ES2266797T3 - Separacion mejorada. - Google Patents
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Abstract
Un método para enlazar selectivamente y separar por lo menos un componente de un fluido corporal, el cual comprende: hacer pasar un fluido corporal, tal como sangre entera, a través de una matriz rígida integral de separación sin estar excluido por dicha matriz, teniendo dicha matriz una estructura porosa con un tamaño de poro que abarca desde 5 micrones hasta 500 micrones así como también una superficie activa que abarca desde 0, 5 cm2 hasta 10 m2, enlazando por lo menos un componente de fluido corporal por al menos un grupo funcional dispuesto en dicha matriz, por lo cual dicha matriz se obtiene mediante un proceso seleccionado del grupo que comprende los procesos de sinterizar, moldear y espumar.
Description
Separación mejorada.
La presente invención se refiere a mejoras en la
remoción de componentes de sangre entera o de un fluido corporal.
Más específicamente, la invención se refiere a un método en el cual
se permite pasar sangre o fluido corporal a través de una matriz
rígida de separación integral sin excluirse de la misma.
Los procesos inflamatorios tales como la sepsis
son la mayor causa de morbilidad y mortalidad en humanos. Se estima
que anualmente de 400.000 a 500.000 episodios de sepsis dan lugar a
100.000 hasta 175.000 muertes humanas sólo en los Estados Unidos. En
Alemania se han notado tasas de sepsis de hasta 19% de pacientes
ubicados en las unidades de cuidado intensivo. La sepsis también se
ha vuelto la causa que conlleva a la muerte en las unidades de
cuidado intensivo entre pacientes con enfermedades no traumáticas. A
pesar de los avances importantes de las últimas décadas en el
tratamiento de infecciones graves, la incidencia y mortalidad debido
a la sepsis continúa aumentando.
Existen tres tipos principales de sepsis
caracterizados por el tipo de organismo infectante. La sepsis
Gram-negativa es la más común. La mayoría de estas
infecciones es causada por Esherichia coli, klebsiella
pneumoniae y pseudomonas aeruginosa. Los patógenos
Gram-positivos, tales como los estafilococos y los
estreptococos, son la segunda causa principal de sepsis. El tercer
grupo en importancia incluye los hongos. Las infecciones por hongos
constituyen un porcentaje relativamente pequeño de casos de sepsis,
pero éstos dan lugar a una tasa alta de mortalidad.
Un mecanismo bien establecido en sepsis se
relaciona con los componentes tóxicos de bacterias
gram-negativas, es decir la estructura de pared
celular lipopolisacárida (LPS, endotoxina), que se compone de un
grupo ácido graso, un grupo fosfato y una cadena de
carbohidratos.
Se han identificado varias de las respuestas de
huésped a las endotoxinas, tales como la liberación de citoquinas
que se producen localmente. En caso de una estimulación extensiva,
sin embargo, existe un vertimiento sobre la sangre periférica y se
obtienen efectos potenciales dañinos, tales como disfunción inducida
de órganos.
Los mediadores clave de choque séptico son el
Factor de Necrosis Tumorales (TNF-\alpha),
interleuquina 1 (II-1) e interleuquina 17
(II-17), que se liberan mediante monocitos y
macrófagos. Estos actúan de manera sinérgica causando una cascada de
cambios fisiológicos que conducen a un colapso de circulación y
fallo multiorgánico. En realidad, las altas concentraciones de
TNF-\alpha pueden imitar los síntomas y resultados
de la sepsis.
Normalmente, las endotoxinas se mantienen dentro
del lumen del intestino. Por ejemplo, durante la desviación
(by-pass) cardio-pulmonar la
presencia de isquemia esplácnica o disoxia da lugar a disrupción o
rompimiento de la barrera mucosa y la translocación (es decir, el
transporte de endotoxinas del intestino al sistema circulatorio) de
endotoxinas del lumen de la víscera al portal de circulación.
Los antibióticos de tipos variantes son
ampliamente usados para prevenir y tratar infecciones. Sin embargo,
para muchos antibióticos usados comúnmente se desarrolla una
resistencia a antibióticos entre diversas especies de bacterias.
Esto es particularmente cierto para la flora microbiana residente en
hospitales, donde los organismos están bajo presión constante
selectiva para desarrollar resistencia.
Por otra parte, en el hospital la alta densidad
de pacientes potencialmente infectados y el contacto extenso de
personal con personal y de personal con paciente facilita la
difusión de organismos resistentes a antibióticos. Los antibióticos
usados son los más económicos, los más seguros y los más fáciles de
administrar y pueden no tener un espectro lo suficientemente amplio
para suprimir ciertas infecciones.
Los antibióticos pueden tener una toxicidad de
niveles variados causando alergias, interacciones con otras drogas y
causando daños directos a los órganos principales (por ejemplo,
hígado, riñón). Muchos antibióticos cambian también la flora
intestinal normal que causan diarrea y una mala absorción
nutricional.
Se conocen ciertos antibióticos para neutralizar
la acción de endotoxinas, tales como la polimixina B. Este
antibiótico se enlaza con la parte A lipídica de la endotoxina y
neutraliza su actividad. La polimixina no se usa rutinariamente
debido a su toxicidad. Solo se da a pacientes bajo supervisión
constante y monitoreando su función renal.
Por otra parte, para superar algunas de las
limitaciones inherentes a la inmunización activa contra componentes
bacteriales, se han usado diversas técnicas para producir
anticuerpos que enlazan la endotoxina. Se ha preparado un número
grande de anticuerpos mediante inmunización de humanos con
bacterias. Para desarrollar preparaciones más consistentes de
anticuerpos terapéuticos, se han desarrollado numerosos anticuerpos
monoclonales reactivos a LPS. Desafortunadamente, los estudios
clínicos no han dado lugar a beneficios. Sin embargo, se debe notar
que estos intentos se llevaron a cabo en humanos después del
principio de los síntomas de sepsis. Se cree ampliamente que un
tratamiento de anticuerpo anti-endotoxina,
administrado después de la sepsis puede dar poco beneficio debido a
que estos anticuerpos no pueden reversar la cascada inflamatoria
iniciada por la endotoxina.
En JP 06022633 se muestra un adsorbente para
anticuerpos antilipídicos que comprende un compuesto con un grupo
funcional aniónico inmovilizado en un material poroso insoluble en
agua. El material poroso puede ser agarosa, celulosa, dextran,
poliacrilamida, vidrio, gel de sílice o un polímero duro hecho de un
copolímero de estireno-divinilbenceno, y el material
poroso se empaca como un lecho de partículas separadas en un
dispositivo de separación.
Han sido preparados diferentes materiales
absorbentes con la intención de retirar componentes de la sangre. En
WO 01/23413 se muestra un adsorbente para retirar endotoxina el cual
comprende un ligando inmovilizado sobre un medio soporte de fase
sólida. Un medio de soporte preferido se encuentra en forma de
perlas. Cuando está empacado en un dispositivo de separación, el
medio soporte de fase sólida es lo suficientemente poroso como para
permitir el paso de células de sangre entre las perlas.
En WO 00/62836 el material adsorbente tiene un
tamaño y una estructura adaptados para retirar
\beta-2 microglobulina de la sangre. El material
adsorbente de este documento puede ser un polímero sintético
macroporoso con una superficie de perlas y de poros modificada de
tal manera que prevenga adsorción de proteína y plaquetas. Sin
embargo, las perlas esféricas individuales del polímero se
destruyeron mecánicamente a una carga de alrededor de 500 g, lo cual
se obtiene en, por ejemplo, una columna empacada con las perlas. Una
carga así da lugar a una baja de presión en la
columna.
columna.
Para reducir la baja de presión se ha preparado
un absorbente en EP 464872, el cual comprende partículas de gel duro
poroso insoluble en agua que tienen un límite de exclusión de
10^{6}-10^{9} Dalton, El lecho de gel se usa
para remoción selectiva de lipoproteínas de sangre o plasma en
tratamiento de circulación extracorpóreo.
De manera similar, en WO 01/23413 el material
poroso de soporte para retirar la endotoxina son perlas con las que
se puede llenar un contenedor y que tienen un tamaño suficiente para
suministrar el espacio requerido entre las perlas empacadas en una
columna o lecho de filtro. El material poroso de soporte pueden
también ser fibras huecas de microfiltración o membranas planas
laminadas para minimizar caídas de presión.
En EP 424698 se muestra un adsorbente para
eliminar biomacro-moléculas, el cual consiste en un
vehículo de partículas porosas esféricas que tienen un tamaño de
partícula de 50-150 micrones y un límite de
exclusión de por lo menos 105 Dalton. La polimixina B se acopla a
las partículas con las que se llena un cartucho a usarse en un
sistema para remoción extracorpórea de endotoxina de la sangre
entera.
