ES2250151T3 - Uso de cpg como adyuvante de vacuna contra vih. - Google Patents
Uso de cpg como adyuvante de vacuna contra vih.Info
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Abstract
Una formulación de vacuna que comprende una combinación de una proteína de fusión de VIH más gp120 y un oligonucleótido inmunoestimulador CpG. La presente invención proporciona una formulación de vacuna mejorada que comprende un oligonucleótido CpG y un antígeno de VIH seleccionado entre el grupo gp160 de VIH, gp120 de VIH; una proteína Nef de VIH o derivado de la misma unida a (i) un compañero de fusión o (ii) una proteína Tat de VIH o derivado de la misma; o una proteína Tat de VIH o derivado de la misma unida a (i) una proteína de fusión o (ii) una proteína Nef de VIH o derivado de la misma; o una proteína Nef de VIH o derivado de la misma unida a una proteína Tat de VIH o derivado de la misma o un compañero de fusión.
Description
Uso de CpG como adyuvante de vacuna contra
VIH.
La presente invención se refiere a nuevas
formulaciones de vacuna y su uso en el tratamiento o profilaxis de
infecciones por VIH. En particular, la invención se refiere al uso
de antígeno de VIH junto con un oligonucleótido CpG.
VIH es la principal causa del SIDA (síndrome de
inmunodeficiencia adquirida) y se considera como uno de los asuntos
de salud más urgente en el mundo. Aunque ha habido grandes esfuerzos
para producir una vacuna exitosa, los esfuerzos hasta la fecha han
fallado en producir una. Por consiguiente, permanece una necesidad
de una composición inmunogénica de VIH mejorada.
La Solicitud de Patente Internacional Nº 92/06113
se refiere a una formulación de vacuna que comprende la proteína de
envuelta gp160 y su derivado de origen natural gp120 con adyuvante
monofosforil lípido A 3 desacilado y un vehículo adecuado tal como
hidróxido de aluminio.
La Solicitud de Patente Internacional Nº 99/16884
describe formulaciones de vacuna basadas en proteínas de VIH no de
envuelta, Nef y Tat, particularmente fusiones de la proteína Nef con
Tat, y fusiones de la proteína Nef con Tat o un compañero de fusión
inmunológico.
Los oligonucleótidos e inmunomoduladores
contienen dinucleótidos CpG no metilados ("CpG") y son
conocidos (documentos WO 96/02555, EP 468520). CpG es una
abreviatura para restos de dinucleótido de
citosina-guanosina presentes en el ADN.
Históricamente, se observó que la fracción de ADN de BCG podía
ejercer un efecto antitumoral. En estudios adicionales, los
oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias génicas de BCG
demostraron ser capaces de inducir efectos inmunoestimuladores
(tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos
estudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas,
incluyendo un resto CG central, llevaban esta actividad. El papel
central del resto CG en la inmunoestimulación se dilucidó
posteriormente en una publicación de Krieg, Nature 374, p546 1995.
El análisis detallado ha demostrado que el resto CG tiene que estar
en un cierto contexto de secuencia, y que dichas secuencias son
comunes en el ADN bacteriano pero raras en ADN de vertebrados.
Actualmente se cree que esta diferencia evolutiva
permite al sistema inmune de vertebrados detectar la presencia de
ADN bacteriano (como sucede durante una infección) que conduce, por
consiguiente, a la estimulación del sistema inmune. La secuencia
inmunoestimuladora como se define por Krieg es:
Purina Purina CG pirimidina pirimidina y donde el
resto CG no está metilado.
En ciertas combinaciones de los seis nucleótidos
está presente una secuencia palindrómica. Varios de estos restos,
como repeticiones de un resto o una combinación de diferentes
restos, pueden estar presentes en el mismo oligonucleótido. La
presencia de una o más de estas secuencias inmunoestimuladoras que
contienen oligonucleótidos pueden activar diversos subconjuntos
inmunes, incluyendo células natural killer (que producen interferón
\gamma y tienen actividad citolítica) y macrófagos (Wooldrige y
col Vol 89 (Nº 8), 1977). Aunque existen otras secuencias que
contienen CPG no metilado que no tienen esta secuencia consenso
ahora se ha demostrado que son inmunomoduladoras.
