculovirus (VSV), (virus Chandipura, virus
del parque Flanders-Hart), el género Lyssavirus
(virus de la rabia), Rhabdovirus de peces y dos Rhabdovirus
probables (virus de Marburg y virus de Ebola); la familia
Arenaviridae que incluye el virus de la coriomeningitis linfocítica
(LCM), el complejo del virus Tacaribe y el virus Lassa; la familia
Coronaviridae que incluye el virus de la bronquitis infecciosa
(IBV), el virus de la hepatitis de ratón, coronavirus entérico
humano y peritonitis infecciosa felina (coronavirus
felino).
felino).
Los virus de ADN ilustrativos que son antígenos
de los animales vertebrados incluyen, sin estar limitados a los
mismos: la familia Poxviridae que incluye el género Orthopoxvirus
(variola major, variola minor, virus de la viruela del mono, virus
de la viruela de la vaca, virus de la viruela del búfalo, virus de
la viruela del conejo, ectromelia), el género Leporipoxvirus
(mixoma, fibroma), el género avipoxvirus (virus de la viruela aviar,
otros poxvirus aviares), el género Capripoxvirus (virus de la
viruela de la oveja, virus de la viruela de la cabra), el género
Suipoxvirus (virus de la viruela del cerdo), el género Parapoxvirus
(virus de la dermatitis postular contagiosa, virus de la
seudoviruela bovina, virus de la estomatitis papular bovina); la
familia Iridoviridae (virus de la peste porcina africana, virus de
la rana 2 y 3, virus del linfoquiste del pez); la familia
Herpesviridae que incluye los alfaherpesvirus (herpes simplex tipos
1 y 2, varicela -zóster, virus del aborto equino, herpesvirus equino
2 y 3, virus de la seudorrabia, virus de la queratoconjuntivitis
infecciosa bovina, virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina,
virus de la rinotraqueitis felina, virus de la laringotraqueitis
infecciosa) los betaherpesvirus (citomegalovirus humano y
citomegalovirus de cerdos, monos y roedores); los gammaherpesvirus
(virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la enfermedad
de Marek, Herpes saimiri, herpesvirus ateles, herpesvirus
sylvilagus, herpesvirus del cobaya, virus del tumor de Lucke); la
familia Adenoviridae que incluye el género Mastadenovirus (subgrupos
humanos A, B, C, D, E y no agrupados; adenovirus de simio (al menos
23 serotipos), hepatitis canina infecciosa y adenovirus de vacas,
cerdos, ovejas, ranas y muchas otras especies, el género
Aviadenovirus (adenovirus aviares); y adenovirus no cultivables; la
familia Papoviridae que incluye el género papilomavirus
(papilomavirus humanos, papilomavirus bovinos, papilomavirus de
conejo Shope y varios papilomavirus patógenos de otras especies), el
género poliomavirus (poliomavirus, agente de vacuolación de simios
(SV-40), agente de vacuolación de conejo (RKV),
virus K, virus BK, virus JC y otros poliomavirus de primates tales
como el papilomavirus linfotrópico); la familia Parvoviridae que
incluye el género de virus adenoasociados, el genéro Parvovirus
(virus de la panleucopenia felina, parvovirus bovino, parvovirus
canino, virus de la enfermedad aleutiana del visón, etc.).
Finalmente, los virus de ADN pueden incluir virus que no se ajustan
a las anteriores familias, tales como los virus de la enfermedad de
Kuru y de Creutzfeldt-Jacob y los agentes
neuropáticos infecciosos crónicos (virus CHINA).
Cada una de las listas anteriores son
ilustrativas y no pretenden ser limitantes.
Además del uso de los oligonucleótidos CpG para
inducir una respuesta inmune específica del antígeno en humanos, los
productos o las composiciones de las realizaciones preferidas son
muy adecuados para el tratamiento de aves, tales como gallinas,
pollos, pavos, patos, ocas, codornices y faisanes. Las aves son las
dianas iniciales para muchos tipos de infecciones.
Las aves recién salidas del huevo están
expuestas a microorganismos patógenos poco después de la eclosión.
Aunque estas aves están protegidas inicialmente contra los agentes
patógenos, por los anticuerpos obtenidos maternalmente, esta
protección es sólo temporal y el propio sistema inmune inmaduro del
ave tiene que empezar a proteger al ave de los agentes patógenos.
Normalmente es deseable evitar la infección en aves jóvenes cuando
son lo más susceptibles. También es deseable evitar la infección en
aves de más edad, especialmente cuando las aves se albergan en
alojamientos cerrados, que conducen a una rápida extensión de la
enfermedad. Por tanto, es deseable administrar el oligonucleótido
CpG y el aditivo que no sea de ácido nucleico de la invención, a las
aves para mejorar una respuesta inmune específica del antígeno
cuando el antígeno está presente.
Un ejemplo de una infección común en los pollos,
es el virus de la anemia infecciosa del pollo (CIAV). El CIAV se
aisló en primer lugar en Japón en 1979 durante una investigación de
una pausa de la vacunación contra la enfermedad de Marek (Yuasa y
col., 1979, Avian Dis. 23:366-385). Durante ese
tiempo, el CIAV se había detectado en aves de corral comerciales en
todos los países importantes productores de aves de corral (van
Bulow y col., 1991, págs. 690-699) en Diseases of
Poultry, 9ª edición, Iowa State University Press).
La infección con CIAV da como resultado una
enfermedad clínica, caracterizada por anemia, hemorragia e
inmunosupresión, en pollos jóvenes susceptibles. La atrofia del timo
y de la médula ósea y las lesiones constantes de los pollos
infectados con el CIAV, son también características de la infección
con CIAV. El agotamiento celular de los linfocitos en el timo y,
ocasionalmente, en la bolsa de Fabricio, es el resultado de la
inmunosupresión y de una susceptibilidad incrementada a infecciones
secundarias víricas, bacterianas o fúngicas, que entonces complican
el curso de la enfermedad. La inmunosupresión puede producir un
agravamiento de la enfermedad después de la infección con uno o
varios de los virus de la enfermedad de Marek (MDV), el virus de la
bursitis infecciosa, el virus de la reticuloendoteliosis, el
adenovirus o el reovirus. Se ha descrito que la patogénesis del MDV
se potencia con el CIAV (DeBoer y col., 1989, pág. 28 En Proceedings
of the 38th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Arizona).
Además, se ha descrito que el CIAV agrava los signos de la bursitis
infecciosa (Rosenberger y col., 1989, Avian Dis.
33:707-713). Los pollos desarrollan una resistencia
con la edad a la enfermedad inducida experimentalmente, debido a
CAA. Esta se completa esencialmente a la edad de 2 semanas, pero las
aves mayores todavía son susceptibles de contraer la enfermedad
(Yuasa, N. y col., 1979, supra; Yuasa, N. y col., Avian
Diseases 24, 202-209, 1980). Sin embargo, si los
pollos se infectan por partida doble con CAA y un agente
inmunosupresor (IBDV, MDV, etc.), se retrasa la resistencia a la
enfermedad con la edad (Yuasa, N. y col., 1979 y 1980 más arriba;
Bulow von V. y col., J. Veterinary Medicine 33,
93-116, 1986). Las características del CIAV que
pueden potenciar la transmisión de la enfermedad, incluyen una alta
resistencia a la inactivación por el entorno y algunos
desinfectantes comunes. El impacto económico de la infección con
CIAV en la industria de las aves de corral está claro por el hecho
de que 10% a 30% de las aves infectadas en epidemias con la
enfermedad, mueren.
La vacunación de las aves, del mismo modo que de
otros animales vertebrados, se puede realizar a cualquier edad.
Generalmente, las vacunaciones con un microorganismo vivo se
realizan hasta las 12 semanas de edad y entre 14-18
semanas con un microorganismo inactivado u otro tipo de vacuna. Para
la vacunación del huevo, la vacunación se puede realizar en la
última cuarta parte del desarrollo embrionario. La vacuna se puede
administrar por vía subcutánea, con aerosol, oral, intraocular,
intratraqueal, nasal o por otros métodos de administración a la
mucosa, descritos en esta memoria. Por tanto, el oligonucleótido CpG
de la invención se puede administrar a las aves y a otros
vertebrados no humanos, empleando planes de vacunación rutinarios y
el antígeno se administra después de un periodo de tiempo adecuado,
tal y como se ha descrito en esta memoria.
El ganado vacuno y el ganado de granja también
son susceptibles de contraer la infección. La enfermedad que afecta
a estos animales puede producir grandes pérdidas económicas,
especialmente entre el ganado vacuno. Los métodos de la invención se
pueden utilizar para proteger contra la infección el ganado, tal
como las vacas, los caballos, los cerdos, las ovejas y las
cabras.
Las vacas se pueden infectar con virus bovinos.
El virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) es un pequeño virus de
ARN de cadena positiva con envuelta y se clasifica en el género
pestivirus junto con el virus del cólera de cerdos (HOCV) y el mismo
de la enfermedad de la frontera bovina (BDV). Aunque los Pestivirus
se han clasificado previamente en la familia Togaviridae, algunos
estudios han sugerido su reclasificación en la familia Flaviviridae,
junto con los grupos del flavivirus y el virus de la hepatitis C
(HCV) (Francki y col., 1991).
El BVDV que es un agente patógeno importante del
ganado, se puede distinguir, basándose en análisis de cultivo
celular, en biotipos citopatógenos (CP) y no citopatógenos (NCP). El
biotipo NCP está más extendido, aunque ambos biotipos se pueden
encontrar en el ganado. Si una vaca gestante se infecta con una cepa
NCP, la vaca puede parir un ternero infectado de forma persistente y
específicamente inmunotolerante que extenderá el virus durante toda
su vida. El ganado infectado de forma persistente puede sucumbir a
la enfermedad de la mucosa y se pueden aislar ambos biotipos en el
animal. Las manifestaciones clínicas pueden incluir el aborto, la
teratogénesis y los problemas respiratorios, la enfermedad de la
mucosa y la diarrea suave. Además, se ha descrito una
trombocitopenia aguda, asociada con epidemias en el rebaño que
pueden conducir a la muerte del animal y las cepas asociadas con
esta enfermedad parecen ser más virulentas que las BVDVs
clásicas.
Los herpesvirus equinos (EHV) comprenden un
grupo de agentes biológicos, antigénicamente distintos que causan
una variedad de infecciones en los caballos, desde la enfermedad
subclínica a la muerte. Estos incluyen el herpesvirus equino 1
(EHV-1), un agente patógeno omnipresente en los
caballos, el EHV-1 está asociado con epidemias de
abortos, enfermedad del tracto respiratorio y trastornos del sistema
nervioso central. La infección primaria del tracto respiratorio
superior de caballos jóvenes, da como resultado una enfermedad
febril que dura de 8 a 10 días. Yeguas que ya han tenido el contacto
inmunológico, se pueden infectar de nuevo a través del tracto
respiratorio sin que sea evidente la enfermedad, de modo que el
aborto tiene lugar generalmente sin un aviso previo. El síndrome
neurológico está asociado con la enfermedad respiratoria o el aborto
y puede afectar a animales de cualquier sexo o edad, conduciendo a
descoordinación, debilidad y parálisis posterior (Telford, E. A. R.
y col., Virology 189, 304-316, 1992). Otros EHVs
incluyen el EHV-2 o el citomegalovirus equino, el
EHV-3, el virus del exantema coital equino y el
EHV-4, anteriormente clasificado como
EHV-1 subtipo 2.
Las ovejas y las cabras se pueden infectar con
una variedad de microorganismos peligrosos que incluyen el
visna-maedi.
Los primates, tales como los monos, los simios y
los macacos se pueden infectar con el virus de la inmunodeficiencia
de simios. Se ha descrito que vacunas inactivadas de
células-virus y exentas de células para la
inmunodeficiencia de simios, proporcionan protección en macacos
(Stott y col. (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers
y col. PNAS USA (1989) 86:6353-6357;
Murphey-Corb y col. (1989) Science
246:1293-1297; y Carlson y col. (1990) AIDS Res.
Human Retroviruses 6:1239-1246). De una vacuna
recombinante gp 120 contra VIH, se ha descrito que concede
protección en chimpancés (Beman y col. (1990) Nature
345:622-625).
Los gatos, tanto domésticos como silvestres, son
susceptibles de sufrir infección con una variedad de
microorganismos. Por ejemplo, la peritonitis infecciosa felina es
una enfermedad que aparece en los gatos domésticos y silvestres
tales como leones, leopardos, guepardos y jaguares. Cuando se desea
evitar la infección con este o con otros tipos de organismos
patógenos en los gatos, los productos y las composiciones de la
invención se pueden utilizar para vacunar a los gatos para
protegerlos de las infecciones.
Los gatos domésticos se pueden infectar con
diversos retrovirus, que incluyen sin estar limitados a los mismos,
el virus de la leucemia felina (FeLV), el virus del sarcoma felino
(FeSV), el oncomavirus endógeno de tipo C (RD-114) y
el virus formador de sincitios felino (FeSFV). De todos ellos, el
FeLV es el más patógeno, causando diversos síntomas, que incluyen
los neoplasmas linforreticulares y mieloides, anemias, trastornos
mediados por el sistema inmune y un síndrome de inmunodeficiencia
que es similar al síndrome de inmunodeficiencia adquirida humano
(SIDA). Recientemente, se ha asociado más particularmente un mutante
de FeLV en particular, defectuoso para la replicación, denominado
FeLV-SIDA, con propiedades inmunosupresoras.
El descubrimiento del lentivirus
linfotrópico-T felino (también denominado
inmunodeficiencia felina), ha sido descrito en primer lugar por
Pedersen y col. (1987) Science 235:790-793; las
características del FIV han sido descritas por Yamamoto y col.
(1988) Leukemia, suplemento de diciembre
2:204S-215S; Yamamoto y col. (1988) Am. J. Vet. Res.
49:1246-1258; y Ackley y col. (1990) J. Virol.
64:5652-5655. La clonación y el análisis de las
secuencias del FIV han sido descritos por Olmsted y col. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2448-2452 y
86:4355-4360.
La peritonitis infecciosa felina (FIP) es una
enfermedad esporádica que aparece de modo impredecible en los
felinos domésticos y silvestres. Aunque la FIP es en primer lugar
una enfermedad de los gatos domésticos, se ha diagnosticado en
leones, pumas, leopardos, guepardos y el jaguar. Los gatos
silvestres menores que han padecido FIP incluyen el lince, el
caracal, el gato del desierto y el gato pallas. En los gatos
domésticos, la enfermedad tiene lugar predominantemente en animales
jóvenes, aunque los gatos de todas las edades son susceptibles. Un
pico de incidencia existe entre los 6 y los 12 meses de edad. Una
disminución de la incidencia se observa desde los 5 hasta los 13
años de edad, seguido por una incidencia incrementada en los gatos
de 14 y 15 años de edad.
Las enfermedades víricas, bacterianas y
parasitarias en pescados y mariscos u otras formas de vida acuática,
plantean un serio problema a la industria de la acuicultura. Debido
a la alta densidad de animales en los tanques de cultivo de huevos o
en las áreas cerradas de granjas marinas, las enfermedades
infecciosas pueden eliminar una gran proporción de las reservas de,
por ejemplo, peces, mariscos u otras formas de vida acuática en la
instalación. Frente a estas amenazas, la prevención de la enfermedad
es un tratamiento más deseado que la intervención una vez que se
desarrolla la enfermedad. La vacunación de los peces es el único
método preventivo que puede ofrecer una protección a largo plazo
mediante la inmunidad. Las vacunaciones que se basan en el ácido
nucleico están descritas en el documento de patente de EE.UU. nº
5.780.448, expedida a Davis.
El sistema inmune de los peces tiene muchas
características similares al sistema inmune de los mamíferos, tales
como la presencia de linfocitos B, linfocitos T, linfoquinas,
complemento e inmunoglobulinas. Los peces tienen subclases de
linfocitos que tienen un papel que parece similar en muchos aspectos
al de los linfocitos B y T de los mamíferos. Las vacunas se pueden
administrar por inmersión u oralmente.
Las especies de acuicultura incluyen, sin estar
limitadas a las mismas, los peces, los mariscos y otros animales
acuáticos. Los peces incluyen todos los peces vertebrados que pueden
ser peces óseos o cartilaginosos, tales como por ejemplo, los
salmónidos, las carpas, los siluros, las pangas, los meros y las
seriolas. Los salmónidos son una familia de peces que incluyen la
trucha (incluida la trucha arcoiris), el salmón y la trucha
asalmonada. Ejemplos de mariscos incluyen, sin estar limitados a los
mismos, las almejas, las langostas, las gambas, los cangrejos y las
ostras. Otros animales acuáticos incluyen, sin estar limitados a los
mismos, las anguilas, los calamares y los pulpos.
Los polipéptidos de agentes patógenos víricos de
acuicultura incluyen, sin estar limitados a los mismos, la
glicoproteína (G) o la nucleoproteína (N) del virus de la septicemia
hemorrágica vírica (VHSV); las proteínas G o N del virus de la
necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV); las proteínas
estructurales VP1, VP2, VP3 o N del virus de la necrosis pancreática
infecciosa (IPNV); la proteína G de la viremia primaveral de la
carpa (SVC); y una proteína asociada a la membrana, tegumina o
proteína de la cápsida o glicoproteína del virus canal del pez gato
(CCV).
Los polipéptidos de los agentes patógenos
bacterianos incluyen, sin estar limitados a los mismos, una proteína
de la membrana externa regulada con hierro (IROMP), una proteína de
la membrana externa (OMP) y una proteína A de Aeromonis
salmonicida que causa forunculosis, la proteína p57 de
Renibacterium salmoninarum que causa la enfermedad bacteriana
del riñón (BKD), el antígeno asociado a la superficie principal
(msa), una citotoxina expresada en la superficie (mpr), una
hemolisina expresada en la superficie (ish) y un antígeno flagelar
de Yersiniosis; una proteína extracelular (ECP), una proteína de la
membrana externa regulada con hierro (IROMP) y una proteína
estructural de Pasteurellosis; una OMP y una proteína flagelar de
Vibrosis anguillarum y V. ordalii; una proteína
flagelar, una proteína OMP, aroA y purA de Edwardsiellosis
ictaluri y E. tarda; y un antígeno de superficie de
Ichthyophthirius; y una proteína estructural y reguladora de
Cytophaga columnari; y una proteína estructural y reguladora
de Rickettsia.
Los polipéptidos de los agentes patógenos
parasitarios incluyen, sin estar limitados a los mismos, los
antígenos de superficie de Ichthyophthirius.
Un "alérgeno" se refiere a una sustancia
(antígeno) que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un
individuo susceptible. La lista de alérgenos es enorme y puede
incluir pólenes, venenos de insectos, caspa animal, esporas fúngicas
y fármacos (p. ej., penicilina). Ejemplos de alérgenos naturales de
animales y plantas incluyen, sin estar limitados a los mismos,
proteínas específicas de los siguientes géneros: Canine
(Canis familiaris); Dermatophagoides (p. ej.,
Dermatophagoides farinae); Felis (Felis
domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia;
Lolium (p. ej., Lolium perenne o Lolium
multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica);
Alternaria (Alternaria alternata); Alder;
Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula
verrucosa); quercus (Quercus alba); Olea
(Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris);
Plantago (p. ej., Plantago lanceolata);
Parietaria (p. ej., Parietaria officinalis o
Parietaria judaica); Blattella (p. ej., Blattella
germanica); Apis (p. ej., Apis multiflorum);
Cupressus (p. ej., Cupressus sempervirens,
Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa);
Juniperus (p. ej., Juniperus sabinoides, Juniperus
virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei);
Thuya (p. ej., Thuya orientalis); Chamaecyparis
(p. ej., Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (p. ej.,
Periplaneta americana); Agropyron (p. ej.,
Agropyron repens); Secale (p. ej., Secale
cereale); Triticum (p. ej., Triticum aestivum);
Dactylis (p. ej., Dactylis glomerata); Festuca
(p. ej., Festuca elatior); Poa (p. ej., Poa
pratensis o Poa compressa); Avena (p. ej.,
Avena sativa); Holcus (p. ej., Holcus lanatus);
Anthoxanthum (p. ej., Anthoxanthum odoratum);
Arrhenatherum (p. ej., Arrhenatherum elatius);
Agrostis (p. ej., Agrostis alba); Phleum (p.
ej., Phleum pratense); Phalaris (p. ej., Phalaris
arundinacea); Paspalum (p. ej., Paspalum notatum);
Sorghum (p. ej., Sorghum halepensis); y Bromus
(p. ej., Bromus inermis).
