PT1334461E - Processo e dispositivo de análise de células - Google Patents

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DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "PROCESSO E DISPOSITIVO DE ANÁLISE DE CÉLULAS" O invento refere-se a um processo, de acordo com o conceito principal da reivindicação N°.1 da patente e, também, a um arranjo, de acordo com o conceito principal da reivindicação N°. 12 da patente. A classificação das células na estrutura do tecido, de acordo com um tipo de célula exactamente definido (por exemplo, célula epitelial, célula muscular, fibroblasto leucócito, célula carcinogénea, célula linfática) e a determinação das suas propriedades funcionais realiza-se, quando as caracteristicas morfológicas não forem suficientes, através de análises imuno-histológicas. Nesta caso, são empregues anticorpos altamente específicos, orientados contra antigénios característicos específicos do tipo de célula. A partir da coloração possível tirar as conclusões correspondentes.

Até ao momento, ainda não se dispõe de um sistema de análise objectivo e automático que, por exemplo, indique quantas células estão presentes num preparado, quantas destas células reagem com o(s) respectivo(s) anticorpo (s) (em caso de colorações múltiplas) e, qual a força desta(s) reacção (ões) . De acordo com o estado da técnica, o analista realiza a contagem puramente óptica de um número representativo de células e, faz uma estimativa da sua 1 utiliza os tradicionais intensidade de coloração, ou então, softwares de processamento de imagem, para medir com precisão a intensidade da cor, o que, no entanto, o obriga a definir manualmente as áreas da célula a serem medidas. Se o analista desejar realizar uma análise quantitativa em 100 células e 100 núcleos celulares, ele precisará circundar individualmente 100 células e 100 núcleos para poder então realizar a sua medição. Estas medições, no entanto, apenas raramente fornecem informações em relação às reactividades duplas, triplas, etc. e estão associadas a um enorme gasto de tempo, sendo que a comparação com controlos negativo e positivo - que são importantes para a comparabilidade - faz com que o trabalho aumente de forma exponencial.

Esta situação é a principal responsável pelo facto dos resultados das análises imuno-histológicas, ainda serem considerados como não sendo essencialmente padronizáveis e comparáveis, e ainda estarem associados ao defeito da subjectividade, enquanto que a técnica muito mais recente da citometria por impulso (um sistema de análise comparável apenas para células individuais em suspensão) já conseguiu dar este salto. Actualmente, nas análises citométricas por impulso, são empregues, de modo rotineiro, colorações quádruplas, de modo que a distribuição percentual e a intensidade de coloração exactas de cada sub-população possam ser determinadas, de acordo com o desejado, enquanto que os métodos de avaliação da imuno-histologia ainda correspondem ao estado da técnica de há vinte anos atrás e, na grande maioria das vezes é empregue o método de uma ou duas células positivas cruzadas, para exprimir os resultados determinados visualmente. O objectivo do invento é viabilizar um reconhecimento 2 automático das células individuais e dos seus componentes como o núcleo celular, citoplasma e membrana celular, em estruturas celulares densamente fechadas, e realizar medições exactas nos respectivos componentes, sem com isto perder a sua referência espacial em relação às células e, também a sua localização na estrutura do tecido. Com isso, a imuno-histologia deve ser colocada ao mesmo nível da citometria por impulso, sendo que, no que se refere à comparação dos dados com controlos positivo e negativo, à classificação das populações em sub-populações uni- e poli-reactivas e às determinações quantitativas das intensidades de coloração, a imuno-histologia ultrapassa em muito a citometria por impulso, em relação à multiplicidade de informações, pois ela permite uma classificação espacial, que não se limita à localização da respectiva célula na estrutura celular, mas abrange também o interior da célula {membranosa, citoplasmática ou nuclear).

De acordo com o presente invento, um processo de acordo com o descrito na introdução, é caracterizado pelos critérios da reivindicação N°.1. Um arranjo de acordo com o descrito na introdução é caracterizado pelos critérios da revindicação N°.12. É realizada pelo menos uma coloração do núcleo, sendo que pode ser empregue qualquer coloração convencional do núcleo celular, e pelo menos uma coloração da estrutura objectivo, preferencialmente com um anticorpo ou antisoro. Nesse caso, não é importante à qual estrutura celular este anticorpo, ou um ácido nucleico, ou similar, se liga, desde que (como geralmente ocorre) o produto da reacção, se diferencie pela cor da coloração nuclear. A partir disso, o número de colorações dos núcleos celulares e dos objectos celulares não é limitado, até ao ponto, em que fisicamente não seja mais possível uma clara separação das 3 diferentes colorações.

Regra geral, também é possível tingir os núcleos celulares na forma de estrutura objectivo. Nesse caso, existirão núcleos celulares com pelo menos uma coloração de identificação e, pelo menos uma coloração da estrutura objectivo. Como as imagens são avaliadas separadamente após s realização das colorações, é possível tirar conclusões correspondentes, a partir de cada uma das duas colorações, realizadas nos núcleos celulares. A SU 652 580 A refere-se ao reconhecimento de estruturas em micro-cortes. Este documento não tem nenhuma relação com o reconhecimento automático de células individuais na estrutura do tecido, com a análise das co-reactividades, a sua avaliação estatística e a selecção e vinculação dos parâmetros, através de gráficos interactivos. Particularmente, no ano de 1979 ainda não existia interface gráfica do utilizador nos computadores.

Na JP 6138119 A é descrito um arranjo para a contagem automática e para a análise de células. Trata-se, neste caso, de um processo para o reconhecimento e medição de células isoladas. Sistemas deste tipo referem-se às análises de células individuais em porta-objectos. Deve-se considerar o conceito "célula individual" literalmente: as células encontram-se individualmente (isoladas) sobre porta-objectos e, ao contrário do presente invento, são claramente (espacialmente) delimitadas (separadas) umas das outras.

