ES2296419T3 - Reactivos de transfeccion. - Google Patents
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Abstract
Elemento de contacto con un terminal de tornillo para conductores eléctricos, presentando el elemento de contacto una pieza de conexión de conductor, que está provista de un taladro en el que el conductor puede insertarse y aprisionarse mediante un tornillo que puede atornillarse en la pieza de conexión de conductor, en un taladro roscado, transversalmente al eje del taladro o del conductor, estando prevista en el taladro, entre el conductor y el extremo del tornillo que está orientado hacia el conductor, una chapa protectora de hilo (9), que está configurada en esencia en forma de L y presenta un pie acodado (11), y estando la chapa protectora de hilo (9) insertada en el taladro (6) de tal modo que el pie (11) se halla en el fondo del taladro, caracterizado porque el pie (11) está provisto de unos elementos conformados laterales (12) en forma de garfio que, al insertar la chapa protectora de hilo (9), se entierran en la pared del taladro (6) y porque la chapa protectora de hilo (9) puede girar un poco a modo de un soporte pivotante alrededor de un eje (X) formado por los elementos conformados (12).
Description
Reactivos de transfección.
La presente invención está relacionada con
lípidos catiónicos y composiciones de lípidos catiónicos que tienen
utilidad en los agregados de lípidos para administrar macromoléculas
y otros compuestos a las células.
Se ha descubierto que los agregados de lípidos,
como los liposomas, son útiles como agentes de administración para
introducir macromoléculas (como ADN, ARN, proteínas y pequeños
compuestos químicos como productos farmacéuticos) en las células.
En particular, se ha demostrado que los agregados de lípidos
contienen componentes lípidos catiónicos que son especialmente
eficaces para administrar moléculas aniónicas a las células. En
parte, se cree que la eficacia de los lípidos catiónicos es
resultado de una mayor afinidad para las células, muchas de las
cuales tienen una carga neta negativa. También en parte, la carga
neta negativa de los agregados de lípidos que contienen un lípido
catiónico permite que el agregado una polianiones, como los ácidos
nucleicos. Se sabe que los agregados de lípidos que contienen ADN
son agentes eficaces para una transfección eficiente de células
diana.
La estructura de los distintos tipos de
agregados de lípidos varía en función de la composición y método de
formación del agregado. Esos agregados incluyen liposomas, vesículas
unilamelares, vesículas multilamelares y similares, con tamaños
particulares que oscilan entre el nanómetro y el micrómetro. En la
técnica son bien conocidos los métodos para hacer agregados de
lípidos. El principal inconveniente de utilizar liposomas que
contengan fosfolípidos convencionales para la administración es que
el material que se va a administrar debe estar encapsulado y la
composición de liposoma tiene una carga neta negativa que no es
atraída hacia la superficie celular cargada negativamente.
Combinando compuestos de lípidos catiónicos con un fosfolípido, con
vesículas cargadas positivamente y con otros tipos de agregados de
lípidos que puedan unir ADN (el cual está cargado negativamente),
pueden ser absorbidos por las células diana y pueden transfectar
células diana (Felgner, P.L. et al., (1987) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:7413-7417; Eppstein, D. et
al., US Patente nº 4.897.355).
Un lípido catiónico muy conocido es
N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio
cloruro (DOTMA). La estructura del DOTMA es:
DOTMA, por si mismo o en combinación 1:1 con
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), se formula a liposomas
utilizando técnicas estándares. Felgner et al. supra
demostraron que esos liposomas proporcionaban una administración
eficaz de ácidos nucleicos a algunos tipos de célula. Una
formulación DOTMA:DOPE (1:1) se vende bajo el nombre comercial de
LIPOFECTIN (Life Technologies, Inc., Rockville, MD). Otro lípido
catiónico disponible en el mercado es
1,2-bis(oleoiloxi)-3-3(trimetilamoníaco)propano
(DOTAP), el cual sólo se diferencia del DOTMA en que las fracciones
oleoil están ligadas vía éster, en lugar de enlaces éter a la
propilamina. Un grupo relacionado de compuestos se diferencia de
DOTMA y de DOTAP en que uno de los grupos metil del grupo
trimetilamonio es sustituido por un grupo hidroxietil. Los
compuestos de este tipo son similares al Inhibidor Rosenthal (RI)
de fosfolipasa A (Rosenthal, A.F., y Geyer, R.P. (1960) J. Biol.
Chem. 235:2202-2206) que tiene ésteres de estearoil
ligados al núcleo de propilamina. Los análogos dioleoil de RI se
abrevian habitualmente como DORI-éter y DORI-éster, dependiendo del
enlace de las fracciones de ácido graso con el núcleo de
propilamina. El grupo hidroxi se puede utilizar como sitio para
funcionalización adicional.
El análogo dimiristiloxi de RI se conoce como
DMRIE. Con el nombre comercial DMRIE-C (Life
Technologies, Inc., Rockville, MD) se vende una formulación 1:1
(M/M) de DMRIE:colesterol. La estructura de DMRIE es:
Otra clase de compuestos ha sido revelada por
Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci, USA
86:6982-6986; publicación EPO 0 394 111 (24 de
octubre de 1990) en los que se ha conjugado carboxiespermina con dos
tipos de lípidos. La estructura de
5-carboxiespermilglicina dioctadecilamida (DOGS)
es:
La estructura de
dipalmitoilfosfatidiletanolamina
5-carboxiespermilamida (DPPES) es:
DOGS y DPPES se han utilizado para recubrir
plásmidos, formando un complejo de agregado de lípidos que
proporciona una transfección eficaz. Se afirma que los compuestos
son más eficaces y menos tóxicos que DOTMA para la transfección de
algunas líneas celulares. DOGS está disponible comercialmente como
TRANSFECTAM^{TM} (Promega, Madison, Wis.).
También se ha descrito otra clase de compuestos
en los que se ha conjugado carboxiespermina con lípidos vía un
enlace amida (Gebeyehu, G. et al., US Patente nº 5.334.761).
Estos compuestos son útiles para una administración eficaz de
ácidos nucleicos a diversas células y también intermedia para hacer
otros de esos lípidos.
