ES2292973T3

ES2292973T3 - Metodo para video-microscopia y sistema asociado, y producto de programa de soporte logico informatico.

Info

Publication number: ES2292973T3
Application number: ES03732046T
Authority: ES
Inventors: Raphael Marcelpoil; Didier Morel
Original assignee: TriPath Imaging Inc
Current assignee: TriPath Imaging Inc
Priority date: 2002-01-24
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2023-01-22
Also published as: EP1470411A2; DE60316113T2; US7602954B2; US7826650B2; CA2473848A1; US20060204068A1; WO2003062803A2; JP2005516188A; EP1470411B1; CA2473848C; JP4376058B2; US7133547B2; AU2003236675B2; ATE372512T1; US20030138140A1; DE60316113D1; WO2003062803A3; US20100054574A1

Abstract

Un método de modelado de un tinte, el mencionado método comprendiendo: determinar una transmitancia de la muestra tratada con el tinte, a partir de una imagen en color de la muestra tratada, la imagen comprendiendo una pluralidad de píxeles, en cada uno de los canales rojo, verde y azul de un espacio de color RGB, y para cada píxel de la imagen, al objeto de formar un triplete RGB para cada píxel; caracterizado por agrupar los tripletes RGB de acuerdo con la transmitancia mínima en los canales rojo, verde y azul, para el respectivo triplete RGB; normalizar cada grupo de tripletes RGB mediante sumar las transmitancias en cada uno de los respectivos canales rojo, verde y azul, y después dividir cada una de las transmitancias sumadas por el número de tripletes RGB en el respectivo grupo, para formar respectivos tripletes RGB normalizados; y tabular los tripletes RGB normalizados de acuerdo con la transmitancia mínima de cada triplete RGB normalizado, al objeto de formar una tabla de correspondencia para el tinte, la tabla de correspondencia extendiéndose a incrementos de transmitancia entre el 0% y 100% de transmitancia.

Description

Método para vídeo-microscopía y sistema asociado, y producto de programa de soporte lógico informático.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a análisis de imágenes, y más en concreto a un método para vídeo-microscopia cuantitativa en aplicaciones de biología celular y patología y a un sistema asociado, y a un producto de programa de software informático para este.

Antecedentes de la invención

El análisis eficaz de imágenes microscópicas es esencial en biología celular y patología, en particular para la detección y cuantificación de materiales genéticos, tales como por ejemplo genes o a ARN mensajero, o de la expresión de esta información genética en forma de proteínas, tal como por ejemplo a través de amplificación genética, supresión genética, mutación genética, cuantificación de moléculas de ARN mensajero o análisis de la expresión de proteínas. La amplificación genética es la presencia de demasiadas copias del mismo gen en una célula, donde una célula contiene usualmente dos copias del mismo gen conocidas como alelos. La supresión genética indica que puede encontrarse menos de dos copias de un gen en una célula. La mutación genética indica la presencia de genes incompletos o no funcionales. Los ARN mensajeros (ARNm) son moléculas de información genética sintetizadas a partir de un proceso de lectura de genes, que sirven como plantillas para la síntesis proteica. La expresión de proteínas es la producción de una proteína mediante una célula. Si está aumentada la codificación genética para una proteína dada, determinada a partir de un proceso de expresión de proteínas, o si está presente un exceso de copias del gen o del ARNm, la proteína puede estar sobre-expresada. A la inversa, si la codificación genética está suprimida o ausente, la proteína puede estar infra-expresada o ausente.

Los comportamientos celulares normales se controlan de forma precisa mediante mecanismos que involucran un gran número de proteínas, ARNms y genes. Se sabe que la amplificación genética, la supresión genética y la mutación genética tienen un rol predominante en comportamientos celulares anómalos, a través de la expresión de proteínas anómala. El rango de comportamientos celulares de relevancia incluye comportamientos tan diversos como, por ejemplo, regulación de diferenciación o proliferación. Por lo tanto, la detección eficaz y cuantificación en la amplificación, supresión y mutación genéticas, cuantificación de ARNm o análisis de la expresión de proteínas, son necesarios para facilitar herramientas útiles de investigación, diagnóstico y pronóstico.

Hay numerosas técnicas de laboratorio dirigidas a la detección y cuantificación de la amplificación, supresión y mutación genéticas, la cuantificación de ARNm o el análisis de la expresión de proteínas. Por ejemplo, tales incluyen las técnicas de transferencia de Western, Northern and Southern, reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"), ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas ("ELISA"), e hibridación genómica comparada ("CGH"). Sin embargo, rutinariamente se utiliza microscopía debido a que es una técnica informativa que permite de investigaciones rápidas en los niveles celular y sub-celular, siendo a la vez capaz de ser implementada rápidamente y a relativo bajo coste.

Cuando se escoge la microscopia como técnica de laboratorio, las muestras biológicas deben primero ser sometidas a preparaciones específicas de detección y revelación. Una vez que las muestras están preparadas, una persona experta analiza las muestras típicamente sólo con un microscopio, en un estudio cualitativo, o con un microscopio acoplado a una cámara y ordenador, en un estudio cuantitativo y generalmente estandarizado. En algunos casos el microscopio puede configurarse para un análisis totalmente automatizado, en el que el microscopio está automatizado con enfoque y portaobjetos motorizados, cambiador de objetivo motorizado, controles automáticos de intensidad de la luz, etcétera.

La preparación de las muestras para la detección, puede involucrar diferentes tipos de técnicas de preparación adecuadas para el análisis microscópico de imágenes, tales como por ejemplo técnicas de preparación basadas en hibridación y basadas en marcado con anticuerpos. Tales técnicas de detección pueden acoplarse con técnicas de revelación apropiadas, tales como por ejemplo las técnicas basadas en fluorescencia y basadas en reacción de color visible.

La hibridación in situ ("ISH", In Situ Hybridation) y la hibridación in situ fluorescente ("FISH") son técnicas de detección y revelación, utilizadas por ejemplo para la detección y cuantificación en análisis de mutación y amplificación de información genética. Tanto ISH como FISH pueden aplicarse a muestras histológicas o citológicas. Estas técnicas utilizan sondas complementarias específicas para reconocer correspondientes secuencias precisas. Dependiendo de la técnica utilizada, la sonda específica puede incluir un marcador colorimétrico (clSH) o un marcador fluorescente (FISH), donde las muestras son analizadas utilizando respectivamente un microscopio de transmisión o un microscopio de fluorescencia. El uso de un marcador colorimétrico o de un marcador fluorescente depende del objetivo del usuario teniendo, en cada caso concreto, cada tipo de marcador las correspondientes ventajas sobre el otro.

En los análisis de la expresión de proteínas puede utilizarse, por ejemplo, las técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") e inmunocitoquímica ("ICC"). IHC es la aplicación de inmunoquímica a secciones de tejido, mientras que ICC es la aplicación de inmunoquímica a marcas de tejidos o células cultivadas, después de que han experimentado preparaciones citológicas específicas, tales como por ejemplo preparaciones basadas en líquido. La inmunoquímica es una familia de técnicas basadas en el uso de un anticuerpo específico, donde los anticuerpos son utilizados específicamente para moléculas objetivo, en el interior o sobre la superficie de las células. El anticuerpo contiene típicamente un marcador que experimentará una reacción bioquímica, y por lo tanto experimenta un cambio de color tras encontrar las moléculas objetivo. En algunos casos, la amplificación de señal puede integrarse en el protocolo concreto, donde un anticuerpo secundario que incluye el tinte marcador sigue a la aplicación de un anticuerpo específico primario.

En los estudios tanto de hibridación como de marcado con anticuerpos, se utiliza generadores cromáticos de diferentes colores para distinguir entre los diferentes marcadores. Sin embargo, el número máximo de marcadores que puede utilizarse en un estudio está limitado por varios factores. Por ejemplo, el solapamiento espectral de los colores utilizados para los respectivos marcadores puede ser un factor limitativo, debido a que los tintes pueden absorber una gran parte del espectro visible. Por consiguiente, cuando mayor es el número de tintes involucrados en un estudio mayor es el riesgo de solapamiento espectral. Además, la resolución espectral del dispositivo de adquisición puede ser un factor limitativo, y es necesario considerar el mínimo desplazamiento cromático que el dispositivo es capaz de detectar.

Además, generalmente se considera que la inmunoquímica así como la química en ISH, exhiben una escasa sensibilidad cuando se necesita conseguir la cuantificación de un marcador. No obstante, la precisión de la cuantificación en estas técnicas, puede depender de varios factores. Por ejemplo, el tipo de reacción utilizado puede jugar un papel en la precisión de la técnica, puesto que la linealidad de la relación entre la concentración de ligando y el grado de la reacción inmunoquímica de tinción, pueden depender estrechamente del tipo de reacción. En concreto, por ejemplo un método de peroxidasa/anti-peroxidasa puede ser más lineal que un método de biotina-avidina. La localización celular de los marcadores puede también afectar a la precisión por ejemplo cuando, si los marcadores de membrana y nucleares solapan espacialmente, el color resultante es una mezcla de los respectivos colores. Por consiguiente, puesto que la correspondiente cuantificación es subjetiva, la precisión de la determinación puede verse afectada. Adicionalmente puede requerirse un estándar de calibración, tal como por ejemplo células con características conocidas, geles con concentraciones dadas del marcador, o similares, cuando se aplique un modelo de análisis desarrollado sobre un caso nuevo y diferente. De forma general, hay disponibles equipos de tinción que incorporan estándares de calibración. Sin embargo, el estándar de calibración es usualmente aplicable sólo a una muestra concreta, tal como una célula específica o una estructura de un tipo específico, de los que se sabe exhiben características constantes con respecto al estándar, y puede ser de utilidad limitada cuando se aplique a una muestra de naturaleza diferente.

En general, los estudios "colorimétricos" descritos presentan información de análisis de muestra, en color y facilitan el procesamiento y cuantificación de la información, para de ese modo ayudar a proporcionar una diagnosis o generar un pronóstico del caso concreto. Por ejemplo, la detección y cuantificación de la expresión de proteínas HER2 y/o la amplificación genética, pueden evaluarse mediante diferentes enfoques utilizados en microscopia cuantitativa. HER2 es una proteína de la membrana, que se ha demostrado significativa en el diagnóstico y pronóstico del cáncer metastásico de mama. Debido a que los pacientes positivos a HER2 mostraron ser más sensibles a tratamientos que incluían Herceptin® (un tratamiento objetivo desarrollado por Genentech), la definición del estado HER2 de los cáncer metastásicos de mama ha demostrado ser de primera importancia en la elección del adecuado protocolo de tratamiento. La definición del estado HER2 se basó en un estudio de muestras, tratadas bien con hibridación (FISH, ISH) o con marcado con anticuerpos (IHC).

En tales estudios, utilizar FISH por ejemplo con un equipo autorizado por la FDA, tal como PathVysion® producido por Vysis, requiere un protocolo de análisis de imagen para contar el número de copias del gen HER2 presentes en cada célula. En un caso normal se encuentra dos copias del gen en cada célula, mientras que más de tres copias del gen en una célula indican que el gen está amplificado. Alternativamente, utilizar IHC por ejemplo con un equipo autorizado por la FDA, tal como Herceptest® producido por Dako, requiere un protocolo de análisis de imagen que clasifique los casos en cuatro categorías, dependiendo de la intensidad y la localización de la tinción de membrana específica HER2. Los estudios actuales tienden a mostrar que estas dos técnicas de investigación (hibridación y marcado con anticuerpos) pueden ser complementarias, y combinadas pueden ayudar a los patólogos en el diagnóstico del subtipo de tumor.