En estos sistemas tradicionales para retiro
extracorpóreo de componentes tóxicos de la sangre, se llena primero
un contenedor o cartucho con un líquido y las perlas porosas
adsorbentes se introducen después. En US 6,408,894 se muestra un
método que proporciona una distribución más uniforme y un empaque
más denso de las perlas. El método involucra suministrar
forzadamente una mezcla de líquidos y perlas en un contenedor de tal
manera que el líquido haya sido exprimido de la mezcla y fuera del
contenedor.
Así, una eliminación de células de sangre
facilita el retiro de componentes presentes en plasma tal como se
describe arriba, por ejemplo en WO 00/62836 ó WO 01/23413. Sin
embargo, una técnica así involucra dos pasos de separación que
podrían contribuir a un riesgo aumentado de activación celular
adversa debido a bioincompatibilidad.
El propósito de la presente invención es
suministrar un método nuevo para enlazar de manera selectiva y
separar por lo menos un componente de la sangre entera o de los
fluidos corporales, mediante el cual se eliminan los problemas
arriba mencionados en conexión con procesos inflamatorios.
Otro propósito es suministrar un método así,
mediante el cual el enlazamiento selectivo y la separación se pueden
realizar sobre la sangre entera sin la necesidad de separar la
sangre en plasma y células sanguíneas.
Otro propósito de la invención es suministrar un
método que no sea dependiente del tamaño, es decir, los componentes
de la sangre no se separan por medio de exclusión.
Un objetivo más de la invención es suministrar
un método, mediante el cual se pueden obtener altas tasas de flujo
en un dispositivo de separación sin caídas significativas de presión
en el tiempo.
Otro propósito más es suministrar un método tal
que no se someta la sangre a fuerzas de corte en un dispositivo de
separación incluso a tasas altas de flujo mientras se mantienen una
línea baja de presión para evitar daño a los vasos sanguíneos.
Estos objetivos se logran mediante la presente
invención que tiene los rasgos característicos de la reivindicación
1. Otras ventajas de la invención se volverán aparentes de la
reivindicación 24 y de las sub-reivindicaciones.
De acuerdo con la invención, se proporciona un
método para enlazar y separar selectivamente por lo menos un
componente de sangre entera o un fluido corporal. Se deja pasar la
sangre o fluido corporal por una matriz rígida íntegra de separación
sin ser excluida de allí, teniendo la matriz una estructura porosa
con un tamaño de poro que abarque desde 5 micrones hasta 500
micrones y una superficie activa que abarca desde 0.5 cm^{2} hasta
10 m^{2}, enlazando por lo menos un componente de fluido corporal
mediante por lo menos un grupo funcional dispuesto en dicha matriz,
por lo cual dicha matriz se obtiene mediante un proceso seleccionado
de un grupo que comprende: proceso de sinterizar, moldear y
espumar.
En una realización preferida de la invención la
matriz además comprende por lo menos un grupo funcional que ha sido
introducido por medio de revestimiento y/o modificación de
superficie de la estructura porosa. Esto da lugar a que la
superficie activa obtenida, sola o en combinación con regiones no
funcionarizadas de la misma, es capaz de enlazar selectivamente por
lo menos un componente de sangre entera o fluido corporal. Los
componentes a ser retirados pueden ser naturales así como no
naturales, es decir un ligando específico, tal como un anticuerpo
que se pega al componente.
Por otra parte, los grupos funcionales,
obtenidos por medio de conversión selectiva directa o indirecta de
la superficie de la estructura porosa, han sido usados además para
inmovilización de ligandos. Sin embargo, los grupos funcionales de
la estructura porosa se pueden utilizar tal como se usan en el
método inventivo.
El tamaño de poro así como la superficie de la
estructura porosa semejante a un esqueleto han sido adaptados para
usarse en la matriz de separación del método inventivo en conexión
con la purificación de sangre entera. Sin embargo, el método de
acuerdo con la invención también se puede usar para retirar
componentes de otros fluidos corporales así como también de
soluciones acuosas. Es un aspecto importante de la invención que no
se excluya de la matriz ningún componente ni ningún solvente durante
un procedimiento de separación.
De acuerdo con la invención, la matriz integral
rígida debe tener una superficie disponible de 0.5 cm^{2} hasta 10
m^{2}, y la densidad de la estructura de la matriz no es limitante
para llevar a cabo el método inventivo.
En este contexto, el término "rígido"
significa que la matriz no es flexible, no se flexiona o cede, pero
es capaz de resistir una presión de por lo menos 0,5 bar. El término
"integral" significa que la matriz con gran superficie de área
es una entidad entera.
La estructura porosa de la matriz en el método
de la invención está hecha de metal, óxido inorgánico, carbono,
vidrio, cerámica, polímero sintético y/o polímero natural, o mezclas
de los mismos. Las estructuras porosas sólidas de metal con tamaños
de poro bien y grandes áreas de superficie bien definidos se pueden
fabricar usando procesos de sinterización controlados estrictamente
produciendo poros de tamaño uniforme.
Se han producido diferentes polímeros como un
material poroso moldeado o extrudido con una estructura porosa que
tiene el tamaño de poro deseado así como también un área grande de
superficie para la matriz. Ellos también se han producido en calidad
de espuma. Por ejemplo, los poliuretanos preparados a partir de
isocianatos y otros compuestos orgánicos diversos tienen átomos
activos de hidrógeno que han sido usados para producir productos de
poliadición. Este hidrógeno activo puede provenir de compuestos
bifuncionales o polifuncionales, tales como polialcoholes,
poliaminas. Las reacciones con agua ocasionan aminas primarias que
se han usado para inmovilización covalente de ligandos
específicos.
Se ha usado una amplia variedad de metales y
aleaciones, tales como acero inoxidable, níquel, titanio, monel,
inconel, hastelloy y otros materiales especiales de metal. Los
óxidos inorgánicos de gran área de superficie, especialmente alúmina
y circonio, también se han utilizado con las mismas técnicas para
producir materiales cerámicos con estructuras de poro definido.
Similarmente, se pueden adquirir tales cerámicas así como vidrio
sinterizado, que tienen tamaños de poro adecuado.
También se han usado otros materiales naturales
rígidos, tales como sílice amorfa, por ejemplo zeolitas y roca de
lava.
Materiales naturales e híbridos de los mismos,
que se pueden usar como un material de matriz en el método de la
invención son los polisacáridos, tales como la celulosa y otros
materiales poliméricos de carbohidratos. Otros materiales
poliméricos naturales apropiados son los poliaminoácidos, también
aquellos que involucran aminoácidos sintéticos, ácido poliláctico,
ácido poliglicólico y sus copolímeros con ácido láctico.
En este contexto el término híbrido abarca
derivados de materiales naturales como por ejemplo diacetato de
celulosa que es un derivado preferido polisacárido.
Los polímeros sintéticos adecuados para la
matriz a ser utilizada en la presente invención son poliolefinas,
tales como el polietileno, polipropileno, el polibutileno, el
polimetilpenteno y copolímeros de acetato de etileno vinilo;
polímeros vinílicos, tales como alcohol polivinílico, acetales
polivinílico y polivinilpirrolidona; polímeros que contienen flúor,
tal como politetrafluoretileno, copolímero fluorado de
etileno-propileno, policlorofluoroetileno,
polivinilfluoruro y fluoruro de polivinilideno; poliacrilatos, tales
como polimetilmetacrilato, cianoacrilato, polyacrilonitrilo, y
polimetacrilatos; poliamidas, tales como poliacrilamida; poliimidas,
tales como polietileniminas; polistyreno y sus copolímeros, tales
como poliestireno y polímeros de
acrilonitrilo-butadieno-estireno;
gomas de silicona; poliésteres/éteres; policarbonatos; poliuretanos;
polisulfonatos; poliglicoles; polialquideoxidos tales como
polietilenóxido, polipropilenóxido; y copolímeros o híbridos de los
mismos.
En la realización preferida, por lo menos un
grupo funcional se ha introducido en una estructura porosa de la
matriz rígida de separación. Los grupos funcionales pueden ser de
diferente tipo, es decir, de tipo aniónico, catiónico o no iónico.
Los grupos funcionales de la estructura porosa se han usado para
enlazar covalentemente substancias como péptidos/proteínas y ácidos
biliares (por ejemplo, ácido deoxicólico), anticuerpos y fragmentos
de los mismos así como también otras moléculas y substancias que
tienen la habilidad de enlazar selectivamente endotoxinas y/o
mediadores pro-inflamatorios.
