ES2270430T5 - Sobreexpresión de proteínas de mamífero y virales. - Google Patents

Sobreexpresión de proteínas de mamífero y virales. Download PDF

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Abstract

LA INVENCION CARACTERIZA UN GEN SINTETICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA NORMALMENTE EXPRESADA EN CELULAS DE MAMIFERO EN DONDE AL MENOS UN CODIFICADOR NO PREFERIDO O MENOS PREFERIDO EN EL GEN NATURAL QUE CODIFICA LA PROTEINA DE MAMIFERO HA SIDO SUSTITUIDO POR UN CODIFICADOR PREFERIDO QUE CODIFICA EL MISMO AMINOACIDO.

Description

Campo de la invención
La invención se refiere a genes y métodos para expresar proteínas de VIH a altos niveles en células eucariotas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La expresión de productos de genes eucarióticos en procariotas algunas veces está limitado por la presencia de codones que se usan con poca frecuencia en E. coli. La expresión de estos genes puede potenciarse por medio de la sustitución sistemática de los codones endógenos con codones sobrerrepresentados en genes procarióticos de alta expresión (Robinson et al. 1984). Comúnmente se supone que los codones raros producen paradas del ribosoma, con lo que no se puede completar la cadena polipeptídica naciente y se produce el desacoplamiento de la transcripción y la traducción. El extremo 3' del ARNm del ribosoma parado se expone a ribonucleasas celulares, reduciéndose de esta manera la estabilidad del transcrito.
Sumario de la invención
La invención se refiere a un método para preparar un gen sintético, y a un gen sintético que se obtiene por este método, de acuerdo con la reivindicaciones adjuntas.
Son codones preferidos: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac) Cys (tgc); Gln (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr (acc); Tyr (tac); y Val (gtg). Son codones menos preferidos: Gly (ggg); Ile (att); Leu (ctc); Ser (tcc); Val (gtc). Todos los codones que no se ajustan a la descripción de codones preferidos o codones menos preferidos son codones no preferidos.
En realizaciones preferidas, el gen sintético puede expresar dicha proteína de mamífero a un nivel que es al menos 150%, 200%, 500%, 1.000%, o 10.000% del expresado por dicho gen natural en un sistema de cultivo de células de mamífero in vitro en condiciones idénticas (es decir, el mismo tipo celular, las mismas condiciones de cultivo, y el mismo vector de expresión).
A continuación se describen sistemas de cultivo de células adecuados para medir la expresión del gen sintético y el gen natural correspondiente. Los especialistas en la técnica conocen bien otros sistemas de expresión adecuados que emplean células de mamífero y los describen, por ejemplo, en los trabajos de referencia de biología molecular convencionales indicados más adelante. Los vectores adecuados para la expresión de los genes sintéticos y naturales se describen más adelante y en los trabajos de referencia convencionales descritos a continuación. Por "expresión" se entiende expresión de proteínas. La expresión puede medirse usando un anticuerpo específico por la proteína de interés. Estos anticuerpos y técnicas de medición son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Por "gen natural" se entiende la secuencia génica que codifica de forma natural la proteína.
En otras realizaciones preferidas al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de los codones del gen natural son codones no preferidos.
En una realización preferida, la proteína es una proteína de VIH. En otras realizaciones preferidas, la proteína es gag, pol, env, gp120, o gp160.
En algunas circunstancias (por ejemplo, para permitir la introducción de un sitio de restricción) puede ser deseable reemplazar un codón no preferido por un codón menos preferido en lugar de por un codón preferido.
No es necesario reemplazar todos los codones menos preferidos o no preferidos por codones preferidos. Puede conseguirse una expresión aumentada incluso con un reemplazo parcial.
En otras realizaciones preferidas, la invención se refiere a vectores (incluyendo vectores de expresión) que comprenden el gen sintético
Por "vector" se entiende una molécula de ADN obtenida, por ejemplo, a partir de un plásmido, bacteriófago
o virus de mamífero o de insecto, en el que pueden insertarse o clonarse fragmentos de ADN. Un vector contendrá uno o más sitios de restricción únicos y puede replicarse de forma autónoma en un hospedador u organismo vehículo definido de tal forma que la secuencia clonada sea reproducible. De esta manera, por "vector de expresión" se entiende cualquier elemento autónomo capaz de dirigir la síntesis de una proteína. Estos vectores de expresión de ADN incluyen plásmidos y virus de mamífero.
Para construir los genes sintéticos de la invención puede ser deseable evitar secuencias CpG, ya que estas secuencias pueden producir silenciamiento génico.
La preferencia codónica presente en el gen de la envuelta gp120 de VIH también está presente en las proteínas gag y pol. De esta manera, el reemplazo de una porción de los codones no preferidos y menos preferidos encontrados en estos genes por codones preferidos produciría un gen que podría tener un mayor nivel de expresión. Una gran fracción de los codones presentes en los genes humanos que codifican el Factor VIII y el Factor IX son codones no preferidos o codones menos preferidos. El reemplazo de una porción de estos codones por codones preferidos produciría genes que podrían tener un mayor nivel de expresión en cultivo de células de mamífero. Por el contrario, puede ser deseable reemplazar codones preferidos en un gen natural por codones menos preferidos como medio para reducir la expresión.
Los trabajos de referencia convencionales que describen los principios generales de la tecnología de ADN recombinante incluyen Watson, J.D. et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J.E. et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986); Old, R.W., et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2ª Ed., University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); y Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).
Descripción Detallada
Descripción de los Dibujos
La Figura 1 representa la secuencia de la proteína gp120 sintética (SEC ID Nº: 34) y un gen sintético de gp160 (SEC ID Nº: 35) en la que los codones se han reemplazado por los encontrados en genes humanos de alta expresión.
La Figura 2 es un dibujo esquemático del gen gp120 sintético (MN de VIH-1). Las porciones sombreadas marcadas v1 a v5 indican regiones hipervariables. Los recuadros negros indican el sitio de unión a CD4. Se muestra un número limitado de los sitios de restricción únicos: H (Hind3), Nh (Nhe1), P (Pst1), Na (Nae1), M (Mlul), R (EcoR1), A (Age1) y No (Not1). Los fragmentos de ADN sintetizados químicamente que sirvieron como plantillas de PCR se muestran debajo de la secuencia de gp120, junto con las localizaciones de los cebadores usados para su amplificación.
La Figura 3 es una fotografía de los resultados de ensayos de transfección transitoria usados para medir la expresión de gp120. Electroforesis en gel de sobrenadantes inmunoprecipitados de células 293T transfectadas con plásmidos que expresan gp120 codificada por el aislado IIIB de VIH-1 (gp120IIIb), por el aislado MN (gp120mn), por el aislado MN modificado por sustitución del péptido líder endógeno por el del antígeno CD5 (gp120mnCD5L), o por el gen sintetizado químicamente que codifica la variante MN con el líder de CDS humanas (syngp120mn). Los sobrenadantes se recogieron después de un período de marcaje de 12 horas 60 horas después de la transfección y se inmunoprecipitaron con proteína de fusión CD4:IgG1 y proteína A sepharose.
La Figura 4 es un gráfico que representa los resultados de ensayos ELISA usados para medir los niveles de proteína en sobrenadantes de células 293T transfectadas de forma transitoria. Se recogieron sobrenadantes de células 293T transfectadas con plásmidos que expresaban gp120 codificada por el aislado IIIB de VIH-1 (gp120 IIIb), por el aislado MN (gp120mn), por el aislado MN modificado por sustitución del péptido líder endógeno por el del antígeno CD5 (gp120mn CD5L), o por el gen sintetizado químicamente que codifica la variante MN con el líder de CDS humanas (syngp120mn) después de 4 días y se ensayaron en un ELISA con gp120/CD4 . El nivel de gp120 se expresa en ng/ml.
La Figura 5, panel A es una fotografía de un gel que ilustra los resultados de un ensayo de inmunoprecipitación usado para medir la expresión de la gp120 nativa y sintética en presencia de rev en trans y RRE en cis. En este experimento se transfectaron de forma transitoria células 293T por coprecipitación con fosfato cálcico de 10 µg de plásmido que expresaba: (A) la secuencia de gp120MN sintético y RRE en cis, (B) la porción de gp120 de IIIB de VIH-1, (C) la porción de gp120 de IIIB de VIH-I y RRE en cis, todos en presencia o ausencia de expresión de rev. Las construcciones de RRE qp120IIIbRRE y syngpl20mnRRE se generaron usando un fragmento de RRE Eagl/Hpal clonado por PCR a partir de un clon proviral HXB2 de VIH-1. Cada plásmido de expresión de gp120 se co-transfectó con 10 µg de ADN plasmídico de pCMVrev o CDM7. Los sobrenadantes se recogieron 60 horas después de la transfección, se inmunoprecipitaron con proteína de fusión CD4:IgG y proteína A agarosa y se procesaron en una SDSPAGE reductora al 7%. El tiempo de exposición del gel se prolongó para permitir la inducción de gp120IIIbrre por rev que se quería demostrar. La Figura 5, panel B es una exposición más corta de un experimento similar en el que se co-transfectó syngp120mnrre con o sin pCMVrev. La Figura 5 panel C es un diagrama esquemático de las construcciones usadas en el panel A.