Sin embargo, tales estudios de colorimetría requieren la preparación exhaustiva de la muestra, y un control del procedimiento. Así, cuando se dispone de protocolos de tinción adaptados es crítico ser capaz de verificar que la tinción de cada muestra se adapta al modelo concreto utilizado en el dispositivo de adquisición y procesamiento de la imagen, de forma que se obtenga resultados útiles y precisos a partir de la información obtenida. De otro modo, puede ser necesario repetir el análisis comenzando de nuevo desde la etapa de preparación de la muestra, lo que posiblemente tiene como resultado un proceso costoso y prolongado.

En un típico dispositivo de microscopia basado en adquisición y procesamiento de imágenes, la imagen amplificada de la muestra debe ser primero capturada y digitalizada con una cámara, antes de ser analizada. Además, para explotar las propiedades cromáticas de la muestra se ha desarrollado dispositivos de adquisición de imagen multiespectral y métodos asociados de generación de imagen multiespectral, donde tal formación de imagen multiespectral está típicamente dirigida a la adquisición de múltiples imágenes de una escena, en diferentes bandas espectrales. Más en concreto, se utiliza típicamente cámaras digitales de dispositivo acoplado por carga (CCD, charge coupled device), en microscopia cuantitativa tanto luminosa como fluorescente. Por consiguiente, excluyendo los espectrofotómetros se utiliza generalmente dos técnicas diferentes para llevar a cabo tales estudios microscópicos cromáticos. En una técnica, puede utilizarse una cámara CCD en blanco y negro (BW). En tal caso se obtiene una imagen de la muestra en un nivel de gris, correspondiente a una luz monocromática que tiene una longitud de onda concreta para la tinción de la muestra a ser analizada. La longitud de onda concreta de la luz, se obtiene bien filtrando una fuente de luz blanca a través de un filtro con un ancho de banda reducido, específico, o bien directamente mediante controlar la longitud de onda de la fuente de luz, utilizando controles bien manuales o electrónicos. La aplicación de patente europea EP 1 065 496 A2, de Meyer et al. (sobre la que se basa la parte pre-caracterizadora de la reivindicación 1 anexa), proporciona una muestra de esta técnica. Por consiguiente, utilizando esta técnica se incrementa la duración del análisis cuando se incrementa el número de colores, debido a que es necesario seleccionar una fuente de luz o un filtro para cada diferente tinción de la muestra o cada diferente longitud de onda. Por tanto, se necesita capturar individualmente muchas imágenes diferentes de la muestra, mostrando la respuesta espectral de la muestra a diferentes longitudes de onda, para facilitar el análisis. Cuando se requiere analizar múltiples escenas o campos de visión, el protocolo típico es automatizar la secuencia en un modo por lotes, para mantener el tiempo de procesamiento.

De acuerdo con una segunda técnica, se utiliza una cámara digital CCD en color, en la que se captura y obtiene simultáneamente tres imágenes de la muestra, en un nivel de gris. Cada imagen en un nivel de gris corresponde con el respectivo canal rojo, verde y azul (RGB) de la cámara CCD en color. Después las imágenes son analizadas directamente en el espacio de color RGB, mediante limitar el análisis a los píxeles localizados en una región específica del cubo RGB, la región incluyendo además los píxeles procedentes de una base de datos de preparación. Alternativamente las imágenes son analizadas después de la transformación matemática del espacio de color RGB, en uno o más espacios de color definidos por la CIE (International Comission on Illumination; Comisión Internacional de Alumbrado), tales como por ejemplo un espacio HLS (Hue, Luminance or Saturation; tono, luminancia o saturación). Alternativamente, algunos fabricantes de cámaras producen cámaras CCD específicas, en las que pueden reemplazarse los filtros usuales rojo, verde y azul, por filtros con ancho de banda estrecho para la obtención de longitudes de onda específicas. En tal caso, la cámara permite una rápida captura de imágenes de los tres componentes espectrales de una escena, en forma paralela. Sin embargo, las cámaras modificadas de este modo pueden estar limitadas a parámetros específicos de análisis espectral, debido a que no puede cambiarse los filtros, y por lo tanto no pueden adaptarse a tratar una combinación de tinte exclusiva para la muestra. Así, generalmente la segunda técnica depende o bien de la detección de contraste entre las especies de interés y el resto de la muestra, o bien del análisis de la muestra sobre un ancho de banda estrecho.

Los espectrómetros tales como el descrito en la patente de EE.UU. número 6 007 996, de McNamara et al., pueden implementar una combinación concreta de tintes y un interferómetro para recoger los datos de imagen necesarios para el análisis. La patente 6 007 996 revela una técnica de formación de imágenes que requiere la elección de tintes fluorescentes, de acuerdo con un método concreto para proporcionar una combinación específica de tintes. Después se necesita un interferómetro, configurado para examinar un ancho de banda estrecho (un rango de longitud de onda predefinido, o un conjunto predeterminado de combinaciones lineales de intensidad espectral) al objeto de analizar la muestra, donde el dispositivo de recogida de datos espectrales y la selección de tintes deben ser tales que pueda recogerse el componente espectral asociado con cada uno de los tintes. Por consiguiente, el interferómetro necesita que se adquiera una pluralidad de imágenes de la muestra, en sucesivos incrementos de medida a través de un rango de longitudes de onda a ser examinado, con cada una de las imágenes cubriendo la resolución espectral del ancho de banda estrecho, del dispositivo de interferómetro. Así, puede recogerse una pluralidad de imágenes para cada muestra, sobre el rango de longitudes de onda, donde las imágenes están separadas de acuerdo con cada tinte, mediante integrar la pluralidad de imágenes que componen la señal óptica sobre el rango espectral (longitud de onda) de la matriz CCD, utilizando un algoritmo RGB al objeto de proporcionar una imagen RGB convertida.

El documento WO 98/55026, de Youvan et al., revela equipamiento físico y software de generación de imágenes, calibradores, y métodos para visualizar y cuantificar la cantidad de transferencia de energía resonante fluorescente (FRET) que se produce entre moléculas donante y aceptora en microscopia epifluorescente, y utiliza algoritmos que proporcionan pseudo-color a la imagen, para mostrar píxeles que exhiben emisión de fluorescencia corregida radiométricamente, procedente de la donante (azul), la aceptora (verde), y FRET (rojo), donde se utiliza una transformación de ortonormalización (ecuación de Förster) para convertir las señales de donante, aceptora y FRET en los canales exclusivos rojo, verde y azul.

Son posibles otras técnicas de análisis, y estas son aplicables con diferentes propósitos, si bien no están relacionados con los conceptos aquí descritos. Ejemplos de estas incluyen la patente de EE.UU. número 6 330 349, de Hays et al., que describe un método automatizado para evaluar la cantidad de niveles de proteínas residuales que siguen al tratamiento de especies celulares, y la patente de EE.UU. número 6 276 798. de Gil et al., que describe un método de generación biológica de imágenes para mejorar las firmas espectrales patológica, fisiológica, metabólica y relacionada con la salud, del tejido de un ojo.

Por consiguiente, las técnicas utilizadas en análisis colorimétricos de muestras preparadas, son de uso limitado en la detección y cuantificación de especies de interés, debido a varios factores tales como por ejemplo solapamiento espectral, mezcla de colores debida a solapamiento espacial de la membrana, marcadores citoplásmicos y nucleares, aberraciones cromáticas en el camino óptico, resolución espectral limitada del dispositivo de adquisición, singularidades de calibración, subjetividad del proceso de detección y cuantificación, e inconsistencias entre operarios humanos. La parte de procesamiento de imagen de las técnicas de análisis colorimétrico ha estado históricamente dirigida a la detección subjetiva de contraste dentro de la muestra preparada, o a un análisis complejo y voluminoso de la muestra a varias longitudes de onda de la luz, específicas, utilizando una combinación de fuentes de luz y filtros.

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Así, existe una necesidad para una técnica de análisis colorimétrico más simple y más eficaz, que supere las limitaciones de detección y cuantificación que se encuentra en las técnicas de análisis del arte previo. Tal técnica debe además ser capaz de proporcionar datos de alta calidad, que comprendan la necesaria información de análisis sobre la muestra, reduciendo a la vez la subjetividad y la inconsistencia en el análisis de la muestra.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método de modelado de un tinte, comprendiendo el mencionado método:

determinar una transmitancia de la muestra tratada con el tinte, a partir de una imagen de color de la muestra tratada, la imagen comprendiendo una pluralidad de píxeles en cada uno de los canales rojo, verde y azul de un espacio de color RGB, y para cada píxel de la imagen al objeto de formar un triplete RGB para cada píxel; caracterizado
por

agrupar los tripletes RGB de acuerdo con la transmitancia mínima de los canales rojo, verde y azul, para el respectivo triplete RGB;

normalizar cada grupo de tripletes RGB, mediante sumar las transmitancias en cada uno de los respectivos canales rojo, verde y azul, y después dividir cada una de las transmitancias sumadas, por el número de tripletes RGB en el respectivo grupo, al objeto de formar los respectivos tripletes RGB normalizados; y

tabular los tripletes RGB normalizados de acuerdo con la mínima transmitancia de cada triplete RGB normalizado, para formar así una tabla de correspondencia para el tinte, la tabla de correspondencia extendiéndose a incrementos de transmitancias entre el 0% y el 100% de transmitancias.

Breve descripción de los dibujos

Habiendo descrito así la invención en términos generales, ahora se hará referencia a los dibujos anexos, que no están necesariamente dibujados a escala y en los cuales:

la figura 1 es una representación general esquemática, de un sistema de vídeo-microscopia cuantitativa acorde con la realización de la presente invención;

las figuras 2A-2C ilustran esquemáticamente la adición de tripletes RGB a una correspondiente tabla para un tinte, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 3 ilustra esquemáticamente la normalización de una tabla de correspondencia, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 4A ilustra a modo de ejemplo, un modelo de un tinte NFR en un espacio de color RGB 3D, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 4B ilustra a modo de ejemplo, un modelo de un tinte BCIP-NBT en un espacio de color RGB 3D, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 4C ilustra a modo de ejemplo, un modelo de un tinte NFR como el mostrado en la figura 4A,

la figura 5A ilustra a modo de ejemplo, un modelo de un tinte NFR sobre una escala 1D (tabla de correspondencia), de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 5B ilustra a modo de ejemplo, un modelo de un tinte BCIP-NBT en una escala 1D (tabla de correspondencia), de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 5C ilustra a modo de ejemplo, un modelo de un tinte NFR como el que se muestra la figura 5A, combinado por adición ortogonal con un tinte BCIP-NBT como el mostrado en la figura 5B, en una escala 2D (espacio del tinte), de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 6 es una representación esquemática de un modelo de combinación de tinte, trazado en un espacio de color RGB 3D, que muestra un píxel de una imagen de la muestra desconocida, teñida de acuerdo con el mismo protocolo y representada frente al modelo, separada del modelo mediante un error, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 7 ilustra una muestra de un modelo de combinación de tinte, representada en un espacio de color RGB 3D, que tiene un trazado recubierto de una imagen de una muestra desconocida, teñida según el mismo protocolo, de acuerdo con una realización de la presente invención;

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la figura 8 ilustra un ejemplo de una representación a escala 2D (espacio del tinte) de una combinación de dos tintes, para determinar las propiedades cromáticas de un píxel de una imagen de una muestra desconocida, teñida según el mismo protocolo, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9 es una ilustración esquemática de una representación en escala 2D (espacio del tinte), de una combinación de dos tintes que tienen una región limítrofe definida, en la que se lleva a cabo la búsqueda de una combinación óptima para un píxel de una imagen de una muestra desconocida, teñida según el mismo protocolo, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 10 es una ilustración esquemática de una representación en espacio de color RGB 3D, de una combinación de dos tintes que tienen una región limítrofe definida, en la que se lleva a cabo la búsqueda de una combinación óptima para un píxel de una imagen de una muestra desconocida, teñida según el mismo protocolo, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 11 es una imagen de una muestra desconocida, teñida con una combinación de NFR y BCIP-NBT, de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 12 es una representación esquemática de la realización práctica, en una configuración extendida, de un sistema de vídeo-microscopia cuantitativa acorde con una realización de la presente invención;

la figura 13A es una imagen de una muestra desconocida, teñida con una combinación de NFR y BCIP-NBT de acuerdo con una realización de la presente invención, e ilustrando un componente desconocido; y

la figura 13B es una imagen de una distribución de error por píxel, del error entre la imagen que se muestra en la figura 13A y el modelo de dos tintes (NFR y BCIP-NBT), de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

En lo que sigue se describirá la presente invención de forma más completa, con referencia a los dibujos anexos en los que se muestra realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo esta invención puede realizarse de muchas formas diferentes, y no debe concebirse como limitada a las realizaciones aquí enunciadas; por el contrario, se proporciona estas realizaciones para que esta revelación sea minuciosa y completa, y traslade totalmente el alcance de la invención a aquellas personas cualificadas en el arte. A través del documento, los mismos números se refieren a elementos análogos.