La presente invención proporciona una formulación
de vacuna mejorada que comprende un oligonucleótido CpG y un
antígeno de VIH seleccionado entre el grupo gp160 de VIH, gp120 de
VIH; una proteína Nef de VIH o derivado de la misma unida a (i) un
compañero de fusión o (ii) una proteína Tat de VIH o derivado de la
misma; o una proteína Tat de VIH o derivado de la misma unida a (i)
una proteína de fusión o (ii) una proteína Nef de VIH o derivado de
la misma; o una proteína Nef de VIH o derivado de la misma unida a
una proteína Tat de VIH o derivado de la misma o un compañero de
fusión.
Por "compañero de fusión" se entiende
cualquier secuencia proteica que no sea Tat o Nef. Preferiblemente,
el compañero de fusión es la proteína D o su derivado lipidado
lipoproteína D, de Haemophilius influenzae B. En particular,
se prefiere que se utilice el tercio N-terminal, es
decir, aproximadamente los primeros 100-130
aminoácidos. Esto se representa en este documento como Lipo D 1/3.
En una realización preferida de la invención, la proteína Nef o
derivado de la misma puede unirse a la proteína Tat o derivado de la
misma. Dichas fusiones Nef-Tat pueden unirse también
opcionalmente a un compañero de fusión, tal como proteína D.
Si está presente, el compañero de fusión
normalmente está unido al extremo N-terminal de la
proteína Nef o Tat.
Los derivados incluidos en la presente invención
incluyen moléculas con un extremo de Histidina
C-terminal, que preferiblemente comprende entre
5-10 restos de Histidina. Generalmente, el extremo
de histidina que contiene n restos se representa en este documento
como His (n). La presencia de un extremo de histidina (o "His")
ayuda a la purificación. Más específicamente, la invención
proporciona vacunas que comprenden proteínas con la siguiente
estructura:
\newpage
| Lipo D 1/3 | - | Nef | - | His(_{6}) |
| Lipo D 1/3 | - | Nef-Tat | - | His(_{6}) |
| Prot D 1/3 | - | Nef | - | His(_{6}) |
| Prot D 1/3 | - | Nef-Tat | - | His(_{6}) |
| Nef-Tat | His(_{6}) |
En una realización preferida, las proteínas se
expresan con un extremo de Histidina que comprende entre 5 a 10 y
preferiblemente seis restos de histidina. Esto es ventajoso para
ayudar a la purificación. La expresión por separado, en levaduras
(Saccharomyces cerevisiae) de Nef (Macreadie IG y col 1993,
Yeast 9 (6) 565-573) y Tat (Braddock M y col, 1989,
Cell 58 (2) 269-79) ya se ha presentado. La proteína
Nef sólo está miristoilada. La presente invención también
proporciona vacunas que comprenden Nef y/o Tat por separado. El ADN
y secuencias de aminoácidos de Nef-His,
Tat-His, y de proteínas de fusión
Nef-Tat-His representativas se
expone en el documento WO99/16884.
Particularmente, las vacunas preferidas de
acuerdo con la invención comprenden una proteína de fusión de VIH
tal como Nef-Tat y opcionalmente una proteína de VIH
adicional. Particularmente, se prefiere en una formulación de vacuna
de acuerdo con la invención, una combinación de una proteína de
fusión de VIH más gp120, más particularmente Nef-Tat
con gp120.
Los derivados incluidos en la presente invención
también incluyen proteínas mutadas. El término "mutado" se usa
en este documento para indicar una molécula que ha experimentado
deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos usando
técnicas bien conocidas para mutagénesis dirigida de sitio o
cualquier otro procedimiento convencional.
La preparación de vacuna se describe en líneas
generales en Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach (Ed.
