ES2264809T3 - Proteinas de fusion para el transporte intracelular e intercelular y sus usos. - Google Patents
Proteinas de fusion para el transporte intracelular e intercelular y sus usos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A POLIPEPTIDOS ACOPLADOS Y POLIPEPTIDOS DE FUSION PARA EL TRANSPORTE INTRACELULAR, Y A SU PREPARACION Y UTILIZACION. DICHOS POLIPEPTIDOS CONTIENEN (I) UNA SECUENCIA AMINOACIDA CON LA FUNCION DE TRANSPORTE DE LA PROTEINA DEL VIRUS DEL HERPES VP22 (O UNA HOMOLOGA, P.EJ. PROCEDENTE DE VZV, BHV O MDV) Y (II) OTRA SECUENCIA PROTEINICA SELECCIONADA A PARTIR DE (A) PROTEINAS DE CONTROL DEL CICLO CELULAR; (B) PROTEINAS SUICIDAS; (C) SECUENCIAS ANTIGENICAS O PROTEINAS ANTIGENICAS PROCEDENTES DE ANTIGENOS MICROBIANOS Y VIRALES Y ANTIGENOS TUMORALES; (D) PROTEINAS INMUNOMODULADORAS; Y (E) PROTEINAS TERAPEUTICAS. LAS PROTEINAS ACOPLADAS SE PUEDEN UTILIZAR PARA EL SUMINISTRO INTRACELULAR DE SECUENCIAS PROTEINICAS (II), PARA EJERCER LA FUNCION EFECTORA CORRESPONDIENTE EN LA CELULA DIANA, Y LOS POLIPEPTIDOS DE FUSION SE PUEDEN EXPRESAR A PARTIR DE LOS POLINUCLEOTIDOS CORRESPONDIENTES, VECTORES Y CELULAS HUESPED.
Description
Proteínas de fusión para el transporte
intracelular e intercelular y sus usos.
La presente invención se refiere a mejoras,
modificaciones y avances en relación a las proteínas de transporte,
el transporte intracelular y sus aplicaciones. En las realizaciones
particulares, la invención se refiere a las proteínas de fusión que
comprenden las proteínas de transporte que comprenden secuencias de
VP22 del virus herpes o de homólogos o fragmentos de los mismos
conjuntamente con secuencias de otras proteínas; y a procedimientos
para su preparación y utilización. En las realizaciones
particulares, la invención se refiere a proteínas de fusión para el
control del ciclo celular, y a materiales y procedimientos para su
preparación y utilización. En los ejemplos particulares, la
invención se refiere a proteínas de fusión que presentan tanto la
funcionalidad p53 de mamífero como la funcionalidad VP22 del virus
herpes. Otros aspectos de la invención resultarán evidentes a
partir de la descripción y las reivindicaciones.
Es relevante con respecto a la presente
solicitud la solicitud de patente internacional anterior de los
presentes inventores nº WO 97/05265 (de O'Hare y Elliott) (publicada
después de la fecha de prioridad reivindicada en la presente
solicitud) que se refiere a la proteína VP22 y a sus propiedades y
usos. De manera similar, el artículo de los inventores (Elliott y
O'Hare, en Cell 88:223-233, 1997) se refiere al
tráfico intercelular y a la administración de proteínas por parte
de una proteína estructural del virus herpes.
Los inventores han demostrado que la proteína
VP22 del virión HSV-1 posee un mecanismo no habitual
de tráfico intercelular, un efecto descrito particularmente en el
documento nº WO 97/05265. VP22 es una proteína de 38kDa que en
células de mamífero transfectadas expresantes de forma primaria se
encuentra situada predominantemente en el citoplasma, donde se
asocia con los microtúbulos celulares (ver el dibujo adjunto, fig.
1b). Sin embargo, una propiedad notable de VP22 es su capacidad
para extenderse a lo largo de toda una monocapa de células no
expresantes. VP22 se transporta desde el citoplasma de una célula
expresante hasta células vecinas, donde se acumula en el núcleo
(fig. 1b). El mecanismo de este transporte todavía no se entiende
por completo, pero se ha demostrado que es una ruta independiente
del Golgi y puede utilizar el citoesqueleto de actina. Se han
atribuido propiedades de tráfico intercelular a la proteína Tat de
HIV-1 (Ensoli et al., 1993; Fawell et
al., 1994) y a un número reducido de otras proteínas no víricas
(Jackson et al., 1992), pero ninguna parece demostrar este
fenómeno tan acusadamente como VP22. Una propiedad importante
adicional de VP22 es que, cuando se aplica exógenamente al medio de
una monocapa de células no transfectadas, puede ser incorporada por
aquellas células no transfectadas, donde se acumula en el núcleo
celular.
La técnica anterior incluye de manera general
una diversidad de antígenos, proteínas inmunomoduladoras, proteínas
que son condicionalmente citotóxicas o letales tras la
administración (en una célula que las contiene) de un fármaco o
compuesto activador correspondiente, proteínas para el control del
ciclo celular, y otras proteínas diagnósticas y terapéuticas,
especialmente en las formas de proteína y de secuencias de
polinucleótidos que permiten la manipulación genética mediante
técnicas estándar. Se proporcionan posteriormente referencias a
algunos ejemplos de estos materiales.
Por ejemplo, entre las proteínas de control del
ciclo celular, se conoce la proteína p53 como supresor tumoral. La
proteína p53 es una fosfoproteína nuclear de 53 kDa (fig. 1C). La
proteína p53 de tipo salvaje y la mutante se han expresado por
medio de virus vaccinia recombinantes (Ronen et al., Nucleic
Acids Research 20:3435-3441, 1992). La proteína p53
funciona regulando la progresión del ciclo celular y bajo
condiciones de daño al ADN a través de un complejo mecanismo de
traducción de señales puede inducir la detención del ciclo celular
o la apoptosis (Levine 1997). La no síntesis de p53, o más
comúnmente la síntesis de una forma mutada de la proteína, puede
dar lugar a una proliferación celular descontrolada y a la formación
de tumores. Varios grupos han demostrado que la adición exógena de
p53 de tipo salvaje funcional puede inducir la detención del ciclo
celular y/o la apoptosis, dando lugar a la regresión tumoral, con
ejemplos que incluyen los carcinomas cervicales (Hamada et
al., 1996) y los xenoinjertos de cáncer de mama (Nielsen et
al., 1997). Se han utilizado varios sistemas de administración
de p53 in vivo e in vitro, tales como la inyección
intravenosa de un complejo de p53:liposoma (Kumar et al.,
1997), la transfección directa (Zheng et al., 1996) y la
transferencia mediada por adenovirus (Hamada et al., 1996;
Sandig et al., 1997), aunque la administración de proteína
funcional en un porcentaje suficientemente elevado de células
supervivientes sigue resultando difícil.
También son conocidos a partir de la patente US
nº 5.484.710 (La Jolla: J.C. Reed et al.) elementos
reguladores ligados a genes implicados en la muerte celular,
regulados por la proteína p53 supresora tumoral, y proteínas
adicionales y sus análogos para el control del ciclo celular.
Se da a conocer una versión de la proteína VP22
etiquetada con un epítopo de 10 aminoácidos del gen UL83 de HCHV
(que permite el reconocimiento por un anticuerpo monoclonal) en J.
Leslie et al., Virology 220:60-68, 1996.
Sigue resultando deseable proporcionar
constructos particulares de administración celular adicionales para
proteínas útiles.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporcionan proteínas acopladas que comprenden
secuencias proteicas de transporte que comprenden secuencias de VP22
de virus herpes o de homólogos o fragmentos del mismo,
conjuntamente con secuencias de otras proteínas seleccionadas de
entre: (a) proteínas para el control del ciclo celular; (b)
proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales tras la
administración (para una célula que las contiene) de un fármaco,
profármaco o compuesto activador correspondiente (descrito de otra
manera en la presente memoria como proteínas suicidas); (c)
secuencias antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo de
longitud superior a 12 residuos de aminoácidos) procedentes de
antígenos microbianos y víricos y de antígenos tumorales; (d)
proteínas inmunomoduladoras; y (e) proteínas terapéuticas.
Posteriormente se indican ejemplos de estos tipos de proteínas. De
esta manera, el acoplamiento o la fusión a una secuencia de
aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 puede
proporcionar un constructo útil de administración celular para
proteínas de los tipos indicados (donde lo admita el contexto, los
"productos de acoplamiento" y las expresiones similares
incluyen la referencia a proteínas de fusión).
Preferentemente, las proteínas acopladas son
proteínas de fusión, que convenientemente pueden expresarse en
células huésped adecuadas conocidas. Pueden prepararse y manipularse
las secuencias de polinucleótidos correspondientes utilizando
elementos conocidos per se y técnicas estándar de ADN
recombinante y adaptaciones fácilmente disponibles de las mismas.
Sin embargo, los productos químicamente acoplados pueden utilizarse
para determinadas aplicaciones si se desea, y pueden prepararse a
partir de los componentes proteicos individuales de acuerdo con
cualquiera de una diversidad de técnicas de acoplamiento químico
conocidas per se.