Probablemente el cáncer que se extiende más rápidamente sea el melanoma cutáneo, para el que recientemente se ha descubierto un nuevo marcador. Sin embargo, el uso para diagnóstico y pronóstico requiere la cuantificación precisa de la regulación a la baja de este marcador, en melanocitos del tumor. Así, el análisis espectral es una de las metodologías colorimétricas más fiables para tratar esta cuantificación en la rutina de microscopia en campo claro. Por consiguiente, se describe aquí una técnica dedicada a la optimización del análisis multiespectral, y la aplicación de esta a la cuantificación del marcador de melanoma, junto con programas de software y sistemas asociados. Más en concreto, aquí se describe la presente invención aplicándose a la cuantificación del marcador de melastatina, un prometedor marcador del tumor de melanoma cutáneo, si bien se comprenderá que la aplicación concreta se presenta sólo a modo de ejemplo, y no debe interpretarse como una restricción ni como una limitación de la aplicabilidad de la presente invención. Por consiguiente la presente invención puede ser aplicable, de forma más general, a los estudios colorimétricos cuantitativos de un amplio rango de muestras teñidas por uno o más tintes, y analizada de acuerdo con los métodos aquí descritos.

De acuerdo con la American Cancer Society, la incidencia del melanoma cutáneo se está incrementando más rápidamente que cualquier otro cáncer en los Estados Unidos. Por ejemplo habrá unos 51 400 nuevos casos de melanoma en 2001, 21 000 hombres y 22 400 mujeres, lo que es aproximadamente un incremento del 9% desde 2000. En 2001, con las tasas actuales, aproximadamente 1 de cada 71 estadounidenses tendrá riesgo de desarrollar melanoma a largo de su vida. Generalmente, la escisión quirúrgica de melanoma cutáneo primario localizado (etapas I y II del American Joint Committee on Cancer [AJCC], que comprenden aproximadamente el 75% de los diagnósticos) puede llevar a la curación en muchos pacientes. Además, la tasa global de supervivencia a 5 años para los pacientes con escisión quirúrgica, es aproximadamente del 80%, sugiriendo así que aproximadamente el 20% de los pacientes de la etapa I y la etapa II pueden tener una enfermedad micrometastática en el momento del diagnóstico del melanoma cutáneo. El melanoma es uno de los cáncer más letales. Por ejemplo en 1996, el melanoma fue responsable de aproximadamente el 2% de todas las muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Actualmente no existe cura para los pacientes que tienen melanoma que se ha metastatizado a puntos distantes, y la supervivencia media de estos pacientes es de sólo unos 6 meses. Por lo tanto, de acuerdo con Duncan et al., J. Clin. Oncol., Vol. 19, No. 2, páginas 568-576, 2001, identificar pacientes con alto riesgo de desarrollar metástasis es una de las cuestiones más críticas en el tratamiento de esta clase de cáncer.

Un gen novedoso denominado melastatina, cuya expresión está correlacionada con la agresividad en vivo, ha sido descubierto en sublíneas celulares del melanoma B16 murino, con potencial metastático divergente en vivo, utilizando análisis ARNm diferencial. La melastatina humana ha sido clonada, y generalmente se designa como MLSN-1. El análisis Northern ha demostrado la expresión de melastatina sólo en células melanocíticas y en la coroides (tejido del ojo), mientras que no se detecta expresión de melastatina en otros tejidos. Aunque el análisis de hibridación in situ de tejidos melanocíticos cutáneos humanos, ha revelado que el ARNm de melastatina se expresaba uniformemente en nevus melanocíticos benignos, los melanomas cutáneos primarios mostraron una expresión variable de ARNm de melastatina. Notablemente, el estado de melastatina estaba correlacionado con el grosor del tumor primario, de acuerdo con Deeds et al., Hum. Pathol., Vol. 31, No. 11, páginas 1346-1356, 2000. Los datos preliminares también sugerían que la expresión de melastatina estaba en relación inversa con la enfermedad metastásica humana. Sin embargo, la mayoría de los últimos resultados indican que la regulación a la baja de ARNm de melastatina en el tumor cutáneo primario, es un marcador de pronóstico para la metástasis en pacientes con melanoma maligno localizado, y es independiente del grosor del tumor y de otras variables. Cuando son utilizados en combinación, el estado de la melastatina y el grosor del tumor permiten la identificación de subgrupos de pacientes, en riesgos alto y bajo de desarrollar enfermedad metastásica.

La patente de EE.UU. número 6 025 137 está relacionada con el gen Melastatina^{TM} y el melanoma metastático, y más en concreto está dirigida a métodos para detectar Melastatina^{TM} en muestras de tejido del paciente, al objeto de determinar si un paciente tiene un melanoma metastático o un riesgo de desarrollarlo. Utilizando la expresión de Melastatina^{TM} como un marcador de diagnóstico en el trabajo rutinario, la evaluación debe llevarse a cabo de forma fiable y a bajo coste. IHC e ISH sobre material histológico procedente de muestras de la piel, son típicamente las técnicas más convenientes, utilizadas rutinariamente para cuantificar a bajo coste la expresión de proteína. Así, las realizaciones de la presente invención están dirigidas a la cuantificación de melastatina, tiñendo tantos núcleos de melanocitos normales (melanocitos procedentes de la capa basal de células epiteliales) considerados como núcleo de referencia, como núcleos de melanocitos anómalos (melanocitos procedentes de los focos del tumor). Los resultados de tal análisis cuantitativo indican si el gen está regulado a la baja o bien se expresa normalmente, en los núcleos anómalos. Sin embargo, la eficiencia del análisis cuantitativo depende estrechamente de la metodología del análisis de imagen, que debe considerar y llevar a cabo la segmentación de los núcleos de melanocitos, así como el análisis colorimétrico de los tintes específicos utilizados en el protocolo.

La plataforma para la evaluación de muestras biológicas a través del análisis de imagen se está desplazando de forma incremental, desde un analizador de imagen de propósito general a una "estación de trabajo de patología" dedicada, a menudo altamente especializada. Tales estaciones de trabajo están típicamente diseñadas para facilitar el trabajo rutinario, que a menudo combina muchas de las herramientas necesarias para proporcionar a un patólogo la información necesaria para determinar los mejores resultados posibles. Un ejemplo de tal estación de trabajo se ilustra en la figura 1, como un sistema de vídeo-microscopia cuantitativa indicado por el número 100, acorde con una realización de la presente invención. El sistema 100 comprende generalmente un microscopio 150, que tiene una fuente de luz 200 y un objetivo de amplificación 250, una cámara 300, un dispositivo informático 350, y la conexión 400 de transmisión de datos entre la cámara 300 y el dispositivo informático 350. El microscopio 150 puede constar, por ejemplo, de un microscopio Axioplan (o Axiovert) fabricado por ZEISS, Alemania, o un microscopio similar que tenga una fuente de luz de campo claro. La cámara 300 acopla operativamente con el microscopio 150, y una realización comprende una cámara RGB 3CCD, tal como por ejemplo el modelo DC-330E Dage - MTI RGB 3CCD producido por Dage-MTI, Inc., Michigan, o una cámara RGB similar. Típicamente, tal cámara 300 incluye además un registrador visualizador de tramas (no mostrado) para facilitar la captura de imágenes siendo por conveniencia, tanto la cámara 300 como el registrador visualizador de tramas, aludidos aquí como "cámara 300". En algunos casos, tanto la cámara 300 con el microscopio 150 pueden reemplazarse, por ejemplo mediante un escáner plano lineal que tenga un chip 3CCD o equivalente, y una fuente de iluminación controlada. Por ejemplo, puede utilizarse un escáner modelo Super CoolScan 4000 Ed, fabricado por Nikon Corporation, para la generación de imágenes a baja resolución. Nótese que, aunque la presente invención contempla diferentes configuraciones del sistema 100 necesario, la presente invención se revela aquí en términos de una cámara 300 y un microscopio asociado 150. Por consiguiente, una persona cualificada en el arte comprenderá y apreciará las capacidades y las metodologías asociadas con estas diferentes configuraciones, para realizar la presente invención tal como se detalla aquí.

La cámara 300 está configurada generalmente para capturar una imagen 450 de una muestra de 500, a través del dispositivo de aumento 250 (cuando se utiliza un escáner plano, la imagen 450 es capturada a través de lentes internas), donde la imagen 450 puede comprender además una imagen digital que tiene correspondientes datos de imagen (aquí aludidos colectivamente como "la imagen 450"). Generalmente la imagen 450 se captura como un todo, donde los correspondientes datos de imagen comprenden imagen del campo visual en el canal rojo 550, el canal verde 600, y el canal azul 650. La conexión 400 de transmisión de datos está configurada para ser capaz de transmitir la imagen 450 al dispositivo informático 350, donde el dispositivo informático 350 está además configurado para ser capaz de analizar la imagen 450, con respecto a cada uno de los canales rojos 550, verde 600 y azul 650.

Cuando el sistema de vídeo-microscopía cuantitativa 100 de la presente invención evalúa una expresión de melastatina, debe cumplir ciertos requisitos para proporcionar resultados adecuados, tal como se describirá aquí con mayor detalle. Por ejemplo la tinción de muestras histológicas gruesas puede inducir no linealidades en la relación entre la intensidad de la tinción y la concentración de proteínas en la muestra. En tal caso, la densidad óptica integrada de la muestra no proporcionará datos colorimétricos estables, reproducibles, y por tanto debe utilizarse una medida alternativa. Adicionalmente, en general hay presentes 3 generadores cromáticos en las muestras histológicas: el marcador (BCIP-NBT), un colorante morfológico (NFR, rojo rápido nuclear) y una melanina natural. Los tres generadores cromáticos deben ser tenidos en cuenta por diversas razones. En primer lugar, para llevar a cabo un análisis cuantitativo del marcador del tumor, cuando se utiliza un colorante para el análisis morfológico y el reconocimiento de melanocitos, se requiere un análisis espectral específico para distinguir y cuantificar tanto el marcador como el colorante. Además, cuando el colorante se aplica a la muestra después del marcador, las células muy teñidas con el marcador no se tiñen tan fácilmente con el colorante. Además la melastatina se utiliza como marcador de regulación a la baja, y debido al elevado ruido de fondo, a menudo es problemático discriminar ruido de fondo inespecífico, respecto de la tinción específica del marcador, regulada a la baja. Adicionalmente, la melanina (marrón) puede ser además una fuente de interferencia durante la evaluación del marcador en regiones de tinción particularmente intensa.