Una modificación superficial, es decir, una
funcionalización de superficie de una manera directa, se llevó a
cabo mediante electrodeposición,
electro-evaporación, deposición química de plasma,
deposición de un flujo de plasma iónico o deposición de vapor
químico (por ejemplo polimerización de plasma, deposición de
polímero con superficie aumentada por plasma). Los métodos de
modificación de superficie son conocidos per se y se
encuentran en "Modificación de superficie por plasma y
polimerización por plasma" por N. Inagaki, 1996, Technomic
Publishing, Lancaster, Estados Unidos de América. Por medio de estos
métodos han sido tratados diferentes estructuras tridimensionales
de matriz alcanzándose una modificación muy homogénea de la
superficie activa.
Polimerización de monómeros bifuncionales de
dobles enlaces acrílico o alílicos con grupos polares como OH,
NH_{2}, CN y COOH han sido usados para producir polímeros de
plasma con alta densidad de los grupos funcionales. Por ejemplo, se
ha llevado a cabo una funcionalización de superficie de las
superficies inorgánicas y orgánicas en un medio de plasma de
compuestos alílicos, tales como la alilamina.
Se han hecho también posibles las superficies
poliméricas en medios de plasma de NH_{3}, O_{2} ó CO_{2}, las
cuales ocasionan cualquiera de los grupos funcionales =NH,
-NH_{2}, =CN, -OH, o -COOH. Otros ejemplos de gases usados son
bien conocidos en el arte.
Un procesamiento plasma-químico
se ha combinado también con la síntesis química clásica,
aumentándose significativamente la selectividad de modificaciones de
superficie para polímeros. Un enfoque ha sido aplicar una
funcionalización específica de superficie por gas de plasma
inmediatamente seguida por una unificación química de los grupos
funcionales de plasma coexistentes.
Otra forma de introducir los grupos funcionales
es por medio de una funcionalización directa, es decir, revistiendo
la superficie con un material polimérico. En este contexto el
polímero sintético o natural se ha revestido sobre un metal de gran
superficie, óxido inorgánico, carbón, vidrio, cerámica, así como
también otro polímero sintético adecuado y/o polímero natural o
mezclas de los mismos.
Muchos de los polímeros mencionados arriba,
especialmente aquellos sin grupos funcionales, tales como el
polietileno, polipropileno, politetrafluoretileno, etc. necesitan
más tratamiento para alterar sus propiedades de superficie. Así, un
tratamiento de plasma o corona, como se menciona arriba, de la
superficie polimérica generará un grupo funcional muy único, como el
grupo hidroxilo, el carbonilo, el carboxilo, el amino y el imino,
etc, los cuales están pegados covalentemente a la superficie.
El revestimiento también se ha llevado a cabo
por medio de adhesión o adsorción de una substancia polimérica que
tiene grupos funcionales. Ejemplos de tales substancias son la
polilisina, poliarginina y la polietilenimina.
Por ejemplo, usando una técnica de plasma, se
obtuvieron substancias similares a polietilenimina sobre la
superficie porosa. Cuando se usa una matriz de separación en el
método de acuerdo con la invención para enlazar selectivamente y
separar por lo menos un componente de sangre entera o de un fluid
corporal, tanto las regiones hidrofílicas como las hidrofóbicas de
los componentes proteínicos de la sangre pueden interactuar con la
superficie procesada para retirar los componentes deseados. Después
de la funcionalización cuando la superficie de la matriz para enlace
y separación selectivos comprende una poliolefina, por ejemplo un
polietileno o polipropileno, las cargas positivas de los grupos
amino se usan de manera similar para interacciones electrostáticas y
las regiones hidrofóbicas se usan para interacciones hidrofóbicas.
Este enfoque se usa en el método de la invención para el enlace
selectivo de regiones diferentes de lipopolisacáridos, por
ejemplo.
Se pueden funcionalizar polímeros y metales que
tienen hidroxilos reactivos, por ejemplo, por medio de la
silanización.
Por consiguiente, diversos grupos funcionales
diferentes se han acoplado covalentemente a una estructura de matriz
porosa de gran superficie. Después de una funcionalización directa o
indirecta, la estructura porosa puede tener tanto regiones
hidrofílicas como hidrofóbicas, las cuales pueden interactuar con
los diferentes componentes de la sangre. Así, las propiedades
características de una substancia de interés se utilizan al preparar
la superficie a ser usada en el método de acuerdo con la
invención.
Preferiblemente, los grupos funcionales de la
superficie activa son sulfihidrilos, carboxilatos, aminas,
aldehídos, cetonas, hidroxilos, halógenos, hidrazidas e hidrógeno
activo.
En otra realización preferida se ha acoplado un
ligando a por lo menos un grupo funcional de la estructura porosa de
gran superficie de una manera covalente. En este contexto, un
ligando es una substancia con alta afinidad por el componente que se
va a retirar de la sangre entera o de un fluido corporal. Así, el
ligando se usa para aumentar las propiedades de adsorción y la
eficacia de enlazamiento.
El ligando puede ser una proteína,
preferiblemente una proteína recombinante, un péptido, un anticuerpo
o un fragmento del mismo, un carbohidrato, por ejemplo un
polisacárido, una hormona, un antioxidante, una glicoproteína, una
lipoproteína, un lípido, una vitamina soluble en grasa, por ejemplo
vitamina E, un ácido biliar, un colorante reactivo, alantoina, ácido
úrico o polimixina o combinaciones de los mismos.
Un ácido biliar adecuado es ácido deoxicólico
que es una substancia hidrofóbica endógena. Un ácido biliar así
puede acoplarse ya sea directamente con los grupos funcionales, por
medio de un espaciador, o acoplarse por medio de una molécula grande
y se usa luego para retirar endotoxinas de la sangre, fluidos
corporales y soluciones acuosas como en el método de acuerdo con la
invención.
En este contexto un espaciador es una molécula,
grande o pequeña, la cual conecta al ligando con la superficie de la
estructura porosa.
Por ejemplo, si en el método de la invención la
estructura porosa de la matriz de separación comprende una
poliolefina que tiene un grupo amino añadido, este grupo puede tener
una albúmina acoplada al mismo y a su vez por lo menos una fracción
de ácido biliar acoplada a esta molécula grande.
De esa manera, la invención también se refiere a
un nuevo uso de una fracción de ácido biliar inmovilizada sobre un
soporte para eliminar un componente de una solución acuosa que
comprende la misma. Preferiblemente, la fracción de ácido biliar es
una fracción de ácido deoxicólico.
Por consiguiente, un soporte sólido adecuado
para la inmovilización de la fracción de ácido biliar es una matriz
rígida integral de separación que tiene una estructura porosa con un
tamaño de poro que abarca desde 5 micrones hasta 500 micrones,
preferiblemente desde 70 micrones hasta 170 micrones y una
superficie activa que abarca desde 0,5 cm^{2} hasta 10
m^{2}.
También se prefiere que el ligando de la matriz
en el método inventivo sea albúmina o una albúmina producida por
medio de tecnología recombinante, que se puede usar en lugar de
albúmina de suero, polimixina B (es decir, grupos cargados sobre una
estructura hidrofóbica) o ácido deoxicólico.
Así, un ligando también puede actuar como un
espaciador en el método de acuerdo con la invención. Por ejemplo,
también ha sido posible primero pegar covalentemente una proteína
humana recombinante u otra molécula grande (por ejemplo, ácido
hialurónico) a la estructura porosa, que permite un enlazamiento
consiguiente del ligando específico para el componente que va a ser
retirado.
Si es necesario, se acopla un reticulador entre
por lo menos un grupo funcional y el ligando de una manera
covalente. En este contexto, un reticulador es un elemento que
enlaza covalentemente el ligando con la estructura porosa de
soporte, siendo el elemento un separador al ligar el ligando a una
distancia de la misma estructura porosa. Tales separadores
moleculares se conocen en el arte. Se han introducido para
incrementar la afinidad por el componente a enlazarse y separarse de
sangre entera o de fluidos corporales suministrando una mejor
disponibilidad a los ligandos. La biocompatibilidad de la superficie
de la estructura porosa de la matriz también se incrementa por la
introducción de estos separadores moleculares.
Un reticulador/separador puede comprender un
reticulador de longitud cero, solo o en combinación con un
reticulador de intermedio, estando el complejo final obtenido
enlazado en virtud de substancias químicas que añaden estructuras a
la substancia reticulada. Estos reticuladores intermedios pueden ser
del tipo homobifuncional.(por ejemplo, dialdehidos),
heterobifuncional (por ejemplo aminoácidos) o del tipo reticulador
trifuncional.
El principal propósito del separador es
incrementar la biodisponibilidad del ligando específico
utilizado.
El separador puede ser por ejemplo un silano, un
diisocianato, un glicolato, un polietilenglicol, un reactivo de
succinimidilo, una dihidrazina, ácido adipídico, una diamina, un
amino ácido, un poli u oligoaminoácido, un poliaminoácido, un
péptido o una proteína. La proteína es preferiblemente una proteína
humana recombinante.
