JPH11502222A

JPH11502222A - 遺伝子供給用ベクター

Info

Publication number: JPH11502222A
Application number: JP8528219A
Authority: JP
Inventors: エフスタスィオウ，スタシー; チャールズイングリス，スティーブン; ツァン，シーアオリウ
Original assignee: キャンタブファーマシューティカルズリサーチリミティド; ケンブリッジユニバーシティテクニカルサービシズリミティド
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-25
Publication date: 1999-02-23
Also published as: AU5153296A; US5928913A; AU711702B2; WO1996029421A1; EP0871755A1; CA2215162A1

Abstract

(57)【要約】ヘルペスウィルスアンプリコン調製物は、複製の起点、パッケージング配列、及びプロモーターの制御下での少なくとも１つの挿入された遺伝子、並びに正常な宿主細胞において制限された複製能力のものであるヘルパーヘルペスウィルス又はその DNAを含んで成り；ここで前記ヘルパーウィルスは感染性新規ウィルス粒子の生成のために必須である遺伝子に関して不活性化欠陥を有し、そして前記アンプリコンがヘルパーウィルスの増殖のために必要である挿入された遺伝子を担持する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子供給用ベクター発明の分野本発明は、遺伝子供給のためのアンプリコン（amplicon）ベクター類、並びに免疫原、ワクチン、ワクチンアジュバント、免疫療法剤及び遺伝子治療における剤としてのそれらの使用に関する。本発明はまた、インビボ及びインビトロでの診断方法へのそれらの使用並びにすでに言及されたような免疫原及び他の目的のための誘導生物学的材料のエクスビボ又はインビトロ調製のためのそれらの使用にも関する。本発明はまた、そのようなベクター及びそれらの誘導体を製造し、そして増殖するための方法及び材料にも関する。発明の背景及び従来の技術しばしば、ベクターにより、及びしばしば、（しばしばウィルス様）タンパク質性被膜によりカプシド封入された核酸の形で真核細胞中への DNAを導入するための多くの技法が知られている。多くのそのような技法は、広範囲の臨床及び実験用途のために提案されており、そしていくつかは使用されている。所望の遺伝子が細胞内で発現され得、そして RNA及び／又はタンパク質の生成を導びく条件下で、その所望の遺伝子をコードする DNAを意図的に導入することは、いづれかの広範囲の有用な生物学的応答を誘発するために所望される。身体組織、たとえば骨格筋又は皮膚中への直接的な遊離（裸の）プラスミド D NAの注入さえもが、タンパク質発現、並びに細胞毒性Ｔリンパ球(CTL)及びプラスミドに含まれるコードされたタンパク質抗原に対する抗体の誘導を導びくことができることが最近、報告されている(U lmerなど．Science，259（1993）1745-1749 ; Wangなど．Proc Nat Acad Sci US 90（1993）4156-4160 ; Razなど．Proc Nat Acad Sci US 91（1994）9519-9523 )。それにもかかわらず、ウィルス様ベクターによる核酸導入の効率はしばしば、裸の DNAの効果よりも高く、そして改良されたウィルス様ベクターを同定し、そして製造するための連続した努力が存在する。既知のウィルスベクター間には、組換えウィルスが存在し、この例は、ポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス及びレトロウィルスを包含するいくつかのウィルス種に基づいて開示されている。そのような組換え体は、ベクター感染された宿主細胞においてそれらの発現を引き起こすことができるプロモーターの制御下に異種遺伝子を担持することができる。ワクシニア及び他のタイプの組換えウィルスが、たとえばMackett，Smith and Moss(J Virol 49(3)(1984 )857-864)による総説に言及され、そして引用されている。さらなる例によれば、WO 88／00971 明細書(CSIRO，Australian National Uni versity : Ramshawなど)及び WO 94／16716 明細書（Virogenetics Corp : Paol ettiなど）は、種々のサイトカイン、たとえば GMCSFのための遺伝子を担持する組換えワクシニアウィルスを記載しており、そして報告された効果は、サイトカイン遺伝子を担持する組換えウィルスに対する免疫応答の強化を包含する。さらなる既知の組換えウィルスベクター、たとえばワクシニアウィルス及びヘルペスウィルスタイプの例が、WO 92／16636 明細書（Cantab Pharmaceuticals : Boursnellなど）、WO 92／05263 明細書（Immunology Ltd：Inglisなど）及び WO 94／21807 明細書（Cantab Pharmaceuticals：Inglisなど）に記載されており、ここで処理された対象において免疫応答を引き起こすよう意図された異種抗原のための遺伝子を担持する組換えウィルスが開示されている。従来技術はまた、たとえばVlazny and Frenkel，Proc Nat AcadSci US 78（19 81）742-746；及びR R Spaete and N Frenkel，Cell 30（1982）295-304により記載されるように、ヘルペスウィルス、たとえば単純ヘルペスウィルスに基づくアンプリコンを包含する。そのようなアンプリコンは、ウィルス遺伝子機能に関してひじょうに不完全であるが、しかし複製の HSV起点(ORI)の少なくとも１つのコピー及びパッケージングシグナル配列(HSVゲノムの“ａ”配列に位置する) を含む DNAである。ヘルパー HSVウィルスと共に適切な細胞中に導入される場合、アンプリコンは、ヘルパーヘルペスウィルスの同じ細胞における増殖に依存して増殖することができ、このヘルパーウィルスは、そのアンプリコン自体によりコードされないトランス複製及びパッケージング機能（子孫アンプリコンがパッケージされるビリオンの構造成分を包含する）を提供するものである。 WO 94／04695 明細書（Rockefeller University : M G Kaplitt）は、外来性遺伝子を担持するヘルペスウィルス欠陥ベクターにより感染される予定である宿主に対して内因性のプロモーターにより“駆動される”前記ベクターに言及する。その予期される使用は、たとえば成熟哺乳類脳に関しての遺伝子療法を包含する。関連する出版物において、Kaplittなど，Proc Nat Acad Sci US 91(19)(199 4)8979-8983（及び初期文献）は、成熟ラット脳において外来性遺伝子を発現するためへの欠陥単純ヘルペスウィルスベクターの使用を論じている。それらは、ラットプレプロエンケファリンプロモーターの 2.7kbフラグメント下流に外来性遺伝子（細菌lacZ）を含む単純ヘルペスウィルスアンブリコンを記載する。アメリカ特許第 4,996,152号(JK Carterなど : US Sec of Agriculture)は、M arek病ウィルスからのアンプリコンの特徴を有する DNAフラグメント（種子）を記載しており、ここで前記種子及び関連する遺伝子のコンカテマーは、ヘルパーウィルスの存在下で、及びヘルパーウィルス中への遺伝子の挿入のためへの使用のためにコトランスフェクトされ、そして複製される場合、ワクチン又は供給ベクターとしての可能性を有するものとして記載されている。 Proc Nat Acad Sci(1990)(Nov)87 : 8950-8954においてA.I Gellerなどは、遺伝子IE３に関して欠失されたヘルパーウィルスに関連して補完細胞系(complemen ting cell live)上で増殖した成熟ラット脳からの細胞中へのＥ．コリβ・ガラクトシダーゼの導入のための欠陥HSV1ベクターシステムの使用に基づいて、“欠陥単純ヘルペスウィルスベクターのための効果的欠失変異パッケージングシステム：ヒト遺伝子療法及びニューロン生理学への可能性ある適用”を記載する。 “遺伝子療法”は、不明であるか又は欠損する遺伝子の機能を置換する臨床目的を包含し、そしてのう胞性繊維症又はアデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症において欠損する遺伝子（すなわち、それぞれCFTR及び ADAをコードする遺伝子）の機能的コピーを患者細胞中に導入することによって前記疾病を処理する試みが知られている。遺伝子療法の形についてのもう１つの既知の案は、導入された核酸配列によりコードされるタンパク質により、又は導入された核酸によりコードされる RNAと内因性遺伝子生成物に対応する標的核酸分子との間のアンチセンス関係により、宿主細胞における標的遺伝子の発現のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションのために核酸配列を導入することを含んで成る。伝統的には、予防接種の目的は感染性疾病に対して保護することであったが、しかしこの目的は、他の種類の免疫刺激を包含するよう、たとえば腫瘍及び他のいくつかの免疫疾患の処理を包含し、そして治療及び予防を包含するよう拡大して来た。たとえば遺伝子療法及び予防接種のために遺伝子供給と共に所望の性質の有用な組合せを示すベクターの追加の形及び調製を提供することが所望される。本発明本発明の目的は、免疫原、たとえばワクチン又はワクチンアジュバントとして、及び／又は、たとえばエキソビボ処理に関連して免疫原の調製に使用され得る、アンプリコンを基礎とするベクターの供給を包含する。前記ベクターの一定の例が、治療的又は予防的修正(corrective)遺伝子療法のために使用され得る。本発明の目的はまた、既知のアンプリコン調製物よりも、処理の対象により安全に投与され得るアンプリコンの調製物の供給を包含する。本発明の目的はまた、特にたとえば、アンプリコンが少なくとも選択された培養条件下でヘルパーウィルスの増殖のために必要な挿入された遺伝子を担持する場合、ヘルパーウィルスに比較してウィルス−パッケージされたアンプリコンの満足する収率を伴って、培養において増殖され得る、遺伝子供給のためのアンプリコンを基礎とするベクターの供給を包含する。たとえば、下記に記載されるようなシステムが、ヘルパーウィルスに比較してアンプリコンの相対的収率において重要な利点を付与することができる。本発明の目的の中にはまた、ひじょうに変異可能な又は抗原的に変化しやすい病原体の複数の抗原を有用にコードすることができる遺伝子を担持するベクターの供給が包含される。本発明によれば、ヘルパーヘルペスウィルス又はその DNAと共同して、免疫原又はワクチンとしての使用のために適切な、複製の起点、パッケージング配列、及びプロモーターの制御下での少なくとも１つの挿入された遺伝子を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンの調製物が供給され、ここで前記結合されたヘルパーウィルスは正常な宿主細胞において制限された複製能力のものである。また、ヘルパーウィルス又はその DNAと組合わせた、複製の起点、パッケージング配列、及びプロモーターの制御下での少なくとも１つの挿入された遺伝子を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンの調製物が本発明により供給され、ここで前記組合わされたヘルパーウィルスは感染性新規ウィルス粒子の生成のために必須である遺伝子に関して不活性化欠陥を有し、前記ウィルスが必須のウィルス遺伝子の機能を提供する遺伝子を担持するよう製造された組換え補完宿主細胞に感染し、そしてその遺伝子を発現できる場合を除き、そのヘルパーウィルスが感染性新規ウィルス粒子の生成を引き起こすことができず、；そして前記アンプリコンがヘルパーウィルスの増殖のために必要な挿入された遺伝子を担持することを特徴とする。本発明に関して、用語“アンプリコン”及び“パッケージドアンプリコン”とは、複製の起点、たとえばウィルス性複製起点、たとえばヘルペスウィルス複製起点；パッケージングシグナル、たとえばウィルスパッケージングシグナル、たとえばヘルペスウィルスパッケージングシグナル；及びアンプリコンにより感染されるべき宿主細胞において活性である転写プロモーターの制御下での遺伝子、しばしば異種遺伝子、を定義するリーディングフレームを（順に）コードする核酸を意味するよう使用され；それらの要素の配列は多くの連結されたコピーで存在し、そして前記核酸はウィルスコートに対応するウィルスの正常な宿主範囲内の宿主細胞中へのアンプリコンの核酸の導入を可能にするために機能的に効果的であるウィルスコートにしばしばパッケージドされる。パッケージされた完全アンプリコンは、高い欠損性のウィルスとして機能することができ、そして新規のアンプリコンを生成するための培養システムにおけるその増殖のためには、その培養の条件下で通常、複製能力を有する、アンプリコンに対応するタイプの同時感染ヘルパーウィルスの同じ宿主培養細胞中の存在に依存する。