Além disso, no que se refere às células a serem analisadas, trata-se de células do mesmo tipo {na JP 613819A de mielócitos e (células sanguíneas periféricas) células sanguíneas, (células com uma morfologia correspondentemente mais uniforme).

De acordo com o invento, são analisadas células combinadas em tecidos e, são reconhecidas as medidas das células, de 4 qualquer tipo e de qualquer (mesmo dentro de um tipo de célula VARIÁVEL) morfologia. Os sistemas que podem analisar células individuais fracassam na estrutura do tecido. Algoritmos que podem reconhecer células individuais isoladas, não funcionam quando as células individuais se encontram estreitamente comprimidas umas às outras (como geralmente é comum num tecido). A WO 99/04244 Al refere-se a um processo de análise de amostras citológicas, sendo que células atípicas podem ser reconhecidas por meio de diversos parâmetros, que se encontram dentro ou fora de variações especificadas de valores. Neste processo, os objectos celulares, principalmente representados por núcleos celulares, tem os seus diferentes parâmetros medidos e, são analisados de acordo com a sua filiação em relação a determinados limites de valores. O processo segundo o qual a WO 99/04244 Al prevê que considerando uma abundância de dados (historial clínico do paciente, anamnese, exames prévios e - apenas um factor -processamento analítico da imagem de amostras actuais) seja realizado um cálculo de probabilidades, que irá fornecer ao patologista informações sobre se uma colecta vaginal "contém células degeneradas", "é suspeita" ou provavelmente se encontra "dentro dos limites normais". O método de análise de acordo com o invento, não fornece este tipo de informação, mas representa, de forma resumida, um instrumento de medição com o qual o investigador, como por exemplo, o patologista, pode obter informações detalhadas sobre as condições das células individuais na estrutura do tecido, principalmente, por meio da comparação entre tecidos normais e degenerados, assim como a relação entre os valores de medição e os controlos positivo e negativo, é possível determinar o estado com bastante precisão. 5

Com o método descrito em WO 99/04244 Al são analisadas principalmente colectas vaginais (assim chamadas, PAP-smears), portanto uma forma de amostra, na qual as células a serem medidas, mais uma vez não se encontram em forma de tecido, mas sim de certa forma isoladas (execução comparável à JP 6138119) . No entanto, na introdução da WO 99/04244 Al é citado que este método também pode ser adequado para a análise de amostra de tecido, mas no decorrer da descrição da patente, não é feita mais nenhuma menção a este respeito. Isso só pode ser plausível quando se tratar de uma determinação estatística e, independentemente dos parâmetros celulares na estrutura do tecido. Muito relatada no entanto, é a problemática da separação óptica das células individuais, não apenas no caso dos tecidos, mas também no caso de colectas, principalmente quando se tratar de uma técnica de coloração única. Se este processo realmente permite medir algo no tecido, na melhor das hipóteses seriam estruturas isoladas (estatisticamente ou distribuídas de modo especifico), mas não são identificadas células individuais em sua totalidade. No restante, é citado que algumas estruturas são analisadas em algumas imagens; de modo elementar. A identificação de células individuais na estrutura do tecido é diferente, tanto no que se refere ao significado prático como também e, principalmente, em relação à metodologia necessária e às etapas do processo. São analisadas meramente colorações simples, e não combinações de cores múltiplas. Isso significa, que só é possível analisar uma estrutura celular, sendo que esta estrutura representa a célula, mas não é a célula. Se for identificado um núcleo celular, então a célula individual à qual este núcleo pertence só é identificada numa primeira abordagem. A posição precisa do corpo celular, que é indispensável para a medição citológica e a determinação dos 6 parâmetros relevantes para o diagnóstico, não é absolutamente considerado por este processo de análise. Uma análise citopatológica adequada, pressupõe uma diferenciação entre membrana celular, citoplasma e núcleo celular. Uma diferenciação deste tipo, em compartimentos celulares individuais, com base em células individuais identificadas, torna obrigatório o emprego de uma técnica de cores múltiplas para a representação dos componentes a serem analisados individualmente. Este requisito básico de diagnóstico moderno de células individuais, exigindo a diferenciação entre membrana celular, citoplasma e núcleo celular, não pode ser atendido por uma técnica de coloração única, de acordo com a WO 99/04244 Al. Esta propriedade básica do processo de análise, de acordo com o invento, diferenciação entre membrana celular, citoplasma e núcleo celular, faz com que a presente requisição da patente se diferencie essencialmente da WO 99/04244 Al. Neste documento é feita a referência especifica de que este processo não se limita à análise de núcleos celulares, e sim, que pode ser empregue em relação a qualquer parâmetro celular. Este facto não é apresentado em nenhum ponto do documento de patente mencionado, mas também nada se altera, pois com uma técnica de coloração única a diferenciação citopatológica essencial entre membrana celular, citoplasma e núcleo celular não é realizável. A WO 99/08091 Al apresenta um sistema de análise automático parar a identificação de células malignas. Para se obter dados em relação à malignidade das células, são processadas, principalmente as informações do núcleo celular. Além disso, por intermédio de algoritmos adequados, é possível calcular as extremidades e a área das células. De modo semelhante à WO 99/04244 Al, na WO 99/08091 A trata-se de um processo para a 7 análise citométrica dos núcleos (não de células no sentido morfológico) de células, que não se encontram na estrutura do tecido. Trata-se de um bom processo para a medição de núcleos celulares, mas não mais que isto. Em contrapartida, o processo de acordo com o invento, não se limita a um método de coloração (coloração do núcleo celular), e sim, pode ser empregue em qualquer método de técnica de fluorescência e combinação de corantes. No entanto, são reconhecidas e calculadas apenas as extremidades e áreas dos núcleos celulares, justa e precisamente não aquelas das células completas. Esta é, portanto, precisamente a dificuldade que é solucionada com o presente invento. Nominalmente, é viabilizado o reconhecimento de células completas (núcleo celular, membrana e plasma celular), e ainda, de células na estrutura do tecido fechado. No entanto, exactamente esta funcionalidade não pode ser reconhecida uma única vez na WO 99/08091 Al, no que se refere à sua aplicação.