Powell and Newman) Pharmaceutical Biotechnology Vol. 6 Plenum Press
1995. La encapsulación con liposomas se describe por Fullerton,
Patente de Estados Unidos 4.235.877.
Los oligonucleótidos preferidos contienen
preferiblemente dos o más restos CpG separados por seis o más
nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención
típicamente son desoxinucleótidos. En una realización preferida, el
internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditionato, o más
preferiblemente un enlace fosforoditioato, aunque pertenecen al
alcance de la invención enlaces fosfodiéster y otros enlaces
internucleótido incluyendo oligonucleótidos con enlaces
internucleótido mixtos.
Los oligonucleótidos preferidos tienen las
siguientes secuencias
| Oligo (denominación interna*) | 5'-SECUENCIA-3' | CpG | Tio |
| WD1001 | TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT | + | + |
| WD1002 | TCT CCC AGC GTG CGC CAT | + | + |
| WD1003 | ACC GAT AAC GTT GCC GGT GAC G | + | - |
| WD1004 | G*G*G GTC AAC GTT GAG* G*G*G* G*G | + | Mezcla |
| WD1006 | TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT | + | - |
| WD1007 | ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG | + | + |
| TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT | + | + | |
| * mencionado alternativamente como WD001-WD007 |
En la tabla anterior un + en la columna Tio
indica la presencia de una modificación tioato. "Mezcla" indica
una mezcla de modificación tioato y secuencia sin modificación
tioato (los asteriscos indican las uniones con una modificación
tioato). Un - en la columna Tio indica ausencia de una modificación
tioato. Un + en la columna CpG indica la presencia de un resto CpG y
un - en la columna CpG indica ausencia de un resto CpG. Por ejemplo
WD1005 contiene un resto GpC en lugar de un resto CpG, que está
marcado de este modo con un - en la columna CpG de la tabla. WD1007
contiene un resto palindrómico (GACGTC) así como otras secuencias
CpG no palindrómicas. Esto también pertenece al alcance de un
oligonucleótido CpG como término usado en la presente solicitud.
Los oligonucleótidos CpG utilizados en la
presente invención pueden sintetizarse por cualquier procedimiento
conocido en la técnica, (por ejemplo, documento EP 0 468 520).
Adecuadamente, dichos oligonucleótidos pueden sintetizarse
utilizando un sintetizador automático. Los procedimientos para
producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se
describen en los documentos US 5.666.153, US 5.278.302 y WO
95/26204.
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora con efectos secundarios adversos significativos en
vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo de qué
inmunógeno específico se emplea y cómo se presenta. Generalmente, se
espera que cada dosis comprenda 1-1000 \mug de
proteína, preferiblemente 2-500 \mug, más
preferiblemente 5-250 \mug. Una cantidad óptima
para una vacuna particular pueden determinarse por estudios
convencionales que implican la observación de respuestas inmunes
apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los
sujetos pueden recibir una o más inmunizaciones de estimulación
adecuadamente espaciadas.
También es posible
pre-administrar el oligonucleótido CpG poco antes de
la vacunación con el antígeno de VIH, por ejemplo 1 día antes.
Por consiguiente, de acuerdo con otro aspecto de
la invención, se proporciona un procedimiento para tratar un ser
humano en necesidad del mismo con una composición de vacuna que
comprende un antígeno de VIH y un oligonucleótido CpG (como se ha
definido anteriormente) o con el oligonucleótido CpG seguido de un
tiempo adecuado por el antígeno de VIH.
También se proporciona un kit que comprende
cantidades eficaces de una formulación que contiene oligonucleótido
CpG para su uso como una formulación iniciadora para la
pre-administración a pacientes humanos y un antígeno
de VIH para la inyección en algún momento adecuado después, como se
ha descrito anteriormente.
Los oligonucleótidos CpG preferidos son los
indicados en la tabla anterior.
Adecuadamente, el CpG estará presente estará
presente en el intervalo de 10 \mug por dosis a 2000 \mug,
preferiblemente 50-1000 \mug, tal como
aproximadamente 50 o aproximadamente 500 o aproximadamente 1000
\mug por dosis.