El antígeno puede ser un antígeno que está
codificado por un vector de ácido nucleico o puede no estar
codificado por un vector de ácido nucleico. En el primer caso, el
vector de ácido nucleico se administra al individuo y el antígeno se
expresa in vivo. En el último caso, el antígeno se administra
directamente al individuo. Un "antígeno no codificado en un vector
de ácido nucleico", tal y como se emplea en esta memoria, se
refiere a cualquier tipo de antígeno que no es un ácido nucleico.
Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención el antígeno no
codificado en un vector de ácido nucleico, es un polipéptido.
Modificaciones menores de las secuencias primarias de los
aminoácidos de los antígenos polipeptídicos, pueden dar como
resultado un polipéptido que tenga una actividad antigénica
sustancialmente equivalente comparada con la del polipéptido copia
no modificado. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, tal como
con la mutagénesis dirigida al sitio o pueden ser espontáneas. Todos
los polipéptidos producidos mediante estas modificaciones están
incluidos en esta memoria, mientras que siga existiendo la
antigenicidad. El polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido
vírico. Un ejemplo no limitativo de un antígeno útil de acuerdo con
la invención, es, están descritos en los Ejemplos a
continuación.
La expresión "purificado sustancialmente"
tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a un polipéptido
que está sustancialmente exento de otras proteínas, lípidos,
carbohidratos u otros materiales con los que está asociado
naturalmente. Un experto en la técnica puede purificar polipéptidos
víricos o bacterianos, empleando técnicas convencionales para la
purificación de proteínas. El polipéptido sustancialmente puro
mostrará frecuentemente una sola banda principal en un gel de
poliacrilamida no reductor. En el caso de polipéptidos parcialmente
glicosilados o los que tienen diversos codones de iniciación, puede
haber varias bandas en un gel de poliacrilamida no reductor, pero
estos formarán un patrón distintivo para ese polipéptido. La pureza
del polipéptido vírico o bacteriano también se puede determinar
mediante análisis de la secuencia de aminoácidos
amino-terminales.
La invención también emplea polinucleótidos que
codifican los polipéptidos antigénicos. Se ha observado que el
antígeno se puede administrar al individuo en una molécula de ácido
nucleico que codifica el antígeno, de modo que el antígeno se tenga
que expresar in vivo. Tales antígenos administrados al
individuo en un vector de ácido nucleico se denominan "antígenos
codificados por un vector de ácido nucleico". El ácido nucleico
que codifica el antígeno está ligado funcionalmente a una secuencia
de expresión génica que dirige la expresión del ácido nucleico del
antígeno en una célula eucariota. La "secuencia de expresión
génica" es cualquier secuencia reguladora de nucleótidos, tal
como una secuencia de promotor o una combinación de
promotor-potenciador, que facilita la transcripción
y la traducción eficaz del ácido nucleico del antígeno, al que está
ligado funcionalmente. La secuencia de expresión génica puede ser,
por ejemplo, un promotor de mamífero o vírico, tal como un promotor
constitutivo o inducible. Los promotores constitutivos de mamíferos
incluyen, sin estar limitados a los mismos, los promotores para los
siguientes genes:
hipoxantina-fosforribosil-transferasa
(HPTR), desaminasa de adenosina, quinasa de piruvato, promotor de
\beta-actina y otros promotores constitutivos.
Promotores víricos a modo de ejemplo que funcionan constitutivamente
en células eucariotas incluyen, por ejemplo, los promotores del
citomegalovirus (CMV), del virus de simio (p. ej.,
SV-40), del papilomavirus, del adenovirus, del virus
de la inmunodeficiencia humana (VIH), del virus de sarcoma de Rous,
del citomegalovirus, las repeticiones largas terminales (LTR) del
virus de la leucemia de Moloney y de otros retrovirus y el promotor
de la quinasa de timidina del virus del herpes simplex. Otros
promotores constitutivos son conocidos por los expertos ordinarios
en la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión
génica de la invención, también incluyen promotores inducibles. Los
promotores inducibles se expresan en presencia de un agente
inductor. Por ejemplo, el promotor de la metalotioneína se induce
para favorecer la transcripción y la traducción en presencia de
ciertos iones metálicos. Otros promotores inducibles son conocidos
por los expertos en la técnica.
En general, la secuencia de expresión génica
debe incluir, si es necesario, secuencias 5' que no se transcriben y
5' que no se traducen, implicadas en el inicio de la transcripción y
de la traducción, respectivamente, tales como la caja TATA, la
secuencia del casquete, la secuencia CAAT y similares.
Especialmente, las secuencias 5' que no se transcriben, incluirán
una región de promotor que incluye una secuencia de promotor para el
control de la transcripción del ácido nucleico del antígeno ligado
funcionalmente. Las secuencias de expresión génica incluyen
opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadoras
aguas arriba, según se desee.
El ácido nucleico del antígeno está ligado
funcionalmente a la secuencia de expresión génica. Tal y como se
emplea en esta memoria, la secuencia de ácido nucleico del antígeno
y la secuencia de expresión génica, se dice que están "ligadas
funcionalmente", cuando están ligadas covalentemente de modo que
la expresión o la transcripción y/o traducción de la secuencia que
codifica el antígeno, está bajo la influencia o el control de la
secuencia de expresión génica. Dos secuencias de ADN se dice que
están ligadas funcionalmente si la inducción de un promotor en la
secuencia 5' de expresión génica, da como resultado la transcripción
de la secuencia del antígeno y si la naturaleza de la ligación entre
las dos secuencias de ADN no da como resultado (1) la introducción
de una mutación de cambio de marco de lectura, (2) no interfiere con
la capacidad de la región del promotor para dirigir la transcripción
de la secuencia del antígeno o (3) no interfiere con la capacidad
del transcrito de ARN correspondiente, para ser traducido a una
proteína. Por tanto, una secuencia de expresión génica estaría
ligada funcionalmente a una secuencia de ácido nucleico de un
antígeno, si la secuencia de expresión génica es capaz de efectuar
la transcripción de la secuencia de ácido nucleico del antígeno, de
modo que el transcrito resultante se traduzca en la proteína o el
polipéptido deseado.
El ácido nucleico del antígeno de la invención
se puede entregar al sistema inmune de forma aislada o asociado con
un vector. En el sentido más amplio, un "vector" es cualquier
vehículo capaz de facilitar el transporte del ácido nucleico del
antígeno hasta las células del sistema inmune, de modo que el
antígeno se pueda expresar y ser presentado en la superficie de la
célula inmune. El vector generalmente transporta el ácido nucleico
hasta las células inmunes con una degradación reducida, en relación
con el grado de degradación que resultaría en ausencia del vector.
El vector incluye opcionalmente la secuencia de expresión génica
descrita anteriormente, para potenciar la expresión del ácido
nucleico del antígeno en las células inmunes. En general, los
vectores útiles en la invención incluyen, sin estar limitados a los
mismos, los plásmidos, los fagémidos, los virus, otros vehículos
obtenidos a partir de fuentes víricas o bacterianas que se han
manipulado mediante la inserción o la incorporación de secuencias de
ácido nucleico del antígeno. Los vectores víricos son un tipo
preferido de vector e incluyen, sin estar limitados a los mismos,
las secuencias de ácido nucleico procedentes de los siguientes
virus: retrovirus, tal como el virus de la leucemia de Moloney,
virus del sarcoma de múrido de Harvey, virus del tumor mamario de
múridos y virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus
adeno-asociados; virus de tipo
SV-40; poliomavirus; virus
Epstein-Barr; papilomavirus, herpesvirus; virus
vaccinia; poliovirus; y virus de ARN tales como un retrovirus.
También se pueden emplear cómodamente otros vectores no mencionados,
pero conocidos en la técnica.
Los vectores víricos preferidos se basan en
virus eucariotas no citopáticos en los que los genes no esenciales
se han sustituido por el gen de interés. Los virus no citopáticos
incluyen los retrovirus, cuyo ciclo de vida implica una
transcripción inversa del ARN vírico genómico en ADN, con una
integración posterior provírica en el ADN celular de un hospedador.
Los retrovirus han sido aceptados para ensayos de terapia génica en
humanos. Los más útiles, son los retrovirus que son deficientes para
la replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las
proteínas deseadas, pero incapaces de producir una partícula
infecciosa). Tales vectores de expresión retrovírica alterados
genéticamente, se emplean generalmente para la transducción de genes
in vivo, con alta eficacia. Protocolos convencionales para
producir retrovirus con replicación defectuosa (que incluyen las
etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido,
transfección de una línea celular de empaquetamiento con el
plásmido, producción de retrovirus recombinantes en la línea celular
de empaquetamiento, recolección de las partículas víricas a partir
de los medios de cultivo de tejidos e infección de las células diana
con las partículas víricas) han sido proporcionados por Kriegler,
M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", W. H.
Freeman C.O., Nueva York (1990) y Murry, E.J. compilador, "Methods
in Molecular Biology", vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New
Jersey (1991).
Un virus preferido para ciertas aplicaciones es
el virus adeno-asociado, un virus de ADN
bicatenario. El virus adeno-asociado se puede
preparar por ingeniería genética para que sea defectuoso para la
replicación y sea capaz de infectar una amplia gama de tipos y
especies celulares. También tiene ventajas tales como ser
termoestable y estable frente a disolventes lipídicos; altas
frecuencias de transducción en células de diversas estirpes,
incluyendo las células hemopoyéticas; y la falta de inhibición de la
superinfección, permitiendo de este modo series múltiples de
transducciones. Se ha descrito que el virus
adeno-asociado puede integrarse en el ADN celular
humano, de forma específica del sitio, reduciendo de este modo la
posibilidad de mutagénesis por inserción y la variabilidad de las
características de la expresión del gen insertado de la infección
retrovírica. Además, las infecciones con virus
adeno-asociados de tipo silvestre, han continuado en
cultivo de tejidos durante más de 100 pases en ausencia de presión
selectiva, lo que implica que la integración genómica del virus
adeno-asociado es un acontecimiento relativamente
estable. El virus adeno-asociado puede actuar
también de forma extracromosómica.
Otros vectores incluyen vectores plasmídicos.
Los vectores plasmídicos se han descrito ampliamente en la técnica y
son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej.,
Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual",
segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los
últimos años, se ha observado que los vectores plasmídicos son
particularmente ventajosos para entregar genes a células in
vivo, debido a su incapacidad para replicarse dentro de un
genoma hospedador e integrarse dentro del mismo. Sin embargo, estos
plásmidos que tienen un promotor compatible con la célula
hospedadora, pueden expresar un péptido procedente de un gen
codificado funcionalmente en el plásmido. Algunos plásmidos
empleados generalmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40
y pBlueScript. Otros plásmidos son bien conocidos por los expertos
en la técnica. Adicionalmente, los plásmidos se pueden diseñar
normalmente empleando enzimas de restricción y reacciones de
ligación para retirar y añadir fragmentos específicos del ADN.
Se ha descubierto recientemente que los
plásmidos portadores de genes se pueden entregar al sistema inmune,
empleando bacterias. Las formas modificadas de bacterias tales como
Salmonella se pueden transfectar con el plásmido y emplear
como vehículos de entrega. Los vehículos de entrega bacterianos se
pueden administrar a un individuo hospedador por vía oral o por
otros medios de administración. Las bacterias entregan el plásmido a
las células inmunes, p. ej., células dendríticas, probablemente
pasando a través de la barrera intestinal. Se han establecido altos
niveles de protección inmune empleando esta metodología. Tales
métodos de entrega son útiles para los aspectos de la invención que
emplean la entrega sistémica del antígeno, del oligonucleótido CpG
y/o de la hormona.
El oligonucleótido CpG puede actuar de forma
sinérgica con otros aditivos de la mucosa, para potenciar las
respuestas inmunes. El oligonucleótido CpG y el aditivo de la mucosa
se pueden administrar simultánea o secuencialmente. Cuando los
aditivos se administran simultáneamente, se pueden administrar en la
misma formulación o en formulaciones separadas, pero se administran
al mismo tiempo. Los aditivos se administran secuencialmente cuando
la administración de al menos dos aditivos está separada
temporalmente. La separación en el tiempo entre la administración de
los aditivos puede ser cuestión de minutos o puede ser más
larga.
Tal y como se muestra en la sección de los
Ejemplos, los títulos de IgG anti-HBs en suero que
está asociada con la inmunidad sistémica, en ratones inmunizados con
oligonucleótido CpG más CT, eran al menos 50 veces superiores que
con sólo CT o oligonucleótido CpG (Figura 1). Además, los títulos
con 1 \mug de los dos aditivos juntos, daban mejores resultados
que con 10 \mug de un aditivo aislado. Estos resultados indican
una acción sinérgica de los dos aditivos. También se obtuvieron
resultados similares con CpG y LT. Esta sinergia se observó en la
respuesta humoral (Figuras 1-3) y en la mediada por
células (proliferación de CTL y de linfocitos T) (Figura 4). Del
mismo modo, la proporción del isotipo IgG2a de los anticuerpos, era
aproximadamente 10 veces superior con ODN CpG que con CT, lo que
indicaba una mayor influencia de Th1 de ODN CpG, comparada con CT.
Adicionalmente, la combinación de ODN CpG y CT proporcionaba una
relación IgG2a:IgG1 50 veces mayor que con CT de forma aislada.
Todos estos resultados indican una fuerte sinergia de las respuestas
inmunes humorales combinadas con aditivo, en relación a la fuerza y
a la tendencia a Th1, y las respuestas inmunes celulares (Figura
3).
La característica distintiva de la inmunidad
mucosa es la presencia de anticuerpos IgA secretores asociados a las
superficies mucosas. Los anticuerpos IgA son esenciales para evitar
la entrada del patógeno en el cuerpo. La inmunización IN de ratones
sólo con HBsAg, 1 o 10 \mug, fallaba en la inducción de cualquier
IgA detectable en lavados pulmonares. Tampoco había ninguna IgA con
la dosis baja de antígeno y una dosis baja (1 \mug) de CT o de ODN
CpG. Sin embargo, había IgA significativa con una dosis alta de
antígeno y una dosis baja de CT o de ODN CpG o una dosis baja de
antígeno y una dosis baja de aditivos combinados. De hecho, los
niveles de IgA con 1 \mug de cada uno de ODN CpG y de CT
combinados, eran superiores que con 10 \mug de cada uno por
separado, cuando se administraban con 10 \mug de HBsAg (Figura 5).
Además, la IgA en los extractos fecales que indica la inducción de
la inmunidad mucosa en sitios distantes, se detectó sólo con los
aditivos combinados (Figura 6). Estos resultados indican que ODN CpG
es un potente aditivo para la inducción de la inmunidad mucosa y que
hay una respuesta sinérgica fuerte cuando se emplea con otro aditivo
de la mucosa, tal como CT.
Se encontraron resultados similares cuando se
empleó LT en lugar de CT (Figura 7, Tablas 2 y 3). CT y LT que están
estrechamente relacionadas con una homología estructural y funcional
considerable, son ambas demasiado tóxicas para el uso en humanos.
Sin embargo, hay una variedad de derivaciones de CT y LT que
mantienen alguna actividad de aditivo y son mucho menos tóxicas. Un
ejemplo es la subunidad B de CT (CTB) que no es tóxica puesto que la
toxicidad está asociada con la subunidad A. Otro ejemplo es LTK63,
un mutante de LT destoxificado genéticamente que no tiene actividad
enzimática tóxica. Aunque estos aditivos se están empleando en
ensayos clínicos en humanos, ninguno era tan fuerte como ODN CpG
para inducir la inmunidad sistémica (IgG sérica) cuando se empleó 1
\mug de cada uno (Figura 7). También había un efecto sinérgico
cuando ODN CpG y CTB o LTK63 se empleaban juntos, sin embargo, era
más remarcable por la tendencia a Th1 que por la fuerza de la
respuesta del anticuerpo (Figura 7 y Tabla 2). La combinación de ODN
CpG y LTK63 también inducía IgA en lavados pulmonares, incluso
cuando ningún aditivo por sí mismo inducía IgA a concentraciones
bajas (Tabla 3).
La fuerza del aditivo y la baja toxicidad del
oligonucleótido CpG cuando se entregaba a una superficie mucosa,
tienen implicaciones importantes. Permitirá la entrega de muchos
antígenos a las superficies mucosas para la inducción de respuestas
inmunes sistémicas fuertes. La entrega de vacunas no invasivas es
deseable para la inmunización de niños, de animales, los programas
de vacunación en masa y también para evitar el riesgo de lesión por
pinchazo con la aguja. Tales vacunas se podrían administrar por vía
intranasal, mediante gotas nasales o un aerosol nasal, o con un
sistema de entrega, o se podrían administrar por otras vías (oral,
rectal, ocular) a otras superficies mucosas, que incluyen otros
sistemas diferentes de entrega.
La interacción sinérgica del oligonucleótido CpG
con los aditivos de la mucosa tiene implicaciones importantes en el
desarrollo de vacunas. Debido a la respuesta sinérgica, ahora es
posible emplear dosis menores y menos tóxicas de aditivos de la
mucosa, tales como CT, u otras toxinas relacionadas o subunidades de
las mismas, junto con oligonucleótido CpG, para obtener incluso
mejores respuestas inmunes con menos toxicidad. Por ejemplo, sería
posible emplear el oligonucleótido CpG junto con mutantes de CT o de
LT menos tóxicos, modificados genéticamente, para una vacuna muy
eficaz de toxicidad aceptable. No sólo se podría utilizar el
planteamiento del aditivo combinado para beneficiar con diferentes
toxinas, sino también con diferentes formas de antígeno y diferentes
sistemas de entrega para diversas vías de la mucosa. Una cantidad
eficaz empleada de acuerdo con este aspecto de la invención, es una
cantidad que produce una respuesta inmune sinérgica. Una cantidad
sinérgica es aquella cantidad que produce una respuesta inmune
contra un antígeno específico que es superior a la suma de los
efectos individuales de CpG aislado o del aditivo de la mucosa, por
separado.
La invención también se puede emplear junto con
estrategias de inmunización parenteral (p. ej., inyección
intramuscular, intradérmica o subcutánea) que se emplean normalmente
para inducir respuestas inmunes sistémicas. Nótese, que los ratones
inmunizados con HBsAg y que tienen oligonucleótido CpG como un
aditivo al menos, cuando se sensibilizan por una vía parenteral (IM)
y se refuerzan por una ruta mucosa (IN) o se sensibilizan IN y se
refuerzan IM, tenían hasta 10 veces más IgG (es decir, respuesta
humoral sistémica) que cuando se sensibilizaban y se reforzaban por
vía IM (Figura 8). Las respuestas inmunes celulares también eran más
fuertes con los planteamientos combinados parenteral/mucosa que sólo
con IN o sólo con IM, tal y como se indica por CTL más fuertes
(Figura 9) y una proliferación mayor de los linfocitos T (Figura
10). Mientras que la sensibilización y el refuerzo IN proporcionan
buenas respuestas mucosas, la sensibilización y el refuerzo IM no
producen respuestas mucosas detectables (Figuras
11-13). El planteamiento de sensibilización IM y
refuerzo IN también proporcionaba IgA significativa en lavados
pulmonares (Figura 11) y saliva (Figura 12), pero no en las heces
(Figura 13).