Así, de acuerdo con un aspecto ventajoso de la presente invención, un análisis espectral de la expresión de melastatina está basado en el cálculo de un modelo de cada tinte utilizado en el protocolo. Tal como se ha descrito previamente, en una expresión de melastatina hay implicados típicamente tres diferentes componentes espectrales: el colorante (NFR); el marcador de melastatina (BCIP-NBT); y un pigmento natural (melanina) de la muestra histológica. Por consiguiente, las propiedades espectrales de cada uno de los diferentes componentes espectrales son estudiadas primero por separado con el sistema de vídeo-microscopia 100 de la presente invención, por ejemplo utilizando un portaobjetos histológico por cada tinte. Es decir, en la fase de prueba del sistema de vídeo-microscopía 100 se presume que, si está analizándose sólo un tinte por parte del sistema 100, entonces el tinte estará distribuido de forma homogénea y continua en un espacio de color RGB. Una vez que está preparada la muestra histológica 500 para un tinte concreto, se captura una imagen 450 de la muestra 500, con la cámara 300 a través del objetivo de aumento 250. La imagen digital resultante 450 es un conjunto bidimensional de píxeles (2D), ordenado, en el que cada píxel está definido por un triplete RGB. Es decir, si se utiliza un dispositivo de adquisición de imagen en color de 8 bits, tal como por ejemplo una cámara 3CCD RGB de 8 bits 300, cada píxel puede definirse mediante una intensidad medida de la luz I, o transmitancia, de la muestra 500 en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, teniendo la luz medida 256 valores posibles que varían entre límites de 0 y 255.

Cuando ha sido capturada al menos una imagen 450 de una muestra histológica 500 para cada tinte, puede entonces reconstruirse las imágenes artificiales para cada tinte en una muestra desconocida separada, teñida de acuerdo con el mismo protocolo, como se discutirá en mayor detalle más abajo. Típicamente, la imagen 450 de la muestra histológica 500 para cada tinte, es analizada por el dispositivo informático 350 en una base por píxel, al objeto de proporcionar un correspondiente conjunto de datos de tripletes RGB. Después puede establecerse un espacio de color RGB, el espacio de color RGB comprendiendo un cubo que tiene un eje para cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, con cada eje extendiéndose desde 0 hasta 255, para un dispositivo 300 de adquisición de imágenes de 8 bits. En consecuencia, se ha encontrado que cuando se representa los tripletes RGB en el espacio de color RGB, para ilustrar la distribución espacial del tinte dentro de tal espacio, el tinte ocupa un camino característico que va desde el negro (0% de transmitancia o no intensidad, en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650) al blanco (100% de transmitancia o intensidad total, en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650) en el espacio de color RGB. Nótese que las propiedades RGB correspondientes al 0% de transmitancia y al 100% de transmitancia, pueden determinarse fácilmente para un sistema concreto, y por consiguiente típicamente comprenden valores conocidos. También se ha encontrado que, el mismo análisis llevado a cabo para muestras histológicas adicionales 500 teñidas con el mismo tinte, revela un patrón espectral reproducible, más en concreto el camino característico 940 para tal tinte, en el espacio de color RGB (por ejemplo, véase la figura 4A para NFR y la figura 4B para BCIP-NBT). Así, puede almacenarse un patrón espectral para el respectivo tinte, en una tabla de correspondencia también aludida aquí como tabla de consulta (LUT, look-up table), que describe las propiedades RGB de un tinte para transmitancias entre el 0 y el 100%, en el espacio de color RGB.

Una típica tabla de correspondencia para un tinte, en un sistema de adquisición de imágenes de 8 bits, puede definirse por ejemplo con 256 filas y 4 columnas, donde cada fila 900 representa un incremento de intensidad o transmitancia. Tres de las columnas 905, 910, 915 representan cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, mientras que la cuarta columna 920 que sirve para indexación, como se describe más abajo. Cada triplete RGB para el correspondiente píxel en la imagen 450 es introducido después en la tabla de correspondencia, e indexado de acuerdo con el mínimo valor de intensidad o transmitancia del triplete, la mínima intensidad correspondiendo al canal más absorbente (de menor intensidad o transmitancia) para el tinte concreto. Además, para cada triplete RGB añadido a la tabla de correspondencia en la apropiada fila indexada 900, los valores de intensidad del triplete RGB en los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, son añadidos a los respectivos valores de intensidad para cualquier triplete RGB ya insertado en la fila indexada 900. Adicionalmente, para todo triplete RGB añadido a la fila indexada 900, el índice en la cuarta columna 920 de la tabla de correspondencia se incrementa en uno, al objeto de seguir el número de píxeles definidos por la misma fila indexada 900 en la tabla de correspondencia. Este proceso se muestra, por ejemplo, en las figuras 2A-2C y puede ser aplicado, por ejemplo, a un gran conjunto de imágenes para cada tinte, al objeto de proporcionar una caracterización espectral extensiva y precisa, de ese tinte. Así, una vez que todos los píxeles en el conjunto de imágenes para tal tinte, han sido evaluados e insertados en la tabla de correspondencia de acuerdo con el correspondiente triplete RGB para el respectivo píxel, la tabla de correspondencia está terminada. A continuación, como se muestra en la figura 3, es normalizada la tabla de correspondencia terminada, donde para cada fila indexada 900 el valor de intensidad sumado en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650 es dividido por el número de tripletes RGB recogidos en la fila, como se indica mediante el valor del índice en la cuarta columna 920 de la tabla de correspondencia. Así, los tripletes RGB normalizados 925, 930, 935 en la tabla de correspondencia, constan de una línea representativa 945 a través del espacio de color RGB para el tinte concreto (por ejemplo, véase la figura 4A para NFR y la figura 4B para BCIP-NBT), donde la línea representativa 945 se extiende a lo largo del camino característico 940 determinado previamente para tal tinte.

Una vez normalizadas, las filas indexadas incluirán generalmente tripletes RGB normalizados para la respectiva fila. Sin embargo, en algunos casos algunas de las filas indexadas pueden perderse un triplete RGB puesto que, por ejemplo, una fila indexada en la tabla de correspondencia puede no estar necesariamente representada por un correspondiente píxel en la imagen. Es decir, puede haber casos en los que ningún triplete RGB para un píxel en la imagen, satisfaga el criterio para ser añadido a una fila concreta. Además en algunos casos puede establecerse un criterio de importancia, al objeto de eliminar artefactos debidos a una representación por defecto en la imagen. Por ejemplo, una fila indexada en la tabla de correspondencia puede considerarse significativa solo si en tal fila se ha indexado 1000 o más píxeles de la imagen. Si la fila indexada deja de satisfacer el criterio de importancia, entonces puede descartarse cualesquiera valores en las tres columnas R, G y B, o bien ser retirados del modelo para ese tinte. Por consiguiente, en casos en los que una fila indexada de la tabla de correspondencia normalizada, no incluye un triplete RGB normalizado, puede utilizarse una interpolación al objeto de determinar un triplete RGB aproximado para cualquier fila que carezca de un triplete RGB normalizado. Típicamente es pequeño el número de tripletes contiguos RGB perdidos o no significativos, y así puede implementarse, por ejemplo, una interpolación polinómica cúbica (véase por ejemplo "Numerical Recipes in C: The Art of Scientific Computing" (ISBN 0-521-43108-5), páginas 113-117, Copyright (c) 1988-1992 por Cambridge University Press. Programs Copyright (c) 1988-1992 por Numerical Recipes Software) al objeto de obtener un triplete RGB aproximado para una fila vacía, tanto desde un triplete RGB normalizado conocido en una fila indexada de transmitancia superior, como desde un triplete RGB normalizado en una fila indexada de transmitancia menor. Sin embargo, una persona cualificada en el arte comprenderá que son igualmente aplicables y eficaces otras formas de interpolación, dependiendo de los requisitos de la aplicación concreta. Por ejemplo en algunos casos puede utilizarse una interpolación lineal. Por consiguiente, una vez que se ha completado la correspondiente tabla el respectivo tinte está modelado en grado suficiente, y el modelo es válido para su uso en otras aplicaciones, tal como se detalla más abajo.

De acuerdo con una realización ventajosa de la presente invención, una vez que se ha modelado los tintes concretos de acuerdo con el procedimiento descrito arriba, puede combinarse dos o más de estos modelos para tintes individuales, al objeto de corresponder con el protocolo de tinción utilizado para una expresión concreta. Así, por ejemplo para una expresión de melastatina puede combinarse modelos individuales para el colorante (NFR) y el marcador de melastatina (BCIP-NBT), con el propósito de facilitar la evaluación de una muestra histológica desconocida, teñida de acuerdo con este protocolo. Generalmente, la respectiva tabla de correspondencia para cada tinte define valores de transmitancia que varían desde negro (transmitancia del 0%) a blanco (transmitancia del 100%), con etapas incrementales lineales (1/256% en transmitancia, para un dispositivo de adquisición de imágenes de 8 bits/canal) entre ambos. Así, como se ha descrito previamente la LUT para un sólo tinte es la línea representativa 945 que se extiende a través del camino característico 940 para tal tinte, en el espacio de color RGB, donde la línea representativa 945 puede ser expresada en una escala de una dimensión (1D), resumiendo la distribución espacial del tinte en el espacio de color RGB, desde el 0 al 100% de transmitancia (por ejemplo, véase la figura 5A para NFR y la figura 5B para BCIP-NBT).

Para un protocolo de tinción que especifique una cierta combinación de tintes, puede llevarse a cabo un modelo de tal protocolo para tal combinación de tintes, a partir de la adición ortogonal de las LUTs para los respectivos tintes, como se muestra por ejemplo en la figura 5C. Por consiguiente tal modelo se definirá teniendo una dimensión por tinte. Generalmente, la suma de por ejemplo dos tintes tales como los utilizados en una expresión de melastatina, puede conseguirse utilizando la ley de Lambert-Beer para generar los tripletes RGB apropiados, para la combinación de tintes concreta. Así, de acuerdo con un concreto aspecto ventajoso de la presente invención, el sistema 100 está configurado para analizar la muestra de acuerdo con la ley de Lambert-Beer. La ley de Lambert-Beer describe en general una proporcionalidad que puede ser observada, entre la concentración de moléculas en una solución (la concentración de la "especie molecular" o de la "muestra") y la intensidad de la luz medida a través de la solución, y típicamente se expresa como:

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donde OD es la densidad óptica de la solución, \varepsilon es una constante de proporcionalidad denominada extinción molar o coeficiente de absorción, l es el grosor de la muestra y C es la concentración de la especie molecular. El coeficiente de absorción \varepsilon es específico de la especie molecular, y se expresa típicamente en unidades de 1\cdotmol^{-1}\cdotcm^{-1}.

Esta relación de proporcionalidad definida como la ley de Lambert-Beer, ha sido verificada bajo diversas condiciones incluyendo, por ejemplo, iluminar la muestra con luz monocromática, baja concentración molecular dentro de la muestra, generalmente no fluorescencia ni heterogeneidad de respuesta luminosa (fluorescencia y difusión despreciables) de la muestra, y ausencia de fotosensibilidad de la muestra. Además, otro requisito para el análisis acorde con la ley de Lambert-Beer incluye, por ejemplo, la correcta iluminación Koehler de la muestra bajo el microscopio. La iluminación Koehler está disponible en muchos microscopios modernos, proporcionando una iluminación uniforme de la muestra en el plano de la imagen, y permitiendo un control eficaz del contraste. La iluminación Koehler es crítica para ciertos procesos, tales como por ejemplo el análisis de densitometría. Típicamente una iluminación Koehler correcta se proporciona mediante, por ejemplo, un sistema de iluminación en dos plataformas para el microscopio, en el que se genera la imagen de la fuente en la abertura del condensador sub-plataforma mediante un condensador auxiliar. A su vez, el condensador sub-plataforma forma una imagen del condensador auxiliar sobre el objeto. También puede colocarse un diafragma del iris en cada condensador, donde el primer iris controla el área del objeto a ser iluminado y el segundo iris varía la abertura numérica del haz de iluminación.