La Figura 6 es una comparación de la secuencia del gen THY-1 de rata de tipo silvestre (wt) (SEC ID Nº: 37) y un gen THY-1 sintético de rata (env) (SEC ID Nº 36) construido por síntesis química y que tenía los codones más prevalentes encontrados en el gen env de VIH-1.
La Figura 7 es un diagrama esquemático del gen THY-1 sintético de rata. El recuadro relleno negro indica el péptido señal. El recuadro sombreado indica las secuencias del precursor que dirigen la unión de un anclaje
5
10
15
20
25
30
35
de fosfatidilinositol glicano. Los sitios de restricción únicos usados para el montaje de las construcciones de THY-1 están marcados como H (Hind3), M (Mlul), S (Sac1) y No (Not1). La posición de los oligonucleótidos sintéticos empleados en la construcción se muestra en la parte inferior de la figura.
La Figura 8 es un gráfico que representa los resultados de un análisis de citometría de flujo. En este experimento se transfectaron de forma transitoria células 293T con THY-1 de rata de tipo silvestre (línea oscura), THY-1 de rata con codones de envuelta (línea clara) o vector solo (línea de puntos). Las células 293T se transfectaron con los diferentes plásmidos de expresión por co-precipitación con fosfato cálcico y se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-THY-1 de rata OX7 seguido de un anticuerpo policlonal anti-IgG de ratón conjugado con FITC 3 días después de la transfección.
La Figura 9, panel A es una fotografía de un gel que ilustra los resultados del análisis de inmunoprecipitación de sobrenadantes de células 293T humanas transfectadas con syngp120mn (A) o una construcción syngp120mn.rTHY-lenv que tiene el gen rTHY-lenv en la región 3' no traducida del gen syngp120mn (B). La construcción syngp120mn.rTHY-lenv se generó insertando un adaptador Not1 en el sitio Hind3 romo del plásmido rTHY-lenv. Posteriormente, se clonó un fragmento Not1 de 0,5 kb que contenía el gen rTHY-lenv en el sitio Not1 del plásmido syngp120mn y se ensayó para comprobar si tenía la orientación correcta. Se recogieron sobrenadantes de células marcadas con 35S 72 horas después de la transfección, se precipitaron con proteína de fusión CD4:IgG y proteína A agarosa y se procesaron en una SDS-PAGE reductora al 7%. La Figura 9, panel B es un diagrama esquemático de las construcciones usadas en el experimento representado en el panel A de esta figura.
Descripción de las realizaciones preferidas
Construcción de un Gen gp120 Sintético que Tiene Codones Encontrados en Genes Humanos de Alta Expresión.
Se generó una tabla de frecuencia de codones para el precursor de la envuelta del subtipo LAV de VIH-1 usando el software creado por el University of Wisconsin Genetics Computer Group (Grupo de Informática Aplicada a la Genética de la Universidad de Wisconsin). Los resultados de esta tabla se contrastan en la Tabla 1 con el patrón de uso de codones por una colección de genes humanos de alta expresión. Para cualquier aminoácido codificado por codones degenerados, el codón más preferido para los genes de alta expresión es diferente del codón más preferido del precursor de la envuelta de VIH. Además, una regla sencilla describe el patrón de codones de la envuelta preferidos dondequiera que se aplique: los codones preferidos maximizan el número de restos de adenina en el ARN viral. En todos los casos excepto uno esto significa que el codón en el que la tercera posición es A, es el usado con más frecuencia. En el caso especial de la serina, tres codones aportan igualmente un resto A al ARNm; conjuntamente, estos tres constituyen 85% de los codones usados realmente en los transcritos de la envuelta. Un ejemplo particularmente sorprendente de la preferencia de A se encuentra en la elección de codones para arginina, en la que el triplete AGA constituye 88% de todos los codones. Además de la preponderancia de restos A, se observa una preferencia marcada por uridina entre codones degenerados cuyo tercer resto debe ser una pirimidina. Finalmente, las inconsistencias entre las variantes usadas con menos frecuencia pueden explicarse por la observación de que el dinucleótido CpG está infrarrepresentado; de esta manera, es menos probable que la tercera posición sea G siempre que la segunda posición es C, como ocurre en los codones para alanina, prolina, serina y treonina; y los tripletes CGX para arginina apenas se usan.
TABLA 1: Frecuencia de Codones en el gen IIIb env de VIH-1 y en genes humanos de alta expresión
Elevado
Env Elevado Env
Ala
Cys
GC
C 53 27 TG C 68 16
T
17 18 T 32 84
A
13 50
G
17 5 Gln
CA
A 12 55
Arg
G 88 45
CG
C 37 0
Elevado Env Elevado Env
T7 4 Glu A 6 0 GA A 25 67 G 21 0 G 7533 AG A 10 88 G 18 8 Gly GG C 50 6 Asn T 12 13 AA C 78 30 A 14 53 T22 70 G 24 28
Asp His
GA C 75 33CA C 79 25 T 25 67 T 21 75
Ile
ATC 77 25 T 18 31 A 5 44
Leu Ser
CTC 26 10TC C 28 8 T5 7 T138 A 3 17 A 5 22 G 5817 G 9 0 TT A 2 30AG C 34 22 G 6 20 T1041
Lys Thr
AA A 18 68AC C 57 20 G 82 32 T14 22 A 14 51 G 15 7
5
10
15
20
25
30
Elevado
Env Elevado Env
Pro
Tyr
CC
C 48 27 TA C 74 8
T
19 14 T 26 92
A
16 55
G
17 5
Phe
Val
TT
C 80 26 GT C 25 12
T
20 74 T 7 9
A
5 62
G
64 18
La frecuencia de codones se calculó usando el programa GCG establecido en el University of Wisconsin Genetics Computer Group. Los números representan el porcentaje de casos en los que se usa el codón particular. Las frecuencias de uso de codones de genes de la envuelta de otros aislados de virus VIH-1 son comparables y muestran una preferencia similar.
Para producir un gen gp120 que puede tener una alta expresión en células de mamífero, se construyó un gen sintético que codificaba el segmento gp120 de VIH-1 (syngp120mn), basándose en la secuencia del subtipo más común en Norteamérica, MN de VIH-1 (Shaw et al. 1984; Gallo et al. 1986). En este gen sintético de gp120, casi todos los codones nativos se han reemplazado sistemáticamente por codones usados con más frecuencia en genes humanos de alta expresión (FIG. 1). Este gen sintético se ensambló a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente con una longitud de 150 a 200 bases. Si se sintetizan químicamente oligonucleótidos que exceden de 120 a 150 bases, el porcentaje de producto de longitud completa puede ser bajo y la inmensa mayoría de material consiste en oligonucleótidos más cortos. Como estos fragmentos más cortos inhiben los procedimientos de clonación y de PCR, puede ser muy difícil usar oligonucleótidos que excedan de una cierta longitud.Para usar material de síntesis bruto sin purificación previa, se amplificaron por PCR grupos de oligonucleótidos monocatenarios antes de la clonación. Los productos de PCR se purificaron en geles de agarosa y se usaron como plantillas en la siguiente etapa de PCR. Pudieron co-amplificarse dos fragmentos adyacentes debido al solapamiento de secuencias al final de cualquier fragmento. Estos fragmentos, que tenían un tamaño comprendido entre 350 y 400 pb, se subclonaron en un plásmido derivado de pCDM7 que contenía la secuencia líder de la molécula de superficie CD5 seguida de un polienlazador Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1. Cada una de las enzimas de restricción de este polienlazador representa un sitio que está presente en el extremo 5' o 3' de los fragmentos generados por PCR. De esta manera, por medio de la subclonación secuencial de cada uno de los 4 fragmentos largos, se ensambló el gen gp120 entero. Para cada fragmento se subclonaron de 3 a 6 clones diferentes y se secuenciaron antes del ensamblaje. En la FIG. 2 se muestra un dibujo esquemático del método usado para construir la gp120 sintética. La secuencia del gen gp120 sintético (y un gen gp160 sintético creado usando la misma estrategia) se presenta en la FIG. 1.
El índice de mutación fue considerable. Las mutaciones encontradas con más frecuencia fueron deleciones cortas (de 1 nucleótido) y largas (de hasta 30 nucleótidos). En algunos casos, fue necesario cambiar partes con adaptadores o piezas sintéticas de otros subclones sin mutación en esa región particular. Se realizaron algunas desviaciones de la adhesión estricta al uso de codones optimizados para acomodar la introducción de sitios de restricción en el gen resultante con el fin de facilitar el reemplazo de diversos segmentos (FIG. 2). Estos sitios de restricción únicos se introdujeron en el gen a intervalos de aproximadamente 100 pb. La secuencia líder de VIH nativa se cambió por el péptido líder de alta eficacia del antígeno CD5 humano para facilitar la secreción. El plásmido usado para la construcción es un derivado del vector de expresión de mamífero pCDM7 que transcribe el gen insertado bajo el control de un promotor temprano inmediato fuerte de CMV humano.
