CN1208438A - 转运蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及转运蛋白,具体涉及VP22及其同源物,并涉及递送这些蛋白质和任何结合的分子至靶细胞群的方法。该转运蛋白可应用于基因治疗和引导试剂至需要高效导向的细胞的方法。

Description

转运蛋白及其应用
本发明涉及转运蛋白，具体涉及基于VP22的转运蛋白、VP22的同源物或其片段，还涉及包括转运蛋白的分子和组合物，并涉及高效递送这类蛋白质和任何结合的分子至靶细胞群的方法。
1型单纯疱疹病毒(HSV-1)UL49基因的产物，结构蛋白VP22(4)，是HSV壳的主要成分，处于病毒壳体外和包膜内的毒粒的区室，由至少10个或更多个病毒多肽构成(参见综述(6))。VP22的分子量为32k，具有较强的碱性，并通过感染细胞内的磷酸化和核苷酸化(1、4、8、9、11)而被修饰。
尽管和已被完全鉴定的转录调节蛋白VP16一起是毒粒内主要壳蛋白之一，但对于VP22在病毒复制循环中的作用知道得很少。尚不知它是否是必需的病毒蛋白，但在类似于VP16的方式中，VP22有可能在感染期间起两个作用一首先在病毒基因表达中作为功能蛋白，其次在病毒装配中作为毒粒的结构成分。至于前者，一些迹象表明VP22能与HSV-1 DNA专一性地结合(2、8、10)。
我们最近阐述了VP16和VP22之间存在稳定的和专一性的相互作用，它与装配和转录激活中VP16的作用机制有联系。在那些研究中，我们发现当VP22自身在细胞中时，它具有独特的行为模式。在本文所述的工作中，我们扩展了这些研究以详细探讨细胞的定位作用，业已发现VP22表现出极为独特的性能，因为它从最初表达它、而且它在其中表现胞质定位作用的细胞有效地转运至单细胞层内的毗邻细胞，它在毗邻细胞中被摄取入细胞核。我们试验过的一些蛋白质中的其它任何蛋白质例如VP16均未观测到这种行为模式；而且据我们所知，这些性能和活性是前所未有的。
当将VP22或VP16引入单细胞层大约30小时之后观测到VP22的这种意外的性能，虽然平均而言可在约2-5％的细胞内检测到VP16(是这种试验中常见的)，但VP22几乎可在单细胞层的每个细胞中被检测到。我们还发现VP22胞间转运的专一性，并业已证实了在该蛋白质的C端含有决定子。这是由于，缺失C端34个氨基酸的变体虽然在初始表达细胞内的胞质定位中被表达，但未被转运至毗邻的细胞。
蛋白质分泌或外排通常是通过专一途径发生的，要求已被完全鉴定的信号序列，分选入输出途径中包括的区室和小泡，可参见综述(12)。VP22没有惯常的任意信号序列，而且它的转运途径和机制相当独特，从未被鉴定过。对于VP22中需要的决定子和细胞内生理需要的进一步研究应有助于阐明所涉及的途径。因此，VP22或者更具体地指VP22转运中涉及的决定子，可被转移到其它蛋白质，以能在靶细胞群内转运和有效表达或摄取。可容易地设想该性质的广泛效用和应用。
因此，本发明基于上述发现，即有可能将编码转运蛋白的核酸引入靶细胞群的第一部分，和任选地用编码与转运蛋白结合的蛋白质(例如融合配偶体)的核酸，来表达核酸，任选地从组织专一性启动子产生蛋白质；然后该转运蛋白连同相关任意蛋白质从细胞中输出，而被不直接产生蛋白质的靶细胞群的第二部分摄取。通常发现该蛋白质被靶细胞群的第二部分高效地摄取，并倾向于定位在靶细胞群的第二部分的核内。于是，将初始引入作用和后续的转运结合可使转运蛋白和任何相关蛋白质被高效递送至靶细胞群。
因此，本发明的一方面在于提供这种蛋白质：它可从表达它的细胞内输出，并能被其它细胞例如不直接产生该蛋白质的细胞摄取。该转运蛋白优选与需要递送至靶细胞群的一种或多种其它蛋白质结合。
进一步的实验证实，当VP22作为提取物被加入胞外介质时它就被输入细胞。这说明，要发生观测到的胞间转运，无需在至少部分细胞群中表达VP22。
在另一方面，VP22转运蛋白例如可通过共价键与相关分子偶联，或与相关分子结合，并以该形式应用；这与应用表达载体产生蛋白质和/或相关分子恰好相反。具体地说，这可使非肽基分子如核酸、药物或标志物(蛋白质除外或作为蛋白质的替代物)与转运蛋白结合并被细胞群摄取，而无需在至少部分细胞群内表达VP22及相关分子，其中需要将VP22和/或相关分子递送至这些细胞群。
在一个优选的实施方案中，本发明提供如下转运蛋白：
(ⅰ)VP22或其活性部分；
(ⅱ)VP22的片段或同源物，包括提供转运性能的一种或多种决定子；或者，
(ⅲ)得自VP22的C端34个氨基酸的片段；
该转运蛋白任选与需要转运至靶细胞群的一个或多个其它分子结合。
在本发明中，“活性部分”表示比全长VP22短的肽，但它保留被产生它的细胞分泌和被其它分子摄取的性能。
本发明的进一步方面是提供包括一种或多种上述转运蛋白的组合物，该蛋白质任选与需要递送至细胞群的一个或多个分子结合。