Los grupos funcionales del reticulador se
diseñan para reaccionar con grupos amino (Lys, Arg), con
sulfihidrilos (Cys), o con carboxilos (Asp, Glu), para citar algunos
ejemplos.
En conexión con la química de grupos reactivos,
se hace referencia a las Técnicas Bioconjugadas (Bioconjugate
Techniques), Greg T Hermanson, Academic Press, USA 1996.
Así, la superficie de la matriz activa porosa es
capaz, en el método inventivo, de retirar endoxinas, por ejemplo,
solas o en combinación en regiones no funcionarizadas de la
superficie disponible de la estructura porosa. La superficie activa
también se puede usar como una herramienta para inmovilización
covalente de químicos, tales como biomoléculas como aminoácidos,
polipéptidos y anticuerpos para elevar selectivamente la eliminación
de tales componentes específicos.
Una matriz de separación destinada a retirar
selectivamente por lo menos un componente de sangre entera o de
fluidos corporales se puede producir con una estructura porosa de un
cierto tamaño de poro y/o cierto rango de tamaño de poro en
dependencia de la aplicación destinada. Preferiblemente, la
estructura de poro debe permitir el paso de células sanguíneas. Por
consiguiente, ciertos tipos de células sanguíneas también se pueden
retirar de sangre entera por medio del método de la invención. Tales
células enfermas o células con receptores de superficie específicos,
como por ejemplo células fagocitantes activadas.
La estructura de metal puede ser magnética para
aplicaciones especiales. Una matriz magnética se puede obtener por
ejemplo mediante revestimiento de magnetita sinterizada con un
polímero, por ejemplo polietileno. Una remoción eficiente de células
se puede llevar a cabo permitiendo que los anticuerpos, con una
etiqueta de hierro magnético dextran, se peguen a células
específicas en la sangre.
El tamaño de poro debe estar dentro del rango
desde 5 micrones hasta 5000 micrones, preferiblemente desde 70
micrones hasta 170 micrones, más preferiblemente desde 80 micrones
hasta 100 micrones para que se mantengan latas tasas de flujo sin
daño celular o exclusión celular. Así, la separación realizada con
el método de acuerdo con la invención no se basa en una distribución
de tamaños de los componentes. Virtualmente todos los componentes de
sangre entera o de un fluido corporal pueden ser eliminados por
medio del método inventivo.
Después de retirar uno o más de los causantes
tóxicos primarios, es decir una endotoxina, otros causantes tóxicos
secundarios se pueden retirar. Los causantes secundarios pueden ser
citoquinas (por ejemplo, TNF-\alpha),
interleuquinas (por ejemplo, II-1), oxígeno reactivo
y radicales nirogenados, etc.
Al llevar a cabo el método de acuerdo con la
invención, una o más matrices de separación se protegen dentro de
una carcasa, que puede tener diversas formas y diferentes y/o
variables entradas y salidas dependiendo de la aplicación. Un
dispositivo así puede entonces usarse para retirar endotoxina y/o
citoquina y/o neutralizar citoquina. Esto se lleva a cabo haciendo
pasar sangre u otros fluidos corporales a través del dispositivo,
aplicado de manera intra-, para- o
extra-corporalmente, sin excluir al líquido de la
matriz rígida íntegra de separación, el cual está allí. La
superficie activa de la estructura porosa, los grupos funcionales
y/o los ligandos específicos sobre ella enlazan entonces
selectivamente y separan por lo menos un componente del líquido. El
dispositivo puede ventajosamente usarse también para retirar
endotoxinas de soluciones acuosas.
Un rasgo importante del método inventivo es que
se pueden cubrir todos los aspectos del choque séptico, es decir
tanto los causantes tóxicos primarios como los secundarios se pueden
retirar por medio del método inventivo.
Se hace referencia a la figura 1 en conexión con
la realización del método de acuerdo con la invención. Un
dispositivo 1 comprende una carcasa 2, estando la carcasa (o
cartucho) del dispositivo integrado en una circulación cerrada, en
la cual la sangre entera o los fluidos corporales se hacen circular
por medio de una bomba. En la carcasa 2 está dispuesta por lo menos
una matriz de separación 5a, 5b, ..., cada una destinada a retirar
selectivamente un componente de sangre entera o de fluidos
corporales. La carcasa 2 se provee de una entrada 3 y una salida 4,
los sitios de las cuales no son de importancia mientras se obtenga
un flujo adecuado dentro de una o más matrices de separación y la
carcasa. La bomba se dispone preferiblemente corriente arriba de la
entrada 3.
De esta manera se obtiene un dispositivo que
puede mantener tasas de flujo desde 5 ml/h hasta 6 000 ml/min sin
una caída significativa de presión. Al aplicarse extracorporalmente
se obtiene una presión en la línea de no más de 300 mm de Hg desde
la bomba hasta la cánula incluso a tasas de flujo muy altas.
La matriz rígida integral de separación se puede
producir en diferentes formas a ser usadas en el método inventivo.
Se puede diseñar por ejemplo como un disco, una barra, un cilindro,
un anillo, una esfera, un tubo, un tubo hueco, una lámina plana u
otras formas moldeadas.
Puesto que el flujo dentro de cada matriz de
separación es dependiente de su porosidad, se puede controlar el
tiempo de contacto de los componentes en sangre o en un fluido
corporal con la superficie de contacto. Por otra parte, se puede
crear un gradiente de flujo deseado dentro de un dispositivo de
separación cambiando la porosidad y configuración de las matrices
individuales de separación que allí se encuentran.
En las figuras 2 y 3 se muestran diferentes
realizaciones esquemáticas de dispositivos, que se pueden usar al
realizar el método de acuerdo con la invención. Las flechas indican
el flujo de sangre o fluido corporal dentro de las matrices
individuales de separación y las carcasas para ellas; las flechas
grandes indican una tasa mayor de flujo que las flechas pequeñas. En
estos ejemplos de configuraciones diferentes, las matrices de
separación pueden tener las mismas porosidades o diferentes
porosidades, con o sin el mismo tipo o diferente tipo de grupos
funcionales o ligandos para retirar uno o varios componentes de
sangre o de un fluido corporal.
Las matrices de separación se integran
preferiblemente con las carcasas (que tienen cada una entrada 3 y
una salida 4) para asegurar que no se impida entrar a líquido o
componentes allí presentes a la matriz o matrices, es decir que sean
excluidos de allí. En la figura 2 (a) y (b) se dan ejemplos de una
matriz de separación 5 dentro de una carcasa 2, siendo la matriz de
diferentes configuraciones. En la figura 2 (c) y (d) se muestran
ejemplos de dos matrices de separación 5a y 5b dentro de una carcasa
2. En el dispositivo de la figura 2 (c) un revestimiento impermeable
6, tal como una piel aplicada, en la periferia externa de la matriz
de separación 5a asegura que todo el material suministrado al
dispositivo pasará por esta matriz entera. En el dispositivo de la
figura 2 (d), por otra parte, algo del material suministrado tendrá
un tiempo más corto de residencia en la matriz de separación 5a que
en la matriz de separación 5b, y
viceversa.
viceversa.
En la figura 3 cada dispositivo comprende varias
matrices de separación 5a-5g. En la figura 3 (a) una
pared de tabique 7 asegura un flujo a través de todas las matrices.
Las matrices de separación se pueden posicionar lateralmente o
transversalmente en relación con su dirección longitudinal, tal como
en la s figuras 3 (b) y (c), respectivamente. En la figura 3 (d) el
dispositivo comprende matrices de separación de diferentes
tamaños.
En conclusión, el método inventivo se puede usar
con un dispositivo aplicado intra- para- o
extra-corporalmente o puesto solo, el cual de esa
manera es capaz de reducir la circulación de endotoxinas y
mediadores potencialmente dañinos por inflamatorios, especialmente
TNF-\alpha, IL-1 e
IL-17, preferiblemente en sangre. También es posible
retirar selectivamente endotoxinas de otras soluciones acuosas. Se
considera que los componentes se enlazan con la superficie activa de
la matriz rígida integral de separación por medio de la
adhesión.
Ahora la invención seguirá describiéndose e
ilustrándose por referencia a los siguientes ejemplos, que han sido
seleccionados cuidadosamente para abarcar la invención. Por
consiguiente, estos ejemplos no deben ser interpretados de ninguna
manera como limitantes de la invención.
La superficie de una matriz de polietileno
poroso (Porex Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de
350 micrones y una superficie activa de 10 cm^{2}, fue modificada
por medio de deposición de vapor químico aumentada con plasma usando
O_{2} (Plasma Science, Estados Unidos de América, Tipo PS 0350
Plasma Surface Treatment System (Sistema de tratamiento de
superficie con plasma)).
La formación de grupos hidroxilo sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se ensayó con
la prueba de Dye, confirmándose su hidrofilicidad.
La superficie de una matriz de polietileno
poroso (Porex Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de
100 micrones y una superficie activa de 20 cm^{2}, se modificó por
medio de deposición de vapor químico aumentada con plasma usando
O_{2} (Plasma Science, Estados Unidos de América, Tipo PS 0350
Plasma Surface Treatment System (Sistema de tratamiento de
superficie con plasma)).
La formación de grupos carboxílicos y la
cantidad sobre la superficie de estructura porosa de la matriz
obtenida se determinó mediante conversión hacia ácidos hidroxámicos.
En este contexto todos los ácidos hidroxámicos dan un color rojo o
violeta con cloruro férrico en solución ácida, tal como se describe
en Feigel et al.; Microchemie 15:18, 1934.
La superficie de una matriz de polietileno
poroso (Porex Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de
170 micrones y una superficie activa de 0,04 m^{2}, se modificó
por medio de polimerización en plasma usando alilamino (Plasma
Science, Estados Unidos de América, Tipo PS 0350 Sistema de
tratamiento de superficie con plasma).
La cantidad de aminas primarias sobre la
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó por medio de
ensayo con ácido sulfónico de trinitro benceno (TNBS).
La superficie de una matriz de polietileno
poroso (Porex Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de 70
micrones y una superficie activa de 0,26 m^{2}, fue modificada por
medio de polimerización con plasma usando ácido acrílico (Plasma
Science, EE.UU, Tipo PS 0350 Sistema de tratamiento de superficie
con plasma).
La cantidad de grupos hidroxilo sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se ensayó como
se describe en el ejemplo 2.
La superficie de una matriz de polietileno
poroso (Porex Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de 5
micrones y una superficie activa de 0,9 m^{2}, se modificó por
medio de polimerización en plasma usando NH_{3} (Plasma Science,
USA, Tipo PS 0350 Sistema de tratamiento de superficie con
plasma).
La cantidad de aminas primarias de la superficie
de estructura porosa de la matriz obtenida se ensayó como se
describe en el ejemplo 3.
La superficie de una matriz de
politetrafluoroetileno, PTFE (W.L. Gore & Associates Inc., USA),
que tiene una porosidad de 10 micrones y una superficie activa de
100 cm^{2}, fue modificada por medio de deposición de vapor
químico aumentada con plasma usando NH_{3} (Plasma Science, USA,
Tipo PS 0350 Sistema de tratamiento de superficie con plasma).
La cantidad de aminas primarias sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida fue ensayada
como se describe en el ejemplo 3.
La superficie de una matriz de poliestireno
poroso (Dow Chemical, Estados Unidos), que tiene una porosidad de 10
micrones y una superficie activa de 300 cm^{2} fue modificada por
medio de deposición de vapor químico aumentada con plasma usando
CO_{2} (Plasma Science, USA, Tipo PS 0350 Sistema de tratamiento
de superficie con
plasma).
plasma).
La cantidad de grupos carboxílicos sobre la
estructura porosa de la matriz obtenida se ensayó como se describe
en el ejemplo 2.
La superficie de una matriz de poliuretano
poroso (Polymers Unlimited, Suecia), que tiene una porosidad de 80
micrones y una superficie activa de 100 cm^{2}, fue modificada por
medio de una solución al 2% de un silano alcoxi aldehídico, (Art No.
PSX 1050, United Chemical Technologies Inc., Estados Unidos) en 95%
de etanol. El pH de la solución se ajustó a pH 5,5 con ácido acético
y la solución se difunde a través de la matriz, la cual se incubó
por una noche a temperatura ambiente y luego se lavó con suero
fisiológico al 0,9%.
La funcionalidad de aldehído de la matriz
obtenida se evaluó usando una aceleración catalítica de la oxidación
de p-fenilendiamina con peróxido de hidrógeno,
siendo oxidad la p-fenilendiamina por el peróxido de
hidrógeno en una solución ácida, conocida como la base de
Bandrowski.
La superficie de una matriz de un silicona
porosa (Nusil, Francia), que tiene una porosidad de 200 micrones y
una superficie active de 0,5 m^{2}, se modificó por medio de una
solución al 2% de una amino-silano (Art No. 0750,
United Chemical Technologies Inc., Estados Unidos) en etanol al 95%.
La solución se difundió a través de la matriz, la cual se incubó por
una noche a temperatura ambiente y se lavó finalmente con suero
fisiológico al 0,9%.
La cantidad de aminas primarias en la superficie
de estructura porosa de la matriz obtenida fue ensayada como se
describe en el ejemplo 3.
Se disolvió poli-lisina (200 mg)
en 10 ml de una solución de carbonato de sodio de 50 mM y se
sumergió en la solución una matriz de policarbonato poroso con una
porosidad de 100 micrones (MicroPore Plastics, USA) y se mantuvo a
4°C por 24 horas para obtener un enlace covalente entre la
poli-lisina y la matriz de policarbonato. Esta
matriz porosa se lavó finalmente con agua destilada en exceso.
La cantidad de aminas primarias sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se ensayó como
se describe en el ejemplo 3.
La matriz de polietileno poroso obtenida de
acuerdo con el ejemplo 4 se difundió con una solución acuosa de
1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida
meto-p-toluenesulfonato (WCCM)
(Aldrich) a una tasa de flujo de 5 ml/min en un circuito cerrado a
temperatura ambiente por 6 h. Luego se enjuagó con agua y finalmente
se adicionó una solución de polietilenimina (Sigma) (10 mg/ml, pH
7.0) y se incubó la matriz por una noche.
La cantidad de aminas primarias sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se ensayó como
se describe en el ejemplo 3.
La matriz de polietileno porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 3 se conjugó usando glutardialdehído al 1,0%
en un buffer de fosfatote 0,2M, pH 7,5 y difundido a una tasa de
flujo de 1 ml/min por 6 horas a temperatura ambiente. La matriz se
lavó luego con buffer antes de la incubación con solución de ácido
hialurónico (2 mg/ml) por 16 horas a temperatura ambiente. Se retiró
finalmente el exceso de ácido hialurónico.
El contenido de ácido hialurónico sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se verificó y
determinó con Alcian Blue (Sigma)
Una matriz de polietileno poroso (Porex
Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de 70 micrones y
una superficie activa de 0,18 m^{2}, fue difundida a una tasa de
flujo de 1 ml/min e un circuito cerrado por 16 horas a temperatura
ambiente con solución de ácido hialurónico de 2 mg/ml (BioHyos,
Sweden, 12 106 Da) a un pH 3,3, el cual se ajustó con HCl de 0,1
M.
El contenido de ácido hialurónico en la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se verificó
tal como en el ejemplo 12.
Una matriz de polietileno poroso (Porex
Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de 70 micrones y
una superficie activa de 7.0 m^{2}, fue colocada en un tubo de
vidrio. El tubo, con la matriz porosa allí, se lleno con una
solución de poli-lisina al 0,13% (Sigma) en 350 ml
de agua y se ajustó el pH a pH 3,3 con HCl de 0,1 M. Entonces la
solución de polilisina se recirculó a través de tubo con su matriz
de filtro por 16 horas a temperatura ambiente a una tasa de flujo de
<5 ml/min. La matriz porosa finalmente se enjuagó con agua de
ósmosis inversa.
La cantidad de aminas primarias sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida fue ensayada
como se describe en el ejemplo 3.
Una matriz de polietileno poroso (Porex
Technologies, Alemania), que tiene una porosidad de 70 micrones y
una superficie active de 3,4 m^{2}, fue colocada en un tubo de
vidrio. El tubo con la matriz porosa allí se llenó con una solución
de Recombumin™ (Albúmina de Suero Humano Recombinante,
Hoechst-Pharma, USA) al 0.2% en 350 ml de agua de
ósmosis inversa y después ajustada a pH 3,3 con HCl de 0,1 M.
Luego, la solución de Recombumin™ se recirculó a
través del tubo con su matriz de filtro por 16 horas a temperatura
ambiente usando una bomba a una tasa de flujo de < 5 ml/min. La
matriz porosa se enjuagó finalmente con agua de ósmosis inversa.
El contenido de proteína de superficie sobre la
superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se determinó
usando Coomassie Brilliant Blue (BioRad, USA).
La matriz de polietileno poroso obtenida de
acuerdo con el ejemplo 4 se hace pernear con una solución de
polietilenimina (Sigma), 10 mg/ml, por una noche a una tasa de flujo
de 5 ml/min en un circuito cerrado. Luego, la matriz porosa se
enjuagó con agua.
La cantidad de aminas primarias en la superficie
de estructura porosa de la matriz obtenida se ensayó como se
describe en el ejemplo 3.
La matriz de polietileno poroso obtenida de
acuerdo con el ejemplo 5 se conjugó con deoxicolato (DOC) usando una
solución acuosa de WCCM. Se adicionó una solución de 300 ml de
dimetilformamida (DMF) (Sigma) al 40% en agua, la cual contenía 1
mmol de deoxicolato de sodio, al policarbonato poroso revolviendo
mientras se ajustaba el pH con HCl de 0,3 M a un pH 4,8. Una
solución de WCCM de 6 mM en DMF:agua (1:1,8) se adicionó luego por
un período de 10 minutos. La suspensión se mantuvo a un pH 4,8 por 3
horas mediante la adición de HCl de
0,3 M.
0,3 M.
El contenido de DOC sobre la superficie de
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó usando un Kit
de ácido biliar (Sigma).
\newpage
La matriz de polietileno porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 3 se conjugó usando glutardialdehído al 12%
en búfer de fosfato de 0,15 M, pH 7.0 por 24 horas a temperatura
ambiente. La matriz se lavó entonces con búfer de fosfato de 0,15 M
y luego se adicionaron anticuerpos anti CD14 (DAKO Dinamarca) a una
concentración de 1 mg/ml e incubado a 8°C por 24 horas. La reducción
siguiente con cianoborohidruro de sodio se realizó para producir
enlaces estables de amina secundaria.
El contenido de anticuerpo en la superficie de
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó directamente
por medio de espectroscopia UV de la solución de búfer anticuerpo
antes y después de la incubación con la matriz porosa.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 8 se lavó con búfer de fosfato de 0,15 M y
luego se adicionó un receptor IL-1 recombinante
(Kineret, Amgen, USA) a una concentración de 1 mg/ml y se incubó a
8°C por 24 horas. La reducción siguiente con cianoborohidruro de
sodio se realizó para producir enlaces estables de amina
secundaria.
El contenido de receptor IL-1 en
la superficie de estructura porosa de la matriz obtenida se
determinó indirectamente por medio de espectroscopia UV de la
solución de búfer receptor IL-1 antes y después de
la incubación con la matriz porosa.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 5 se conjugó usando glutardialdehído al 1,0%
y búfer de fosfato de 0,2 M, pH 7,5. La matriz se incubó con esta
solución por 3 horas. Después de lavar con búfer de fosfato la
matriz se incubó en una solución de Polimyxina B sulfato (Sigma), 1
mg/ml, por una noche bajo circulación. La matriz se lavó finalmente
con un búfer de fosfato de 0,1 M, pH 7,4.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 2 se conjugó con un receptor recombinante
TNF-\alpha(Enbrel, Wyeth, Reino Unido) a
una concentración de 5 mg/ml en búfer de ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) de 0.1 M,
(Sigma), pH 4.8. Treinta mg/ml de una solución acuosa de WCCM se
adicionaron y la matriz se incubó por una noche a 8°C. La matriz
finalmente se lavó con búfer fosfato de 0,1 M, pH 7,4.
El contenido de receptor
TNF-\alpha en la superficie de estructura porosa
de la matriz obtenida de determinó indirectamente por medio de
espectroscopia UV de la solución de búfer de receptor
TNF-\alpha antes y después de la incubación con la
matriz porosa.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 3 conjugó con un anticuerpo antihumano
TNF-\alpha (Sigma) usando un glutardialdehído al 1.0% en un búfer de fosfato de 0,2 M, pH 7,5. La matriz se incubó con la solución búfer de anticuerpo TNF-\alpha por 3 horas. Después de lavar la matriz porosa con búfer de fosfato, se adiciona anticuerpo antihumano TNF-\alpha (1 mg/ml) en búfer de fosfato y se incuba a temperatura ambiente por 6 horas bajo recirculación a una tasa de flujo de 1 ml/min. La matriz se lavó finalmente con búfer de fosfato de 0,1 M,
pH 7,4.
TNF-\alpha (Sigma) usando un glutardialdehído al 1.0% en un búfer de fosfato de 0,2 M, pH 7,5. La matriz se incubó con la solución búfer de anticuerpo TNF-\alpha por 3 horas. Después de lavar la matriz porosa con búfer de fosfato, se adiciona anticuerpo antihumano TNF-\alpha (1 mg/ml) en búfer de fosfato y se incuba a temperatura ambiente por 6 horas bajo recirculación a una tasa de flujo de 1 ml/min. La matriz se lavó finalmente con búfer de fosfato de 0,1 M,
pH 7,4.
El contenido de anticuerpo
TNF-\alpha en la superficie de estructura porosa
de la matriz obtenida se determinó indirectamente por medio de
espectroscopia UV de la solución de búfer de anticuerpo
TNF-\alpha antes y después de la incubación con la
matriz porosa.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 5 se conjugó con proteína humana bactericida
de permeabilidad incrementada (BPI) (Wieslab, Sweden) a una
concentración de 2 mg/ml en un búfer de MES de 0,1 M, pH 4,8. Se
adicionó una solución acuosa de WCCM a esta matriz a una
concentración de 15 mg/ml y se incubó la matriz por una noche a 8°C.
La matriz se lavó finalmente con búfer de fosfato de 0,1 M, pH
7,4.
El contenido de BPI en la superficie de
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó indirectamente
por medio de espectroscopia UV de la solución búfer de BPI antes y
después de la incubación con la matriz porosa.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 15 se incubó en una solución de DOC en búfer
MES de 0,1 M, pH 4,8, a una concentración de 1 mg/ml. Luego se
adicionó una solución acuosa de WCCM y la matriz se incubó por una
noche a 8°C. La matriz se lavó finalmente con búfer de fosfato de
0,1 M, pH 7,4.
El contenido DOC en la superficie de estructura
porosa de la matriz obtenida se determinó tal como en el ejemplo
17.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 3 se activó con glutardialdehído al 1,2% en
búfer de fosfato de 0,2 M, pH 7,0 por 24 horas a temperatura
ambiente. La matriz se lavó con búfer y posteriormente se incubó por
24 horas en 1,6-diaminohexano (DAH) (Sigma), 50
mg/ml, en búfer de fosfato de 0.2 M, pH 7.0. Después se adicionó
cianoborohidruro de sodio (Sigma) de 10 mg/ml a la solución. La
matriz porosa se lavó con búfer de fosfato de 0,1 M y luego se
incubó en una solución de DOC (1 mg/ml) en búfer MES de 0,1 M, pH
4,8. Luego se adicionó una solución acuosa de WCCM y se incubó la
matriz por una noche a 8°C. La matriz se lavó finalmente con búfer
de fosfato de 0,1 M, pH 7,4.
El contenido de DOC en la superficie de
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó tal como en el
ejemplo 17.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 5 se activó por 24 horas a temperatura
ambiente con glutaraldehído al 1,2% en búfer de fosfato de 0,2 M, pH
7,0. La matriz se lavó con búfer y se incubó por 24 horas con
dihidrazida atípica (Aldrich) a una concentración de 10 mg/ml en
búfer de fosfato de 0,2 M, pH 7,4. Luego se adicionaron 10 mg/ml de
cianoborohidruro de sodio (Sigma) a la solución.
La matriz porosa se lavó con búfer de fosfato de
0,1 M y se incubó luego con una solución de DOC a una concentración
de 1 mg/ml en búfer MES de 0,1 M, pH 4,8. Luego se adicionó una
solución de WCCM y se incubó la matriz por una noche a 8°C. La
matriz se lavó finalmente con búfer fosfato de 0,1 M, pH 7,4.
El contenido de DOC en la superficie de la
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó tal como en el
ejemplo 17.
La matriz obtenida de acuerdo con el ejemplo 10
se conjugó con DOC usando una solución acuosa de WCCM. A la matriz
porosa de policarbonato se adicionó revolviendo una solución de agua
de 300 ml de DMF al 40% (Sigma) que contiene 1 mmol de deoxicolato
de sodio. El pH de la solución se ajustó a 4,8 con HCl de 0,3 M. Una
solución de 6 mM de WCCM en DMF:agua (1:1,8) se adicionó por un
período de 10 minutos y se mantuvo la suspensión a un pH 4,8 por 3
horas mediante adición periódica de 0,3 M de HCl. Luego se mantuvo a
temperatura ambiente por 24 horas.
El contenido de DOC en la superficie de
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó tal como en el
ejemplo 17.
La matriz obtenida de acuerdo con el ejemplo 14
se activó por 10 horas a temperatura ambiente con glutardialdehído
al 1,2% en búfer fosfato de 0,2 M, pH 7,0, y luego se enjuagó con
cantidades excesivas de búfer. Se introdujo en la matriz porosa
polietilenimina (Sigma) a una concentración de 10 mg/ml en búfer de
bicarbonato de 0,1 M, pH 8,0; y la matriz se incubó con la solución
por 16 horas.
Luego se lavó la matriz con búfer y se conjugó
con DOC usando una solución acuosa de WCCM. Se adicionó revolviendo
una solución de 300 ml 40% de DMF en agua que contiene 1 mmol de
deoxilato de sodio a la matriz porosa. El pH se ajustó a 4,8 con HCl
de 0,3 M. Se adicionó luego una solución de 6 mM de WCCM en
DMF:agua (1:1,8) por un período de 10 minutos. La suspensión se
mantuvo en pH 4,8 por 3 horas mediante la adición periódica de HCl
de 0,3 M. Luego se mantuvo a temperatura ambiente por 24 horas.
El contenido de DOC en la superficie de
estructura porosa de la matriz obtenida se determinó tal como en el
ejemplo 17.
La matriz polietilénica porosa obtenida de
acuerdo con el ejemplo 3 se activó por 24 horas a temperatura
ambiente con glutardialdehído al 1,2% en búfer fosfato de 0,2 M, pH
7,0. La matriz se lavó luego con el búfer y se incubó por 24 horas
con 1,6-diaminohexano (DAH) (Sigma) a una
concentración de 50 mg/ml en búfer fosfato de 0,2 M, pH 7,0. La
matriz porosa se lavó luego con búfer fosfato de 0,1 M y se incubó
por 12 horas a 8°C como una suspensión en una solución del receptor
de TNF-\alpha (Enbrel, Wyeth, UK) a una
concentración de 10 mg/ml en búfer fosfato de 0,1 M, pH 7,4. Luego a
la suspensión se adicionó una solución de cianoborohidruro de sodio
(Sigma) a una concentración de 10 mg/ml. La matriz finalmente se
lavó con búfer fosfato de 0,1 M, pH 7,4.
El contenido de receptor
TNF-\alpha en la superficie de estructura porosa
de la matriz obtenida se determinó indirectamente por medio de
espectroscopia UV de la solución búfer del receptor
TNF-\alpha antes y después de la incubación con la
matriz porosa.
Las separaciones de célula se llevaron a cabo
permitiendo que la sangre entera pase por un filtro de una matriz
con forma de disco que tiene una superficie activa de 0,02
m^{2}.
La remoción de las endotoxinas y citoquinas se
realizó con el sistema de prueba mostrado en la figura 4. Se conectó
un contenedor 8, lleno con hasta 2 L de sangre entera o plasma, con
una bomba 9, un monitor de presión 10 y un dispositivo de filtro 1
con hasta 40 platos de matriz; es decir, suministrándose una
superficie activa de hasta 7 m^{2}, la cual tiene una porosidad
entre 70 y 130 micrones.
Una matriz magnética porosa que comprende una
mezcla de polietileno y ferrite magnética (80% FeO, 20% BaO2, Porex
Technologies, Alemania), que tenía una porosidad de 10º micrones, se
usó para separar leucocitos de sangre entera usando anticuerpos anti
CD45+ específicamente etiquetados (MACS Microperlas Anticuerpos;
Miltenyi Biotec, Alemania). Después de un etiquetado magnético de
los leucocitos con tales anticuerpos, se permitió que la sangre
pasara por la matriz porosa.
El conteo de células de leucocitos se llevó a
cabo usando un Contador de Células automático, el cual después de la
separación mostró una reducción del contenido de leucocito en la
sangre de 90%.
La superficie de una matriz de diacetato de
celulosa poroso (Tenite, Eastman Chemicals, USA), que tiene una
porosidad de 200 micrones y una superficie active de 0,2 m^{2} fue
usada para separación de células fagocitantes de sangre humana tales
como neutrofilos y monocitos. Se recolectó sangre humana entera en
tubos vacutainer de EDTA (B&D, UK) y se permitió a la sangre
pasar por la matriz porosa.
La reducción en el número de neutrofilos y
monocitos en la sangre recogida fue de 50% y 35%, respectivamente,
tal como se determinó por microscopía por conteo diferencial de
células en una cámara Bürkner usando Reactivo Türks.
La matriz obtenida de acuerdo con el ejemplo 22,
que había sido revestida con grupos de remoción de endotoxinas, se
usó como discos porosos en el sistema de prueba mostrado en la
figura 4.
La eliminación de TNF-\alpha
de la sangre entera se investigó después de inmovilizar anticuerpos
policlonales contra TNF-\alpha con
glutardialdehído sobre los grupos aminas en la estructura polimérica
porosa. Se indujo la producción de TNF-\alpha
mediante la adición de LPS a la sangre y la sangre entera activada
se vertió difundiéndose por el filtro inmovilizado en el
dispositivo.
Las cantidades de TNF-\alpha
en la sangre entera (figura 5) se determinaron pre
(\blacklozenge) y post (\sqbullet) el dispositivo mediante un
inmunoensayo de enzima (Enzymimmuno-ensayo, Milenia
Biotec GmbH, Alemania) para estudiar la captación de
TNF-\alpha por parte de los discos de filtro.
Tal como se ve, se podría obtener una reducción
considerable de las concentraciones patológicas de
TNF-\alpha en sangre entera.
La matriz obtenida de acuerdo con el ejemplo 25,
es decir una matriz polietilénica modificada con plasma, que tiene
DOC en ella, fue inmovilizada por medio de un espaciador o separador
de diaminohexano, que primero había sido acoplado a la matriz por el
glutardialdehído y luego al deoxicolato usando carbodiimida. La
matriz obtenida se usó como discos porosos en el dispositivo de
filtro del sistema mostrado en la figura 4.
La eliminación de LPS de plasma se llevó a cabo
de una manera similar a la del ejemplo 32.
La cantidad de LPS en plasma se determinó
mediante un ensayo de Lisado de Limulus Amebocita
(Endochrome-K, Charles River Laboratories Inc. USA)
en masa en diferentes intervalos de tiempo durante la recirculación
a través del dispositivo de filtro.
En la figura 6 se muestra la reducción de la
cantidad de endotoxina (pg/ml) con el tiempo. Después de una
recirculación de 3 h la carga de endotoxina se redujo desde 75
pg/ml, al inicio, hasta 15 pg/ml que es el límite de detección.
Las matrices obtenidas de acuerdo con el ejemplo
3 (grupos aminos no inmovilizados) y el ejemplo 17 (DOC
inmovilizado), respectivamente, se usaron como discos porosos y se
compararon con referencia a su habilidad de eliminar LPS. Se llevó a
cabo un estudio de recirculación similar al del ejemplo 33 con la
diferencia de que se disolvió LPS en agua destilada.
La eliminación de LPS de la solución de agua se
determinó tal como se muestra en la figura 4 mientras se recirculaba
a una tasa de flujo de 0,22 ml/min a través de cada filtro en un
dispositivo de 10 ml.
En la tabla 1 de abajo se dan los valores para
eliminación de LPS mediante dos matrices del ejemplo 3 y del ejemplo
17, respectivamente, como porcentaje de la concentración inicial de
LPS después de una recirculación de 120 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 | Ejemplo 17 | |
Eliminación de LPS (%) | 81 | 96 |
\vskip1.000000\baselineskip
La diferencia en el grado de eliminación entre
el plasma (ejemplo 34) y agua (ejemplo 35) se puede explicar
mediante interacciones competitivas de proteínas, LPS y el
ligando.
Las matrices obtenidas de acuerdo con el ejemplo
19 y el ejemplo 29 se usaron para la remoción combinada de
TNF-\alpha e IL-1,
respectivamente.
Las dos matrices de especificidad diferente se
conectaron en serie en un sistema de prueba de bucle cerrado de dos
dispositivos de filtro, tal como se muestra en la figura 4. La
sangre entera en un contenedor se mantuvo a 37°C, se activó mediante
la adición de LPS y se introdujo al sistema. El muestreo se llevó a
cabo en diferentes intervalos de tiempo simultáneamente del
contenedor y de las salidas del filtro para análisis de
citoquinas.
Para ambas matrices los resultados mostraron un
decrecimiento en las concentraciones de citoquina de 70% y 55% para
TNF-\alpha e IL-1\beta,
respectivamente.
La tabla 2 de abajo muestra un resumen de la
aplicabilidad versátil y la eficacia considerable del método
inventivo para un enlazamiento selectivo y separación de diferentes
componentes de la sangre entera o de un fluido corporal. Para este
propósito se han usado diferentes matrices porosas como soporte para
la conexión de ligandos con o sin separador o espaciador. De esta
manera, se han llevado a cabo métodos de inmovilización con
glutardialdehído usando dos terminales -NH_{2} y con
1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
con un terminal -NH_{2} y un terminal -OH o -COOH,
respectivamente. También se ha usado silanización a través de
aldehído o reactivos funcionales de acoplamiento de amino silano
para enlazamiento específico de grupos amino, anticuerpos, enzimas,
péptidos, proteínas; grupos de aldehído que reaccionan
espontáneamente conaminas, péptidos y proteínas.
Claims (32)
1. Un método para enlazar selectivamente y
separar por lo menos un componente de un fluido corporal, el cual
comprende: hacer pasar un fluido corporal, tal como sangre entera, a
través de una matriz rígida integral de separación sin estar
excluido por dicha matriz, teniendo dicha matriz una estructura
porosa con un tamaño de poro que abarca desde 5 micrones hasta 500
micrones así como también una superficie activa que abarca desde 0,5
cm^{2} hasta 10 m^{2}, enlazando por lo menos un componente de
fluido corporal por al menos un grupo funcional dispuesto en dicha
matriz, por lo cual dicha matriz se obtiene mediante un proceso
seleccionado del grupo que comprende los procesos de sinterizar,
moldear y espumar.
2. El método tal como se reivindica en la
reivindicación 1, que comprende: revestir o modificar la superficie
de dicha estructura porosa de dicha matriz para colocar dicho, por
lo menos uno, grupo funcional en dicha estructura porosa, mediante
lo cual dicho, por lo menos uno, grupo funcional solo o en
combinación con regiones no funcionarizadas de dicha estructura
porosa es capaz de enlazar dicho, al menos uno, componente.
3. El método tal como se reivindica en la
reivindicación 1 en el cual dicha matriz está hecha de un material
seleccionado del grupo que comprende: metal, óxido inorgánico,
carbón, vidrio, cerámica, polímero sintético y un polímero natural y
las combinaciones de los mismos.
4. El método tal como en la reivindicación 3, en
el cual dicha matriz se hace de un metal ferromagnético.
5. El método tal como en las reivindicaciones 3
ó 4 en el cual dicho material se reviste de un polímero sintético o
natural.
6. El método tal como en las reivindicaciones 3
ó 5, en el cual dicho polímero sintético se selecciona del grupo que
comprende: una poliolefina, un polímero vinílico, un polímero que
contiene flúor, un poliacrilato, una poliamida, una poliimida, una
poliimina, un poliestireno y sus copolímeros, una goma de silicona,
un poliéster, un policarbonato, un poliuretano, un polisulfonato, un
poliglicol, un poliéter y un polialquidóxido y un copollímero y un
híbrido de los mismos.
7. El método tal como en las reivindicaciones 3
ó 5, en el cual dicho polímero natural se selecciona del grupo que
comprende un polisacárido, un policarbohidrato, un ácido de
poliamina, un ácido poliláctico o un ácido poliglicólico y un
copolímero y un híbrido de los mismos.
8. El método, tal como en la reivindicación 2,
en el cual dicha modificación de superficie se selecciona del grupo
que comprende: electrodeposición, electroevaporación, deposición
química por plasma, deposición desde un flujo de plasma iónico,
polimerización de plasma, deposición de polímero de superficie
aumentada con plasma y deposición de vapor químico.
9. El método tal como en la reivindicación 2, en
el cual dicho, al menos uno, grupo funcional se selecciona del grupo
que comprende: un sulfihidrilo, un carboxilato, una amina, un
aldehído, una cetona, un hidroxilo, un halógeno, una hidracida o un
hidrógeno activo.
10. El método tal como en la reivindicación 2,
en el cual un ligando se acopla con dicho, cuando menos uno, grupo
funcional de una manera covalente.
11. El método tal como en la reivindicación 10,
en el cual dicho ligando se selecciona del grupo que comprende: una
proteína, un péptido, un anticuerpo o un fragmento de los mismos, un
carbohidrato, un polisacárido, una hormona, un antioxidante, una
glicoproteína, una lipoproteína, un lípido, una vitamina soluble en
grasa, un ácido biliar, un colorante reactivo, alantoina, ácido
úrico o polimixina o combinaciones de los mismos.
12. El método tal como en las reivindicaciones
10 u 11, en el cual se acopla covalentemente un reticulador entre
dicho, al menos uno, grupo funcional y dicho ligando.
13. El método tal como en la reivindicación 12,
en el cual dicho reticulador se selecciona del grupo que comprende
un reticulador homobifuncional, uno heterobifuncional y uno
trifuncional.
14. El método tal como en las reivindicaciones
12 ó 13, en el cual dicho reticulador se acopla covalentemente como
un separador entre dicho, al menos uno, grupo funcional y dicho
ligando.
15. El método tal como en la reivindicación 14,
en el cual dicho separador se selecciona del grupo que comprende: un
silano, un diisocianato, un glicolato, un polietilenglicol, un
reactivo de succinimidilo, una dihidrazina, ácido adipídico, una
diamina, un aminoácido, un ácido oligoamino, un poliaminoácido, un
péptido y una proteína.
16. El método, tal como en la reivindicación 1,
en el cual dicha matriz de separación tiene la forma seleccionada
del grupo que comprende: un disco, una barra, un cilindro, un
anillo, una esfera, un tubo y un tubo hueco.
17. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el cual dicho tamaño de poro es desde 50
micrones hasta 500 micrones.
18. El método tal como en cualquiera de las
reivindicaciones 1 hasta 17, que se lleva a cabo en un dispositivo
(1) que comprende una carcasa (2), una entrada (3), una salida (4),
y dicha, por lo menos una, matriz de separación (5a, 5b, ...).
19. El método tal como en la reivindicación 18,
en el cual dicho dispositivo tiene por lo menos dos matrices de
separación (5a, 5b, ...), las cuales, cada una de ellas, remueven
selectivamente y por separado por lo menos un componente de un
fluido corporal.
20. El método tal como se reivindica en la
reivindicación 19, en el cual dichas, por lo menos dos, matrices de
separación (5a, 5b, ...) remueven por lo menos dos componentes de un
fluido corporal.
21. El método tal como se reivindica en la
reivindicación 20 en el cual una primera matriz de separación
remueve un primer componente y una segunda matriz de separación
remueve un segundo componente de un fluido corporal.
22. El método de las reivindicaciones 19, 20 ó
21, en el cual por lo menos una de dichas matrices de separación
tiene un tamaño de poro desde 50 micrones hasta 500 micrones.
23. El método tal como en cualquiera de las
reivindicaciones 16 ó 22, en el cual la tasa de flujo a través de
dicho dispositivo es desde 5 ml/h hasta 6 000 ml/min.
24. Un dispositivo para enlazar selectivamente y
separar por lo menos un componente de un fluido corporal de acuerdo
con el método de cualquiera de las reivindicaciones
1-21, que comprende una carcasa (2), una entrada
(3), una salida (4) y por lo menos una matriz de separación (5a, 5b,
..., que es rígida e integral para dejar pasar dicha sangre o fluido
corporal a través de sí, la cual tiene una estructura porosa con un
tamaño de poro que abarca desde 5 micrones hasta 500 micrones así
como también una superficie activa en un rango desde 0,5 cm^{2}
hasta 10 m^{2}, la cual es capaz de enlazar dicho, por lo menos
uno, componente, donde dicha matriz de separación tiene una
estructura porosa obtenida mediante un proceso seleccionado del
grupo de: proceso de sinterizar, moldear y espumar.
25. El dispositivo tal como se reivindica en la
reivindicación 24, en el cual dicha matriz tiene un tamaño de poro
desde 50 micrones hasta 500 micrones.
26. El dispositivo tal como se reivindica en las
reivindicaciones 24 ó 25, donde dicho dispositivo tiene por lo menos
dos matrices de separación (5a, 5b, ...), cada una de ellas remueve
selectivamente y por separado por lo menos un componente de sangre
entera o de un fluido corporal.
27. El dispositivo tal como se reivindica en la
reivindicación 26, en el cual dichas por lo menos dos matrices de
separación (5a, 5b, ...) remueven por lo menos dos componentes de un
fluido corporal.
28. El dispositivo tal como se reivindica en la
reivindicación 27, en el cual una primera matriz de separación
remueve un primer componente y una segunda matriz de separación
remueve un segundo componente de un fluido corporal.
29. El dispositivo tal como se reivindica en las
reivindicaciones 26, 27 ó 28, en el cual por lo menos una de dichas
matrices tiene un tamaño de poro desde 50 micrones hasta 500
micrones.
30. El dispositivo tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, en el cual dicha matriz
de separación tiene la forma de un disco, una barra, un cilindro, un
anillo, una esfera, un tubo o un tubo hueco.
31. El dispositivo tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, en el cual dicha matriz
de separación comprende varios discos dispuestos uno después de otro
en la dirección de flujo para que el fluido corporal se disponga
para pasar un disco y luego fluya por la superficie entera del
siguiente disco.
32. El dispositivo tal como se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31, en el cual se lleva a
cabo una modificación de superficie por medio de un proceso
seleccionado del grupo de electrodeposición, electroevaporación,
deposición química por plasma, deposición de un flujo de plasma
iónico, polimerización por plasma, deposición polimérica de
superficie aumentada por plasma y deposición química de vapor.
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