Adecuadamente, la vacuna usada en la presente
invención puede comprender un vehículo tal como una sal de aluminio,
por ejemplo, hidróxido de aluminio (Al(OH)_{3}),
fosfato de aluminio o fosfato sulfato de aluminio (alumbre), o un
aceite no tóxico en emulsión con agua o una mezcla de los
mismos.
Si se usa una sal de aluminio (preferiblemente
hidróxido de aluminio) como vehículo generalmente está presente en
el intervalo de 50 a 100 \mug, preferiblemente 100 a 500 \mug
por dosis.
El aceite no tóxico en emulsiones con agua
preferiblemente contiene un aceite no tóxico, por ejemplo, escualeno
y un emulsionante tal como (monooleato de polisorbitano) Tween 80,
en un vehículo acuoso tal como solución salina tamponada con
fosfato.
Si se desea, la vacuna usada en la presente
invención puede comprender un adyuvante adicional, preferiblemente
un adyuvante de saponina tal como QS21, como se describe, por
ejemplo, en el documento WO 9517210, opcionalmente en presencia de
un esterol, tal como colesterol, como se describe, por ejemplo, en
el documento PCT/EP96/01464. La vacuna de la invención también puede
comprender monofosforil lípido A y derivados del mismo conocidos en
la técnica. Un derivado preferido es un monofosforil lípido A 3
des-O-acilado, descrito en la
Patente Británica Nº GB 2 220 221.
Por consiguiente, las formulaciones de vacuna de
la presente invención pueden comprender adicionalmente otros
excipientes farmacéuticos o inmunoestimuladores. En una realización
preferida, la formulación de vacuna comprende adicionalmente una sal
de aluminio, preferiblemente hidróxido de aluminio. En una
realización adicional, también puede incluirse un adyuvante de
saponina tal como QS21 (Aquila).
La presente invención ahora se describirá con
referencia a los siguientes ejemplos:
Se realizó un estudio de inmunogenicidad para
evaluar el efecto adyuvante de CpG en primates no humanos. Se
inmunizaron grupos de cinco monos dos veces con gp120 de
VIH-1_{\text{W6.1D}} en combinación con CpG o
CpG/alumbre. Después de la segunda inmunización, se evaluó la
respuesta inmune de los animales. Se evaluaron los anticuerpos
frente a gp120 y respuestas linfoproliferativos así como de
citoquinas.
Grupos de
monos
| Grupo | antígeno | Adyuvante |
| 1 | gp120 de VIH-1_{\text{W6.1}} | CpG/alumbre |
| 2 | gp120 de VIH-1_{\text{W6.1}} | CpG |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Lotes de componente
usados
| Componente | Marca | Número de Lote | Concentración (mg/ml) | Tampón |
| Gp120* | 47/025 | 0,456 | PBS | |
| Al(OH)_{3} | Superfos | 96A0089 | 10,380 | H_{2}O |
| CpG | WD001 | 5 | H_{2}O | |
| * gp120 del clon W6.1D de VIH-1 (Groenink y col., 1991) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las formulaciones se prepararon un día antes de
cada inyección. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura
ambiente con agitación.
Se adsorbió gp120 (50 \mug) sobre 500 \mug de
Al(OH)_{3} durante 1 hora. La formulación se tamponó
con una solución a pH 6,8 de PO_{4}/NaCl concentrada 10 veces
antes de la adición de 500 \mug de WD001. Después de 15 minutos,
se añadieron 50 \mug/ml de tiomersal como conservante.
Se diluyó gp120 (50 \mug) en tampón
PO_{4}/NaCl a pH 6,8 antes de la adición de 500 \mug de CpG
WD001. Después de 15 minutos, se añadieron 50 \mug/ml de tiomersal
como conservante.
Se inmunizaron cinco monos rhesus (Macaca
mulatta) por grupo dos veces por vía intramuscular con 500
\mul de vacuna a un intervalo de cuatro semanas. Los sueros y
células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) se tomaron en
varias ocasiones.