Para comparar las secuencias codificantes sintéticas y de tipo silvestre de gp120, la secuencia codificante sintética de gp120 se insertó en un vector de expresión de mamífero y se ensayó en ensayos de transfección transitorios. Como controles para excluir variaciones en los niveles de expresión entre diferentes aislados de virus y artefactos inducidos por distintas secuencias líder se usaron varios genes gp120 nativos diferentes.La construcción gp120 VIH IIIb usada como control se generó por PCR usando un fragmento de la envuelta Sal1/Xho1 HXB2 de VIH1 como plantilla. Para excluir mutaciones inducidas por PCR, un fragmento Kpn1/Ear1 que contenía aproximadamente 1,2 kb del gen se cambió por la secuencia respectiva del clon proviral. Las construcciones de gp120mn de tipo silvestre usadas como controles se clonaron por PCR a partir de células C8166 infectadas con MN de VIH-1. (AIDS Repository, Rockville, MD) y expresaron gp120 con una envuelta nativa o con una secuencia líder de CD5. Como no se disponía de clones provirales en este caso, se ensayaron dos clones de cada construcción para evitar artefactos de PCR. Para determinar semi-cuantitativamente la cantidad de gp120 secretada, se inmunoprecipitaron sobrenadantes de células 293T transfectadas de forma transitoria por co-precipitación con fosfato cálcico con proteína de fusión soluble CD4:inmunoglobulina y proteína A sepharose.
Los resultados de este análisis (FIG. 3) demuestran que el producto génico sintético se expresa a un nivel muy elevado en comparación con el de los controles de gp120 nativo. El peso molecular del gen gp120 sintético fue comparable al de las proteínas de control (FIG. 3) y parecía estar en el intervalo de 100 a 110 kd. La migración ligeramente más rápida puede explicarse por el hecho de que en algunas líneas de células tumorales tales como 293T, la glicosilación no se completa o está alterada en alguna medida.
Para comparar la expresión de forma más precisa, se cuantificaron los niveles de proteína gp120 usando un ELISA de gp120 con CD4 en la fase inmóvil. Este análisis demuestra (FIG. 4) que los datos del ELISA eran comparables a los datos de inmunoprecipitación, con una concentración de gp120 de aproximadamente 125 ng/ml para el gen gp120 sintético, y menos del límite basal (5 ng/ml) para todos los genes gp120 nativos. De esta manera, la expresión del gen gp120 sintético parece ser al menos un orden de magnitud superior que los genes gp120 de tipo silvestre. En el experimento mostrado el aumento fue de al menos 25 veces.
El Papel de rev en la Expresión de gp120
Como rev parece ejercer su efecto en varias etapas en la expresión de un transcrito viral, se ensayó el posible papel de efectos no traduccionales en la mejora de la expresión del gen gp120 sintético. En primer lugar, para descartar la posibilidad de que los elementos de señales negativas que conferían una mayor degradación de ARNm o retención de ácido nucleico se eliminaran cambiando la secuencia de nucleótidos, se ensayaron los niveles de ARNm citoplásmico. Se preparó ARN citoplásmico por lisis con NP40 de células 293T transfectadas de forma transitoria y la posterior eliminación de los núcleos por centrifugación. Posteriormente se preparó ARN citoplásmico a partir de los lisados por múltiples extracciones con fenol y precipitación, se aplicaron sobre nitrocelulosa usando un aparato slot blot y finalmente se hibridó con una sonda específica para la envuelta.
En resumen, se aisló ARNm citoplásmico de células 293 transfectadas con CDM&, gp120 IIIB, o syngp120 36 horas después de la transfección. El ARN citoplásmico de células Hela infectadas con virus vaccinia de tipo silvestre o virus recombinante que expresaba gp120 IIIb o el gen gp120 sintético estaba bajo el control del promotor
7.5 y se aisló 16 horas después de la infección. Se aplicaron cantidades iguales sobre nitrocelulosa usando un dispositivo slot blot y se hibridaron con fragmentos de gp120IIIb y syngp120 de 1,5 kb marcados aleatoriamente o beta-actina humana. Los niveles de expresión de ARN se cuantificaron explorando las membranas hibridadas con un phosphoimager. Los procedimientos usados se describen con mayor detalle más adelante.
Este experimento demostró que no había ninguna diferencia significativa en los niveles de ARNm de las células transfectadas con el gen gp120 nativo o sintético. De hecho, en algunos experimentos el nivel de ARNm citoplásmico del gen gp120 sintético era incluso menor que el del gen gp120 nativo.
Estos datos se confirmaron midiendo la expresión de virus vaccinia recombinantes. Se infectaron células 293 o células Hela humanas con virus vaccinia que expresaba gp120 IIIb de tipo silvestre o syngp120mn a una multiplicidad de infección de al menos 10. Los sobrenadantes se recogieron 24 horas después de la infección y se inmunoprecipitaron con proteína de fusión CD4:inmunoglobina y proteína A sepharose. Los procedimientos usados en este experimento se describen con mayor detalle más adelante.
Este experimento demostró que se observaba una mayor expresión del gen sintético cuando el producto del gen endógeno y el producto del gen sintético se expresaban en recombinantes de virus vaccinia bajo el control del promotor 7.5 k mixto temprano y tardío fuerte.Como los ARNm del virus vaccinia se transcriben y traducen en el citoplasma, el aumento de la expresión del gen sintético de la envuelta en este experimento no puede atribuirse a una mejor exportación desde el núcleo. Este experimento se repitió en dos tipos de células humanas adicionales, la línea celular de cáncer de riñón 293 y células HeLa. Como ocurre con las células 293T transfectadas, los niveles de ARNm fueron similares en células 293 infectadas con cualquier virus vaccinia recombinante.
Uso de Codones en Lentivirus
Como parece ser que el uso de codones tiene un impacto significativo sobre la expresión en células de mamífero, se examinó la frecuencia de codones en los genes de la envuelta de otro retrovirus. Este estudio no encontró un patrón claro de preferencia de codones entre los retrovirus en general. Sin embargo, si se analizaran por separado virus del género lentivirus, al que pertenece VIH-1, se encontrarían preferencias del uso de codones casi idénticas a las de VIH-1. Se preparó una tabla de frecuencia de codones a partir de las glicoproteínas de la envuelta de una diversidad de retrovirus (predominantemente de tipo C) excluyendo los lentivirus, y se comparó con
una tabla de frecuencia de codones creada a partir de las secuencias de la envuelta de cuatro lentivirus no muy relacionados con VIH-1 (virus de la encefalitis y artritis caprina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia felina y virus visna) (Tabla 2). El patrón de uso de codones para los lentivirus es sorprendentemente similar al de VIH-1, en todos los casos excepto uno, el codón preferido para VIH-1 es el mismo 5 que el codón preferido para los otros lentivirus. La excepción es prolina, que se codifica por CCT en 41% de los restos de la envuelta lentiviral no-VIH, y por CCA en 40% de los restos, una situación que refleja también claramente una preferencia significativa por el triplete que termina en A. El patrón de uso de codones por las proteínas de la envuelta no lentivirales no muestra una predominancia similar de restos A, y tampoco está tan sesgado hacia los restos de tercera posición C y G como el uso de codones para genes humanos de alta expresión. En general, los
10 retrovirus no lentivirales parecen explotar los diferentes codones más equitativamente, un patrón que comparten con genes humanos menos expresados.
TABLA 2: Frecuencia de codones en el gen de la envuelta de lentivirus (lenti) y retrovirus no lentivirales (otros)
Otros Lenti Otros Lenti Ala Cys
GC C 4513 TG C 5321 T 26 37 T47 79 A 20 46 G 9 3 Gln
CA A 52 69 Arg G 48 31 CG C 142
T6 3 Glu A 16 5 GA A 5768 G 17 3 G 4332
AG A 31 51 G 15 26 Gly GG C 218
Asn T13 9 AA C 49 31 A 3756 T 51 69 G 29 26
Asp His
A C 55 33 CA C 5138 T 51 69 T49 62
Ile
AT C 38 16
Otros Lenti Otros Lenti
T 31 22 A 31 61
Leu Ser
CT C 228 TC C 3810 T 14 9 T1716 A 21 16 A 18 24 G 1911 G 6 5 TT A 1541 AG C 1320 G 1016 T7 25
Lys Thr
AA A 6063 AC C 4418 G 40 37 T27 20 A 19 55 Pro G 10 8 CC C 4214 T 30 41 Tyr A 20 40 TA C 48 28 G 7 5 T5272
Phe Val
TT C 5225 GT C 369
T 48 75 T17 10
A 22 54
G 25 27
La frecuencia de codones se calculó usando el programa GCG establecido por el University of Wisconsin Genetics Computer Group. Los números representan el porcentaje en el que se usa un codón particular. El uso de codones de retrovirus no lentivirales se recopiló a partir de las secuencias de precursores de la envuelta del virus de la leucemia bovina, el virus de la leucemia felina, el virus de la leucemia de células T humanas de tipo I, el virus linfotrópico de células T humana de tipo II, el aislado que forma focos de células de visón del virus de la leucemia murina (MuLV), el aislado que forma focos de bazo de Rauscher, el aislado 10A1, el aislado anfotrópico 4070A y el aislado del virus de la leucemia mieloproliferativa, y del virus de la leucemia de rata, el virus del sarcoma de simio, el virus de la leucemia de células T de simio, el retrovirus leucemogénico T1223/B y el virus de la leucemia del gibón. Las tablas de frecuencia de codones para los lentivirus no VIH, no VIS se recopilaron a partir de las secuencias de precursores de la envuelta para el virus de la encefalitis y artritis caprina, el virus de la anemia infecciosa equina, el virus de la inmunodeficiencia felina y el virus visna.