Como colorações ou objectos celulares passíveis de coloração são consideradas principalmente colorações ou objectos celulares, de acordo com o citado na reivindicação N°.4.

De acordo com o presente invento, para uma primeira identificação das células a serem analisadas, pelo menos um parâmetro dos núcleos celulares identificados é limitado, de acordo com uma determinada variação de valores. Estes limites devem representar com a maior probabilidade possível os núcleos celulares tingidos que possam ser realmente determinados. Os objectos que por exemplo, sejam menores e que não correspondem aos limites especificados para o parâmetro "tamanho", devem ser desconsiderados, pois no caso de objectos deste tipo, não se trata de núcleos celulares. Os objectos muito grandes também são desconsiderados. O número de parâmetros que são empregues para 8 seleccionar os objectos a serem considerados como núcleos celulares não é limitado. Para a selecção dos núcleos celulares e para a determinação dos limites dos parâmetros também podem ser empregues as interdependências entre os parâmetros individuais ou as comparações entre os parâmetros em forma de diagramas de dispersão ou histogramas. A limitação dos parâmetros individuais, também se pode realizar em função dos parâmetros das células individuais reconstruídas; particularmente deste modo, os limites dos parâmetros podem ser estabelecidos e reajustados, em função dos resultados obtidos na análise. Deste modo, deve-se proceder de acordo com o citado nas reivindicações N°.3, N°.5 e/ou N°.7.

As consequências das medidas de limitação, que preferencialmente são realizadas por meio de limitações das populações desejadas, em diagramas de dispersão, dão origem, em forma de feedback, a uma estratégia de identificação de objectos melhorada e, mais adaptada às propriedades do núcleo celular e, podem ser associadas à alteração da coloração da população limitada na imagem original, para controlar as consequências destas operações.

Quando o processo de identificação da área parcial do preparado, estiver completo e analisado, então, com os parâmetros determinados, todas as outras imagens do preparado de tecido ou de outros preparados de tecido do mesmo órgão, ou de um órgão do mesmo tipo, serão automaticamente avaliados.

Para a avaliação, é necessária uma identificação do corpo celular (citoplasma) e da extremidade da célula (membrana celular) . Para isso, e necessária, pelo menos, uma coloração de estrutura objectivo, que tinja o citoplasma e/ou a membrana celular. As propriedades características desta coloração podem 9 ser automaticamente determinadas por meio de uma ferramenta de medição, disponibilizada por meio de software, sendo que o utilizador realiza a marcação da célula tingida, por ele seleccionada, a partir de uma cena representativa da imagem apresentada, que irá determinar a área em que a medição destes parâmetros se deverá realizar. A ferramenta de medição pode determinar automaticamente, por exemplo, a intensidade da coloração, a tonalidade, o tamanho e/ou a forma desta célula. O limite, ou a diferença em relação ás cédulas não tingidas, pode ser determinado, marcando-se uma célula não-tingida com a ferramenta de medição e, procedendo-se à sua medição. Esta operação pode ser realizada para qualquer canal de cor disponível. Com isto, é possível determinar de modo simples, a extensão da área de uma célula. Em razão de uma correlação entre a(s) imagem(ns) tingida(s)para a identificação e a(s) imagem(ns) tingida(s) para determinar a estrutura objectivo, todos os objectos com propriedades comparáveis serão considerados.

Deste modo, deve-se proceder de acordo com os critérios da reivindicação N°.8, em que uma coloração de estrutura objectivo citoplasmática, partindo de núcleos celulares já identificados, sofre um processo de crescimento e este é continuado, até que seja alcançado um ponto de imagem, ou a tolerância relativa ao tamanho e forma (diâmetro) seja ultrapassada, ou seja atingido um objecto pertencente ao núcleo celular adjacente. Deste modo, o processo de crescimento não é interrompido quando for atingido um ponto de imagem inválido, mas o ponto de imagem inválido não deve ser apenas considerado no objecto binário crescente. No caso de uma coloração de membrana, o crescimento em tamanho a partir dos núcleos celulares, prolonga-se, até que seja alcançada uma área, que corresponda à tonalidade, sendo que este processo é 10 continuado dentro desta área tingida, até que o máximo de intensidade, ou um objecto adjacente, respectivamente o limite de tolerância para o tamanho, seja alcançado.

No caso de colorações múltiplas, que abranjam as porções membranosas e/ou citoplasmáticas das células, ambos os processos de crescimento podem ser realizados simultaneamente: também podem ser empregues diversas tonalidades paralelas, para a reconstrução da célula.

As células identificadas na imagem apresentada, ou gerada, de acordo com este método, são analisadas em relação aos seus parâmetros, preferencialmente intensidade da coloração, tamanho e forma e, os resultados, em relação a todos os núcleos celulares desta imagem, são apresentados ou fornecidos em forma de diagramas de dispersão. Deste modo, é registado ou representado o tamanho em relação à intensidade de coloração, separadamente para cada canal de cor. Em caso de colorações múltiplas, de modo mais adequado, os objectos são ordenados de acordo com os diferentes canais de cor e, comparados de acordo com a respectiva intensidade de coloração. Adicionalmente, os objectos ou células identificados, podem ter a sua cor acentuada na imagem original. As relações e dependências representada pelos diagramas de dispersão alteram-se quando os limites dos parâmetros forem alterados ou receberem nova definição.