Los anticuerpos específicos de gp120 en sueros de
monos inmunizados se determinaron en un ELISA como se describe en
Mooij y col., 1998. Brevemente, se revistieron placas de ELISA con 1
\mug/ml de gp120, se saturaron con BSA y se sometieron a
incubación con sueros de mono rhesus seguido por anticuerpo
biotinilado humano \alpha. Finalmente, se añadió
HRP-estreptavidina y se cuantificó en una reacción
de color usando OPD como
substrato.
substrato.
Se evaluó la linfoproliferación usando PBMC
purificadas en gradiente de densidad de monos rhesus inmunizados.
Las células se sembraron por cuadruplicado a 1 x 10^{5} en 100
\mul de RPMI/FCS al 5% por pocillo en placas de 96 pocillos de
fondo redondo. Después, se añadieron otros 100 \mul de medio solo
o que contenía gp120 soluble (10 \mug/ml) y se incubaron cultivos
paralelos durante 48 horas. Después, se remplazaron los 100 \mul
de sobrenadante de cultivo por medio fresco que contenía 1 \muCi
de [^{3}H]-timidina. Después de 16 horas, se
recogieron las células sobre placas de filtro y la radioactividad
incorporada se determinó en un contador \beta. Los resultados se
expresan en cpm y en índices de estimulación (SI = cpm de cultivos
que contienen antígeno/cpm de cultivos de medio solo), SI mayor de 3
se considera como respuesta positiva.
Se prepararon placas de 96 pocillos de fondo
plano revistiendo con un anticuerpo de captura específico de
IFN-\gamma en 50 \mul de PBS durante 4 horas a
37ºC. Las placas se lavaron tres veces y se sembraron PBMC de manera
similar a los ensayos de linfoproliferación. Después de 48 horas de
cultivo, las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05%
y se añadieron 50 \mul de anticuerpo específico de
IFN-\gamma secundario biotinilado diluido en
PBS/Tween/FCS al 1% durante 2 horas. Las placas se lavaron otra vez
y se incubó un anticuerpo con biotina \alpha conjugado con oro
durante 1 hora. Después de los lavados adicionales, se visualizaron
los ELIspot usando un kit de potenciación de plata (50
\mul/pocillo). La reacción se detuvo después de aproximadamente 30
minutos añadiendo agua desionizada. Las células secretoras de
citoquinas se contaron por examen microscópico.
Los análisis de anticuerpos específicos de gp120
en sueros de los monos reveló que todos los animales en los dos
grupos habían adquirido respuestas inmunes específicas (Tabla 1 y
Figura 1). Fueron detectables algunas respuestas bajas en dos
animales ya después de una inmunización. Después de la segunda
inmunización, todos los animales mostraron títulos altos de
anticuerpos específicos de gp120.
\vskip1.000000\baselineskip
| d-12 | media | 14 d post I | media | 7 d post II | media | 28 d post II | media | ||
| N5V | <100 | 188 | 6445 | 2014 | |||||
| 1055 | <100 | 50 | 4699 | 1484 | |||||
| Grupo 1 | R441 | <100 | <100 | 50 | <50 | 2942 | 5530 | 827 | 2504 |
| BXJ | <100 | 50 | 5808 | 4013 | |||||
| CPJ | <100 | 50 | 7758 | 4184 | |||||
| NJ5 | <100 | 50 | 734 | 729 | |||||
| X006 | <100 | 50 | 4182 | 1171 | |||||
| Grupo 2 | 1041 | <100 | <100 | 50 | <50 | 2834 | 3358 | 400 | 963 |
| R361 | <100 | 258 | 5227 | 1821 | |||||
| BBE | <100 | 50 | 3811 | 693 |
\vskip1.000000\baselineskip
La inducción de linfoproliferación específica por
inmunización con gp120 en combinación con CpG o CpG/alumbre se
evaluó antes de la inmunización y 6 días después de la inmunización
secundaria. Los 10 animales no mostraron ninguna linfoproliferación
específica (SI>3) en el inicio del estudio (datos no mostrados).