Los aditivos de la mucosa útiles, de acuerdo con
la invención, son aditivos de la mucosa no oligonucleótidos. Un
"aditivo de la mucosa no oligonucleótido" tal y como se emplea
en esta memoria, es un aditivo diferente de un oligonucleótido CpG
que es capaz de inducir una respuesta inmune mucosa en un individuo,
cuando se administra a una superficie mucosa junto con un antígeno.
Los aditivos de la mucosa incluyen, sin estar limitados a los
mismos, toxinas bacterianas; p. ej., toxina colérica (CT), derivados
de CT que incluyen, sin estar limitados a los mismos, la subunidad B
de CT (CTB) (Wu y col., 1998, Tochikubo y col., 1998); CTD53 (Val a
Asp) (Fontana y col., 1995); CTK97 (Val a Lys) (Fontana y col.,
1995); CTK104 (Tyr a Lys) (Fontana y col., 1995); CTD53/K63 (Val a
Asp, Ser a Lys) (Fontana y col., 1995); CTH54 (Arg a His) (Fontana y
col., 1995); CTN107 (His a Asn) (Fontana y col., 1995); CTE114 (Ser
a Glu) (Fontana y col., 1995); CTE112K (Glu a Lys) (Yamamoto y col.,
1997a); CTS61F (Ser a Phe) (Yamamoto y col., 1997a, 1997b); CTS106
(Pro a Lys) (Douce y col., 1997, Fontana y col., 1995); y CTK63 (Ser
a Lys) (Douce y col., 1997, Fontana y col., 1995), toxina de Zonula
occludens, zot, enterotoxina termolábil de Escherichia coli,
toxina lábil (LT), derivados de LT que incluyen, sin estar limitados
a los mismos, la subunidad B de LT (LTB) (Verweij y col., 1998);
LT7K (Arg a Lys) (Komase y col., 1998, Douce y col., 1995); LT61F
(Ser a Phe) (Komase y col., 1998); LT112K (Glu a Lys) (Komase y
col., 1998); LT118E (Gly a Glu) (Komase y col., 1998); LT146E (Arg a
Glu) (Komase y col., 1998); LT192G (Arg a Gly) (Komase y col.,
1998); LTK63 (Ser a Lys) (Marchetti y col., 1998, Douce y col.,
1997,1998, Di Tommaso y col., 1996); y LTR72 (Ala a Arg) (Giuliani y
col., 1998), toxina Pertussis, PT. (Lycke y col., 1992, Spangler BD,
1992, Freytag y Clemments, 1999, Roberts y col., 1995, Wilson y
col., 1995) que incluye PT-9K/129G (Roberts y col.,
1995, Cropley y col., 1995); derivados de la toxina (véase más
abajo) (Holmgren y col., 1993, Verweij y col., 1998, Rappuoli y
col., 1995, Freytag y Clements, 1999); derivados del Lípido A (p.
ej., lípido A monofosforilo, MPL) (Sasaki y col., 1998, Vancott y
col., 1998; derivados del dipéptido muramílico (MDP) (Fukushima y
col., 1996, Ogawa y col., 1989, Michalek y col., 1983, Morisaki y
col., 1983); proteínas de la membrana externa de bacterias (p. ej.,
lipoproteína de la proteína A de la superficie externa (OspA) de
Borrelia burgdorferi, proteína de la membrana externa de
Neisseria meningitidis) (Marinaro y col., 1999, Van de Verg y
col., 1996); emulsiones de
aceite-en-agua (p. ej., MF59)
(Barchfield y col., 1999, Verschoor y col., 1999, O'Hagan, 1998);
sales de aluminio (Isaka y col., 1998,1999); y saponinas (p. ej.,
QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, MA) (Sasaki y col.,
1998, MacNeal y col., 1998), ISCOMS, MF-59 (una
emulsión de escualeno-en-agua
estabilizada con Span 85 y Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville,
CA); la serie ISA de Seppic de los aditivos de Montanide (p. ej.,
Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, Francia); PROVAX (una emulsión
de aceite-en-agua que contiene un
detergente estabilizante y un agente formador de micelas; IDEC
Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA); formulación del aditivo
Syntext (SAF; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO);
poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno] (polímero
PCPP; Virus Research Institute, EE.UU.) y el factor de elongación de
Leishmania (Corixa Corporation, Seattle, WA).
Aunque la administración del antígeno a la
mucosa se considera un requisito previo para la inducción de las
respuestas inmunes mucosas fuertes, es posible inducir una inmunidad
mucosa fuerte frente a antígenos suministrados sistémicamente,
modulando la respuesta inmune con hormonas esteroides, tal y como se
describe para la 1,25-dihidroxi vitamina D_{3}
[1,25(OH)_{2}D_{3}] (Daynes y col., 1996). La
invención también incluye métodos para la administración de
oligonucleótido CpG aislado o junto con otros aditivos de la mucosa
y antígeno para individuos tratados hormonalmente. Cada uno de los
compuestos se puede administrar junto o separadamente, sistema o
mucosamente. En algunas realizaciones, el oligonucleótido CpG y el
antígeno, y opcionalmente otros aditivos de la mucosa, se
administran vía mucosa y la hormona se administra sistémicamente. La
hormona se puede entregar parenteralmente (p. ej. , inyección
subcutánea) o vía mucosa (p. ej., oralmente).
Las respuestas inmunes mucosas también se pueden
inducir con la coadministración de citoquinas junto con los
oligonucleótidos CpG. Las respuestas inmunes también se pueden
aumentar mediante expresión co-lineal de citoquinas
(Bueler & Mulligan, 1996; Chow y col., 1997; Geissler y col.,
1997; Iwasaki y col., 1997; Kim y col., 1997) o con moléculas
coestimuladoras B-7 (Iwasaki y col., 1997; Tsuji y
col., 1997). Las citoquinas se pueden administrar directamente con
los oligonucleótidos CpG o se pueden administrar en forma de un
vector de ácido nucleico que codifica la citoquina, de modo que la
citoquina se puede expresar in vivo. En una realización,
cuando el CpG se administra en forma de un vector de expresión
plasmídico, el vector puede codificar la citoquina y no es necesaria
una administración separada de la citoquina. El término
"citoquina" se emplea como un nombre genérico para un grupo
diverso de proteínas y de péptidos solubles que actúan como
reguladores humorales en concentraciones de nano a picomolares y
que, bajo condiciones normales o patológicas, modulan las
actividades funcionales de las células y los tejidos individuales.
Estas proteínas también median en las interacciones entre las
células directamente y regular procesos que tienen lugar en el medio
extracelular. Ejemplos de citoquinas incluyen, pero no están
limitadas a IL-1, IL-2,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-10, IL-12,
IL-15, el factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF), el
factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), el
interferón-\gamma (IFN-\gamma),
el factor de necrosis tumoral (TNF), TGF-\beta, el
ligando de FLT-3 y el ligando de CD40.
Las citoquinas tienen un papel director de la
respuesta de los linfocitos T. Los linfocitos T auxiliares (CD4+)
controlan la respuesta inmune de mamíferos a través de la producción
de factores solubles que actúan sobre las células del sistema
inmune, incluyendo otros linfocitos T. La mayoría de los linfocitos
T auxiliares CD4+ maduros expresan uno de los dos perfiles de
citoquinas: Th1 o Th2. Las células Th1 expresan
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-9, IL-10,
IL-13, GM-CSF y niveles bajos de
TNF-\alpha. El subgrupo Th1 favorece la
hipersensibilidad de tipo retardada, la inmunidad mediada por
células y el cambio de clase de inmunoglobulina a IgG_{2a}. El
subgrupo Th2 induce la inmunidad humoral activando los linfocitos B,
favorece la producción de anticuerpos e induce el cambio de clase a
IgG_{1} e IgE. En algunas realizaciones, se prefiere que la
citoquina sea una citoquina Th1.
Sorprendentemente, se encontró que los
oligonucleótidos CpG inducen la inmunidad mucosa en sitios
distantes, así como en sitios locales. Un "sitio distante", tal
y como se emplea en esta memoria, es un tejido mucoso que está
localizado en una región diferente del cuerpo, al del tejido mucoso
en el que se ha administrado el oligonucleótido CpG. Por ejemplo, si
el oligonucleótido CpG se administra intranasalmente, un sitio
distante sería la envuelta mucosa del intestino.
Para uso en la presente invención, los ácidos
nucleicos se pueden sintetizar de novo empleando cualquiera
entre una variedad de procedimientos bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, el método de la fosforoamidita de
b-cianoetilo (Beaucage, S.L. y Caruthers, M.H.,
Tet. Let. 22:1859, 1981); el método del fosfonato de
nucleósido H (Garegg y col., Tet. Let.
27:4051-4054, 1986; Froehler y col., Nucl. Acid.
Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg y col., Tet.
Let. 27:4055-4058, 1986; Gaffney y col., Tet.
Let. 29:2619-2622, 1988). Estos productos
químicos se pueden preparar con una variedad de sintetizadores
automáticos de oligonucleótidos, disponibles en el mercado.
Alternativamente, los dinucleótidos CpG se pueden producir a gran
escala en los plásmidos (véase Sambrook, T. y col., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Nueva York, 1989) y separarlos en trozos menores o
administrarlos completos. Después de administrar a un individuo, el
plásmido se puede degradar en oligonucleótidos. Los oligonucleótidos
se pueden preparar a partir de secuencias existentes de ácidos
nucleicos (p. ej., ADN genómico o ADNc) empleando técnicas
conocidas, tales como las que emplean enzimas de restricción,
exonucleasas o endo-
nucleasas.
nucleasas.
Para uso in vivo, los ácidos nucleicos
son preferentemente relativamente resistentes a la degradación (p.
ej., mediante endo y exonucleasas). Las estructuras secundarias,
tales como los lazos, pueden estabilizar a los ácidos nucleicos
frente a la degradación. Alternativamente, la estabilización de los
ácidos nucleicos se puede realizar mediante modificaciones del
esqueleto de fosfato. Un tipo de ácido nucleico estabilizado tiene
al menos un esqueleto parcialmente modificado de fosforotioato. Los
fosforotioatos se pueden sintetizar empleando técnicas automatizadas
que emplean productos químicos con fosforoamidato o
H-fosfonato. Los fosfonatos de arilo y de alquilo
se pueden preparar, p. ej., tal y como se describe en el documento
de patente de EE.UU. nº 4.469.863; y los fosfotriésteres de alquilo
(en los que el resto de oxígeno cargado se alquila tal y como se
describe en el documento de patente de EE.UU. nº 5.023.243 y el
documento de patente europea nº 092574) se pueden preparar por
síntesis automatizada en fase sólida, empleando reactivos
disponibles comercialmente. Los métodos para preparar otras
modificaciones y sustituciones del esqueleto de ADN se han descrito
(Uhlmann, E. y Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990;
Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990).
Los ácidos nucleicos que contienen un CpG no
metilado adecuado, pueden ser eficaces en cualquier vertebrado.
Diferentes ácidos nucleicos que contienen un CpG no metilado pueden
causar una estimulación inmune óptima, dependiendo de la especie de
mamífero. Por tanto, un oligonucleótido que causa una estimulación
óptima en los humanos puede no causar una estimulación óptima en un
ratón y viceversa. Un experto en la técnica puede identificar los
oligonucleótidos óptimos útiles para una especie de mamífero de
interés en particular, empleando ensayos convencionales descritos en
esta memoria y/o conocidos en la técnica, empleando la orientación
proporcionada por esta
memoria.
memoria.
La expresión "una cantidad eficaz de un
oligonucleótido CpG" se refiere a la cantidad necesaria o
suficiente para realizar un efecto biológico deseado. Por ejemplo,
una cantidad eficaz de un oligonucleótido que contiene al menos un
CpG no metilado para inducir la inmunidad de la mucosa, es la
cantidad necesaria para provocar el desarrollo de IgA como respuesta
a un antígeno después de la exposición al antígeno. Combinando las
enseñanzas proporcionadas en esta memoria, escogiendo entre los
distintos compuestos activos y factores de peso, tales como la
potencia, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del
paciente, setenta de los efectos secundarios adversos y el modo de
administración preferido, se pueden planificar un régimen de
tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz que no provoque una
toxicidad sustancial y que sea totalmente eficaz para tratar al
individuo en particular. La cantidad eficaz para cualquier
aplicación en particular, puede variar dependiendo de factores tales
como la enfermedad o el estado que se va a tratar, el
oligonucleótido CpG en particular que se va a administrar (p. ej.,
el número de motivos de CpG sin metilar o su localización en el
ácido nucleico), el antígeno, el tamaño del individuo o la gravedad
de la enfermedad o del estado. Un experto ordinario en la técnica
puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un
oligonucleótido CpG en particular y el antígeno sin necesidad de una
experimentación indebi-
da.
da.
Las dosis para el individuo de los compuestos
descritos en esta memoria, están típicamente en el intervalo desde
aproximadamente 80 mg/día hasta 16.000 mg/día, más típicamente desde
aproximadamente 800 mg/día hasta 8000 mg/día, y lo más típicamente
desde aproximadamente 800 mg/día hasta 4000 mg/día. Expuesto en
términos de peso corporal del individuo, el intervalo de
dosificación típica es desde aproximadamente 1 a 200 mg/kg/día, más
típicamente desde aproximadamente 10 a 100 mg/kg/día y lo más
típicamente, desde aproximadamente 10 a 50 mg/kg/día. Expuesto en
términos de áreas de la superficie corporal del individuo, los
intervalos de dosificación típica son desde aproximadamente 40 hasta
8000 mg/m^{2}/día, más típicamente desde aproximadamente 400 hasta
4000 mg/m^{2}/día y lo más típico desde aproximadamente 400 hasta
2600 mg/m^{2}/día.
En algunas realizaciones, al menos 50 \mug de
CpG se administran a un individuo. En otras realizaciones, se
administran al menos 75 \mug, 100 \mug, 200 \mug, 300 \mug,
400 \mug, 500 \mug de CpG y cada número entero entremedias, al
individuo.
Para cualquier compuesto descrito en esta
memoria, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar
inicialmente a partir de ensayos con cultivos celulares. Por
ejemplo, la cantidad eficaz de oligonucleótido CpG útil para inducir
la inmunidad mucosa, se puede determinar empleando los ensayos in
vitro descritos anteriormente en relación con el índice de
estimulación. El índice de estimulación se puede utilizar para
determinar como cantidad eficaz del oligonucleótido en particular
para el individuo en particular y la dosificación se puede ajustar
hacia arriba o hacia abajo, para conseguir los niveles deseados en
el individuo. Las cantidades terapéuticamente eficaces también se
pueden determinar a partir de modelos animales. Una dosis
terapéuticamente eficaz también se puede determinar a partir de
datos humanos para los oligonucleótidos CpG que se han sometido a
ensayo en humanos (ensayos clínicos en seres humanos ya se han
iniciado) y para los compuestos que se conoce que muestran
actividades farmacológicas similares, tales como otros aditivos de
la mucosa, p. ej., LT y otros antígenos con fines de vacunación. La
dosis aplicada se puede ajustar basándose en la biodisponibilidad
relativa y la potencia del compuesto administrado. El ajuste de la
dosis para conseguir una eficacia máxima basándose en los métodos
descritos anteriormente y en otros métodos que se conocen en la
técnica, está dentro de las capacidades de los expertos ordinarios
en la técnica.
Las formulaciones de la invención se administran
en soluciones farmacéuticamente aceptables que pueden contener de
forma rutinaria concentraciones farmacéuticamente aceptables de
sales, agentes tamponadores, conservantes, vehículos compatibles,
aditivos y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.
Para el uso en la terapia, una cantidad eficaz
de oligonucleótido CpG se puede administrar a un individuo mediante
cualquier modo que entregue el oligonucleótido a una superficie
mucosa. La "administración" de la composición farmacéutica de
la presente invención, se puede realizar por cualquier medio
conocido por los expertos en la técnica. Las vías de administración
preferidas incluyen, pero no están limitadas a las mismas, la oral,
la intranasal, la intratraqueal, la inhalación, la ocular, la
vaginal y la rectal.
Para la administración oral, los compuestos (es
decir, los oligonucleótidos CpG, el antígeno, el aditivo de la
mucosa) se pueden formular cómodamente combinando el(los)
compuesto(s) activo(s) con vehículos farmacéuticamente
aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten
que los compuestos de la invención se puedan formular como
comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes,
pastas, suspensiones y similares, para que un individuo que se va a
tratar lo tome como ingestión oral. Las preparaciones farmacéuticas
para uso por vía oral se pueden obtener como excipiente sólido,
opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla
de gránulos, añadiendo a continuación aditivos adecuados, si se
desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los
excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como
azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol;
preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz,
almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina,
goma tragacanto, metil-celulosa,
hidroxipropilmetil-celulosa,
carboximetil-celulosa sódica y/o
polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes
disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o
ácido algínico, o una sal de los mismos, tal como alginato sódico.
Opcionalmente, las formulaciones orales también se pueden formular
en solución salina o en tampones para neutralizar las condiciones
ácidas
internas.
internas.
Los núcleos de las grageas se proporcionan con
revestimientos adecuados. Para este fin, se pueden utilizar
soluciones de azúcar concentrado que pueden contener opcionalmente
goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol,
polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de lacas y
disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Los
colorantes o pigmentos se pueden añadir a los comprimidos o a los
revestimientos de las grageas para identificar o caracterizar
diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden
utilizar oralmente, incluyen cápsulas ajustadas por empuje, hechas
de gelatina, así como cápsulas selladas blandas, hechas de gelatina
y un agente plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las
cápsulas ajustadas por empuje pueden contener los ingredientes
activos mezclados con la carga, tal como lactosa, agentes ligantes
tales como almidones y/o lubricantes, tales como estearato de talco
o de magnesio y, opcionalmente, agentes estabilizantes. En las
cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o
suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina
líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir
agentes estabilizantes. Las microesferas formuladas para la
administración oral también se pueden utilizar. Tales microesferas
están bien definidas en la técnica. Todas las formulaciones para la
administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para
dicha administración.
Para la administración bucal, las composiciones
deben tener forma de comprimidos o pastillas formuladas de forma
convencional.
Para la administración por inhalación, los
compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se pueden
administrar convenientemente en forma de una presentación de
pulverización con aerosol, en paquetes a presión o un nebulizador,
con el uso de un propulsante adecuado, p. ej.,
diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosificación se puede
determinar proporcionando una válvula que entregue una cantidad
medida. Las cápsulas o cartuchos, p. ej., de gelatina para emplear
en un inhalador o insuflador, se pueden formular de modo que
contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo
adecuada, tal como lactosa o almidón.
Los compuestos, cuando se desea administrarlos
sistémicamente, se pueden formular para la administración parenteral
mediante inyección, p. ej., en inyección de bolo o como infusión
continua. Las formulaciones para la inyección se pueden persnetar en
forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas o en recipientes
con multidosis, con un agente conservante añadido. Las composiciones
pueden tener forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en
vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes
formuladores tales como agentes de suspensión, estabilización y/o
dispersión.
Las formulaciones farmacéuticas para la
administración parenteral, incluyen las soluciones acuosas de los
compuestos activos en forma hidrosoluble. Adicionalmente, las
suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como
suspensiones aceitosas adecuadas para inyectar. Los disolventes
lipofílicos adecuados o los vehículos incluyen aceites grasos, tales
como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales
como el oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las
suspensiones acuosas para inyectar pueden contener sustancias que
incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como
carboximetil-celulosa sódica, sorbitol o dextrano.