2,3-di-oleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propano-aminio
(DOSPA) está disponible como una formulación 3:1 (agua/agua) con
DOPE con el nombre comercial LipofectAMINE (disponible en Life
Technologies, Incl., Rockville, MD). La estructura de DOSPA es la
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
También se han descrito compuestos lípidos con
un grupo cabeza espermina (Haces, A., et al., US Patente nº
5.674.908). Estos compuestos son especialmente útiles para
administrar ácidos nucleicos a células de insectos. Una formulación
1:1,5 (M/M) de tetrametiltetrapalmitil espermina
(TM-TPS) y DOPE está disponible en el mercado con
el nombre comercial CellFECTIN (Life Technologies Inc., Rockville,
MD). La estructura de TM-TPS es la siguiente:
Un derivado de colesterol catiónico
(DC-Chol) ha sido sintetizado y formulado en
liposomas en combinación con DOPE (Gao, X. y Huang. L (1991)
Biochim. Biophys. Res. Comm. 179:280-285). La
estructura del compuesto es:
Se afirma que los liposomas formulados con
DC-Chol proporcionan una transfección más eficaz y
menor toxicidad que los liposomas que contienen DOTMA para algunas
líneas celulares.
Se ha informado que la lipopolilisina, formada
mediante conjugación de polilisina a DOPE, es especialmente eficaz
para la transfección en presencia de suero, una condición que es
probable encontrar in vivo (Zhou, X., et al. (1991)
Biochim. Biophys. Acta 1065: 8-14).
WO 97/42819 describe otros tipos de lípidos
catiónicos para la transfección de ácidos nucleicos al interior de
células.
US 5.744.335 describe un método de transfección
de una célula con un polinucleótido mezclado con uno o más
compuestos amfipáticos y una proteína de unión de AND como H1, H2A o
H2B. Los compuestos amfipáticos descritos incluyen compuestos
amfipáticos catiónicos que tienen una fracción poliamina no natural
y fracción hidrofóbica.
McCluskie et al., Antisense & Nucleic
Acid Drug Development (1998), 8(5), páginas
401-414, describe transferencia directa de ADN al
interior del sistema respiratorio de ratones utilizando ADN desnudo
y formulado como lípido. Los lípidos descritos incluyen análogos de
tetrametiltetraalquilespermina y formulaciones de
DMRIE/colesterol.
EP 0846680 describe otros lípidos catiónicos
para administrar ácidos nucleicos a células, en particular, lípidos
guanidino.
UR 5.830.430 describe lípidos catiónicos para
administrar materiales bioactivos como ácidos nucleicos y compuestos
farmacéuticos a células, en particular, células que contengan como
mínimo dos grupos catiónicos.
WO98/40502 describe composiciones que comprenden
péptidos y agentes de transfección como lípidos catiónicos y
polímeros dendrímeros para la transfección de células eucarióticas.
Los péptidos se pueden acoplar a los agentes de transfección.
WO 98/40499 describe métodos y composiciones
para la transfección de mucosa epitelial múrida con complejos de
ácido nucleico/lípido catiónico.
WO 98/02190 describe anfifilas catiónicas que
facilitan el transporte de moléculas biológicamente activas
(incluyendo polinucleótidos) a las células. Las anfifilas catiónicas
contienen grupos lipofílicos derivados de esteroides, mono o
dialquilaminas, grupos alquil o acil y grupos catiónicos derivados
de aminas, alquilaminas o polialquilaminas.
FR 1567214 describe un detergente para uso en
lavadoras que contiene moléculas catiónicas.
A pesar de los avances en el campo, sigue
existiendo la necesidad de una variedad de compuestos de lípidos
catiónicos mejorados. En particular, hasta la fecha no se ha
encontrado ningún lípido catiónico sencillo que funcione bien con
todo tipo de células. Como los distintos tipos de célula se
diferencian entre sí por la composición de la membrana, no es
sorprendente que diferentes composiciones y tipos de agregados de
lípidos sean eficaces para diferentes tipos de célula, bien por su
capacidad para entrar en contacto y fundirse con la membrana de las
células diana, o por aspectos del propio proceso de transferencia.
En la actualidad, estos procesos no son bien entendidos y en
consecuencia, el diseño de precursores liposomiales eficaces es en
gran medida empírico. Además del contenido y la transferencia hay
otros factores de importancia, por ejemplo, la capacidad para
formar agregados de lípidos idóneos para el propósito pretendido, la
posibilidad de transfección de células en presencia de suero,
toxicidad para la célula diana, estabilidad como portador para el
compuesto que se va a administrar y la capacidad para funcionar en
un entorno in vivo. Además, los agregados de lípidos se
pueden mejorar ampliando la gama de sustancias que se pueden
administrar a las células. Los compuestos de lípidos catiónicos de
la presente invención tienen un mejor funcionamiento en relación con
varios de los anteriores atributos.
Un compuesto de fórmula:
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de
unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6},
independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H
y C_{8}-C_{24} alquenil,
C_{8}-C_{24} aril y
C_{8}-C_{24} alquil opcionalmente sustituidos
por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter,
poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o
carbamoil,
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3},
R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o
ramificado o un grupo aril.
X' es un anión aceptable fisiológicamente
a es el número de carga positiva dividido por la
valencia de X
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan
los requisitos de valencia del nitrógeno, y
R_{7} y R_{8} son H.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de la invención son útiles, en
solitario o en combinación con otros componentes que formen
agregados de lípidos (p.ej., DOPE, DOPC o colesterol), para su
formulación en liposomas u otros agregados de lípidos. Esos
agregados son policatiónicos capaces de forma complejos estables con
macromoléculas aniónicas, como ácidos nucleicos. El complejo
macromolecular de agregado de lípidos interactúa con las células,
poniendo las macromoléculas polianiónicas disponibles para
absorción y asimilación por la célula.
La presente invención proporciona un agregado de
lípidos que comprende uno o más de los compuestos de la presente
invención. Preferentemente, el agregado de lípidos comprende como
mínimo un compuesto de formación de agregados de lípidos.
Preferentemente, el compuesto de formación de agregados de lípidos
se selecciona del grupo formado por DOPE, DOPC y colesterol.