Por el contrario, todos los animales del grupo 1 tuvieron respuestas
linfoproliferativas fuertes 6 días después de la inmunización de
estimulación (Figura 2). De manera similar, todos excepto un animal
del grupo 2 mostraron linfoproliferación especí-
fica.
fica.
La presencia de células secretoras de
IFN-\gamma específicas de gp120 se investigó en
todos los monos antes de la inmunización y 6 días después de la
segunda dosis. Las células secretoras de
IFN-\gamma no se pudieron evaluar a partir de las
muestras de pre-inmunización debido a las
dificultades técnicas. Sin embargo, dichas células fueron
detectables después de la inmunización secundaria (Figura 3). Todos
los animales en ambos grupos mostraron una respuesta específica de
antígeno.
La inmunización con gp120 de
VIH-1 en combinación con CpG o CpG/alumbre induce
respuestas inmunes en primates no humanos. Estas respuestas incluyen
anticuerpos específicos de gp120, linfoproliferación y células
secretoras de IFN-\gamma.
Los antígenos preparados de acuerdo con el
documento WO99/16884 se dializaron frente a NaCl 150 mM para
eliminar los iones PO_{4} que inhiben la adsorción de gp120 en
Al(OH)_{3}.
La secuencia de formulación es como se describe a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos se incubaron con el CpG antes de la
adsorción sobre Al(OH)_{3} para favorecer una
interacción potencial entre el extremo His de los antígenos
Net-Tat y Nef y el oligonucleótido.
La formulación se centrifugó y se analizó el
sobrenadante por SDS-PAGE (Novex
4-20%, condiciones reductoras) para comprobar la
adsorción de Nef-Tat-VIH. El gel se
tiñó con plata. El análisis del gel de la formulación reveló que la
mayoría de la proteína Nef o Nef-Tat se adsorbió
sobre el alumbre.
La formulación de vacuna se preparó de acuerdo
con la invención que comprende una proteína de fusión
Nef-Tat y gp120 junto con un oligonucleótido que
contiene restos dinucleotídicos CpG no metilados e hidróxido de
aluminio como vehículo.
Preparación de solución de oligonucleótidos CpG:
se disuelve CpG en polvo seco en H_{2}O para dar una solución de 5
mg/ml de CpG.
Se dializaron los 3 antígenos frente a NaCl 150
mM para eliminar los iones fosfato que inhiben la adsorción de gp120
sobre hidróxido de aluminio.
Los antígenos diluidos en H_{2}O (100 \mug de
gp120, 20 \mug de Nef-Tat y 20 \mug de Nef de
VIS) se incubaron con la solución de CpG (500 \mug de CpG) durante
30 minutos antes de la adsorción sobre Al(OH)_{3}
para favorecer una interacción potencial entre el extremo His de los
antígenos NefTAt y Nef y el oligonucleótido (efecto
inmunoestimulador más fuerte de CpG descrito cuando se une a el
antígeno en comparación con CpG libre). Después, se añadieron
consecutivamente Al(OH)_{3} (500 \mug), NaCl
concentrado 10 veces y 1 \mug/ml de tiomersal como conservante a
intervalos de 5 minutos.
Todas las incubaciones se realizaron a
temperatura ambiente con agitación.
Se inmunizaron cuatro monos rhesus por vía
intramuscular a 0, 1 y 3 meses con la composición de vacuna.
Un mes después de la última inmunización todos
los animales se estimularon con un VIHS patogénico (cepa 89.6p).
Desde la semana de la estimulación (sem16) se tomaron periódicamente
muestras sanguíneas en los tiempos puntuales indicados para
determinar el % de células CD4-positivas entre
células mononucleares sanguíneas periféricas por análisis FACS
(Figura 4) y la concentración de genomas virales de ARN en el plasma
por ensayo de ADNb (Figura 5).
Todos los animales llegaron a estar infectados
después de la estimulación con VIHS_{\text{89.6p}}.