As imagens de todas as áreas parciais do preparado de tecido, são analisadas de acordo com o acima descrito e os resultados, respectivamente os parâmetros determinados das células individuais, são fornecidos em forma de diagrama de dispersão, que preferencialmente devem comparar as intensidades de coloração entre si. A avaliação dos objectos celulares, núcleo celular, citoplasma e membrana celular, pode ser feita de forma 11 individual ou também combinada de acordo com o desejado. A avaliação final realiza-se, assim, com o auxilio de diagramas de dispersão da intensidade, em que populações gráficas individuais podem ser avaliadas de modo diferente e independente. A avaliação realiza-se principalmente em relação ao número de objectos analisados, à distribuição percentual dos respectivos objectos nos diferentes canais de cor, à intensidade de coloração, ao tamanho e à forma, sendo que também é possível realizar limitações de população no diagrama de dispersão.

Com o invento, torna-se possível reconhecer automaticamente e, com elevada precisão, células individuais, mesmo em estruturas celulares fechadas. A seguir, explica-se o invento mais detalhadamente e, de modo ilustrativo, recorrendo-se ao uso de desenhos. A Fig.l mostra a especificação dos parâmetros das células -respectivamente, a fixação das variações admissíveis dos parâmetros, através de ferramentas de marcação intuitivas por software. A Fig.2 mostra exemplos de diagramas de dispersão e de histogramas. A Fig.3 mostra um exemplo para a avaliação dos dados e a Fig.4 mostra um exemplo de um arranjo, de acordo com o presente invento.

Na Fig. 1, é apresentado como exemplo, um corte de tecido de um rim. Foram coloridos os núcleos celulares (coloração de identificação), por exemplo azul e, o citoplasma (coloração da estrutura objectivo). Após a coloração dos preparados de tecido, são definidas áreas parciais e, por exemplo, estas são manipuladas com auxílio de um micro-manipulador Eppendorf. Com um microscópio de scanner a laser, são realizados, por exemplo, dois scaneamentos no plano Z, um mais grosso e um mais fino, ao longo de uma linha horizontal no centro da imagem, sendo que o foco 12 pode ser ajustado sobre a área com mais luminosidade. 0 tempo dos scaneamentos corresponde, por exemplo, a quatro segundos por campo visual, sendo que cada área parcial é scaneada apenas uma vez com um laser de argónio de 488 nm. É possível realizar diversos scaneamentos consecutivos. Para se obter diferentes colorações, poderia, por exemplo, ser realizado um primeiro scaneamento com laser He/Ne de 543 nm, para poder medir a cianina fluorcrómica 5 (Cy5) ou Cy3, seguido de um scaneamento com um laser de argónio de 488 nm, para determinar os fluorcromos Cy2, fluoresceína isotiocianato (FITC) ou proteína de clorofila peridimina (PerCP). O ajuste da sensibilidade dos detectores deve ser realizado em conformidade com os controlos negativo e positivo, respectivamente, com os limites dos parâmetros. 0 armazenamento sistemático dos dados das imagens de cada scaneamento individual, composto por até oito canais de cor, é realizado automaticamente.

Para a configuração do sistema de medição existem ferramentas de software para a marcação intuitiva das áreas de validade de cada um dos parâmetros de medição e se for necessário, também para determinadas áreas da imagem [Fig.1).

Estes parâmetros de medição incluem, por exemplo, tamanho, abrangência, forma, intensidade da coloração e amostra de coloração dos objectos representados. Estes limites podem ser definidos de forma numérica ou gráfica; deve ser dada preferência a uma definição intuitiva, isto é, o utilizador fornece ao sistema, após observar a imagem representada, um ou mais, objectos de medição representativos, ou seja, células individuais ou compartimentos celulares que sejam identificáveis na imagem representada e, o sistema irá extrair a partir deles e, por si só, os dados numéricos para os intervalos de validade da cada 13 parâmetro desejado. Com isso, o sistema tem condições de reconhecer automaticamente todas aquelas estruturas nas imagens que se encontram dentro dos limites de tolerância dos objectos definidos como representativos.

Como representado na Fig.l, por meio da identificação de dois núcleos celulares é especificado o parâmetro da coloração em relação ao seu valor mínimo e ao seu valor máximo. Estes dois valores fixam os limites de variação para este parâmetro e, na continuidade do processo de avaliação são reconhecidos ou admitidos como núcleo celular, objectos cuja intensidade de coloração se encontre dentro desta variação.

Para a definição da variação do parâmetro do tamanho da célula, é utilizada uma coloração que seja característica para toda a célula, ou seja, deste modo, uma coloração de membrana ou coloração de citoplasma. Os parâmetros assim determinados irão corresponder à variação do parâmetro para o tamanho da célula (canto inferior direito da Fig.l).

As imagens nas quais os núcleos celulares foram definidos em relação à sua intensidade de coloração de acordo com as respectivas variações do parâmetro, e as imagens nas quais foram definidos ao tamanhos das células de acordo com as respectivas variações do parâmetro, são controladas, sendo que os núcleos celulares e as células definidas pelo tamanho, são classificados entre si, principalmente no que se refere à posição. Uma classificação deste tipo também se pode realizar, de modo que diferentes colorações de núcleo celular, sejam classificadas de acordo com uma de entre as diversas colorações de célula e, ao contrário, pois pela correlação entre as diversas colocações diferentes e os correspondentes processos de avaliação, pode-se realizar de forma mais precisa a definição dos núcleos celulares 14 e tamanhos celulares das células, o que eleva a precisão da avaliação.

Na imagem apresentada de uma área parcial de um preparado de tecido, é possível identificar os núcleos celulares e/ou objectos celulares, que correspondem aos limites seleccionados ou especificados do parâmetro. Para estes objectos identificados, também podem ser determinados outros parâmetros, a partir da medição destes objectos. A comparação dos parâmetros determinados por meio de diagramas de dispersão ou histogramas (Fig.2) já irá fornecer informações iniciais em relação à população de células existente e, pode ser utilizada para respectivamente, realizar uma nova ou fixação mais exacta dos limites dos parâmetros anteriormente utilizados, de modo a elevar a precisão da avaliação.