Además de la prevalencia de codones que contenían A, los codones lentivirales se adhieren al patrón de VIH de infrarrepresentación de CpG fuerte, de forma que la tercera posición para alanina, prolina, serina y treonina raramente es G. Los tripletes de la envuelta retroviral muestran una infrarrepresentación similar, pero menos pronunciada de CpG. La diferencia más evidente entre los lentivirus y otros retrovirus con respecto a la prevalencia de CpG se basa en el uso de la variante CGX de tripletes de arginina, que se representa de una forma razonablemente frecuente entre las secuencias codificantes de la envuelta retroviral, pero casi nunca está presente entre las secuencias de lentivirus comparables.
Diferencias en Dependencia de rev Entre gp120 Nativa y Sintética
Para examinar si la regulación por rev está relacionada con el uso de codones de VIH-1, se investigó la influencia de rev sobre la expresión tanto del gen nativo como del gen sintético. Como la regulación por rev requiere el sitio de unión a rev RRE en cis, se realizaron construcciones en las que este sitio de unión se clonó en la región 3' no traducida tanto del gen nativo como del gen sintético. Estos plásmidos se co-transfectaron con rev o un plásmido de control en trans en células 293T, y los niveles de expresión de gp120 en los sobrenadantes se midieron semicuantitativamente por inmunoprecipitación. Los procedimientos usados en este experimento se describen con mayor detalle más adelante.
Como se muestra en la FIG. 5, paneles A y B, rev regula positivamente el gen gp120 nativo, pero no tiene ningún efecto sobre la expresión del gen gp120 sintético. De esta manera, la acción de rev no es evidente en un sustrato que carece de la secuencia codificante de secuencias de la envuelta viral endógenas.
Expresión de un gen THY-1 de rata sintético con codones de la envuelta de VIH
El experimento descrito anteriormente sugiere que, efectivamente, para la regulación de rev tienen que estar presentes "secuencias de la envuelta". Para ensayar esta hipótesis, se preparó una versión sintética del gen que codificaba la proteína de la superficie celular pequeña, típicamente de alta expresión, antígeno THY-1 de rata. La versión sintética del gen THY-1 de rata se diseñó para tener un uso de codones similar al de gp120 de VIH. Para diseñar este gen sintético se evitaron secuencias AUUUA, que están asociadas con la inestabilidad del ARNm. Además, se introdujeron dos sitios de restricción para simplificar la manipulación del gen resultante (FIG. 6). Este gen sintético, con el uso de codones de la envuelta de VIH (rTHY-1env) se generó usando tres oligonucleótidos de 150 a 170 unidades (FIG. 7). A diferencia del gen syngp120mn, los productos de PCR se clonaron directamente y se ensamblaron en pUC12, y posteriormente se introdujeron por clonación en pCDM7.
Los niveles de expresión de rTHY-1 nativo y rTHY-1 con los codones de la envuelta de VIH se cuantificaron por inmunofluorescencia de células 293T transfectadas de forma transitoria. La FIG. 8 demuestra que la expresión del gen THY-1 nativo es casi dos órdenes de magnitud superior al nivel basal de las células transfectadas de control (pCDM7). Por el contrario, la expresión del THY-1 de rata sintético es sustancialmente menor que la del gen nativo (como se muestra por el desplazamiento del pico hacia un número de canal inferior).
Para demostrar que no se introdujeron sin querer elementos de secuencia negativos que promovieran la degradación del ARNm, se generó una construcción en la que se clonó el gen rTHY-lenv en el extremo 3' del gen gp120 sintético (FIG. 9, panel B). En este experimento, se transfectaron células 293T con el gen syngp120mn o el gen de fusión syngp120/THY-1 de rata env (syngp120mn.rTHY-lenv). La expresión se midió por inmunoprecipitación con proteína de fusión CD4:IgG y proteína A agarosa. Los procedimientos usados en este experimento se describen con más detalle más adelante.
Como el gen gp120 sintético tiene un codón de parada UAG, rTHY-1env no se traduce a partir de este transcrito. Si estuvieran presentes en la secuencia elementos negativos que confirieran una mayor degradación, los niveles de proteína gp120 expresados a partir de esta construcción deberían estar reducidos en comparación con la construcción syngp120mn sin rTHY-1env. La FIG. 9, panel A, demuestra que la expresión de las dos construcciones es similar, lo que indica que la baja expresión debe estar asociada a la traducción.
Expresión dependiente de rev del gen THY-1 sintético de rata con codones de la envuelta
Para explorar si rev puede regular la expresión de un gen THY-1 de rata que tiene codones env, se realizó una construcción con un sitio de unión a rev en el extremo 3' de la fase de lectura abierta de rTHYlenv. Para medir la sensibilidad a rev de una construcción THY de rata-lenv que tenía a RRE 3', se co-transfectaron células 293T humanas con THY de rata-lenvrre y CDM7 o pCMVrev. 60 horas después de la transfección las células se separaron con EDTA 1 mM en PBS y se tiñeron con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-rTHY-1 OX-7 y un anticuerpo secundario conjugado con FITC. La intensidad de fluorescencia se midió usando un citofluorómetro EPICS XL . Estos procedimientos se describen con más detalle más adelante.
En experimentos repetidos, se detectó un ligero aumento de la expresión de rTHY-lenv si se cotransfectaba rev con el gen rTHY-lenv. Para aumentar adicionalmente la sensibilidad del sistema de ensayo, se generó una construcción que expresaba una versión secretada de rTHY-lenv. Esta construcción produciría datos más fiables debido a que la cantidad acumulada de proteína secretada en el sobrenadante refleja el resultado de producción de proteína durante un periodo prolongado, a diferencia de la proteína expresada en la superficie que parece reflejar con más precisión el porcentaje de producción actual. Se preparó un gen capaz de expresar una forma secretada por PCR usando cebadores directos e inversos que hibridaban en posición 3' de la secuencia líder endógena y en posición 5' del motivo de secuencia requerido para el anclaje de fosfatidilinositol glicano, respectivamente. El producto de PCR se clonó en un plásmido que ya contenía una secuencia líder de CD5, generando de esta manera una construcción en la que se ha delecionado el anclaje de la membrana y la secuencia líder se ha cambiado por un péptido líder heterólogo (y probablemente más eficaz).
La sensibilidad a rev de la forma secretada de THY de rata-lenv se midió por inmunoprecipitación de sobrenadantes de células 293T humanas co-transfectadas con un plásmido que expresaba una forma secretada de THY de rata-lenv y la secuencia RRE en cis (rTHY-lenvPI-rre) y CDM7 o pCMVrev. La construcción rTHY-lenvPI-RRE se preparó por PCR usando el oligonucleótido cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac como cebador directo y cgcggatcccttgtattttgtactaata a como cebador inverso y la construcción rTHY-lenv sintética como plantilla. Después de la digestión con Nhe1 y Not1, el fragmento de PCR se clonó en un plásmido que contenía secuencias líder de CD5 y RRE. Se recogieron los sobrenadantes de las células marcadas con 35S 72 horas después de la transfección, se precipitaron con un anticuerpo monoclonal de ratón OX7 contra rTHY-1 y anti-IgG de ratón sepharose, y se procesaron en una SDS-PAGE reductora al 12%.
En este experimento, la inducción de rTHY-1env por rev fue mucho más prominente y clara que en el experimento descrito anteriormente y sugiere fuertemente que rev puede regular la traducción de transcritos que se reprimen por codones de bajo uso.
Expresión independiente de rev de una proteína de fusión rTHY-lenv:inmunoglobulina
Para ensayar si los codones de bajo uso deben estar presentes a lo largo de toda la secuencia codificante o si es suficiente una región corta para conferir sensibilidad a rev, se generó una proteína de fusión rTHYlenv:inmunoglobulina. En esta construcción, el gen rTHY-lenv (sin el motivo de secuencia responsable para el anclaje de fosfatidilinositol glicano) está unido a la bisagra de IgG1 humana, dominios CH2 y CH3. Esta construcción se generó por PCR de anclaje usando cebadores con sitios de restricción Nhe1 y BamHI y rTHY-lenv como plantilla. El fragmento de PCR se clonó en un plásmido que contenía la secuencia líder de la molécula de superficie CD5 y la bisagra, partes CH2 y CH3 de la inmunoglobulina IgG1. Un fragmento Hind3/Eagl que contenía el inserto rTHYlenveg1 se clonó posteriormente en un plásmido derivado de pCDM7 con la secuencia de RRE.
Para medir la respuesta del gen de fusión rTHY-lenv/inmunoglobulina (rTHY-lenveglrre) a rev, se cotransfectaron células 293T humanas con rTHY-lenveglrre y pCDM7 o pCMVrev. La construcción rTHY-lenveglrre se obtuvo por PCR de anclaje usando cebadores directo e inverso con sitios de restricción Nhe1 y BamH1 respectivamente. El fragmento de PCR se clonó en un plásmido que contenía un líder de CDR y una bisagra de IgG1 humana, dominios CH2 y CH3. Los sobrenadantes de las células marcadas con 35S se recogieron 72 horas después de la transfección, se precipitaron con un anticuerpo monoclonal de ratón OX7 contra rTHY-1 e IgG antiratón sepharose, y se procesaron en una SDS-PAGE reductora al 12%. Los procedimientos usados se describen con mayor detalle más adelante.
Como ocurre con el producto del gen rTHY-lenvPI-, esta proteína de fusión rTHY-lenv/inmunoglobulina se secreta en el sobrenadante. De esta manera, este gen debe responder a la inducción por rev. Sin embargo, a diferencia de rTHY-lenvPI-, la co-transfección de rev en trans no indujo o indujo únicamente un aumento insignificante de la expresión de rTHY-1enveg1.