Opcionalmente, la suspensión puede contener también agentes
estabilizantes adecuados o agentes que incrementan la solubilidad
de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy
concentradas.
Alternativamente, los compuestos activos pueden
estar en forma de polvo para la constitución antes del uso con un
vehículo adecuado, p. ej., agua estéril exenta de pirógenos.
Los compuestos también se pueden formular en
composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios o enemas
de retención, p. ej. que contengan bases de supositorio
convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
previamente, los compuestos también se pueden formular como una
preparación para depósito. Tales formulaciones que actúan la largo
plazo, se pueden formular con materiales adecuados polímeros o
hidrófobos (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o
resinas de intercambio iónico, o como derivados solubles escasos,
por ejemplo, como una sal soluble escasa.
Las composiciones farmacéuticas también pueden
comprender vehículos o excipientes sólidos o en fase gel. Ejemplos
de tales vehículos o excipientes incluyen, sin estar limitados a los
mismos, carbonato cálcico, fosfato cálcico, azúcares diversos,
almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como
polietilenglicoles.
Las formas de preparación farmacéutica adecuada,
sólida o líquida son, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para
inhalar, microencapsuladas, encocleadas, revestidas sobre partículas
microscópicas de oro, contenidas en liposomas, nebulizadas, en
aerosoles, glóbulos para implantación en la piel o secadas sobre un
objeto agudo para arañarlas en la piel. Las composiciones
farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, comprimidos,
comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositorios,
jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones
con liberación retardada de los compuestos activos, en cuya
preparación se emplean excipientes y aditivos y/o auxiliares tales
como agentes disgregantes, ligantes, de revestimiento, de
inflamiento, lubricantes, saboreantes, edulcorantes o
solubilizantes, de forma convencional, tal y como se ha descrito
anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para
uso en una variedad de sistemas de entrega de fármacos. Para una
breve revisión de los métodos presentes de entrega de fármacos,
véase Langer, Science 249:1527-1533,
1990.
Los oligonucleótidos CpG y los antígenos se
pueden administrar per se (neto) o en forma de una sal
farmacéuticamente aceptable. Cuando se emplean en medicina, las
sales tienen que ser farmacéuticamente aceptables, pero también se
pueden emplear de forma conveniente sales farmacéuticamente no
aceptables para preparar a partir de las mismas las sales
farmacéuticamente aceptables. Tales sales incluyen, sin estar
limitadas a las mismas, las preparadas a partir de los siguientes
ácidos; clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico,
maleico, acético, salicílico,
p-toluen-sulfónico, tartárico,
cítrico, metano-sulfónico, fórmico, malónico,
succínico, naftaleno-2-sulfónico y
benzo-sulfónico. También, dichas sales se pueden
preparar como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales
como sales de sodio, potasio o calcio del grupo de ácido
carboxílico.
Los agentes tamponadores adecuados incluyen:
ácido acético y una sal (1-2% en p/v); ácido cítrico
y una sal (1-3% en p/v); ácido bórico y una sal
(0,5-2,5% en p/v); y un ácido fosfórico y una sal
(0,8-2% en p/v). Los agentes conservantes adecuados
incluyen el cloruro de benzalconio (0,003-0,03% en
p/v); clorobutanol (0,3-0,9% en p/v); parabenos
(0,01-0,25% en p/v) y timerosal
(0,004-0,02% en p/v).
Las composiciones farmacéuticas de la invención
contienen una cantidad eficaz de un oligonucleótido CpG y antígenos,
incluidos opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa
una o varias cargas compatibles sólidas o líquidas, diluyentes o
sustancias encapsulantes que son adecuadas para la administración a
un ser humano o a otro animal vertebrado. El término "vehículo"
significa un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético,
con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la
aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas
también son capaces de estar mezclados con los compuestos de la
presente invención y entre sí, de modo que no haya interacción que
perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Los oligonucleótidos CpG o los antígenos útiles
en la invención, se pueden suministrar en mezclas con
aditivo(s) de la mucosa o antígeno(s)
adicional(es). Una mezcla puede constar de diversos aditivos
de la mucosa, añadidos al oligonucleótido CpG o a varios
antígenos.
Están disponibles una variedad de rutas de
administración. El modo particular seleccionado dependerá, por
supuesto, de los aditivos o antígenos particulares seleccionados,
del estado en particular que se está tratando y de la dosificación
requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de esta
invención, en general, se pueden llevar a la práctica empleando
cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo
que significa cualquier modo que produzca niveles aceptables de una
respuesta inmune que no cause efectos adversos, clínicamente
inaceptables. Los modos preferidos de administración se han descrito
arriba.
Las composiciones se pueden presentar
convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden
preparar según cualquiera de los métodos bien conocidos en la
técnica farmacéutica. Todos los métodos incluyen la etapa de aportar
los compuestos junto con un vehículo que constituya uno o varios
ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan
asociando los compuestos de forma uniforme e íntima con un vehículo
líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos, y si es
necesario, a continuación dando forma al producto. Las unidades de
dosis líquidas son viales o ampollas. Las unidades de dosis sólidas
son comprimidos, cápsulas y supositorios. Para el tratamiento de un
paciente, dependiendo de la actividad del compuesto, la forma de
administración, los fines de la inmunización (es decir, profiláctica
o terapéutica), la naturaleza o la gravedad del trastorno, la edad y
el peso corporal del paciente, pueden ser necesarias dosis
diferentes. La administración de una dosis dada se puede realizar
mediante administración aislada en forma de una unidad de dosis
individual o también diversas unidades de dosis más pequeñas. La
administración múltiple de las dosis a intervalos específicos de
semanas o meses separadamente, es común para el refuerzo de las
respuestas específicas de antígeno.
Otros sistemas de administración pueden incluir
la liberación en el tiempo, la liberación retardada y la liberación
sostenida. Tales sistemas pueden evitar la administración repetida
de los compuestos, aumentando la comodidad del paciente y del
médico. Muchos tipos de sistemas de liberación están disponibles y
son conocidos por los expertos en la técnica. Incluyen sistemas a
base de polímeros, tales como
poli(lactida-glicolida), copolioxalatos,
policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, poli(ácido
hidroxibutírico) y polianhídridos. Las microcápsulas de los
polímeros anteriores que contienen fármacos, están descritas, por
ejemplo, en el documento de patente de EE.UU. nº 5.075.109. Los
sistemas de liberación también incluyen sistemas no poliméricos que
son: lípidos que incluyen esteroles, tales como colesterol, ésteres
de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono, di y
triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas
silásticos; sistemas a base de péptidos; revestimientos de cera;
comprimidos que emplean ligantes y excipientes convencionales;
implantes parcialmente fusionados; y similares. Los ejemplos
específicos incluyen, sin estar limitados a los mismos: (a) sistemas
de erosión en los que un agente de la invención está contenido en
una forma dentro de una matriz, tal como las descritas en los
documentos de patentes de EE.UU. nº 4.452.775, 4.675.189 y
5.736.152, y (b) sistemas de difusión en los que un componente
activo se permea con una tasa controlada desde un polímero, tal como
se describe en los documentos de patentes de EE.UU. nº 3.854.480,
5.133.974 y 5.407.686. Además, se pueden utilizar los sistemas de
liberación programados a base de una bomba, algunos de los cuales
están adaptados para la implantación.
La presente invención se ilustra adicionalmente
con los siguientes Ejemplos, que no hay que interpretar en absoluto
como limitantes.
Ratones. Todos los experimentos se
realizaron empleando ratones BALB/c hembras, de 6-8
semanas de edad, con 5-10 ratones por grupo
experimental o grupo testigo. Para las inmunizaciones intranasales,
los ratones se anestesiaron levemente con halotano® (Halocarbon
Laboratories, River Edge, NJ).
Aditivos. Los ratones se inmunizaron con
la administración IN de 1 \mug de HBsAg (proteína S de VBH,
obtenida del plasma, subtipo ad, Genzyme Diagnostics, San Carlos,
CA), de forma aislada o combinada con 1 o 10 \mug de CT
(purificada a partir de Vibrio cholerae, Sigma, St. Louis,
MO), LT (purificada a partir de Escherichia coli, Sigma), CTB
(purificada a partir de Vibrio cholerae, Sigma), LTK63
(mutante de LT que es portador de una Ser-Lys en la
posición 63, proporcionada generosamente por el Dr. Rino Rappuoli,
IRIS, Chiron S. p. A., Italia) y/o ODN CpG
(5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3',
ODN CpG nº 1826 SEQ ID NO. 90) o ODN testigo no CpG
(5'TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3', ODN CpG nº 1982 SEQ ID
NO. 91) Hybridon Specialty Products, Milford, MA). El antígeno y el
(los) aditivo(s) se completaron hasta un volumen de 150
\mul con NaCl 0,15 M y se administraron mediante inhalación IN.
Los ODN se resuspendieron en Tris 10 mM (pH 7,0), EDTA 1 mM para
almacenar a +4ºC antes de diluir en solución salina para la
inmunización. El nivel de LPS en los ODN no era detectable (< 1
ng/mg) mediante el ensayo de Limulus (Whittaker Bioproducts,
Walkersville, MD).
Cada animal se inmunizó con 1 o 10 Fg de la
proteína S de VHB obtenida del plasma (HBsAg, subtipo ad, Genzyme
Diagnostics, San Carlos, CA), que se había administrado de forma
aislada o junto con 1 o 10 \mug de CT o LT o derivados de los
mismos y/o oligonucleótido CpG nº 1826. Los derivados de CT eran la
subunidad B de CT (CTB). Los derivados destoxificados de LT se
produjeron todos por mutaciones genéticas que afectaban a la
subunidad A o a la actividad enzimática, e incluían LTK63. Todas las
vacunas se suministraron en un volumen total de 150 \mul, que se
aplicó directamente como gotas sobre los orificios nasales de
ratones ligeramente anestesiados. Algunos ratones se
reforzaron
de forma idéntica 8 semanas después de la sensibilización. Todos los grupos experimentales contenían 5 o 10 ratones.
de forma idéntica 8 semanas después de la sensibilización. Todos los grupos experimentales contenían 5 o 10 ratones.
Plasma: El plasma se recogió de los
ratones en diferentes intervalos de tiempo después de la
inmunización (1, 2, 4 y 8 semanas después de la sensibilización y 1,
2 y 4 semanas después del refuerzo) mediante extracción de sangre
del seno retroorbital y se almacenó a -20ºC hasta el ensayo.
Sedimentos fecales: Los sedimentos
fecales se recogieron de ratones en diversos intervalos de tiempo
después de la inmunización (1, 2, 4 y 8 semanas después de la
sensibilización y 1, 2 y 4 semanas después del refuerzo). Los
ratones se aislaron en jaulas individuales sin material para el
lecho, durante un periodo de 24 h, después del cual se recogieron
los sedimentos fecales y se pesaron en partes alícuotas de 0,1 mg.
Un ml de TBS (Tris-HCI 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5)
y 0,1 Fg de azuro sódico (Sigma) se añadieron por 0,1 mg de materia
fecal. Se permitió que las muestras se rehidrataran durante 30 min a
temperatura ambiente y a continuación se centrifugaron a 6000 rpm
durante 15 min para retirar los desechos fecales y el material
sobrenadante se recogió y se almacenó a -20ºC hasta que se sometió a
un ensayo de S-IgA mediante ELISA.
Lavados pulmonares: Los lavados
pulmonares se realizaron en ratones, 4 semanas después de la
inmunización primaria o del refuerzo. Una jeringa de insulina de
0,33 cc, con una aguja fijada 29G1/2 (Becton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ) se empleó para realizar los lavados pulmonares. Se
introdujo 1 ml de TBS en la jeringa y se fijó un tubo de polietileno
(PE) que era 1 cm más largo que la aguja (PE20, ID = 0,38 mm, Becton
Dickinson). Los ratones se sacrificaron mediante una sobredosis de
anestesia y la tráquea se descubrió inmediatamente mediante una
incisión en la línea media, empleando tijeras quirúrgicas de puntas
finas (Fine Science Tools Inc., North Vancouver, BC). A continuación
se realizó una pequeña incisión en la tráquea y por encima de la
misma se fijó una pinza (Fine Science Tools Inc., North Vancouver,
BC). El tubo de PE se hizo pasar unos pocos mm por la tráquea hacia
abajo a través de la incisión y se fijó una segunda pinza justo por
debajo de la incisión para sujetar el tubo de PE en el lugar
adecuado en la tráquea. La solución de TBS se infundió lentamente en
los pulmones, a continuación se retiró tres veces (80% de
recuperación esperada). Las muestras recuperadas se centrifugaron a
13.000 rpm durante 7 min. y se recogió el material sobrenadante y se
almacenó a -20ºC hasta el ensayo con ELISA.
Respuesta humoral sistémica: Los
anticuerpos específicos de HBsAg (anti-HBs) en el
plasma del ratón, se detectaron y se cuantificaron mediante el
ensayo ELISA de dilución de punto final (por triplicado) para
animales individuales, tal y como se ha descrito previamente (Davis
y col., 1998). Resumiendo, las placas de poliestireno de 96 pocillos
(Corning) se revistieron durante una noche (temperatura ambiente)
con partículas de HBsAg obtenidas del plasma (tal y como se emplea
para la inmunización) (100 Fl de 1 Fg/ml en tampón de
carbonato-bicarbonato sódico 0,05 M, pH 9,6) se
incubaron con el plasma durante 1 h a 37ºC. Los anticuerpos
capturados se detectaron a continuación con peroxidasa de rábano
picante (HRP)-conjugada con IgG, IgG1 o IgG2a de
cabra anti-ratón (1:4000 en
PBS-Tween, 10% de PBS: 100 Fl/pocillo; Southern
Biotechnology Inc., Birmingham, AL), seguido de la adición de
solución de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD,
Sigma), 100 Fl/pocillo, durante 30 min a TA en la oscuridad. La
reacción se detuvo por la adición de H_{2}SO_{4} 4 N, 50
Fl/pocillo.
Los títulos de la dilución de punto final se
definieron como la mayor dilución de plasma que se obtenía con un
valor de la absorbancia (DO 450), dos veces superior a la del plasma
no inmune, con un valor de corte de 0,05. Los títulos de los
anti-HBs de ratones que respondían (títulos de punto
final > 10) se expresaron como las SEM medias de los valores
individuales del animal, que eran ellos mismos el promedio de los
ensayos por triplicado.
Respuesta humoral mucosa: Esta se realizó
sobre el material sobrenadante fecal o en los lavados pulmonares
recuperados o en el plasma (anterior), exceptuando que las muestras
se incubaron sobre placas revestidas durante 2 h a 37ºC y los
anticuerpos capturados se detectaron con IgA de cabra
anti-ratón conjugada con HRP (1:1000 en
PBS-Tween. 10% de PBS: 100 Fl/pocillo; Southern
Biotechnology Inc). El sedimento fecal no inmune o las soluciones de
lavado pulmonar, se emplearon para determinar los valores de los
testigos negativos. Para las soluciones de lavado pulmonar, se
describieron títulos de la dilución de punto final
anti-HBs (tal y como se ha descrito anteriormente),
mientras que para las soluciones de sedimento fecal, se calcularon
valores de la absorbancia (DO 450) superiores al de la solución de
sedimento fecal no inmune, y se expresaron como la SEM promedio de
los valores de la DO 450 individuales, que eran los mismos que el
promedio de los ensayos por triplicado.
Evaluación de las respuestas de CTL: Los
bazos se retiraron de los ratones, 4 semanas después de la
inmunización de sensibilización o del refuerzo. El ensayo in
vitro de la actividad citolítica específica de HBsAg se realizó
tal y como se ha descrito previamente (Davis y col., 1998).
Resumiendo, las suspensiones celulares aisladas se prepararon y se
suspendieron en medio de cultivo de tejidos (RPMI 1640,10% de FBS,
Life Technologies, Grand Island, NY, suplementado con solución de
penicilina-estreptomicina, 1000 U/ml, 1 mg/ml de
concentraciones finales, respectivamente, Sigma). Los esplenocitos
(3 x 10^{7}) se cocultivaron durante 5 días (37ºC, 5% de
CO_{2}) con 1,5 x 10^{6} células estimuladoras singénicas que
expresaban HBsAg (P815-preS, proporcionadas
generosamente por F. V. Chisari, Scripps Institute, La Jolla, CA)
que se habían inactivado previamente por radiación (20.000 rad). Las
células efectoras se recogieron, se lavaron y se diluyeron en serie
y se cultivaron con 5 x 10^{4} células diana que expresaban HBsAg,
marcadas con ^{51}Cr (P815S) en placas de cultivo con 96 pocillos
de fondo redondo (37ºC, 5% de CO_{2}, 4 h). El material
sobrenadante (100 F1) se retiró para el recuento por radiación
(gamma). La liberación espontánea se determinó incubando células
diana sin células efectoras y la liberación total por adición de 100
Fl HCl 2 N a las células diana. El porcentaje de lisis se calculó
como [(liberación experimental-liberación
espontánea)/(liberación total-liberación
espontánea)] x 100. El porcentaje de lisis específica se calculó
como el % de lisis con P815S-% de lisis con células P815. La
actividad de los CTL en ratones que responden [% de lisis específica
> 10 con efector: diana (E:D) de 25:1] se expresó como la SEM
promedio de los valores individuales de animales que eran ellos
mismos el promedio de los ensayos por
triplicado.
triplicado.
Los datos se analizaron empleando el programa
GraphPAD InStat (Graph PAD Software, San Diego). El significado
estadístico de la diferencia entre dos grupos se determinó a partir
de las medias y las desviaciones típicas mediante el ensayo de la t
de Student con dos colas y entre tres o más grupos, por el análisis
de 1 factor de la varianza
(ANOVA) seguido del ensayo de Tukey para el ensayo de intervalo múltiple. Las diferencias se consideraron que no eran significativas cuando la p > 0,05.
(ANOVA) seguido del ensayo de Tukey para el ensayo de intervalo múltiple. Las diferencias se consideraron que no eran significativas cuando la p > 0,05.
Los ratones BALB/c inmunizados en una sola
ocasión mediante inhalación IN de HBsAg sin aditivo, no tenían
anticuerpos IgG anti-HBs detectables en su plasma
con 1 \mug de HBsAg y sólo títulos extremamente bajos (< 20) en
unos pocos ratones con 10 \mug de antígeno (Figura 1).
Por el contrario, los títulos de IgG
anti-HBs eran considerablemente superiores cuando el
HBsAg se administraba junto con oligonucleótido CpG o con CT como
aditivo (Figura 1). Con una dosis menor de aditivo (1 \mug) y una
dosis baja o alta de antígeno (1 o 10 \mug de HBsAg), se encontró
que el oligonucleótido CpG era equivalente a CT para inducir IgG
anti-HBs plasmática (p = 0,73 con 1 \mug de HBsAg
y 0,13 con 10 \mug de HBsAg). El oligonucleótido CpG y CT eran
también equivalentes con una dosis alta de aditivo (10 \mug) y una
dosis alta de antígeno (10 \mug de HBsAg) (p = 0,08), sin embargo,
con una dosis menor del antígeno, la dosis superior de CT era
superior a la del oligonucleótido CpG (p = 0,01) (Figura 1). Estos
resultados indican que el oligonucleótido CpG es esencialmente
igual a CT para potenciar las respuestas inmunes sistémicas con la
administración en la mucosa (IN) de un antígeno
proteico.
proteico.