本发明的又一方面在于提供将所需分子转运入细胞群的方法，是通过将细胞暴露于所需分子和上述转运蛋白而实施的。
因此在该方面，本发明提供的方法避免初始需要用编码转运蛋白和任选所需分子的核酸转染细胞群。这样，也可以转运非肽基、不能在细胞内表达的分子，因为可将所需分子和转运蛋白加入细胞周围的介质中。
在一些实施方案中，可使所需分子与转运蛋白共价偶联，并将这些实体暴露于靶细胞群。也可将所需分子与转运蛋白非共价键结合，例如利用脂质基载体掺合如核酸的所需分子和转运蛋白。
因此在另一方面，本发明提供制备含有待转运至靶细胞群的所需分子的组合物的方法，该方法包括共价键或非共价键地结合所需分子与转运蛋白。
本发明的进一步方面在于，提供编码转运蛋白和(任选)相关分子的核酸。例如，在其中转运蛋白作为融合构建物表达的实施方案中，提供的核酸编码转运蛋白及其融合配偶体。
本发明的进一步方面在于提供这种表达载体：它结合编码转运蛋白或其活性部分或其片段的核酸，和任选的编码相关分子的核酸。
本发明的进一步方面在于提供用上述表达载体转染的宿主细胞。
本发明的进一步方面在于提供转运所需蛋白质或肽至靶细胞群的方法，该方法包括：
(ⅰ)用编码转运蛋白的核酸并任选地用编码与转运蛋白结合的蛋白质的核酸转染、感染或其它方式引入靶细胞群的第一部分；
(ⅱ)表达该核酸而产生蛋白质，随后从细胞输出该转运蛋白，连同与之结合的其它任何蛋白质，由不直接产生该蛋白质的靶细胞群的第二部分摄取。
应懂得，可通过用重组病毒感染而实现靶细胞群第一部分的转染。
本发明的进一步方面在于提供将所需分子转运入细胞群的方法，该方法包括：
(ⅰ)将所需分子与转运蛋白偶联形成复合体；和
(ⅱ)使细胞暴露于复合体中使细胞摄取该复合体。
在该方法中，将可以是非肽基的所需分子例如通过共价作用或掺合作用与转运蛋白结合。
本发明的进一步方面在于提供上述转运蛋白和载体以用于转运分子的方法中。其中的方法指研究方法和治疗方法。本发明特别适用于引导试剂至需要高效导向的细胞群的方法中，例如在基因治疗方法中；癌的治疗，例如可通过递送肿瘤抑制剂至细胞。对图的简要描述
图1示出表达VP22的COS-1细胞的免疫荧光。用VP22表达载体转染生长于盖玻片上的COS-1细胞。转染40小时后，细胞于室温下100％甲醇中被固定15分钟，并与抗VP22单克隆抗体P43培养，接着与FITC-缀合次级抗体培养。然后用共焦显微镜检术(confocal microscopy)分析这些细胞。(a)VP22表达细胞显示的典型核定位。(b)存在于约5-10％表达细胞中VP22表达的胞质模式。(c)当表达量增加时观测到的VP22定位模式。(d)VP22表达导致蛋白质被定位于单细胞层内每个细胞中。
图2示出VP22在Vero细胞中的转运。按对图1那样进行转染和检测，只是该实验是在Vero细胞中进行的。该画面示出处于中心细胞胞质内VP22的焦点和在周围细胞中(它被定位于细胞核内)呈密度梯度。
图3示出VP22表达的转染时间过程，表明VP22在细胞之间被转运。COS-1细胞被转染并在转染后14、20、26和38小时被固定。示出的共焦图像表示在20hr时间点时放大20倍(a栏)和38hr时放大100倍(b栏)。
图4示出VP22的蛋白质编码序列，它是HSV-1 UL49基因的产物，该显示△267突变体的截断点；
图5(a)和(b)示出当含全长VP22和△267 VP22的提取物被加入胞外介质后进行的免疫荧光分析结果；和
图5(c)示出全长VP22和△267 VP22细胞提取物的蛋白质印迹；
图6示出应用于介质时VP22或其修饰物的输入。
图7a示出用β-gal的抗体染色后一个显微注射细胞的视野的典型图。
图7b示出细胞的相同视野，其中VP22不但可见于显微注射的细胞中，而且可见于周围许多细胞中。
图8a示出由T-抗原阳性COS细胞标记的混合细胞的典型视野。T-抗原抗体未检测到周围的BHK细胞；
图8b示出VP22阳性细胞，即见到中央COS细胞加上周围的非转染BHK细胞；
图9a示出：将表达全长VP22的COS-1细胞对于VP22和DNA进行染色，并分析有丝***不同阶段的细胞。为染色DNA，将碘化丙锭(propidium iodide)加到甘油固定物上，最终浓度为3μg/ml。示出代表前期、前中期和后期的细胞。
图9b示出与末端标记的40bp寡核苷酸(T24)一起培养的增加量的GST和GST-VP22融合蛋白；采用凝胶移位分析法分析所得复合体。将VP22专一性复合体标记为1～3；和
图10示出用HSV-1[gH-ve]感染的Vero细胞。a表示对β-半乳糖苷酶染色而感染24小时后的视野。b示出对VP22染色后的相同视野。c示出对β-半乳糖苷酶染色而感染66小时后的视野。d示出对VP22染色后的相同视野。
原料和方法
细胞和病毒。