La expresión de la proteína de fusión rTHY-1:inmunoglobulina con codones nativos de rTHY-1 o de la envuelta de VIH se midió por inmunoprecipitación. En resumen, se transfectaron células 293T humanas con rTHYlenveg1 (codones env) o rTHY-1wteg1 (codones nativos). La construcción rTHY-1wteg1 se generó de una manera similar a la usada para la construcción rTHY-lenvegl, con la excepción de que como plantilla se usó un plásmido que contenía el gen rTHY-1 nativo. Los sobrenadantes de las células marcadas con 35S se recogieron 72 horas después de la transfección, se precipitaron con un anticuerpo monoclonal de ratón OX7 contra rTHY-1 y anti-IgG de ratón sepharose, y se procesaron en una SDS-PAGE reductora al 12%. Los procedimientos usados en este experimento se describen con mayor detalle más adelante.
Los niveles de expresión de rTHY-lenvegl se redujeron en comparación con una construcción similar con rTHY-1 de tipo silvestre como molécula de fusión, pero aún eran considerablemente mayores que rTHY-lenv. Por consiguiente, las dos partes de la proteína de fusión influyeron sobre los niveles de expresión. La adición de rTHYlenv no restringió la expresión a un nivel igual al visto para rTHY-lenv solo. De esta manera, la regulación por rev parece ser ineficaz si la expresión de la proteína no se suprime casi completamente.
Preferencia de codones en genes de la envuelta de VIH-1
La comparación directa entre la frecuencia del uso de codones de la envuelta de VIH y genes humanos de alta expresión revela una diferencia sorprendente para los veinte aminoácidos. Una medida sencilla del significado estadístico de esta preferencia de codones es el descubrimiento de que entre los nueve aminoácidos con degeneración doble de codones, el tercer resto preferido es A o U en todos ellos. La probabilidad de que las nueve elecciones de parejas equiprobables sea la misma es de aproximadamente 0,004, y por lo tanto por cualquier medición convencional la elección del tercer resto no puede considerarse aleatoria. Se encuentran pruebas adicionales de una preferencia de codones sesgada entre los codones más degenerados, donde puede verse una fuerte selección de tripletes que llevan adenina. Esto contrasta con el patrón para genes de alta expresión, que favorece a los codones que llevan C, o menos comúnmente G, en la tercera posición de codones con degeneración triple o mayor.
El cambio sistemático de codones nativos por codones de genes humanos de alta expresión aumentó espectacularmente la expresión de gp120. Un análisis cuantitativo por ELISA demostró que la expresión del gen sintético era al menos 25 veces mayor en comparación con la proteína gp120 nativa después de la transfección transitoria en células 293 humanas. Los niveles de concentración en el experimento ELISA mostrado fueron bastante bajos. Como se usó un ELISA para la cuantificación que se basa en la unión de gp120 a CD4, sólo se detectó material nativo no desnaturalizado. Esto puede explicar la baja expresión que se observa. La medición de los niveles citoplásmicos de ARNm demostraron que la diferencia en la expresión de proteínas se debe a diferencias de traducción y no a la estabilidad del ARNm.
Los retrovirus en general no muestran una preferencia similar hacia A y T como se encuentra para VIH. Pero si esta familia se dividiera en dos subgrupos, lentivirus y retrovirus no lentivirales, se detectaría una preferencia similar por A y, menos frecuente, por T, en la tercera posición del codón para lentivirus. De esta manera, las pruebas disponibles sugieren que los lentivirus retienen un patrón característico de codones de envuelta que no es debido a una ventaja intrínseca para la transcripción inversa o replicación de estos restos, sino más bien por alguna razón peculiar a la fisiología de esa clase de virus. La diferencia principal entre lentivirus y retrovirus no complejos son genes adicionales reguladores y no esencialmente auxiliares presentes en los lentivirus, como ya se ha mencionado. De esta manera, una explicación sencilla para la restricción de una expresión de la envuelta podría ser que en ella se basa un mecanismo regulador importante de una de estas moléculas adicionales. De hecho, se sabe que una de estas proteínas, rev, probablemente tiene homólogos en todos los lentivirus. Este uso de codones en el ARNm viral se usa para crear una clase de transcritos que es susceptible a la acción estimuladora de rev. Esta hipótesis se demostró usando una estrategia similar a la anterior, pero esta vez el uso de codones cambió a la dirección inversa. El uso de codones de un gen celular de alta expresión se sustituyó con los codones usados con más frecuencia en la envuelta de VIH. Como se asumía, los niveles de expresión fueron considerablemente menores en comparación con la molécula nativa, casi dos órdenes de magnitud cuando se analizaron por inmunofluorescencia de la molécula expresada en la superficie (véase 4.7). Si rev se co-expresaba en trans y el elemento RRE estaba presente en cis, únicamente se encontró una ligera inducción para la molécula de superficie. Sin embargo, si THY-1 se expresaba como una molécula secretada, la reducción por rev era mucho más prominente, confirmando la hipótesis anterior. Esto probablemente puede explicarse por una acumulación de proteína secretada en el sobrenadante, lo cual amplifica considerablemente el efecto de rev. Si rev sólo induce un pequeño aumento para moléculas de superficie en general, la inducción de la envuelta de VIH por rev no puede tener el objetivo de una mayor abundancia en la superficie, sino más bien un mayor nivel de gp160 intracelular. Está muy poco claro en este momento por qué ocurriría esto.
Para ensayar si pequeños elementos subtotales de un gen son suficientes para restringir la expresión y hacer que sea dependiente de rev, se generaron proteínas de fusión rTHY1env:immunoglobulin en las que sólo aproximadamente un tercio del gen total tenía el uso de codones de la envuelta. Los niveles de expresión de esta construcción estaban en un nivel intermedio, indicando que el elemento de secuencia negativo para rTHY-lenv no es dominante en la parte de inmunoglobulina. Esta proteína de fusión no respondía a rev o sólo lo hacía ligeramente, indicando que sólo los genes reprimidos casi completamente pueden responder a rev.
Otro rasgo característico que se encontró en las tablas de frecuencia de codones es una infrarrepresentación sorprendente de tripletes CpG. En un estudio comparativo del uso de codones en E. coli, levadura, drosophila y primates, se demostró que en un alto número de genes de primate analizados, los 8 codones menos usados contenían todos los codones con la secuencia dinucleotídica CpG. También se encontró la ausencia de codones que contenían este motivo dinucleotídico en la secuencia de otros retrovirus. Parece convincente que la razón de la infrarrepresentación de tripletes que llevan CpG tenga algo que ver con la ausencia de silenciamiento génico por metilación de citosinas de CpG. El número esperado de dinucleótidos CpG para VIH en conjunto es aproximadamente un quinto del esperado basándose en la composición de bases. Esto podría indicar que se restaura la posibilidad de una expresión elevada y que el gen efectivamente tiene que tener una alta expresión en algún punto durante la patogénesis viral.
Los resultados presentados aquí indican claramente que la preferencia de codones tiene un efecto severo sobre los niveles de proteínas, y sugiere que el alargamiento traduccional está controlando la expresión de genes de mamífero. Sin embargo, pueden intervenir otros factores. En primer lugar, la abundancia de ARNm no cargados máximamente en células eucariotas indica que la iniciación es limitante de la velocidad para la traducción al menos en algunos casos, ya que de lo contrario todos los transcritos estarían completamente cubiertos por los ribosomas. Además, si el mecanismo fuera la parada de los ribosomas y la posterior degradación de ARNm, es muy probable que la supresión por codones raros no se invirtiera por ningún mecanismo regulador tal como el presentado en este documento. Una posible explicación de la influencia tanto de la iniciación como del alargamiento de la actividad traduccional es que la velocidad de iniciación, o el acceso a los ribosomas, se controla en parte por claves distribuidas a lo largo del ARN, de tal manera que los codones lentivirales predisponen al ARN a acumularse en un grupo de ARN iniciados deficientemente. Sin embargo, esta limitación no necesariamente es cinética; por ejemplo, la elección de codones podría influir sobre la probabilidad de que un producto de la traducción dado, una vez iniciado, se complete de manera apropiada. Con este mecanismo, la abundancia de codones menos preferidos provocaría una probabilidad acumulativa significativa de incapacidad de completar la cadena polipeptídica naciente. El ARN retenido entonces se prestaría a una velocidad de iniciación mejorada por la acción de rev. Como los restos de adenina son abundantes en transcritos que responden a rev, es posible que la metilación de adenina del ARN medie esta supresión de la traducción.
Procedimientos Detallados
En los experimentos descritos anteriormente se usaron los siguientes procedimientos.
Análisis de la Secuencia
Los análisis de la secuencia emplearon el software desarrollado por el University of Wisconsin Computer Group (grupo de informática de la Universidad de Wisconsin.