Una dosis baja combinada de oligonucleótido CpG
y CT (1 \mug de cada uno) proporcionaba una mejor respuesta
humoral sistémica que con 10 \mug de oligonucleótido CpG por
separado (p = 0,01) y era igual que con 10 \mug de CT por separado
(p = 0,22), cuando se añadía a 1 \mug de dosis de HBsAg. Además,
con una dosis de 10 \mug de HBsAg, los aditivos combinados (1
\mug de cada uno) inducían títulos de IgG anti-HBs
tan altos como los de con 10 \mug de cualquier aditivo aislado
(CT, p = 0,27; oligonucleótido CpG, p = 0,09) (Figura 1). Este
resultado indica que el oligonucleótido CpG puede actuar de forma
sinérgica con CT, cuando se administra al tejido mucoso para inducir
respuestas humorales sistémicas fuertes y de este modo permitir que
se administre una dosis menor de aditivo.
Los títulos de anticuerpo se incrementaron
adicionalmente aproximadamente 10 veces, reforzando a las 8 semanas.
Los títulos posteriores al refuerzo de la IgG plasmática eran
equivalentes para CT y para el oligonucleótido CpG empleado de forma
aislada, y eran 5-10 veces superiores que los
obtenidos con los aditivos juntos (Figura 2). Estos resultados
indican que el efecto del aditivo de oligonucleótido CpG aislado o
junto con CT se puede mejorar con el refuerzo.
La evaluación del plasma en busca de isotipos
del anticuerpo IgG después de una inmunización mucosa aislada,
mostraba predominantemente anticuerpos IgG1 (similares a Th2) con CT
y anticuerpos mezclados IgG1/IgG2a (Th0) con oligonucleótido CpG
aislado o junto con CT. La proporción de isotipo IgG2a de
anticuerpos, era aproximadamente 10 veces superior con ODN CpG que
con CT, indicando una mayor influencia de Th1 de ODN CpG comparada
con CT. Además, la combinación de ODN CpG y CT proporcionaba
relaciones 50 veces mayores de IgG2a: IgG1 que con CT aislada
(Figura 3). Después del refuerzo, los anti-HBs eran
casi predominantemente IgG1 con CT y mezclados con oligonucleótido
CpG, aunque en el último caso, la proporción de IgG2a no era
superior. Sorprendentemente, los anti-HBs
plasmáticos después del refuerzo con el oligonucleótido CpG y CT
eran ahora predominantemente IgG2a (similar a Th-1)
(Figura 3). Estos resultados indican que el oligonucleótido CpG como
aditivo de la mucosa estimula una respuesta similar a
Th-1, incluso en presencia de un aditivo fuerte
similar a Th-2, tal como CT.
Se encontraron resultados similares cuando se
utilizaba LT en lugar de CT (Figura 7, Tablas 2 y 3). La CT y la LT
que están estrechamente relacionadas con una homología estructural y
funcional considerable, son ambas demasiado tóxicas para el uso en
humanos. Sin embargo, hay un número de derivaciones de CT y de LT
que mantienen alguna actividad como aditivo y que son mucho menos
tóxicas. Un ejemplo es la subunidad B de CT (CTB) que no es tóxica
puesto que la toxicidad está asociada con la subunidad A. Otro
ejemplo es LTK63, un mutante destoxificado genéticamente de LT que
no tiene actividad tóxica. Aunque estos aditivos se están empleando
en ensayos clínicos en humanos, ninguno era tan fuerte como ODN CpG
para inducir una inmunidad sistémica (IgG sérica) cuando se empleó
cada una con 1 \mug (Figura 7). También existe un efecto sinérgico
cuando ODN CpG y CTB o LTK63 se emplean juntas, sin embargo, no se
observó para la tendencia a Th1 ni para la fuerza de la respuesta
del anticuerpo (Figura 7 y Tabla 2).
Se indujeron sólo unos niveles bajos de CTL con
HBsAg aislada, sin embargo, la adición de oligonucleótido CpG o CT
incrementaba significativamente la actividad de los CTL específicos
de HBsAg. Las respuestas de los CTL eran equivalentes en CT y en el
oligonucleótido CpG, independientemente de la dosis. Sin embargo,
una combinación de CT y de oligonucleótido CpG (1 \mug de cada
uno), incrementaba las respuestas de los CTL aproximadamente por
dos. (Figura 4).
No se detectaron S-IgA
anti-HBs en los lavados pulmonares de ratones
inmunizados con 1 o 10 \mug de HBsAg aislada. Tampoco se
detectaron IgA anti-HBs con la dosis baja de
antígeno combinado con una dosis baja (1 \mug) de oligonucleótido
CpG o CT o con una dosis alta de oligonucleótido CpG; se detectaron
sólo títulos bajos con dosis baja de antígeno y dosis alta de CT
(Figura 5). Sin embargo, cuando se emplearon dosis bajas de ambos,
oligonucleótido CpG y CT (1 \mug de cada uno), junto con la dosis
baja de antígeno, se pudieron detectar en los lavados pulmonares,
niveles significativos de S-IgA específica de HBsAg
(Figura 5).
Con una dosis superior de antígeno (10 \mug),
se detectó S-IgA en lavados pulmonares de ratones a
los que se habían administrado las dosis altas o bajas de CT y/o de
oligonucleótido CpG. Los títulos de IgA serán significativamente
superiores con 1 \mug de los dos aditivos juntos que con 10 \mug
de CT o de oligonucleótido CpG por separado (p = 0,0003 y <
0,0001, respectivamente) (Figura 5). Los títulos de IgA se
incrementaban aproximadamente diez veces después del refuerzo con
ambos aditivos. Por tanto, el oligonucleótido CpG puede inducir una
inmunidad mucosa local específica, contra el antígeno administrado
intranasalmente. Además, de forma similar a lo encontrado para la
respuesta sistémica (arriba), el oligonucleótido CpG actúa de forma
sinérgica con CT para inducir la inmunidad de la
mucosa.
mucosa.
También se detectó IgA en sedimentos fecales de
ratones inmunizados con HBsAg y con 10 \mug de oligonucleótido
CpG. Por el contrario, sólo niveles muy bajos fueron detectados en
los ratones inmunizados con HBsAg junto con CT (1 o 10 \mug)
(Figura 6). Por tanto, el oligonucleótido CpG puede inducir la
inmunidad de la mucosa en sitios distantes de la mucosa.
El suministro IN de HBsAg (1 \mug) sin
aditivo, no inducía anticuerpos IgG anti-HBs
detectables en el plasma de ningún ratón (0/15). Por el contrario,
se inducían títulos superiores de IgG anti-HBs en
todos los ratones cuando se administraba HBsAg junto con CpG, CT o
LT como aditivo (Figura 7, Tabla 2). A una dosis baja (1 \mug),
LT, CT y CpG tenían títulos de IgG anti-HBs
equivalentes (p = 0,22). Con una dosis alta (10 \mug) CT y LT
tenían títulos superiores a los de CpG, sin embargo, 5/10 ratones
que recibían esta dosis de LT, murieron a los 10 días. No se detectó
IgG anti-HBs detectable con una dosis baja (1
\mug) de CTB o LTK63, pero con una dosis alta (10 \mug) de CTB,
tenían títulos bajos de IgG anti-HBs con ELISA de
punto final y una dosis alta (10 \mug) de LTK63 proporcionaba
niveles de IgG anti-HBs tan buenos como con una
dosis alta (10 \mug) de CpG (p = 0,97) (Figura 7, Tablas 2 y
3).
Cuando se emplean conjuntamente, CpG y LT o CT
(1 \mug de cada una) parecía que había un efecto sinérgico, puesto
que los títulos de anti-HBs eran de 5 a 10 veces
superiores que los conseguidos con uno cualquiera de los tres
aditivos por separado (Figura 7). Además, CpG más LT (1 \mug de
cada uno) proporcionaban una respuesta mejor que 10 \mug de CpG o
de LT, por separado (p = 0,007, 0,015 respectivamente) y la
respuesta con CpG más CT (1 \mug de cada uno) era igual a la
conseguida con 10 \mug de CT por separado (p = 0,65). Por el
contrario, no había un efecto sinérgico con LTK63 más CpG (1 \mug
de cada uno) para los títulos de IgG anti-HBs, lo
que era equivalente con los de 1 \mug de CpG por separado (p =
0,40). Sorprendentemente, CTB más CpG (1 \mug de cada uno)
proporcionaban menos títulos de anti-HBs que 1
\mug de CpG por separado (p = 0,007) (Figura 7). Los efectos de
los aditivos con ODN CpG eran debidos al motivo CpG más que a un
efecto no específico sobre el esqueleto de ODN ya que los ratones
inmunizados con 1 \mug de HBsAg más 10 \mug de ODN no CpG no
tenían títulos (7/10) o tenían títulos muy bajos (3/10) de
anticuerpos IgG anti-HBs (datos no mostrados).
Los anticuerpos eran preferentemente IgG1
(similar a Th2) con CT, CTB y LT e IgG1/IgG2a (Th1l/Th2) mezcladas
con LTK63. Con una dosis baja (1 \mug), las respuestas con CpG
eran IgG1/IgG2a (Th1/Th2) mezcladas, pero con una dosis más alta (10
\mug) eran más Th1 (IgG2a>>IgG1). Las respuestas eran
Th1/Th2 mezcladas con CT/CpG o CTB/CpG y más Th1 con LT/CpG. Con una
dosis baja (1 \mug de cada uno), las respuestas de LTK63/CpG eran
Th1/Th2, pero con una dosis superior (10 \mug de cada uno) eran
más Th1 (Tabla 3). Por tanto, la administración conjunta de CpG con
otros aditivos desviaba las respuestas más hacia una respuesta
similar a Th-1, tal y como se indica por la mayor
proporción de anticuerpos IgG2a.
Cuando los aditivos se emplearon de forma
individual, sólo los ratones que recibían LT o LTK63 tenían IgA
detectable en lavados pulmonares, sin embargo, cuando también se
incluía ODN CpG con CT o LT, un número superior de animales
respondía o los títulos eran superiores que con dosis comparables
aisladas, lo que sugería un efecto sinérgico. La CpG sola no inducía
IgA. Tampoco la CTB aislada o combinada con CpG (Tabla 3).
Sólo unos pocos aditivos por sí mismos (LT y
CpG) inducían IgA en las heces y entonces sólo en algunos animales.
No se detectó IgA significativa con CT, CTB, LTK63 o ODN no CpG. CpG
y LT juntas daban como resultado IgA en las heces de una proporción
de animales superior a la de sólo con aditivo, lo que sugiere un
efecto aditivo o sinérgico. Con otras combinaciones no eran
evidentes tales efectos (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Alpar HO, Ozsoy Y, Bowen J,
Eyles JE, Conway BR, Williamson ED. Potential
of particulate carriers for the mucosal delivery of DNA vaccines.
Biochemical Society Transactions 1997;
25(2):337S.
Ballas, Z. K., W. L. Rasmussen y
A. M. Krieg. 1996. Induction of natural killer
activity in murine and human cells by CpG motifs in
oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J. Immunol.
157,1840.
Bird, A. P. CpG islands as gene markers
in the vertebrate nucleus. 1987. Trends in Genetics 3:
342.
Bowersock TL. Shalaby WS.
Levy M. Samuels ML. Lallone R. White MR.
Borie DL. Lehmeyer J. Park K. Evaluation of an
orally administered vaccine, using hydrogels containing bacterial
exotoxins of Pasteurella haemolytica, in cattle. Am. J.
Vet. Res. 1994; 55: 502-9.
Bueler H y Mulligan RC. Induction
of antigen-specific tumor immunity by genetic and
cellular vaccines against MAGE: enhanced tumor protection by
coexpression of granulocyte macrophage
colony-stimulating factor and B7-1.
1996; 2; 545-555.
Chace, J. H., N. A. Hooker, K. L.
Mildenstein, A. M. Krieg y J. S. Cowdery.
1997. Bacterial DNA-induced NK cell
IFN-\gamma production is dependent on macrophage
secretion of IL-12. Clin. Immunol.
Immunopath., 84: 185.
Chow YH, Huang WL, Chi WK,
Chu YD, Tao MH. Improvement of hepatitis B virus DNA
vaccines by plasmids coexpressing hepatitis B surface antigen and
interleukin-2. Journal of Virology
1997; 71 (1): 169-78.
Cong Y. Weaver CT. Elson
CO. The mucosal adjuvanticity of cholera toxin involves enhancement
of costimulatory activity by selective up-regulation
of B7.2 expression. J. Immunol. 1997; 159:
5301-8.
Constant SL. Bottomly K. Induction
of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches.
Ann. Rev. Immunol. 1997; 15:
297-322.
Cowdery, J. S., J. H. Chace y A.
M. Krieg. 1996. Bacterial DNA induces in vivo
interferon-\gamma production by NK cells and
increases sensitivity to endotoxin. J. Immunol. 156:
4570.
Davis HL, Weeratna R,
Waldschmidt TJ, Schorr J y Krieg AM. CpG DNA is
a potent adjuvant in mice immunized with recombinant hepatitis B
surface antigen. J. Immunol. 1998; 160:
870-876.
De Haan L. Verweij WR. Feil
IK. Lijnema TH. Hol WG. Agsteribbe E. Wilschut J.
Mutants of the Escherichia coli heat-labile
enterotoxin with reduced ADP-ribosylation activity
or no activity retain the immunogenic properties of the native
holotoxin. Infect. Immun. 1996; 64:
5413-6.
Delong R. Stephenson K.
Loftus T. Fisher M. Alahari S. Nolting
A. Juliano RL. Characterization of complexes of
oligonucleotides with polyamidoamine starburst dendrimers and
effects on intracellular delivery. J. Pharmac. Sci.
1997; 86: 762-4.
Douce G. Turcotte C.
Cropleyl. Roberts M. Pizza M. Domenghini
M. Rappuoli R. Dougan G. Mutants of Escherichia
coli heat-labile toxin lacking
ADP-ribosyltransferase activity act as nontoxic,
mucosal adjuvants. PNAS. 1995; 92:
1644-8.
Eldridge J, Staas JK.,
Meulbroek JA., McGhee JR. Biodegradable microspheres
as a vaccine delivery system. Molecular Immunology
1991; 28: 287-294.
Gallichan WS, Rosenthal KL.
Specific secretory immune responses in the female genital tract
following intranasal immunization with a recombinant adenovirus
expressing glycoprotein B of herpes simplex virus. Vaccine
1995; 13 (16):1589-95.
Geissler M, Gesien A,
Tokushige K, Wands JR. Enhancement of cellular and
humoral immune responses to hepatitis C virus core protein using
DNA-based vaccines augmented with
cytokine-expressing plasmids. J Immunol
1997; 158 (3): 1231-7.
Gregoriadis G. Engineering liposomes for
drug delivery: progress and problems. Trends Biotech.
1995; 13: 527-537.
Halpern, M. D., R. J. Kurlander y
D. S. Pisetsky. 1996. Bacterial DNA induces murine
interferon-\gamma production by stimulation of
interleukin-12 and tumor necrosis
factor-\alpha. Cell. Immunol.167': 72.
Haneberg B, Kendall D,
Amerongen HM, Apter FM, Kraehenbuhl
J-P y Neutra MR. Induction of specific
immunoglobulin A in the small intestine,
colon-rectum, and vagina measured by a new method
for collection of secretions from local mucosal surfaces. Infect.
Immun. 1994; 15-23.
Hogg JC. The pathology of asthma.
APMIS. 1997; 105; 10: 735-45.
Holmgren J, Lycke N,
Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera B subunit as
oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems.
Vaccine 1993; 11:1179-1184.
Homquist E. Lycke N. Cholera toxin
adjuvant greatly promotes antigen priming of T cells. Eur.
J. Immunol. 1993; 23: 2136-43.
Kay AB. TH2-type
cytokines in asthma. Ann. NY Acad. Sci. 1996; 796:
1-8.
Kim JJ, Ayyavoo V,
Bagarazzi ML, Chattergoon MA, Dang K,
Wang B, Boyer JD y Weiner D B. In vivo
engineering of a cellular immune response by coadministration of
IL-12 expression vector with a DNA immunogen. J.
Immunol. 1997; 158: 816-26.
Klinman DM, Yamshchikov G e
Ishigatsubo Y. Contribution of CpG motifs to the
immunogenicity of DNA vaccines. J. Immunol. 1997; 158:
3635-3659.
Klinman, D., A.-K. Yi, S. L.
Beaucage, J. Conover y A. M. Krieg.
1996. CpG motifs expressed by bacterial DNA rapidly induce
lymphocytes to secrete IL-6, IL-12
and IFN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2879.
Krieg, A. M., A.-K. Yi, S.
Matson, T. J. Waldschmidt, G. A. Bishop, R.
Teasdale, G. Koretzky y D. Klinman. CpG motifs
in bacterial DNA trigger direct B-cell activation.
1995. Nature 374: 546.
Krieg, A. M. 1996 An innate immune
defense mechanism based on the recognition of CpG motifs in
microbial DNA. J. Lab. Clin. Med. 128: 128.
Kukowska-Latallo JF.
Bielinska AU. Johnson J. Spindler R.
Tomalia DA. Baker JR Jr. Efficient transfer of genetic
material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine
dendrimers. PNAS. 1996; 93:
4897-902.
Lamm ME, Mazanec MB, Nedrud
JG, Kaetzel CS. Mechanisms of IgA-mediated
mucosal defense. Vaccine Res. 1992; 1:
169-173.
Lycke N, Tsuji T y Holmgren
J. The adjuvant effect of Vibrio cholerae and Escherichia
coli heat-labile enterotoxins is linked to their
ADP-ribosyltransferase activity. Eur. J.
Immunol. 1992; 22: 2277-2281.
Maloy KJ. Donachie AM.
Mowat AM. Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses by
oral or parenteral immunization with ISCOMS. Eur. J. Immunol.
1995; 25: 2835-41.
Mannino RJ y
Gould-Fogerite S. Lipid
matrix-based vaccines for mucosal and systemic
immunization. En: Vaccine Design; The subunit and adjuvant approach.
(compiladores Powell MF y Newman MJ) Plenum Press, Nueva
York. 1995; 363-387.
McGhee JR, Mestecky J,
Dertzbaugh MT, Eldridge JH, Hirasawa M,
Kiyono H. The mucosal immune system: from fundamental
concepts to vaccine development. Vaccine 1992; 10:
75-88.
Messina, J. P., G. S. Gilkeson y
D. S. Pisetsky. 1991. Stimulation of in vitro
murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA. J. Immunol.
147: 1759.
Mestecky J, McGhee JR. Prospects
for human mucosal vaccines. En: Ciardi JE, compilador. Genetically
Engineered vaccines. Nueva York: Plenum Press, 1992:
13-23.
O'Hagan DT. Oral immunization and the
common mucosal immune system. En: O'Hagan DT, compilador. Novel
Delivery Systems for Oral Vaccines. Boca Raton: CRC Press,
1994: 1-24.
O'Hagan DT, Rahman D,
Jeffery H, Sharif S, Challacombe SJ. Controlled
release microparticles for oral immunization. Int. J. Pharm.
1994; 108: 133-139.
Pizza M. Fontana MR.
Giuliani MM. Domenighini M. Magagnoli C.
Giannelli V. Nucci D. Hol W. Manetti R.
Rappuoli R. A genetically detoxified derivative of
heat-labile Escherichia coli enterotoxin
induces neutralizing antibodies against the A subunit. J. Exp.
Med. 1994; 180: 2147-53.
Rappuoli R. Douce G. Dougan
G. Pizza M. Genetic detoxification of bacterial toxins: a new
approach to vaccine development. Int Arch Allergy Immunol.
1995; 108: 327-33.
Sato Y. Roman M. Tighe H.
Lee D. Corr M. Nguyen MD. Silverman GJ.
Lotz M. Carson DA. Raz E. Immunostimulatory DNA
sequences necessary for effective intradermal gene immunization.
Science. 1996; 273: 352-4.
Schirmbeck R, Melber, K,
Kuhröber A, Janowicz ZA y Reimann J.