Las células CD4-positivas
disminuyeron después de la estimulación. Los cuatro animales
mostraron una disminución ligera en células
CD4-positivas y recuperaron los niveles basales con
el tiempo (Figura 4). Por el contrario, tres de los cuatro animales
en un grupo de control con adyuvante solo mostraron un descenso de
células CD4-positivas por debajo del 5% y nunca se
recuperaron.
Los datos de carga viral son casi inversos a los
datos de CD4 (Figura 5). La carga viral disminuyó en los animales
que habían recibido NefTat + gp120 formulado con oligonucleótido que
contiene CpG, pero permanecieron altos en tres de los cuatro
animales de control que recibieron sólo un adyuvante.
En la semana 44 2/4 animales en un grupo de
control tratados con sólo un adyuvante tuvieron que sacrificarse
debido a los síntomas de tipo SIDA.
La combinación de CpG y NefTat (en presencia de
Nef VIS) con adyuvante CpG evita la pérdida de células
CD4-positivas y reduce la carga viral en animales
infectados con VIHS_{\text{89.6p}} patogénico.
Figura 1: respuestas de anticuerpo específico de
gp120 de VIH-1 en monos rhesus inmunizados. Los
anticuerpos específicos se evaluaron en un ELISA. Los valores
individuales de tiempos puntuales múltiples para cada animal se
muestran en la Tabla 1, y se muestran medias de grupo en la Tabla 1
y como un gráfico en la figura 1.
Figura 2: linfoproliferación específica de gp120
en monos rhesus inmunizados 6 días después de la segunda
inmunización. Se estimularon PBMC con antígeno gp120 y se midieron
las respuestas linfoproliferativas por incorporación de
^{3}H-timidina. Los resultados se expresan en cpm
y como SI.
Figura 3: células secretoras de
IFN-\gamma específicas de gp120 de monos rhesus
inmunizados. Se visualizaron células secretoras de
IFN-\gamma por el procedimiento de ELIspot. Se
contaron las células secretoras de citoquinas que provocaron una
mancha coloreada, por examen microscópico y los resultados se
expresan de manera semi-cuantitativa (- =
0-5, + = 5-15, + + =
15-35, + + + = 35-50, + + + + =
>50).
Figuras 4 y 5: datos de recuento de células CD4 y
carga viral del Ejemplo 3 en la que se inmunizaron monos rhesus con
Nef-Tat + gp120 formulado con CpG y estimulados con
VIHS patogénico.
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Claims (12)
1. Una formulación de vacuna que comprende una
combinación de una proteína de fusión de VIH más gp120 y un
oligonucleótido inmunoestimulador CpG.
2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que la proteína de fusión de VIH es una proteína de fusión
Nef-Tat.
3. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en la que el Nef-Tat está fusionado a la
Proteína D, o lipoproteína D o un fragmento de la misma, de
Haemophilius influenzae.
4. Una formulación de vacuna de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende
adicionalmente una sal de aluminio o un adyuvante de saponina.
5. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en la que el oligonucleótido comprende dos
dinucleótidos CpG.
6. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en la que el oligonucleótido CpG tiene entre
15-45 nucleótidos de longitud.
7. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que oligonucleótido se selecciona
entre el grupo:
8. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que el oligonucleótido CpG comprende
al menos un enlace internucleótido fosforotioato.
9. El uso de una proteína de fusión de VIH más
gp120 y un oligonucleótido CpG inmunoestimulador en la fabricación
de un medicamento para la prevención o mejora de la infección por
VIH en un paciente.
10. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para su uso como medicamento.
11. Un procedimiento para producir una vacuna de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende
mezclar una proteína de fusión de VIH más gp120 y un oligonucleótido
inmunoestimulador CpG.
12. Un kit que comprende cantidades eficaces de
una formulación que contiene oligonucleótido CpG para su uso como
formulación iniciadora para la pre-administración a
pacientes humanos y una proteína de fusión de VIH más gp120 para
inyección un tiempo adecuado después.
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