Construcciones de Plásmidos
Las construcciones de plásmidos emplearon los siguientes métodos. Se digirieron vectores y el ADN de inserción a una concentración de 0,5 µg/10 µl en el tampón de restricción apropiado durante 1 - 4 horas (volumen de reacción total aproximadamente 30 µl). El vector digerido se trató con 10% (v/v) de fosfatasa alcalina de intestino de ternero a una concentración de 1 µg/ml durante 30 min antes de la electroforesis en gel. Los productos de digestión tanto del vector como del inserto (de 5 a 10 µl de cada uno) se procesaron en un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% con tampón TAE. Los cortes de gel que contenían bandas de interés se transfirieron a un tubo de reacción de 1,5 ml, se fundieron a 65ºC y se añadieron directamente a la unión sin retirar la agarosa. Los ligamientos se realizaron típicamente en un volumen total de 25 µl en 1x Tampón Bajo 1x Adiciones de Ligamiento con 200-400 U de ligasa, 1 µl de vector y 4 µl de inserto. Cuando fue necesario, los extremos salientes 5' se rellenaron añadiendo 1/10 del volumen de dNTP 250 µM y 2-5 U de polimerasa de Klenow a los productos de digestión extraídos con fenol
o inactivados por calor e incubando durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente. Cuando fue necesario, los extremos 3' salientes se rellenaron añadiendo 1/10 del volumen de dNTP 2,5 mM y 5-10 U de ADN polimerasa de T4 a los productos de digestión extraídos con fenol o inactivados con calor, seguido de incubación a 37ºC durante 30 min. En estas reacciones se usaron los siguientes tampones: 10x tampón Bajo (Tris HCl 60 mM, pH 7,5, MgCl2 60 mM, NaCl 50 mM, BSA a 4 mg/ml, β-mercaptoetanol 70 mM, NaN3 al 0,02%); 10x tampón Medio (Tris HCl 60 mM, pH 7,5, MgCl2 60 mM, NaCl 50 mM, BSA a 4 mg/ml, β-mercaptoetanol 70 mM, NaN3 al 0,02%); 10x tampón Alto (Tris HCl 60 mM, pH 7,5, MgCl2 60 mM, NaCl 50 mM, BSA a 4 mg/ml, β-mercaptoetanol 70 mM, NaN3 al 0,02%); 10x Adiciones de ligamiento (ATP 1 mM, DTT 20 mM, BSA a 1 mg/ml, espermidina 10 mM); 50x TAE (Tris acetato 2 M, EDTA 50 mM).
Síntesis y purificación de nucleótidos
Se produjeron oligonucleótidos en un sintetizador Milligen 8750 (Millipore). Las columnas se eluyeron con 1 ml de hidróxido amónico al 30% y los oligonucleótidos eluidos se desbloquearon a 55ºC durante un periodo de 6 a 12 horas. Después del desbloqueo, se precipitaron 150 µl de oligonucleótido con 10 veces el volumen de n-butanol insaturado en tubos de reacción de 1,5 ml, seguido de centrifugación a 15.000 rpm en una microcentrífuga. El sedimento se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 50 µl de H2O. La concentración se determinó midiendo la densidad óptica a 260 nm en una dilución de 1:333 (1 DO260 = 30 µg/ml).
Para construir el gen gp120 sintético se usaron los siguientes oligonucleótidos (todas las secuencias mostradas en este texto están en la dirección 5' a 3').
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Para la construcción del gen THY de rata-lenv se usaron los siguientes oligonucleótidos.
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Reacción en Cadena de la Polimerasa
Se usaron oligonucleótidos solapantes cortos de 15 a 25 unidades que hibridaban por los dos extremos para amplificar los oligonucleótidos largos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las condiciones típicas de la PCR fueron: 35 ciclos, temperatura de hibridación 55ºC, tiempo de extensión 0,2 seg. Los productos de la PCR se purificaron en gel, se extrajeron con fenol y se usaron en una PCR posterior para generar fragmentos de mayor tamaño que constaban de dos fragmentos pequeños adyacentes. Estos fragmentos de mayor tamaño se clonaron en un plásmido derivado de CDM7 que contenía una secuencia líder de la molécula de superficie CD5 seguido de un polienlazador Nhe1/Pst1/Mlul/EcoR1/BamH1.
En estas reacciones se usaron las siguientes soluciones: 10x tampón PCR (KCl 500 mM, Tris HCl 100 mM, pH 7,5, MgCl2 8 mM, cada dNTP 2 mM). El tampón final se complementó con DMSO al 10% para aumentar la fidelidad de la Taq polimerasa.
Preparación de ADN a pequeña escala
Las bacterias transformadas se cultivaron en 3 ml de cultivos LB durante más de 6 horas o durante una noche. Se vertieron aproximadamente 1,5 ml de cada cultivo en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron durante 20 segundos para sedimentar las células y se resuspendieron en 200 µl de solución I. Posteriormente, se añadieron 400 µl de solución II y 300 µl de solución III. Los tubos de microcentrífuga se taparon, se mezclaron y se centrifugaron durante > 30 seg. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos limpios y se extrajeron con fenol una vez. El ADN se precipitó rellenando los tubos con isopropanol, mezclando y centrifugando en una microcentrífuga durante > 2 min. Los sedimentos se aclararon en etanol al 70% y se resuspendieron en 50 µl de dH20 que contenía 10 µl de RNAsa A. En estos procedimientos se usaron los siguientes medios y soluciones: medio LB (NaCl al 1,0%, extracto de levadura al 0,5%, triptón al 1,0%); solución I (EDTA 10 mM pH 8,0); solución II (NaOH 0,2 M, SDS al 1,0%); solución III (KOAc 2,5 M, ácido acético glacial 2,5 M); fenol (pH ajustado a 6,0, recubierto con TE); TE (Tris HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0).
Preparación de ADN a gran escala
Se cultivaron cultivos de un litro de bacterias transformadas durante 24 a 26 horas (MC1061p3 transformada con derivados de pCDM) o durante 12 a 16 horas (MC1061 transformada con derivados de pUC) a 37ºC en medio de bacterias M9 (derivados de pCDM) o LB (derivados de pUC). Las bacterias se centrifugaron en frascos de 1 litro usando una centrífuga Beckman J6 a 4.200 rpm durante 20 min. El sedimento se resuspendió en 40 ml de solución I. Posteriormente, se añadieron 80 ml de solución II y 40 ml de solución III y los frascos se agitaron semivigorosamente hasta que se formaron bloques con un tamaño de 2 a 3 mm. El frasco se centrifugó a 4.200 rpm durante 5 min y el sobrenadante se vertió a través de una estopilla en un frasco de 250 ml. Se añadió isopropanol a la parte superior y el frasco se centrifugó a 4.200 rpm durante 10 min. El sedimento se resuspendió en 4,1 ml de solución I y se añadió a 4,5 g de cloruro de cesio, 0,3 ml de bromuro de etidio a 10 mg/ml y 0,1 ml de solución de Triton X100 al 1%. Los tubos se centrifugaron en una centrífuga de alta velocidad Beckman J2 a 10.000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se transfirió a tubos de ultracentrífuga Beckman Quick Seal, que después se cerraron herméticamente y se centrifugaron en una ultracentrífuga Beckman usando un rotor de ángulo fijo NVT90 a 80.000 rpm durante > 2,5 horas. La banda se extrajo por luz visible usando una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 20. Al material extraído se le añadió un volumen igual de dH2O. El ADN se extrajo una vez con n-butanol saturado con cloruro sódico 1 M, seguido de la adición de un volumen igual de acetato amónico 10 M/EDTA 1 mM. El material se vertió en un tubo de resorte de 13 ml que después se rellenó hasta arriba con etanol absoluto, se mezcló y se centrifugó en una centrífuga Beckman J2 a 10.000 rpm durante 10 min. El sedimento se aclaró con etanol al 70% y se resuspendió en 0,5 a 1 ml de H2O. La concentración de ADN se determinó midiendo la densidad óptica a 260 nm en una dilución de 1:200 (1 DO260 = 50 µg/ml).
En estos procedimientos se usaron los siguientes medios y tampones: medio bacteriano M9 (10 g de sales M9, 10 g de casaminoácidos (hidrolizados), 10 ml de adiciones de M9, 7,5 µg/ml de tetraciclina (500 µl de una solución madre a una concentración de 15 mg/ml), 12,5 µg/ml de ampicilina (125 µl de una solución madre a una concentración de 10 mg/ml); adiciones de M9 (CaCl2 10 mM, MgSO4 100 mM, tiamina a 200 µg/ml, glicerol al 70%); medio LB (NaCl al 1,0%, extracto de levadura al 0,5%, triptón al 1,0%); solución I (EDTA 10 mM pH 8,0); solución II (NaOH 0,2 M, SDS al 1,0%); Solución III (KOAc 2,5 M, HOAc 2,5 M)
Secuenciación
Los genes sintéticos se secuenciaron por el método de didesoxinucleótido de Sanger. En resumen, se desnaturalizaron de 20 a 50 µg de ADN plasmídico bicatenario en NaOH 0,5 M durante 5 minutos. Posteriormente, el ADN se precipitó con 1/10 de volumen de acetato sódico (pH 5,2) y 2 volúmenes de etanol y se centrifugó durante 5 min. El sedimento se lavó con etanol al 70% y se resuspendió a una concentración de 1 µg/µl. La reacción de hibridación se realizó con 4 µg de ADN de plantilla y 40 ng de cebador en 1x tampón de hibridación en un volumen final de 10 µl. La reacción se calentó a 65ºC y se enfrió lentamente a 37ºC. En un tubo separado, se añadieron para cada reacción 1 µl de DTT 0,1 M, 2 µl de mezcla de marcaje, 0,75 µl de dH20, 1 µl de [35S] dATP (10 Ci) y 0,25 µl de Sequenase™ (12 U/µl). A cada tubo de cebador-plantilla hibridados se le añadieron cinco µl de esta mezcla y los tubos se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para cada reacción de marcaje, se añadieron 2,5 µl de cada una de las 4 mezclas de terminación en una placa Terasaki y se precalentaron a 37ºC. Al final del periodo de incubación, se añadieron 3,5 µl de reacción de marcaje a cada una de las 4 mezclas de terminación. Después de 5 min, se añadieron 4 µl de solución de parada a cada reacción y la placa Terasaki se incubó a 80ºC durante 10 minutos en una estufa. Las reacciones de secuenciación se realizaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 5%. Se preparó una solución de acrilamida añadiendo 200 ml de 10x tampón TBE y 957 ml de dH20 a 100 g de acrilamida:bisacrilamida (29:1). Se preparó 5% de poliacrilamida 46% de urea y 1x gel TBE combinando 38 ml de solución de acrilamida y 28 g de urea. La polimerización se inició por la adición de 400 µl de peroxodisulfato amónico al 10% y 60 µl de TEMED. Los geles se vertieron usando placas de vidrio silanizadas y peines de dientes de tiburón y se procesaron en 1x tampón TBE a 60 a 100 W durante un periodo de 2 a 4 horas (dependiendo de la región a leer). Los geles se transfirieron a papel secante Whatman, se secaron a 80ºC durante aproximadamente 1 hora y se expusieron a una película de rayos x a temperatura ambiente. Típicamente, el tiempo de exposición fue de 12 horas. En estos procedimientos se usaron las siguientes soluciones: 5x Tampón de hibridación (Tris HCl 200 mM, pH 7,5, MgCl2 100 mM, NaCl 250 mM); Mezcla de Marcaje (7,5 µM de cada dCTP, dGTP y dTTP); Mezclas de terminación (80 µM de cada dNTP, NaCl 50 mM, ddNTP 8 µM (cada uno)); Solución de parada (formamida al 95%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,05% y xilencianol al 0,05%); 5x TBE (Tris borato 0,9 M, EDTA 20 mM); Solución de poliacrilamida (96,7 g de poliacrilamida, 3,3 g de bisacrilamida, 200 ml de 1x TBE, 957 ml de dH2O).
Aislamiento de ARN
Se aisló ARN citoplásmico a partir de células 293T transfectadas con fosfato cálcico 36 horas después de la transfección y a partir de células Hela infectadas con vaccinia 16 horas después de la infección esencialmente como describe Gilman. (Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells. En Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds., Wiley & Sons, New York, 1992). En resumen, las células se lisaron en 400 µl de tampón de lisis, los núcleos se centrifugaron y se añadieron SDS y proteinasa K a 0,2% y 0,2 mg/ml respectivamente. Los extractos citoplásmicos se incubaron a 37ºC durante 20 min, se extrajeron con fenol/cloroformo dos veces y se precipitaron. El ARN se disolvió en 100 µl de tampón I y se incubó a 37ºC durante 20 min. La reacción se detuvo por la adición de 25 µl de tampón de parada y se precipitó de nuevo.
En este procedimiento se usaron las siguientes soluciones: Tampón de lisis (TE que contenía Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, NP40 al 0,5%); Tampón I (tampón TE con MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, 0,5 U/µl de inhibidor de RNAsa placentaria, 0,1 U/µl de DNAsa I sin RNAsa); Tampón de parada (EDTA 50 mM, NaOAc 1,5 M, SDS al 1,0%).
Análisis slot blot
Para el análisis slot blot se disolvieron 10 µg de ARN citoplásmico en 50 µl de dH2O al que se habían añadido 150 µl de 10x SSC/formaldehído al 18%. El ARN solubilizado después se incubó a 65ºC durante 15 min y se aplicó puntualmente sobre un aparato de slot blot. Para la hibridación se usaron sondas marcadas radiactivamente de fragmentos de gp120IIIb y syngp120mn de 1,5 kb. Cada uno de los dos fragmentos se marcó aleatoriamente en una reacción de 50 µl con 10 µl de 5x oligo-tampón de marcaje, 8 µl de BSA a 2,5 mg/ml, 4 l de [32P]-dCTP (20 Ci/µl; 6000 Ci/mmol) y 5 U de fragmento de Klenow. Después de 1 a 3 horas de incubación a 37ºC, se añadieron 100 µl de TE y el [32P]-dCTP no incorporado se eliminó usando una columna de centrifugación G50. La actividad se midió en un contador beta Beckman y para la hibridación se usaron actividades específicas iguales. Las membranas se prehibridaron durante 2 horas y se hibridaron durante 12 a 24 horas a 42ºC con 0,5 x 106 cpm de sonda por ml de fluido de hibridación. La membrana se lavó dos veces (5 min) con tampón de lavado I a temperatura ambiente, durante una hora en tampón de lavado II a 65ºC, y después se expuso a la película de rayos
x. Se obtuvieron resultados similares usando un fragmento Notl/Sfil de 1,1 kb de pCDM7 que contenía la región 3' no traducida. Las hibridaciones de control se realizaron en paralelo con una sonda de beta-actina humana marcada aleatoriamente. La expresión de ARN se cuantificó explorando las membranas de nitrocelulosa hibridadas con un phosphorimager de Magnetic Dynamics.
En este procedimiento se usaron las siguientes soluciones:
5x Oligo-tampón de marcaje (Tris HCl 250 mM, pH 8,0, MgCl2 25 mM, β-mercaptoetanol 5 mM, dATP 2 mM, dGTP 2 mM, dTTP 2 mM, Hepes 1 M pH 6,6, 1 mg/ml de hexanucleótidos [dNTP]6); Solución de hibridación (fosfato sódico _M, NaCl 250 mM, SDS al 7%, EDTA 1 mM, sulfato de dextrano al 5%, formamida al 50%, 100 µg/ml de esperma de salmón desnaturalizado); Tampón de lavado I (2x SSC,
SDS al 0,1%); Tampón de lavado II (0,5x SSC, SDS al 0,1%); 20x SSC (NaCl 3 M, citrato de Na3 0,3 M, pH ajustado a 7,0).
Recombinación con vaccinia
La recombinación con vaccinia usó una modificación del otro método descrito por Romeo y Seed (Romeo y Seed, Cell, 64: 1037, 1991). En resumen, se infectaron células CV1 a una confluencia de 70 a 90% con 1 a 3 µl de una solución madre de vaccinia de tipo silvestre WR (2 x 108 pfu/ml) durante 1 hora en medio de cultivo sin suero de ternero. Después de 24 horas, las células se transfectaron por fosfato cálcico con 25 µg de ADN de plásmido TKG por placa. Después de 24 a 48 horas más, las células se rasparon de la placa, se centrifugaron y se resuspendieron en un volumen de 1 ml. Después de 3 ciclos de congelación/descongelación, se añadió tripsina a 0,05 mg/ml y los lisados se incubaron durante 20 min. Para infectar placas pequeñas (6 cm) de células CV1, que se habían pretratado con ácido micofenólico a 12,5 µg/ml, xantina a 0,25 mg/ml e hipoxantina a 1,36 mg/ml durante 6 horas, se usó una serie de dilución de 10, 1 y 0,1 µl de este lisado. Las células infectadas se cultivaron durante 2 a 3 días y posteriormente se tiñeron con el anticuerpo monoclonal NEA9301 contra gp120 y un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina. Las células se incubaron con NBT a 0,33 mg/ml y BCIP a 0,16 mg/ml en tampón AP y finalmente se recubrieron con agarosa al 1% en PBS. Se recogieron las placas positivas y se resuspendieron en 100 µl de Tris pH 9,0. La purificación de placas se repitió una vez. Para producir soluciones madre de alta titulación, se aumentó lentamente la escala de la infección. Finalmente, se infectó una placa grande de células Hela con la mitad del virus de la vuelta previa. Las células infectadas se separaron en 3 ml de PBS, se lisaron con un homogeneizador Dounce y se limpiaron de los desechos de mayor tamaño por centrifugación. Las soluciones madre de vaccinia recombinantes VPE-8 se proporcionaron amablemente por el depósito de SIDA, Rockville, MD, y expresan IIIB gp120 de VIH-1 bajo el promotor mixto temprano/tardío 7.5 (Earl et al., J. Virol., 65:31, 1991). En todos los experimentos con vaccinia recombinante, las células se infectaron a una multiplicidad de infección de al menos
10.
En este procedimiento se usó la siguiente solución: tampón AP (Tris HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM)
Cultivo celular
Las líneas celulares de carcinoma de riñón de mono CV1 y Cos7, la línea celular de carcinoma de riñón humano 293T y la línea celular de carcinoma de cuello de útero humano Hela se obtuvieron a partir de la American Tissue Typing Collection y se mantuvieron en IMDM suplementado. Se mantuvieron en placas de cultivo de tejido de 10 cm y típicamente se dividieron de 1:5 a 1:20 cada 3 a 4 días. En este procedimiento se usó el siguiente medio:
IMDM suplementado (Medio de Dulbecco modificado por Iscove al 90%, suero de ternero al 10%, complementado con hierro, inactivado con calor durante 30 min a 56ºC, 0,3 mg/ml de L-glutamina, 25 µg/ml de gentamicina, β-mercaptoetanol 0,5 mM (pH ajustado con NaOH 5 M, 0,5 ml)).