そのようなアンプリコンは、ベクター核酸を複製しそして／又はパッケージングする機能に必要なタンパク質をコードする多くの遺伝子を欠いており、しばしば、実際、そのような遺伝子の大部分又はすべてを欠いている核酸配列を有する高度に欠損性のウィルスベクターとなる。そのようなアンプリコンは、挿入された遺伝子を担持するよう構築された、R Spaeteなど．Cell 30（1982）295-304に言及される構造体の適用、又は本明細書に言及されるようなアンプリコンの他の従来の記載の適用に基づくことができる。本発明の他の目的はまた、この記載から明らかであろう：本発明はまた、下記に言及されるように、挿入された遺伝子を担持する、種々のヘルペスウィルスのレプリコンの使用も包含する。特に、本発明はまた、興味ある選択された遺伝子をコードするベクターとしてのパックされた及びパックされていないアンプリコン調製物；対応するアンプリコン DNA及び前記アンプリコン DNAを含んで成るプラスミド；ヘルパーウィルス又はヘルパーウィルス DNAと共に混合されたアンプリコンの調製物、たとえばヘルパーウィルスと共に DNAとして又はパックドされたアンプリコンとして実質的な生物学的純粋な状態で存在するアンプリコン調製物；生物学的に単離されたアンプリコン調製物（通常、ヘルパーウィルスを含むが、しかし他の所望しない汚染物は含まない）、及び医薬的に許容できるキャリヤーと共に医薬的に許容できる形でのアンプリコンの配合物；並びに、遺伝子供給のためのベクターとしてのアンプリコン調製物の増殖及び生成方法、並びに使用方法にも拡張する。多くの例においては、そのような欠損ウィルスベクターは、ウィルス遺伝子を含まず、そしてすべてのウィルス的にコードされた遺伝子生成物のためのヘルパーウィルスに完全に又はほとんど完全に依存する。他の例においては、欠損ウィルスベクターは、たとえば１又は２（又は４もしくは５までの）ウィルス遺伝子をコードすることができ、この点に関して、ヘルパーウィルスは欠失体又は不活性化された変異体として選択されて来た。ヘルパーウィルスの遺伝子及び欠損ウィルスベクターの遺伝子は一緒になってすべてのウィルス機能をコードすることができ、あるいは（好ましくは）、アンプリコンの増殖のために使用される組換え補完宿主細胞系により供給され得る１又は複数の定義されたウィルス機能に関して欠損性であり得る。複製・欠損ヘルパーウィルスと共により増殖されるアンプリコン従って、１つの観点において、本発明は、アンプリコンがベクターとして使用される場合に真核細胞に供給されることが所望される少なくとも１種の遺伝子を担持する該アンプリコンを含んで成る、遺伝子供給のためのベクターの調製物を供給し、ここで前記アンプリコンはそれらの増殖のためにヘルパーウィルスに依存性であるが、しかし前記調製物は正常な宿主細胞において複製能力を有するいかなるヘルパーウィルス粒子をも好ましくは有さない。 “正常な宿主細胞”とは、アンプリコンがそれに基礎を置くウィルスの、又はヘルパーウィルスの正常な宿主域内の非組換え動物細胞、すなわちウィルスにおいて人工的な欠失を補完する遺伝子を担持する組換え細胞ではなく、ウィルス起原の異種遺伝子により補完されていない細胞を意味する。そのような調製物はまた通常、ヘルパーウィルス粒子も含み；そのようなヘルパーウィルス粒子は、WO 92／05263 及び WO 94／21807 明細書に記載される種類の遺伝的に無能にされたウィルス、すなわち変異ウィルスが正常な宿主細胞に感染した場合、感染性の新たなウィルス粒子の生成のために必須である少なくとも１つの遺伝子を欠いている変異ウィルスから成る。従って、ヘルパーウィルスのゲノムは、感染された宿主細胞による感染性の新たなウィルス粒子の生成のために必須の選択された遺伝子に関して不活性化欠損を有する変異ウィルスゲノムであり得、その結果、前記ウィルスは正常な宿主細胞（すなわち、必須遺伝子の生成物を発現するよう変異誘発されたそれらの細胞以外の細胞）に感染することができ、そしてそれらの細胞においてウィルス抗原遺伝子のウィルス複製及び発現を引き起こすことができるが、しかし正常な感染性ウィルスの生成は引き起こすことができない。そのような変異ウィルスにおいて、遺伝的欠損は、変異ウィルスがそのような組換え補完宿主細胞以外の宿主細胞に感染する場合、非感染性ウィルス粒子の生成及び開放を可能にするようなもの（たとえば必須糖タンパク質遺伝子、たとえばヘルペスウィルスgH又はgD、又はその相同体の欠失）であり得る。ヘルパーウィルスと共にアンプリコンは、補完宿主細胞系、すなわちヘルパーウィルスにおいて欠損している必須ウィルス遺伝子の機能を補完する遺伝を担持し、そして発現することができる遺伝子組換え宿主細胞系、の培養に基づいて増殖され得る。そのような遺伝的に無能にされた（ヘルパー）ウィルスは、組換え宿主細胞系の補完宿主細胞において複製能力を有するが、しかしそれらは、通常の（正常な）宿主細胞においては、複製不可能、すなわち増殖不可能であり、そしてそこでいづれの感染性子孫ウィルス粒子を生成しない。この意味で、複製不可能又は増殖不可能とは、遺伝的に無能にされたウィルスがそれにより感染された正常な宿主細胞においてのいくつかの細胞内ウィルス分子複事象の発生を引き起こすことを除外しない。遺伝的無能性を生ぜしめる突然変異は、実際好ましくは、必須遺伝子（たとえば、感染性のために必要とされるエンベロープ糖タンパク質のための遺伝子、又は他の“後期遺伝子”として）中に存在するので、多くの又はほとんどのウィルス的にコードされた生成物、たとえば核酸及びタンパク質の細胞内分子複製は正常な宿主細胞において生じるが、感染性の新たなウィルス粒子は究極的にはそれにより形成されない。従って、ある態様においては、本発明は、通常ではあるが、アンプリコン調製物がヘルパーウィルスを含む場合でさえ、それらは感染性の新たなウィルス粒子を、正常な宿主細胞又は宿主動物において生成せず、又は自由に増殖もせず、そしてそれらは処理された宿主動物から他の処理されていない宿主動物に自然に拡散しないという重要な利点を有するアンプリコン調製物を提供する。本発明に関して提供され、そして使用されるアンプリコン及びヘルパーウィルスは、ヒト又は家畜（非ヒト動物）ヘルペスウィルス、そして特に、タイプ１又は２の単純ヘルペスウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、Epstein-Barrウィルス、水痘・帯状ヘルペスウィルス、又は仮性狂犬病（pseudorabies）ウィルス、ウシヘルペスウィルス、ウマヘルペスウィルス又は Marek病ウィルスに基づくことができる。遺伝的に無能にされたウィルスは、そのようなウィルスが正常な宿主細胞に感染する場合、感染性の新たなウィルス粒子の生成のために必須であるいづれかの遺伝子の欠失又は不活性化に基づくことができる。十分に必須の遺伝子はたとえば、それらにおける条件致死感温性変異(conditional-lethal temp erature sensitive mutation)の存在により同定され得る。単純ヘルペスウィルスにおいては、必須の遺伝子、たとえばgB，gD，gH，gL，ICP4，ICP8及び／又は ICP27が欠失され又は不活性化され得る。他のヘルペスウィルスにおいては、既知の必須遺伝子、たとえば HSVの上記遺伝子に対するいづれか既知の必須相同体が、欠失又は不活性化のために選択され得る。サイトメガロウィルスは、たとえばDionなど．Virology 158（1987）228-230 から同定できるように、感温性変異を担当する遺伝子を欠失し、又は不活性化することによって遺伝的に無能にされ得る。欠失のための好ましい遺伝子は、必須のウィルス糖タンパク質、又はビリオン構造の一部を形成し、そして子孫ウィルス粒子の感染性のために必須である他のウィルスタンパク質をコードする、gH，gB、又はgL、又はそれらの同等物である。対応する補完組換え宿主細胞系は、遺伝的に無能にされるべき選択されたウィルスから欠損されるべき遺伝子のコピーをソーシング（sourcing）することによって適合された、下記又は WO 92／05263 明細書に記載されるような補完宿主細胞系の構成法に類似する手段で製造され得る。ヘルパーウィルスにより必要とされる遺伝子を担持するアンプリコンさらなる観点においては、本発明は、アンプリコンがベクターとして使用される場合、真核細胞に供給されることが所望される少なくとも１つの遺伝子を担持するウィルス−パッケージされたアンプリコンを含んで成る、遺伝子供給のためのベクターの調製物を供給し、ここで前記アンプリコンはそれらの増殖のためにヘルパーウィルスに対して依存性であり、そして前記調製物は通常、ヘルパーウィルス粒子を含み；そして前記アンプリコンはまた、少なくとも一定の培養条件下でヘルパーウィルスの増殖に必要であるヘルパー遺伝子も担持し、そして前記ヘルパーウィルス粒子は、そのヘルパー遺伝子に関して、又は機能的に同等のウィルス遺伝子に関して遺伝的に欠損性である。ヘルパーウィルスは、上記種類（たとえば、WO 92／05263 及び WO 94／21807 明細書もまた参照のこと）の遺伝的に無能にされたウィルスであり得る。下記のような本発明の態様は、ヘルペスウィルスのアンプリコンベクターに関する。ある態様において、アンプリコンは、ヘルパーウィルス複製のために必要とされる機能のための遺伝子をコードすることができ、その結果、それは、ヘルパーウィルスの増殖のためにアンプリコンが必須である条件下で宿主細胞培養において増殖され得る。たとえば、アンプリコンは挿入されたTK遺伝子を担持することができ、ヘルパーウィルスはTK^-でありそしてまた必須ウィルス糖タンパク質に関して欠失体であり、それにより、その調製物がメトトレキセートの存在下でTK −細胞上で増殖される場合、アンプリコンはヘルパーウィルスの増殖のために必要である。ヘルパーウィルスの遺伝子及び欠損ウィルスベクターの遺伝子は、一緒になって、必須ウィルス遺伝子の機能に関して欠失性であり得る。アンプリコンは挿入された第１の必須ウィルス遺伝子を担持することができ、前記ヘルパーウィルスはその対応する第１の必須ウィルス遺伝子に関して欠失体であり、そしてまた、第２の必須ウィルス遺伝子に関しても欠失体であり、それにより、その調製物が前記第２の必須ウィルス遺伝子の機能に関して補完される細胞上で増殖される場合、前記アンプリコンはヘルパーウィルスの増殖のために必要である。前記第１の必須ウィルス遺伝子は、必須のウィルス糖タンパク質をコードすることができ、そして第２の必須ウィルス遺伝子もまた、必須のウィルス糖タンパク質（前記第１の必須ウィルス遺伝子によりコードされるものとは異なる）をコードすることができ；たとえば、それぞれ gD及びgHをコードする。そのような調製物の例は、ヘルペスウィルスアンプリコンが、（ａ）該アンプリコンがベクターとして使用される場合、真核細胞に供給されることが所望される遺伝子、及び（ｂ）チミジンキナーゼ遺伝子を担持し；そしてヘルパーウィルスがチミジン−キナーゼ−欠失の変異単純ヘルペスウィルスを含んで成るような調製物である。そのような調製物は、ヘルパーウィルスの増殖をチミジンキナーゼに対して依存性にするメトトレキセートの存在下でチミジン−キナーゼ−陰性ヘルパーウィルスを用いて宿主細胞上での培養において増殖され得る。メトトレキセートは、チミジンキナーゼが存在しない場合、ヘルペスウィルス複製に対して代謝性阻止を与える。この基準に基づく選択は、チミジン−キナーゼ−欠失性細胞系の使用を必要とする。アンプリコン及び複製−能力のヘルパーウィルスの両者により感染された細胞においては、アンプリコン核酸又はヘルパーウィルス核酸のいづれかを含むビリオンが一般的に生成される。ヘルパーウィルスにより感染された細胞は単独で、ヘルパーウィルスのみを生成し、そしてアンプリコンは生成しない。チミジンキナーゼがアンプリコンにより担持されるTK遺伝子の発現により供給される論議下での態様においては、TK−陰性ヘルパーウィルスは複製能力を有し、そしてアンプリコンによっても感染された宿主細胞においてのみ、増殖することができる。従って、アンプリコンにより感染されていない細胞において増殖し、そしてアンプリコンの増殖を助けないで増殖するヘルパーウィルスの割合は、この配置により減じられ、又は除外され得る。この配置の利点は、アンプリコン調製物が、アンプリコンがヘルパーウィルスの増殖に対して必須である条件下で、ヘルパー遺伝子が必須でないか、又はヘルパーウィルスがそのような欠損性でない条件下での培養に比較して改良されたアンプリコンの収率を伴って、適切な宿主細胞培養物において増殖され得ることである。従って、たとえば、ヘルパーウィルスはTK^-，gH^-ヘルペスウィルス、たとえば単純ヘルペスウィルスであり；アンプリコンはTK遺伝子、及びアンプリコンがベクターとして使用される場合、真核細胞に供給されるように意図された遺伝子を担持することができ；そして補完宿主細胞系はgH遺伝子を担持し、そして発現することができる。 TK⁺アンプリコン及びTK^-ヘルパーウィルスの代わりに、アンプリコンは、たとえばヘルパーウィルスの複製に必須である他の遺伝子を担持するよう製造され得、そしてヘルパーウィルスは、その遺伝子、たとえば他の必須ウィルス糖タンパク質遺伝子、たとえば糖タンパク質gB，gD又はgLのための遺伝子に関して欠損性になされる。アンプリコンは、上記で引用された WO 92／05263 明細書に記載のウィルスであるヘルパーウィルスに遺伝的無能性を付与するために欠失された単一の必須遺伝子を担持するように作れるべきでない（可能ではあるが）ことが、そのような場合にしばしば好ましい。従って、アンプリコンにより補完されるヘルパーウィルスにおける欠失は好ましくは、アンプリコン調製物の増殖のために使用されるべき補完細胞系により補完されるべきヘルパーウィルスの必須遺伝子に存在する欠失とは異なり、それに追加するものである。使用における高められた安全体のためには、ヘルパーヘルペスウィルスは、所望により、（例えば）ウィルス転写因子のための遺伝子、又は遺伝子IE３、又は WO 96／04395 明細書（Lynxvale Ltd：PG Speck）に言及される他の突然変異に関して欠損しているか又は不活性化されており、それにより、ヘルペスウィルスは、感染された細胞に対するヘルペスウィルス毒性を減じ、又は遅延せしめ、そして／又は処理された動物において広がるように、感染された細胞における生産的な溶解サイクルに入り又は感染された細胞の溶解を引き起こす減じられた能力を有する。あるいは、ヘルパーウィルスは、制限された複製能力と共に、たとえば tskに対応する感温性変異を包含することができる。アンプリコン又は欠損ヘルパーウィルスは、アンプリコン／ウィルス感染の毒性効果を阻害し、又は遅延せしめるために神経成長因子（たとえばNGF-β）のための遺伝子を担持し、そしてその遺伝子の発現を引き起こすことができる。それらの種々の基準は、所望により、組合して使用され得る。しかしながら、動物へのアンプリコン調製物の投与の後にヘルパーウィルスの広がりを妨げるためには、独力で複製能力を完全に阻止するとは思われない突然変異誘発又は欠失のみに頼らないことが、本発明に関して通常好ましいと現在思われており；たとえば、転写因子の欠失は正常な宿主細胞に存在する機能によりある程度、補完され得、そして従って、転写因子のための遺伝子はここで使用される意味において、完全には必須ではない。従って、好ましくは、いづれかのそのような突然変異誘発は、上記のように、ヘルパーウィルスの必須遺伝子における欠失が伴う。制限酵素により切断されたヘルパー DNAに基づいてのアンプリコン増殖もう１つの観点においては、本発明はまた、アンプリコンがベクターとして使用される場合、真核細胞に供給されることが所望される少なくとも１つの遺伝子を担持するウィルス−パッケージされたアンプリコンを含んで成る、遺伝子供給のためのベクターを増殖するための方法を提供し、そして前記方法は、宿主細胞においてアンプリコンの複製を支持することができるヘルパーウィルスの DNAを供給し；前記アンプリコンの増殖を可能にしながら、ヘルパーウィルスの複製を制限するために１又は複数の必須でない領域内のヘルパーウィルス DNAを切断する制限エンドヌクレアーゼにより前記ヘルパーウィルス DNAを処理し；エンドヌクレアーゼ処理されたヘルパーウィルス DNAと共に、アンプリコン（パッケージされていないか又はパッケージされている）のサンプルにより宿主細胞の培養物をトランスフェクトし又は感染せしめ；そしてウィルス−パッケージされた形でアンプリコンの増殖及び開放を引き起こすために、このようにして感染された宿主細胞を培養することを含んで成る。この技法はまた、ウィルス−パッケージされた複製生成物におけるヘルパーウィルスに対するアンプリコンの割合を高めることも助けることができる。複数のコピーヘルペスウィルスに基づくアンプリコン DNA分子が複製能力を有する(reprica tion-competent)ヘルペスウイルスと共に真核細胞に存在する場合、その複製能力を有するウィルスによりコードされる DNA複製機構は、ウィルス DNA複製に適用される機構に類似する機構によりアンプリコン分子を複製するよう機能することができる。次に、“ローリング−サークル” DNA複製過程は、切断され、そしてヘルペスウィルスビリオン中にパックされるためにおおよそ正しいサイズをそれぞれが有する単位にパッケージされる、アンプリコン DNAのタンデム反復コピーを含んで成る長い DNA分子に導びくことができる。次に、反復単位の正確な数は、出発プラスミドの長さ、及び選択されたヘルペスウィルスによりパッケージされる核酸の通常の長さにおおよそ依存する。たとえば、HSVは約 150kbの長さのゲノムを有し、そして約10kbの長さの単位のプラスミド／アンプリコンは、その複製起点、パッケージングシグナル及び関連する遺伝子と共に、基本アンプリコン単位の約15の鎖状に連結されたコピーを含んで成るパッケージされたアンプリコンを生じることが予測される。従って、ほとんどの組換えベクターは通常、外来性遺伝子の１つのコピーのみを含むが、個々のパッケージされた欠損ウィルス（アンプリコン）ゲノムは、多重性、たとえば担持された外来性遺伝子の少なくとも２又は３個、及び４，５， 10又は20個まで〜30個のコピーを含むことができる。これは、アンプリコンにより処理された細胞中に導入される遺伝子のコピー数の有用な上昇をもたらすことができ、そして所望する遺伝子生成物の発現の程度を高める。好都合には、パッケージされたアンプリコンはまた、標的宿主細胞に供給されるべきいくつかの、たとえば２，３，４個、又はそれ以上の外来性遺伝子を含むことができる比較的大きな外来性 DNAフラグメント（たとえば約10キロ塩基（kb ）又はそれ以上、たとえばたぶん15kb、又は20，30又は45kbまでの）を取ることができる。アンプリコンを構成する方法アンプリコンは、Vlazny and Frenkel，Pro Nat Acad Sci US 78（1981）742- 746；及びR R Spaete and N Frenkel，Cell 30（1982）295-304に開示される技法の適応により及び担持されることが所望される遺伝子に従って構成され得る。本発明に関しては、たとえば約５，10又は15kbのプラスミドサイズまでのいくつかの異なった外来性遺伝子を担持するアンプリコンが構成され得る。これは、たとえば、それ自体既知のコスミドクローニングシステムの使用により容易に達成され得る。次に、そのようにして構成されたプラスミド（それらの生成のいくつかの段階で、パッケージされていないアンプリコンの例を形成する）は、利用できる培養条件下で宿主細胞において複製能力を有するヘルパーウィルスと共にその宿主細胞中にトランスフェクトされ得、そして次に、発生するビリオンの調製物がパッケージされたアンプリコンを含む。複数種のアンプリコン調製物本発明は、単一の分子タイプのアンプリコンの調製及び使用に制限されない。本発明はまた、多くのたとえばウィルス抗原、一定の場合でさえ、与えられたウィルスの抗原のすべてをコードするアンプリコンの混合物を供給する（他方では、たとえば小さなウィルスの場合、単一のアンプリコンに多くのすべてのウィルス抗原を組込むことが所望される）。異なった遺伝子又は他の核酸を担持するアンプリコンは、別々に製造され、そしてそれらのアンプリコンの混合物は、ヘルパーウィルスと共にパッケージング細胞中に導入される。次に、そのようなパッケージング細胞培養物から現われるビリオンは、導入されるタイプに対応する異なったパッケージされたアンプリコンの混合物を含むことができる。そのような混合物は、たとえば病原体、たとえばウィルス又は細菌の個々の多くの異なった変異体の抗原性遺伝子を含むことができる。これは、高い変異性の病原体、たとえば RNAウィルス、たとえばインフルエンザウィルス又は HIV、又は SIV、又はＣ型肝炎ウィルスに関して特に有用である（たとえばＣ型肝炎ウィルスの場合、 AM Delisseなど，J Hepatol（1991）13（Suppl 4）：520-23 ; G Inchauspoなど ,（1991）Proc Nat Acad Sci US 88（22）: 10292-10296 ；及び QL Chooなど, （1991）Proc Nat Acad Sci US 88（6）:2451-5からである）。従って、たとえば臨床的単離物又は実験室用継代から得られたウィルスゲノムの異種集団は、単一のアンプリコン又は混合物に使用される組のアンプリコン中にポリメラーゼ連鎖反応により異なった分子種のライブラリーをクローニングするための出発材料を供給するために使用され得る。次に、このアンプリコンライブラリーが、ヘルパーウィルスと共にパッケージング細胞中に導入される。その細胞から現われるビリオンは、臨床的単離物又は他の異種源に対応する広範囲の異なった遺伝子型に由来する遺伝子を含み、そして有用に広範囲の抗原多様性の免疫原又はワクチンとして使用され得る。抗原をコードする遺伝子に対する本明細書における言及は、臨床的単離物又は天然に存在する抗原性タンパク質の抗原性フラグメントをコードする遺伝子、及び対応する一部の又は完全なアミノ酸配列を組込む融合タンパク質及びそのムテインの言及を包含する。免疫原、ワクチン、ワクチンアジュバントとしてのアンプリコン本発明の調製物は、免疫原、たとえばワクチン及びワクチンアジュバントとして使用され得る。抗原をコードするアンプリコン特に、本発明はアンプリコン調製物を提供し、このアンプリコン調製物においては、該アンプリコンにより担持される遺伝子は、免疫応答が哺乳類、たとえばヒト又は非ヒト動物により高められることが所望される抗原をコードする遺伝子を包含する。そのような抗原をコードする遺伝子は、たとえば病原体、たとえばアンプリコン系の基礎であるタイプと同じか又は異なったタイプのウィルス、たとえばヘルペスウィルス、他のタイプのウィルス、たとえばインフルエンザ又は免疫不全ウィルス、たとえばHIV，SIV又は FIV、いづれか広範囲の既知の細菌病原体、真核寄生体、たとえばクラミジア、又はいづれか他の感染性物質からのタンパク質（又は、その抗原性フラグメント又は抗原的に関連する融合タンパク質）に対応することができる。たとえば、単純ヘルペスウィルスに基づくアンプリコンは、抗原、たとえば H SVウィルス糖タンパク質、たとえば HSVに対する免疫性の主要抗原性標的物であると思われるgD及び／又はgBタンパク質のためのヘルペスウィルス遺伝子を担持することができる。そのようなアンプリコンは、他のヒト又は家畜ヘルペスウィルスの抗原タンパク質のための遺伝子、たとえば CMVのgHもしくは他のエンベロープ糖タンパク質遺伝子、又は CMV即時初期遺伝子、あるいはエプスタイン−バールウィルスの g p350遺伝子又は仮性狂犬病ウィルス(pseudorabies virus)(PRV)糖タンパク質のg p50遺伝子を担持することができる。また、処理される生物への供給のためのアンプリコンにより担持される免疫原性遺伝子が乳頭腫ウィルスタンパク質、たとえばＬ１又はＬ２； HIVタンパク質 gag，pol，envもしくは nef、又は他の免疫不全ウィルス、たとえば SIV又は F IVにおけるそれらの類似体； SIV gp120遺伝子； FIV mgENV遺伝子；インフルエンザHA及びNP遺伝子；クラミジア抗原、たとえばクラミジア主要外膜タンパク質 MOMP及びクラミジア熱ショックタンパク質を特にコードする。これらに加えて又はこれらに代って、そのような抗原コード遺伝子は、たとえば腫瘍関連抗原（又はその抗原性フラグメント、又は抗原的に関連する融合タンパク質）、たとえばいづれか既知の自己コード抗原、たとえばT Boon，Adv Cancer Res 1992（58）pp177-210において同定されるMAGE-1及びMAGEシリーズの他の抗原、及び P van der Bruggenなど，Sc ience 1991（254）pp1643-1647において同定されるような MZ2-E及び他の抗原；黒色腫タンパク質、たとえばヒトチロシナーゼ；ムチン、たとえばP O Livingst on，Current Opinion in Immunology 1992 4（5）pp624-629において同定されるもの；たとえばJ Burchellなど，Int J Cancer 1989（44）pp691-696において同定されるようなMUCI；又は腫瘍関連ウィルス、たとえばヒト乳頭腫ウィルスによりコードされることが知られているそれらの腫瘍関連抗原のいづれか（たとえば HPV、たとえば HPVタイプ６，11，16又は18のＥ６又はＥ７タンパク質）；又はエプスタイン−バールウィルス由来のタンパク質、たとえば P van der Bruggen など，Current Opinion in Immunology 1992，4 (5)，pp608-612の文献における参照24及び25に同定されるもの；並びに、その文献において論ぜられる他の腫瘍関連抗原に対応することができる。すべてのそれらの担持される遺伝子は、部分的又は完全なタンパク質配列、抗原フラグメント、又は他の起原の配列を含んで成る融合タンパク質をコードする配列として表わされ得る。これに関して、アンプリコンはたとえば、引用により本明細書に組込まれる W O 92／16636 明細書（Cantab Pharmaceuticals : Boursnellなど）に開示される HPV E7遺伝子における突然変異として、ワクチン使用のためにそれらの適合性及び安全性を高める突然変異を含むことができる、ヒト乳頭腫ウィルスの１又は複数のタンパク質、たとえばＬ１，Ｌ２，Ｅ６又はＥ７タンパク質をコードする１又は複数の遺伝子を担持することができる。免疫モジュレーターをコードするアンプリコン本発明の調製物において、アンプリコンはたとえば、サイトカイン、たとえばインターロイキン１〜15、特にたとえばIL２，IL12、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、GMCSF、及び／又は他の遺伝子、たとえば WO 88／009 71（CSIRO，Australian National University : Ramshawなど）及び WO 94／167 16（Virogenetics Corp：Paolettiなど）明細書に言及されるもののための免疫調節機能を有する種々の遺伝子のいづれかを担持することができる。また次の遺伝子は、本発明に関して、アンプリコンにより担持され得る：インターフェロンα，β又はγ；腫瘍壊死因子；顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、ケモカイン、たとえば好中球活性化タンパク質 NAP、マクロファージケモアトラクタント及び活性化因子MCAF，RANT ES、マクロファージ炎症ペプチドMIP-1a及びMIP-1b、補体成分及びそれらの受容体、アクセサリー分子、たとえば B7.1，B7.2，ICAM-1，2もしくは3、又はサイトカイン受容体のための遺伝子。１よりも多くの免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列が挿入される場合、それらは１つよりも多くのサイトカインを含んで成り、又はサイトカイン及びアクセサリー分子の組合せを表わすことができる。より一般的には、有用な免疫調節タンパク質の例は、サイトカイン、ケモカイン、補体成分、免疫系アクセサリー及び付着分子及びヒト又は非ヒト動物特異性のそれらの受容体を包含する。有用な例は、GM-CSF，IL-2，IL-12，OX40，OX40L （gp34）、リンホタクチン、CD40及び CD40Lを包含する。さらなる有用な例は、インターロイキン、たとえばインターロイキン１〜15、インターフェロンα，β 又はγ、腫瘍壊死因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、ケモカイン、たとえば好中球活性化タンパク質(NAP)、マクロファージ化学誘引物質及び活性化因子（MCAF ）、RANTES、マクロファージ炎症ペプチドMIP-1a及びMIP-1b、補体成分及びそれらの受容体、又はアクセサリー分子、たとえば B7.1, B7.2，ICAM-1，2又は3、及びサイトカイン受容体を包含する。OX40及びOX40−リガンド（gp34）は、免疫調節タンパク質のさらなる有用な例である。免疫調節タンパク質は、ヒト又は非ヒト動物の特異性のものであり、そして場合により、そして便利なように、細胞外ドメイン及び天然に存在するタンパク質の結合活性を有する他のフラグメント、及びそれらのムテイン、並びに他のポリペプチド配列、たとえば免疫グロブリンＨ鎖不変ドメインを有するそれらの融合タンパク質により本発明の目的のために表わされ得る。１つよりも多くの免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列が挿入される場合、それらは、たとえば１つよりも多くのサイトカイン又はサイトカイン及びアクセサリー／付着分子の組合せを含んで成る。免疫調節タンパク質をコードする遺伝子材料は、もう１つの相同性及び場合によってはもう１つの官能性を有するポリペプチド領域に連結される、免疫調節タンパク質に対する相同性及びその官能性を有するポリペプチド領域を含んで成る、ハイブリッド又は融合タンパク質をコードする発現可能なリーディンクフレームとしてベクターに担持され得る。たとえば、免疫調節タンパク質は、ヒトOx-4 0（W Godfreyなど，J Exp Med 180（2）1994，pp757-762 及びそこに引用される文献、たとえば S Miuraなど，Mol Cell Biol 11（3）1991，pp1313-1325を参照のこと）に対する結合パートナーとして同定されるgp34タンパク質を含んで成ることができ、あるいはそれに官能的に対応することができる。変異ウィルスゲノムにコードされ得るこのタンパク質官能性のバージョンは、天然のgp34配列自体又はそのフラグメントに対応し、あるいはたとえば、免疫グロブリン不変ドメインのＣ−末端にそのＮ−末端で融合したgp34（タイプ２膜タンパク質）の細胞外ドメインと共に、もう１つのタンパク質、たとえば免疫グロブリンＨ鎖、たとえばヒトIgG1の不変領域に融合したgp34の（Ｃ−末端）細胞外（結合）ドメインに基づくハイブリッド発現生成物に対応することができる。他の免疫調節タンパク質もまた、そのような誘導体及びハイブリッド形で担持され、そして発現され得る。そのような免疫調節タンパク質のアミノ酸配列の突然変異が組込まれ得ることもまた理解される。その対応する親の配列を有するタンパク質と、配列、機能及び抗原特徴において相同のままである、変異誘発された配列を有するタンパク質も本発明に包含される。そのような突然変異は好ましくは、保存的アミノ酸変化、たとえば広く類似する分子特性のアミノ酸間の変化を包含する突然変異であり得る。たとえば、脂肪族群アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン内の相互交換は、保存的であるものとして考慮され得る。時々、それらの１つとグリシンとの置換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。脂肪族群アスパラギン酸及びグルタミン酸内の相互交換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。アミド群アスパラギン及びグルタミン内の相互交換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。ヒドロキシ群セリン及びトレオニン内の相互交換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。芳香族群フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン内の相互交換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。塩基性群リジン、アルギニン及びヒスチジン内の相互交換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。硫黄含有群メチオニン及びシステイン内の相互交換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。時々、メチオニン及びロイシン群内の置換もまた、保存的であるものとして考慮され得る。好ましい保存的置換群は、アスパラギン酸−グルタミン酸；アスパラギン−グルタミン；バリン−ロイシン−イソロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン；及びリジン−アルギニンである。他の観点においては、変異誘発された配列は、挿入及び／又は欠失を含んで成る。そのような調製物は、ワクチン又はワクチンアジュバントとして使用され得る。いくつかの態様においては、有益性が、根礎状態（underlying rondition）又は感受性の部分的保護又は改善に寄与する免疫応答、たとえば治療又は予防によりそれを他の処置をより受けやすくする応答により達成され得る。特に、たとえば、本明細書に言及される免疫調節タンパク質、たとえばサイトカイン、IL２，IL４，IL12、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、又は GMCSF のための遺伝子を担持するアンプリコンの場合、そのような調製物は、生存腫瘍細胞に感染し、そしてそれらの免疫原性を増強するためにインビトロ又はエクシビボで使用され得る。そのような処理された細胞は、たとえばその対応する腫瘍を担持する動物において、免疫原材料として使用され得る（たとえば、致死照射の後）。これは、たとえば D Dranoffなど，Proc Nat Acad Sci US 90(8)(1993) 3539-3543 に言及される技法、又はP Golumbekなど，Immunol Res 12(2)(1993)1 83-192又はP Golumbekなど，Science 254(5032)(1991)pp713-716に言及される技法の適応により達成され得る。本発明の態様のアンプリコン調製物、たとえば腫瘍抗原又は免疫調節分子をコードするそれらの調製物は、アンプリコン調製物及び／又はそれにより感染された細胞により、患者に全身的に直接投与し、又は腫瘍中に直接注射し、又は他方では、処理されるべき患者からの免疫系細胞の感作及び／又は刺激を包含するエクシビボ方法のいづれかにより癌免疫療法において使用され得る。宿主免疫応答の調節のための遺伝子を担持する、複製能力を有する組換えウィルスの使用に関連する可能性ある危険性の観点から、そのような調節遺伝子は、上記のように、感染性の新たなウィルス粒子の生成のために必須である遺伝子を欠いている複製欠損ウィルスと共に使用されるアンプリコンにより担持され、その結果、組換えがアンプリコンとヘルパーウィルスとの間で生じる場合でさえ、その得られるウィルスは処理された宿主動物から処理されていない宿主動物への広がりを妨げられるであろうことが、本発明に関して、強く好まれる。広範囲のウィルスタイプに基づくアンプリコンアンプリコンは、種々のウィルスタイプに基づいて製造され得る。それらはたとえば、下記に記載されるように、及び／又はR R Spaete and N Frenkel，Cell 30（1982）295-304により記載されるように、単純ヘルペスウィルスに基づいて製造され得る。アンプリコンはまた、たとえば、Campなど，J Virol 65(11)(199 1)6320-6324 ；アメリカ特許第 4,995,152号（Carterなど）；又はそこに言及されるようなアンプリコンの他の文献に記載され又は引用されるように、MDV又は他のウィルスの特性を有する複製起点をコードする DNAを用いて、他のヘルペスウィルス、たとえば Marek病ウィルス(MDV)に基づいても製造され得る。アンプリコンとしての使用のためのプラスミドは、たとえばそれ自体既知のコスミドクローニング系に基づいて構成され得、アンプリコンにより担持されるべき遺伝子材料のサイズが５〜10kb又はそれ以上のものである場合、特に好都合である。アンプリコン中への所望の遺伝子の挿入は、PCR又は他のそれ自体既知の技法を用いて、種々の野生型源の生物のいづれかから調製された DNAから得られ、そしてクローン化された遺伝子に基づいて、それ自体既知のrDNA技法に基づいて実施され得る。アンプリコン含有調製物の製造及び使用本発明の調製物は、既知のキャリヤー、賦形剤、保存剤及びアジュバント、特に通常の良好な医薬製造実施下で好き勝手に、生存ウィルスワクチンに関しての使用のために知られており、そして使用され又は提供されるものにより製造され、そして配合され、その結果、それらは、ヒト及び非ヒト動物対象への非経口投与のために、又はそのような対象中に導入され、又は再導入されるであろう生存細胞の処置のために、本発明のある態様に関して、適切になる。それらは、ワクチン及びウィルスベクターの投与のために知られている経路のいづれか、たとえば粘膜表面、たとえば経口、鼻腔又は膣粘膜への皮下供給、又は腫瘍中への直接的な注射により完全な動物生物中に導入され得る。用量は、たとえば 10²〜10⁸pfu、たとえば 10⁴〜10⁸pfuの範囲であり得る。それらは、活性疾病及び／又は病巣の存在の期間、又は緩解又は潜伏期間、現在、疾病を有さない動物、又は疾病を有する（又は有していた）動物に投与され得る。本発明の調製物はまた、細胞を感染せしめ、そしてそのような細胞中に導入されることが所望される DNAを担持する誘導体細胞調製物(derivative cell prepa ration)を製造するために、たとえばそのような処理された細胞又は誘導体細胞の動物宿主中への後での導入のために、又はインビトロ診断目的のために動物細胞中にエクシビボ又はインビトロで導入され得る。本発明の例のアンプリコン調製物は、それらにより処理される対象に免疫応答を生成することへの直接的又は間接的な予防又は治療使用のための免疫原として使用され得る。その免疫応答は、アンプリコンによりコードされる異種抗原に対して存在する。アンプリコンはまた、腫瘍治療への治療的又は予防的使用のために免疫原、たとえばワクチンの調製物にも使用され得る。たとえば、その調製物の例は、（たとえば、ウィルス特異的）細胞毒性Ｔ細胞のインビトロ感作、刺激又は拡張に使用され得る。従って、アンプリコン又はアンプリコンにより処理された細胞（たとえば上記技法により処理された腫瘍細胞）は、患者に由来する細胞毒性リンパ球を刺激し、そして／又は感作するためにエクシ−ビボ（イン−ビトロ）で使用され得；次に、そのような感作された CTLは、細胞関連又はアンプリコン関連の抗原に対してのある程度の免疫応答を付与するために、処理されるべき患者又は他の対象中に再注入され得る。本発明のアンプリコンベクター調製物の例は、たとえば癌免疫療法の目的のために、処理されたヒト又は非ヒト動物対象に免疫刺激を付与する工程に使用され得る。ベクターの使用は、固体腫瘍の部位中への投与により直接的であるか又はそれは間接的であり得る。たとえば、ベクターの使用は：（ｉ）ベクターによる感染の後、処理されるべき対象に免疫刺激を付与することができる細胞の調製物とベクター調製物とをエクシ−ビボで接触せしめ；そして（ii）たとえば、（ａ）たとえば投与の前、不活性化した後、たとえば照射した後、ワクチンとしての感染された細胞の直接的な投与により、又は（ｂ）免疫受容能力細胞、たとえば処理されるべき対象の免疫系の細胞をエクシ−ビボで感作し、又は刺激するためへのその細胞の直接的な使用、続いて、ウィルス又はウィルス感染された細胞の同時投与を伴わないで、前記免疫受容能力細胞の再投与により、処理されるべき対象に免疫刺激を供給するためへの前記感染された細胞を使用することを含んで成る。これに関しての所望されない細胞は、たとえば、陰性消耗を含んで成る精製方法により、たとえば所望しないタイプの細胞の対応する抗体又は他の結合剤による選択的な除去により除去され得る。ベクターによりエクシ−ビボで感染された細胞は、自系細胞又は異種細胞、たとえば処理される予定である条件に類似する条件により１又は複数の対象から得られた異種細胞のいづれかであり得る。細胞は、単一の細胞系又は細胞系の混合物のものであり得、たとえばそれらは臨床学的な腫瘍サンプルから確立された１又は複数の細胞系の細胞を含んで成る。従って、たとえば免疫刺激が黒色腫細胞に対して向けられる予定である場合、異種細胞は、処理されるべき対象以外の黒色腫を有する１又は複数の対象（又は処理されるべき対象も包含する）からの黒色腫細胞であり得る。対応する組合せは、免疫刺激の他の特異性のためになされ得る。免疫刺激を付与するための投与のための感染された細胞はたぶん、たとえば投与の前、照射により不活性化され得る。それらはたぶん、ウィルスベクターにより担持される異種遺伝子の発現を可能にするために、不活性化の前、十分な時間インキュベートされ得る。感染された細胞は、免疫受容能力細胞、たとえば処理されるべき対象の免疫系細胞をエクシ−ビボで感作し、又は刺激するためへのその細胞の使用、続いて、それらにより感染されたアンプリコン又は細胞の同時投与を伴わないで、前記免疫受容能力細胞の再投与により、処理されるべき対象に免疫刺激を供給するために使用され得る。アンプリコン調製物によりエクシ−ビボで感染された細胞は、自己系細胞、又は腫瘍細胞系、たとえば黒色腫細胞系の細胞を含んで成る異種細胞であり得る。本発明の例によれば、ベクター感染された、場合によっては不活性化された細胞の適量に分けられた又は検定された調製物が、それが含む感染された細胞の数又は濃度の参照により、又はそれが発現する異種遺伝子生成物の量の参照により用量検定され、そしてそれが免疫刺激される処理されるべき対象への投与のために供給される。他方では、遺伝的に無能にされたウィルスベクターは、接触し、そしてそれにより、インビボで、腫瘍細胞、たとえば固体腫瘍、たとえば黒色腫の細胞を感染せしめる一定量又は濃度のウィルスベクターのインビボ投与に使用され得る。この手段で有用に処理され得る細胞の中には、ヒト及び非ヒト動物の悪性細胞、特にたとえば血液細胞、たとえば白血病細胞、たとえばCD34⁺細胞(造血細胞)( たとえば、R Jurecicなど，ch2，pp7-30，“Somatic Gene Therapy”CRC Press 1995，ed．P.L.Chang に言及されるような細胞型を参照のこと)が存在する。サイトカインを用いての腫瘍の免疫学的処理は、H Taharaなど，ch.15，pp263 -285,“Somatic Gene Therapy”CRC Press 1995，ed. P.L.Changに総説されている。本明細書に記載されるベクターは、サイトカインの免疫学的用途に適用され得、そして前記引用物に再検討される処理方法は、当業者に容易に明らかになるであろうような適切な適合及び変性を用いて、H Taharaなどにより総説されている。本発明はまた、インビトロ処理、たとえばＴ細胞、たとえばウィルス特異的細胞毒性Ｔ細胞の拡張にさらにインビトロで適用される。多くの免疫抑制又は細胞毒性処理の２つの複雑化要因は、潜在的ウィルスの再活性化の結果としてのウィルス感染及びウィルス−形質転換された細胞の拡張に続く、全身性のウィルス血症である。これは、そのような感染を制御するための正常な機構が、その処理の結果として損傷を受けた事実によるものである。この問題に対する１つの可能な解決策は、ウィルス感染された細胞を制御できる適切な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで生成することである。これは、患者の処理の前、末梢血液単核細胞、又はリンパ球、又はＴ細胞を単離し、そしてそのような細胞を、生存ウィルスの調製物によりインビトロで刺激することによって行なわれ得る。細胞毒性Ｔ細胞が、抗原を示す細胞内で合成される外来性タンパク質に由来するペプチドに対して一般的に向けられる場合、生存ウィルスを用いることが必要であり；不活性化されたウィルス又は個々のタンパク質は生じる細胞毒性Ｔ細胞の応答でひじょうに不良である。次に、活性化された細胞が、抗原及び成長因子、たとえばインターロイキン−２によるさらなる再刺激を伴って数週間にわたって培養において拡張される。しかしながら、CTLが患者中に再注入される場合、細胞培養物への残留する生存ウィルスの存在に関する関心が存在する。CTL活性を誘発することができるが、しかし患者内で広がることができない無能にされたウィルスの使用は、インビトロに拡張された細胞と共に偶然に与えられる場合、複製受容能力のウィルスを用いるシステムに対して利点を提供することができる。従って、本発明はさらに、ウィルス特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成するための方法を提供し、ここで前記方法は：（ａ）患者から血液単核細胞、リンパ球又はＴ細胞のサンプルを単離し；（ｂ）前記サンプルを、本発明の例に従っての、及び場合によっては、免疫調節タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含むことができるアンプリコン調製物の存在下でインビトロで培養し；そして（ｃ）前記患者にその培養された細胞を再注入することを含んで成る。本発明により供給される一定のベクターは、遺伝子療法、たとえば修正遺伝子療法(corrective gene therapy)に適用され得る。そのような適用において、ベクターは、修正遺伝子療法により供給されるべき遺伝子、たとえば ADAをコードする遺伝子、又は上記で言及されたような目的のために投与されるべき遺伝子をコードすることができる。免疫調節タンパク質 TGFβをコードする、本明細書に記載されるようなベクターは、これにより供給されるベクターにより直接的に、又は自系又は異種の生存細胞により、ベクターによるそれらの感染の後、通常処理されるであろう、その処理された対象の応答をダウンレギュレートするために、修正遺伝子療法のためのベクターとして特に適切である。負の免疫調節効果は、免疫調節タンパク質の適切な選択により提供され得る。この用途のための免疫調節タンパク質のさらなる選択はたとえば、次の通りである：Th１効果の阻害がTh２サイトカインをコードするベクターにより達成されるか、又はその逆の場合、；たとえばTh１効果に対するIL10をコードするベクター；及びTh２効果に対するIFN-γをコードするベクター。免疫応答はさらに、たとえばウィルス又は他の病原起原の免疫ダウンレギュレーション遺伝子をコードするベクター、たとえばヘルペス ICP47遺伝子（HSV1又はHSV2からの）をコードし、又はさらに、もう１つの既知の免疫ダウンレギュレーション遺伝子、たとえばアデノウィルスのE3-gp19K(G Fejerなど，J Virol 68（1994）5871-81 を参照のこと)をコードするベクターを用いることによってダウンレギュレーションされ得る。遺伝子療法の文献、たとえばアメリカ特許第 5,399,346号(WF An dersonなど)の方法は、これにより供給されるベクターの使用により適合され得る。本発明は、SIV gag-pol，Nef又はHPV E6／E7（又はGM-CSF及び／又はB7.1）のための遺伝子を担持するように製造され（前記技法のいづれかの必要な通常の適応により）、そしてgH−欠損単純ヘルペスウィルス及びHSV gHを発現する補体組換え細胞系の助けにより増殖することができる、HSVに基づくアンプリコンの生成に関する指図を付与する次の例示的調製物によりさらに示される。例示的調製物の詳細な記載下記の記載は、単純ヘルペスウィルス(HSV)に基づき、そして免疫調節タンパク質、たとえばネズミGM-CSF、ネズミB7.1、及び病原体、たとえばヒト乳頭腫ウィルス(HPV)又はシミアン免疫不全ウィルス(SIV)に起因する一定の抗原をコードする遺伝子の機能的コピーを含むアンプリコンの構成のための指針を提供する。次に、それらのアンプリコンは、インビトロ又はインビボで宿主細胞へのそれらの外来性遺伝子の供給のために、遺伝的に無能にされたヘルパーウィルス系と共に使用され得る。しかしながら、その方法は、容易に適用され得、そして同じアンプリコン／ヘルパーウィルス系、又はたとえば他のヘルペスウィルスからのいづれか他の同等のアンプリコン／ヘルパーウィルス系を用いて、いづれかの遺伝子又は遺伝子の組合せを供給するよう適合され得る。使用される個々の分子生物学的技法は、それ自体既知であり、そて“Molecula r Cloning，A Laboratory Manual”eds．Sambrook，Fritsch and Maniatis，Col d Spring Harbor Laboratory Press，1989又は他の版に実質的に詳しく記載されている。次の記載において、表現“欠損ウィルス”は、ウィルス的にパッケージされたアンプリコンを示すために、しばしば使用される。HSV-1 に基づく基本的アンプリコンプラスミドの構成最初に、基本的アンプリコンを作製する。pW７と称するこの基本的アンプリコンを用いて、異る外来性遺伝子を含む、下記に言及されるアンプリコンのすべての他の例を作製する。次のセクションは、それらの作製の詳細な方法を記載する。アンプリコンpW７アンプリコンpW７を、プラスミドベクターpAT153（Stowなど，Nucleic Acid R es 11（1983）8205-8220；Cancer Cells 4／DNA Tumor Viruses（1986）497-507 ）を用いて作製する。初めに、機能的 HSV-1 DNA複製起点(ORI)を定義する 535b pの Sau3Aフラグメントを、pAT153のBamHＩ部位中に挿入する。次に、完全に配列決定されており、そして HSV-1ゲノムの単一の“ａ”配列にパッケージングシグナルを含む、HSV-1のHinfＩ連結フラグメントを、HindIII／EcoRＩ部位中に挿入する。pW７を複製し、そしてそれらの２つの決定的 HSV-1成分の挿入に基いて、ヘルパー HSVウィルスの存在下で適切な哺乳類細胞にパッケージすることができる。pW7lacZ pW7lacZは、基本的アンプリコンpW７の修飾されたバージョンである。これは、HSV IE110プロモーターにより駆動される細菌lacZ遺伝子から成り、そしてSV4 0 polyAシグナルを端に有する遺伝子カセットを、pW７のユニークEcoRＶ部位中に挿入することによって構成する。lacZ遺伝子発現からの青色 X-gal染色は、インビトロでの欠損ヘルパーウィルスの割合、及びインビボでの細胞中への遺伝子供給の効能を検出するために有用である。pW71K+ pW71K+は、基本的アンプリコンpW７のもう１つの修飾されたバージョンである。これは、pW７のユニークEcoRＶ部位中にHSV TK遺伝子のコピーを挿入することによって構成する。TK−陰性変異 HSVがヘルパーウィルスとして使用される場合、メトトレキセートが、上記のようにして、欠損ウィルスのために好ましい増殖培地に使用することができる。HSV アンプリコン中への異種遺伝子のクローニング外来性遺伝子発現のためのアンプリコンベクターを次の通りに構成する。初めに、有用な組のクローニング部位に隣接する強い真核プロモーターを含むプラスミドを構成する。pMX1.1と称するこのプラスミドを次の通りに構成する：pIMX1.1 このプラスミドの構成は、HSV-1株 KOS(m)DNAから製造されるプラスミド pIMM B63を用いる。pIMMB63は、中央のユニーク HpaＩ部位と共に、HSV-1 gH遺伝子を挟む配列を含む。従って、この部位中にクローン化されたいづれかの遺伝子を、 gH遺伝子座において HSV-1ゲノム中に、組換えにより挿入することができる。（ウィルスがTK遺伝子の３′端を欠いているTK−陰性ウィルスである場合、プラスミドはTK遺伝子の３′端を置換し、そしてTK活性を回復し、TK+ウィルスのための選択を可能にする。）プラスミド pIMMB63を次の通りにして製造する。２つの PCRフラグメントを、 HSV-1 KOS(m)DNAに基づいて、それぞれオリゴヌクレオチド MB96-MB63及び MB61 -MB58の対により製造する。使用されるオリゴヌクレオチドは次の通りである：得られる PCRフラグメントを、オリゴヌクレオチドに含まれる制限部位に特有の制限酵素により消化する。MB98-MB63フラグメントを、HindIII及び HpaＩにより消化する。MB61-MB58フラグメントを、HpaＩ及びEcoRＩにより消化する。次に、それらのフラグメントを、HindIII及びEcoRＩによりすでに消化されたベクターpUC119(J Vieira and J Messing，Methods in Enzymology 153（1987）3-11) 中に連結する。その得られるプラスミドは、pIMMB63である。次に、プラスミド pRC／CMV(Invitrogen Corporation)を、NruＩ及び PvuIIにより消化し、そしてCMV IEプロモーター及び polyAシグナルを含む1066bpのフラグメントをブラント末端化し、そしてプラスミド pIMMB63のユニーク HpaＩ部位中に挿入する。得られるプラスミドを pIMX1.1と命名し、そしてそれは、異種 DNAの挿入のために有用である制限酵素BsaBＩによる消化のためのユニーク部位を CMVプロモーターに隣接して含む。アンプリコンから２種の異なった遺伝子の同時発現を可能にするための第２の有用なプラスミドを、Rous Sarcomaウィルス(RSV)の長い末端反復配列(LTR)に由来する第２プロモーターを導入することによって構成する。この第２のプロモーターはpMX1.1中の CMVプロモーターに隣接するが、しかし第２のプロモーターからの遺伝子の発現が CMVプロモーターの方向から反対の方向に駆動されるように配向される。このプラスミドをpMX6.0と命名し、そして次の通りに構成する：pIMX6.0 プラスミドpREP.4（Invitrogen Corporationからの）を、SalＩにより消化し、そして RSV LTR及びSV40 polyAシグナルカセットを含む 1012 1084bp DNAフラグメントを単離し、そして制限酵素消化により生じた３′端一本鎖 DNAオーバーハングを除去するために処理し、それをブラント末端化する。その得られるプラスミド pIMX6.0は、RSV LTRプロモーターとSV40ポリアデニル化シグナル（poly- A）との間に、挿入される、例えば異種遺伝子のクローニング及び発現のために使用され得るユニーク SfiＩ制限部位を含む。免疫調節遺伝子GM-CSF及びB7.1の発現のためのアンプリコンベクターを、次の通りにして構成することができる：pIMX4.0 プラスミド pIMX4.0は、CMV IEプロモーターの制御に配置されたネズミGM-CSF をコードする遺伝子のコピーを含む組換えベクターである。このプラスミドは、制限酵素 SmaＩ及び DraＩによりプラスミドpGM3.2FF(Goughなど，EMBO J 4（19 85）645-653)から切断されたネズミGM-CSF遺伝子のコピーを pIMX1.1のユニーク BsaBＩ部位中に挿入することによって構成される。pIMX7.0 このプラスミドは、pIMX6.0に基づいて構成されるもう１つの組換えベクターであり、そしてそれは、CMV IEプロモーターにより駆動されるネズミGM-CSFを含む。このプラスミドは、SmaＩ及び DraＩによりプラスミドpGM3.2FF(Goughなど，EMBO Journal 4（1985）645-653)から切断されたネズミGM-CSF遺伝子を含む同じ単離された DNAフラグメントのさらなるサンプルを、pIMX6.0のユニークBsaB Ｉ部位中に挿入することによって構成される。pIMX8.0 このプラスミドは pIMX7.0に基づいて構成されており、そしてそれぞれCMV IE プロモーター及び RSV LTRの制御下で配置されるネズミGM-CSF及びB7.1遺伝子を含む。構成は、制限酵素HindIII及び XbaＩによりプラスミドpiLN-murB7から切断されたネズミB7.1をコードする遺伝子のコピーを、pIMX7.0のユニーク SfiＩ部位中に挿入することによって達成される。最終的に、それぞれ CMV及び RSV LTRプロモーターの制御下でのGM-CSF及びB7 .1遺伝子を含んで成る DNAのフラグメントを、基本的プラスミドpW７中に挿入し、アンプリコン発現ベクター pAMP1.0を創造する。pAMP1.0 ネズミGM・CSF 及びB7.1遺伝子の両者を含むこのアンプリコンは、制限酵素 S maＩにより pIMX8.0から切断されたそれらの２種の遺伝子を含む DNAフラグメントを単離し、そしてそれをpW７のユニークEcoRＶ部位中にクローニングすることによって構成される。SIV からの抗原性配列の発現のためのアンプリコンベクターの構成 pAMP1.0の構成から適合された類似する方法を用いることによって、SIV gag-p olおよび Nef遺伝子を含むアンプリコンもまた構成することができる。SIVmac 2 51（32Ｈ単離物、クローンpJ５）からの gag-pol領域（ヌクレオチド 1048-5760 ）をプラスミドMV11のEcoRＩ部位中にクローニングすることによってまず構成されたプラスミドMV12をEcoRＩにより消化し、そして gag-polを含む4712bpのフラグメントを pIMX6.0のユニークBsaBＩ部位中にクローン化する。次に、SIV Nef 遺伝子を、同じプラスミドのユニークSfi1部位中に挿入する。その結果、その得られるプラスミドは、CMV IEプロモーターにより駆動される SIV gag-pol遺伝子及び RSV LTRにより駆動される Nef遺伝子を含むであろう。次に、それらの２種の遺伝子を含むカセットを、SmaＩにより切断し、そしてpW７又はpW7TK+のいづれか中にクローン化する。“SIV遺伝子ライブラリー”の発現のためのアンプリコンベクターの構成 CMVプロモーターを含むアンプリコンを、pRC／CMV(上記を参照のこと)からの BGH polyAカセット及びCMV IEプロモーターを、pW７又はpW7TK+の単一のHindIII 部位中にクローニングすることによって構成する（これは、ブラント末端連結により行われ、従って、ユニークHindIII部位を破壊する。）。SIV遺伝子、たとえば gag-pol及び Nefを、種々の患者の血液サンプルのプールからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、増幅された SIV遺伝子フラグメントの一端で NotＩ部位及び他端で XbaＩ部位を有するプライマーを用いて増幅する。従って、CMVプロモーターを含むアンプリコンを、NotＩ及び XbaＩの両者により消化し、そしてゲル精製する（それらの制限酵素の両者は、CMVプロモーターとアンプリコンの末端シグナルとの間の複数のクローニング部位でのユニーク位置での切断を行なう）。それらの２種の酵素により生成される末端は適合可能ではなく、従って自己再連結を妨げる。次に、その PCR生成物を、配向された付着端連結を通してアンプリコン中にクローン化する。欠損ウィルスのストックを、それらのアンプリコンから製造し、そしてこのストックは多くの SIV変異体からの gag-pol及び N ef遺伝子配列を含むべきである。この技法は、HIV、及び多くの変異体における SIVからの遺伝子を含むアンプリコンの構成に容易に適合され得る。抗原性変動をもたらす時々の遺伝子変異は、宿主の免疫監視の HIVによる回避を引き起こすと思われて来た。これは、HIV ワクチン開発のための主要な障害であると思われて来た。広範囲の SIV又は HIV変異遺伝子を担持する欠損 HSVウィルスアンプリコンのストックを製造するこの技法は、そのような抗原及びそれらの変異体に対する有用な免疫原性又はワクチン応答を生成するための材料を供給する。HPV 遺伝子を含むアンプリコンの構成上記ですでに言及された方法から適合された類似する手段を用いることによって、HPV E6／E7遺伝子を含むアンプリコンもまた、構成することができる。たとえば、HPVからの遺伝子は、その源からであり、そして WO 92／16636 明細書（C antab Pharmaceuticals: Boursnellなど）に記載される突然変異を包含することができる。欠損ウィルス（パッケージされたアンプリコン）ストックの調製のためのヘルパーウィルスとしてのタイプＩ HSV gH 欠失変異体の構成ワクチン開発目的のための欠損ウィルスの調製のための安全なヘルパーウィルスを得るために、タイプＩ gH 欠失変異体を生成する。HSVのgH欠失変異体は、ウィルスgHを発現する補完細胞系においてのみ増殖することができる遺伝的に無能にされたウィルスである(WO 92／05263 明細書（Immunology Ltd；Inglisなど）を参照のこと)。HSV gH遺伝子は、ウィルス感染のために必要とされる必須糖タンパク質Ｈ(gH)をコードする（また、Forresterなど，J Virol66，341-348，1 992 を参照のこと）。gHタンパク質発現の不在下で、そのgH−陰性 HSVはまた、欠損ウィルス調製のためのヘルパーウィルスとしての必要条件を満たすウィルスタンパク質のほとんど完全なレパートリーを供給することができる。しかしながら、gH−陰性 HSVがウィルスgHに関して補完ではない宿主細胞を感染する場合、ウィルス株子孫粒子は他の宿主細胞を感染することができず、そして従って、宿主内での感染性ウィルス粒子の広がり、及び処理されていない宿主への広がりが妨げられる。タイプＩ gH 発現細胞系の構成そのような細胞系を用いて、gH欠失変異ウィルスを生成し、そして増殖する。そのような細胞系の１つの例は、WO 92／05263 明細書に記載される。そのような細胞系の構成のもう１つの方法は、次の通りである。プラスミドpI MCO5を用いる。プラスミドpIMCO5を次の通りにして構成する：HSV-1(HFEH)gH遺伝子及び上流のHSV-1 gDプロモーターをコードする 4.3kbのSst-Ｉフラグメント（−392〜＋11）を、プラスミドpgDBrgH（Forresterなど.，J Virol 66，341-34 8，1992を参照のこと）から切断し、そしてベクターpUC119(J Vieira and J Mes sing，Methods in Enzymology 153（1987）3-11)中にクローン化し、プラスミド pUC119gHを生成する。Not1部位を、部位特定突然変異誘発によりプラスミドpUC1 19gH中に導入する。その得られるプラスミドpIMCO3を、CMV IEプロモーターを除去するためにNot1及びNru1により予備消化された真核発現ベクター pRC／CMV(In vitrogen Corporation)中に修復され、そして連結されるNot1−Sst1フラグメントを生成するために使用する。その得られるプラスミドをpIMCO5と命名し、そしてそれは、ウィルス誘発性gDプロモーター及びBGH(ウシ成長ホルモン)polyAの転写制御下でHSV-1 gH遺伝子を含む。それはまた、G418耐性の安定した細胞系の選択のために耐ネオマイシン性遺伝子も含む。次に、プラスミドpIMCO5を、リン酸カルシウム技法（Sambrook，Fritsch & Ma niatis，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いて、Vero細胞（ATCC No.88020401）中にトランスフェクトする。細胞を、G418の存在下で希釈クローニングにより選択し、そしてクローン細胞系を単離する。拡張及び凍結に続いて、細胞を24ウェルプレート中に接種し、そして0.1pfu／細胞でのSC16-del -gH（Forresterなど，J Virol 66，341-348，1992 を参照のこと）による感染により、gH−陰性ウィルスの増殖を支持するそれらの能力について試験する。ウィルスプラークを感染の３日後に観察し、gH遺伝子の発現を確かめる。タイプＩ gH 欠失変異体の生成のために使用されるプラスミドの構成 pIMMB25 gH遺伝子のいづれかの側でのフランキング配列を、Taq DNAポリメラーゼよりも低い誤差割合を有するVent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により HSV-1株KOS(m)ウィルス DNAから増幅する。オリゴヌクレオチドMB62（TCAAAGCTTCTGCAGGGCGGCGGGTCGTGG）及びMB63（TCAG TTAACGGACCCCGTCCCTAACCCACG）により増幅されたフラグメントを、EcoRＩ及び H paＩにより消化し、そしてオリゴヌクレオチドMB61-MB58(本明細書に記載される pIMMB63を構成するのに使用されるのと同じもの)により増幅されたフラグメントを HpaＩ及びHindIIIにより消化する。それらのフラグメントを、ゲル精製し、そしてEcoRＩ−HindIIIにより切断されたpUC119中にクローン化する。その得られるプラスミドを、pIMMB25と命名する。pIMMB27⁺ CMV-lacZカセットを、HindIIIによる消化により、ベクターpMV10(Forresterなど，J Virol 66（1992）341-348)から切り出す。そのフラグメントを、クレノウポリメラーゼによる修復によりブラント末端化し、そして次に、ゲル精製する。その精製されたフラグメントを、pIMMB25の HpaＩ部位中にクローン化する。CMV -lacZカセットがgH遺伝子と同じ配向で挿入されているクローンを選択する。このプラスミドを、pIMMB27⁺と命名する。gH 欠失変異体の生成組換えウィルスを、プラスミド pIMMB27によるタイプＩ HSV（sc16株）ウィルス DNAのトランスフェクションにより構成する。ウィルス DNAを、Walboomers & Ter Schegget(1996，Virology 74，256-258)に記載のようにしてヨウ化ナトリウムグラジエント上で精製する。組換えは次の通りにして行なう：トランスフェクション混合物を、１mlのHEBS緩衝液(137mMのNaCl、５mMの KCl、0.7mMの NaH₂ PO₄、5.5mMのグルコース、20mMの Hepes、pH7.05)において、５μｇのウィルス DNA、0.5μｇの線状化されたプラスミド DNA(制限酵素 ScaＩによる消化により線状化された)を混合することによって調製する。70μｌの２Ｍの CaCl₂を滴加し、そして軽く混合する。培地を、タイプＩ gH を発現する補完細胞のサブ・コンフルエント５cm皿から除去し、そして前記トランスフェクション混合物 500μ ｌを、２つの皿の個々に添加する。細胞を37℃で40分間インキュベートし、この時点で、５％ウシ胎児血清(FCS)を含む増殖培地４mlを添加する。トランスフェクション混合物の添加の４時間後、培地を除去し、そして細胞を血清フリーの培地により洗浄する。次に、細胞に、皿当り 500μｌの15％グリセロールにより２分間、“ショックを与える”。グリセロールを除去し、細胞を血清フリーの培地により２度洗浄し、そして５％ FCSを含む増殖培地を添加する。４，７日後、十分なウィルス細胞障害効果(CPE)が観察される場合、細胞を培地中に削り落とし、2500rpmで４℃で５分間、回転沈降せしめ、そして 120μｌのイーグルの最少必須培地（EMEM）に再懸濁する。これは現在、野生型及び組換えウィルスを含む粗ウィルスストックである。そのストックを凍結し、融解し、そして音波処理し、そして一定範囲の希釈度で、タイプＩ gH を発現する補体細胞上で組換え体についてスクリーンする。ウィルス希釈溶液の添加の後、細胞を、１％の低ゲル化温度のアガロースを含む培地により被覆する。約３日でのウィルスプラークの出現の後、330μｇ／mlのXgalを含むアガロースの第２オーバーレイを添加する。青色のプラークを、48時間内に取り、そしてタイプＩ gH を発現する補体細胞を含む24−ウェル皿(ウェル当たり１cm²)に移す。プラークを、十分な CPEに増殖せしめ、そして培地中に削り落とすことにより収穫する。複数回のプラーク精製を、ウィルスの純粋なストックが得られるまで実施する。組換え体の構造を次の通りにして確かめる。ヨウ化ナトリウム精製されたウィルス DNAを前記のようにして調製し、そしてBamHＩにより消化する。この消化物を、アガロースゲル上で分離し、そしてナイロン膜に移す。これを、gH遺伝子のいづれかの側の配列に対して相同の放射性ラベルされた DNAフラグメントによりプローブする。外来性遺伝子を含む欠損ウィルスストックの生成外来性遺伝子含有アンプリコンの DNAを、gH陰性HSV-1(又は遺伝的に無能にされたヘルペスウィルスの他の例)の精製されたゲノム DNAにより、適切な遺伝子生成物を発現する補完細胞（この場合、タイプＩ gH 生成物）中に、上記トランスフェクション法により同時トランスフェクトする。ウィルス調製物を、初期 D NAトランスフェクションの後、種々の時点でそれらの同時トランスフェクトされた細胞を収穫することによって製造する。多量のウィルスストックを、タイプＩ gH を発現するトランスフェクトされたいくらかの補体細胞にそれらのウィルス調製物を単純に用いることによって製造され得る。ヘルパーウィルスに対する欠損ウィルスの割合を、それらのウィルス調製物から抽出された DNA上でのサザンハイブリダイゼーションにより調べる。必要なら、この割合を、欠損ウィルスは感染の最後の段階で選択的にアセンブルすることが報告されているので、トランスフェクションのために使用されるアンプリコン及びヘルパーウィルス DNAの量を変えることによって調節する。ウィルスストックにおいてより高い％の欠損ウィルスを達成するためには、２種の新規手段が本発明に従って使用される：１）ストック調製物におけるヘルパーウィルスに対する欠損ウィルスのより高い割合を達成するためには、HSVチミジンキナーゼ遺伝子pW7TK+を含む HSVアンプリコンを用いて、外来性遺伝子を担持し、そしてTK陰性gH-HSVをヘルパーウィルスとして用い；増殖を gH+補完組換え細胞系上で実施する。増殖培地におけるメトトレキセートの存在下で、ウィルスは、欠損及びヘルパー両ウィルスにより感染されるそれらの細胞においてのみ増殖することができる。この工程は、欠損ウィルスを選択的に増幅し、そしてストックにおけるヘルパーウィルスに対するその割合を高める。２）あるいは、精製された HSV DNAを初め、タイプＩ HSV DNAを１度又は２度、切断する制限酵素（たとえば SpeＩ及び／又は AseＩ）により消化する。酵素消化されたウィルス DNAが適切な細胞中にアンプリコン DNAにより同時トランスフェクトされた後すぐに、それは、消化されていない HSV DNAと同じように、すべてのヘルパー機能を提供するが、しかしそれは新規のヘルパーウィルス粒子を生成する能力を減じた。この技法は、アンプリコンPW7 lacZ1(上記PW７アンプリコン中にクローン化されたlacZ遺伝子を駆動する IE110プロモーター)を用いて、次の比較実験により例示される。（この例においては、lacZ遺伝子は、例示の実験的目的のためにここで使用される“レポーター”酵素lacZをコードする。この実験例に従っての本発明の実施においては、この例におけるlacZ遺伝子の場所が、本明細書の他の部分で言及されたように、本発明の出願に関して、興味ある抗原又は他の生成物をコードする１又は複数の他の遺伝子及びそれらのプロモーターにより、容易に入手できるrDNA 技法を用いて、取られ、又は補充されるであろう。）切断された DNAを有するアンプリコンを増殖するためには、HSV-1株の高分子量感染性 DNAの調製物を、制限酵素 AseＩにより消化する。これは、1593及び12 4777の位置で２度、ゲノムを切断するが、しかし現在同定された遺伝子生成物のいづれをも***せしめない。しかしながら、そのような消化は、感染性子孫のビリオンへのウィルス DNAの発生する能力を破壊し、又は減じる。 Vero細胞を、アンプリコンPW7 lacZ1(３μｇ)及び AseＩにより切断されたSC1 6 DNA（10μｇ）によりトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を３日間培養し、次に、ウィルス子孫を収穫し、そしてlacZ酵素により青色の生成物を生成する標準の基質 X-galの存在下でアッセイした（Vero細胞のさらなるアッセイ培養物の感染の後）。前記アッセイにおける青色の細胞は、lacZ−担持のアンプリコンにより感染された細胞を表わし、そしてアッセイにおける白色のプラークは、ヘルパーウィルスにより感染された細胞を示した。選択された培養条件下で、その収穫物は、1. 8×10⁴pfu／mlのアンプリコン力価及び３×10³pfu／mlのヘルパーウィルス力価（１：６の比でのヘルパー：アンプリコン）を示した。制限酵素の使用を伴わない比較のためのその対応する条件下で、その得られた力価は、アンプリコンで 1.3×10⁴pfu／ml及びヘルパーウィルスで 1.5×10⁵pfu ／mlであった。増殖の前での制限酵素の使用は、ほぼ２倍の大きさの程度、ヘルパーウィルスの生産量を抑制し、そして78倍、収穫されたビリオン子孫粒子におけるヘルパーウィルスに対する相対的なアンプリコンの量を富化したことが明らかになった。欠損ウィルスに含まれる外来性遺伝子の発現の試験欠損ウィルスにおける外来性遺伝子の発現を、SDS-PAGEゲル分析(SIV遺伝子及びHPV E6／E7の場合)、又は機能的アッセイ（GM-CSF及びB7.1の場合）により試験することができる。 SDS-PAGE分析のためには、タイプＩ gH を発現する補完細胞を、欠損ウィルスストックにより感染せしめ、そして35-Sメチオニンによりラベルする。感染の24 時間後、全タンパク質を抽出し、そして抗−SIV gag-pol，Nef又は抗HPV E6／E7 タンパク質による免疫沈殿にゆだねる。抗体により沈殿されたタンパク質を、SD S-PAGE分離及びオートラジオグラフィーにゆだねる。 GM-CSFについての機能的アッセイは、ヘルパーウィルス、及びGM-CSF遺伝子を担持するアンプリコンにより、いづれかの既知の GMCSF応答細胞系を用いての既知態様で感染された宿主細胞系の培養物の上清液のバイオアッセイにより実施され得る。外来性遺伝子を含むアンプリコン（欠損ウィルス）のワクチン能力の試験ワクチンアジュバントとしてGM-CSF及び／又はB7.1を含むアンプリコン（欠損ウィルス）の適合性アジュバントとして免疫モジュレーター、たとえばGM-CSF及びB7.1を含むアンプリコン（欠損ウィルス）のいづれか一定の検体の適合性を、gH−陰性HSV-1のみにより付与される HSV−特異的免疫性及びアンプリコン（欠損ウィルス）及び gH−陰性 HSV-1の混合物により付与される免疫性を比較することによって、Farr ellなど，J Virol 68，927-32（1994）に記載されるように、マウスモデルにおいて試験され得る HSVワクチン能力を高めることに対するその効果により評価することができる。マウスのグループを、種々の用量(10²〜10⁶pfuの範囲)のウィルスにより、耳介の乱刺によりワクチン接種する。対照グループは、PBSによりワクチン接種される。ワクチン接種の３週間後、マウスは、10⁶pfuの野生型HSV- 1(SC16株)により反対側の耳介においてチャレンジされる。そのチャレンジの５日後、マウスを殺し、そしてそのチャレンジされた耳を除去し、そして−70℃で凍結する。耳をホモジナイズし、そして個々の耳における感染性挑戦ウィルスの量を、プラークタイターにより決定する。PBS−処理された対照に比較してのワクチン接種されたマウスのグループにおけるウィルス力価の低下が、ウィルスワクチンにより付与される保護の基準である。 gH−欠失されたウィルスは５×10⁵pfuのワクチン接種量で感染性ウィルスの存在を完全に破壊することができ、そして５×10⁴pfuでさえ、３対数の低下が観察されることが見出される。 GM-CSF及び／又はB7.1を含む欠損ウィルスを含むウィルスストックは、このレベルの保護を高める傾向があり；いづれかの感染性ウィルスからの完全な保護が gH−欠失されたウィルスによりワクチン接種されたマウスにおいてよりも低い挑戦用量で観察され、そして感染性ウィルス力価のより強い低下が、PBSによりワクチン接種された対照に比較して、見出され得る。ワクチン開発のためのアンプリコン遺伝子供給の効力欠損 HSVウィルスによる遺伝子供給の効力を、２段階で評価することができる。段階１で、SIV及び HPV遺伝子を含む欠損ウィルスを用いて、マウスをワクチン接種し、そして CTLアッセイを行ない、対応する細胞介在免疫応答を生成するそれらの能力を評価する。その結果を促進する欠損ウィルスサンプルのために、段階２の試験を適切に実施する。動物モデルを設定し、そしてそれらの組換え欠損ウィルスを、腫瘍を発現するE6／E7遺伝子に対するそれらの有益な効果、又は野生型 SIVによるモンキーの挑戦を妨げ又は改善するそれらの能力について試験する。それらの及び他の構造体の効果の他の試験は、当業者に容易に入手できるであろう。本明細書に記載される発明は、当業者に明らかであろう修飾及び変更を受けることができ、そして上記開示はまた、本明細書に、及び引用により本明細書に組込まれる引用された出版物において言及され、又は記載される特徴の組合せに及ぶ。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年５月１２日【補正内容】請求の範囲１．正常な宿主細胞において制限された複製能力のものであるヘルパーヘルペスウィルス又はその DNAと共に、複製起点、パッケージング配列、及びプロモーターの制限下での少なくとも１つの挿入された遺伝子を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンの調製物の、処理されるべき対象に免疫応答を生ぜしめることへの予防又は治療使用のための免疫原又はワクチンとしての使用。２．前記関連するヘルパーウィルスが、そのヘルパーウィルスが、感染性新規ウィルス粒子の生成を引き起こさないように、その感染性新規ウィルス粒子の生成のために必須である遺伝子に関する不活性化欠陥を有し、但し、前記ウィルスが前記必須のウィルス遺伝子の機能を供給する遺伝子を担持するよう製造され、そしてその遺伝子を発現することができる組換え補体宿主細胞を感染する場合を除く請求の範囲第１項記載の使用。３．前記必須のウィルス遺伝子が必須のウィルス糖タンパク質、たとえばgH， gD，gB又はgL、又はそれらの相同体である請求の範囲第２項記載の使用。４．前記挿入された遺伝子が、抗原又は免疫調節タンパク質をコードする請求の範囲第１，２又は３項記載の使用。５．前記挿入された遺伝子が異種抗原をコードする請求の範囲第４項記載の使用。６．前記異種抗原がウィルス抗原を含んで成る請求の範囲第５項記載の使用。７．前記アンプリコン調製物が、多くのウィルス抗原、たとえばアンプリコンに対して異種のウィルス、たとえばインフルエンザウィルス、又は HIV又は SIV もしくはＣ型肝炎ウィルスからの複数の抗原をコードするアンプリコンの混合物を含んで成る請求の範囲第６項記載の使用。８．前記異種抗原が腫瘍−関連抗原を含んで成る請求の範囲第５項記載の使用。９．前記挿入された遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン及びアクセサリー分子から選択された免疫調節タンパク質をコードする請求の範囲第４項記載の使用。 10．前記アンプリコンが、ヘルパーウィルスの複製のために必要とされる機能のための遺伝子をコードし、その結果、それが、アンプリコンがヘルパーウィルスの増殖に必須である条件下で宿主細胞培養物において増殖され得、そして逆もまた同じである請求の範囲第１項記載のアンプリコン調製物の使用。 11．ヘルパーウィルス又はその DNAと共に、複製の起点、パッケージング配列及びプロモーターの制御下での少なくとも１つの挿入された遺伝子を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンの調製物であって、前記関連するヘルペスウィルスが、そのヘルペスウィルスが感染性新規ウィルス粒子の生成を引き起こさないように、その感染性新規ウィルス粒子の生成のために必須である遺伝子に関する不活性化欠陥を有し、但し、前記ウィルスが前記必須のウィルス遺伝子の機能を供給する遺伝子を担持するよう製造され、そしてその遺伝子を発現することができる組換え補体宿主細胞を感染する場合を除き；そして前記アンプリコンがヘルパーウィルスの増殖のために必要な挿入された遺伝子を担持することを特徴とする調製物。 12．前記アンプリコンが挿入されたTK遺伝子を担持し、前記ヘルパーウィルスがTK−であり、そしてまた、必須のウィルス糖タンパク質を欠いており、それにより、前記アンプリコンが、前記調製物がメトトレキセートの存在下でTK−細胞上で増殖される場合、ヘルパーウィルスの増殖のために必要である請求の範囲第11項記載の調製物。 13．一緒に取られる前記ヘルパーウィルス及び前記欠損ウィルスベクターの遺伝子が必須のウィルス遺伝子機能に関して欠損性である請求の範囲第11又は12項記載の調製物。 14．前記アンプリコンが挿入された第１の必須ウィルス遺伝子を担持し、前記ヘルパーウィルスが前記対応する第１の必須ウィルス遺伝子を欠いており、そして又は第２の必須ウィルス遺伝子も欠いており、それにより、前記アンプリコンが、前記調製物が前記第２の必須ウィルス遺伝子の機能に関して補足される細胞上で増殖される場合、前記ヘルパーウィルスの増殖のために必要である請求の範囲第13項記載の調製物。 15．前記第１の必須ウィルス遺伝子が必須のウィルス糖タンパク質をコードし、そして前記第２の必須ウィルス遺伝子がまた、必須のウィルス糖タンパク質（前記第１の必須ウィルス遺伝子によりコードされるものとは異なる）をコードし；たとえば、それぞれgD及びgHをコードする請求の範囲第14項記載の調製物。 16．正常な宿主細胞において制限された複製能力のものであるヘルパーヘルペスウィルス又はその DNAと共に、複製の起点、パッケージング配列、及びプロモーターの制御下での少なくとも１つの挿入された遺伝子を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンの調製物であって、前記ヘルパーウィルスが、そのヘルパーウィルスの複製を制限するために、非必須部位において制限エンドヌクレアーゼにより切断されている DNAの形で存在することを特徴とする調製物。 17．請求の範囲第１〜16のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る医薬調製物。 18．免疫原、たとえばワクチン又はワクチンアジュバントとして使用するための請求の範囲第17項記載の医薬調製物。 19．処理される対象に免疫応答を生ぜしめるために予防又は治療使用のためへの、免疫原としての請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 20．前記免疫応答が前記アンプリコンによりコードされる異種抗原に対してである請求の範囲第１〜10又は19のいづれか１項記載の使用。 21．腫瘍治療における治療又は予防使用のための免疫原、たとえばワクチンの調製への請求の範囲第11〜16のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 22．細胞毒性Ｔ細胞（たとえば、ウィルス特異性）のインビトロ拡張への請求の範囲第11〜16のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 23．治療又は予防の調整遺伝子療法への請求の範囲第11〜16のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 24．処理されたヒト又は非ヒト動物対象に免疫刺激を付与するためへの請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用方法であって；（ｉ）感染の後、処理されるべき対象に免疫刺激を付与することができる細胞の調製物と前記アンプリコン調製物とをエクシ−ビボで接触せしめ；そして（ii）処理されるべき前記対象に免疫刺激を供給するために前記感染された細胞を用いることを含んで成る方法。 25．前記感染された細胞が、投与の前、不活性化した後、たとえば照射した後、ワクチンとしての前記感染された細胞の直接的な投与により、処理されるべき対象に免疫刺激を供給するために使用される請求の範囲第24項記載の方法。 26．前記感染された細胞が、免疫受容能力の細胞、たとえば処理されるべき対象の免疫系の細胞をエクシ−ビボで感作し、又は刺激し、続いて、たとえばそれらにより感染されたアンプリコン又は細胞の同時投与を伴わないで、前記免疫受容能力の細胞を再投与するためへの前記細胞の使用により、処理されるべき対象に免疫刺激を供給するために使用される請求の範囲第24項記載の方法。 27．前記アンプリコン調製物によりエクシ−ビボで感染された細胞が、自己系細胞である請求の範囲第24項記載の方法。 28．前記アンプリコン調製物によりエクシ−ビボで感染された細胞が、たとえば腫瘍細胞系の細胞を含んで成る異種細胞である請求の範囲第24項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者エフスタスィオウ，スタシーイギリス国，ケンブリッジシービー２１エヌイー，ノーウィッチストリート 18 (72)発明者イングリス，スティーブンチャールズイギリス国，ケンブリッジシービー１６エルエックス，リントン，リュガーブガーデンズ２ (72)発明者ツァン，シーアオリウイギリス国，ケンブリッジシービー４１エーゼット，オークツリーアベニュ 21

Claims

【特許請求の範囲】１．正常な宿主細胞において制限された複製能力のものであるヘルパーヘルペスウィルス又はその DNAと共に、複製の起点、パッケージング配列、及びプロモーターの制限下での少なくとも１つの挿入された遺伝子を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンの免疫原又はワクチンとしての使用のために適切な調製物。２．前記関連するヘルパーウィルスが、そのヘルパーウィルスが、感染性新規ウィルス粒子の生成を引き起こさないように、その感染性新規ウィルス粒子の生成のために必須である遺伝子に関する不活性化欠陥を有し、但し、前記ウィルスが前記必須のウィルス遺伝子の機能を供給する遺伝子を担持するよう製造され、そしてその遺伝子を発現することができる組換え補体宿主細胞を感染する場合を除く請求の範囲第１項記載の調製物。３．前記必須のウィルス遺伝子が必須のウィルス糖タンパク質、たとえばgH， gD，gB又はgL、又はそれらの相同体である請求の範囲第２項記載の調製物。４．前記挿入された遺伝子が、抗原又は免疫調節タンパク質をコードする請求の範囲第１，２又は３項記載の調製物。５．前記挿入された遺伝子が異種抗原をコードする請求の範囲第４項記載の調製物。６．前記異種抗原がウィルス抗原を含んで成る請求の範囲第５項記載の調製物。７．前記アンプリコン調製物が、多くのウィルス抗原、たとえばアンプリコンに対して異種のウィルス、たとえばインフルエンザウィルス、又は HIV又は SIV もしくはＣ型肝炎ウィルスからの複数の抗原をコードするアンプリコンの混合物を含んで成る請求の範囲第６項記載の調製物。８．前記異種抗原が腫瘍−関連抗原を含んで成る請求の範囲第５項記載の調製物。９．前記挿入された遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン及びアクセサリー分子から選択された免疫調節タンパク質をコードする請求の範囲第４項記載の調製物。 10．前記アンプリコンが、ヘルパーウィルスの複製のために必要とされる機能のための遺伝子をコードし、その結果、それが、アンプリコンがヘルパーウィルスの増殖に必須である条件下で宿主細胞培養物において増殖され得、そして逆もまた同じである請求の範囲第１項記載のアンプリコン調製物。 11．ヘルパーウィルス又はその DNAと共に、複製の起点、パッケージング配列及びプロモーターの制御下での少なくとも１つの挿入された遺伝子を含んで成るヘルペスウィルスアンプリコンの調製物であって、前記関連するヘルペスウィルスが、そのヘルペスウィルスが感染性新規ウィルス粒子の生成を引き起こさないように、その感染性新規ウィルス粒子の生成のために必須である遺伝子に関する不活性化欠陥を有し、但し、前記ウィルスが前記必須のウィルス遺伝子の機能を供給する遺伝子を担持するよう製造され、そしてその遺伝子を発現することができる組換え補体宿主細胞を感染する場合を除き；そして前記アンプリコンがヘルパーウィルスの増殖のために必要な挿入された遺伝子を担持することを特徴とする調製物。 12．前記アンプリコンが挿入されたTK遺伝子を担持し、前記ヘルパーウィルスがTK−であり、そしてまた、必須のウィルス糖タンパク質を欠いており、それにより、前記アンプリコンが、前記調製物がメトトレキセートの存在下でTK−細胞上で増殖される場合、ヘルパーウィルスの増殖のために必要である請求の範囲第 11項記載の調製物。 13．一緒に取られる前記ヘルパーウィルス及び前記欠損ウィルスベクターの遺伝子が必須のウィルス遺伝子機能に関して欠損性である請求の範囲第11又は12項記載の調製物。 14．前記アンプリコンが挿入された第１の必須ウィルス遺伝子を担持し、前記ヘルパーウィルスが前記対応する第１の必須ウィルス遺伝子を欠いており、そして又は第２の必須ウィルス遺伝子も欠いており、それにより、前記アンプリコンが、前記調製物が前記第２の必須ウィルス遺伝子の機能に関して補足される細胞上で増殖される場合、前記ヘルパーウィルスの増殖のために必要である請求の範囲第13項記載の調製物。 15．前記第１の必須ウィルス遺伝子が必須のウィルス糖タンパク質をコードし、そして前記第２の必須ウィルス遺伝子がまた、必須のウィルス糖タンパク質（前記第１の必須ウィルス遺伝子によりコードされるものとは異なる）をコードし；たとえば、それぞれgD及びgHをコードする請求の範囲第14項記載の調製物。 16．前記ヘルパーウィルスが、そのヘルパーウィルスの複製を制限するために、非必須部位において制限エンドヌクレアーゼにより切断されている DNAの形で存在する請求の範囲第１項記載の調製物。 17．請求の範囲第１〜16のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る医薬調製物。 18．免疫原、たとえばワクチン又はワクチンアジュバントとして使用するための請求の範囲第17項記載の医薬調製物。 19．処理される対象に免疫応答を生ぜしめるために予防又は治療使用のためへの、免疫原としての請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 20．前記免疫応答が前記アンプリコンによりコードされる異種抗原に対してである請求の範囲第19項記載の使用。 21．腫瘍治療における治療又は予防使用のための免疫原、たとえばワクチンの調製への請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 22．細胞毒性Ｔ細胞（たとえば、ウィルス特異性）のインビトロ拡張への請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 23．治療又は予防の調整遺伝子療法への請求の範囲第１又は11項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用。 24．処理されたヒト又は非ヒト動物対象に免疫刺激を付与するためへの請求の範囲第１〜18のいづれか１項記載のアンプリコン調製物を含んで成る組成物の使用方法であって；（ｉ）感染の後、処理されるべき対象に免疫刺激を付与することができる細胞の調製物と前記アンプリコン調製物とをエクシ−ビボで接触せしめ；そして（ii）処理されるべき前記対象に免疫刺激を供給するために前記感染された細胞を用いることを含んで成る方法。 25．前記感染された細胞が、投与の前、不活性化した後、たとえば照射した後、ワクチンとしての前記感染された細胞の直接的な投与により、処理されるべき対象に免疫刺激を供給するために使用される請求の範囲第24項記載の方法。 26．前記感染された細胞が、免疫受容能力の細胞、たとえば処理されるべき対象の免疫系の細胞をエクシ−ビボで感作し、又は刺激し、続いて、たとえばそれらにより感染されたアンプリコン又は細胞の同時投与を伴わないで、前記免疫受容能力の細胞を再投与するためへの前記細胞の使用により、処理されるべき対象に免疫刺激を供給するために使用される請求の範囲第24項記載の方法。 27．前記アンプリコン調製物によりエクシ−ビボで感染された細胞が、自己系細胞である請求の範囲第24項記載の方法。 28．前記アンプリコン調製物によりエクシ−ビボで感染された細胞が、たとえば腫瘍細胞系の細胞を含んで成る異種細胞である請求の範囲第24項記載の方法。