Para a reconstrução da célula e, respectivamente, determinação das células individuais, é iniciado o crescimento celular a partir dos núcleos celulares identificados, por meio de um algoritmo de cálculo previamente especificado ou adaptado/seleccionado em relação ao respectivo preparado de tecido a ser analisado. Neste caso, preferencialmente sob consideração dos valores máximo e mínimo dos parâmetros celulares, principalmente relativos ao tamanho ou diâmetro da célula, é construída uma área celular em torno dos respectivos núcleos celulares, sendo que deve ser observado o critério sob o qual, as áreas adjacentes da célula, também crescentes, não se fundam umas nas outras e, que um contacto entre as áreas celulares ou paredes celulares ou ainda as membranas celulares, seja evitado. A limitação dos objectos "adultos" determinados, é considerada como a limitação das células individuais assim reconstruídas. 15 O número, a área e/ou a intensidade de coloração a que se refere a, pelo menos, uma das colorações realizadas e/ou outros parâmetros das células individuais reconstruídas pode ser determinado, e/ou as células individuais podem eventualmente ser classificadas em populações e, apresentadas, se for necessário, em função da sua intensidade de coloração e/ou outro parâmetro seleccionado, dando continuidade à análise. As características extraídas a partir das respectivas imagens, disponíveis em dados numéricos, podem ser processadas e apresentadas em forma de histogramas e diagramas de dispersão {Fig.2}.

Na Fig.2 são apresentados histogramas (frequência das intensidades de coloração nos canais de cor individuais) e diagramas de dispersão (para células de reactividade única, dupla ou tripla) para as intensidades de coloração em diferentes canais de cor. É possível reconhecer a localização ou agrupamentos dos valores de medição, relativos às células individuais, que viabilizam informações sobre as células. Os diagramas de difusão são particularmente adequados para a continuidade do processamento dos valores de medição e, uma avaliação mais profunda dos dados numéricos. Nestes diagramas de dispersão é possível registar, de modo comparativo, diversas propriedades do objecto (forma do objecto, qualidade da superfície, intensidade densitométrica média, oscilações na intensidade, etc.), sendo possível representar as relações entre elas. Com estes diagramas de dispersão podem ser estabelecidos Gates (intervalos de validade para cada dupla de parâmetros de medição), e estes podem ser vinculados uns aos outros (Fig.3). A Fig.3 mostra o resultado da identificação do preparado de tecido apresentado na Fig.l e, um procedimento adequado para a utilização dos parâmetros/conteúdos de imagem obtidos. A partir 16 de uma cena correspondente representativa de objectos celulares identificados, obtém-se um diagrama de dispersão, no qual o tamanho dos objectos é comparado à intensidade da colocação (primeira linha da Fig.3). Pela definição dos Gates, de modo interactivo ou automático através da determinação do ponto principal dos grupos de ponto de medição, podem ser identificadas populações especificas dentro de todos os valores de medição, como exemplificado na segunda linha, quando os respectivos parâmetros de diferentes canais de cor são comparados entre si.

Os Gates, definidos de acordo com uma combinação de parâmetros, também podem ser visualizados em outras combinações de parâmetros, a partir do que são, identificadas sub-populações definidas com uma precisão cada vez maior, como pode ser visto, por exemplo, na terceira linha.

De acordo com a última representação na Fig.3, os objectos celulares apresentados na tabela 14 (Fig.4) podem ser apresentados sob diferentes constelações, isto é, identificadas de acordo com os valores de medição sem Gate, de acordo com os valores de medição no Gate 1, ou de acordo com os valores de medição no Gate 1 e Gate 2, ou de acordo com os valores de medição no Gate 1, mas não no Gate 2. Essa caracterização, principalmente por coloração, pode ser realizada automaticamente pelo computador; o pressuposto para tal, é a representação dos parâmetros obtidos ao longo do processo de correlação em forma de histogramas e diagramas de dispersão e, uma selecção da sobreposição dos respectivos parâmetros.

Com esta possibilidade de avaliação, podem ser obtidas identificações muito precisas de células individuais de um determinado tipo celular. As células existentes num Gate podem ser ressaltadas através de cores noutros diagramas de dispersão, 17 em que outros parâmetros de medição estejam registados de forma comparativa e, tratadas analiticamente de forma independente, de modo que seja possível, que as propriedades das células que foram uma vez reunidas numa população, através de um Gate (ou seja, dois parâmetros de medição) , possam ser investigadas especificamente, em relação a outras propriedades do objecto, sem que seja necessário recorrer novamente à totalidade de células medidas, para se realizar a análise. A avaliação propriamente dita dos valores de medição se realiza, portanto, não pelas limitações na análise da imagem, mas sim a partir de determinadas propriedades do objecto, dentro da totalidade dos objectos medidos. Os parâmetros determinados nesta análise podem ser empregues para melhorar a fixação dos limites dos parâmetros.

Na Fig. 4 está representado o esquema de um exemplo de execução de um arranjo, de acordo com o presente invento . 0 arranjo abrange um suporte 1 para os preparados de tecido 2. Os preparados de tecido 2 correspondentemente tingidos, são fotografados com um dispositivo electrónico de geração de imagens 3 por meio de diversos canais de cor 4. As imagens na coloração correspondente, são transmitidas ao computador 5 em forma digital e, avaliadas por meio do emprego de um processador 6. O computador inclui uma unidade de limitação de parâmetros 7, que deste modo, é executada sob a forma de uma ferramenta de software, em que podem ser previamente especificados os limites dos parâmetros celulares. Pode-se partir do principio, de que, como apresentado na Fig.l, um determinado tamanho de núcleo e uma determinada coloração, são especificados para os núcleos celulares 11 e 11' e, por exemplo, um núcleo celular de coloração forte 11 e um de coloração fraca 11' são marcados. Deste modo, realiza-se a limitação do parâmetro de intensidade de coloração 18 dos núcleos celulares na imagem apresentada de acordo com um valor mínimo e um valor máximo. Também se podem limitar outros parâmetros.