Immunization with soluble hepatitis B virus surface protein elicits
murine H-2 class I-restricted CD8+
cytotoxic T lymphocyte responses in vivo. J. Immunol.
1994; 152: 1110-1119.
Sjolander A. Lovgren Bengtsson K.
Johansson M. Morein B. Kinetics, localization and isotype
profile of antibody responses to immune stimulating complexes
(ISCOMS) containing human influenza virus envelope glycoproteins.
Scand. J. Immunol. 1996; 43:
164-72.
Sjolander A. van't Land B.
Lovgren Bengtsson K. Iscoms containing purified Quillaja
saponins upregulate both Th1-like and
Th2-like immune responses. Cell. Immunol.
1997; 177: 69-76.
Snider DP. The mucosal adjuvant
activities of ADP-ribosylating bacterial
enterotoxins. Crit. Rev. Immunol. 1995; 15:
317-48.
Spangler BD. Structure and function of
cholera toxin and the related Escherichia coli
heat-labile enterotoxin. Microbiol. Rev.
1992; 56: 622-647.
Staats HF, Jackson RJ,
Marinaro M, Takahashi I, Kiyono H,
McGhee JR. Mucosal immunity to infection with implications
for vaccine development. Current Biology. 1994; 6:
572-583.
Tokunaga, T.H. Yamamoto, S.
Shimada, H. Abe, T. Fukuda, Y. Fujisawa,
Y. Furutani, O. Yano, T. Kataoka, T.
Sudo, N. Makiguchi y T. Suganuma. 1984.
Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from
mycobacterium bovis GCG. I. Isolation, physicochemical
characterization, and antitumor activity. JNCI 72: 955.
Tsuji T, Hamajima K, Ishii
N, Aoki I, Fukushima J, Xin KQ, Kawamoto
S, Sasaki S, Matsunaga K, Ishigatsubo Y,
Tani K, Okubo T y Okuda K. Immunomodulatory
effects of a plasmid expressing B7-2 on human
immunodeficiency virus-1-specific
cell-mediated immunity induced by a plasmid encoding
the viral antigen. Eur. J. Immunol. 1997; 27:
782-7.
Valodas, J., Davies, J. K.,
Wright, P. J., Strugnell R. A. Intranasal immunization
with liposomes induces strong mucosal immune responses in mice.
Eur. J. Immunol. 1995; 25:
969-975.
Weeratna R, Brazolot Millan CL,
Krieg AM y Davis HL. Reduction of antigen expression
from DNA vaccines by co-administered
oligodeoxynucleotides. Anti. Nucl. Acid Res. (en prensa).
Yamamoto, S., T. Yamamoto, S.
Shimada, E. Kuramoto, O. Yano, T.
Kataoka y T. Tokunaga. 1992. DNA from bacteria,
but not from vertebrates, induces interferons, activates natural
killer cells and inhibits tumor growth. Microbiol. Immunol.
36: 983.
Yi, A.-K., Cowdery, J. S., J. H.
Chace y A. M. Krieg. 1996.
IFN-\gamma promotes IL-6 and
Ig-M secretion in response to CpG motifs in
bacterial DNA and ODN. J. Immunol., 156: 558.
La memoria descriptiva escrita anteriormente se
considera que es suficiente para permitir que un experto en la
técnica ponga en práctica la invención. La presente invención no se
debe limitar en el alcance a los ejemplos proporcionados, puesto que
los ejemplos pretenden ser una mera ilustración de un aspecto de la
invención.
<110> Ottawa Civic Hospital Loeb Research
Institute
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y productos para inducir
inmunidad en mucosas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C1040/7006WO/HCL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/086,393
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-05-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagatgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgacgtt gagct
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaggtc cagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18) ... (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaggtc caacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctg gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc gaccttcgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctg gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgatg gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc cagcactgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12) ... (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgctgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaacgtt
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagcgct
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatcgat
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcgaa
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacgtt
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaacgtt
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgttct
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaacgtc
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggactctc cagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaggtc caacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaggctc catcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14) ...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18) ... (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgccgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatggcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcga tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgc tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt ccctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt gcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccataacgt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt ccctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatcacgt gcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtcaacg ttgacgggg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtcagtc gtgacgggg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agtgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg atctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccagcg tgcgccat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg aactgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg agctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg acctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg tactgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg gtctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg ttctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgttgagg ggcat
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagcgtgcg cc
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgacgttcc tgacgtt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccagcg ggcgcat
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt tcctgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatagcgt tcctagcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgctgt ctccccttct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgacgtt cctgacgtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtcgtt cctgtcgtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt ttttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtcgtt ccttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccttgtcgt tcctgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtcgtt ttttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgctgt ctgcccttct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgctgt tgtcgtttct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgcgtg cgtgcgtttt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgcgtt gcgttgcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccacgacgt tttcgacgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgttgt cgttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgtttt gtcgttttgtcgtt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgttgt cgttttgtcg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtgcgttg tcgttgtcgt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgtttgt cgtttgtcgt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgttgtc gttgtcgtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgtcgt cgtt
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgttgtc gtt
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatagcgt tcctagcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgacgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgyt
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
<212 > DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgyt
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctatgacg ttccaagg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgacgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccaggactt ctctcaggtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gaacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgacgca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcgat
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataggaggtc caacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Ottawa Civic Hospital Loeb Research
Institute
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y productos para inducir
inmunidad en mucosas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> C1040/7006WO/HCL
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/086,393
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-05-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagatgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)...(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agcgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgacgtt gagct
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaggtc cagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaggtc caacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctg gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc gaccttcgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctg gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgatg gaccttccat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacgctc cagcactgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgctgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaacgtt
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagcgct
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatcgat
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcgaa
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacgtt
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaacgtt
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgttct
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaacgtc
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggactctc cagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaggtc caacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaggctc catcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> m5c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gagcgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgccgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatggcgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgg tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcga tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgc tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt ccctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt gcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccataacgt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt ccctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatcacgt gcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtcaacg ttgacgggg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggtcagtc gtgacgggg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctagacgtt agtgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt tcctgatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg atctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccagcg tgcgccat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg aactgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg agctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg acctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg tactgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg gtctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatggacg ttctgtttcc cctc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgttgagg ggcat
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagcgtgcg cc
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgacgttcc tgacgtt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcccagcg ggcgcat
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt tcctgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatagcgt tcctagcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgctgt ctccccttct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgacgtt cctgacgtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtcgtt cctgtcgtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgt ttttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtcgtt ccttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccttgtcgt tcctgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctgtcgtt ttttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgctgt ctgcccttct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgctgt tgtcgtttct t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgcgtg cgtgcgtttt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgcgtt gcgttgcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccacgacgt tttcgacgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgttgt cgttgtcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgttgt cgttttgtcg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtgcgttg tcgttgtcgt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgtttgt cgtttgtcgt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgttgtc gttgtcgttg tcgtt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgttgtc gttgtcgtt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtcgtcgt cgtt
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgttgtc gtt
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatagcgt tcctagcgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgacgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgyt
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcgyt
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctatgacg ttccaagg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgacgt tcctgacgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccaggactt ctctcaggtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgactctc gaacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatgtcgg tcctgacgca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttcgat
\hfill8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
inmunoestimulador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataggaggtc caacgttctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (54)
1. Uso de un oligonucleótido que tiene una
secuencia que incluye al menos la siguiente fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, para la
preparación de una composición para administrar a una superficie
mucosa de un individuo que también está expuesto a un antígeno, para
inducir una respuesta inmune mucosa frente a dicho antígeno en dicho
individuo.
2. Un uso según la reivindicación 1, en donde la
composición se administra oralmente.
3. Un uso según la reivindicación 1, en donde la
composición se administra intranasalmente.
4. Un uso según la reivindicación 1, en donde la
composición se administra rectalmente.
5. Un uso según la reivindicación 1, en donde la
composición se administra vaginalmente.
6. Un uso según la reivindicación 1, en donde la
composición se administra ocularmente.
7. Un uso según la reivindicación 1, en donde la
composición se administra por inhalación.
8. Un uso según la reivindicación 1, en donde
tanto el antígeno como la composición se administran oralmente.
9. Un uso según la reivindicación 1, en donde
tanto el antígeno como la composición se administran
intranasalmente.
10. Un uso según la reivindicación 1, en donde
tanto el antígeno como la composición se administran
rectalmente.
11. Un uso según la reivindicación 1, en donde
tanto el antígeno como la composición se administran
vaginalmente.
12. Un uso según la reivindicación 1, en donde
tanto el antígeno como la composición se administran
ocularmente.
13. Uso de un oligonucleótido según la
reivindicación 1, en donde el antígeno no está codificado en un
vector de ácido nucleico.
14. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en donde el individuo está expuesto
activamente al antígeno.
15. Un uso según la reivindicación 14, en donde
el antígeno se administra intranasalmente.
16. Un uso según la reivindicación 14, en donde
el antígeno se administra vaginalmente.
17. Un uso según la reivindicación 14, en donde
el antígeno se administra rectalmente.
18. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en donde el antígeno se administra al mismo
tiempo que la composición.
19. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde el individuo está expuesto
pasivamente al antígeno.
20. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en donde la composición se administra en
una cantidad eficaz para inducir inmunidad mucosa.
21. Un uso según la reivindicación 20, en donde
el individuo es un asmático o tiene riesgo de desarrollar una
reacción alérgica, una enfermedad infecciosa o un cáncer.
22. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en donde la composición se administra junto
con una citoquina o una molécula coestimuladora
B-7.
23. Un uso de un oligonucleótido según la
reivindicación 1, en donde la composición se administra a una
superficie mucosa de un individuo, al mismo tiempo que un
antígeno.
24. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, en donde la inmunidad mucosa se induce en
un sitio distante.
\newpage
25. Un uso según la reivindicación 14 o la
reivindicación 23, en donde un aditivo de la mucosa no
oligonucleótido se administra junto con el antígeno.
26. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 14, 23 o 25, en donde se administra al individuo un
refuerzo de oligonucleótido.
27. Un uso según la reivindicación 26, en donde
también se administra al individuo un refuerzo de aditivo de la
mucosa no oligonucleótido.
28. Un uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27, en donde X_{1}X_{2} son nucleótidos
seleccionados entre el grupo consistente en: GpT, GpG, GpA, ApA,
ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT y TpG; y X_{3}X_{4} son
nucleótidos seleccionados entre el grupo consistente en: TpT, CpT,
ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA y CpA.
29. Un producto que comprende un oligonucleótido
que tiene una secuencia que incluye al menos la siguiente
fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, un antígeno y
una hormona para el uso simultáneo, separado o secuencial para
inducir en un individuo una respuesta inmune mucosa a dicho
antígeno.
30. Un producto según la reivindicación 29, en
donde el antígeno y el oligonucleótido se administran a una
superficie mucosa del individuo.
31. Un producto según la reivindicación 29 o 30,
en donde la hormona se administra sistémicamente.
32. Uso de un oligonucleótido que tiene una
secuencia que incluye al menos la siguiente fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada, en
donde X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y un
antígeno que no está codificado en un vector de ácido nucleico, para
la preparación de un medicamento para administrar de forma
simultánea, separada o secuencial a una superficie mucosa de un
individuo, para inducir una respuesta inmune sistémica frente a
dicho
antígeno.
33. Un uso según la reivindicación 32, en donde
el antígeno no produce una respuesta inmune sistémica cuando se
administra de forma aislada a la superficie mucosa.
34. Un uso según la reivindicación 14 o 33, en
donde el antígeno se administra junto con un sistema de dispersión
coloidal.
35. Un uso según la reivindicación 32, en donde
un aditivo de la mucosa no oligonucleótido se administra junto con
el antígeno y el oligonucleótido.
36. Un producto que comprende un oligonucleótido
que tiene una secuencia que incluye al menos la siguiente
fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada, en
donde X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, y un
aditivo de la mucosa no oligonucleótido, para la administración
simultánea, separada o secuencial a una superficie mucosa de un
individuo, que también está expuesto a un antígeno, para inducir una
respuesta inmune sistémica frente a dicho
antígeno.
37. Un producto que comprende un oligonucleótido
que tiene una secuencia que incluye al menos la siguiente
fórmula:
5'
X_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada, en
donde X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos, un
aditivo de la mucosa no oligonucleótido y un antígeno, para la
administración simultánea, separada o secuencial a una superficie
mucosa de un
individuo.
38. Un producto según la reivindicación 37, en
donde el individuo está expuesto activamente al antígeno y el
antígeno se administra junto con un sistema de dispersión
coloidal.
\newpage
39. Un uso según la reivindicación 34 o un
producto según la reivindicación 38, en donde el sistema de
dispersión coloidal se selecciona entre el grupo que consiste en
complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, lechos y
sistemas a base de lípidos.
40. Un uso o un producto según la reivindicación
39, en donde el sistema a base de lípidos se selecciona entre el
grupo que consiste en emulsiones de
aceite-en-agua, micelas, micelas
mixtas y liposomas.
41. Un producto según la reivindicación 38, en
donde el antígeno se administra a una superficie mucosa.
42. Un uso según la reivindicación 26 o 35 o un
producto según la reivindicación 41, en donde el aditivo de la
mucosa no oligonucleótido se selecciona entre el grupo consistente
en la toxina colérica, los derivados de la toxina colérica, la
enterotoxina termolábil, los derivados de la enterotoxina
termolábil, alum, MLP, MDP, saponinas tales como QS21, citoquinas,
formulaciones de emulsiones de
aceite-en-agua y otras, tales como
MF59, SAF, Montanide ISA 720 y PROVAX, polímeros PCPP e ISCOMS.
43. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28 o un producto según una cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 31 o 36 a 42, en donde el oligonucleótido
tiene de 8 a 100 nucleótidos de longitud.
44. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28 o 43 o un producto según una cualquiera de
las reivindicaciones 29 a 31, 36 a 42 o 43, en donde el
oligonucleótido:
(a) incluye una modificación del esqueleto de
fosfato que es una modificación fosforotioato o fosforoditioato;
o
(b) tiene un esqueleto quimérico.
45. Un uso o un producto según la reivindicación
44, en donde la modificación del esqueleto de fosfato tiene lugar en
el extremo del extremo 5' del oligonucleótido y/o del extremo 3' del
nucleótido.
46. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 35 o 39 a 43 o un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 o 36 a 42, en donde
X_{1}X_{2} son nucleótidos seleccionados entre el grupo
consistente en: GpT, GpG, GpA, y ApA y X_{3}X_{4} son
nucleótidos seleccionados entre el grupo consistente en: TpT, CpT,
ApT y TpC.
47. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, 32 a 35 o 39 a 43 o un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 o 36 a 42, en donde el
oligonucleótido tiene una secuencia que incluye al menos la
siguiente fórmula:
5'
TCNTX_{1}X_{2}CGX_{3}X_{4}3'
en donde C no está metilada y
X_{1}, X_{2}, X_{3} y X_{4} son nucleótidos y N es una
secuencia de ácido nucleico compuesta por aproximadamente
0-25
nucleótidos.
48. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, 32 a 35 o 39 a 43 o un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 o 37 a 42, en donde el
antígeno se selecciona entre el grupo consistente en células,
extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos,
polisacáridos, conjugados de polisacáridos, miméticos peptídicos de
polisacáridos, lípidos, glicolípidos, carbohidratos, alérgenos,
virus y extractos víricos y organismos pluricelulares, tales como
parásitos.
49. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, 32 a 35 o 39 a 43 o un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 o 37 a 42, en donde el
antígeno es un alérgeno.
50. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, 32 a 35 o 39 a 43 o un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 o 37 a 42, en donde el
antígeno se obtiene a partir de un organismo infeccioso seleccionado
entre el grupo consistente en bacterias infecciosas, virus
infecciosos, parásitos infecciosos y hongos infecciosos.
51. Un producto según la reivindicación 36, en
donde el antígeno no se codifica en un vector de ácido nucleico.
52. Un uso según la reivindicación 14, en donde
el antígeno se administra a una superficie mucosa.
53. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, 32 a 35 o 39 a 43 o un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 o 37 a 42, en donde el
antígeno es un péptido.