Los compuestos de la presente invención también
se pueden conjugar o mezclar o utilizar en conjunción con diversas
moléculas y sustancias útiles, como proteínas, péptidos, factores de
crecimiento y similares para mejorar la selección de la célula
(cell targeting), la absorción, internalización, la selección
nuclear y la expresión.
Esta invención incluye también agregados de
lípidos que comprenden uno o más compuestos de la presente invención
o mezclas de ellos. Esos agregados de lípidos se pueden combinar
con uno o más componentes de formación de agregados o potenciadores
de la transfección.
Los métodos de transfección que aquí se revelan
que emplean los compuestos o composiciones (como los descritos
anteriormente) de la presente invención, o mezclas de ellos, se
pueden aplicar a la transfección in vitro de células, en
particular, para la transfección de células eucarióticas o tejidos,
incluyendo células de animales, células humanas, células de
insectos, células de plantas, células de aves, células de peces,
células de mamíferos y similares.
En concordancia, la presente invención
proporciona un método para introducir un polianión en una célula o
células, método que comprende la formación de un liposoma a partir
de un compuesto cargado positivamente de acuerdo con la invención,
poniendo en contacto el liposoma con el polianión para formar un
complejo polianión-liposoma cargado positivamente e
incubar el complejo con una célula o células.
Los métodos que aquí se revelan se pueden
utilizar para generar células transfectadas o tejidos que expresen
productos génicos útiles. Los métodos que aquí se revelan se pueden
utilizar también como paso en la producción de animales
transgénicos. Los métodos que aquí se revelan son útiles en
cualquier método terapéutico que requiera la introducción de ácidos
nucleicos en células o tejidos. En particular, estos métodos son
útiles en el tratamiento del cáncer, en terapia génica ex
vivo y en métodos de diagnóstico. Véase, por ejemplo, la patente
US nº 5.589.466 de Felgner, et al. Los compuestos o
composiciones de transfección de la presente invención se pueden
emplear como reactivos de investigación en cualquier transfección de
células o tejidos que se realice a efectos de investigación. Los
ácidos nucleicos que se pueden transfectar con los métodos de la
presente invención incluyen ADN y ARN de cualquier origen que
comprendan bases naturales o bases no naturales, e incluye aquéllos
que codifiquen y sean capaces de expresar proteínas terapéuticas o
de otra forma proteínas útiles en células o tejidos, aquéllos que
inhiban la expresión de ácidos nucleicos en células o tejidos,
aquéllos que inhiban la actividad enzimática o que activen enzimas,
aquéllos que catalicen reacciones (ribozimas) y aquéllos que
funcionen en ensayos de diagnóstico.
Los compuestos, composiciones y métodos que aquí
se facilitan también se pueden adaptar fácilmente en vista de las
revelaciones del presente documento para introducir sustancias o
macromoléculas activas biológicamente distintas a ácidos nucleicos,
incluyendo entre otros, poliaminas, ácidos de poliaminas,
polipéptidos, proteínas, biotina y polisacáridos en células. Con
los métodos de la presente revelación se pueden introducir en
células otros materiales útiles, por ejemplo, agentes terapéuticos,
materiales de diagnóstico y reactivos de investigación. En un
aspecto preferente, mediante la presente invención se puede
administrar a o en el interior de una célula cualquier vector de
ácido nucleico.
En consecuencia, se revela un método para
introducir una sustancia activa biológicamente en el interior de
una célula, método que comprende la formación de un liposoma de un
compuesto de acuerdo con la invención y una sustancia activa
biológicamente e incubar el liposoma con una célula o cultivo
celular.
La invención también está relacionada con
composiciones que comprenden uno o más compuestos de la
invención.
La invención está relacionada también con
composiciones que comprenden uno o más compuestos de la invención y
uno o más componentes adicionales seleccionados del grupo formado
por ácidos nucleicos, una célula, un cultivo celular, células,
tampones, medios de cultivo, sustancia activa biológicamente,
lípidos neutros y potenciadores de la transfección,
preferentemente, un ácido nucleico.
La presente invención incluye también kits de
transfección que incluyen uno o más de los compuestos o
composiciones de la presente invención o mezclas de ellos. En
particular, la invención proporciona un kit formado por uno o más
de los compuestos de la presente invención y como mínimo, un
componente adicional seleccionado del grupo formado por una célula,
células, un medio de cultivo celular, un ácido nucleico, un
potenciador de la transfección e instrucciones para realizar la
transfección de una célula o células.
La revelación está relacionada también con
intermedios y métodos para utilizar esos intermedios para la
preparación de los compuestos o composiciones de la invención. La
revelación está relacionada también con las composiciones,
compuestos o componentes obtenidos por la interacción de materiales
(intermedios, compuestos, lípidos, etc.) utilizados en los métodos
de síntesis de la invención.
Otras realizaciones preferentes de la presente
invención resultarán evidentes para una persona con conocimientos
habituales en la técnica en vista de los siguientes dibujos y
descripción de la invención.
La Figura 1 es una gráfica que muestra la
transfección de células HEK-293 con reactivos
catiónicos de transfección.
La Figura 2 es una gráfica que muestra la
transfección de células COS-7 con reactivos
catiónicos de transfección.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la
transfección de células CHO-K1 con reactivos
catiónicos de transfección.
La Figura 4 es una gráfica que muestra la
transfección de células HeLa con reactivos catiónicos de
transfección.
La presente invención está relacionada con
lípidos catiónicos y composiciones de lípidos catiónicos que tienen
utilidad en agregados de lípidos para administrar macromoléculas y
otros compuestos a células. Los compuestos se pueden utilizar en
solitario o combinados con otros compuestos para preparar liposomas
y otros agregados de lípidos adecuados para la transfección o
administración de compuestos a células diana in vitro.
Los compuestos de la presente invención son
preferentemente policatiónicos, y por tanto forman preferentemente
complejos altamente estables con diversas macromoléculas aniónicas,
en particular, polianiones como ácidos nucleicos. Estos compuestos
tienen la propiedad, cuando se dispersan en agua, de formar
agregados de lípidos que se asocian con vigor, vía su porción
catiónica, a los polianiones. Utilizando un exceso de cargas
catiónicas en relación con el compuesto aniónico, los complejos
polianión-lípido pueden ser adsorbidos en membranas
celulares, facilitando de esta manera la asimilación del compuesto
deseado por las células.