Do mesmo modo, também se pode efectuar a limitação, por exemplo, do tamanho da célula, de acordo com a variação do parâmetro. No canto inferior direito da Fig.l encontram-se marcadas, uma célula maior mais fortemente tingida 12 e uma célula menor mais francamente tingida 12' e estas formam a limitação de variação para os parâmetros do tamanho celular e, intensidade da coloração de acordo com toda a extensão celular ou área celular. Regra geral, também é possível introduzir e estabelecer estes parâmetros, ou variações, manualmente ou de acordo com valores empíricos ou ainda, com base nos resultados obtidos em análises anteriores. Estes parâmetros são então tomados como base, para a correlação das imagens tingidas, para identificação e tingidas, para a determinação da estrutura.

Além disso, o computador 5 inclui uma memória 8 para os parâmetros seleccionados, respectivamente, para os parâmetros determinados e, também uma memória de imagens 9 para as diversas imagens tingidas, construídas em formato digital. A correlação entre os conteúdos de imagem determinados para os núcleos celulares, com os conteúdos de imagem determinados para os objectos celulares, tingidos para estabelecer a estrutura objectivo, realiza-se numa unidade de correlação 10. A unidade de correlação 10 realiza-se por meio de cálculos, principalmente o crescimento celular, sob consideração da classificação por posição dos núcleos celulares determinados e, das áreas celulares crescentes partindo destes núcleos celulares. A apresentação das imagens dos preparados de tecido tingidos e/ou, das células reconstruídas e/ou ainda dos histogramas e diagramas de 19 dispersão, realiza-se através de um monitor 14.

As etapas do processo, de acordo com o presente invento, são realizadas pelas unidades correspondentes do computador, ou componentes e programas de hardware do arranjo, de acordo com o presente invento.

Lisboa, 4 de Outubro de 2006 20

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Processo para a análise, principalmente identificação, de preferencialmente de células presentes em estruturas celulares densas ou fechadas, e, principalmente de células individuais em tecidos, - em que um preparado de tecido plano, principalmente um corte congelado ou parafinado, colecta celular, Cytospin, ou similar, é submetido a uma ou diversas colocação(ões) de identificação, principalmente completas, preferencialmente plana(s) dos núcleos celulares, de todos os núcleos celulares, em que é realizada, pelo menos, uma coloração de estrutura objectivo, diferente em relação àquela(s} da(s) coloração(ões) de identificação, dos objectos celulares, principalmente citoplasma e/ou membrana celular e/ou núcleo celular e/ou, outros parâmetros citológicos do preparado de tecido, onde a partir do preparado de tecido tingido, por meio de um dispositivo electrónico de geração de imagens - por exemplo, microscópio de scaneamento a laser, câmara CCD, câmara de vídeo ou digital, scanner fotográfico, ou similar - sejam geradas imagens digitais, principalmente imagens a cores ou com graduação monocromática e onde - pelo menos uma imagem de uma área parcial do preparado de tecido seja apresentada em pelo menos uma coloração e/ou, numa combinação seleccionada de colorações, caracterizado por compreender, - pelo menos um parâmetro - por exemplo, tonalidade, área, forma, abrangência, intensidade da cor, amostra de cor, ou similar, dos núcleos celulares identificados na imagem da área parcial pela coloração de identificação, e pelo menos um parâmetro, por 1 exemplo, a tonalidade, área, forma, abrangência, intensidade da cor, amostra de cor ou similar, dos objectos celulares identificados na imagem da área parcial, pela coloração de estrutura objectivo, sejam limitados de acordo com os limites especificados e passíveis de selecção, - de que, sob o emprego de algoritmos de processamento de imagem, na imagem desta área parcial, sejam determinados e eventualmente representados os núcleos celulares e os objectos celulares, cujos parâmetros correspondem ao(s) respectivo(s) limite(s) dos parâmetros, de que, os parâmetros dos núcleos celulares e objectos celulares representados na imagem da área parcial, eventualmente determinados sob o emprego de algoritmos de processamento de imagem, sejam representados em forma de histogramas e diagramas de dispersão, que considerem as suas interdependências, e eventualmente, dependente destes resultados de medição, sejam especificados novos limites para os parâmetros, - de que, para a determinação das células individuais existentes, pelo menos uma, preferencialmente todas, as imagens com conteúdo relativo aos núcleos celulares sejam correlacionadas com pelo menos uma, preferencialmente todas as imagens, com conteúdo relativo aos objectos celulares tingidos para determinar a estrutura objectivo, sendo que, eventualmente, sob consideração de pelo menos uma extensão de área do objecto celular tingido, para o estabelecimento da estrutura objectivo determinada por pelo menos uma coloração de estrutura objectivo, abrangendo o citoplasma e/ou membrana celular, seja iniciado um crescimento celular ou aumento celular, a partir do núcleo celular identificado, com um algoritmo de cálculo especificado, no qual, preferencialmente e, sob consideração dos valores máximo e mínimo 2 dos parâmetros celulares, principalmente os relativos ao tamanho ou diâmetro celular, seja construída uma respectiva área celular em torno dos núcleos celulares, sob consideração do critério de que, as áreas celulares adjacentes não se podem fundir umas nas outras e, um contacto das áreas celulares, respectivamente as suas extremidades, deve ser evitado, devendo considerar-se a limitação dos objectos determinados, como a limitação das células individuais reconstruídas e, de que, o número, a área e/ou intensidade de coloração relativos a pelo menos uma das colorações realizadas e/ou outros parâmetros nas células individuais reconstruídas, sejam estabelecidos e/ou, as células individuais sejam eventualmente classificadas em populações, em função da sua intensidade de cor e/ou outros parâmetros seleccionados e, se for necessário, que seja dada continuidade à sua investiqação, análise ou representação.
2. 2- Processo, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizado por as imagens dos núcleos celulares e/ou objectos celulares determinados, serem apresentadas separadamente ou sobrepostas na mesma imagem.
3. 3- Processo, de acordo com a reivindicação N° . 1 ou N° .2, caracterizado por os parâmetros seleccionados, preferencialmente tamanho e/ou forma e/ou intensidade da cor dos núcleos celulares e/ou dos objectos celulares identificados e/ou, das células individuais reconstruídas e/ou, o número de núcleos celulares identificados e/ou, o número de objectos celulares identificados e/ou, células individuais reconstruídas, serem apresentados em relação aos outros, sob a forma de histogramas e/ou diagramas de dispersão, de acordo com a sua interdependência.
4. 4- Processo, de acordo com uma das reivindicações N° . 1 até 3 N°.3, caracterizado por, como coloração de identificação e/ou coloração de estrutura objectivo, serem realizadas colorações ADN e/ou colorações de anticorpos e/ou, colorações de antisoro e/ou, difusão de corante e/ou, reacções cromáticas químicas e/ou, colorações de ácido nucleico e/ou, como objectos celulares que se encontram na célula ou estruturas presas na sua superfície, sejam tingidos o núcleo celular, citoplasma, membrana celular, marcador de tumor, citocina, substâncias de crescimento, iões, proteínas específicas, fracções de ADN ou similares.
5. 5- Processo, de acordo com uma das reivindicações N° . 1 até N°.4, caracterizado por, pela determinação das interdependências dos parâmetros do núcleo celular e/ou objectos celulares e/ou, células reconstruídas, preferencialmente tamanho e/ou forma e/ou intensidade da coloração e/ou, do número e/ou da distribuição dos núcleos celulares e/ou, objectos celulares e/ou, pela determinação dos pontos principais da distribuição ou população dos núcleos celulares e/ou, dos objectos celulares, principalmente pela representação dos valores de parâmetro para as células individuais, reconstruídas em diagramas de dispersão e/ou histogramas, serem determinadas especificações para a limitação/selecção dos limites dos parâmetros para a representação dos núcleos celulares tingidos para identificação e/ou dos objectos celulares tingidos para a estrutura objectivo, antes da ou para a realização do crescimento celular e/ou, estas interdependências, principalmente as intensidades de coloração nos canais de cor individuais, serem utilizados para a avaliação das células individuais.
6. 6- Processo, de acordo com uma das reivindicações N° . 1 até N°.5, caracterizado por, após a correlação das imagens da área parcial, geradas a partir do preparado de tecido e reconstrução 4 das células individuais para esta área parcial, os valores respectivos para os limites dos parâmetros determinados e, empregues para a avaliação das imagens, possam ser utilizados para as áreas restantes deste preparado de tecido e/ou outros preparados de tecido correspondentes.
7. 7- Processo, de acordo com uma das reivindicações N°. 1 até N°.6, caracterizado por a especificação ou limitação do valor ou da variação do parâmetro para um objecto celular tingido para determinar a estrutura, principalmente para cada coloração existente, se realizar pela marcação de um objecto celular apresentado (núcleo celular, citoplasma, membrana celular} ou de um objecto celular avaliado como célula individual, antes e/ou após a realização da reconstrução da célula, no qual a intensidade da coloração, tonalidade, tamanho e/ou forma desta célula individual são determinados e, em função da representação avaliada do objecto celular, para este parâmetro especificado seja especificado/seleccionado um novo valor/limite do parâmetro.
8. 8- Processo, de acordo com uma das reivindicações N°.l até N°.7, caracterizado por, a partir dos núcleos celulares, ser iniciada uma reconstrução da célula em forma de crescimento, com um algoritmo de cálculo, até que a área da célula, respectivamente, a extremidade da mesma ou a membrana celular, alcance um ponto de imagem ou um objecto na imagem do preparado de tecido, cujo parâmetro corresponda a um parâmetro de um objecto celular não-tingido, para a determinação da estrutura, ou outros objectos no preparado de tecido, e/ou até que um valor especificado do parâmetro seja ultrapassado e/ou, até seja atingida a área de crescimento celular pertencente a um núcleo celular adjacente.
9. 9- Processo, de acordo com uma das reivindicações N° . 1 até 5 N°.8, caracterizado por as células individuais identificadas sejam realçadas ou caracterizadas, principalmente de acordo com o parâmetros, especificados na imagem digital apresentada do preparado de tecido, eventualmente nas imagens separadas para cada uma das colorações.
10. 10- Processo, de acordo com uma das reivindicações N°.1 até N°.9, caracterizado por - antes da representação dos núcleos celulares e dos objectos celulares e, antes da reconstrução da célula, se realize uma limitação, respectivamente na nova determinação dos parâmetros, principalmente da intensidade da coloração e do tamanho, sendo que entre uma nova determinação/limitação deste tipo, se proceda à representação e avaliação das imagens correlacionadas, determinadas com o(os) respectivo(s) valor(es) de parâmetro anterior(es) e/ou, a partir dos parâmetros, principalmente da área, tonalidade e intensidade de coloração, dos objectos celulares tingidos para a determinação das estruturas objectivo, sejam derivados parâmetros, principalmente tamanho celular e forma celular, para a reconstrução da célula.
11. 11- Processo, de acordo com uma das reivindicações N°.1 até N°.10, caracterizado por - para uma reconstrução da célula numa coloração citoptasmática, a partir dos núcleos celulares identificados, se inicie um processo de crescimento, que é continuado até que seja alcançado um ponto de imagem, que não corresponde à tonalidade seleccionada, ou o limite de tolerância para o tamanho seja ultrapassado, seja respectivamente alcançado um objecto pertencente a um núcleo celular adjacente, - para a reconstrução da célula numa coloração de membrana 6 celular, o crescimento que se realiza em todas as direcções, a partir do núcleo celular circundado pela membrana, seja parado no ponto onde a área da célula ou a sua extremidade, ou membrana celular, atinge uma da(s) secção(ões) ou objecto celular, tingida (s) de acordo com a cor da membrana, ou atinja um outro objecto celular crescente, onde eventualmente uma penetração da área celular em crescimento seja admitida, numa proporção especificada na área tingida de membrana.
12. 12- Arranjo para a análise, principalmente identificação, de células presentes em estruturas celulares densas ou fechadas, que se apresentam sob a forma de preparado de tecido plano (2), principalmente corte congelado ou parafinado, colecta celular, Cytospin, ou similar e, que foram submetidos a uma ou diversas coloração(ões) completas de identificação, preferencialmente plana(s), de todos os núcleos celulares e, a pelo menos uma coloração de estrutura objectivo - diferente da(s) coloração(ões) de identificação dos objectos celulares, principalmente citoplasma e/ou membrana celular e/ou, núcleo celular e/ou, outros parâmetros citológicos, em que o arranjo inclui um dispositivo electrónico de geração de imagens (3), por exemplo, microscópio de scanner a laser, câmara CCD, câmara de vídeo ou digital, scanner fotográfico, ou similar, para a geração de imagens digitais, principalmente imagens a cores ou com graduação monocromática do preparado de tecido (2) tingido, no qual se encontra ligada a pelo menos uma unidade de imagem ou unidade de computador (5), para a representação de pelo menos uma imagem, duma área parcial do preparado do tecido, numa coloração e/ou, combinação passível de selecção das colorações, principalmente para a realização do processo, de acordo com uma das reivindicações 1 até 11, 7 caracterizado por a unidade de computador (5) esteja configurada para a representação, processamento e medição dos objectos celulares representados nas imagens, e inclua uma unidade de limitação de parâmetros (7), com a qual, pelo menos um parâmetro, por exemplo, a tonalidade, área, forma, abrangência, intensidade da coloração, amostra de coloração, ou similar, dos núcleos celulares (11, 11') identificados na imagem pela coloração de identificação e, pelo menos um parâmetro, por exemplo, a tonalidade, área, forma, abrangência, intensidade de coloração, amostra de cor, ou similar, dos objectos celulares (12,12'), identificados pela coloração de estrutura objectivo na imagem de uma área parcial, seja limitado por limites especificados, inseridos/seleccionados numa unidade de inserção, - na unidade de computador (5), sob emprego de algoritmos de processamento de imagem, os núcleos celulares {11, 11') e os objectos celulares (12, 12'), contidos na imagem desta área parcial, tenham os seus parâmetros determinados, de acordo com o{s) respectivo(s) limite(s) de parâmetro e, eventualmente, que estes sejam apresentados, principalmente de forma diferenciada entre si. o arranjo inclua uma unidade de correlação (10), para a determinação das células individuais existentes, com a qual pelo menos uma, preferencialmente, todas as imagem{ns) com o conteúdo determinado para os núcleos celulares, seja correlacionada com pelo menos uma, preferencialmente, todas as imagem(ns) com o conteúdo determinado para os objectos celulares, tingidos para o estabelecimento da estrutura, nas quais, pelo menos uma extensão de área do objecto celular tingido para determinação da estrutura, através de, pelo menos uma coloração de estrutura objectivo, abrangendo o citoplasma e/ou as membranas celulares, seja iniciado um crescimento celular a partir dos núcleos celulares identificados, com um algoritmo de cálculo, especificado para a reconstrução das células individuais, no qual, preferencialmente sob consideração de valores máximo e mínimo dos parâmetros celulares, principalmente relativos ao tamanho/diâmetro da célula, seja construída uma respectiva área celular em torno do núcleo celular, sendo que sob observação do critério, - as áreas celulares adjacentes não se fundindo e seja evitado um contacto das áreas da parede de célula, determinadas por cálculo, onde eventualmente a limitação da estrutura determinada é considerada como a limitação das células individuais reconstruídas, e - o número, a área e/ou intensidade de coloração relativos a pelo menos uma das colorações realizadas e/ou, outros parâmetros das células individuais reconstruídas, sejam determinados pela unidade de computador (5) e/ou, as células individuais sejam eventualmente representadas em função da sua intensidade de coloração e/ou outro parâmetro seleccionado e/ou, seus dados sejam armazenados.
13. 13- Arranjo, de acordo com a reivindicação N°.12, caracterizado por o dispositivo de geração de imagens (3) possuir diversos canais de cor (4) para a geração das imagens do preparado de tecido (2) em diferentes colorações.
14. 14- Arranjo, de acordo com a reivindicação N°.12 ou N°.13, caracterizado por, com a unidade de geração de imagens (5), os parâmetros seleccionados, preferencialmente, o tamanho e/ou forma e/ou, intensidade da coloração dos núcleos celulares identificados e/ou, dos objectos celulares identificados e/ou, 9 das células individuais reconstruídas e/ou, o número de núcleos celulares identificados e/ou, o número de objectos celulares identificados e/ou, das células individuais reconstruídas possam ser apresentados comparativamente, de acordo com a respectiva interdependência sob a forma de histogramas e/ou diagramas de dispersão.
15. 15- Arranjo, de acordo com uma das reivindicações N°.12 até N°.14, caracterizado por as células individuais identificadas na imagem digital apresentada do preparado de tecido, eventualmente nas imagens separadas para cada uma das colorações individuais, sejam realçadas/caracterizadas pela unidade de geração de imagem (5) . Lisboa, 4 de Outubro de 2006 10