54. Un uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, 32 a 35 o 39 a 43, o un producto según una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 o 37 a 42, en donde el
antígeno es una proteína.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8639398P | 1998-05-22 | 1998-05-22 | |
US86393P | 1998-05-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2272069T3 true ES2272069T3 (es) | 2007-04-16 |
Family
ID=22198286
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES06118586.4T Expired - Lifetime ES2628744T3 (es) | 1998-05-22 | 1999-05-21 | Métodos y productos para inducir inmunidad en mucosas |
ES99925754T Expired - Lifetime ES2272069T3 (es) | 1998-05-22 | 1999-05-21 | Metodos y productos para inducir inmunidad en mucosas. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES06118586.4T Expired - Lifetime ES2628744T3 (es) | 1998-05-22 | 1999-05-21 | Métodos y productos para inducir inmunidad en mucosas |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8574599B1 (es) |
EP (2) | EP1733735B1 (es) |
JP (1) | JP2002516294A (es) |
AT (1) | ATE335510T1 (es) |
AU (1) | AU761899B2 (es) |
BR (1) | BR9910643A (es) |
CA (1) | CA2328894A1 (es) |
CY (1) | CY1107337T1 (es) |
DE (1) | DE69932717T2 (es) |
DK (2) | DK1733735T3 (es) |
ES (2) | ES2628744T3 (es) |
HK (1) | HK1037125A1 (es) |
IL (2) | IL139813A0 (es) |
NZ (1) | NZ508927A (es) |
PT (2) | PT1733735T (es) |
SI (1) | SI1077722T1 (es) |
WO (1) | WO1999061056A2 (es) |
ZA (1) | ZA200006765B (es) |
Families Citing this family (79)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7935675B1 (en) | 1994-07-15 | 2011-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US20030026782A1 (en) | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
US6239116B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US5981501A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
EP0855184A1 (en) | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
US6406705B1 (en) | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
US6287591B1 (en) * | 1997-05-14 | 2001-09-11 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Charged therapeutic agents encapsulated in lipid particles containing four lipid components |
EP1003531B1 (en) | 1997-05-20 | 2007-08-22 | Ottawa Health Research Institute | Processes for preparing nucleic acid constructs |
US6589940B1 (en) | 1997-06-06 | 2003-07-08 | Dynavax Technologies Corporation | Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof |
DE69932717T2 (de) | 1998-05-22 | 2007-08-09 | Ottawa Health Research Institute, Ottawa | Methoden und produkte zur induzierung mukosaler immunität |
US20030022854A1 (en) | 1998-06-25 | 2003-01-30 | Dow Steven W. | Vaccines using nucleic acid-lipid complexes |
DE69929444T2 (de) * | 1998-08-10 | 2006-09-28 | Antigenics Inc., Woburn | Cpg-zusammensetzungen, saponin-adjuvantien und verfahren zu deren verwendung |
JP2002536344A (ja) * | 1999-02-05 | 2002-10-29 | ジエンザイム コーポレイション | 抗腫瘍免疫を発生させるためのカチオン性脂質の使用 |
US7776343B1 (en) | 1999-02-17 | 2010-08-17 | Csl Limited | Immunogenic complexes and methods relating thereto |
EP1176966B1 (en) * | 1999-04-12 | 2013-04-03 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
GB9908885D0 (en) * | 1999-04-19 | 1999-06-16 | Smithkline Beecham Biolog | Vccine |
US6558670B1 (en) | 1999-04-19 | 2003-05-06 | Smithkline Beechman Biologicals S.A. | Vaccine adjuvants |
WO2000062800A2 (en) * | 1999-04-19 | 2000-10-26 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide |
WO2000062802A2 (en) * | 1999-04-20 | 2000-10-26 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | Vaccine comprising rsv antigen and cpg oligonucleotide |
DE60022665T2 (de) * | 1999-09-25 | 2006-06-22 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunstimulierende nukeinsäuren |
US6949520B1 (en) | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
JP2003514872A (ja) * | 1999-11-19 | 2003-04-22 | シーエスエル、リミテッド | ワクチン組成物 |
AU781812B2 (en) * | 2000-01-13 | 2005-06-16 | Antigenics, Inc. | Innate immunity-stimulating compositions of CPG and saponin and methods thereof |
AU2001227889A1 (en) | 2000-01-14 | 2001-07-24 | The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
US6653467B1 (en) * | 2000-04-26 | 2003-11-25 | Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
DE60139689D1 (de) | 2000-06-22 | 2009-10-08 | Univ Iowa Res Found | Kombination von CpG und Antikörpern gegen CD19,CD20,CD22 oder CD40 zur Prävention oder Behandlung von Krebs. |
WO2002011761A2 (en) * | 2000-08-10 | 2002-02-14 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Vaccine against rsv |
WO2002022809A2 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Coley Pharmaceutical Gmbh | PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST |
ES2295229T3 (es) * | 2000-10-18 | 2008-04-16 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vacunas contra canceres. |
EP2266603B1 (en) * | 2000-10-18 | 2012-09-12 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Tumour vaccines |
CA2430691A1 (en) | 2000-12-27 | 2002-07-04 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory polynucleotides and methods of using the same |
EP1404873B1 (en) | 2001-06-21 | 2013-05-22 | Dynavax Technologies Corporation | Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same |
PT1446162E (pt) | 2001-08-17 | 2009-01-27 | Coley Pharm Gmbh | Agrupamentos imunoestimuladores oligonucléotidos com actividade melhorada |
AU2002340662B2 (en) * | 2001-11-07 | 2008-07-03 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid |
CA2471092A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-10 | Antigenics Inc. | Compositions comprising immunoreactive reagents and saponins, and methods of use thereof |
EP1474432A1 (en) | 2002-02-04 | 2004-11-10 | Biomira Inc. | Immunostimulatory, covalently lipidated oligonucleotides |
JP2006502964A (ja) * | 2002-02-06 | 2006-01-26 | ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ スクール オブ メディシン | 特定の器官または組織に対する全身性免疫応答の標的化のための方法および組成物 |
CA2480775C (en) | 2002-04-04 | 2016-05-31 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides |
US20040009944A1 (en) * | 2002-05-10 | 2004-01-15 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same |
SE0201701D0 (sv) * | 2002-06-05 | 2002-06-05 | Gotovax Ab | Treatment of epithelial tumors and infections |
US20040053880A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
EP1551221A4 (en) * | 2002-07-03 | 2007-08-01 | Coley Pharm Group Inc | NUCLEIC ACID COMPOSITIONS FOR STIMULATING IMMUNE RESPONSES |
US7807803B2 (en) | 2002-07-03 | 2010-10-05 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
AR040996A1 (es) | 2002-08-19 | 2005-04-27 | Coley Pharm Group Inc | Acidos nucleicos inmunoestimuladores |
WO2004031382A1 (ja) * | 2002-10-02 | 2004-04-15 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | 新規なモノクローナル抗体の作製方法 |
EP1556077A2 (en) | 2002-10-29 | 2005-07-27 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd | Use of cpg oligonucleotides in the treatment of hepatitis c virus infection |
AU2003300919A1 (en) | 2002-12-11 | 2004-06-30 | Coley Pharmaceutical Gmbh | 5' cpg nucleic acids and methods of use |
US8158768B2 (en) | 2002-12-23 | 2012-04-17 | Dynavax Technologies Corporation | Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same |
PT1992635E (pt) | 2002-12-23 | 2012-03-20 | Dynavax Tech Corp | Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos |
US8877204B2 (en) | 2003-02-20 | 2014-11-04 | University Of Connecticut Health Center | Methods and compositions for the treatment of cancer and infectious disease using alpha (2) macroglobulin-antigenic molecule complexes |
US20040235770A1 (en) * | 2003-04-02 | 2004-11-25 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd. | Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations and related methods of use |
BRPI0411514A (pt) | 2003-06-20 | 2006-08-01 | Coley Pharm Gmbh | antagonistas de receptor toll-like de molécula pequena |
US20070219149A1 (en) * | 2003-08-11 | 2007-09-20 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Novel Vaccine Containing Adjuvant Capable Of Inducing Mucosal Immunity |
US8541002B2 (en) | 2003-09-12 | 2013-09-24 | Agenus Inc. | Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection |
CA2542099A1 (en) * | 2003-10-11 | 2005-04-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity |
SG122973A1 (en) | 2003-10-30 | 2006-06-29 | Coley Pharm Gmbh | C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency |
EP1781325A2 (en) * | 2004-07-18 | 2007-05-09 | CSL Limited | Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses |
MY159370A (en) | 2004-10-20 | 2016-12-30 | Coley Pharm Group Inc | Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides |
US20060193820A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-31 | Andrianov Alexander K | Immunostimulating polyphosphazene compounds |
WO2007004979A1 (en) | 2005-07-01 | 2007-01-11 | Index Pharmaceuticals Ab | Method for modulating responsiveness to steroids |
DK2380584T3 (da) | 2005-07-01 | 2014-01-20 | Index Pharmaceuticals Ab | Immunstimulerende fremgangsmåde |
CA2625969A1 (en) | 2005-10-28 | 2007-05-03 | Index Pharmaceuticals Ab | Composition and method for the prevention, treatment and/or alleviation of an inflammatory disease |
CA2630738C (en) * | 2005-11-25 | 2013-09-03 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunostimulatory oligoribonucleotides |
NZ575437A (en) | 2006-09-27 | 2012-02-24 | Coley Pharm Gmbh | Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity |
DE102007044093A1 (de) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Phenion Gmbh & Co. Kg | Nukleinsäurehaltige kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen zur Induktion antimikrobieller Peptide in epithelialen Deckgeweben |
NZ602945A (en) | 2008-06-27 | 2014-05-30 | Zoetis Llc | Novel adjuvant compositions |
TWI351288B (en) * | 2008-07-04 | 2011-11-01 | Univ Nat Pingtung Sci & Tech | Cpg dna adjuvant in avian vaccines |
MY160201A (en) * | 2008-12-09 | 2017-02-28 | Coley Pharm Group Inc | Immunostimulatory oligonucleotides |
RU2015117604A (ru) | 2009-04-03 | 2015-10-27 | Эйдженус Инк. | Способы получения и применения мультишаперон-антигенных комплексов |
CN105579582A (zh) | 2013-07-25 | 2016-05-11 | 埃克西奎雷股份有限公司 | 用于预防和治疗用途的作为免疫刺激剂的基于球形核酸的构建体 |
CN109675026A (zh) | 2013-09-19 | 2019-04-26 | 硕腾服务有限责任公司 | 油基佐剂 |
EP3164113B1 (en) | 2014-06-04 | 2019-03-27 | Exicure, Inc. | Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications |
JP2017537619A (ja) | 2014-11-21 | 2017-12-21 | ノースウェスタン ユニバーシティ | 球状核酸ナノ粒子複合体の配列特異的細胞内取込 |
SI3244920T1 (sl) | 2015-01-16 | 2023-09-29 | The United States of America, represented by The Secretary of Agriculture, United States Department of Agriculture | Cepivo proti slinavki in parkljevki |
US10568948B2 (en) | 2015-05-13 | 2020-02-25 | Agenus Inc. | Vaccines for treatment and prevention of cancer |
US11364304B2 (en) | 2016-08-25 | 2022-06-21 | Northwestern University | Crosslinked micellar spherical nucleic acids |
US11696954B2 (en) | 2017-04-28 | 2023-07-11 | Exicure Operating Company | Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties |
MA52363A (fr) | 2018-04-26 | 2021-03-03 | Agenus Inc | Compositions peptidiques de liaison à une protéine de choc thermique (hsp) et leurs méthodes d'utilisation |
Family Cites Families (228)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3854480A (en) | 1969-04-01 | 1974-12-17 | Alza Corp | Drug-delivery system |
US3906092A (en) | 1971-11-26 | 1975-09-16 | Merck & Co Inc | Stimulation of antibody response |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4675189A (en) | 1980-11-18 | 1987-06-23 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Microencapsulation of water soluble active polypeptides |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
JP2547714B2 (ja) | 1981-10-23 | 1996-10-23 | モルキユラ− バイオシステムズ インコ−ポレテツド | オリゴヌクレオチド治療剤及びその製法 |
ES8301593A1 (es) | 1981-11-16 | 1983-01-01 | Union Ind Y Agro Ganader S A U | Procedimiento de obtencion de una leche humanizada adiciona-da de nucleotidos con destino a la alimentacion infantil. |
US4452775A (en) | 1982-12-03 | 1984-06-05 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules |
US4627850A (en) | 1983-11-02 | 1986-12-09 | Alza Corporation | Osmotic capsule |
US5194428A (en) | 1986-05-23 | 1993-03-16 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates |
US4806463A (en) | 1986-05-23 | 1989-02-21 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides |
US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
ES2007350A6 (es) | 1987-05-29 | 1989-06-16 | Ganadera Union Ind Agro | Productos alimenticios enriquecidos con nucleosidos yno nucleotidos para la nutricion infantil y de adultos, y procedimiento para su preparacion. |
CA1339596C (en) | 1987-08-07 | 1997-12-23 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Viral expression inhibitors |
US5004810A (en) | 1988-09-30 | 1991-04-02 | Schering Corporation | Antiviral oligomers |
US6214804B1 (en) | 1989-03-21 | 2001-04-10 | Vical Incorporated | Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence |
US5133974A (en) | 1989-05-05 | 1992-07-28 | Kv Pharmaceutical Company | Extended release pharmaceutical formulations |
US5786189A (en) | 1989-11-29 | 1998-07-28 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine |
US5457189A (en) | 1989-12-04 | 1995-10-10 | Isis Pharmaceuticals | Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus |
US5514577A (en) | 1990-02-26 | 1996-05-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses |
US5248670A (en) | 1990-02-26 | 1993-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses |
US5166195A (en) | 1990-05-11 | 1992-11-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides |
EP0468520A3 (en) | 1990-07-27 | 1992-07-01 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences |
US6042838A (en) * | 1991-02-15 | 2000-03-28 | Uab Research Foundation | immunogenic compositions for mucosal administration of pneumococcal surface protein A (PspA) |
US5407686A (en) | 1991-11-27 | 1995-04-18 | Sidmak Laboratories, Inc. | Sustained release composition for oral administration of active ingredient |
WO1993015207A2 (en) | 1992-02-04 | 1993-08-05 | Viagene, Inc. | Hepatitis therapeutics |
US6498147B2 (en) | 1992-05-22 | 2002-12-24 | The Scripps Research Institute | Suppression of nuclear factor-κb dependent processes using oligonucleotides |
US5585479A (en) | 1992-07-24 | 1996-12-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA |
WO1994008004A1 (en) | 1992-10-05 | 1994-04-14 | Hybridon, Inc. | Therapeutic anti-hiv oligonucleotide and pharmaceutical |
US5567604A (en) | 1993-04-23 | 1996-10-22 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides |
JP2798305B2 (ja) | 1993-06-23 | 1998-09-17 | ジェネシス ファーマ インコーポレイテッド | アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒト免疫不全ウイルス感染におけるその使用 |
US20030109469A1 (en) | 1993-08-26 | 2003-06-12 | Carson Dennis A. | Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen |
US5985847A (en) | 1993-08-26 | 1999-11-16 | The Regents Of The University Of California | Devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides |
US5830877A (en) | 1993-08-26 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory |
US5849719A (en) | 1993-08-26 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of California | Method for treating allergic lung disease |
US5804566A (en) | 1993-08-26 | 1998-09-08 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides |
US5679647A (en) | 1993-08-26 | 1997-10-21 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides |
US6133244A (en) * | 1993-10-22 | 2000-10-17 | Institut Pasteur | Method for immunization against hepatitis B |
AU710504B2 (en) | 1994-03-15 | 1999-09-23 | Brown University Research Foundation | Polymeric gene delivery system |
US6727230B1 (en) * | 1994-03-25 | 2004-04-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
WO1995026204A1 (en) | 1994-03-25 | 1995-10-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs |
US6429199B1 (en) | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
US6239116B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-05-29 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US6207646B1 (en) | 1994-07-15 | 2001-03-27 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US20030050263A1 (en) | 1994-07-15 | 2003-03-13 | The University Of Iowa Research Foundation | Methods and products for treating HIV infection |
ATE420171T1 (de) * | 1994-07-15 | 2009-01-15 | Univ Iowa Res Found | Immunomodulatorische oligonukleotide |
US20030026782A1 (en) | 1995-02-07 | 2003-02-06 | Arthur M. Krieg | Immunomodulatory oligonucleotides |
US7935675B1 (en) | 1994-07-15 | 2011-05-03 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules |
US5646262A (en) | 1994-07-28 | 1997-07-08 | Georgetown University | Antisense oligonucleotides against hepatitis B viral replication |
US6630455B1 (en) | 1995-01-13 | 2003-10-07 | Vanderbilt University | Methods for inducing mucosal immune responses |
GB9503863D0 (en) | 1995-02-25 | 1995-04-19 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine compositions |
US5994315A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-30 | East Carolina University | Low adenosine agent, composition, kit and method for treatment of airway disease |
WO1997003702A1 (en) | 1995-07-21 | 1997-02-06 | Brown University Research Foundation | A method for gene therapy using nucleic acid loaded polymeric microparticles |
US6248720B1 (en) | 1996-07-03 | 2001-06-19 | Brown University Research Foundation | Method for gene therapy using nucleic acid loaded polymeric microparticles |
DE69637942D1 (de) | 1995-10-04 | 2009-07-09 | Immunex Corp | Stimulationsfaktor für dendriten |
US5736152A (en) | 1995-10-27 | 1998-04-07 | Atrix Laboratories, Inc. | Non-polymeric sustained release delivery system |
US5780448A (en) | 1995-11-07 | 1998-07-14 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research | DNA-based vaccination of fish |
US5840332A (en) | 1996-01-18 | 1998-11-24 | Perio Products Ltd. | Gastrointestinal drug delivery system |
EP1346649A3 (en) | 1996-01-22 | 2003-12-10 | Chr. Hansen A/S | Water dispersible compositions containing natural hydrophobic pigment, method of preparing same and their use |
EP0879284B1 (en) | 1996-01-30 | 2009-07-29 | The Regents of The University of California | Gene expression vectors which generate an antigen specific immune response and methods of using the same |
US20030078223A1 (en) | 1996-01-30 | 2003-04-24 | Eyal Raz | Compositions and methods for modulating an immune response |
US6689757B1 (en) * | 1996-02-12 | 2004-02-10 | M.L. Laboratories Plc | Methods for vaccination and vaccines therefor |
SE9600647D0 (sv) | 1996-02-21 | 1996-02-21 | Bror Morein | Ny användning |
US6030955A (en) | 1996-03-21 | 2000-02-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York And Imclone Systems, Inc. | Methods of affecting intracellular phosphorylation of tyrosine using phosphorothioate oligonucleotides, and antiangiogenic and antiproliferative uses thereof |
AU705647B2 (en) | 1996-07-10 | 1999-05-27 | Immunex Corporation | Method of activating dendritic cells |
ATE292980T1 (de) * | 1996-10-11 | 2005-04-15 | Univ California | Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate |
EP0855184A1 (en) | 1997-01-23 | 1998-07-29 | Grayson B. Dr. Lipford | Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination |
WO1998037919A1 (en) | 1997-02-28 | 1998-09-03 | University Of Iowa Research Foundation | USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS |
US6406705B1 (en) | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
DK1005368T3 (da) | 1997-03-10 | 2010-01-04 | Ottawa Hospital Res Inst | Anvendelse af nukleinsyrer, der indeholder ikke-metyleret CpG dinukleotid i kombination med alun som hjælpestoffer |
US6426334B1 (en) * | 1997-04-30 | 2002-07-30 | Hybridon, Inc. | Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal |
KR20010020370A (ko) | 1997-04-30 | 2001-03-15 | 파샬 비. 린네 | 향상된 생체이용률을 갖는 올리고뉴클레오티드 |
US6287591B1 (en) | 1997-05-14 | 2001-09-11 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Charged therapeutic agents encapsulated in lipid particles containing four lipid components |
US20030104044A1 (en) | 1997-05-14 | 2003-06-05 | Semple Sean C. | Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response |
CA2289741A1 (en) * | 1997-05-19 | 1998-11-26 | Merck & Co., Inc. | Oligonucleotide adjuvant |
EP1003531B1 (en) | 1997-05-20 | 2007-08-22 | Ottawa Health Research Institute | Processes for preparing nucleic acid constructs |
US6589940B1 (en) | 1997-06-06 | 2003-07-08 | Dynavax Technologies Corporation | Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof |
JP4101888B2 (ja) | 1997-06-06 | 2008-06-18 | ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション | 免疫刺激オリゴヌクレオチド、その組成物およびその使用方法 |
US20040006034A1 (en) | 1998-06-05 | 2004-01-08 | Eyal Raz | Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof |
US6221882B1 (en) | 1997-07-03 | 2001-04-24 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for inhibiting immunostimulatory DNA associated responses |
US5877309A (en) | 1997-08-13 | 1999-03-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides against JNK |
AU757175B2 (en) | 1997-09-05 | 2003-02-06 | Regents Of The University Of California, The | Use of immunostimulatory oligonucleotides for preventing or reducing antigen-stimulated, granulocyte-mediated inflammation |
US6749856B1 (en) * | 1997-09-11 | 2004-06-15 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses |
WO1999030686A1 (en) | 1997-12-12 | 1999-06-24 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Cationic drugs encapsulated in anionic liposomes |
GB9727262D0 (en) | 1997-12-24 | 1998-02-25 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US20050031638A1 (en) | 1997-12-24 | 2005-02-10 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine |
JPH11209289A (ja) | 1998-01-22 | 1999-08-03 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | 粘膜免疫誘起剤 |