La revelación está relacionada también con
intermedios para preparar los compuestos y composiciones de la
invención.
Más específicamente, la presente invención está
relacionada con un lípido catiónico para transfección que tiene un
eficacia de transfección más alta que los productos disponibles en
el mercado en los tres tipos de células más comunes utilizados en
investigación de expresiones (CHO-K1,
COS-7 y HEK293), haciéndolo útil para aplicaciones
de alta producción; y que tiene un sencillo protocolo de uso como
define el hecho de que no se necesite ningún reactivo adicional
(p.ej., como LipofectAMINE PLUS Reagent disponible en Life
Technologies, Inc., Rockville, MD), ninguna eliminación del suero y
por lo tanto, no se necesita realizar cambios del medio, y no es
necesario retirar el complejo ADN/lípido de las células antes del
ensayo.
En un aspecto, la presente invención está
relacionada con compuestos que tienen la siguiente fórmula:
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de
unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6},
independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H
y C_{8}-C_{24} alquenil,
C_{8}-C_{24} aril y
C_{8}-C_{24} alquil, opcionalmente sustituidos
por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter,
poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o
carbamoil.
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3},
R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o
ramificado o un grupo aril
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan
los requisitos de valencia del nitrógeno
R_{7} y R_{8} son H.
X' es un anión aceptable fisiológicamente
a es el número de carga positiva dividido por la
valencia de X,
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, la invención proporciona
compuestos de fórmula:
donde 1 es un entero entre 1 y 4 y
los demás símbolos son los definidos
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización relacionada, la invención
proporciona compuestos de fórmula:
donde R_{7} y R_{8} son
hidrógeno y los demás símbolos son los definidos
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuestos específicos dentro del alcance de la
invención incluyen los siguientes ejemplos.
R_{7} y R_{8} en la fórmula son H.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ciertos compuestos de la invención pueden no ser
lo suficientemente solubles en medios fisiológicos para emplearlos
en métodos de administración y transfección. Las personas diestras
en la técnica apreciarán que existe diversidad de técnicas
disponibles en la técnica para mejorar la solubilidad de esos
componentes en medios acuosos. Esos métodos se pueden aplicar
rápidamente sin demasiada experimentación a los compuestos que aquí
se describen.
\vskip1.000000\baselineskip
Grupos aril útiles son
C_{6-24} aril. Los grupos aril típicos incluyen
fenil, naftil, fenanantril, antracil, indenil, azulenil, bifenil,
bifenilenil, fluorenil, pirenil, aceantrenil, colantrenil y
acefenantrenil.
Grupos alquil útiles son
C_{8-24} alquil de cadena recta o ramificado. Los
grupos alquil típicos incluyen etil, propil, isopropil, butil-
sec.-butil, terc.-butil, pentil, hexil, octil, decil, dodecil,
tetradecil, hexadecil, octadecil, eicosil y docosil.
Grupos alquenil útiles son
C_{8-24} alquenil de cadena recta o ramificado.
Los grupos alquenil típicos incluyen etenil, propenil, isopropenil,
butenil, sec.-butenil, hexenil, octenil, decenil, dodecenil,
especialmente 9-dodecenil, tetradecenil,
especialmente 9-tetradecenil, hexadecenil,
especialmente 9-hexadecenil, octadecenil,
especialmente 9-octadecenil, eicosenil y
docosenil.
Grupos alquinil útiles son
C_{8-24} alquinil de cadena recta o ramificado.
Los grupos alquinil típicos incluyen etinil, propinil, butinil,
hexinil, octinil, decinil, dodecinil, tetradecinil, hexadecinil,
octadecinil, eicosinil y docosinil.
Los grupos alquil éter típicos incluyen
cualquiera de los grupos alquil C_{2-100} que
tenga un grupo éter.
Un grupo éter es -O-.
Los grupos poliéter típicos incluyen el
-(CHR^{14}-CH_{2}-O)_{t}-,
donde R^{14} es H o un grupo alquil C_{1-4} y t
es un entero como se ha definido anteriormente; preferentemente t es
de 2 a 5.
A los efectos de la invención, un grupo amida es
un radical orgánico que tiene -NHC(O)- como grupo funcional.
Los grupos amida típicos incluyen alquil amidas, alquenil amidas,
alquinil amidas y aril amidas, donde alquil, alquenil, alquinil y
aril son como se ha definido anteriormente.
Los grupos poliamida típicos incluyen radicales
orgánicos que tienen dos o más grupos amida como se han definido
anteriormente.
Típicamente, un grupo éster es un radical
orgánico que tiene -C(O)-O- como grupo
funcional. Los grupos éster típicos incluyen
R^{14}-C(O)-O-R^{15},
donde R^{14} y R^{15} son grupos alquileno, alquenileno,
alquinileno y arileno como se han definido anteriormente.
Típicamente, los grupos urea son radicales
orgánicos que tienen
-NH-C(O)-NH- como grupo
funcional. Los grupos urea típicos incluyen
R^{14}NH-C(O)-NHR^{14},
R^{14}NH-C(O)-NHR^{15},
R^{14}R^{15}N-C(O)-NR^{14}R^{15}
donde R^{14} y R^{15} son grupos alquileno, alquenileno,
alquinileno y arileno como se han definido anteriormente.
Típicamente, los grupos tiourea son radicales
orgánicos que tienen grupo urea como se ha definido anteriormente
en el que el oxígeno del grupo urea es sustituido por azufre.
Típicamente, los grupos guanidil son radicales
orgánicos que tienen
-NH-C(NH)-NH- como grupo
funcional. Los grupos guanidil típicos incluyen
R^{14}NH-C(NH)-NHR^{14},
R^{14}NH-C(NH)-NHR^{15} y
R^{14}R^{15}N-C(NH)-NR^{14}R^{15}
donde R^{14} y R^{15} son grupos alquileno, alquenileno,
alquinileno y arileno como se han definido anteriormente.
Un grupo carbamoil es
-NH-C(O)-O-.
Típicamente, los grupos carbonato incluyen
radicales orgánicos que contienen un radical CO_{3}^{2-}, es
decir, -O-C(O)-O.
Un grupo fosfato es un radical
PO_{4}^{3}.
Un grupo sulfato es un radical
SO_{4}^{2}.
Un grupo sulfóxido es -S(O)-.
Un grupo imina es -C(N)-.
Un grupo carbonil es -C(O)-.
Un grupo amino secundario es -NH-.
Típicamente, los grupos aminoalcohol son
radicales orgánicos que tienen un grupo amino secundario como se ha
definido anteriormente y un grupo hidroxil. Los aminoalcoholes
típicos incluyen aminoetanol, aminopropanol y aminobutanol.
La definición "D es un enlace" significa
que cuando D no es Q, existe un enlace simple entre
(CH_{2})_{p} y Z.
Sustancia Activa Biológicamente hace
referencia a cualquier molécula o mezcla o complejo de moléculas
que ejerce un efecto biológico in vitro o in vivo,
incluyendo productos farmacéuticos, drogas, proteínas, péptidos,
polipéptidos, hormonas, vitaminas, esteroides, polianiones,
nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos (p.ej., ADN o ARN),
nucleótidos, polinucleótidos, etc.
Lípidos Catiónicos hace referencia a
cualquier lípido catiónico que se pueda utilizar para transfección,
incluyendo pero no quedando limitado a DOSPA, DOTMA, DMRIE, DOTAP,
DOGS y TM-TPS.
Célula hace referencia a células
eucarióticas de cualquier tipo y de cualquier origen. Tipos de
células eucarióticas incluyen células epiteliales, fibroblásticas,
neuronales, hematopoiéticas y similares a partir de células
primarias, células tumorales o líneas celulares inmortalizadas.
Fuente de esas células incluyen cualquier animal como humano,
canino, ratón, hamster, gato, bovino, porcino, mono, simio, oveja,
pez, insecto, hongo y cualquier planta, incluyendo plantas de
cultivo, ornamentales y árboles.
Administración se utiliza para denotar un
proceso mediante el cual es transferido un compuesto deseado a una
célula diana de forma que el compuesto deseado se sitúe en última
instancia en el interior de la célula diana o en o sobre la
membrana de la célula diana. En muchos usos de los compuestos de la
invención, el compuesto deseado no es realmente absorbido por la
célula diana y la administración vía agregados de lípidos es un
medio de introducir el compuesto deseado en la célula. En
determinados usos, la administración a un tipo específico de célula
diana es preferible y se puede facilitar mediante compuestos de la
invención.
Droga hace referencia a cualquier agente
terapéutico o profiláctico distinto a comida que se utilice en la
prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o cura de enfermedades
en personas o animales.
Kit hace referencia a kits de
transfección o kits de expresión de proteínas que incluyen uno o más
de los compuestos de la presente invención o mezclas de ellos. Esos
kits pueden comprender un medio portador que es compartimentado
para recibir en confinamiento cerrado uno o más medios contenedor
como ampolletas, tubos de ensayo y similares. Cada uno de esos
medios contenedor comprende componentes o mezcla de componentes
necesarios para realizar la transfección. Esos kits puede incluir
uno o más componentes seleccionados entre ácidos nucleicos
(preferentemente uno o más vectores), células, uno o más compuestos
de la presente invención, compuestos que formen agregados de
lípidos, potenciadores de la transfección, sustancias activas
biológicamente, etc.
Agregado de lípidos es un término
genérico que incluye liposomas de todo tipo, unilamelares y
multilamelares, así como micelos y agregados más amorfos de lípidos
catiónicos o lípidos mezclados con lípidos amfifáticos como
fosfolípidos y esteroides.
Compuestos que forman agregados de
lípidos hace referencia a compuestos neutros o lípidos como
DOPE, DOPC y colesterol, etc.
Célula diana hace referencia a cualquier
célula a la que se administre un compuesto deseado utilizando un
agregado de lípidos como portador para el compuesto deseado.
Transfección se utiliza en este documento
para significar la administración de ácido nucleico, proteína u
otra macromolécula a una célula diana, de forma que el ácido
nucleico, proteína u otra macromolécula se exprese o tenga una
función biológica en la célula. El término "ácido nucleico con
capacidad de expresión" incluye ADN y ARN sin importar el peso
molecular, y el término "expresión" significa cualquier
manifestación de la presencia funcional del ácido nucleico dentro
de la célula incluyendo, sin limitación, la expresión transiente y
la expresión estable. Aspectos funcionales incluyen inhibición de la
expresión mediante administración de oligonucleótidos o
proteínas.
Potenciadores de la transfección hace
referencia generalmente a moléculas y sustancias como proteínas,
péptidos, factores de crecimiento y similares que mejoran la
selección de la célula, la absorción, la internalización, la
selección nuclear y la expresión. Esas moléculas y sustancias
incluyen ligandos como insulina, transferrina y fibronectina que se
dirigen a la superficie celular, péptidos que se dirigen a los
receptores celulares de integrina, y otros compuestos como Plus
Reagent (disponible en Life Technologies, Inc., Rockville,
Maryland). Ejemplos de potenciadores de la transfección se pueden
encontrar en la patente US nº 5.736.392 y la solicitud US Serie nº
09/039.780 presentada el 16 de marzo de 1998.
La invención quedará más clara con los
siguientes ejemplos, los cuales sólo se pretende que sean a modo de
ilustración de la invención. Los lípidos policatiónicos se
prepararon siguiendo los esquemas generales de reacción que se
describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de
1,4-diaminobutano (4,28 g, 48,6 mmol) y trietilamina
(20,3 ml, 146 mmol) en 10 ml de cloruro de metileno seco o se
añadió lentamente a una solución de oleoil cloruro (30,0 g, 99,7
mmol) en 300 ml de cloruro de metileno anhidro en un baño helado a
0ºC. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente con un agitador
mecánico. Tras finalizar la adición, se retiró el baño helado y la
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 días. El
análisis TLC confirmó que la reacción había finalizado y que se
había precipitado el producto. El oleoil cloruro sobrante se
eliminó mediante filtrado. El precipitado se lavó dos veces con 50
ml de cloruro de metileno. Se concentró el licor madre y se
precipitó más producto. Este precipitado se filtró y combinó con el
precipitado anterior. El sólido resultante se secó al vacío durante
4 horas. Se obtuvo un total de 27,0 g de un sólido blanco del
producto deseado,
N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de
N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano
(27,0 g, 43,8 mmol) en 400 ml de dietil éter anhidro se le añadió
cuidadosamente hidruro de litio y aluminio (8,62 g, 95%, 216 mmol) a
0ºC. Tras la adición se retiró el baño helado. La mezcla de
reacción se calentó lentamente a temperatura ambiente y después se
calentó suavemente hasta reflujo con un dispositivo de condensación
adecuado, y se agitó durante 16 horas. La mezcla de reacción se
templó y enfrió con cuidado a 0ºC con 70 ml de una solución de 1 N
hidróxido de sodio. Se añadió 500 ml de dietil éter y la mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 2 horas más. La capa de éter
superior se volvió clara gradualmente y entonces se separó. Se
extrajo la capa acuosa tres veces con 100 ml de dietil éter cada
vez. La solución combinada de éter se concentró y secó a alto vacío
durante la noche. Se obtuvo un total de 17,0 g de
N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano
incoloro aceitoso.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de
N^{1},N^{4}-dioleoil-diaminobutano
(15,5 g, 26,3 mmol) y
N-(2,3-epoxipropil)-ftalimida (15,6
g, 76,8 mmol) en 110 ml de N,N-dimetilformamida seca
se le añadió diisopropiletilamina (11,1 ml, 63,7 mmol). Después de
purgar con nitrógeno, la mezcla de reacción fue sellada en un matraz
de base redonda y calentada hasta 90ºC aproximadamente durante 24
horas. Se retiró N,N-dimetilformamida y
diisopropiletilamina y se obtuvo un aceite amarillo. Este material
crudo se recristalizó a partir de etanol. Se obtuvo un total de 18,6
g de un sólido blanco,
N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-ftalamido)propil]-diamino-butano.
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de
N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-ftalamido)propil]-diaminobutano
(17,0 g, 17,1
mmol) en 250 ml de etanol seco se le añadió hidracina (4,0 ml, 80% ac., 103 mmol) a temperatura ambiente. Con un dispositivo de condensación adecuado, la mezcla de reacción se calentó a reflujo, punto en el que la suspensión cambió a una solución clara. El baño de aceite se fijó a 85ºC. Transcurridos 45 minutos, de la solución se precipitó un sólido blanco. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 4 horas antes de ser enfriada a -20ºC. El sólido blanco se depósito en el fondo. La solución de etanol claro de la parte superior se decantó. El residuo se lavó dos veces con etanol frío. La solución combinada de etanol se concentró y secó al vacío durante la noche. Se obtuvo 12,4 g de N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano aceitoso.
mmol) en 250 ml de etanol seco se le añadió hidracina (4,0 ml, 80% ac., 103 mmol) a temperatura ambiente. Con un dispositivo de condensación adecuado, la mezcla de reacción se calentó a reflujo, punto en el que la suspensión cambió a una solución clara. El baño de aceite se fijó a 85ºC. Transcurridos 45 minutos, de la solución se precipitó un sólido blanco. La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 4 horas antes de ser enfriada a -20ºC. El sólido blanco se depósito en el fondo. La solución de etanol claro de la parte superior se decantó. El residuo se lavó dos veces con etanol frío. La solución combinada de etanol se concentró y secó al vacío durante la noche. Se obtuvo 12,4 g de N^{1},N^{4}-dioleoil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano aceitoso.
\newpage
Se sintetizaron los siguientes compuestos
mediante el método anterior utilizando la correspondiente diamina y
un cloruro de acilo de cadena larga:
N^{1},N^{4}-dimiristil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-dipalmitil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-dipalmitolil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-distearil-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{4}-dilauril-N^{1},N^{4}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminobutano
N^{1},N^{2}-dimiristil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dipalmitil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dipalmitolil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-distearil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dilauril-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{2}-dioleil-N^{1},N^{2}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-diaminoetano
N^{1},N^{9}-dimiristil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dipalmitil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dipalmitolil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-distearil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dilauril-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
N^{1},N^{9}-dioleil-N^{1},N^{9}-di-[2-hidroxi-3-(N-aminopropil)]-Jeffamina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Síntesis de
dihidroxi-dioleiol-diesperminacarboxamida
espermina y
análogos
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
Los análogos poliméricos de la presente
invención se pueden sintetizar utilizando aminas poliméricas como
PEI como material de inicio u poliaminas dendriméricas. Por ejemplo,
se puede acilar PEI con alquiloil cloruro (p.ej., oleoil cloruro) y
el PEI acilado se puede reducir después con hidruro de litio y
aluminio para obtener compuestos de la invención.
Aunque los métodos anteriores ejemplifican la
síntesis de compuestos específicos, los esquemas de reacciones
proporcionan un método general para preparar diversos compuestos de
acuerdo con la presente invención. Las personas con conocimientos
normales en la técnica apreciarán que se pueden utilizar métodos y
reactivos alternativos a los aquí detallados específicamente o se
pueden adaptar fácilmente para producir compuestos de la
invención.
Los compuestos de la presente invención se
pueden utilizar de la misma forma que los compuestos de la técnica
anterior como DOTMA, DOTAP, DOGS, DOSPA y similares. En la técnica
son bien conocidos métodos para incorporar esos lípidos catiónicos
a agregados de lípidos. Métodos representativos se revelan en
Felgner, et al., supra; Eppstein et al.,
supra; Behr et al., supra; Bangham, A. et
al. (1965) M. Mol. Biol. 23:238-252;
Olson, F. et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta
557:9-23; Szoka, F. et al., (1978)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198;
Mayhew, E. et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta
775:169-175; Kim, S. et al. (1983)
Biochim. Biophys. Acta 728:339-348; y
Fukunaga, M. et al. (1984) Endocrinol.
115:757-761. Técnicas para preparar agregados
de lípidos de tamaño apropiado para uso como vehículos de
administración incluyen sonicación y
congelación-descongelación más extrusión, como
quizás los más comúnmente utilizados. Véase por ejemplo, Mayer, L.
et al. (1986) Biochim. Biophys. Acta
858:161-168. La microfluidización se utiliza
cuando se desean agregados pequeños (50-200 mm) y
relativamente uniformes (Mayhew, E., supra). Se prefieren
agregados que oscilen entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente
200 mm de diámetro; sin embargo, son funcionales tamaños más grandes
y más pequeños.
En la técnica son bien conocidos métodos de
transfección y administración de otros compuestos. Los compuestos y
composiciones de la presente invención proporcionan agregados de
lípidos que se pueden utilizar en los mismos procesos usados para
otros agentes de transfección conocidos.
Resultará muy evidente para las personas con
conocimientos normales en la técnica que para conseguir la óptima
eficacia de la transfección o administración son importantes una
serie de parámetros generales. Estos parámetros incluyen, por
ejemplo, la concentración del lípido catiónico, la concentración del
compuesto que se va a administrar, el número de células
transfectadas, el medio empleado para la administración, el tiempo
de incubación de las células con el complejo
polianión-lípido, y las cantidades relativas de
lípido catiónico y no catiónico. Puede ser necesario optimizar
estos parámetros para cada tipo de célula específico. Esa
optimización es rutinaria empleando la directriz que aquí se
facilita y los conocimientos generalmente disponibles por la
técnica.
El uso de compuestos representativos de la
invención se detalla adicionalmente consultando los siguientes
ejemplos. Todas las abreviaturas utilizadas en este documento son
las abreviaturas estándares en la técnica. Procedimientos
específicos que no se describen en detalle son bien referenciados o
conocidos en la técnica.
Este ejemplo compara la transfección de células
HEK-293 (línea celular derivada de riñón embrionario
humano), COS-7 (línea celular de mono transformada
SV40), CHO-K1 (línea celular derivada de ovario de
hamster chino) y HeLa (línea celular derivada de carcinoma de
cuello de útero humano) con el plásmido "reporter"
\beta-galactosidasa ADN
pCMV\cdotSPORT-\beta-gal (Life
Technologies, Rockville, MD) utilizando reactivos de transfección de
lípidos catiónicos disponibles en el mercado y los compuestos de la
presente invención.
Las células fueron colocadas el día anterior a
la transfección en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en
un volumen total de 0,4 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium,
Life Technologies, Rockville, MD), medio de cultivo que contenía
una solución al 1% de aminoácido no esencial (NEAA) (Life
Technologies) y 10% FBS. Para las células HEK-293 y
COS-7, las placas de cultivo de tejidos fueron
recubiertas previamente con
Poli-L-Lisina para mejorar la
adhesión de las células.
Al día siguiente se preparó el reactivo de
transfección ADN de la siguiente forma:
Los reactivos de lípidos catiónicos y el ADN se
diluyeron por separado en alícuotas de 25 \mul de DMEM sin suero
que contenía 1% NEAA. Para LipofectAMINE PLUS, al ADN se añadió
7-14 \mul de reactivo PLUS, se mezcló y se incubó
durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ADN diluido se combinó
con el lípido diluido y se incubó a temperatura ambiente durante 15
minutos como mínimo para que el AND y el lípido formaran complejos.
Tras esta incubación, los complejos fueron añadidos directamente al
medio de cultivo gota a gota y se mezcló balanceando la placa de
cultivo adelante y atrás. Las células fueron incubadas
adicionalmente a 37ºC durante un total de 24 horas para permitir la
expresión del transgen lacZ codificado por el plásmido
"reporter",
pCMV\cdotSPORT-\beta-gal. A las
24 horas de la transfección, el medio de crecimiento y los complejos
de transfección se retiraron de los pocillos, y las células
presentes en cada pocillo se enjuagaron brevemente con 1 ml de
D-PBS (Dulbecco's PBS, Life Technologies,
Rockville, MD). Las células de cada pocillo fueron sometidas a
lisadas mediante la adición de 0,15 a 2,0 ml de 0,1% Tris, pH 8,0,
que contenía 0,1 M Triton X-100. Las placas fueron
congeladas a -80ºC durante un mínimo de 2 horas, y descongelados a
temperatura ambiente o a 37ºC. Las células descongeladas sometidas
a lisis fueron aclaradas mediante centrifugado y se ensayaron los
supernatantes para detectar actividad de
\beta-gal utilizando el sustrato enzimático ONPG.
La concentración de proteínas totales en las células lisadas se
determinó también utilizando un ensayo Bradford
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se calculó la
actividad de \beta-gal en los extractos de células
transfectadas con una curva estándar y se expresó como ng
\beta-gal por área de superficie de placa de
cultivo de tejidos (ng/cm^{2}) para reflejar la actividad total
por transfección, o como ng \beta-gal por \mug
de proteínas totales (ng/\mug) para reflejar la actividad
específica.
La transfección de las células
HEK-293 (Figura 1), COS-7 (Figura
2), CHO-K1 (Figura 3) y HeLa (Figura 4) se realizó
con 0,4 a 0,8 \mug de ADN
pCMV\cdotSPORT-\beta-gal y 0,2 a
4,0 \mul de reactivo de transfección. Los reactivos de
transfección testados fueron DHDOS (IV) formulado a 2 mg/ml con el
colípido neutro colesterol (a una relación de 1:15 (M/M)
DHDOS-colesterol); DHDOS se formuló a 2 mg/ml con el
colípido neutro DOPE (dioleil fosfatidil etanolamina) (a una
relación de 1:1 (M/M) DHDOS-DOPE); LipofectAMINE
PLUS (Life Technologies, Rockville, MD) y FuGENE^{TM} (Boehringer
Mannheim, Alemania). Las formulaciones de DHDOS se testaron en el
intervalo entre 0,2 y 1,5 \mul; LipofectAMINE PLUS y
FuGENE-6 fueron testados en el intervalo entre 0,2 y
4,0 \mul. FuGENE-6 se utilizó de acuerdo con el
protocolo recomendado por el fabricante. DHDOS y LipofectAMINE PLUS
se utilizaron de acuerdo con el protocolo anterior. Los datos
presentados en las Figuras son expresados como actividad total
(ng/cm^{2}) para comparar mejor la expresión total del ADN
transfectado. Sólo se muestran datos con 0,8 \mug de ADN, pues se
obtuvieron resultados similares con 0,4 y 0,8 \mug de ADN.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
de patente mencionadas en esta especificación son indicativas del
nivel de destreza de las personas diestras en la técnica a la que
pertenece la presente invención.
Claims (35)
1. Compuesto de fórmula:
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de
unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6}
independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H
y C_{8}-C_{24} alquenil,
C_{8}-C_{24} aril y
C_{8}-C_{24} alquil opcionalmente sustituidos
por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter,
poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o
carbamoil
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3},
R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o
ramificado o un grupo aril
X' es un anión aceptable fisiológicamente
a es el número de carga positiva dividido por la
valencia de X
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan
los requisitos de valencia del nitrógeno, y
R_{7} y R_{8} son H.
2. Compuesto de la reivindicación 1 en el que el
mencionado compuesto tiene la fórmula:
donde 1 es un entero entre 1 y
4.
3. Compuesto de la reivindicación 2, es
decir:
4. Compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{1}, R_{4}, R_{7} y
R_{8} son como se ha definido en la reivindicación 1 y 1 es un
entero entre 1 y
4.
5. Compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 y 4 en el que R_{1}, R_{3}, R_{4} y
R_{6} se seleccionan entre los mencionados grupos de alquil
sustituido opcionalmente.
6. Compuesto de la reivindicación 4, es
decir:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
7. Compuesto de la reivindicación 4, es
decir:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
8. Compuesto de la reivindicación 4, es
decir:
9. Compuesto de la reivindicación 4, es
decir:
10. Compuesto de fórmula
donde R_{7} y R_{8} son
H.
11. Compuesto de las reivindicaciones 1, 2 o 4
en el que R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6}, independientemente
uno de otro, se seleccionan del grupo formado por H, C_{8} a
C_{24} alquenil y C_{8}-C_{24} alquil.
12. Composición que comprende uno o más
compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
13. Composición de la reivindicación 12 que
comprende además un componente adicional seleccionado del grupo
formado por una célula, células, un cultivo celular, un medio de
cultivo celular, un lípido neutro, un ácido nucleico y un
potenciador de la transfección.
14. Composición de la reivindicación 13, el cual
incluye un ácido nucleico.
15. Composición de las reivindicaciones 13 o 14
en la que, como mínimo, un componente adicional es un lípido
neutro.
16. Composición de la reivindicación 15 en la
que el lípido neutro es DOPE, DOPC o colesterol.
17. Agregado de lípidos que comprende uno o más
compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
18. Agregado de lípidos de la reivindicación 17,
el cual incluye como mínimo un lípido neutro.
19. Agregado de lípidos de la reivindicación 18
en el que el mencionado compuesto de formación del agregado de
lípidos se selecciona del grupo formado por DOPE, DOPC y
colesterol.
20. Kit que comprende uno o más compuestos de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y como mínimo un
componente adicional seleccionado del grupo formado por una célula,
células, un medio de cultivo celular, un ácido nucleico, un
potenciador de transfección e instrucciones para realizar la
transfección de una célula o células.
21. Método para introducir un polianión en una
célula o células in vitro, comprendiendo el mencionado
método la formación de un agregado de lípidos a partir de un
compuesto cargado positivamente de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, poniendo en contacto el agregado de lípidos
con un polianión para formar un complejo
polianión-liposoma cargado positivamente incubando
el complejo con una célula o células.
22. Método de la reivindicación 21 en el que el
polianión es un ácido nucleico.
23. Método de la reivindicación 21 o 22 en el
que el agregado de lípidos es un liposoma.
24. Composición para uso en métodos de
transfección que comprende:
un medio fisiológico
un compuesto policatiónico, y
un anión aceptable fisiológicamente en un número
apropiado para equilibrar las cargas catiónicas del mencionado
compuesto, siendo el compuesto policatiónico de formula:
donde
Q es N
L es un radical orgánico bivalente capaz de
unirse a cada Q
R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6}
independientemente entre sí, se seleccionan del grupo formado por H
y C_{8}-C_{24} alquenil,
C_{8}-C_{24} aril y
C_{8}-C_{24} alquil opcionalmente sustituidos
por uno o más de un grupo alcohol, amina, amida, éter, poliéter,
poliamida, éster, mercaptano, urea, tiourea, guanidil o
carbamoil.
y donde como mínimo uno de R_{1}, R_{3},
R_{4} y R_{6} es un grupo alquil o alquenil de cadena recta o
ramificado o un grupo aril
r, s, u e y son 0 o 1, siempre que se satisfagan
los requisitos de valencia del nitrógeno, y
R_{7} y R_{8} son H.
25. Composiciones de la reivindicación 24 en las
que el mencionado compuesto tiene la fórmula:
donde 1 es un entero entre 1 y
4.
26. Composición de la reivindicación 25 en la
que el mencionado compuesto es:
\vskip1.000000\baselineskip
27. Composición para uso en métodos de
transfección que comprende un medio fisiológico y un compuesto de
fórmula:
donde R_{1}, R_{4}, R_{7} y
R_{8} son como se define en la reivindicación 24 y 1 es un entero
entre 1 y
4.
28. Composición reivindicada en cualquiera de
las reivindicaciones 24, 25 y 27 en la que R_{1}, R_{3},
R_{4} y R_{6} se seleccionan de los mencionados grupos de alquil
sustituido.
29. Composición de la reivindicación 27 en la
que el mencionado compuesto es:
30. Composición de la reivindicación 27 en la
que el mencionado compuesto es:
\vskip1.000000\baselineskip
31. Composición de la reivindicación 27 en la
que el mencionado compuesto es:
\vskip1.000000\baselineskip
32. Composición de la reivindicación 27 en la
que el mencionado compuesto es:
\vskip1.000000\baselineskip
33. Composición para uso en métodos de
transfección que comprende un medio fisiológico y un compuesto de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{7} y R_{8} son
H.
34. Composición de la reivindicaciones 24 o 25
donde R_{1}, R_{3}, R_{4} y R_{6} se seleccionan del grupo
formado por H, C_{8}-C_{24} alquenil,
C_{8}-C_{24} aril y
C_{8}-C_{24} alquil.
35. Uso de una composición de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 34 para realizar la transfección de un ácido
nucleico a una célula o células in vitro.
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