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La ley de Lambert-Beer tiene una propiedad aditiva, de forma que si la muestra comprende varias especies moleculares que absorben la luz, por ejemplo s_{1} y s_{2}, con respectivas concentraciones C_{1} y C_{2}, el OD de una muestra de grosor I (donde I_{1} = I_{2} = I para la muestra, como se indica en la siguiente solución) puede expresarse como:

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Esta situación ocurre, por ejemplo, en un análisis biológico en el que una "escena", un campo visual, o una parte de la muestra, han sido teñidos con dos tintes, consistentes en un tinte marcador para delimitar la especie molecular de interés y un colorante para teñir el resto de la muestra.

Una vez que el microscopio 150 ha sido configurado para proporcionar iluminación Koehler para la adquisición de imagen, y las aberraciones cromáticas han sido tratadas, puede aplicarse la propiedad aditiva de la ley de Lambert-Beer para separación del generador cromático. Por ejemplo, la propiedad aditiva de la ley de Lambert-Beer puede extenderse a una situación en que la escena es analizada en un entorno de color, por ejemplo generado por una cámara RGB, separado en canales rojo, verde y azul. En tal caso, el tinte marcador (o "tinte 1") exhibe coeficientes de absorción \varepsilon_{1r}, \varepsilon_{1g} y \varepsilon_{1b}, respectivamente en los canales rojo, verde y azul. Nótese que en algunos casos, el análisis de la imagen en cada uno de los canales rojo, verde y azul es equivalente a analizar una representación roja de la imagen a través del espectro rojo, una representación verde de la imagen a través del espectro verde, y una representación azul de la imagen a través del espectro azul. Por consiguiente, el colorante (o "tinte 2") exhibe coeficientes de absorción \varepsilon_{2r}, \varepsilon_{2g} y \varepsilon_{2b}, respectivamente en los canales rojo, verde y azul. Por lo tanto, de acuerdo con la propiedad aditiva de la ley de Lambert-Beer, el análisis de la muestra en el entorno RGB conduce a tres ecuaciones para la densidad óptica de esta:

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donde OD_{r}, OD_{g} y OD_{b} representan las densidades ópticas de la muestra, medidas respectivamente en los canales rojo, verde y azul. Es más, en el caso de una complejidad incrementada en la preparación de la muestra, tal como por ejemplo el tratamiento de la muestra con tres tintes diferentes, las ecuaciones (3), (4) y (5) quedan como:

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En tal situación, los tres tintes pueden constar por ejemplo de un tinte marcador y dos colorantes, o de dos tintes marcadores y un colorante, o incluso de tres tintes marcadores diferentes. Por ejemplo siguiendo con la aplicación de la expresión de Melastatina^{TM}, los tres tintes comprenden el colorante (Rojo Rápido Nuclear), el marcador (BCIP-NBT) y el pigmento natural (melanina) de la muestra histológica. No obstante, las personas cualificadas en el arte comprenderán que esta propiedad demostrada de la ley de Lambert-Beer puede expandirse para incluir una pluralidad incluso mayor de combinaciones de tintes, de acuerdo con el espíritu y alcance de la presente invención. Nótese además que, en algunos casos, puede excluirse inicialmente uno o más tintes respecto del análisis descrito, y después ser caracterizados y añadidos al modelo para combinación de tintes si fuera necesario. Por ejemplo algunas muestras pueden caracterizarse por tener pocas células que expresen melanina, o por estar estas localizadas. Por consiguiente, para muchas imágenes de la muestra puede ser suficiente un modelo que consista sólo en el colorante (rojo rápido nuclear) y el marcador (BCIP-NBT), para analizar tales imágenes. Sin embargo, donde hay presentes células expresando melanina el modelo de dos tintes puede complementarse con un tercer componente de tinte correspondiente a la melanina, el tercer componente de tinte obteniéndose e incorporándose al modelo como se ha descrito aquí. La suficiencia del modelo y de los ejemplos concretos que requieren la incorporación de componentes de tinte adicionales, se discute adicionalmente más abajo, con respecto al concepto de determinación de error entre respectivos píxeles de la imagen de la muestra y el modelo de tinte aplicable.

Un aspecto particularmente ventajoso de la presente invención, utiliza un dispositivo de formación de imágenes en color, de captura rápida, tal como por ejemplo una cámara 3CCD RGB, para la formación multiespectral de imágenes de los marcadores, sobre tres canales distintos (rojo, verde y azul), al objeto de facilitar la formación multiespectral de imágenes de marcadores biológicos. Por consiguiente, la aplicación de la ley de Lambert-Beer a un sistema de microscopía digital 100 de la presente invención, asume que la ley de Lambert-Beer puede también expresarse como:

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para una imagen digital 450 de la muestra 500, que comprende una pluralidad de píxeles, dispuestos por ejemplo de acuerdo con un sistema cartesiano de coordenadas, donde (x, y) significa un píxel concreto de la imagen 450, OD_{(x, y)} es la densidad óptica de la muestra 500 en el píxel, I_{(x, y)} es la transmitancia o intensidad de la luz medida de la muestra 500 en el píxel, e I_{0(x, y)} es la intensidad de la en la fuente de luz 200, medida sin ningún objeto intermedio absorbente de luz, tal como la muestra. Una persona cualificada en el arte apreciará además, que la relación logarítmica descrita en la ecuación (9) puede ser expresada en diversas bases, dentro del espíritu y alcance de la presente invención. Por ejemplo, la relación puede ser expresada en base 2, en base 10 o en logaritmos naturales, donde las diversas bases están relacionadas por respectivas constantes de proporcionalidad (por ejemplo, ln(x) o log_{e}(x) = 2,3026 \cdot log_{10}(x)). Así, la constante de proporcionalidad puede considerarse de forma apropiada cuando se dibuje comparaciones relativas, en intensidades de luz. Además, en la microscopía cuantitativa acorde con la ley de Lambert-Beer se conserva la relación de proporcionalidad entre la densidad óptica OD de la muestra y las concentraciones de tinte. Por lo tanto, para una muestra preparada 500 examinada por el sistema 100, la relación apropiada se expresa como:

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Cuando se utilice, por ejemplo, una cámara RGB de 8 bits 300 en el sistema 100, la intensidad de la luz transmitida a través de la muestra en cada canal, puede expresarse como 2^{8} (= 256) valores entre 0 y 255. Por ejemplo, la intensidad inicial I_{0} de la fuente de luz 200, que corresponde una transmitancia del 100%, se expresará preferentemente en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, como un valor próximo a 255, representando el valor más brillante posible en cada canal. La cámara 300 y/o la fuente de luz 200 pueden ajustarse correspondientemente de forma que, en ausencia de la muestra, una luz "blanca" pura tendrá un valor de intensidad de 251 en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, correspondiendo a una transmitancia del 100%. A la inversa, en ausencia de luz, lo cual en general corresponde a una transmitancia que se aproxima al 0%, una "imagen negra" tendrá un valor de intensidad próximo a 0 en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650. En cualquier píxel, la intensidad inicial I_{0} de de la fuente de luz 200, correspondiente a una transmitancia del 100% se expresa, por tanto, como la diferencia entre el valor de intensidad medido en presencia de la fuente de luz 200, y el valor de intensidad medido en ausencia de la fuente de luz 200, para cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650. Debido a que la intensidad de la fuente de luz 200 puede variar espacialmente a través de la imagen 450, o sobre el campo visual medido, y debido a que el objetivo de aumento 250 u otros componentes típicos pueden absorber luz de forma heterogénea, la transmitancia del 100% puede representarse por diversas intensidades diferenciales sobre el campo visual medido. Sin embargo, puesto que la densidad óptica OD de la muestra se expresa como el logaritmo de la razón entre la transmitancia de luz en ausencia de la muestra (intensidad inicial I_{0}) y la transmitancia de luz en presencia de la muestra (I), en buena medida la densidad óptica OD es insensible a pequeñas variaciones en las intensidades diferenciales sobre el campo visual medido. Puesto que la fuente de luz 200 permanece sustancialmente constante en el tiempo, o puede ser reevaluada fácilmente, la medida de la intensidad de luz para cualquier píxel, en ausencia de la muestra, puede traducirse por la transmitancia I en tal píxel, y en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650. Una vez que se ha determinado los valores para la intensidad inicial I_{0} y la transmitancia I, puede calcularse la densidad óptica OD.

En el caso de que un protocolo que incluya dos tintes, tal como por ejemplo la expresión de melastatina, el modelo para la combinación de los dos tintes es un mapa en 2D correspondiente a la suma ortogonal de la LUT para un tinte mas la LUT para el segundo tinte, estando cada LUT expresada como una escala de una dimensión (1D) (figuras 5A y 5B) que describe la línea representativa 945, que se extiende a través del camino característico 940 para tal tinte en el espacio de color RGB, desde el 0% hasta el 100% de transmitancia. Así, cada píxel en una localización (x, y) en el mapa 2D (figura 5C) corresponde a la suma del tinte 1 (o sea NFR) y el tinte 2 (o sea BCIP-NBT). Es decir, cada píxel en una localización (x, y) del mapa 2D, corresponde a la combinación de un triplete RGB desde la LUT del tinte 1, en una fila indexada x, con un triplete RGB desde la LUT del tinte 2, en una fila indexada y. Por consiguiente, el triplete RGB resultante para el píxel en (x, y) en el mapa 2D, puede expresarse como:

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donde R_{(x, y)}, G_{(x, y)} y B_{(x, y)} son transmitancias, respectivamente en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650. Sin embargo, aunque las transmitancias no exhiben generalmente una propiedad aditiva, las densidades ópticas sí exhiben una propiedad aditiva. Por consiguiente para un sistema de 8 bits/canal, las densidades ópticas en cada uno de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, para el píxel en (x, y) en el mapa 2D, pueden expresarse como:

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Así, puesto que todo píxel en el modelo 2D está definido por un triplete RGB determinado a partir de la combinación de un triplete RGB apropiado para cada uno de los dos tintes, el modelo 1D de cada tinte así como el modelo 2D de la combinación de los dos tintes, pueden visualizarse por separado en un espacio de color RGB 3D como se muestra en la figura 4C.

Después haberse completado el modelo para la combinación de tintes utilizados para el protocolo concreto, el modelo puede entonces ser aplicado a muestras histológicas desconocidas, teñidas de acuerdo con el protocolo. Por consiguiente se utiliza después el sistema 100, para capturar una imagen 450 de una muestra histológica desconocida 500 acorde un protocolo, tal como la expresión de melastatina, para el que se ha desarrollado previamente un modelo apropiado. Como con el procedimiento del modelado de tintes, la imagen 450 de la muestra histológica desconocida 500 es analizada sobre una base por píxel. Así, cada píxel P_{i} en la imagen 450 de la muestra histológica desconocida 500 está definido por un triplete RGB (R_{i}, G_{i}, B_{i}), y un aspecto ventajoso concreto de la presente invención, asume que un semejante píxel P_{i} puede estar correlacionado con un color P_{m} definido por un triplete RGB (R_{m}, G_{m}, B_{m}) en el modelo. El color P_{m} corresponde a una combinación de tintes, que minimiza la distancia euclídea entre el píxel Pi y el modelo en el espacio de color RGB, como se muestra en la figura 6. De ese modo, Pm se determina mediante minimizar la solución de d(P_{i}, P_{m}) sobre el modelo, donde:

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Además, la distancia euclídea minimizada entre P_{i} y P_{m} corresponde a un error entre la imagen real y el modelo, e indica así la eficiencia del modelo para describir la imagen real. Tal concepto puede mostrarse gráficamente en el espacio de color RGB y puede utilizarse para evaluar la muestra, como se ve por ejemplo en la figura 7. Más en concreto, el error medio de los pixeles que representan un objeto específico (es decir la máscara de un núcleo) dentro de la imagen, puede utilizarse para bien aceptar o rechazar el modelo para tal objeto específico. De acuerdo con este procedimiento puede identificarse los objetos dentro de la imagen, como inclusivos de otros tintes respecto de los utilizados para construir el modelo. Por ejemplo, en el caso de la expresión de melastatina, un error medio significativo en una parte de la imagen de la muestra puede indicar que la estructura que está estudiándose en la imagen comprende pigmento natural (melanina), que no se consideró en el desarrollo del modelo de los otros dos tintes, puede indicar contaminación, o puede indicar un artefacto no identificado. Por contraste, un error pequeño o inexistente puede indicar que la parte de la muestra que está siendo estudiada incluye tejido que está tenido por cualquiera, o la totalidad, de las tintas utilizadas para desarrollar el modelo para ese protocolo. Es más, por ejemplo un error constante significativo encontrado a través de la totalidad de los píxeles en la imagen de una muestra histológica desconocida, puede indicar que el modelo para el protocolo está desplazado en relación con la muestra histológica desconocida. En otros casos, un error significativo a través de la totalidad de los píxeles de la imagen, puede indicar que se ha utilizado uno o más tintes inapropiados para teñir la muestra histológica desconocida.