AU760549B2 (en) | 1998-04-03 | 2003-05-15 | University Of Iowa Research Foundation, The | Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines |
PL354714A1 (en) | 1998-04-09 | 2004-02-09 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Adjuvant compositions |
EP1100834B1 (en) | 1998-04-28 | 2006-06-28 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Polyanionic polymers which enhance fusogenicity |
CA2328602A1 (en) | 1998-05-06 | 1999-11-11 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides |
CA2328406A1 (en) | 1998-05-14 | 1999-11-18 | Hermann Wagner | Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides |
DE69932717T2 (de) | 1998-05-22 | 2007-08-09 | Ottawa Health Research Institute, Ottawa | Methoden und produkte zur induzierung mukosaler immunität |
US6562798B1 (en) | 1998-06-05 | 2003-05-13 | Dynavax Technologies Corp. | Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof |
US6086898A (en) | 1998-06-23 | 2000-07-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method of converting a Th2-type allergic immune response into a Th1-type immune response |
US20040247662A1 (en) | 1998-06-25 | 2004-12-09 | Dow Steven W. | Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes |
US20030022854A1 (en) | 1998-06-25 | 2003-01-30 | Dow Steven W. | Vaccines using nucleic acid-lipid complexes |
US6693086B1 (en) | 1998-06-25 | 2004-02-17 | National Jewish Medical And Research Center | Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes |
DE69906977T2 (de) | 1998-07-20 | 2004-05-19 | Protiva Biotherapeutics Inc., Burnaby | In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe |
WO2000006588A1 (en) | 1998-07-27 | 2000-02-10 | University Of Iowa Research Foundation | STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS |
GB9817052D0 (en) | 1998-08-05 | 1998-09-30 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US20010034330A1 (en) | 1998-08-10 | 2001-10-25 | Charlotte Kensil | Innate immunity-stimulating compositions of CpG and saponin and methods thereof |
DE69929444T2 (de) | 1998-08-10 | 2006-09-28 | Antigenics Inc., Woburn | Cpg-zusammensetzungen, saponin-adjuvantien und verfahren zu deren verwendung |
US6210663B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-04-03 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting |
CA2341338A1 (en) | 1998-09-03 | 2000-03-16 | Coley Pharmaceutical Gmbh | G-motif oligonucleotides and uses thereof |
FR2783170B1 (fr) | 1998-09-11 | 2004-07-16 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Emulsion immunostimulante |
EP1117433A1 (en) | 1998-10-09 | 2001-07-25 | Dynavax Technologies Corporation | Anti hiv compositions comprising immunostimulatory polynucleotides and hiv antigens |
DE69935606T9 (de) | 1998-10-16 | 2021-03-11 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Adjuvanzsysteme und impfstoffe |
CZ20012544A3 (cs) | 1999-01-12 | 2002-01-16 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Farmaceutické balení |
AU2977500A (en) | 1999-02-02 | 2000-08-25 | Biocache Pharmaceuticals, Llc | Advanced antigen presentation platform |
JP2002536344A (ja) | 1999-02-05 | 2002-10-29 | ジエンザイム コーポレイション | 抗腫瘍免疫を発生させるためのカチオン性脂質の使用 |
WO2000054803A2 (en) | 1999-03-16 | 2000-09-21 | Panacea Pharmaceuticals, Llc | Immunostimulatory nucleic acids and antigens |
CZ303653B6 (cs) | 1999-03-19 | 2013-01-30 | Smithkline Beecham Biologicals S. A. | Imunogenní prostredek |
FR2790955B1 (fr) | 1999-03-19 | 2003-01-17 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Utilisation d'oligonucleotides stabilises comme principe actif antitumoral |
US6977245B2 (en) | 1999-04-12 | 2005-12-20 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
EP1176966B1 (en) | 1999-04-12 | 2013-04-03 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response |
AU4642600A (en) | 1999-04-15 | 2000-11-02 | Regents Of The University Of California, The | Methods and compositions for use in potentiating antigen presentation by antigenpresenting cells |
WO2000062800A2 (en) | 1999-04-19 | 2000-10-26 | Smithkline Beecham Biologicals Sa | Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide |
US6558670B1 (en) | 1999-04-19 | 2003-05-06 | Smithkline Beechman Biologicals S.A. | Vaccine adjuvants |
AU4978100A (en) | 1999-04-29 | 2000-11-17 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Screening for immunostimulatory dna functional modifyers |
US6737066B1 (en) | 1999-05-06 | 2004-05-18 | The Immune Response Corporation | HIV immunogenic compositions and methods |
OA11937A (en) | 1999-05-06 | 2006-04-12 | Immune Response Corp Inc | HIV immunogenic compositions and methods. |
CA2376634A1 (en) | 1999-06-08 | 2000-12-14 | Aventis Pasteur | Immunostimulant oligonucleotide |
US6479504B1 (en) | 1999-06-16 | 2002-11-12 | The University Of Iowa Research Foundation | Antagonism of immunostimulatory CpG-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases |
ES2250151T3 (es) | 1999-06-29 | 2006-04-16 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Uso de cpg como adyuvante de vacuna contra vih. |
GB9915204D0 (en) | 1999-06-29 | 1999-09-01 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US6514948B1 (en) | 1999-07-02 | 2003-02-04 | The Regents Of The University Of California | Method for enhancing an immune response |
DE19935756A1 (de) | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Mologen Forschungs Entwicklung | Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation |
AU774380B2 (en) | 1999-08-19 | 2004-06-24 | Dynavax Technologies Corporation | Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein |
US20050249794A1 (en) | 1999-08-27 | 2005-11-10 | Semple Sean C | Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response |
GB9921146D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-11-10 | Smithkline Beecham Biolog | Novel composition |
DE60022665T2 (de) | 1999-09-25 | 2006-06-22 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunstimulierende nukeinsäuren |
US6949520B1 (en) | 1999-09-27 | 2005-09-27 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon |
US7223398B1 (en) | 1999-11-15 | 2007-05-29 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof |
AU2593701A (en) | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Regents Of The University Of California, The | Method for preventing an anaphylactic reaction |
EP1311288A1 (en) | 2000-01-20 | 2003-05-21 | Ottawa Health Research Institute | Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response |
US6852705B2 (en) | 2000-01-21 | 2005-02-08 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
PL211762B1 (pl) | 2000-01-31 | 2012-06-29 | Smithkline Beecham Biolog | Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki |
AU2001231245A1 (en) | 2000-01-31 | 2001-08-07 | The Regents Of The University Of California | Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen |
US7585847B2 (en) | 2000-02-03 | 2009-09-08 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy |
FR2805265B1 (fr) | 2000-02-18 | 2002-04-12 | Aventis Pasteur | Oligonucleotides immunostimulants |
US20030130217A1 (en) | 2000-02-23 | 2003-07-10 | Eyal Raz | Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation |
CA2399550A1 (en) | 2000-02-23 | 2001-08-30 | The Regents Of The University Of California | Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation |
AU2001239873A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-09-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Adjuvant treatment by in vivo activation of dendritic cells |
US20020156033A1 (en) | 2000-03-03 | 2002-10-24 | Bratzler Robert L. | Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer |
US20040131628A1 (en) | 2000-03-08 | 2004-07-08 | Bratzler Robert L. | Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms |
US20020028784A1 (en) | 2000-03-10 | 2002-03-07 | Nest Gary Van | Methods of preventing and treating viral infections using immunomodulatory polynucleotide sequences |
US7129222B2 (en) | 2000-03-10 | 2006-10-31 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US20020107212A1 (en) | 2000-03-10 | 2002-08-08 | Nest Gary Van | Methods of reducing papillomavirus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences |
US20020098199A1 (en) | 2000-03-10 | 2002-07-25 | Gary Van Nest | Methods of suppressing hepatitis virus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences |
US20010046967A1 (en) | 2000-03-10 | 2001-11-29 | Gary Van Nest | Methods of preventing and treating respiratory viral infection using immunomodulatory polynucleotide |
US7157437B2 (en) | 2000-03-10 | 2007-01-02 | Dynavax Technologies Corporation | Methods of ameliorating symptoms of herpes infection using immunomodulatory polynucleotide sequences |
US20030129251A1 (en) | 2000-03-10 | 2003-07-10 | Gary Van Nest | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
WO2001072123A1 (en) | 2000-03-28 | 2001-10-04 | The Regents Of The University Of California | Methods for increasing a cytotoxic t lymphocyte response in vivo |
AU2001251407A1 (en) | 2000-04-07 | 2001-10-23 | The Regents Of The University Of California | Synergistic improvements to polynucleotide vaccines |
DE60139689D1 (de) | 2000-06-22 | 2009-10-08 | Univ Iowa Res Found | Kombination von CpG und Antikörpern gegen CD19,CD20,CD22 oder CD40 zur Prävention oder Behandlung von Krebs. |
US20020165178A1 (en) | 2000-06-28 | 2002-11-07 | Christian Schetter | Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia |
CN1549726A (zh) | 2000-07-31 | 2004-11-24 | 耶鲁大学 | 先天性免疫***指导的疫苗 |
US20020198165A1 (en) | 2000-08-01 | 2002-12-26 | Bratzler Robert L. | Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers |
US20020091097A1 (en) | 2000-09-07 | 2002-07-11 | Bratzler Robert L. | Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases |
WO2002022809A2 (en) | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Coley Pharmaceutical Gmbh | PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST |
GB0023008D0 (en) | 2000-09-20 | 2000-11-01 | Glaxo Group Ltd | Improvements in vaccination |
FR2814958B1 (fr) * | 2000-10-06 | 2003-03-07 | Aventis Pasteur | Composition vaccinale |
EP2266603B1 (en) | 2000-10-18 | 2012-09-12 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Tumour vaccines |
AU2002214868A1 (en) | 2000-11-02 | 2002-05-15 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic oligonucleotides of reduced toxicity |
EP1985702A3 (en) | 2000-12-08 | 2010-08-18 | Coley Pharmaceutical GmbH | CPG-like nucleic acids and methods of use thereof |
WO2002053141A2 (en) | 2000-12-14 | 2002-07-11 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Inhibition of angiogenesis by nucleic acids |
CA2430691A1 (en) | 2000-12-27 | 2002-07-04 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory polynucleotides and methods of using the same |
AU2002248646A1 (en) | 2001-03-16 | 2002-10-03 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for modulating an immune response |
US20030050268A1 (en) | 2001-03-29 | 2003-03-13 | Krieg Arthur M. | Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases |
JP2005509591A (ja) | 2001-06-15 | 2005-04-14 | リバファーム・インコーポレイテッド | ヌクレオシドワクチンアジュバント |
US20030148316A1 (en) | 2001-08-01 | 2003-08-07 | Lipford Grayson B. | Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells |
AU2002326561B2 (en) | 2001-08-07 | 2008-04-03 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof |
PT1446162E (pt) | 2001-08-17 | 2009-01-27 | Coley Pharm Gmbh | Agrupamentos imunoestimuladores oligonucléotidos com actividade melhorada |
JP2005501550A (ja) | 2001-08-30 | 2005-01-20 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 免疫反応調整剤分子を用いた形質細胞様樹状細胞を成熟させる方法 |
US20030119774A1 (en) | 2001-09-25 | 2003-06-26 | Marianna Foldvari | Compositions and methods for stimulating an immune response |
CA2461315A1 (en) | 2001-10-05 | 2003-04-17 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists |
AU2002347062B2 (en) | 2001-10-06 | 2008-06-26 | Merial Ltd | CpG formulations and related methods |
WO2003094836A2 (en) | 2001-10-12 | 2003-11-20 | University Of Iowa Research Foundation | Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds |
AU2002340662B2 (en) | 2001-11-07 | 2008-07-03 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid |
TW200303759A (en) | 2001-11-27 | 2003-09-16 | Schering Corp | Methods for treating cancer |
US8088388B2 (en) | 2002-02-14 | 2012-01-03 | United Biomedical, Inc. | Stabilized synthetic immunogen delivery system |
US20030232443A1 (en) | 2002-06-18 | 2003-12-18 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of centromere protein B expression |
CA2480775C (en) | 2002-04-04 | 2016-05-31 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunostimulatory g,u-containing oligoribonucleotides |
ATE411815T1 (de) | 2002-05-10 | 2008-11-15 | Tekmira Pharmaceuticals Corp | Methylierte immunstimulierende oligodeoxynukleotide und verfahren zu deren verwendung |
CA2487452A1 (en) | 2002-05-28 | 2003-12-04 | Robinson Ramirez-Pineda | A method for generating antigen-presenting cells |
AU2003243409A1 (en) | 2002-06-05 | 2003-12-22 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids |
US20040013688A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-01-22 | Cambridge Scientific, Inc. | Vaccines to induce mucosal immunity |
US7569553B2 (en) | 2002-07-03 | 2009-08-04 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7605138B2 (en) | 2002-07-03 | 2009-10-20 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7576066B2 (en) | 2002-07-03 | 2009-08-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US7807803B2 (en) | 2002-07-03 | 2010-10-05 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
US20040053880A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-03-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid compositions for stimulating immune responses |
WO2004007743A2 (en) | 2002-07-17 | 2004-01-22 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Use of cpg nucleic acids in prion-disease |
CN1468957A (zh) | 2002-07-19 | 2004-01-21 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种用作人用治疗性疫苗佐剂的质粒 |
AR040996A1 (es) | 2002-08-19 | 2005-04-27 | Coley Pharm Group Inc | Acidos nucleicos inmunoestimuladores |
WO2004026888A2 (en) | 2002-09-19 | 2004-04-01 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species |
EP1556077A2 (en) | 2002-10-29 | 2005-07-27 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd | Use of cpg oligonucleotides in the treatment of hepatitis c virus infection |
AU2003300919A1 (en) | 2002-12-11 | 2004-06-30 | Coley Pharmaceutical Gmbh | 5' cpg nucleic acids and methods of use |
KR100525321B1 (ko) | 2002-12-13 | 2005-11-02 | 안웅식 | 파필로마바이러스 항원 단백질 및CpG-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는파필로마바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약제학적조성물 |
US20040235770A1 (en) | 2003-04-02 | 2004-11-25 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd. | Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations and related methods of use |
EP1631687A2 (en) | 2003-04-22 | 2006-03-08 | Coley Pharmaceutical GmbH | Methods and products for identification and assessment of tlr ligands |
BRPI0411514A (pt) | 2003-06-20 | 2006-08-01 | Coley Pharm Gmbh | antagonistas de receptor toll-like de molécula pequena |
CA2536139A1 (en) | 2003-09-25 | 2005-04-07 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Nucleic acid-lipophilic conjugates |
US20050215501A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-09-29 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Methods and products for enhancing epitope spreading |
SG122973A1 (en) | 2003-10-30 | 2006-06-29 | Coley Pharm Gmbh | C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency |
US20050239733A1 (en) | 2003-10-31 | 2005-10-27 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides |
US20050100983A1 (en) | 2003-11-06 | 2005-05-12 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling |
EP2415481A3 (en) | 2004-02-19 | 2012-04-18 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides |
WO2005111057A2 (en) | 2004-04-02 | 2005-11-24 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses |
CA2567789A1 (en) | 2004-06-08 | 2006-08-03 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist |
EP1776105A2 (en) | 2004-07-18 | 2007-04-25 | Coley Pharmaceutical Group, Ltd | Methods and compositions for inducing innate immune responses |
EP1781325A2 (en) | 2004-07-18 | 2007-05-09 | CSL Limited | Immuno stimulating complex and oligonucleotide formulations for inducing enhanced interferon-gamma responses |
MY159370A (en) | 2004-10-20 | 2016-12-30 | Coley Pharm Group Inc | Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides |
AU2006216493A1 (en) | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunostimulatory oligonucleotides |
RS20070422A (en) | 2005-04-08 | 2009-01-22 | Sanofi-Aventis U.S. Llc., | Methods for treating infectious disease exacerbated asthma |
WO2006116458A2 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Modified oligoribonucleotide analogs with enhances immunostimulatory activity |
JP2009508842A (ja) | 2005-09-16 | 2009-03-05 | コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー | ヌクレオチド修飾による短鎖干渉リボ核酸(siRNA)の免疫賦活性の調節 |
EP1928500A2 (en) | 2005-09-27 | 2008-06-11 | Coley Pharmaceutical GmbH | Modulation of tlr-mediated immune responses using adaptor oligonucleotides |
CA2630738C (en) | 2005-11-25 | 2013-09-03 | Coley Pharmaceutical Gmbh | Immunostimulatory oligoribonucleotides |
JP5473336B2 (ja) | 2006-02-15 | 2014-04-16 | アディウタイド・ファーマスーティカルズ・ゲーエムベーハー | オリゴヌクレオチドの処方に関する組成物および方法 |
US8027888B2 (en) | 2006-08-31 | 2011-09-27 | Experian Interactive Innovation Center, Llc | Online credit card prescreen systems and methods |
WO2008033432A2 (en) | 2006-09-12 | 2008-03-20 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides |
NZ575437A (en) | 2006-09-27 | 2012-02-24 | Coley Pharm Gmbh | Cpg oligonucleotide analogs containing hydrophobic t analogs with enhanced immunostimulatory activity |
EP2068912A2 (en) | 2006-09-27 | 2009-06-17 | Coley Pharmaceutical Group, Inc. | Compositions of tlr ligands and antivirals |
BRPI0718182A2 (pt) | 2006-10-26 | 2014-02-25 | Coley Pharm Gmbh | Oligorribonucleotídeos e seus usos. |
-
1999
- 1999-05-21 DE DE69932717T patent/DE69932717T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-21 IL IL13981399A patent/IL139813A0/xx active IP Right Grant
- 1999-05-21 PT PT61185864T patent/PT1733735T/pt unknown
- 1999-05-21 CA CA002328894A patent/CA2328894A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-21 PT PT99925754T patent/PT1077722E/pt unknown
- 1999-05-21 AT AT99925754T patent/ATE335510T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-05-21 NZ NZ508927A patent/NZ508927A/en unknown
- 1999-05-21 BR BR9910643-4A patent/BR9910643A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-05-21 DK DK06118586.4T patent/DK1733735T3/en active
- 1999-05-21 US US09/316,199 patent/US8574599B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-21 WO PCT/US1999/011359 patent/WO1999061056A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-21 DK DK99925754T patent/DK1077722T3/da active
- 1999-05-21 AU AU41977/99A patent/AU761899B2/en not_active Ceased
- 1999-05-21 EP EP06118586.4A patent/EP1733735B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-21 ES ES06118586.4T patent/ES2628744T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-21 JP JP2000550515A patent/JP2002516294A/ja active Pending
- 1999-05-21 ES ES99925754T patent/ES2272069T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-21 SI SI9930928T patent/SI1077722T1/sl unknown
- 1999-05-21 EP EP99925754A patent/EP1077722B1/en not_active Revoked
-
2000
- 2000-11-20 ZA ZA200006765A patent/ZA200006765B/xx unknown
- 2000-11-21 IL IL139813A patent/IL139813A/en not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-10 HK HK01105556A patent/HK1037125A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-07-09 US US10/888,886 patent/US20040266719A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-11-06 CY CY20061101595T patent/CY1107337T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1999061056A3 (en) | 2000-04-06 |
IL139813A (en) | 2007-06-03 |
DE69932717T2 (de) | 2007-08-09 |
BR9910643A (pt) | 2001-10-30 |
CA2328894A1 (en) | 1999-12-02 |
AU761899B2 (en) | 2003-06-12 |
EP1077722B1 (en) | 2006-08-09 |
WO1999061056A2 (en) | 1999-12-02 |
HK1037125A1 (en) | 2002-02-01 |
EP1733735A2 (en) | 2006-12-20 |
ES2628744T3 (es) | 2017-08-03 |
EP1733735B1 (en) | 2017-03-22 |
US8574599B1 (en) | 2013-11-05 |
AU4197799A (en) | 1999-12-13 |
NZ508927A (en) | 2003-12-19 |
DK1733735T3 (en) | 2017-06-19 |
US20040266719A1 (en) | 2004-12-30 |
PT1733735T (pt) | 2017-06-16 |
IL139813A0 (en) | 2002-02-10 |
DE69932717D1 (de) | 2006-09-21 |
DK1077722T3 (da) | 2006-11-27 |
EP1733735A3 (en) | 2008-08-27 |
WO1999061056A9 (en) | 2000-06-15 |
ZA200006765B (en) | 2002-08-22 |
CY1107337T1 (el) | 2012-12-19 |
JP2002516294A (ja) | 2002-06-04 |
ATE335510T1 (de) | 2006-09-15 |
PT1077722E (pt) | 2006-12-29 |
EP1077722A2 (en) | 2001-02-28 |
SI1077722T1 (sl) | 2007-02-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2272069T3 (es) | Metodos y productos para inducir inmunidad en mucosas. | |
ES2284247T3 (es) | Metodos y productos para estimular el sistema inmunitario usando oligonucleotidos y citoquinas inmunoterapeuticos. | |
ES2307568T3 (es) | Acidos nucleicos de tipo cpg y metodos de uso de los mismos. | |
CA2471968C (en) | Immunostimulatory nucleic acids and use thereof | |
US20040235770A1 (en) | Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations and related methods of use | |
US20050043529A1 (en) | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant | |
AU2002340662B2 (en) | Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid | |
EP1100807A1 (en) | STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS | |
AU2002347062A1 (en) | CpG formulations and related methods | |
AU2002340662A1 (en) | Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid |