ES2267825T3 - Metodo y sistema para analizar celulas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para el examen, en especial la identificación, de células que se presentan preferiblemente en formaciones celulares densas o cerradas, en especial de células aisladas en tejidos, En la que una preparación tisular plana, en particular un corte congelado o en parafina, frotis celular, citospin o similar, se somete a uno o a un número de diferentes colorante(s) de identificación del núcleo, en particular completos, preferiblemente planos, en particular todos los núcleos, en el que por lo menos uno de las tinciones de identificación de diferentes tinciones de estructuras diana de objetos celulares, en especial del citoplasma y/o membrana celular y/o núcleo y/u otros parámetros citológicos, se hacen de la preparación tisular, en la que se graban imágenes digitales, en particular imágenes en color o en gama de grises, de la preparación tisular coloreada, mediante un equipo de grabación de imagen electrónica, por ejemplo microscopio de barrido láser, cámara CCD, cámara de vídeo odigital, escáner fotográfico o similar, y en el que se representa al menos una imagen de una subzona de la preparación tisular en por lo menos una coloración y/o en una combinación de coloraciones seleccionables, caracterizado por el hecho, que se limita por lo menos a un parámetro, por ejemplo tonalidad de color, superficie, forma, contorno, intensidad de la tinción, patrón de coloración o similar, que hace reconocibles núcleos en la imagen de esa subzona mediante tinción de identificación y por lo menos un parámetro, por ejemplo tonalidad de color, superficie, forma, contorno, intensidad de la tinción, patrón de coloración o similar, que hace reconocibles en la imagen de una subzona mediante tinción de estructuras diana objetos celulares de un intervalo de valor dado o bien seleccionable, que bajo aplicación de algoritmos de proceso de imagen a la imagen de esa subzona de núcleos y objetos celulares, sus parámetros se corresponden al o a los respectivos intervalos de parámetros determinados y eventualmente representados, que eventualmente se representan determinados parámetros bajo aplicación de algoritmos de proceso de imagen a los núcleos y objetos celulares en la imagen de la subzona en forma de histogramas y gráficos de dispersión en mutua dependencia y eventualmente -dependiendo de los resultados de medición- se especifican nuevos intervalos de parámetros, que para la investigación de células individuales existentes el contenido de la imagen determinado para los núcleos en por lo menos una, preferiblemente en todas, las imágenes, se correlaciona con el contenido de la imagen determinado para los objetos celulares de estructuras diana coloreadas, por lo menos en una, preferiblemente en todas, las imágenes, en donde eventualmente teniendo en cuenta por lo menos en una por el citoplasma y/o la tinción de la o las estructuras diana consideradas de las membranas celulares en la extensión de la superficie determinada de los objetos celulares, partiendo de los núcleos identificados se inicia con un algoritmo informático prefijado un crecimiento celular o ampliación celular para la reconstrucción de células individuales, preferiblemente teniendo en cuenta los valores máximos y mínimos de los parámetros celulares, sobre todo para el tamaño celular o diámetro celular alrededor de los núcleos celulares de una superficie celular, y más concretamente considerando el criterio de que las superficies celulares vecinas, igualmente crecientes, no se mezclan entre sí y se descarta un contacto de las superficies celulares o paredes celulares o membrana celular, y que se puede determinar el número, la superficie y/o intensidad de la tinción en referencia a al menos una de las coloraciones efectuadas y/u otro parámetro de las células individuales reconstruidas y/o las células individuales, dependiendo eventualmente de su intensidad de la tinción y/u otro parámetro seleccionado, pueden ser clasificadas en poblaciones y a lo sumo ser representadas y posteriormente examinadas oanalizadas.

Description

Método y sistema para analizar células.

La presente invención se refiere a un procedimiento según el concepto general de la reivindicación de patente 1 así como a una configuración según el concepto general de la reivindicación 12.

La asignación de células en tejidos a un tipo celular exactamente definido (por ejemplo célula epitelial, miocito, fibroblasto, leucocito, célula de carcinoma, célula de linfoma) y la caracterización de sus propiedades funcionales se realizan cuando las características morfológicas no bastan, mediante estudios inmunohistológicos. En ese caso se emplean anticuerpos altamente específicos que son dirigidos contra antígenos característicos específicos del tipo celular. Por la coloración se pueden trazar las correspondientes conclusiones.

Hasta ahora se carece de un sistema de análisis automatizado y objetivo, el cual por ejemplo determina cuantas células existen en una preparación, cuantas de esas células reaccionan con el o los respectivos anticuerpos (en el caso de colorantes múltiples) y cómo de fuerte es la reacción o reacciones. El estado de la técnica es que o el investigador cuenta ópticamente un número de células representativo y calcula su intensidad de tinción o bien utiliza un software de tratamiento de imagen tradicional para medir exactamente la intensidad de tinción, al tiempo que está obligado no obstante, a definir manualmente el área de la célula que se va a medir. Si el investigador quiere realizar un estudio cuantitativo en 100 células y 100 núcleos, debe rodear 100 células y 100 núcleos uno por uno y puede entonces llevar a cabo su medición. Estas mediciones no dan no obstante salvo en los casos más infrecuentes informaciones detalladas sobre reactividades dobles, triples, etc. y son reunidas con unos enormes gastos de tiempo, al tiempo que el ajuste con controles negativos y positivos, que son importantes para la reproducibilidad, hace crecer la cantidad de trabajo exponencialmente.

De esta circunstancia es principal responsable, que los resultados de estudios inmunohistológicos todavía no son válidos como real y científicamente estandarizables y comparables y siempre están afectados por el inconveniente de la subjetividad, mientras que en la esencialmente más joven técnica de la citometría de flujo (un sistema analítico comparable sólo para células individuales en suspensión) este defecto se ha superado ya hace tiempo. Mientras que actualmente en estudios flujocitométricos son rutinarias las tinciones cuádruples que se pueden emplear para la distribución porcentual e intensidad de tinción exactas de una subpoblación determinada cualquiera, los métodos de evaluación de la inmunohistología todavía permanecen en el mismo estado de la técnica desde hace veinte años y se utilizan en la inmensa mayoría medios como células positivas de una cruz, de dos cruces, para expresar visualmente determinados resultados.

El objetivo de la invención es lograr una detección automática de células aisladas y sus partes constituyentes como núcleos, citoplasma y membrana celular en formaciones celulares densas o cerradas y realizar medidas exactas de las respectivas partes constituyentes, sin perder por ello las referencias espaciales con las células ni tampoco su localización en el tejido. Por lo tanto la inmunohistología debe situarse al nivel de la citometría de flujo, en lo que se refiere al ajuste de datos con controles negativos y positivos, el desglose de las poblaciones en subpoblaciones reactivas simples o múltiples o también la caracterización cuantitativa de las intensidades de tinción, la inmunohistología no obstante supera por mucho a la citometría de flujo en la multiplicidad de información, que la permite una asignación espacial y más concretamente, no sólo limitada a la localización de la respectiva célula en la formación celular sino también en el interior de la célula (membrana citoplasmática o nuclear).

Conforme a la invención hay un procedimiento de la clase citada al principio caracterizado por la característica de rasgos distintivos de la reivindicación 1. Una configuración de la clase citada al principio está caracterizada conforme a la invención por la característica de la reivindicación 12.

Se debe realizar por lo menos una coloración nuclear, en la que se puede aplicar cualquier tinción corriente del núcleo, y al menos una coloración de una estructura celular, preferiblemente con un anticuerpo o antisuero. No es importante a qué estructuras celulares se unen estos anticuerpos o una sonda génica o similar, en tanto que, como es normalmente también el caso, se distinga el color del producto de reacción de la tinción nuclear. No se fija ninguna limitación hacia arriba respecto al número de coloraciones de núcleos y de objetos celulares, hasta que ya no sea posible físicamente una clara distinción de las diferentes coloraciones.

También es posible en principio, colorear núcleos como estructura celular. En este caso están presentes por tanto, núcleos que están coloreados como identificación por lo menos una vez y coloreados como estructura diana por lo menos una vez. Puesto que las imágenes tomadas se analizan separadamente según las coloraciones, se pueden también trazar en ambas las correspondientes conclusiones para las coloraciones efectuadas a los núcleos.

LA SU 652 580 A concierne a la detección de estructuras en micro secciones. Esta referencia no tiene nada que ver con la detección automatizada de células aisladas en el tejido, el análisis de correactividades, su interpretación estadística y la elección e interconexión de parámetros de los gráficos interactivos. En especial, en el año 1979 no había todavía ninguna interfaz gráfica de usuario para ordenador.

En la JP 6138119 A se describe una configuración para recuento automático y para el análisis de células. Se trata de un procedimiento para la detección y medición de células aisladas. Tales sistemas conciernen a los análisis de células individuales sobre portaobjetos. En ese caso se debe tomar el término "célula- individual" literalmente: Las células se sitúan individualmente (aisladas) sobre portaobjetos y están al contrario que en la presente invención (espacial) claramente delimitadas unas de otras (separadas), Además se trata de analizar células normalmente sobre células del mismo tipo (en JP 6138119 A sobre mielocitos y
(peripheral blood cells) células sanguíneas, células con morfología unitaria respectivamente).

Conforme a la invención se analizan células unidas en tejidos, son reconocidas y medidas células de cualquier tipo y de cualquier- también dentro de un tipo celular VARIABLE - morfología. Los sistemas que pueden analizar células individuales aisladas, fracasan en el tejido. Los algoritmos que pueden detectar células individuales aisladas fallan, si esas células individuales se disponen apretadamente unas con otras (como es usual en un tejido).

WO 99/04244 A1 se refiere a un proceso para el examen de muestras citológicas, en las que se reconocen células atípicas debido a diferentes parámetros, que quedan dentro o fuera de intervalos de valores fijados. En este procedimiento se representan objetos celulares, pero ante todo núcleos, se miden diferentes parámetros y se analizan con respecto a su vinculación a determinados intervalos de valores.

El procedimiento según WO 99/04244 A1 prevé, que bajo inclusión de datos en abundancia (historias clínicas, anamnesia, exámenes preliminares y - sólo un factor - tratamiento analítico de imágenes de muestras actuales) se realiza un cálculo de probabilidades, que proporciona al patólogo información sobre si un frotis vaginal "probablemente contiene células degeneradas", es "sospechoso" o está probablemente "dentro de valores límite normales". El procedimiento analítico conforme a la invención no afecta a tales conclusiones, sino que describe visto en resumen un instrumento de medición, con el que los investigadores básicos, como patólogos, pueden encontrar conclusiones detalladas sobre el estado de las células individuales en el tejido. En especial, por comparación de tejidos normales y degenerados así como en referencia a los valores de medición se pueden realizar clasificaciones muy exactas con controles positivos y negativos.

Con el procedimiento descrito en la WO 99/04244 A1 se examinan ante todo frotis vaginales (s.g. PAP-smears), una forma de muestras además, con la que las células que se van a medir están presentes por otro lado no en forma de tejido sino más o menos aisladas (realización comparada en referencia a JP 6138119). Si bien se menciona en la WO 99/04244 Al al principio, que aquel procedimiento también es apropiado para el examen de muestras tisulares, no obstante en el transcurso posterior de la descripción de patente no se hace ninguna otra referencia. Por lo tanto es plausible que se trate de una caracterización independiente de la célula o estadística de parámetros celulares en el tejido. Muy probablemente se hace referencia a ello sobre todo por la problemática surgida de la distinción óptica de células individuales mediante una técnica monocromática, no sólo en tejido sino incluso en frotis. Si también con aquel procedimiento se mide algo realmente en el tejido, son en el mejor de los casos estructuras aisladas (estadísticamente o específicamente distribuidas), pero no se identifican células individuales en su totalidad. Si bien se lleva a cabo el que se analicen algunas estructuras en algunas imágenes; la identificación de células individuales en el tejido es fundamentalmente distinta, tanto en lo que concierne a la importancia práctica como - y sobre todo - a la metodología necesaria y a los pasos de procedimiento. Únicamente se analizan tinciones sencillas, no obstante ninguna combinación multicromática. Eso quiere decir que sólo se puede examinar una estructura celular, si bien donde esa estructura representa a la célula, pero que al fin y al cabo no es la célula. Si se identifica un núcleo, entonces la célula individual a la que pertenece ese núcleo se identifica sólo en primera aproximación. La posición exacta del cuerpo celular, que es imprescindible para mediciones citológicas y caracterización diagnóstica de parámetros relevantes, no es tenida en cuenta en absoluto en cada observación/es cada procedimiento analítico.

Un adecuado análisis citopatológico establece una diferenciación en membrana celular, citoplasma y núcleo. Una diferenciación tal en compartimentos celulares aislados sobre la base de células individuales identificadas exige por fuerza el empleo de una técnica multicromática para representación de componentes para el análisis uno por uno. Estos requisitos básicos del diagnóstico moderno de células aisladas - diferenciación exigida en membrana celular, citoplasma y núcleo - tampoco puede satisfacerlos por completo la WO 99/04244 A1 basada en una técnica monocromática.

Esta propiedad básica del procedimiento analítico conforme a la invención - diferenciación en membrana celular, citoplasma y núcleo- distingue el presente registro de patente muy esencialmente de la WO 99/04244 A1. Se indica en este escrito expresamente, que aquel procedimiento no se limita al análisis de núcleos, sino que se puede aplicar a cualquier parámetro celular. Si bien esto no se describe en ningún sitio en la mencionada inscripción de patente, tampoco cambia no obstante nada en que con una técnica monocromática la diferenciación citopatológica esencial en membrana celular, citoplasma y núcleo no es realizable.

WO 99/08091 A1 muestra un sistema analítico automatizado para la identificación de células malignas. Para obtener datos sobre la malignidad de células, se utilizan sobre todo informaciones del núcleo. Además se pueden calcular con algoritmos adecuados los bordes de las células y las superficies de las células. De modo similar a como en la WO 99/04244 A1 se trata en la WO 99/08091 A1 de un procedimiento para el análisis citométrico de núcleos (no células en el sentido morfológico) de células no situadas en el tejido. Concretamente, es un buen procedimiento para la medición de núcleos, pero nada más. Por el contrario, el procedimiento conforme a la invención no se limita a un procedimiento de tinción (tinción nuclear), sino que es aplicable a cualquier procedimiento de la técnica de fluorescencia y combinaciones de colorantes. Por supuesto solamente los bordes y superficies de los núcleos son reconocidos o. calculados y no precisamente los de las células completas. Existe una dificultad precisa que se resuelve conforme a la invención, concretamente, que se posibilita la detección de células completas (núcleo, membrana, citoplasma), además de células en el tejido cerrado. Sin embargo esta funcionalidad, no es ni siquiera reconocible en principio en la WO 99/08091 A1.

Como coloraciones o bien objetos celulares coloreables se emplean sobre todo las coloraciones o bien objetos celulares en cuestión, tal como se les menciona en la reivindicación 4.

Conforme a la invención se limita para una primera identificación de las células a examen por lo menos un parámetro de los núcleos reconocibles sobre un determinado intervalo de valores. Ese intervalo de valores debe representar, con la mayor probabilidad posible, un intervalo de valores con el que los núcleos teñidos puedan ser efectivamente registrados. Los objetos, que por ejemplo son pequeños y no caben en el intervalo de valores dado para el parámetro "tamaño", deben eliminarse, pues en el caso de tales objetos no se trata de núcleos. Los objetos demasiado grandes también son eliminados. El número de parámetros para aplicar el filtrado de objetos considerados como núcleos no está limitado. Para el filtrado de los núcleos o definición de los intervalos de parámetros se pueden utilizar también las dependencias de parámetros aislados unos de otros o bien la confrontación de parámetros en forma de gráficos de dispersión o histogramas.

La restricción de los valores de los parámetros aislados también puede efectuarse en dependencia de los parámetros de las células individuales reconstruidas; en especial pueden ser así establecidos y perfeccionados los intervalos de parámetros en dependencia de los resultados conseguidos del examen. Se procede preferiblemente en ese caso, como se indica en las reivindicaciones 3, 5 y/o 7.

Los efectos de las medidas limitadas, que se aplican preferiblemente mediante localización de las poblaciones deseadas en gráficos de dispersión, conducen en forma de un procedimiento de retroalimentación a una estrategia de identificación de objetos mejorada, adaptada a las propiedades del núcleo y pueden asociarse con una alteración de coloración de la población localizada en la imagen original, para poder controlar las consecuencias de estas operaciones.

Cuando el proceso de identificación de la subzona examinada de la preparación tisular termina, es posible analizar automáticamente con los parámetros determinados todas las demás imágenes de la preparación tisular u otras preparaciones tisulares del mismo órgano o de uno igual.

Para la interpretación es necesaria una identificación del cuerpo celular (citoplasma) y del contorno celular (membrana celular). Por lo tanto es necesaria por lo menos una tinción de estructuras diana, que tiña el citoplasma y/o la membrana celular. Las propiedades características para esta coloración pueden determinarse automáticamente mediante un software puesto a disposición como herramienta de medida, en que el usuario mediante el marcaje de una célula coloreada, que es elegida de la imagen representada en la escena representativa, predetermina el área en la que debe efectuarse la medición de este parámetro. La herramienta de medida puede determinar automáticamente por ejemplo la intensidad de tinción, la tonalidad de color, el tamaño y/o forma de estas células. Se puede determinar la limitación o la diferencia para células no coloreadas, cuando una célula no coloreada se marca y mide con la herramienta de medida. Esta operación puede realizarse para todos los canales de color disponibles. Así puede fijarse la extensión de la superficie de una célula de un modo sencillo. En el transcurso de una correlación de la (o las) imágenes coloreadas de identificación y de la (o de las) imágenes de estructuras diana coloreadas se consideran todos los objetos con propiedades comparables.

Se procede preferiblemente según las características de la reivindicación 8, en donde mediante una tinción citoplasmática de estructuras diana, partiendo de los núcleos ya identificados se inicia un proceso de crecimiento que continua, hasta que se alcanza un punto en la imagen que no corresponde a la tonalidad de color elegida, o se excede el límite de tolerancia para el tamaño y forma (diámetro) o bien se alcanza un objeto perteneciente al núcleo vecino. El proceso de crecimiento, preferiblemente, no se interrumpe por el alcance de un punto de la imagen no válido, sino que sólo el punto de la imagen no válido no queda incluido en el objeto binario creciente. En el caso de una tinción de membrana, el crecimiento de tamaño partiendo de los núcleos continúa hasta que se alcanza una tonalidad de color del área correspondiente, donde este proceso continúa mientras dentro del área coloreada, hasta que se alcanza el máximo de intensidad o un objeto vecino o bien el límite de tolerancia para el tamaño.

En el caso de colorantes múltiples, que comprenden las partes membranosas y/o citoplasmáticas de la célula, pueden llevarse a cabo simultáneamente ambos procesos de crecimiento; también pueden aproximarse varias tonalidades de color juntas para la reconstrucción celular.

Las células identificadas representadas o tomadas con este procedimiento en la imagen se analizan respecto a sus parámetros, preferiblemente intensidad de la tinción, tamaño, forma y los resultados, referidos a todos los núcleos de esa imagen, representados o emitidos en forma de gráficos de dispersión. Preferiblemente, se aplica o representa el tamaño frente a la intensidad de la tinción, más concretamente para cada canal de color por separado. En colorantes múltiples los objetos se ordenan oportunamente por los diferentes canales de color según la correspondiente intensidad de la tinción, confrontado. Adicionalmente es posible realzar el color de los objetos o células identificadas en la imagen original.

Las condiciones y dependencias representadas mediante los gráficos de dispersión se modifican cuando los intervalos de parámetros cambian o se definen de nuevo.

Las imágenes de todas las subzonas de la preparación tisular son analizadas de la manera arriba mencionada y los resultados o parámetros determinados de las células individuales son emitidos en forma de gráficos de dispersión, que confrontan preferiblemente las intensidades de tinción entre sí. La interpretación para los objetos celulares núcleo, citoplasma y membrana celular puede realizarse uno por uno, pero también en cualquier combinación. La interpretación final se realiza preferiblemente con ayuda de gráficos de dispersión de intensidades, en los que se pueden distinguir gráficamente poblaciones aisladas y analizarlas por separado. La interpretación se realiza ante todo con respecto al número de los objetos analizados, la distribución porcentual de los correspondientes objetos en los diferentes canales de color, la intensidad de la tinción, el tamaño y la forma, en donde se pueden realizar restricciones poblacionales en el gráfico de dispersión.

Con la invención es posible detectar, células individuales, incluso en formaciones celulares cerradas, automatizadamente con alta exactitud.

La invención se explica en detalle por ejemplo mediante los dibujos siguientes.

La Fig. 1 muestra la especificación de parámetros de células o la localización de los intervalos de parámetros admisibles mediante intuitivas herramientas de software de marcaje. La Fig. 2 muestra ejemplos de gráficos de dispersión e histogramas. La Fig. 3 muestra un ejemplo para la evaluación de datos y la Fig. 4 muestra un ejemplo conforme a la invención de una configuración.

En la Fig. 1 se representa como ejemplo una sección tisular de un riñón. Los núcleos fueron teñidos (tinción de identificación), por ejemplo azul y el citoplasma (tinción de estructuras diana). Tras la coloración de preparaciones tisulares se definieron subzonas y se escanearon por ejemplo con ayuda de un micromanipulador Eppendorf. Con un microscopio de barrido láser se realizan, por ejemplo, dos barridos en el plano Z, uno grueso y uno fino, a lo largo de una línea horizontal en la mitad de la imagen, donde se puede ajustar el foco a la zona de mayor claridad. El tiempo de barrido asciende por ejemplo a cuatro segundos por campo de visión, donde cada subzona se escanea sólo una vez con un láser de argón de 488 nm. Es posible, además, realizar barridos en sucesión. Para obtener diferentes coloraciones se podría por ejemplo realizar un primer barrido con láser He/Ne de 543 nm, para poder medir la fluorocromo cianina 5 (Cy5) o Cy3, seguido de un barrido con un láser de argón de 488 nm, para poder registrar el fluorocromo Cy2, fluoresceina-isotiocianato (FITC) o proteína clorofila peridinina (PerCP). El ajuste de la sensibilidad de los detectores se debe llevar a cabo una vez con los controles negativos y positivos o ajuste del intervalo de parámetros. El almacenamiento sistemático de los datos de imagen de cada barrido individual, consistente en hasta ocho canales de color, se realiza automáticamente.

Para el ajuste del sistema de medición hay disponibles herramientas de software para el marcaje intuitivo de los intervalos de validez de los parámetros de medición individuales y también de determinadas zonas de imagen (Fig. 1). Estos parámetros de medición incluyen por ejemplo tamaño, contorno, forma, intensidad de tinción, y patrón de coloración del objeto representado. Así, se pueden definir estos valores límite numérica o gráficamente; es preferible una definición intuitiva, es decir el usuario preselecciona en el sistema tras la observación de la imagen representada uno o varios objetos de medición representativos, también células individuales o compartimentos celulares, que son reconocibles en la imagen representada y el sistema extrae a partir de ello independientemente los datos numéricos para los intervalos de validez de cada parámetro deseado. Por tanto el sistema está en condiciones de reconocer todas las estructuras en las imágenes que se corresponden con objetos representativamente definidos dentro de los límites de tolerancia prefijados.

Mediante el marcaje de dos núcleos, como se representa en la Fig. 1 arriba, se especifica el parámetro intensidad de la tinción respecto a su valor mínimo y su valor máximo. Ambos valores representan los límites de intervalo para este parámetro y en posteriores procesos de evaluación son reconocidos o admisibles sólo los objetos tales como los núcleos, cuya intensidad de la tinción cae dentro de esta zona.

Para la definición del intervalo de parámetros del tamaño celular se recurre a una coloración, que característicamente es para la célula entera, y también preferiblemente una tinción de membrana o tinción de citoplasma. Los parámetros determinados en ese caso proporcionan el intervalo de parámetros para el tamaño celular (Fig. 1 derecha abajo).

Las imágenes en las que se definieron los núcleos respecto a su intensidad de la tinción con los correspondientes intervalos de parámetros, y las imágenes en las que se definió el tamaño celular con los correspondientes intervalos de parámetros, están correlacionadas, donde los núcleos y las células definidas por el tamaño se asignan sobre todo de acuerdo a su localización. Una ordenación de esta clase puede efectuarse también de tal manera que en una gama de diferentes tinciones nucleares se establece la correspondencia respectivamente de una de entre una gama de diferentes tinciones celulares y viceversa, pues mediante correlación de una gama de diferentes coloraciones y los correspondientes procesos de evaluación se puede realizar con precisión la definición de núcleos y tamaños celulares o bien células, por lo que la exactitud aumenta.

Es posible caracterizar en la imagen representada de una subzona de una preparación tisular los núcleos y/o los objetos celulares que se corresponden con los intervalos de parámetros seleccionados o prefijados. Para estos objetos caracterizados también se pueden determinar parámetros adicionales con los que medir dichos objetos. La confrontación de determinados parámetros en gráficos de dispersión o Histogramas (Fig. 2) proporciona ya las primeras conclusiones sobre la población celular existente o puede recurrirse además al intervalo de parámetros utilizado anteriormente para el aumento de la exactitud del trazo fijado de nuevo o con más precisión.

Para la reconstrucción celular o para la investigación de las células individuales se induce un crecimiento celular, partiendo de los núcleos identificados, con un algoritmo informático prefijado o seleccionable adaptado a la correspondiente preparación tisular para su examen. Así, se construye, preferiblemente teniendo en cuenta los valores máximos y mínimos de los parámetros celulares, sobre todo para el tamaño celular o diámetro celular alrededor de los núcleos celulares de una superficie celular, y más concretamente considerando el criterio de que las superficies celulares vecinas, igualmente crecientes, no se mezclan entre sí y se descarta un contacto de las superficies celulares o paredes celulares o membrana celular. La limitación mantenida de los objetos determinados o acrecentados se considera como la limitación de las células individuales así reconstruidas.

Se puede determinar el número, la superficie y/o intensidad de la tinción en referencia a al menos una de las coloraciones efectuadas y/u otro parámetro de las células individuales reconstruidas y/o las células individuales, dependiendo eventualmente de su intensidad de la tinción y/u otro parámetro seleccionado, pueden ser clasificadas en poblaciones y a lo sumo ser representadas y posteriormente examinadas o analizadas. Las características extraídas del respectivo material gráfico, disponible en forma de datos numéricos, se pueden elaborar y representar en forma de histogramas y gráficos de dispersión (Fig. 2).

En la Fig. 2 se representan histogramas (frecuencia de intensidades de tinción en canales de color individuales) y gráficos de dispersión (para células simple, doble y triplemente reactivas) para las intensidades de tinción en diferentes canales de color. Se detecta la localización o agrupación de valores de medición asignados a células individuales, que permiten hacer conclusiones sobre las células. Por tanto, los gráficos de dispersión son apropiados en particular para un posterior tratamiento de los valores de medición y una evaluación más a fondo de los datos numéricos. En tales gráficos de dispersión se pueden trazar unas frente a otras diferentes propiedades de los objetos (forma del objeto, estructura superficial, intensidad densitométrica media, oscilaciones de intensidad, etc.) y representar su relación mutua. Mediante esos gráficos de dispersión se pueden establecer puertas (Gates, intervalos de validez para cada dos parámetros de medición), e interconectar éstos (Fig. 3).

La Fig. 3 muestra el resultado de la identificación de la preparación tisular representada en la Fig. 1 y una ventaja en relación al proceso mediante el aprovechamiento del parámetro obtenido o bien del contenido de la imagen. A partir de una escena representativa de objetos celulares reconocibles se deriva un gráfico de dispersión, en el que se confronta el tamaño de los objetos de la intensidad de tinción (primera serie de la Fig. 3). Mediante la definición de puertas, ya sea interactiva o automáticamente mediante determinación del centro de gravedad de grupos de puntos de medición se pueden identificar poblaciones específicas dentro de los valores de medición globales, como por ejemplo la representada en la segunda serie, cuando se confrontan los correspondientes parámetros de diferentes canales de color.

Las puertas que se definieron en una combinación de parámetros, se pueden visualizar también bajo otras combinaciones de parámetros, por lo que se pueden identificar subpoblaciones cada vez más exactamente definidas, como la que se extrae como ejemplo en la tercera serie.

Según la representación inferior en la Fig. 3 los objetos celulares representados en la pantalla 14 (Fig. 4) pueden representarse en diferentes marcajes, es decir sobre valores de medición reconocibles no en una puerta, sobre valores de medición en la puerta 1 o bien sobre valores de medición en la puerta 1 y la puerta 2 o bien sobre valores de medición en la puerta 1 pero no en la puerta 2. Este marcaje, sobre todo mediante tinción, puede realizarse automáticamente desde el ordenador; la condición para ello es la representación en el transcurso del proceso de correlación del parámetro obtenido en forma de histogramas y gráficos de dispersión y una selección previa del parámetro seleccionado.

Con esta posibilidad de evaluación se pueden alcanzar identificaciones muy exactas de células individuales de un determinado tipo celular. A las células contenidas en una puerta se las puede realzar el color y tratar analíticamente por separado en otros gráficos de dispersión, donde se aplican otros parámetros de medición unos frente a otros, de modo que se puede examinar las propiedades de células, que ya se habían resumido en una puerta (es decir con dos parámetros de medición) como una población, específicamente con vistas a otras propiedades de los objetos, sin por otro lado tener que extender el análisis hacia la totalidad de las células medidas. La verdadera evaluación de los valores de medición tampoco tiene lugar a través de limitaciones en el análisis de imagen, sino sobre la base de determinadas propiedades de los objetos dentro de la totalidad de los objetos medidos. Los parámetros determinados por esta interpretación se pueden utilizar para mejorar la definición del intervalo de valores de los parámetros.

En la Fig. 4 se representa esquemáticamente un ejemplo de realización de una configuración conforme a la invención. La configuración comprende un soporte 1 para la preparación tisular 2. La correspondiente preparación tisular teñida 2 se graba con un equipo de grabación de imagen electrónico 3 a través de un número de canales de color 4. Las imágenes en la coloración respectiva son conducidas hacia el ordenador 5 en forma digital y analizadas bajo la utilización de un procesador 6. El ordenador comprende una unidad de localización de parámetros 7, que se ejecuta preferiblemente como herramienta de Software y con la que se pueden especificar intervalos de valores para los parámetros celulares. Puede por tanto ocurrir, como se representa en la Fig. 1, que un determinado tamaño nuclear y coloración se especifica como valor de parámetro para los núcleos 11 y 11' y por ejemplo los núcleos teñidos se marcan como un 11 fuerte y un 11' débil. Así se efectúa una localización del parámetro intensidad de la tinción de los núcleos en la imagen representada sobre un mínimo y 5 sobre un valor máximo. También pueden limitarse otros parámetros.

De modo similar se puede también, por ejemplo, limitar el tamaño celular sobre un intervalo de parámetros. En la Fig. 1 a la derecha abajo aparecen marcadas una célula grande fuertemente coloreada 10 12 y una célula pequeña poco coloreada 12' y éstas constituyen por tanto los límites del intervalo para el parámetro tamaño celular e intensidad de la tinción según la extensión celular o superficie celular total. En principio es posible también, introducir y determinar tales valores de parámetro o intervalo manualmente o según valores experimentales o debidos a interpretaciones precedentes de resultados obtenidos. Estos parámetros son además la base de la correlación de las imágenes coloreadas de identificación y las de estructuras coloreadas.

El ordenador 5 comprende una memoria 8 adicional para los parámetros seleccionados o para parámetros obtenidos y una memoria de imagen adicional para las distintas imágenes digitales coloreadas tomadas.

Una correlación del contenido de la imagen determinado para núcleos con el contenido de la imagen determinado para objetos celulares de estructuras diana coloreadas se realiza en una unidad de correlación 10. En la unidad de correlación 10 se realiza informáticamente el crecimiento celular, en particular considerando la ordenación de los núcleos determinados según su localización y las, partiendo de estos núcleos, superficies celulares crecientes. La representación de las imágenes de preparaciones tisulares teñidas y/o células reconstruidas y/o de histogramas y gráficos de dispersión se realiza en un monitor 14.

Los pasos de procedimiento conforme a la invención se realizan mediante unidades informáticas o bien componentes de hardware y programas según la configuración de la invención.

Claims (15)

1. Un procedimiento para el examen, en especial la identificación, de células que se presentan preferiblemente en formaciones celulares densas o cerradas, en especial de células aisladas en tejidos,

En la que una preparación tisular plana, en particular un corte congelado o en parafina, frotis celular, citospin o similar, se somete a uno o a un número de diferentes colorante(s) de identificación del núcleo, en particular completos, preferiblemente planos, en particular todos los núcleos, en el que por lo menos uno de las tinciones de identificación de diferentes tinciones de estructuras diana de objetos celulares, en especial del citoplasma y/o membrana celular y/o núcleo y/u otros parámetros citológicos, se hacen de la preparación tisular, en la que

se graban imágenes digitales, en particular imágenes en color o en gama de grises, de la preparación tisular coloreada, mediante un equipo de grabación de imagen electrónica, por ejemplo microscopio de barrido láser, cámara CCD, cámara de vídeo o digital, escáner fotográfico o similar, y en el que se representa al menos una imagen de una subzona de la preparación tisular en por lo menos una coloración y/o en una combinación de coloraciones seleccionables, caracterizado por el hecho,

que se limita por lo menos a un parámetro, por ejemplo tonalidad de color, superficie, forma, contorno, intensidad de la tinción, patrón de coloración o similar, que hace reconocibles núcleos en la imagen de esa subzona mediante tinción de identificación y por lo menos un parámetro, por ejemplo tonalidad de color, superficie, forma, contorno, intensidad de la tinción, patrón de coloración o similar, que hace reconocibles en la imagen de una subzona mediante tinción de estructuras diana objetos celulares de un intervalo de valor dado o bien seleccionable,

que bajo aplicación de algoritmos de proceso de imagen a la imagen de esa subzona de núcleos y objetos celulares, sus parámetros se corresponden al o a los respectivos intervalos de parámetros determinados y eventualmente representados,

que eventualmente se representan determinados parámetros bajo aplicación de algoritmos de proceso de imagen a los núcleos y objetos celulares en la imagen de la subzona en forma de histogramas y gráficos de dispersión en mutua dependencia y eventualmente -dependiendo de los resultados de medición- se especifican nuevos intervalos de parámetros,

que para la investigación de células individuales existentes el contenido de la imagen determinado para los núcleos en por lo menos una, preferiblemente en todas, las imágenes, se correlaciona con el contenido de la imagen determinado para los objetos celulares de estructuras diana coloreadas, por lo menos en una, preferiblemente en todas, las imágenes, en donde eventualmente teniendo en cuenta por lo menos en una por el citoplasma y/o la tinción de la o las estructuras diana consideradas de las membranas celulares en la extensión de la superficie determinada de los objetos celulares, partiendo de los núcleos identificados se inicia con un algoritmo informático prefijado un crecimiento celular o ampliación celular para la reconstrucción de células individuales, preferiblemente teniendo en cuenta los valores máximos y mínimos de los parámetros celulares, sobre todo para el tamaño celular o diámetro celular alrededor de los núcleos celulares de una superficie celular, y más concretamente considerando el criterio de que las superficies celulares vecinas, igualmente crecientes, no se mezclan entre sí y se descarta un contacto de las superficies celulares o paredes celulares o membrana celular, y

que se puede determinar el número, la superficie y/o intensidad de la tinción en referencia a al menos una de las coloraciones efectuadas y/u otro parámetro de las células individuales reconstruidas y/o las células individuales, dependiendo eventualmente de su intensidad de la tinción y/u otro parámetro seleccionado, pueden ser clasificadas en poblaciones y a lo sumo ser representadas y posteriormente examinadas o analizadas.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que las imágenes de los núcleos determinados y/o los objetos celulares determinados se representan por separado o puestos unos sobre otros en la misma imagen.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por el hecho de que se representan los parámetros seleccionados, preferiblemente tamaño y/o forma y/o intensidad de tinción, de los núcleos identificados y/o los objetos celulares identificados y/o las células individuales identificadas y/o el número de los núcleos identificados y/o el número de los objetos celulares identificados y/o de las células individuales reconstruidas en forma de histogramas y/o gráficos de dispersión confrontados entre sí en mutua dependencia.

4. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que como tinción de identificación y/o tinción de estructuras diana se realizan tinciones de ADN y/o tinciones de anticuerpos y/o tinciones de antisueros y/o infusiones de colorantes y/o reacciones cromáticas químicas y/o tinciones de sonda génica y/o como objetos celulares situados en la célula o estructuras adheridas a su superficie, se tiñen núcleo, citoplasma, membrana celular, marcadores tumorales, citocinas, sustancias de crecimiento, iones, proteínas específicas, segmentos de ADN o similares.

5. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que son determinados mediante la investigación de dependencias de los parámetros de núcleo y/o objetos celulares y/o las células reconstruidas, preferiblemente tamaño y/o forma y/o intensidad de tinción, entre sí y/o del número y/o de la distribución de los núcleos y/u objetos celulares y/o mediante la investigación de la distribución o bien de los centros de gravedad de la población de los núcleos y/o objetos celulares, en especial por representación de los valores de parámetro determinados para las células individuales reconstruidas en gráficos de dispersión y/o histogramas, especificaciones para la limitación o bien selección de los intervalos de valores para los parámetros para la representación de los núcleos coloreados de identificación y/o las estructuras diana coloreadas de objetos celulares antes de o bien para la realización del crecimiento celular y/o se aproximan estas dependencias, en especial las intensidades de tinción en los canales de color individuales, para la valoración de las células individuales.

6. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que tras la correlación de las imágenes del mismo tomadas de una subzona de la preparación tisular y reconstrucción de las células individuales para esa subzona, se recurre a los valores de parámetro o intervalos determinados y utilizados para la interpretación de las imágenes del restante intervalo de esa preparación tisular y/o posteriores preparaciones tisulares correspondientes.

7. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que la especificación o limitación de un valor de parámetro o intervalo para un objeto celular de estructura coloreada, en especial para cada coloración existente, mediante marcaje de un objeto celular representado (núcleo, citoplasma, membrana celular) o bien de un objeto celular como célula individual evaluado antes y/o después de efectuarse la realización de la reconstrucción celular, en la que se determinan intensidad de tinción, tonalidad de color, tamaño y/o forma de esa célula individual y dependiendo de la representación evaluada del objeto celular de ese parámetro determinado se especifica o selecciona un nuevo valor de parámetro o intervalo.

8. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que, partiendo de los núcleos se inicia con el algoritmo informático determinado una reconstrucción celular en forma de un crecimiento celular, hasta que la superficie celular o el borde celular o bien la membrana celular alcanza un punto de la imagen o un objeto en la imagen de la preparación tisular, cuyo parámetro corresponde a un parámetro de un objeto celular de estructuras no coloreadas u otros objetos en la preparación tisular y/o hasta que se excede un valor de parámetro preestablecido y/o hasta que se alcanza un núcleo vecino asignado a un intervalo de crecimiento celular.

9. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que las células individuales identificadas, en especial según parámetros prefijados o intervalos de parámetros en la imagen representada de la preparación tisular, se destacan o caracterizan eventualmente para las coloraciones individuales en imágenes aisladas, una tinción de estructuras diana de objetos celulares, en especial citoplasma y/o membrana celular y/o núcleos y/u otros parámetros citológicos, diferente frente al o a las tinciones de identificación.

10. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de,

- que antes de la representación de los núcleos y de los objetos celulares y antes de la reconstrucción celular se realiza una restricción o nueva determinación de los parámetros, en especial de la intensidad de la tinción y tamaño, en donde se realiza entre una de tales nuevas determinaciones o restricciones una representación y valoración con el o los valores de parámetros precedentes de imágenes correlacionadas determinadas, y/o

- que se deriva de los parámetros, en especial superficie, tonalidad de color e intensidad de la tinción de los parámetros de objetos celulares de estructuras diana coloreadas, en especial tamaño y forma celular, para la reconstrucción celular.

11. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de

- que para la reconstrucción celular en una tinción citoplásmica, partiendo de los núcleos identificados se inicia un proceso de crecimiento que continua, hasta que o se alcanza un punto de la imagen que no corresponde a la tonalidad de color elegida, o se excede el límite de tolerancia para el tamaño o se alcanza un objeto perteneciente al núcleo vecino,

- que para la reconstrucción celular efectuada en una tinción de membrana celular, el crecimiento celular desde el núcleo rodeado de la membrana en todas direcciones se termina en la zona donde la superficie celular o su borde o la membrana celular de uno o más de los colores de la membrana se encuentra con uno o varios segmentos teñidos u objeto celular u otro objeto celular creciente, en donde eventualmente es admisible hasta una extensión prefijada una penetración de la superficie celular que se ha hecho crecer en la zona de la membrana teñida.

12. Una configuración para el examen, en especial la identificación, de células situadas en formaciones celulares densas o cerradas, que están presentes en forma de una preparación tisular plana (2), en particular un corte congelado o en parafina, frotis celular, citospin o similar, y fueron sometidos a uno o a un número de diferentes colorante(s) de identificación del núcleo, en particular completos, preferiblemente planos, en particular todos los núcleos, y al menos una tinción de estructuras diana de objetos celulares, en especial citoplasma y/o membrana celular y/o núcleos y/u otros parámetros citológicos, diferente frente al o a las tinciones de identificación, - donde la configuración consta de un equipo de grabación de imagen electrónico (3), por ejemplo microscopio de barrido láser, cámara CCD, cámara de vídeo o digital, escáner fotográfico o similar para la grabación de imágenes digitales, en particular imágenes en color o en gama de grises, de la preparación tisular coloreada (2), que se conecta a por lo menos una unidad de imagen o bien una unidad informática (5) para representación de por lo menos una imagen de por lo menos una subzona de la preparación tisular en por lo menos una coloración y/o en por lo menos una combinación seleccionable de sus coloraciones, en especial para la realización del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11,

caracterizada por el hecho de

- que la unidad informática (5) está configurada para representación y tratamiento así como medición de imágenes de objetos celulares representados y comprende una unidad de localización de parámetros (7), con la que se limita por lo menos a un parámetro, por ejemplo tonalidad de color, superficie, forma, contorno, intensidad de la tinción, patrón de coloración o similar, que hace reconocibles núcleos (11, 11') en la imagen de esa subzona mediante tinción de identificación y por lo menos un parámetro, por ejemplo tonalidad de color, superficie, forma, contorno, intensidad de la tinción, patrón de coloración o similar, que hace reconocibles en la imagen de una subzona mediante tinción de estructuras diana objetos celulares (12, 12') de un intervalo de valor dado o bien seleccionable,

- que desde la unidad informática (5) bajo aplicación de algoritmos de proceso de imagen a la imagen de esa subzona de núcleos (11, 11') y objetos celulares (12, 12'), sus parámetros se corresponden al o a los respectivos intervalos de parámetros determinados y eventualmente representados, en particular distinguibles y reconocibles,

- que la configuración para la investigación de células individuales existentes conecta una unidad de correlación (10), con la que el contenido de la imagen determinado para los núcleos en por lo menos una, preferiblemente en todas, las imágenes, se correlaciona con el contenido de la imagen determinado para los objetos celulares de estructuras diana coloreadas, por lo menos en una, preferiblemente en todas, las imágenes, en donde eventualmente teniendo en cuenta por lo menos en una por el citoplasma y/o la tinción de estructuras diana considerada de las membranas celulares en la extensión de la superficie determinada de los objetos celulares de estructuras diana coloreadas - partiendo de los núcleos identificados se inicia con un algoritmo informático prefijado un crecimiento celular para la reconstrucción de células individuales, preferiblemente teniendo en cuenta los valores máximos y mínimos de los parámetros celulares, sobre todo para el tamaño celular o diámetro celular alrededor de los núcleos celulares de una superficie celular, y más concretamente considerando el criterio,

- que las superficies celulares vecinas no se mezclan entre sí y se descarta un contacto de las superficies de pared celular determinadas por ordenador, donde eventualmente la limitación de la estructura determinada se considera como la limitación de las células individuales reconstruidas, y

- que se determina el número, la superficie y/o intensidad de la tinción en referencia a al menos una de las coloraciones efectuadas y/u otro parámetro de las células individuales reconstruidas con la unidad informática (5) y/o las células individuales, dependiendo eventualmente de su intensidad de la tinción y/u otro parámetro seleccionado, y/o sus datos son almacenados.

13. Una configuración según la reivindicación 12, caracterizada por el hecho de que el equipo de grabación de imagen (3) muestra una gama de canales de color (4) para grabación de imágenes de la preparación tisular (2) en diferentes coloraciones.

14. Una configuración según la reivindicación 12 o 13, caracterizada por el hecho de que con la unidad de imagen (5) se representan los parámetros seleccionados, preferiblemente tamaño y/o forma y/o intensidad de tinción, de los núcleos identificados y/o los objetos celulares identificados y/o las células individuales reconstruidas y/o el número de los núcleos reconstruidos y/o el número de los objetos celulares identificados y/o de las células individuales reconstruidas en forma de histogramas y/o gráficos de dispersión confrontados entre sí en mutua dependencia.

15. Una configuración según una de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada por el hecho de que las células individuales identificadas en la imagen digital representada de la preparación tisular, se destacan o caracterizan eventualmente para las coloraciones individuales en imágenes aisladas, con la unidad de imagen (5).