La proteína VP22 o una subsecuencia funcional de
la misma, opcionalmente con una cola de polipéptido adicional para
el acoplamiento, puede unirse a otras proteínas o ácidos nucleicos
mediante acoplamiento químico de cualquier manera estándar adecuada
conocida.
La invención también proporciona polinucleótidos
que codifican las proteínas de fusión indicadas en la presente
memoria, incluyendo secuencias que corresponden a VP22 y a otra
proteína de uno de los tipos indicados anteriormente, y casetes de
expresión, plásmidos, vectores y células recombinantes que
comprenden los polinucleótidos. Estos pueden formarse y utilizarse
en modos análogos o fácilmente adaptables a partir de la técnica
estándar de ADN recombinante. De esta manera, los polinucleótidos
correspondientes pueden codificar un polipéptido de fusión que
comprende una secuencia con la función de transporte de la proteína
VP22 de virus herpes y una secuencia con una de las funciones
especificadas en la presente memoria. El polinucleótido puede
encontrarse comprendido en un marco de lectura abierto
operativamente ligado a una secuencia promotora adecuada, y puede,
de acuerdo con los ejemplos de la invención, formar parte de un
vector de expresión, por ejemplo que comprende el polinucleótido
transportado en un plásmido. El vector de expresión puede ser, por
ejemplo, un vector virus recombinante o un vector de transfección
no vírico. Los vectores pueden, por ejemplo, ser análogos o ejemplos
de aquellos vectores indicados o descritos en los documentos nº WO
97/05265, o aquéllos indicados o descritos en los documentos nº WO
92/05263, nº WO 94/21807 o nº WO 96/26267. Para secuencias de
nucleótidos capaces de transcribirse y traducirse para producir un
polipéptido funcional, la degeneración del código genético da lugar
a una serie de secuencias de nucleótidos que codifican el mismo
polipéptido. La invención incluye todas estas secuencias.
De esta manera, los productos descritos en la
presente memoria pueden utilizarse de acuerdo con la invención como
proteínas transportables capaces de ser incorporadas por una
población diana de células, por ejemplo, de manera que pueda tener
lugar dentro de las células diana que han incorporado el producto,
una función efectora correspondiente a la secuencia polipeptídica
acoplada a la proteína VP22, de entre los tipos indicados
anteriormente. De esta manera, por ejemplo, las células diana pueden
presentar epítopos del antígeno tumoral deseado en el caso de que
la secuencia polipeptídica sea de un antígeno tumoral seleccionado,
o encontrarse sometidas a los efectos de control del ciclo celular
en el caso de que la secuencia polipeptídica sea de una proteína de
control del ciclo celular, o adquirir cierto grado de
susceptibilidad a la eliminación o daño celular tras el tratamiento
adicional con un profármaco en el que la secuencia polipeptídica es
de una "proteína suicida" correspondiente. Durante la
utilización, muchos de los productos indicados en la presente
invención pueden expresarse como proteínas de fusión en una primera
parte de la población diana de células, exportarse desde la misma,
y resultar incorporados por una segunda parte de la población diana
de células que no produce directamente la proteína. También dentro
de la invención se encuentran las células huésped de mamífero y
células microbianas que comprenden dichos vectores u otros
polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión, y su
producción y utilización.
Un polipéptido de fusión tal como se describe en
la presente memoria puede transportarse hasta una población diana
de células mediante la introducción de un polinucleótido u otro
vector que codifica el polipéptido de fusión en una primera parte
de la población diana de células, por ejemplo, mediante transfección
o microinyección; mediante la expresión del polinucleótido
codificante para producir el polipéptido de fusión, provocando de
esta manera que sea exportado de dicha primera parte de dicha
población diana, y que resulte incorporado por una segunda parte de
la población diana de células que no produce directamente el
polipéptido de fusión.
Los productos de acoplamiento (incluyendo los
productos acoplados químicamente) también pueden ser transportados
a una población diana de células mediante la exposición directa de
las células a una preparación de los productos de acoplamiento,
causando de esta manera que las células diana los incorpore.
En el presente documento, "VP22" se refiere
a la proteína VP22 del HSV, por ejemplo de HSV1, y los fragmentos y
homólogos activos en transporte de la misma, incluyendo los
homólogos activos en transporte de otros virus herpes, incluyendo
el virus varicela zóster (VZV), el virus herpes equino (EHV), y el
virus herpes bovino (BHV); las proteínas modificadas y mutantes, y
los polipéptidos de fusión y productos de acoplamiento con
homología entre sí, y con una función de transporte correspondiente
a una función de transporte de la proteína VP22 de HSV1; y en este
contexto también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que
codifican cualquiera de los productos anteriormente indicados, sea
en la forma de ADN o ARN desnudo, o de un vector, o de secuencias
de ácidos nucleicos más grandes, incluyendo dichas secuencias como
subsecuencias.
Entre las subsecuencias de la proteína VP22 de
virus herpes con actividad de transporte, los presentes inventores
han descubierto que, por ejemplo, la actividad de transporte se
encuentra presente en los polipéptidos correspondientes a los
aminoácidos 60 a 301 y 159 a 301 de la secuencia completa de VP22 de
HSV1 (1-301). Para la secuencia, ver, por ejemplo,
la figura 4 en WO 97/05265. Un polipéptido consistente en los
aminoácidos 175 a 301 de la secuencia de VP22 presenta una
actividad de transporte marcadamente reducida, y resulta menos
preferente en relación a la presente invención. Por consiguiente, la
presente invención se refiere en un aspecto a proteínas acopladas y
de fusión que comprenden una subsecuencia de VP22 que contiene una
secuencia que se inicia preferentemente desde aproximadamente el
aminoácido 159 (o antes, hacia el extremo
N-terminal, de la secuencia nativa de VP22), hasta
aproximadamente el aminoácido 301, y que presenta (respecto a la
secuencia completa de VP22) por lo menos una deleción de por lo
menos parte de la secuencia de VP22 que puede extenderse, por
ejemplo, desde el extremo N-terminal hasta el punto
de inicio indicado, por ejemplo, una deleción de toda o parte de la
secuencia entre aproximadamente los aminoácidos 1 y 158. (Menos
preferentemente, esta deleción puede extenderse adicionalmente en
la dirección C-terminal, por ejemplo, hasta
aproximadamente el aminoácido 175). Por ejemplo, se proporcionan
secuencias parciales en el intervalo entre aproximadamente los
aminoácidos 60 a 301 y aproximadamente los aminoácidos 159 a
301.
Las secuencias de VP22 tal y como se contemplan
en la presente memoria se extienden a proteínas homólogas y
fragmentos basadas en las secuencias de los homólogos de la proteína
VP22 de otros virus herpes, por ejemplo la invención proporciona
derivados correspondientes y usos de las secuencias homólogas
conocidas de VP22 de VZV (por ejemplo, la totalidad de las partes o
las partes homólogas de la secuencia entre los aminoácidos 1 y
302), de MDV (por ejemplo, la totalidad de las partes o las partes
homólogas de la secuencia entre los aminoácidos
1-249) y de BHV (por ejemplo la totalidad de las
partes o las partes homólogas de la secuencia entre los aminoácidos
1 y 258). Las secuencias de las proteínas correspondientes de HSV2,
VZV, BHV y MDV se encuentran disponibles en bases de datos públicas
de secuencias de proteína/ácidos nucleicos. De esta manera, por
ejemplo, dentro de la base de datos EMBL/Genbank, una secuencia de
VP22 de HSV2 se encuentra disponible como el elemento génico UL49
bajo el nº de acceso Z86099, que contiene el genoma completo de la
cepa HG52 de HSV2; el genoma completo de VZV, incluyendo el
gen/proteína homólogo, se encuentra disponible bajo los números de
acceso X04370, M14891, M16612; la secuencia correspondiente de la
proteína de BHV se encuentra disponible como "proteína del
tegumento del virión del virus herpes bovino 1" bajo el número de
acceso U21137; y la secuencia correspondiente de MDV se encuentra
disponible como elemento génico UL49 bajo el número de acceso
L10283 para "genes de secuencia homóloga del virus herpes gallid
de tipo 1". En estas proteínas, especialmente aquéllas de HSV2 y
de VZV, pueden llevarse a cabo las deleciones correspondientes, por
ejemplo de secuencias homólogas respecto a los aminoácidos 1 a 159
de VP22 de HSV1. Las homologías entre ellas resultan fácilmente
accesibles mediante la utilización de algoritmos y programas
estándar, por ejemplo aquéllos indicados en el documento nº WO
95/12673, página 9.
Además, las proteínas VP22 quiméricas y las
secuencias de proteína también resultan útiles dentro del contexto
de la presente invención, por ejemplo, una secuencia proteica de
VP22 de HSV1 en la que parte de la misma se ha sustituido por una
secuencia homóloga del homólogo de VP22 correspondiente a otro virus
herpes. Por ejemplo, en la secuencia del polipéptido 159 a 301 de
VP22 de HSV1, las secuencias C-terminal pueden
sustituirse de la VP22 de HSV2 o del homólogo de VP22 de BHV.
Se ha descubierto que la deleción de la
secuencia C-terminal de 34 aminoácidos de la VP22 de
HSV1 elimina la actividad de transporte; de esta manera, esta
región de secuencia contiene elementos esenciales para la actividad
de transporte. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención,
se proporcionan polipéptidos acoplados y de fusión que comprenden
la secuencia C-terminal de 34 aminoácidos de VP22 o
una variante de la misma, conjuntamente con una secuencia de otra
proteína seleccionada de entre: (a) proteínas para el control del
ciclo celular; (b) proteínas que son condicionalmente citotóxicas o
letales tras la administración (a una célula que las contiene) de
un fármaco o compuesto activador correspondiente; (c) las secuencias
antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo, de longitud
superior a 12 residuos de aminoácidos) de antígenos microbianos y
víricos y antígenos tumorales; (d) proteínas inmunomoduladoras; y
(e) proteínas terapéuticas. Éstas se proporcionan para su
utilización, por ejemplo, mediante la administración en forma de
proteínas a células que las incorporan. También se proporcionan los
productos acoplados de fragmentos terminales modificados que
presentan por lo menos una mutación por inserción o por deleción
respecto a la secuencia C-terminal de 34 aminoácidos
de la VP22 de HSV1.
También se ha descubierto que las secuencias
necesarias para la actividad de transporte contienen una o una
pluralidad de motivos de secuencia de aminoácidos o de sus homólogos
de la secuencia C-terminal de la VP22 de HSV1 o de
otros virus herpes, que pueden seleccionarse de entre RSASR, RTASR,
RSRAR, RTRAR, ATATR, y en los que el tercer o cuarto residuo A
puede duplicarse, por ejemplo tal como en RSAASR. También se
proporcionan polipéptidos correspondientes de fusión con proteínas
de los tipos indicados en la presente invención.
Además de sus usos, tales como los indicados en
otras partes de la presente invención, los polipéptidos acoplados y
de fusión también pueden utilizarse para cultivar anticuerpos que
pueden utilizarse de una manera conocida per se en ensayos
de unión específica de diagnóstico y de seguimiento, por ejemplo
para el seguimiento de la localización intracelular de las
proteínas acopladas o de fusión mismas o de sus componentes.
("VP22" en la presente memoria no pretende
incluir la proteína VP22 no modificada natural o el gen
correspondiente en su asociación natural y no modificada con el
virus herpes en sus diversos estados naturales del ciclo vital, por
ejemplo en asociación con virus herpes que no ha sido sometido a
alteración genómica. Sin embargo, "VP22" sí se refiere, por
ejemplo, a la proteína o gen correspondientes de un virus que por
ejemplo ha sido alterado con respecto a su gen o función UL49/VP22,
o en el que se ha insertado en su genoma un gen de VP22 adicional
y/o
híbrido).
híbrido).
Los productos de acoplamiento o proteínas de
fusión basados en VP22 pueden presentar un abanico de tamaños
moleculares. Los productos pueden ser, en la práctica, de hasta
aproximadamente 70 kDa o más, por ejemplo de 90 kDa o de 100 kDa o
más con respecto al tamaño de la proteína a acoplar o a fusionar con
VP22. Entre las realizaciones de la invención se incluyen ejemplos
en los que el péptido de fusión presenta una longitud, por ejemplo,
de por lo menos 13 residuos aminoácidos, o de más de aproximadamente
12 residuos aminoácidos de longitud, por ejemplo diferente de un
péptido epítopo antigénico de 12 residuos. Las proteínas a fusionar
en ocasiones pueden presentar más de aproximadamente 27 ó 32 kDa,
por ejemplo pueden ser de un tamaño diferente a 27 kDa. Por
ejemplo, una de las proteínas que pueden acoplarse de esta manera,
p53, ella misma presenta un tamaño de aproximadamente 53 kDa. El
polipéptido acoplado o proteína de fusión, incluyendo el componente
de VP22, puede presentar un tamaño de hasta aproximadamente 120 kDa,
por ejemplo de hasta aproximadamente 80 ó 100 kDa.
En ocasiones resulta preferente que la secuencia
de VP22 se fusione en su extremo N-terminal con la
secuencia de la otra proteína seleccionada de uno de los tipos
indicados en la presente memoria. Las fusiones
C-terminales en ocasiones pueden ser
correspondientemente menos preferentes.
En los polipéptidos de la invención, las
mutaciones de las secuencias de aminoácidos constituyentes
(incluyendo aquéllas de las proteínas inmunomoduladoras y otras
proteínas indicadas en la presente memoria) pueden incorporarse en
los polipéptidos de fusión y en otras proteínas acopladas. Se
incluyen en la presente memoria proteínas que presentan secuencias
mutadas de manera que siguen siendo homólogas, por ejemplo en
secuencia, en función y en características antigénicas o de otra
función, con una proteína que presenta la secuencia parental
correspondiente. Estas mutaciones preferentemente pueden ser, por
ejemplo, mutaciones que implican cambios conservativos de
aminoácidos, por ejemplo cambios entre aminoácidos de propiedades
moleculares ampliamente similares. Por ejemplo, los intercambios
dentro del grupo alifático alanina, valina, leucina, isoleucina
pueden considerarse conservativos. En ocasiones, la sustitución de
la glicina por uno de estos aminoácidos también puede considerarse
conservativa. Los intercambios dentro del grupo alifático de
aspartato y glutamato también pueden considerarse conservativos.
Los intercambios dentro del grupo amida de asparagina y glutamina
también puede considerarse conservativos. Los intercambios dentro
del grupo hidroxi de serina y treonina también pueden considerarse
conservativos. Los intercambios dentro del grupo aromático de
fenilalanina, tirosina y triptófano también pueden considerarse
conservativos. Los intercambios dentro del grupo básico de lisina,
arginina e histidina también pueden considerarse conservativos. Los
intercambios dentro del grupo que contiene azufre de metionina y
cisteína también pueden considerarse conservativos. En ocasiones, la
sustitución dentro del grupo metionina y leucina también puede
considerarse conservativa. Son grupos de sustitución preferentes
asparato-glutamato;
asparagina-glutamina;
valina-leucina-isoleucina;
alanina-valina;
fenilalanina-tirosina; y
lisina-arginina. En otros aspectos, las secuencias
mutadas pueden comprender inserciones y/o deleciones. Las secuencias
proteicas mutadas pueden encontrarse adicional o alternativamente
codificadas por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones
astringentes con la cadena apropiada del polinucleótido de origen
natural que codifica la proteína parental, y puede someterse a
ensayo para resultados positivos en ensayos funcionales conocidos
relevantes para la proteína parental. Las "condiciones
astringentes" son dependientes de la secuencia y son diferentes
en diferentes circunstancias. Generalmente, las condiciones
astringentes pueden seleccionarse para que sean aproximadamente 5ºC
inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia
específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la
temperatura (bajo la fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50%
de la secuencia diana se híbrida con una sonda perfectamente
correspondiente. Habitualmente, las condiciones astringentes son
aquéllas en las que la concentración salina es de por lo menos
aproximadamente 0,02 molar a pH 7 y la temperatura es de por lo
menos aproximadamente 60ºC. Debido a que otros factores pueden
afectar a la astringencia de la hibridación, incluyendo, entre
otros, la composición de bases y el tamaño de las cadenas
complementarias, la presencia de solventes orgánicos y el grado de
desapareamiento de bases, la combinación de parámetros es más
importante que la medida absoluta de cualquiera de ellas.
En una clase útil de realizaciones de la
invención, la VP22 puede acoplarse con proteínas conocidas per
se de control del ciclo celular. De esta manera, en un ejemplo
de la invención referido al control del ciclo celular, tal como
describe particularmente en un ejemplo posterior, VP22 puede
acoplarse con la proteína p53. Un propósito y uso de la presente
invención puede ser bloquear la progresión del ciclo celular,
especialmente de células malignas.
La VP22 también puede acoplarse útilmente con
los inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, por ejemplo
p16, p21 o p27. La progresión del ciclo celular normal requiere
estas proteínas; la ausencia de éstas puede desreprimir el ciclo
celular, y pueden utilizarse los productos de acoplamiento
correspondientes para el tratamiento de las células de cáncer.
Los productos de acoplamiento a VP22 también
pueden utilizarse útilmente en la modulación de la apoptosis, por
ejemplo para inducir la muerte celular, del tipo apoptosis, mediante
la introducción en una célula de un dominio apoptótico de proteína
acoplado a VP22, de manera que, por ejemplo la proteína de apoptosis
bax, o su péptido identificado conocido inductor de apoptosis; o
proteína relacionada conocida bad o bak. En este caso también, el
producto de acoplamiento puede aplicarse en la forma de proteína o
de ADN que lo codifica. Los productos de acoplamiento a VP22 pueden
utilizarse en la forma de VP22 con proteínas conocidas de la familia
bcI2, tal como la bcI2 misma, bcl-xL o bclw, para
enmascarar o para inhibir la apoptosis en el caso de que se desee,
por ejemplo en el tratamiento de la neurodegeneración.
Pueden utilizarse otros productos de
acoplamiento a VP22 para inducir la apoptosis, comprendiendo VP22
unido a proteasas similares a ICE. Los productos de unión a VP2 con
inhibidores de las proteasas similares a ICE, por ejemplo los
pseudosustratos, pueden utilizarse para enmascarar o para superar a
los efectos estimulantes de la apoptosis de las proteasas
mismas.
De esta manera, de acuerdo con una realización
de la invención se proporciona un polipéptido de fusión que
comprende una secuencia de aminoácidos con la función de transporte
de la proteína VP22 del virus herpes y una secuencia con la
funcionalidad de control del ciclo celular de la proteína p53. El
polipéptido de fusión puede incluir, por ejemplo, la secuencia de
p53 sustancialmente de longitud completa o la secuencia de VP22
sustancialmente de longitud completa, o ambas.
La fusión con VP22 de esta manera puede
utilizarse para la administración de un agente para el control del
ciclo celular, tal como p53. Donde la descripción proporcionada en
la presente memoria se refiere a p53 y péptidos relacionados, se
entenderá que, donde el contexto lo permita, también se contemplan
agentes alternativos de control del ciclo celular, tales como, por
ejemplo, aquellos análogos de p53 y otras proteínas de control del
ciclo celular indicadas y referidas en la presente memoria, tales
como, más generalmente, las parejas alternativas de fusión o de
acoplamiento a VP22, o cualquiera de los otros tipos indicados en la
presente memoria. Una vez expresadas en un subpoblación de células
expresantes, esta proteína de fusión puede transportarse mediante
el mecanismo de transporte de VP22 desde la célula expresante al
interior de una proporción significativa de células circundantes, y
entonces el polipéptido foráneo unido puede ejercer su
funcionalidad.
Este aspecto de la invención también proporciona
los polinucleótidos correspondientes, que codifican un polipéptido
de fusión que comprende una secuencia con la función de transporte
de la proteína VP22 del virus herpes y una secuencia con la función
reguladora del ciclo celular humana/de mamífero de la proteína p53.
El polinucleótido puede encontrarse comprendido en un marco de
lectura abierta operablemente ligado a una secuencia promotora
adecuada.
El polinucleótido puede, de acuerdo con los
ejemplos de la invención, formar parte de un vector de expresión,
por ejemplo, que comprenda el polinucleótido transportado en un
plásmido. El vector de expresión puede ser, por ejemplo, un vector
virus o un vector de transfección no vírico. Los vectores pueden
ser, por ejemplo, análogos o ejemplos de ellos descritos y
referidos en la patente nº WO 97/05265 o Elliot y O'Hare
(1997).
La invención también proporciona un
procedimiento de inhibición de la división celular, que comprende
exponer las células que presentan p53 activa/libre insuficiente para
detener su ciclo celular, al contacto con un polipéptido de fusión
tal como se describe en la presente memoria.
Entre los procedimientos de la invención se
encuentra un procedimiento de inhibición de la división de las
células tumorales, que comprende exponer una célula tumoral presente
en una masa celular tumoral, comprendiendo la célula tumoral una
cantidad insuficiente de p53 activa/libre para detener su ciclo
celular, al contacto con un vector tal como se describe en la
presente memoria, provocando de esta manera que la célula exprese
un polipéptido de fusión tal como se describe en la presente
memoria, y exponer otras células de la masa de células tumorales al
contacto con el polipéptido de fusión.
Los presentes inventores han demostrado (ver la
descripción posteriormente) que VP22-p53 puede ser
transportado por muchas células no transfectadas en una monocapa. La
proteína de fusión puede ser funcional en la detención del ciclo
celular y/o en la inducción de la apoptosis, por ejemplo tanto en
las células expresantes primarias y en las células que han recibido
VP22 mediante la extensión
célula-a-célula. Por ejemplo, la
proteína de fusión puede aplicarse a una línea celular de
osteosarcoma p53-negativa SAO2-2
(Diller et al., 1990). La p53 funcional expresada en estas
células causa la detención del ciclo celular en el límite entre las
fases G y S, y finalmente la muerte celular; lo anterior puede
someterse a ensayo utilizando microscopía confocal y anticuerpos
contra los marcadores específicos del ciclo celular. La función de
la proteína de fusión p53 también puede utilizarse y evaluarse en
otras líneas celulares tumorigénicas en las que se encuentra
presente p53 pero que contienen mutaciones puntuales específicas y
bien caracterizadas que conducen a la falta de funcionalidad.
Varios sistemas de vector, tales como la
infección retrovírica o adenovírica, o la inyección de complejos
proteína-liposoma, pueden adaptarse fácilmente para
constituir ejemplos de la presente invención para la administración
de proteínas de control del ciclo celular a células y tejidos de
sujetos humanos y animales no humanos que deben tratarse. Por
ejemplo, en relación al trabajo sobre la proteína p53 sola, se ha
demostrado claramente que la adición de proteína p53 de tipo
salvaje puede reducir el crecimiento in vivo de las células
cancerosas. Resultarán evidentes al lector experto en la materia
varias aplicaciones terapéuticas de administración no invasiva de
proteínas de acoplamiento de VP22 con proteínas de control del ciclo
celular.
Por ejemplo, puede inyectarse ADN desnudo para
una fusión VP22-proteína con una proteína efectora
tumoral, tal como p53, en un tumor, por ejemplo un tumor sólido,
por ejemplo un tumor sólido seleccionado mediante diagnóstico
molecular para la falta de p53 funcional.
Pueden utilizarse virus recombinantes, tales
como los indicados anteriormente, codificantes y capaces de
expresar VP22-p53 y proteínas de fusión de
funcionamiento equivalente. Por ejemplo, un adenovirus puede
expresar VP22-p53 y puede prepararse para que sea
dependiente de un promotor específico tumoral para regular un gen
vírico esencial, tal como E1a. Más generalmente, un vector virus
recombinante que porta esta fusión puede ser defectivo, no
replicante o de replicación restringida, de manera que la
replicación dependa de condiciones que predominan en el tejido o
célula diana pero que no predominan en las células normales o en las
células que no son diana.
En determinados ejemplos de la invención, la
proteína con funcionalidad de p53 puede, por ejemplo, comprender
variantes o mutantes de p53, por ejemplo aquellas variantes tales
como las indicadas en la especificación nº WO 97/04092 (Rhone
Poulenc Rorer SA: Bracco, L., Conseiller, E.) ("New p53 variants
e.g. with oligomerisation domain replaced by leucine zipper -
useful for treating hyper-proliferative disorders,
especially cancer and restenosis"), que describe, inter
alia, las proteínas variantes siguientes: (a) variantes de la
proteína p53 que presentan por lo menos parte del dominio de
oligomerización delecionado y sustituido por un dominio de
cremallera de leucina; (b) variantes de p53 preferentemente activas
en células transformadas, en las que la totalidad o parte de por lo
menos un dominio funcional se ha delecionado y sustituido por un
dominio heterólogo preferentemente activo en estas células; (c)
variantes de p53 con una deleción en la parte
C-terminal, desde el residuo 366, seguido de una
secuencia de 19 aminoácidos (codificada por un fragmento de 76 pb
reproducido en la especificación) que representa la última parte de
la parte alternativamente cortada de la p53 murina, y (d) una
proteína quimérica que contiene un dominio transactivante, un
dominio de unión a ADN, un dominio de localización nuclear y un
dominio de oligomerización, en el que el dominio de unión a ADN y el
dominio de localización nuclear comprenden los aminoácidos 75 a 325
o 75 a 336 de la p53 humana de tipo
salvaje.
salvaje.
En ejemplos adicionales de la invención, los
vectores y proteínas de fusión pueden codificar o comprender
polipéptidos p53 variantes que comprenden secuencias quiméricas de
p53, incluyendo dominios de tetramerización heterólogos, que pueden
adaptarse a partir de aquéllas descritas en las especificaciones nº
WO 96/16989 y nº US 5.573.925 (Wistar Institute of Anatomy &
Biology: Halazonetis TD) y utilizarse de maneras correspondientes.
En estos ejemplos de la invención, las secuencias de p53 pueden
comprender proteína p53 quimérica que presenta una secuencia nativa
de p53 y un dominio de tetramerización heterólogo que forma
homotetrámeros, de manera que la proteína quimérica resultante no
puede heterooligomerizarse con p53 mutante de tipo salvaje o
derivada tumoral y que no interfiere con la funcionalidad supresora
tumoral de la p53 nativa.
Las proteínas de fusión y los vectores de
acuerdo con ejemplos adicionales de la presente invención pueden
utilizarse para el tratamiento de la enfermedad hiperproliferativa,
especialmente del cáncer y de las enfermedades autoinmunológicas,
por ejemplo la restenosis, y particularmente para el tratamiento de
células que presentan una mutación de p53 y que también expresan
proteína MDM2 a nivel elevado, incluyendo por ejemplo las células
de cáncer relacionadas con HPV. También pueden utilizarse para
eliminar células hiperproliferantes in vitro. Estas
variantes pueden implicar supresores tumorales activos y estables, y
agentes inductores de apoptosis, y se propone que se encuentran
activos cuando la proteína de tipo salvaje no lo está, es decir,
cuando no se encuentra inactivada por mutantes dominantes negativos
u oncogénicos ni por otras proteínas celulares (debido a que el
dominio de cremallera de leucina evita la formación de oligómeros
mixtos inactivos).
Asimismo, pueden utilizarse las proteínas de
fusión y vectores de acuerdo con ejemplos adicionales de la
presente invención, en medicamentos para suprimir el fenotipo
neoplásico de las células cancerosas que carecen de la proteína p53
de tipo salvaje, de maneras, por ejemplo, correspondientes a la
utilización de gen de p35 de tipo salvaje, tal como se describe en
la especificación nº EP 0 710 722 (Univ. California: Chen, P., Lee,
W.), que describe genes y vectores retrovíricos para los fines
inter alia de suprimir el fenotipo neoplásico en las células
de cáncer, tales como las células de osteosarcoma, las células de
carcinoma pulmonar, las células de carcinoma de colon, las células
de linfoma, las células de leucemia, las células del sarcoma del
tejido blando o las células de carcinoma de mama, vejiga o
próstata.
Asimismo, las proteínas de fusión y vectores
también pueden utilizarse de acuerdo con ejemplos adicionales de la
presente invención, por ejemplo de maneras correspondientes a
aquéllas descritas en la especificación nº WO 95/12660 (Univ. Texas
System: Roth, J.A. et al.), que describe adenovirus
recombinantes que portan un constructo de vector adenovirus que
comprende una región de expresión que codifica p53, y que es capaz
de expresar la p53 en, por ejemplo, células malignas humanas, y que
de utilizarse inter alia para la administración regional del
gen supresor tumoral de p53, hasta las células enfermas, para
restaurar la función de p53 de las células deficientes en p53, o
para suprimir el crecimiento tumoral en células que presentan p53
anormal, y de esta manera tratar los tumores malignos humanos,
tales como el cáncer de mama y de pulmón. Estos adenovirus también
pueden utilizarse para análisis in vitro y estudios de
mutagénesis de diversos genes de p53.
Asimismo, pueden utilizarse proteínas de fusión
y vectores de acuerdo con ejemplos adicionales de la presente
invención, como inhibidores de la replicación del virus de la
hepatitis B (HBV), de maneras correspondientes a aquéllas descritas
en la patente nº US 5.635.473 y nº WO 96/11017 (Mogam Biotechnology
Research Institute: H-S, Lee et al.).
Los ensayos de cribado para identificar agentes
que incrementan con efectividad el nivel de muerte celular, y que
pueden actuar como análogos de p53 y pueden inducir la apoptosis en
las células, se describen, por ejemplo, en la patente nº US
5.484.710 (La Jolla: J.C., Reed et al.), particularmente en
el ejemplo IV del mismo. También se contemplan como realizaciones
alternativas de la invención las proteínas de fusión y materiales
relacionados que incorporan la funcionalidad de VP22 y la
funcionalidad de la proteína Bax. En relación a la proteína Bax, se
hace referencia a la patente nº US 5.484.710 y las referencias
citadas en la misma.
En una clase adicional de realizaciones de la
invención, puede acoplarse o fusionarse útilmente VP22 o una
subsecuencia funcional de la misma con, por ejemplo, una "proteína
suicida", tal como, por ejemplo, la timidina quinasa conocida,
la nitrorreductasa, u otro enzima o fragmento funcional del mismo,
según resulte aplicable para un propósito similar. El producto
acoplante puede penetrar en las células, que deben tratarse con (en
el caso de la timidina quinasa) ganciclovir u otro fármaco
(profármaco) de la misma familia, de manera que el profármaco se
convierta en las células que contienen el producto de "gen
suicida" en una forma activa para eliminar las células.
Se proporcionan ejemplos adecuados de genes
suicidas conocidos útiles y los profármacos correspondientes, a los
que se hace referencia por ejemplo en la patente nº WO 94/13824
(Univ. Curie Paris: M. Caruso et al.), en la patente nº WO
95/05835 (Baylor College: S. Chen et al.), y en la patente nº
WO 93/08288 (Cancer Research Campaign Technology: G., Anzelark
et al.) y la patente nº WO 93/01281 (US DHHS: R.M. Blaese
et al.) e incluyen, aparte de la timidina quinasa (gen
suicida) y ganciclovir/aciclovir (profármaco), nitrorreductasa (gen
suicida) y CB1954 (profármaco) y citosina desaminasa (gen suicida)
y 5-fluorocitosina (profármaco). Ésta y otras
proteínas suicidas y los (pro)fármacos correspondientes
también se revisan y se citan sus usos en "Genetic Prodrug
Activation Therapy", A. Rigg y K. Sikora, Molecular Medicine
Today, agosto de 1997, páginas 359-366.
En el caso de que la fusión
VP22-TK se presente en la forma de ADN de cualquiera
de las maneras descritas en la patente nº WO 97/05265 o en Elliott
y O'Hare (1997), una célula diana puede transfectarse con el gen
codificante de esta fusión, y la fusión expresada seguidamente puede
translocarse fuera de la célula en la que se expresó y hacia el
interior de las células circundantes, produciendo un efecto de
eliminación de estas células al tratarlas con ganciclovir, etc., un
efecto que es diferente de, y puede ser adicional a, efectos
espectador. Alternativamente, tal como en otras realizaciones, esta
fusión VP22-TK puede aplicarse directamente en
forma de proteína.
En realizaciones adicionales, la invención se
refiere, por ejemplo, a proteínas de transporte relacionadas con
VP22 o con sus fragmentos activos fusionados en polipéptidos de
fusión o de otra manera acoplados con secuencias o proteínas
antigénicas (por ejemplo de longitud superior a 12 residuos
aminoácidos) seleccionados, por ejemplo, de entre cualquiera de los
materiales antigénicos u otras proteínas y péptidos indicados
posteriormente.
Además de los polipéptidos de fusión y productos
de acoplamiento, la invención proporciona híbridos acoplantes que
comprenden VP22 acoplado a un ADN que puede comprender, por ejemplo
elementos reguladores conocidos adecuados, de manera que puede ser
transcrito y traducido, y que contiene un marco de lectura abierto
que codifica cualquiera de las proteínas indicadas
posteriormente.
Acoplamiento a antígenos: VP22 puede acoplarse
útilmente con ejemplos de antígenos microbianos y víricos y de
antígenos tumorales, tales como aquellos indicados
posteriormente.
El tratamiento con los productos de acoplamiento
de VP22 que implica antígenos de patógenos tal como se proporcionan
en la presente invención pueden inducir respuestas inmunológicas
útiles contra patógenos correspondientes. Son ejemplos de estos
antígenos las proteínas del virus del papiloma L1 y L2, las
proteínas de VIH gag, pol, env y nef, los antígenos de clamidia
(tales como la proteína principal de la membrana externa, MOMP) y
las proteínas de choque térmico de Chlamydia.
VP22 también puede acoplarse útilmente con
antígenos de micobacterias, tales como antígeno de Mycobacterium
tuberculosis.
Alternativamente, el antígeno puede ser un
antígeno asociado a tumor, en el que la actividad antitumoral de
los CTLs asociados con la eliminación de las células tumorales
resulta incrementada. Se ha descubierto que citoquinas específicas,
tales como el factor \alpha de necrosis tumoral, el interferón
gamma, la interleuquina 2, la interleuquina 4 y la interleuquina 7
resultan particularmente útiles en este aspecto. Los antígenos
asociados a tumor y su papel en la inmunobiología de determinados
cánceres se comenta, por ejemplo, en P. van der Bruggen et
al., Current Opinion in Immunology
4(5):608-612, 1992. Son ejemplos particulares
de estos antígenos que se contemplan para la utilización en el
contexto de la presente solicitud los antígenos E6 y E7 del
papilomavirus humano (especialmente, por ejemplo, de los tipos 6,
11, 16, 18, etc.); las proteínas derivadas del virus de
Epstein-Barr, por ejemplo, aquéllas identificadas en
las referencias 2 y 25 en P. van der Bruggen et al., citados
anteriormente: antígenos de la serie MAGE, tales como los
identificados en T. Boon, Adv. Cancer Res.
58:177-210, 1992 y/o MZ2-E y otros
antígenos, tales como los identificados en P. van der Bruggen et
al., Science 254:1643-1647, 1991; proteínas de
melanoma, por ejemplo la tirosina humana, y mucinas, tales como
aquéllas identificadas en P.O. Livingston, en Current Opinion in
Immunology 4(5):624-629, 1992, por ejemplo
MUC1, tal como se identifica en J. Burchell et al., Int. J.
Cancer 44:691-696, 1989.
Asimismo, la VP22 puede acoplarse útilmente con
proteínas víricas, tales como los antígenos glucoproteicos, por
ejemplo del virus herpes, tales como gH o gD o gB del virus del
herpes simplex, o g50 del virus de la pseudorrabia, como ejemplo de
un antígeno de un patógeno animal, en este caso de un virus
animal.
De esta manera, VP22 puede acoplarse útilmente
con antígenos conocidos de la técnica anterior de tratamiento de
los tumores malignos, incluyendo estudios que subrayan el potencial
de vacunación terapéutica contra tumores utilizando material
autólogo derivado del propio tumor del paciente. La teoría detrás de
este enfoque es que las células tumorales pueden expresar una o más
proteínas u otras macromoléculas biológicas que son diferentes de
las células sanas normales, y por lo tanto pueden utilizarse para
dirigir una respuesta inmunológica para reconocer y destruir las
células tumorales.
Estas dianas tumorales pueden encontrarse
presentes ubicuamente en tumores de un tipo determinado. Un buen
ejemplo de lo anterior es el cáncer cervical, donde la gran
mayoridad de tumores expresan las proteínas E6 y E7 del
papilomavirus humano. En este caso, la diana tumoral no es una
autoproteína, y por lo tanto su potencial como marcador
tumoroespecífico único para la inmunoterapia del cáncer no está
clara.
La evidencia es creciente de que determinadas
autoproteínas también pueden utilizarse como antígenos de diana
tumoral. Esto se basa en la observación de que se expresan
consistentemente en las células tumorales, pero no en las células
sanas normales. Entre los ejemplos de éstas se incluyen la familia
MAGE de proteínas. Es previsible que se identifiquen más
autoproteínas útiles como dianas tumorales.
Los antígenos asociados a tumor y sus papel en
la inmunobiología de determinados cánceres se comenta, por ejemplo,
en P. van der Bruggen et al., en: Current Opinion in
Immunology 4(5):608-612, 1992. Otros
antígenos similares, de la serie MAGE, se identifican en T. Boon,
Adv. Cancer Res. 58:177-210, 1992, y se identifican
MZ2-E y otros antígenos relacionados con tumores en
P. van der Bruggen et al., Science
254:1643-1647, 1991; se indican mucinas asociadas a
tumores e P.O. Livingston, en: Current Opinion in Immunology
4(5):624-629, 1992, por ejemplo MUC1, tal
como se menciona en J. Burchell et al., Int. J. Cancer
44:691-696, 1989.
Entre las realizaciones de la invención de
utilización en la modulación inmunológica se incluyen, por ejemplo,
las que se indican a continuación. VP22 puede acoplarse útilmente
con ejemplos de citoquinas o de otros compuestos inmunomoduladores,
tal como se indica posteriormente. De esta manera, VP22 puede
acoplarse útilmente con proteínas inmunomoduladoras, por ejemplo
aquéllas que potencian la respuesta inmunológica, incluyendo la
citoquina interleuquina 1, la interleuquina 2 y el factor
estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF). Estos productos pueden utilizarse, por
ejemplo, de maneras análogas a aquéllas indicadas en, por ejemplo,
la patente nº WO 96/26267 o nº WO 97/14808, para alterar, por
ejemplo para incrementar, una respuesta inmunológica específica de
un tipo celular diana, por ejemplo un tipo de célula tumoral, que se
ha expuesto al producto sea in vitro o in vivo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "proteína inmunomoduladora" y términos relacionados
incluye una proteína o proteínas que potencian o suprimen una
respuesta inmunológica del huésped frente a un virus mutante o
proteína codificada por el mismo, o contra un antígeno, tal como un
inmunógeno de un patógeno o fuente exógena al virus, o un antígeno
asociado a tumor. Las proteínas inmunomoduladoras normalmente no
son aquellas proteínas utilizadas en la actualidad como inmunógenos
(antígenos) en sí mismos. Una proteína inmunomoduladora puede ser
un miembro natural de un sistema inmunológico humano o animal no
humano, por ejemplo de un sistema inmunológico de mamífero.
Alternativamente, una proteína inmunomoduladora puede ser una
proteína codificada por un patógeno, que presenta una capacidad de
unión funcional con un constituyente natural de dicho sistema
inmunológico.
Alternativamente, una proteína inmunomoduladora
puede ser una proteína artificial, por ejemplo un fragmento de una
proteína inmunomoduladora natural, o una muteína de dicha proteína o
fragmento, o una proteína de fusión que incorpore cualquiera de los
mismos. Muchas proteínas inmunomoduladoras, y los materiales
genéticos que las codifican, y sus secuencias de nucleótidos y de
aminoácidos, son conocidas de la literatura en esta materia, y se
encuentran disponibles en bases de datos de secuencias genéticas,
tales como la base de datos EMBL, y varias se encuentran
disponibles comercialmente en la forma de material genético de
ingeniería genética para la clonación y otras manipulaciones.
Las proteínas inmunomoduladoras acopladas con
VP22 tal como se describen en la presente memoria pueden ser
útilmente de, por ejemplo, secuencias nativas a la especie que debe
recibir el tratamiento con estos productos de acoplamiento o con
ADN, por ejemplo en la forma de virus recombinante, por ejemplo una
proteína inmunomoduladora de tipo humano para el tratamiento de un
sujeto humano.
Entre los ejemplos de proteínas
inmunomoduladoras en este contexto se incluyen las citoquinas, las
quimoquinas, componentes del complemento, moléculas de adhesión y
accesorias del sistema inmunológico y sus receptores de
especificidad humana o animal no humana. Entre los ejemplos útiles
se incluyen GM-CSF, IL-2,
IL-12, linfotactina, CD40 y CD40L. Entre los
ejemplos útiles adicionales se incluyen las interleuquinas, por
ejemplo las interleuquinas 1 a 15, los interferones alfa, beta o
gamma, el factor de necrosis tumoral, el factor estimulante de
colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF), el factor de estimulante de colonias de
macrófagos (M-CSF), el factor estimulante de las
colonias de granulocitos (G-CSF), las quimoquinas
tales como la proteína activadora de neutrófilos (NAP), el factor
quimoatrayente y activador de macrófagos (MCAF), RANTES, los
péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-1a y
MIP-1b, componentes del complemento y sus
receptores, o una molécula accesoria, tal como B7.1, B7.2,
ICAM-1, 2 ó 3 y receptores de citoquina.
OX40 y el ligando de OX40 (OX4OL) (gp34) (ver,
por ejemplo, las patentes nº WO 95/12673, nº WO 95/21251 y nº WO
21915) son ejemplos útiles adicionales de proteínas
inmunomoduladoras. Las proteínas inmunomoduladoras puede ser, para
diversos propósitos, de especificidad humana o animal no humana y
pueden representarse para los presentes propósitos, según el caso y
según resulte conveniente, por dominios extracelulares y otros
fragmentos con la actividad de unión de las proteínas de origen
natural, y las muteínas de las mismas, y sus proteínas de fusión
con otras secuencias polipeptídicas, por ejemplo con dominios
constantes de cadena pesada de inmunoglobulina. Donde ser insertan
secuencias de nucleótidos codificantes de más de una proteína
inmunomoduladora, pueden comprender, por ejemplo, más de una
citoquina o una combinación de una o más citoquinas y una o más
moléculas accesorias/de adhesión.
La respuesta inmunológica inducida por la
utilización de dichos productos de acoplamiento a VP22 o por
vectores que los codifican puede incluir respuestas inmunológicas de
una diversidad de tipos, por ejemplo una respuesta contra una
proteína codificada víricamente, y/o una respuesta contra un
antígeno del huésped, siendo una respuesta estimulada por un vector
vírico o por la expresión de un gen heterólogo codificado por el
mismo, por ejemplo el producto acoplante a VP22. Entre los usos de
los vectores víricos mutantes tal como se describen en la presente
memoria se encuentra, por ejemplo, proteger un sujeto de una especie
susceptible frente a la infección por un virus correspondiente de
tipo salvaje cuando se trata el sujeto con el mismo, por ejemplo se
infecta con el mismo, o por ejemplo, mediante inmunización
directa.
Una proteína inmunomoduladora a acoplar con VP22
puede ser ella misma una proteína híbrida o de fusión que comprende
una región polipeptídica que presenta homología con, y funcionalidad
de, una proteína inmunomoduladora, ligada a una región
polipeptídica que presenta otra homología, y opcionalmente otra
funcionalidad. Por ejemplo, la proteína inmunomoduladora puede ser,
comprender o corresponder en funcionalidad a la proteína gp34
identificada como pareja de unión de la OX-40
humana (ver W. Godfrey et al., J. Exp. Med.
180(2):757-762, 1994, y referencias citadas
en la misma, incluyendo S. Miura et al., Mol. Cell Biol.
11(3):1313-1325, 1991). La versión de esta
funcionalidad de proteína que puede codificarse en el genoma vírico
mutante puede corresponder a la secuencia misma de la gp34 natural,
o a un fragmento de la misma, o a un producto de expresión híbrida,
por ejemplo basado en el dominio (de unión) extracelular
(C-terminal) de gp34 fusionado a otra proteína, por
ejemplo a la región constante de una cadena pesada de
inmunoglobulina, tal como la IgG1 humana, por ejemplo con el dominio
extracelular de gp34 (una proteína membranal de tipo 2) fusionada
en su extremo N-terminal con el extremo
C-terminal del dominio constante de
inmunoglobulina.
Otras proteínas inmunomoduladoras también pueden
transportarse y expresarse en dichas formas derivadas e híbridas,
incluyendo las formas mutadas, tal como se indica en la presente
invención.
En determinados ejemplos, la proteína
inmunomoduladora puede comprender una citoquina, preferentemente un
factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF),
por ejemplo la GM-CSF murina o preferentemente
humana.
La GM-CSF murina y humana son
ambas conocidas: el gen de la GM-CSF murina modifica
un polipéptido de 141 aminoácidos, presentando la glucoproteína
segregada madura un peso molecular comprendido entre 14 y 30
kdaltons, dependiendo del grado de glucosilación. La
GM-CSF genéricamente es un miembro de la familia de
los factores de crecimiento hematopoyéticos y se definió e
identificó por primera vez por su capacidad de estimular la
formación de colonias in vitro en progenitores
hematopoyéticos. GM-CSF es un potente activador de
la función de neutrófilos, eosinófilos y
macrófagos-monocitos, potenciando la migración,
fagocitosis, expresión del complejo de histocompatibilidad mayor
(MHC) e iniciando una cascada de moléculas bioactivas que estimula
adicionalmente el sistema inmunológico. GM-CSF en
la actualidad se está evaluando clínicamente para el tratamiento de
la neutropenia secundaria a quimioterapia y como adyuvante en la
terapia del cáncer.
La secuencia de nucleótidos heteróloga utilizada
puede comprender un gen heterólogo, un fragmento génico o una
combinación de genes con la condición de que codifique una proteína
inmunomoduladora, tal como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con los ejemplos de la invención,
pueden utilizarse combinaciones de dos o más proteínas
inmunomoduladoras para los propósitos indicados en la presente
memoria. En los ejemplos particulares, proporcionados a título
ilustrativo únicamente y no limitativos, la combinaciones que
implican IL2, GMCSF, linfotactina y/o CD4OL pueden utilizarse en
combinaciones entre sí o con otros de las proteínas
inmunomoduladoras indicadas anteriormente. Cada una de las otras
combinaciones binarias de las proteínas inmunomoduladoras indicadas
anteriormente también se proporcionan mediante, y dentro del
alcance de, la presente invención.
En determinadas realizaciones la invención puede
resultar útil en aplicaciones de terapia génica: de esta manera,
por ejemplo, VP22 también puede acoplarse útilmente con ejemplos de
genes utilizados o propuestos para ser utilizados en terapia
génica, incluyendo: el gene para la adenosina desaminasa humana
(ADA), tal como se indica en, por ejemplo, la patente nº WO
92/10564 (K.W. Culver et al.: U.S. Secretary for Commerce
& Cellco Inc.), las patentes nº WO 89/12109 y nº EP 0 420 911
(I.H. Pastan et al.): el gen de la fibrosis quística y las
variantes indicadas en la patente nº WO 91/02796
(L-C Tsui et al.: HSC Research y University
of Michigan), en la patente nº WO 92/05273 (F.S. Collins y J.M.
Wilson: University of Michigan) y en la patente nº WO 94/12649
(R.J. Gregory et al.: Genzyme
Corp.).
Corp.).
Asimismo, la VP22 puede acoplarse útilmente con
proteínas reguladoras de la transcripción conocidas, tales como
NF-AT, que resulta activada por traslocación en el
núcleo e induce la transcripción de las interleuquinas, por ejemplo
de IL-1. El acoplamiento con VP22 puede utilizarse
en la presente memoria para evitar la retención del producto
acoplado en el citoplasma.
La invención también incluye proteínas acopladas
y de fusión en las que se proporciona una secuencia línker que
permite que la proteína de fusión se divida intracelularmente para
permitir la separación de la parte antigénica, tal como la indicada
anteriormente, de la parte proteica de transporte. Una secuencia de
inducción del corte puede comprender, por ejemplo, la subsecuencia
de aminoácidos RVCSNPPCETHETGTTNTATATSN u otras secuencias de corte
indicadas, por ejemplo, en A.C. Wilson et al., en Genes and
Development 9:2445-2458, 1995.
La invención también proporciona procedimientos
para el tratamiento de las células con productos de acoplamiento,
tal como se describen en la presente memoria, de manera que se
produzcan efectos inmunogénicos, inmunomoduladores,
citotóxicos/letales o terapéuticos.
Los ejemplos de los materiales y procedimientos
tal como se describen en la presente invención resultan útiles en
la modulación de la actividad celular, por ejemplo con el objetivo y
el efecto de producir o de alterar las respuestas inmunológicas,
por ejemplo para la profilaxis o la terapia de las enfermedades, por
ejemplo la producción de respuestas inmunológicas contra patógenos
o tumores.
Entre otros usos de determinados materiales y
procedimientos de la presente invención se incluyen la regulación
de la expresión génica en las células, por ejemplo para fines de
terapia génica correctora y/o para la reducción o el control del
crecimiento y la actividad de las células tumorales. Los
tratamientos celulares de acuerdo con la invención pueden ser in
vitro, ex vivo o in vivo.
Entre los derivados de VP22 que pueden
utilizarse de acuerdo con aspectos de la invención como sustancias
activas en transporte y para el acoplamiento con materiales a
transportar, para los fines indicados en otras partes de la
presente memoria, se encuentran los péptidos que comprenden una
secuencia funcional activa en transporte de la sección
C-terminal de VP22.
Los ejemplos no limitativos de los
procedimientos de tratamiento con los materiales descritos en la
presente memoria comprenden el tratamiento de células presentadoras
de antígeno o de preparaciones de células que las contienen con una
fusión de VP22 y un antígeno, por ejemplo uno de aquellos antígenos
indicados anteriormente (o con un vector, por ejemplo un vector
vírico que codifica dicha fusión), de manera que se produce el
procesamiento del antígeno y la presentación por la vía MHCI de
manera que se produce una respuesta de CTL contra el antígeno.
Entre los procedimientos proporcionados de esta manera el cebado y
la expansión de las células T y la inmunoterapia adoptiva
utilizando los materiales obtenidos de esta manera, de una manera de
otra manera análoga a los procedimientos conocidos de cebado,
expansión e inmunoterapia adoptiva.
Varios sistemas de vector, tales como la
infección retrovírica o adenovírica o la inyección de complejos
proteína-liposoma, así como los sistemas de vector
virus herpes, pueden adaptarse fácilmente para constituir ejemplos
de la presente invención. Por ejemplo, el ADN desnudo para una
fusión de proteína VP22 con una proteína de uno de los tipos
indicados en la presente memoria puede inyectarse en un tejido a
tratar, de acuerdo a la naturaleza y propósito de la proteína a
administrar. Pueden utilizarse los virus recombinantes tal como se
ha indicado, que codifican y pueden expresar las proteínas de fusión
de VP22. Un vector virus recombinante que porta dicha fusión puede
ser defectivo, no replicante o de replicación limitada de manera que
la replicación sea dependiente de las condiciones predominantes en
el tejido o célula diana pero no en las células normales o que no
son diana.
Los vectores y proteínas de fusión de los
ejemplos de la invención pueden resultar útiles en la terapia
génica, y para tratar o proteger contra la proliferación celular
anormal, especialmente el cáncer pero también la soriasis, la
ateroesclerosis y la restenosis arterial, y para inducir la
apoptosis de, por ejemplo, linfocitos proliferantes, es decir para
inducir la tolerancia, por ejemplo para prevenir el rechazo del
trasplante o para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas,
tales como el lupus eritematosis sistémico o la artritis
reumatoide.
Además de las aplicaciones terapéuticas médicas,
los efectos mostrados en la presente invención también pueden
explotarse mediante ensayos, proporcionados por la invención, que se
basan en interacciones sustrato-enzima o en la
interacción de proteínas expresadas en diferentes poblaciones
celulares.
Se describe adicionalmente una realización de la
invención, sin pretensión de limitar la invención, haciendo
referencia a los dibujos adjuntos y a los materiales y métodos que
se describen después:
En los dibujos adjuntos,
- La figura 1 ilustra que:
las células cos-1 transfectadas
únicamente con el vector se marcaron mediante inmunofluorescencia
indirecta con anticuerpos para VP22 (figura 1a), p53 (figura 1c) y
el epítopo de CMV (figura 1d) para establecer los niveles de
marcaje de fondo. Las transfectadas con pc49epB (figura 1b) y
marcadas para VP22 demostraron un patrón citoplasmático de VP22
típico, con clara expansión de los núcleos de las células contiguas.
Las células transfectadas con el constructo de proteína de fusión
VP22-p53 llamado p4953ep+10 se marcaron para VP22 y
p53 (figuras 1e y 1f) o VP22 y epítopo (figuras 1g y 1h): la
proteína de fusión puede detectarse en los núcleos de las células
contiguas a la célula expresante primaria.
- La figura 2 es un mapa de plásmido para
ilustrar el p4953ep+10 codificante de una proteína de fusión que
comprende secuencias VP22, p53 y una etiqueta epítopo.
- La figura 3 ilustra que:
los extractos de proteína procedentes de células
cos-1 transfectadas con un abanico de constructos de
plásmido se analizaron mediante transferencia western. El panel
mostrado de más a la izquierda se ha sondeado con un anticuerpo
contra VP22 y demuestra que los plásmidos pU49epB y pc49epB
codificantes de VP22 solo generan una proteína de 38 kDa, la
proteína de fusión VP22-p53 expresada a partir de
p4953ep+10 produce una proteína de aproximadamente 90 kDa con muy
poca degradación.
El panel mostrado de más a la derecha se ha
sondeado con un anticuerpo contra p53 y demuestra que las células
transfectadas con plásmidos que codifican p53 solo (pcB6+p53) o el
constructo de proteína de fusión p4953ep+10 produce proteína p53 de
53 kDa. El constructo p4953ep+10 también sintetiza la proteína de
fusión VP22-p53 de 90 kDa, la p53 en esta muestra
podría ser un producto de degradación, o más probablemente p53
inducido endógenamente.
Las células cos-1 se cultivaron
en MEM modificado por Dulbecco suplementado con suero de neonato
bovino al 10% a 37ºC con 5% de CO_{2}.
Las transfecciones se llevaron a cabo utilizando
el procedimiento de BES/CaCl_{2} (Elliott y O'Hare 1997) con 200
ng de plásmido de ensayo con 1.800 ng de pUB19. Se dejó que se
produjesen las transfecciones durante 48 horas, momento en el que
se recolectaron las monocapas para análisis de inmunofluorescencia o
de transferencia western.
Se fijaron las monocapas celulares sobre
cubreobjetos con metanol al 100% durante 15 minutos a temperatura
ambiente y se marcaron tal como describen Elliott y O'Hare (1997).
Todos los anticuerpos se diluyeron en PBS + suero al 10%. Se
detectó VP22 utilizando un anticuerpo policlonal de conejo AGV30
(1:500), se detectó p53 utilizando un anticuerpo monoclonal de
ratón DO-1 (Santa Cruz Ltd.), el epítopo de CMV se
detectó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón CMV LNA
(Capricorn Ltd.). Las imágenes se obtuvieron utilizando un
microscopio confocal MRC600 de Bio-Rad.
El constructo de proteína de fusión
VP22-p53 se generó mediante clonación de un
fragmento PCR de p53 de longitud completa
C-terminal a VP22 en un sitio único Bam, manteniendo
tanto VP22 como el epítopo de CMV en el mismo marco de lectura.
Se sondearon filtros western con
anti-VP22 (1:10.000), anti-p53
(1:1.000).
Los presentes inventores construyeron un
constructo de proteína de fusión VP22-p53 en el
mismo marco de lectura, de longitud completa, etiquetado con
epítopo (fig. 2). Este vector genera una proteína de fusión de
aproximadamente 90 kDa al expresarse en células
Cos-1, con muy poca degradación de proteínas según
el análisis de transferencia western (fig. 3). A someterlo a ensayo
para el transporte mediante tráfico intercelular, la proteína de
fusión aparentemente funcionaba exactamente como la VP22 sola. Se
encuentra situada en el citoplasma de células transfectadas
primarias, según muestra la inmunofluorescencia en monocapas de
células Cos-1 marcadas con anticuerpos
anti-VP22 (figs. 1e y 1g), anti-p53
(fig. 1f) o anti-epítopo (fig. 1h) y es capaz de
desplazarse muy eficazmente hacia el interior de los núcleos de
células vecinas. La eficacia relativa de transporte no se ha
determinado empíricamente pero aparentemente sólo es ligeramente
menor a la de VP22 sola.
En experimentos adicionales, se transfectaron
(utilizando la técnica del fosfato de calcio) células de
osteosarcoma negativas para p53 con ADN desnudo que codificaba
expresablemente (a) VP22 de tipo salvaje, (b) p53 de tipo salvaje,
o (c) la proteína de fusión VP22-p53 indicada
anteriormente. Las células transfectadas (b) y (c) mostraron la
capacidad de experimentar apoptosis, al contrario que las células de
control (a), indicando que la proteína de fusión
VP22-p53 conserva la funcionalidad de p53.
En variantes del ejemplo proporcionado en la
presente memoria, pueden prepararse, si se desea, constructos de
deleción de VP22 de tamaño reducido de la proteína de fusión, por
ejemplo para mejorar la tasa o grado de transporte, y que se pierda
funcionalidad de la proteína.
En variantes adicionales, el orden de los
componentes de la fusión puede variarse, por ejemplo las secuencias
de p53 y de VP22 pueden incluirse fácilmente en el orden contrario
al orden presente en el plásmido mostrado en la figura 2, con
resultados satisfactorios.
La presente exposición se extiende a
modificaciones y variaciones de la descripción proporcionada en la
presente memoria, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, que
resultarán evidentes para el lector experto en la materia.
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Claims (15)
1. Polipéptidos acoplados y polipéptidos de
fusión, que comprenden:
(i) una secuencia polipeptídica de VP22 de virus
herpes, con la propiedad de ser un polipéptido activo en transporte
capaz de mediar en el transporte hacia el interior de las células,
conjuntamente con:
(ii) una secuencia de proteína o de polipéptido
seleccionada de entre:
- (a)
- una proteína para el bloqueo de la progresión del ciclo celular que es una proteína p53 para el bloqueo de la progresión del ciclo celular, o un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, o
- (b)
- una proteína suicida que es condicionalmente citotóxica o letal, es decir, citotóxica o letal cuando se administra a una célula que contiene dicha proteína suicida, un profármaco o un compuesto activador correspondiente; o
- (c)
- una secuencia antigénica microbiana o vírica diferente de un epítopo de 10 aminoácidos de longitud codificado por el gen UL-83 de HCMV; o una secuencia antigénica de una proteína L1 o L2 de virus del papiloma, o un polipéptido gag, pol, env o nef de VIH, o un antígeno de clamidia, o un antígeno micobacteriano o una proteína MAGE, o
- (d)
- una proteína inmunomoduladora que es una proteína componente del complemento o una proteína receptora de citoquina, o GM-CSF, linfotactina, CD40, CD40L o cualquiera de entre IL-1 a IL-15, interferón alfa, beta o gamma, factor de necrosis tumoral, factor estimulante de las colonias de macrófagos, factor estimulante de las colonias de granulocitos, proteína activadora de neutrófilos, quimioatrayente y factor activador de macrófagos, MIP-1a o MIP-1b, B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2 o ICAM-3, OX40 u OX40L.
2. Polipéptido según la reivindicación 1,
que es un polipéptido de fusión en el que dicha secuencia (ii) es
una proteína p53 para el bloqueo de la progresión del ciclo celular
o un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina.
3. Polipéptido según la reivindicación 2, en
el que dicha secuencia (ii) es una proteína p53 para el bloqueo de
la progresión del ciclo celular.
4. Polipéptido según la reivindicación 2, en
el que dicha secuencia (ii) es un inhibidor de quinasa dependiente
de ciclina.
5. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que dicha secuencia (ii) es de una proteína suicida.
6. Polipéptido según la reivindicación 5, en
el que dicha proteína suicida es timidina quinasa o
nitrorreductasa.
7. Polipéptido según la reivindicación 1,
que es un polipéptido de fusión y comprende una secuencia de unión
inductora de corte situada entre las secuencias (i) e (ii).
8. Polipéptido que codifica un polipéptido
de fusión según la reivindicación 1.
9. Polipéptido según la reivindicación 8, en
el que dicha secuencia codifica un polipéptido de fusión que
comprende: (i) una secuencia polipeptídica de VP22 de virus herpes
con la propiedad de ser un polipéptido activo en transporte capaz
de mediar en el transporte hacia el interior de las células; e (ii)
una proteína p53 para el bloqueo de la progresión del ciclo
celular, o un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina.
10. Vector de expresión que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 8.
11. Vector de expresión según la
reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido es transportado
por un vector virus.
12. Vector de expresión según la
reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido es transportado
por un complejo proteína-liposoma.
13. Vector de expresión según las
reivindicaciones 11 ó 12, que comprende un polinucleótido según la
reivindicación 9.
14. Utilización de un polipéptido de fusión
según la reivindicación 2, en la preparación de un medicamento para
el bloqueo de la progresión del ciclo celular de las células
malignas.
15. Utilización de un vector según la
reivindicación 13, en la que dicha secuencia codifica un polipéptido
según la reivindicación 3, en la preparación de un medicamento para
el bloqueo de la progresión del ciclo celular de las células
malignas.
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