HeLa(人上皮癌细胞)，COS-1细胞(由SV40 T-抗原转化的猴肾成纤维细胞)，Vero细胞(猴肾成纤维细胞)和BHK(幼仓鼠细胞)均生长于含10％新生小牛血清的Dulbecco改进的极限必需介质中。
质粒。
受hCMV IE启动子控制的真核表达载体pGE 109含VP22开放读框，以前曾被描述过(4)。简言之，该表达构建物是这样制备的：利用聚合酶链反应，以含BgⅢ或BamHⅠ限制酶切位点的接头扩增VP22开放读框，以便于后续在hCMV增强子/启动子区控制下引入载体。
抗体。
这些实验用到抗VP16单克隆抗体LP1和抗VP22单克隆抗体p43。p43抗体是通过单纯疱疹病毒的毒粒蛋白制剂对小鼠免疫接种而产生的。对VP22有反应活性的多克隆抗体(AGV30)是通过用由与VP22开放读框连接的谷胱甘肽S-转移酶构成的融合蛋白对兔子免疫接种而产生的。该融合蛋白是这样生成的：通过得自pGE109的BglⅡ-BamHⅠ片段符合读框***可商购的(Pharmacia)细菌表达载体pGEX2T的BamHⅠ位点而产生载体pGST-VP22。往对数期培养物中加入IPTG(0.1mM)而引入含pGST-VP22的大肠杆菌(E.coli)株HB101，再过3小时后收集细胞。沉淀后，使细胞重悬浮于含0.5％NP-40的磷酸盐缓冲盐水，用Branson Ultra-sonic细胞匀浆器进行超声处理，接着于4℃下在12000rpm时离心净化20分钟。然后通过在谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(Pharmacia)上亲和层析，在PBS 0.5％NP40中洗涤未结合的蛋白质，再用含5mM谷胱甘肽的10mM Tris-Hcl缓冲液(pH8.0)洗脱来纯化GST-VP22融合蛋白。对3只兔子中的每只每隔4周注射一次(每次约50μg)该融合蛋白的佐剂溶液，并于总计17周后采集血清。
SDS-PAGE和蛋白质印迹。
通过用双丙烯酰胺交联的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。干燥含放射性标记的样品的凝胶并暴露于X光片。用于蛋白质印迹分析的凝胶被转至硝酸纤维素滤器与合适的抗体反应。应用辣根过氧化物酶连接的次级偶联物，以3,3′-二氨基联苯胺四盐酸二水合物(DAB)或以增强的化学荧光显影可见到活性带。
转染和免疫荧光。
转染前那天将细胞置于6孔盘(6×35mm)，每孔配有一个盖玻片，密度为每孔2×105个细胞。用pUC19 DNA将500ng表达质粒配成2μg而进行DNA转染，利用磷酸钙沉淀法，其中以BES[N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸]缓中盐水代替以前描述的HEPES缓冲盐水作出修改(3,5)。转染40小时后于室温下在100％甲醇中固定细胞达15分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。转染时，将盖玻片上的细胞在室温下与PBS/10％小牛血清培养15分钟而封阻细胞。往此同一溶液(p43在1∶100的稀释度下)中加入初级抗体并于室温下培养20分钟。用PBS充分洗涤后，将次级抗体(FITC偶联的抗小鼠IgM和/或Texas Red(德克萨斯红)偶联的抗兔IgG)加入PBS/10％小牛血清并培养10分钟。再用PBS充分洗涤，然后使盖玻片在甘油中固定，应用Biorad MRC600共焦显微镜在双通道中检验。利用普通光学显微镜拍下相差照片。
结果
VP22定位于两个不同的模式中。
是这样研究VP22的细胞定位的：先应用抗VP22单克隆P43进行VP22表达细胞的免疫荧光分析，接着通过共焦显微镜检术分析。依上述方法转染COS细胞，然后使细胞在甲醇中固定30～40小时并加工处理以检测VP22。初始结果表明，在大部分含VP22的细胞中，蛋白质存在于独特的核模式中，往往表现出在核边缘富集。图1a表示VP22的核模式的典型实例。但在一些细胞中，VP22呈完全不同的胞质的纤维状模式(图1b)。此时，检测到的蛋白质在胞质内呈网络状或笼形模式并被排除在细胞核外。这种分布不均一性虽然其自身并非异常，但对于本研究的其它HSV壳蛋白(VP16)未观察到该不均一性，它呈现的模式因细胞不同而略有不同，主要包括扩散胞质模式，少量存在于细胞核内。
进一步研究表明，VP22的胞质分布与核分布相互间不是无规的，即含胞质VP22的中心细胞周围被含核VP22的细胞晕圈环绕，后者细胞区中明显地富含该蛋白质，这些细胞毗邻含胞质VP22的中心细胞(图1c)。最后，单细胞层区(其中每个细胞中可检测到VP22)也呈现这种分布，在少量细胞中观察到胞质模式，在周围细胞中观察到核模式(图1d)。
最初是在COS细胞内进行这些实验的，它依靠SV40T-抗原复制本文所用的VP22表达质粒。尽管我们对于相同载体表达的其它蛋白质(例如前述VP16)未检测到这种分布，但我们希望排除这种可能性即VP22分布模式与COS细胞的应用有关。于是用Vero细胞和HeLa细胞进行了同样实验，并得出完全相同的结果。图2示出VP22在Vero细胞中的表达呈上述模式，其中含胞质VP22的中心细胞周围被含核VP22的细胞环绕。此时，可见VP22呈递降的密度梯度，从中心细胞至毗邻细胞具有稠密的核VP22，而相距更远的细胞核VP22密度更小。
这些意外结果指出，VP22从最初在其中合成并呈胞质形式的细胞中被转运至毗邻细胞，也被转运至再一次转移的细胞，其中它定位于细胞核。为了阐述VP22在细胞间的移动，研究了转染的时间过程。转染14小时后，可以在各个细胞中检测到VP22表达。在20小时，可见到含VP22的细胞灶，其中含稠密的VP22的中心细胞周围环绕数个含更低密度的VP22的细胞(图3a，较低的放大倍数以利于看清点的分布)，而38小时后实际上每个细胞中都含该蛋白质(图3b)。
作为VP22在细胞间被转运的另一个证据，用VP22表达载体，和pRG50(一种VP16表达载体)转染独立的两皿COS-1细胞。24小时后，每皿细胞用胰蛋白酶消化，再将两组细胞群混合后固定于盖玻片上。24小时后，可能检测VP16表达细胞，其细胞核内也含有VP22，这表明从未暴露于VP22表达载体的细胞已摄取VP22蛋白。
胞间转运需要VP22内的C端决定子。
为开始鉴定VP22内的需要，我们测试了含短链(3-4个氨基酸)的符合读框的***物的一组变体和缺残基267至该蛋白末端(残基301)的缺失突变体。***突变体在位置60、159、192和267上含***物。在***突变体Ins60、Ins159或Ins267中，任何一个都不影响VP22定位的模式或者其进行胞间转运的能力(数据未显示，均与野生型相同)。然而在位置192上的***具有显著影响。该突变体表现的分布模式类似于从野生型见到的胞质分布；于是，未观测到毗邻细胞中的核染色，总体观测到更少的阳性细胞，而且在VP22阳性细胞中模式全是胞质的(图3c)。
对于缺乏C端34个残基267-301的缺失突变体观测到完全相同的表型(图3d)。应注意在位置267上的***突变体是正常的。分布模式显示全为胞质VP22和267-301缺失突变体和***突变体192没有转运至周围细胞，这并非由于无效合成。当用蛋白质印迹比较总的合成时，观测到相似量的w/t和突变型蛋白质。
为开始提出这种可能性，即胞间转运性能可用于转运其它肽或蛋白质，我们测试了VP22的一种变体(VP22ep)是否也能被转运，该变体在其C端末端含12个残基延伸(它含有单克隆抗体识别位点)。结果表明，该延伸蛋白被有效地转运。事实上，阐述Vero细胞中转运的图3b用到该C端延伸变体。如上所述，含中心胞质VP22ep的细胞灶周围环绕含核VP22ep的细胞，而且，至于w/t蛋白质，其实可在单细胞层的每个细胞中检测到VP22的表达。此外，被检测到的蛋白质就是融合蛋白，而不是某些偶然的缺失产物，因为它可用抗VP22抗体p43或C端肽延伸的抗体检测。这一重要结果表明，确实可以通过将肽或蛋白质与合适的转运蛋白如VP22连接而促使它们递送至细胞。
本领域技术人员可以惯常地应用这些或者其它定点诱变方法来定位或精修对于转运性能至关重要和/或重要的VP22中决定子，因而能够应用VP22片段而不是全长蛋白质。
从介质摄取VP22。
虽然在细胞表面易于检测VP22，但我们还不能检测已转染细胞的介质中的VP22。然而为检验VP22被从胞外介质输入的能力，将从VP22表达细胞制备的可溶性提取物加入未转染细胞介质。VP22被高效和迅速地输入并定位于细胞核(见图5(a))，加入介质后5分钟内被摄取(可解释我们未能在介质中检测它)。摄取机理不受4℃下培养作用的影响，说明不是通过正常的胞吞作用内在化。在对照实验中，对于所试验的其它任何蛋白质均未观测到从介质摄取。
将含全长(WT)或者截短(△267)VP22的可溶性提取物加入覆盖盖玻片上生长的COS-1细胞的介质，1小时后固定细胞。还通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析等量的提取物。
为制备可溶性提取物，用全长或△267 VP22表达载体转染一百万个COS-1细胞，16小时后收集细胞，将提取物调和于10mMHEPES(pH7.9)、400mM NaCl、0.1mM EDTA、0.5mM DTT和5％甘油中。然后将一半提取物加入覆盖生长于盖玻片上5×105个COS-1细胞的介质，1小时后固定细胞，利用多克隆抗VP22抗体进行免疫荧光分析(见图5(a)和5(b))。分析1/10的所述提取物是在10％丙烯酰胺凝胶上进行电泳，接着用单克隆抗体P43进行蛋白质印迹分析(见图5(c))。
此外，虽然在可溶性提取物中存在与全长VP22等量的VP22缺失突变体△267(见图5(c)，△267)，但在细胞间未检测出，表明该过程需要C端34个残基(图5(b))。
为了进一步研究，我们制备了相应于该C端34个残基的肽并续上一个12个残基的标记以便于免疫检测。将此肽应用于细胞介质后，它可进入细胞并被转运至细胞核(图6b)。这些实验表明，这些C端34个残基是a)所需的和b)足以引起转运。
转运融合蛋白
虽然如上所述，我们已阐明可将肽融合至VP22而转运，但尚不知道多大的蛋白质可与VP22融合以便利转运。
用质粒pGE109、△267或VP22-GFP转染6mm皿中的COS-1细胞，VP22-GFP的构建是将UL49开放读框***质粒pGFP-N1(Clontech)的BamH1位点，得到VP22与绿荧光蛋白(GFP)的N端的融合体。转染40小时后收集细胞，制备高含盐量提取物。这些提取物的蛋白质印迹表明，虽然提取物中存在等量的全长VP22和VP22的△267变体，但22-GFP蛋白质的含量约小5倍。将等量的各提取物加入覆盖盖玻片上COS-1细胞的介质，放置1小时，然后在100％甲醇中固定。用AGV30进行免疫荧光分析。结果示出(图6a)，可在受体细胞中检测到VP22-GFP融合蛋白，而且它已积累于细胞核内。
总之，我们已证实能获得表达融合蛋白的细胞提取物，其中连接的蛋白质是32Kda，而且将该提取物应用于细胞介质后，可检测细胞核内的融合蛋白。
显微注射VP22
虽然通过转染而转运适用于组织培养应用中，但在组织或病人中递送可能不是真正有效的途径。
显微注射(还有脂质体递送)被用于活体内且它还适用于阐述通过活体内实用的递送途径的VP22转运。
用100ng/μl pGE109和100ng/μl pBAG混合物作为注射细胞用的标记物(PNAS 84:156-160)显微注射铺板于盖玻片上的COS-1细胞，应用Carl Zeiss半自动手工操作型显微注射器。将细胞培养24小时，于100％甲醇中固定，应用多克隆抗VP22抗体AGV30(1∶500)和单克隆抗β-半乳糖苷酶(1∶50)(Promega)进行双免疫荧光分析。图7a示出用β-gal的抗体染色的一个显微注射细胞视野的代表图。在这些细胞的相同视野内，不但在显微注射细胞内而且在很多非注射细胞内可见到VP22(图7b)。因此，该递送途径可用于活体内通过显微注入例如肿瘤中心以递送VP22或其变体。当然，其它递送途径也同样可行，这里只是阐述一种直接途径。目前，应用两种主要途径递送基因，即脂质体介导的感染和病毒感染。因此，可以把VP22或各种修饰物(包括融合蛋白)的基因掺入脂质体载体供活体内递送。同样，脂质体递送也可用于组织培养***。也可将VP22或其变体的基因***例如腺病毒或逆转录病毒的基因组以传递感染。在两种情况下，将在初始转染或感染细胞群中表达，但VP22将被递送至周围细胞内。这特别适用于通过设计成不复制的缺损病毒载体(disabled virus vectors)的递送。该场合的递送将会增强。直接显微注射基因或者直接应用裸DNA也是本领域中正在研究的方法。
转运VP22至不同种细胞
我们已进一步证实了VP22可从初始表达它的细胞被转运至不同种细胞。
用被PUC19 DNA从1μg配成4μg的pGE109转染60mm板中的COS-1细胞。转染24小时后用胰蛋白酶消化除去细胞，再与先被胰蛋白酶消化的BHK-21细胞(仓鼠)以1∶20的比率混合。将该细胞混合物铺板于6孔板中的盖玻片上，再进一步培养20小时，然后在100％甲醇中固定。应用AGV30(1∶500)和单克隆抗T抗原pAB419(纯净的)进行双免疫荧光分析以鉴定COS-1细胞(J.Vi-rol.39:861-869)。
图8示出混合细胞的典型视野，其中可见T抗原阳性COS细胞(图6a，左边栏)，周围的BHK细胞当然未被T抗原抗体检测到)，而在图8b右边栏中是VP22阳性细胞，即中心COS细胞和周围的未转染BHK细胞均可见。
VP22的DNA结合性能
我们已证实，在VP22在核内的细胞中，它在有丝***期间与浓缩染色体结合。这表明有丝***期间与染色体的强烈结合，且说明一旦VP22或其变体被摄入细胞，它们也在***后被传给子细胞。这性能使VP22更适用于递送。此外我们已证实，在体外，VP22具有非专一性DNA结合性能，这可能(至少部分地)解释活体内染色质结合。综合这两种现象得知VP22有可能结合DNA和递送DNA/基因至细胞核。
分析期间我们发现，一部分核内含VP22的细胞中该蛋白质的模式类似于有丝***染色质的模式。对VP22和DNA的细胞双染色表明，对于有丝***各阶段的细胞均可检测出VP22定位于浓缩染色体周围(图9a)。为测定VP22是否能与DNA直接作用，我们通过凝胶阻滞分析测试了GST-VP22融合蛋白结合40bp寡核苷酸探针的能力。对于GST-VP22观测到3种复合体的出现随剂量增大而增强(图9b)，在GST对照组中未存在该现象。尺寸更大的复合体可能表示该蛋白质的多聚化，因为所形成的最大一个对于更短的探针结合效果差(未显示)。此外，VP22能结合一系列DNA探针，说明该蛋白质与DNA以非专一性方式作用。
VP22在病毒感染的细胞内转运
基因治疗中递送基因的主要途径之一是应用病毒来进行。这类病毒一般在某些方面无功效以至它们低效复制或完全不能复制。希望限制复制以防止病理方面的并发症。病毒载体的安全性是基因治疗中的主要问题，研究人员作出很大努力试图开发严格缺损的病毒。但应用缺损病毒的缺点在于：目的基因只能被递送至初始感染的细胞。
我们意在直接证实VP22可从病毒感染的细胞被转运至未感染的细胞。为此，我们用缺损的单纯疱疹病毒突变体HSV-1[gH-ve]感染细胞。该病毒缺乏病毒糖蛋白gH必需的基因，且必需在含gH的特化互补细胞系上繁殖。但当该病毒感染非互补细胞(即不含病毒gH的任何细胞类型)时，该病毒能渗入初始细胞群、合成病毒蛋白(gH除外)和装配病毒粒子，但这些都是非感染性的。未发生第二轮感染。我们想证实VP22可从初始用HSV-1[gH-ve]病毒突变体感染的细胞转运(Desai,P.J.等，J Gen Virol 69(pt 6):1147-56(1988)；Forrester,A.等，J Virol 66:341-8(1992)U.Gompels & A.Minson Virology 153:230-47(1986))。在大约0.2pfu/细胞的感染复数下用HSV-1[gH-ve]感染Vero细胞。因而大约5个细胞中有一个开始时将被感染。感染24或66小时后使细胞在甲醇中固定，再估测VP22或β-半乳糖苷酶的存在。应注意，该病毒含β-半乳糖苷酶的基因，而且存在的β-半乳糖苷酶用作初级感染细胞的标记物。结果示于图10。
图10a示出对β-半乳糖苷酶染色、感染24小时后的视野。
图10b示出对VP22染色的相同视野。
图10c示出对β-半乳糖苷酶染色、感染66小时后的视野。
图10d示出对VP22染色的相同视野。
图10a中用箭头标出了表达β-半乳糖苷酶的两个细胞。注意周围的细胞缺乏β-半乳糖苷酶。在对VP22染色的相同视野(图10)中，这两个细胞也是VP22阳性的(大箭头)，但还检测到几个周围细胞含VP22(小箭头)，它们是β-半乳糖苷酶阴性的。
在图10c(感染66小时后)中示出的3个细胞也是β-半乳糖苷酶阳性的(大箭头)。在对VP22染色的相同视野(图10d)中，这3个细胞是阳性的，但周围其它细胞是β-半乳糖苷酶阴性的因而未感染，不过含有VP22，它已积聚于细胞核内(小箭头)。注意尽管在3个中心阳性细胞中浓染色，最后的这些细胞完全缺乏可检测的β-半乳糖苷酶。
结果表明，VP22可从病毒感染细胞转运。这不只是疮疹病毒感染的性质，因为VP22可从转染的细胞或显微注射的细胞转运。因此，转运不需其它任何疮疹病毒编码的蛋白质，于是应用任何病毒载体如腺病毒或逆转录病毒都几乎肯定会发生转运。
这样我们直接证实了VP22从病毒感染细胞转运的原理依据。很容易预测，含目的基因的融合蛋白可通过与VP22的基因或其活性部分连接而被构建，并在基本上有效的或组织专一性的启动子控制下被***病毒载体。随后该融合蛋白可被递送至比初始感染的细胞群要大得多的细胞群。
讨论
上还结果表明，VP22表现出相当独特的性能，因为它被有效地从初始表达它、而且它在其中表现为胞质定位的细胞转运至细胞单层中毗邻细胞，在那里它被细胞核摄取。在我们试验过的一系列蛋白质中，对于其它任何蛋白质均未观测到这种行为模式，而且以前从未阐述过这种活性。于是，例如VP16也是在细胞胞质中表达的，但它的表达模式在表达细胞群中是完全均匀的，而且它未被转运至毗邻细胞。这种差异和VP22的这种意外的性能从如下结果得以证实即，当VP22或VP16被引入细胞单层大约30小时后，虽然VP16能在平均约2-5％的细胞中被检测到，但VP22能在单层的每个细胞中被检测到。
本工作还证明了VP22胞间转运的专一性，并证明了该蛋白质C端包含一个决定子，因为缺乏C端34个氨基酸的变体虽然在初始表达细胞内胞质定位中被表达，但未被转运至毗邻细胞。这些实验表明，VP22的胞间转运可在一些不同种细胞包括COS-1细胞、Vero细胞和HeLa细胞中进行，即该现象对其中最初观察到该现象的COS细胞不具有专一性。
蛋白质分泌或外排通常经过特定途径发生，要求完全鉴定的信号序列以分选入外排途径中包括的区室和载体。在蛋白质分泌的主要机制之一中，信号序列通常残留于蛋白质的N端末端，被7S RNA和至少6个多肽的复合体识别，其中复合体的组分一起包括信号识别颗粒(SRP)。由SRP识别后接着在内质膜中停靠和将信号肽传递给受体。然后该出现的多肽通过ER膜排出，接着通过在Golgi网络中相互作用和小泡装配的复杂网络进行处理。VP22不具备任何惯常的信号序列，而且它在胞质内的分布模式与ER分布或Golgi分布不相似。
已有少量有关哺乳动物蛋白质通过非经典途径分泌的现有实例，例如包括细胞因子白细胞介素1α和1β，以及碱性和酸性成纤维细胞生长因子(7)。输出这类成分的一种可能性是通过ABC-转运蛋白***。这些蛋白质包括依赖于ATP的蛋白质和膜结合蛋白质，它们含跨膜螺旋。它们包括于蛋白质专一性结合中和转运穿过膜并在细菌***中已被最完全鉴定。然而，迄今尚无有关任意哺乳动物ABC-转运蛋白在蛋白质分泌中的作用的直接证据。
还有，虽然某些蛋白质是通过非经典途径被分泌的，但VP22分泌的模式极为独特。由于不想受任何具体理论的束缚，对于我们的结果的最简单解释是这样的：VP22被分泌后就被靶细胞的核摄取并在其中浓缩。又一次地，虽然该蛋白质的预计分子量为32k，但VP22中没有明显的核定位信号，所以它无需专门的信号就能进入细胞核。对于VP22内所需决定子和细胞内生理需求的进一步研究将会有助于阐明所包括的途径，而对于VP22如何被分泌的理解将有助于理解其它蛋白质在非经典输出途径中是如何被转运的。
这些结果揭示了有可能应用VP22转运中涉及的决定子来使其它蛋白质或与VP22决定子相关的其他分子在靶细胞群中被转运、有效表达或摄取。我们业已证实，短肽(12个残基)可与VP22连接且该融合蛋白仍能被转运至单层的每个细胞中。该结果表明，确实易于通过将肽与VP22连接而促使肽的传递。
此外，我们已证实大型蛋白质(32Kd)与VP22连接后可从细胞介质被输入细胞，并看到它在细胞核内积聚。
容易预测这种能力的广泛应用。例如有可能将DNA结合蛋白质与VP22决定子连接，使得当递送至靶细胞群后，它们将在大得多的细胞群中被有效地表达。
其它应用包括：
宿主加强免疫响应需要共同刺激分子和细胞因子
疫苗开发领域的近期资料着重于对共同刺激分子和细胞因子的需求，以使疫苗有效地作用以加强细胞水平的宿主免疫响应。肿瘤细胞不在其细胞表面表达共同刺激分子，这就是为什么在宿主中没有CTL(细胞毒性T细胞)的克隆扩充的原因，导致病人没有药物介入就不能使肿瘤收缩。
直接刺激宿主中的细胞毒性T细胞响应
递送具有抗癌性能的外源蛋白至细胞核。外源蛋白可能是已知能引起对肿瘤的免疫(T细胞)响应的肿瘤特异抗原。
该外源蛋白可与VP22分子一起直接递送至细胞核(这也会模拟病毒感染-见注释)。然后该外源蛋白在细胞的蛋白体中会断裂成肽。如果接着进行经典的T细胞引入途径，则肽被导向通过细胞的ER和高尔基体并与MHC-Ⅰ型分子结合呈现于细胞表面。加强病人中CTL响应对于非癌治疗，尤其是由病毒感染引起的疾病有显著作用。认为在宿主中引起强烈的CTL响应可导致体内病毒的消除，近期已获得科学证据。
用待导向的蛋白质/抗原加强递送MHC分子的免疫响应
有可能通过导向抗原加HLA分子来解决细胞群中MHC限制性并加强细胞的响应的问题。该应用也会具有非癌用途。
信号转导途径的调节
很多信号转导途径是通过如下方法进行的：转移环境信号、激素、将配体与膜结合、胁迫(DNA损伤、热渗透的等等)细胞核以引起基因表达变化。可以通过将蛋白质或肽与信号分子偶合而应用VP22介导这种信号。递送融合蛋白或相应基因将会增强信号，因为融合体也是输出至相邻细胞。例如，将VP22与质膜相关性信号效应子的显性突变体(例如小GTP酶及其效应子或编程性细胞死亡(apoptotic)调节分子)融合可能实现所需途径，不但可在存在该基因的受体细胞内实现，还能在没有该基因的周围细胞中实现。可设想调节信号转导途径的多种变化形式。
VP22在体外与DNA结合的能力和VP22在有丝***期间与浓缩染色体结合的能力可应用于基因/DNA治疗。该应用有如下几种形式：
a)病毒感染，其中VP22或其突变体的基因被***腺病毒或逆转录病毒的基因组以传递感染。同样，也可***所需蛋白质的基因从而可表达包括VP22和目的蛋白质的融合蛋白。然后VP22就能递送目的蛋白质至周围细胞群。这样，可使这类病毒的量减少因而降低病毒感染的危害。
b)将编码VP22(或其变体)的核酸和目的蛋白质直接显微注入细胞，于是一旦表达，VP22就能将目的蛋白质转运入周围细胞群。
c)脂质体介导的感染，其中VP22的基因或包括融合蛋白的各种修饰物被掺入脂质体载体以供活体内递送。
对技术人员而言，将DNA引入细胞的其它方法是显而易见的，例如，直接划痕(direct scarification)，其中DNA直接被组织摄取；受体介导的DNA转化；磷酸钙介导的转染；和弹道式递送(ballistic de-livery)。
有效递送功能分子是基因/蛋白质治疗中所期望的。该机制的另外优点在于，表达VP22的基因将只存在于小群细胞中，而蛋白质存在于大得多的细胞群内。当需要考虑递送基因的可能有害效果时，这将是有用的因素。低基因递送量同时保持较大功能性蛋白递送量是所期望的。实际上可预测，需要或者希望有效表达试验蛋白质的任何应用都可运用VP22递送机制。递送肿瘤抑制蛋白、酶等等。我们还已证实有可能将核酸与VP22结合，因此，除了DNA之外也可以递送反义RNA核酸等等。参考文献1．Blaho,J.A.,C.Mitchell，和B.Roizman.1994.由单纯疮疹病毒1α调节蛋白0、4、22和27共享的氨基酸序列预示UL21、UL31、UL47和UL49基因产物的核苷酰化(nucleotidylylation)。J.Biol Chem269:17401-10。2．Blair,E.D.，和R.W.Honess.1983.由herpes virus saimiri专一化的DNA结合蛋白。J.Gen.Virol.64:2697-2715。3．Chen,C.，和H.Okayama.1987.用质粒DNA高效转化哺乳动物细胞。Mol.Cell Biol.7:2745-2752。4．Elliott,G.D.，和D.M.Meredith.1992。由基因UL49编码单纯疮疹病毒-1型壳蛋白VP22。J.Gen．Virol.73:723-6。5．Greaves,R.F.，和P.OHare.1990。对于同细胞八聚体结合蛋白序列和靶TAATGARAT序列作用的单纯疮疹病毒-1型反式激活蛋白Vmw65的结构要求。J.Virol.64:2716-2724。6．Haarr,L.，和S.Skulstad.1994。单纯疮疹病毒-1型粒子：结构和分子功能。论文综述。Apmis 102:321-46。7．Klucher,K.1993.蛋白质分泌的独特途径：简易分泌方式。Trendsin Cell Biol.3:421-426。8．Knopf,K.W.，和H.C.Kaerner.1980.与单纯疮疹病毒-1型(HSV-1)粒子结合的病毒特异性碱性磷蛋白和HSV-1感染的细胞的染色质。J.Gen.Virol.46:405-414。9．Meredith,D.M.,J.A.Lindsay,I.W.Halliburton，和G.R.Whit-taker。1991.通过糖基化作用和磷酸化作用对单纯疮疹病毒-1型的壳蛋白(VP13和VP14)的翻译后修饰。J.Gen.Virol.72:2771-5。10．Pinard,M.F.,R.Simard，和V.Bibor-Hardy.1987.单纯疮疹病毒-1型感染的BHK细胞核基质的DNA结合蛋白。J.Gen.Virol.68:727-35。11．Preston,C.M.，和E.L.Notarianni.1983.单纯疮疹病毒立即早期多肽的聚(ADP-核糖基)化作用。Virol.131:492-501。12．Rothman,J.E.1994。胞内蛋白质转运的机制。Nature.372:55-63。

Claims (18)

1．VP22或者其活性部分、片段或同源物作为能被靶细胞群摄取的转运蛋白的应用。
2．权利要求1的应用，其中转运蛋白至少包括VP22的C端34个氨基酸。
3．权利要求1或权利要求2的应用，其中转运蛋白与一个或多个需要转运至靶细胞群的其它分子结合。
4．权利要求3的应用，其中的一个或多个相关分子是非肽基分子。
5．前述权利要求任一项的应用，其中的蛋白质还能从表达它的靶细胞群的第一部分输出，并被不直接产生该蛋白质的靶细胞群的第二部分摄取。
6．转运蛋白质，它包括VP22或者其活性部分、片段或同源物，该蛋白质结合需要转运至靶细胞群的一个或多个其它分子。
7．权利要求6的转运蛋白，其中的一个或多个相关分子是非肽基分子。
8．权利要求6或权利要求7的转运蛋白，其中的蛋白质还能从表达它的靶细胞群的第一部分输出，并被不直接产生该蛋白质的靶细胞群的第二部分摄取。
9．核酸，它编码权利要求6、7和8中任一项的转运蛋白。
10．表达载体，它包括权利要求9的核酸。
11．哺乳动物或微生物宿主细胞，它包括权利要求10的载体或权利要求9的核酸。
12．转运所需蛋白质或肽至靶细胞群的方法，该方法包括：
ⅰ)将权利要求9或权利要求10的核酸或载体引入靶细胞群的第一部分；
ⅱ)表达该核酸而产生蛋白质，随后从细胞中输出该转运蛋白，连同与之结合的其它任何蛋白质，而被不直接产生该蛋白质的靶细胞群的第二部分摄取。
13．权利要求12的方法，其中通过重组病毒将核酸引入靶细胞群的第一部分。
14．权利要求12的方法，其中通过转染将核酸引入靶细胞群的第一部分。
15．权利要求12的方法，其中通过显微注射将核酸引入靶细胞群的第一部分。
16．将所需分子转运至细胞群的方法，该方法包括：
ⅰ)将所需分子与包括VP22或其活性部分、片段或同源物的转运蛋白偶联而形成复合体；和，
ⅱ)使细胞与该复合体接触使细胞能摄取该复合体。
17．权利要求16的方法，其中所需的分子是非肽基分子。
18．权利要求16或权利要求17的方法，其中通过掺入脂质基载体而将所需分子与转运蛋白偶联。
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