En casos en los que es identificable la fuente de un error medio significativo, por ejemplo a partir de un examen de la imagen, el modelo de tinte puede complementarse con la adición de un componente de tinte adicional, al objeto de proporcionar un modelo mejorado para analizar la imagen, o para analizar un objeto dentro de la imagen. Por ejemplo algunas imágenes pueden incluir células que expresen melanina, la cuales pueden ser identificadas como tales por parte de una persona cualificada en el arte viendo tales imágenes. Por ejemplo se muestra una imagen semejante en la figura 13A, donde el componente de melanina puede estar indicado por un componente (a saber, pardo o sombreado) de la imagen. Por consiguiente, para un modelo de tinte que comprende solo el colorante (rojo rápido nuclear) y el marcador (BCIP-NBT), una distribución de error tal como la que se muestra en la figura 13B indica el componente de melanina (que podría no estar incluido en el modelo de tinte), como un componente rojo o bien oscuro, mientras que un componente azul o bien claro (a saber, el fondo blanco) indica áreas de la imagen descritas en grado suficiente por el modelo de dos tintas, exhibiendo poco o ningún error para tales píxeles. Es decir, los puntos negros indican componentes no descritos por el modelo de dos tintas, mientras que el fondo blanco indica los componentes que están descritos por el modelo de dos tintas. En tales casos, una muestra o fuente de melanina diferente puede caracterizarse como se detalla aquí, y después añadirse los resultados al modelo de dos tintas existente. Es decir, por ejemplo la expresión de Melastatina^{TM} aquí descrita, puede ser analizada por un modelo de tres tintes que comprende un componente para el colorante (rojo rápido nuclear), un componente para el marcador (BCIP-NBT) y un componente para el pigmento natural (melanina), donde una imagen de la muestra histológica teñida exhibe células que expresan melanina. Un análisis de la distribución de error de la imagen mostrada en la figura 13A, con el componente de melanina añadido al modelo de dos tintes para producir un modelo de tres tintes, mostraría así una imagen de error predominantemente azul o bien clara, indicando que el modelo de tres tintes es ahora suficiente para describir la totalidad de los píxeles en la imagen. Es decir, la imagen de error sería sustancialmente blanca en su totalidad, indicando de ese modo que el modelo de tres tintes describe todos los componentes. Nótese además, que una persona cualificada en el arte apreciará que añadir el componente de tinte adicional al modelo de tintes puede conseguirse fácilmente, como se detalla aquí.

Una vez ha sido determinado un error para cada píxel de la imagen, el análisis posterior de estos errores puede proporcionar otra información útil con respecto a la imagen. Por ejemplo, para un objeto dado tal como una célula dentro de la imagen, puede integrarse los errores para los píxeles que comprenden el objeto, con el propósito de proporcionar una indicación de si está teñido con los tintes que componen el modelo, para evaluar si el objeto es válido para una ulterior valoración. En algunos casos, la imagen evaluada puede configurarse con el propósito de servir para la verificación del modelo de tinte concreto, como apreciará una persona cualificada en el arte. Además, puede estructurarse un análisis de los errores, por ejemplo con el propósito de servir para la detección de objetos, dentro de una imagen, que no están descritos por el modelo de tinte concreto, e indicar variaciones en la preparación de múltiples muestras y variaciones dentro de una sola muestra. Así, ventajosamente la evaluación del error entre la imagen y el modelo puede proporcionar información significativa y valiosa para la evaluación de la muestra, como se ha descrito aquí.

Una vez que los píxeles de la imagen de la muestra histológica desconocida han sido capturados y evaluados por el sistema 100, puede evaluarse los píxeles de acuerdo con el respectivo color correspondiente P_{m}, para determinar el triplete RGB apropiado, aportado por cada tinte en el modelo de combinación 2D (es decir (R_{BCIP}, G_{BCIP}, B_{BCIP}) y (R_{NFR}, G_{NFR}, B_{NFR})) procedente de la LUT del respectivo tinte, tal como se ha descrito y mostrado previamente mediante el ejemplo de la figura 8. Así, la imagen de la muestra histológica desconocida puede ser después visualizada como la imagen capturada, y como imágenes individuales de las que cada una representa la distribución de un respectivo tinte. Tal como se ha descrito previamente, cada tinte tiene una concentración representada por una transmitancia, que varía entre transmitancias del 0% y el 100%, estando además el rango de transmitancia representado por valores grises entre 0 y 255 para un sistema de 8 bits/canal. Así, puesto que el modelo de combinación 2D se utiliza para evaluar la imagen de la muestra histológica desconocida, siempre que un color de píxel Pm (triplete RGB) en la imagen de la muestra desconocida, no esté presente en el modelo de combinación de tintes, lo que se manifiesta en el cálculo de un error mayor que cero, la solución propuesta tiene que ser verificada con respecto a la teoría de densidad óptica y la ley de Lambert-Beer. Es decir, cuando un valor RGB para un píxel en la imagen de la muestra histológica desconocida, que no corresponde al modelo de combinación de tintes, tal valor RGB puede incluir algún ruido, por ejemplo procedente de la muestra histológica, de la cámara, de los sistemas ópticos, o de otras fuentes de ruido. Adicional o alternativamente, el valor RGB errado para el píxel puede indicar que el valor RGB se generó a partir de una combinación de tintes diferente, en comparación con el modelo de combinación de tintes.

Por consiguiente para asegurar la solidez y adecuación del modelo de combinación de tintes, un aspecto ventajoso de la presente invención utiliza un enfoque concreto como el mostrado en la figura 9. Primero, el espacio del modelo de combinación de tintes investigado durante la búsqueda de la combinación óptima de tintes, se restringe a una región limitada 950 con respecto al píxel investigado de la imagen de la muestra histológica desconocida. Más en concreto, la región limitada 950 en la que determinar la combinación de tintes óptima para el píxel investigado, está definida por la fila indexada LUT 955, 960 para cada tinte individual, que separa valores RGB que tienen transmitancia igual o mayor con respecto al píxel investigado, respecto de valores RGB que tienen una transmitancia menor con respecto al píxel investigado, en cualquiera de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650. Es decir, la fila indexada LUT que define la región limitada 950 para el respectivo tinte, no puede tener una transmitancia en cualquiera de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, que sea menor que la transmitancia en el correspondiente canal del píxel investigado. La región limitada 950 se define así sobre la premisa de que la búsqueda de la combinación óptima de tintes, no puede realizarse entre concentraciones de tintes para cualquier tinte, en cualquiera de los canales rojo 550, verde 600 y azul 650, que pueda exhibir individualmente una densidad óptica superior que el píxel investigado. Así, la región limitada 950 puede indicarse también sobre un mapa de error en el espacio de color RGB como se muestra en la figura 10, ilustrando para cada píxel la distancia del píxel investigado al modelo de combinación de tintes. Por lo tanto, resolver la combinación óptima de tintes para cada píxel de imagen de la muestra histológica desconocida, facilita por ejemplo la visualización y cuantificación de la cantidad de cada tinte (colorante, marcador o pigmento natural) distribuido sobre la imagen. Por ejemplo la imagen de la muestra representada en la figura 11, puede mostrarse como una imagen artificial de solo uno de los tintes componentes (es decir, solo NFR o solo BCIP-NBT). Tales imágenes artificiales para cada uno de los tintes componentes se reconstruyen típicamente sobre una base por píxel, a partir de la LUT para cada respectivo tinte. Es decir, la imagen artificial para tal componente único de tinte se construye sobre una base por píxel, a partir del valor real de transmitancia en cada uno de los canales rojo, verde y azul, de la fila de índice apropiado de la LUT para tal tinte, donde la fila de índice apropiado para el respectivo píxel corresponde a la contribución de tal tinte, determinada a partir de la combinación óptima de tintes para tal píxel. Alternativamente, la imagen original (figura 11) puede mostrarse como una imagen artificial en nivel de grises, de solo uno de los tintes componentes (es decir, solo NFR o solo BCIP-NBT). Tales imágenes artificiales en nivel de grises se reconstruyen también típicamente en una base por píxel, a partir de la LUT para cada respectivo tinte. Sin embargo, en estos casos la imagen artificial en nivel de grises para el único tinte componente, se construye sobre una base por píxel a partir de la fila de índice apropiado de la LUT, para tal tinte, donde la fila de índice apropiado para el respectivo píxel corresponde a la contribución de tal tinte, determinada a partir de la combinación óptima de tintes para tal píxel. Más en concreto, como se ha descrito previamente, la fila del índice representa el canal RGB con la mínima transmitancia el cual, cuando se combina con la intensidad inicial I_{0} permite que el píxel concreto sea expresado en términos de una densidad óptica OD, con la imagen artificial en nivel de grises estando construida en correspondencia, como apreciará una persona cualificada en el arte. Además una persona cualificada el arte apreciará, por ejemplo, que la subsiguiente cuantificación de cada componente de tinte dentro de la imagen, u otro análisis cualitativo o cuantitativo de una imagen, puede adoptarse de forma complementaria, una vez que se ha determinado las imágenes artificiales utilizando diversas formas de procesamiento de imagen u otras técnicas utilizadas comúnmente en análisis de imagen, y tal subsiguiente análisis, si bien no se describe aquí en detalle por brevedad, se considerará dentro del alcance de las realizaciones de la invención aquí presentada.

Como se ha discutido previamente, si bien aquí se describe realizaciones de la presente invención a modo de ejemplo en términos de un sistema de vídeo-microscopía, una persona cualificada en el arte comprenderá y apreciara que los conceptos aquí descritos pueden tener una extensa aplicabilidad a sistemas no microscópicos. Por ejemplo, los conceptos aquí descritos pueden ser aplicables donde pueda caracterizarse por separado uno o más componentes de color, de forma que pueda recogerse información útil a partir de la distribución de tales componentes de color con respecto a una muestra desconocida que comprenda los componentes de color. Tales casos pueden presentarse, por ejemplo, cuando uno o más líquidos puedan caracterizarse como se revela aquí, y tales caracterizaciones ser después aplicadas a la determinación de las características de una solución líquida desconocida que comprenda los líquidos individuales conocidos, tales líquidos componiéndose por ejemplo de pinturas o tintes. En un sentido más general, los conceptos aquí descritos pueden ser aplicables cuando pueda utilizarse la caracterización de imagen digital de los componentes individuales, para analizar una imagen de una muestra desconocida que puede no necesariamente componerse de los componentes individuales conocidos, en la que puede obtenerse mucha información a partir de la comparación de la muestra desconocida con el modelo seleccionado, tal como apreciará una persona cualificada en el arte.

Como resultado de las técnicas de identificación de tintes, que utilizan generación de imágenes de vídeo en color como se ha descrito aquí previamente, se consigue otros aspectos ventajosos de la presente invención. Por ejemplo puede generarse una imagen artificial del campo visual, en un espacio de color RGB o en niveles de grises, como una imagen en vivo o sustancialmente en tiempo real, o una imagen fija, para combinaciones de los tintes que comprenden un marcador y/o un colorante, utilizados para el protocolo de tinción de la muestra. Más en concreto, puede producirse un imagen del campo visual que presente la muestra como afectada por la totalidad de los tintes, la muestra como afectada por uno o más de los tintes marcadores, o la muestra como afectada por el colorante. Por consiguiente, puesto que los tintes utilizados para preparar la muestra están caracterizados por el sistema, las capacidades del sistema pueden extenderse, de forma que por ejemplo pueda escanearse automáticamente la muestra o el campo visual, al objeto de detectar una región específica de interés identificada por las características de un tinte concreto (o por la ausencia de tales características), o para contribuir a, o facilitar, una tarea a llevar a cabo sobre tal región específica de interés.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el sistema puede configurarse para ser capaz de detectar uno o más tintes concretos que han sido previamente caracterizados por el sistema. En algunos casos, semejante tinte puede comprender por ejemplo la tinta procedente de un bolígrafo concreto, o un marcador de tinta similar que ha sido caracterizado por el sistema como teniendo características exclusivas de color, siendo estas características exclusivas de color retenidas por el sistema como una LUT correspondiente para tal tinte. Se sigue que el sistema puede ser configurado para reconocer, y responder a, partes del campo visual en el que este tinte está identificado, y que en algunos casos el marcador o los marcadores pueden comprenden una parte tangible de un sistema semejante al descrito aquí. Por ejemplo puede utilizarse uno de tales bolígrafos con el que un operador, sea un patólogo o un citotecnólogo, identifica áreas especiales de interés sobre un portaobjetos de plástico o de vidrio, que contiene la muestra. Un área especial de interés puede comprender, por ejemplo, un área de diagnóstico potencial o un área de referencia. Después el operador, utilizando el bolígrafo, puede rodear el área con una línea de tinta de ese bolígrafo. Después de procesar una serie de portaobjetos, el operador puede suministrar los portaobjetos, por ejemplo a un sistema de escaneado automático de evaluación cuantitativa. Estando configurado para detectar la tinta procedente del bolígrafo, el sistema puede entonces identificar de forma inclusiva el área de interés, correspondiente al área que está dentro de la línea de tinta, rodeada con el bolígrafo por el operador. A continuación el sistema puede procesar apropiadamente al área del portaobjetos donde, por ejemplo, un color de tinta de bolígrafo puede indicar que ha de llevarse a cabo una evaluación de diagnóstico concreta, mientras que otro color de tinta puede indicar que el área contiene un material de calibración o referencia, y solicitar al sistema la ejecución de un correspondiente procedimiento de calibración. Nótese que además de los portaobjetos, la técnica descrita puede adaptarse fácilmente para el examen otras formas de montaje de material microscópico, tales como por ejemplo placas de microtitulación, o biochips. Así, una persona cualificada en el arte apreciará que las capacidades de tales realizaciones del sistema, configuradas para reconocer las tintas o los tintes concretos, pueden extenderse a muchos procesos diferentes de escaneado automático, en los que la demarcación interactiva de áreas de interés con bolígrafos específicos, teniendo los bolígrafos diferentes tintas de color evaluadas previamente por el sistema, puede utilizarse para designar y activar automáticamente una subsiguiente evaluación u otro proceso en tal área de interés, mediante un componente apropiado del sistema o mediante otro dispositivo especificado.

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Adicionalmente, las imágenes artificiales del campo visual pueden además facilitar la presentación de los datos en una configuración que permite la identificación y selección de objetos significativos o áreas de interés, como por ejemplo imágenes fijas en un informe preparado para el diagnóstico, o con otros propósitos informativos. Es más, la imagen artificial del campo visual puede además utilizarse para facilitar la identificación y extracción de características seleccionadas de la muestra tratada. Por ejemplo puede utilizarse procesos puntuales marcados, análisis contextual y/o geo-estadísticas, para identificar y extraer características a partir de la imagen, por ejemplo basándose en un análisis de distribución espacial, de un tinte concreto. Además, tal capacidad de extracción de características permitiría, por ejemplo, que los campos visuales de interés sean clasificados, etiquetados o identificados de otro modo, o agrupados basándose por ejemplo en el contenido global de un tinte marcador dado, o de una proporción seleccionada del marcador concreto. Por ejemplo cuando pueda determinarse un criterio umbral, tal capacidad podría proporcionar la detección de eventos raros, eventos empeorando, u otros eventos importantes. Siguiendo con el proceso, los clasificadores basados específicamente en el procesamiento de imagen resultante de las imágenes específicas del tinte colorante y/o del marcador, pueden entonces ser definidos y utilizados para evaluar la presencia de ciertos tipos de célula, o para llevar a cabo diagnósticos basados en el campo visual. Además, tales clasificadores pueden abarcar usualmente otras características informativas, tales como por ejemplo detalles basados en la morfología o en la textura de las células.

Es más, se consigue otro aspecto ventajoso de la presente invención, mediante el cual el sistema es capaz de procesar los datos de imagen a una velocidad superior a aquella a la que se adquiere las imágenes. La velocidad mejorada a la que se procesa los datos de imagen puede permitir, por ejemplo, que se procese y clasifique características indicadas por un tinte marcador concreto. Por consiguiente, puede identificarse diversas condiciones basándose en criterios predeterminados. Así, puede establecerse alarmas visuales y/o sonoras, y/o ser estas mapeadas junto con el procesamiento de los datos de imagen. Así, en algunos casos la atención del operador puede dirigirse a un campo visual específico o a un objeto de interés, cuando una característica del marcador alcanza un nivel predeterminado, por ejemplo en la intensidad, o mediante su presencia en un campo concreto.

La figura 12 es una representación esquemática de una realización práctica de una configuración de sistema extendida, acorde con una realización de la presente invención. En tal implementación, el sistema 100 o estación de trabajo, está centrado en torno a un microscopio 150. El microscopio 150 puede incluir uno o más componentes de robótica que incluyen, por ejemplo, una plataforma motorizada, un mecanismo de enfoque automático, un cambiado de objetivo motorizado y un ajuste automatizado de la intensidad de la luz. El sistema 100 puede incluir además varios dispositivos de entrada, tales como por ejemplo cámaras 300a y 300b, que tienen enfoque rápido automático y están configuradas para adquirir imágenes de baja resolución y de alta resolución, un escáner lineal de base plana 310 utilizado para adquirir imágenes de baja resolución, una estación de análisis grueso 320, y un dispositivo de grabación de voz 330, todos los cuales están conectados a un dispositivo informático 350 a través de diversos enlaces 400 de transmisión de datos. La estación de trabajo 100 puede ser parte de una red de área local (LAN) 700, pero puede también estar configurada para soportar diferentes protocolos de comunicaciones, de forma que los canales de comunicación disponibles tales como por ejemplo una línea telefónica estándar, una conexión ISDN o una línea T1, puedan conectar fácilmente la estación de trabajo 100 a otros componentes o dispositivos a gran distancia, a través de una red de área extendida (WAN) 750, tal como apreciarán las personas cualificadas en el arte.

Si la estación de trabajo de patología 100 está configurada para funcionar en un entorno integrado, la conexión WAN 700 o LAN 750 puede permitir, por ejemplo, el acceso a bases de datos de referencia 800 existentes, y a sistemas de información hospitalarios (HIS, Hospital Information Systems) 850. Con tal configuración puede compararse fácilmente nuevas muestras y/o casos, con las imágenes e información anexa de casos de referencia previamente acumulados. Además, si es necesario las imágenes adquiridas de las muestras y/o los portaobjetos que están siendo examinados en la estación de trabajo 100, pueden complementarse con la historia del paciente y del caso.

En la realización de configuración extendida mostrada en la figura 12, la estación de trabajo de patología 100 está configurada especialmente para una evaluación exhaustiva de la muestra. Por ejemplo, con la información en imágenes digitales de la muestra gruesa biológica inicial, puede prepararse y procesarse imágenes de los portaobjetos preparados a partir de la muestra, tal como se describe aquí. La información del paciente y del caso, las imágenes, y la información cuantitativa resultante relativa a los componentes celulares de la muestra y a la arquitectura de la muestra (por ejemplo en el caso de muestras de tejido), también pueden ser recogidas, integradas y si es necesario almacenadas en una sola base de datos. Por ejemplo, si se necesita una primera o una segunda opinión expertas, o si el portaobjetos se utiliza para formación o para verificar el nivel de competencia, las capacidades de comunicación de la configuración extendida junto con las características de automatización del microscopio 150, pueden permitir que la estación de trabajo 100 sea utilizada como un sistema de tele-patología. Por ejemplo, las imágenes de alta resolución dirigidas a características, o a objetos de interés que caracterizan una situación discutible en un portaobjetos concreto, pueden transferirse electrónicamente al experto y/o al candidato auditado. En algunos casos, puede proporcionarse una imagen general del portaobjetos, en la que se utiliza un microscopio automatizado 150 para escanear automáticamente el portaobjetos, por ejemplo en una base campo por campo. Después, las correspondientes imágenes digitales pueden ser almacenadas en la memoria del dispositivo informático 350. Cuando se utiliza una base campo por campo, los bordes de los campos adyacentes pueden ser acoplados con precisión utilizando algoritmos de correlación, para proporcionar una sola imagen general grande, de todo el portaobjetos. Tal imagen general puede ayudar al patrón de referencia en la formación de una valoración de la información. En algunos casos el patólogo de referencia puede controlar de modo remoto la estación de trabajo 100, desde un punto remoto, para adquirir imágenes necesarias y/o complementarias que pueda requerirse al objeto de proporcionar una valoración correcta y precisa del portaobjetos.

A continuación, la información acumulada por la estación de trabajo 100 para un caso estudiado, tal como por ejemplo imágenes reales o generadas matemáticamente, resultados de medidas y representaciones gráficas de estos, datos de pacientes, datos de preparación, y mapas de detección de enfermedades pueden integrarse selectivamente en el informe, que puede imprimirse o bien accederse electrónicamente. Semejante informe proporcionaría una imagen completa del caso sometido a evaluación, y también facilitaría las cuestiones de aseguramiento de la calidad y estandarización.

Se comprenderá que la metodología y los procedimientos aquí detallados juntamente con el sistema 100, especifican un método de cuantificación de una cantidad de especies moleculares, a partir de una imagen de una muestra capturada por una cámara RGB en un sistema de vídeo-microscopía. Una persona cualificada en el arte apreciará además que tal método puede automatizarse para proporcionar un producto de programa de software informático, ejecutable en un dispositivo informático, que tiene partes ejecutables capaces de cuantificar la cantidad de una especie molecular a partir de una imagen digital de una muestra capturada por un dispositivo de adquisición de imágenes en color, tal como una cámara RGB en un sistema de vídeo-microscopía. Por consiguiente, las realizaciones del sistema 100 describen la implementación del método y/o el correspondiente producto de programa de software informático, que pueden realizarse en equipamiento físico configurado apropiadamente, en software, o una combinación de equipamiento físico y software acorde con el alcance de la presente invención.

Así, las realizaciones de la presente invención comprenden una técnica de análisis colorimétrico para muestras preparadas, que proporciona la detección y cuantificación eficaces de especies de interés, la cual supera los factores limitativos de las técnicas del arte previo, tales como por ejemplo el solapamiento espectral, la mezcla de colores debida el solapamiento espacial de los marcadores de membrana y nucleares, la resolución espectral limitada del dispositivo de adquisición, y las inconsistencias entre operadores humanos del equipamiento de análisis. Las realizaciones de la presente invención proporcionan además una técnica de procesamiento de imagen que no depende de la detección subjetiva de contraste dentro de la muestra preparada, ni de un análisis complejo y voluminoso de la muestra a longitudes de onda de luz específicas utilizando una combinación de fuentes de luz y filtros. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención proporcionan una técnica de análisis colorimétrico más simple y más eficaz, que supera las limitaciones de detección y cuantificación en las técnicas de análisis del arte previo, reduce la subjetividad y la inconsistencia en el análisis de la muestra, y es capaz de proporcionar la información de análisis necesaria sobre la muestra, una vez que se ha capturado la imagen de la muestra, sin depender del posterior examen de la muestra para completar el análisis.

Más en concreto y tal como se ha demostrado, el análisis (detección y cuantificación de una especie molecular de interés) de la muestra preparada, se consigue a través de la medida de intensidades de luz que se manifiestan en una imagen digital de la muestra, capturada por un dispositivo de adquisición de imágenes en color. Puesto que el análisis es relativamente dependiente de la imagen, en lugar de ser dependiente de la muestra, puede capturarse imágenes redundantes para el análisis, mientras que puede procesarse muchas muestras al objeto de capturar las imágenes necesarias dentro de un período de tiempo relativamente corto. Una vez que los datos de imagen han sido capturados y almacenados, el análisis real puede producirse en tiempo real o cuando se necesite, sin requerir la presencia física de la muestra real. Tal análisis puede además ser aplicado a examinar toda la muestra o incluso todo el portaobjetos. Así, las realizaciones de la presente invención proporcionan un sistema rápido de vídeo-microscopía cuantitativa, que permite el uso de tal sistema como una herramienta rutinaria o "de producción", capaz de conseguir un rendimiento total del análisis relativamente alto. Así, mediante realizaciones de la presente invención se obtiene ventajas significativas en comparación con los sistemas de microscopía cuantitativa del arte previo, que típicamente estaban limitados en el análisis y el rendimiento total de la muestra, haciendo así en general tales sistemas más útiles como herramientas de investigación.

A una persona cualificada en el arte se ocurrirá muchas modificaciones, y otras realizaciones de la invención, a las cuales esta invención reclama en posesión de los beneficios de las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y los dibujos asociados. Por lo tanto, debe entenderse que la invención no está limitada a las realizaciones específicas reveladas en tales modificaciones, y se prevé que hay otras realizaciones incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones. Aunque aquí se utiliza términos específicos, son utilizados solo en un sentido genérico y descriptivo, y no con un propósito limitativo.

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Referencias citadas en la descripción

La lista de referencias citadas por el solicitante es solo para comodidad del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Incluso aunque se ha tomado especial cuidado en recopilar las referencias, no puede descartarse errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción:

\bullet EP 1065496 A2 [0014]

\bullet US 6007996 A, McNamara [0016]

\bullet WO 9855026 A, Youvan [0017]

\bullet US 6330349 B, Hays [0018]

\bullet US 6276798 B, Gil [0018]

\bullet US 6025137 A [0027]

Bibliografía no de patentes, citada en la descripción

\bulletDUNCAN et al. J. Clin. Oncol., 2001, vol. 19(2), 568-576 [0025]

\bulletDEEDS et al. Hum. Pathol., 2000, vol. 31(11), 1346-1356 [0026]

Claims

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1. Un método de modelado de un tinte, el mencionado método comprendiendo:

determinar una transmitancia de la muestra tratada con el tinte, a partir de una imagen en color de la muestra tratada, la imagen comprendiendo una pluralidad de píxeles, en cada uno de los canales rojo, verde y azul de un espacio de color RGB, y para cada píxel de la imagen, al objeto de formar un triplete RGB para cada píxel; caracterizado por

agrupar los tripletes RGB de acuerdo con la transmitancia mínima en los canales rojo, verde y azul, para el respectivo triplete RGB;

normalizar cada grupo de tripletes RGB mediante sumar las transmitancias en cada uno de los respectivos canales rojo, verde y azul, y después dividir cada una de las transmitancias sumadas por el número de tripletes RGB en el respectivo grupo, para formar respectivos tripletes RGB normalizados; y

tabular los tripletes RGB normalizados de acuerdo con la transmitancia mínima de cada triplete RGB normalizado, al objeto de formar una tabla de correspondencia para el tinte, la tabla de correspondencia extendiéndose a incrementos de transmitancia entre el 0% y 100% de transmitancia.
2. Un método acorde con la reivindicación 1, que comprende además capturar una imagen de la muestra tratada, en un sistema de vídeo-microscopía con un dispositivo de adquisición de imagen en color, para formar la imagen en color de la muestra tratada, el dispositivo de adquisición de imagen en color comprendiendo al menos uno entre una cámara RGB y un escáner en configuración RGB.
3. Un método acorde con la reivindicación 2, en el que capturar una imagen de la muestra tratada comprende además al menos uno entre iluminar la muestra bajo condiciones de iluminación Koehler, capturar una imagen de la muestra en un sistema de vídeo-microscopía de aberración cromática corregida, e iluminar la muestra con una fuente de luz y determinar una intensidad transmitida, de la luz transmitida a su través en cada uno de los canales rojo, verde y azul.
4. Un método acorde con la reivindicación 1, la 2 o la 3 que comprende además, cuando se tiene un incremento de transmitancia en la tabla de correspondencia sin un triplete RGB normalizado:

determinar un incremento de transmitancia de referencia con un triplete RGB normalizado, tanto en un incremento de transmitancia superior como en un incremento de transmitancia inferior en la tabla de correspondencia, con respecto al incremento de transmitancia sin el triplete RGB normalizado; e

interpolar entre las respectivas transmitancias en cada uno de los canales rojo, verde y azul de los incrementos de transmitancia de referencia, para formar una transmitancia aproximada en cada uno de los canales rojo, verde y azul, la transmitancia aproximada en cada uno de los canales rojo, verde y azul correspondiendo a un triplete RGB normalizado, aproximado, para el incremento de transmitancia sin el triplete RGB normalizado.
5. Un método acorde con cualquier reivindicación precedente, que comprende además establecer un umbral de relevancia para el número de tripletes RGB en un grupo y, para cada grupo que no satisface el umbral de relevancia, descartar los tripletes RGB de este como no significativos.
6. Un método acorde con cualquier reivindicación precedente, que comprende además representar los tripletes RGB para los píxeles de la imagen en un espacio de color RGB, con el objeto de obtener una representación RGB tridimensional del respectivo tinte, previa a la normalización de cada grupo de tripletes RGB.
7. Un método acorde con cualquier reivindicación precedente, que comprende además representar los tripletes RGB normalizados en un espacio de color RGB, para obtener un camino RGB característico del respectivo tinte a través del espacio de color RGB.
8. Un método acorde con cualquier reivindicación precedente, que comprende además representar los tripletes RGB normalizados en una escala de una dimensión, para representar gráficamente la tabla de correspondencia.
9. Un método de modelado de una combinación de una pluralidad de tintes, el mencionado método comprendiendo:

formar una tabla de correspondencia para cada uno de la pluralidad de tintes, de acuerdo con un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8; y

sumar ortogonalmente las tablas de correspondencia de la pluralidad de tintes, para formar una representación de la pluralidad de tintes en el espacio de tintes, la representación en el espacio de tintes teniendo una dimensión para cada tinte y proporcionando un modelo de referencia para una combinación de la pluralidad de tintes.
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10. Un método acorde con la reivindicación 9, en el que sumar ortogonalmente las tablas de correspondencia de la pluralidad de tintes, comprende además sumar ortogonalmente las tablas de correspondencia de la pluralidad de tintes de acuerdo con la ley de Lambert-Beer.
11. Un método acorde con la reivindicación 9 o la 10, que comprende además trazar la representación de la pluralidad de tintes en el espacio de tintes, en una escala que tiene un número de dimensiones correspondiente al número de tintes.
12. Un método acorde con la reivindicación 9, la 10 o la 11, en el que sumar ortogonalmente las tablas de correspondencia de la pluralidad de tintes, comprende además sumar ortogonalmente las tablas de correspondencia de la pluralidad de tintes al objeto de formar una tabla de correspondencia resultante para la pluralidad combinada de tintes, la tabla de correspondencia resultante comprendiendo una pluralidad de tripletes RGB resultantes que se extienden entre el 0% y el 100% de transmitancia.
13. Un método de determinación de una cantidad de, al menos, una especie molecular que comprende una muestra, cada especie molecular estando indicada por un tinte, a partir de una imagen de la muestra capturada por un dispositivo de adquisición de imágenes, la imagen comprendiendo una pluralidad de píxeles, el mencionado método comprendiendo:

formar una representación en el espacio de tintes, de una pluralidad de tintes de acuerdo con un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, cada tinte teniendo una correspondiente tabla de correspondencia que comprende una pluralidad de tripletes RGB normalizados, la representación en el espacio de tintes teniendo una dimensión para cada tinte y proporcionando un modelo de referencia para una combinación de la pluralidad de tintes;

comparar cada píxel de la imagen de la muestra, estando la muestra tratada por la combinación de la pluralidad de tintes, con el modelo de referencia para la combinación de la pluralidad de tintes, teniendo cada píxel un color definido por un triplete RGB, al objeto de determinar una combinación óptima de tripletes RGB normalizados a partir de las respectivas tablas de correspondencia de los tintes que producen el color del respectivo píxel, los tripletes RGB normalizados de la combinación óptima siendo identificables de acuerdo con el respectivo tinte; y

formar una imagen artificial de la muestra, la imagen artificial correspondiendo a la imagen de la muestra, a partir de los tripletes RGB normalizados para cada tinte determinado a partir de la combinación óptima, la imagen artificial indicando de ese modo una distribución del respectivo tinte sobre la imagen de la muestra, y facilitando la determinación de la cantidad de correspondientes especies moleculares.
14. Un método acorde con la reivindicación 13, que comprende además determinar un error entre cada píxel de la imagen de la muestra y el modelo de referencia para la combinación de la pluralidad de tintes, el error correspondiendo a la mínima distancia euclídea entre el respectivo píxel y el modelo de referencia.
15. Un método acorde con la reivindicación 14, que comprende además representar los errores para los respectivos píxeles sobre la imagen, al objeto de identificar cualesquiera desviaciones respecto del modelo de referencia.
16. Un método acorde con la reivindicación 14 o la 15, que comprende además identificar un objeto dentro de la imagen definida por los correspondientes píxeles e integrar los errores para los píxeles que comprenden el objeto, para proporcionar una indicación de si el objeto está tratado con la combinación de la pluralidad de tintes.
17. Un método acorde con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que comparar cada píxel de la imagen con el modelo de referencia, comprende además ignorar cualquier triplete RGB normalizado dentro de la tabla de correspondencia para el mencionado tinte, que tenga una transmitancia en cualquiera de los canales rojo, verde y azul que sea menor que la transmitancia del correspondiente canal del triplete RGB empírico, para el píxel.
18. Un programa informático que comprende medios de codificación del programa, para llevar a cabo la totalidad de las etapas de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 cuando el mencionado programa está ejecutándose en un ordenador.
19. Un sistema para modelar un tinte indicativo de una especie molecular en una muestra, a partir de una imagen de la muestra tratada con el tinte, el mencionado sistema comprendiendo:

un dispositivo informático que tiene cargado un programa informático como el reivindicado en la reivindicación 18, y que tiene al menos una parte de procesamiento configurada para procesar el mencionado programa informático.
20. Un sistema acorde con la reivindicación 19, que comprende además un dispositivo de adquisición de imágenes en color, acoplado operativamente con el dispositivo informático y configurado para ser capaz de capturar una imagen digital de la muestra ampliada, el dispositivo de adquisición de imágenes comprendiendo al menos uno entre un escáner en configuración RGB y un microscopio acoplado operativamente con una cámara de RGB.
21. Un sistema acorde con la reivindicación 20, en el que el dispositivo de adquisición de imagen y el dispositivo informático están además configurados para cooperar, al objeto de formar un sistema de vídeo-microscopía de aberración cromática corregida.
22. Un sistema acorde con la reivindicación 20 o la 21, que comprende además una fuente de luz configurada para iluminar la muestra bajo condiciones de iluminación Koehler.
23. Un medio de almacenamiento legible por ordenador, que comprende el programa informático de la reivindicación 18.