Transfección
La transfección con fosfato cálcico de células 293T se realizó añadiendo lentamente con agitación vorticial 10 µg de ADN plasmídico en 250 µl de CaCl2 0,25 M al mismo volumen de 2x tampón HEBS mientras se agitaba vorticialmente. Después de la incubación durante 10 a 30 min a temperatura ambiente, el precipitado de ADN se añadió a pequeñas placas de células confluentes de 50 a 70%. En experimentos de co-transfección con rev, las células se transfectaron con 10 µg de gp120IIIb, gp120IIIbrre, syngp120mnrre o rTHY-lenveglrre y 10 µg de ADN del plásmido pCMVrev o CDM7.
En este procedimiento se usaron las siguientes soluciones: 2x tampón HEBS (NaCl 280 mM, KCl 10 mM, filtrado estéril 1,5 mM); CaCl2 0,25 mM (esterilizado en autoclave).
Immunoprecipitación
Después de 48 a 60 horas, el medio se cambió y las células se incubaron durante 12 horas más en medio sin Cys/Met que contenía 200 µCi de marcador trans 35S. Los sobrenadantes se recogieron y se centrifugaron durante 15 minutos a 3000 rpm para retirar los residuos. Después de la adición de los inhibidores de proteasa leupeptina, aprotinina y PMSF a 2,5 µg/ml, 50 µg/ml y 100 µg/ml respectivamente, 1 ml de sobrenadante se incubó con 10 µl de proteína A sepharose empaquetada sola (rTHY-lenveglrre) o con proteína A sepharose y 3 µg de una proteína de fusión CD4/inmunoglobulina purificada (proporcionada amablemente por Behring) (todas construcciones de gp120) a 4ºC durante 12 horas en un rotador. Posteriormente, las perlas de proteína A se lavaron 5 veces durante 5 a 15 minutos cada vez. Después de añadir el lavado final que contenía 10 µl de tampón de carga, las muestras se hirvieron durante 3 min y se aplicaron en geles de SDS poliacrilamida al 7% (todas construcciones de gp120) o al 10% (rTHY-lenveglrre) (tampón TRIS pH 8,8 en la resolución, tampón TRIS pH 6,8 en el gel adherente, tampón de proceso TRIS-glicina, Maniatis et al. 1989). Los geles se fijaron en ácido acético al 10% y metanol al 10%, se incubaron con Amplify durante 20 min, se secaron y se expusieron durante 12 horas.
En este procedimiento se usaron los siguientes tampones y soluciones: Tampón de lavado (Tris 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, NP-40 al 1%); 5x Tampón de proceso (Tris 125 mM, Glicina 1,25 M, SDS al 0,5%); Tampón de carga (glicerol al 10%, SDS al 4%, β-mercaptoetanol al 4%, azul de bromofenol al 0,02%).
Inmunofluorescencia
Se transfectaron células 293T por co-precipitación con fosfato cálcico y se analizaron con respecto a la expresión de THY-1 en la superficie después de 3 días. Después de la separación con EDTA 1 mM/PBS, las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal OX-7 en una dilución 1:250 a 4ºC durante 20 min, se lavaron con PBS y posteriormente se incubaron con una dilución 1:500 de un antisuero de cabra anti-inmunoglobulina de ratón conjugado con FITC. Las células se lavaron de nuevo, se resuspendieron en 0,5 ml de una solución de fijación y se analizaron en un citofluorómetro EPICS XL (Coulter).
En este procedimiento se usaron las siguientes soluciones:
PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 4,3 mM, KH2PO4 1,4 mM, pH ajustado a 7,4); Solución de fijación (formaldehído al 2% en PBS).
ELISA
La concentración de gp120 en los sobrenadantes de cultivo se determinó usando placas ELISA recubiertas con CD4 y antisuero de cabra anti-gp120 en la fase soluble. Los sobrenadantes de las células 293T transfectadas por fosfato cálcico se recogieron después de 4 días, se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min para retirar los residuos y se incubaron durante 12 horas a 4ºC en las placas. Después de 6 lavados con PBS, se añadieron 100 µl de antisuero de cabra anti-gp120 diluido 1:200 durante 2 horas. las placas se lavaron de nuevo y se incubaron durante 2 horas con un antisuero de conejo anti-IgG de cabra conjugado con peroxidasa 1:1000. Posteriormente, las placas se lavaron y se incubaron durante 30 minutos con 100 µl de solución de sustrato que contenía 2 mg/ml de ofenilendiamina en tampón citrato sódico. La reacción finalmente se detuvo con 100 µl de ácido sulfúrico 4 M. Las placas se leyeron a 490 nm con un lector de microplacas Coulter. Como control se usó gp12oIIIb recombinante purificado. En este procedimiento se usaron los siguientes tampones y soluciones: Tampón de lavado (NP40 al 0,1% en PBS); Solución de sustrato (2 mg/ml de o-fenilendiamina en tampón citrato sódico).
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
(i)
SOLICITANTE: SEED, BRIAN
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SOBREEXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE MAMÍFERO Y VIRALES
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 37
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
(A)
DESTINATARIO: Fish & Richardson
(B)
CALLE: 225 Franklin Street
(C)
CIUDAD: Boston
(D)
ESTADO: Massachusetts
(E)
PAÍS: ESTADOS UNIDOS
(F)
CÓDIGO POSTAL: 02110-2804
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30B
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/308.286
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-SEP-1994
(viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
(A)
NOMBRE: CLARK, PAUL T
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 30.162
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 00786/226001
(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
(A)
TELÉFONO: (617) 542-5070
(B)
TELEFAX: (617) 542-8906
(C)
TÉLEX: 200154
5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1: CGCGGGCTAG CCACCGAGAA GCTG 24
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 196 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 34 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico 25 (C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3: CCACCATGTT GTTCTTCCAC ATGTTGAAGT TCTC 34
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4: 30 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4: GACCGAGAAC TTCAACATGT GGAAGAACAA CAT 33
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 192 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases 15 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
imagen2
imagen1
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6: GTTGAAGCTG CAGTTCTTCA TCTCGCCGCC CTT 33
20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla 25 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7: GAAGAACTGC AGCTTCAACA TCACCACCAG C 31
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30 (A) LONGITUD: 195 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
imagen1
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
10 GAACTTCTTG TCGGCGGCGA AGCCGGCGGG 30
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 47 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico 15 (C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10: GCGCCCCCGC CGGCTTCGCC ATCCTGAAGT GCAACGACAA GAAGTTC 47
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 198 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12: AGTTGGGACG CGTGCAGTTG ATCTGCACGC TCTC 34
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13: GAGAGCGTGC AGATCAACTG CACGCGTCCC 30
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 120 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15: GTCGTTCCAC TTGGCTCTAG AGATGTTGCA 30
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16: GCAACATCTC TAGAGCCAAG TGGAACGAC 29
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 131 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18: GCAGTAGAAG AATTCGCCGC CGCAGTTGA 29
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19: TCAACTCCGG CGGCGAATTC TTCTACTGC 29
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 195 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
imagen1
imagen1
imagen1
imagen1
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21: GCAGACCGGT GATGTTGCTG CTGCACCGGA TCTGGCCCTC 40
10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22: CGAGGGCCAG ATCCGGTGCA GCAGCAACAT CACCGGTCTG 40
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 242 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24: CGCGGGCGGC CGCTTTAGCG CTTCTCGCGC TGCACCAC 38
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25: CGCGGGGGAT CCAAGCTTAC CATGATTCCA GTAATAAGT 39
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 165 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27: CGCGGGGAAT TCACGCGTTA ATGAAAATTC ATGTTG 36
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28: CGCGGATCCA CGCGTGAAAA AAAAAAACAT 30
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 149 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30: CGCGAATTCG AGCTCACACA TATAATCTCC 30
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31: CGCGGATCCG AGCTCAGAGT AAGTGGACAA 30
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:32:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 170 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:33:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 36 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico 5 (C) CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33: CGCGAATTCG CGGCCGCTTC ATAAACTTAT AAAATC 36
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:34: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 1632 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:35:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 2481 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:36:
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 486 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
(2)
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:37: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 485 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: sencilla
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
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Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para preparar un gen sintético que codifica una proteína que se expresa normalmente en células de mamífero,
    donde al menos 50% de los codones no preferidos y menos preferidos presentes en el gen natural que codifica dicha proteína se han reemplazado por codones preferidos que codifican los mismos aminoácidos,
    5 seleccionándose dichos codones preferidos entre el grupo consistente en gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac y gtg, seleccionándose dichos codones menos preferidos entre el grupo consistente en ggg, att, ctc, tcc y gtc, y siendo todos dichos codones no preferidos codones distintos de dichos codones preferidos y dichos codones menos preferidos,
    donde el gen sintético puede expresar dicha proteína de mamífero a un nivel que es al menos 110% del 10 expresado por el gen natural en un cultivo celular de mamífero in vitro en condiciones idénticas.
  2. 2.
    Un gen sintético que se puede obtener por un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína es una proteína de VIH.
  3. 3.
    Un gen sintético de la reivindicación 2, en el que dicha proteína se selecciona entre el grupo consistente en gag, pol y env.
  4. 4.
    Un gen sintético de la reivindicación 2, en el que dicha proteína es gp120 o gp160.
ES95931798T 1994-09-19 1995-09-08 Sobreexpresión de proteínas de mamífero y virales. Expired - Lifetime ES2270430T5 (es)

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