ES2263153T3

ES2263153T3 - Peptidos marcados con tecnecio 99 m para obtencion de imagenes.

Info

Publication number: ES2263153T3
Application number: ES95922946T
Authority: ES
Inventors: Richard T. Dean; Scott Buttram; William Mcbride; John Lister-James; Edgar R. Civitello
Original assignee: Berlex Inc
Current assignee: Bayer Healthcare Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-06-01
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2015-06-01
Also published as: KR100235136B1; AU2778395A; PT762901E; EP0762901B1; DK0762901T3; CN1154072A; EP0762901A1; WO1995033498A1; CN1090973C; DE69534943D1; CA2191950A1; KR970703171A; DE69534943T2; US5997844A; ZA954547B; JPH10501241A; EP0762901B9; AU697048B2; CA2191950C; US6074627A

Abstract

SE HACE REFERENCIA A PEPTIDOS RADIOETIQUETADOS Y A METODOS PARA PRODUCIR DICHOS PEPTIDOS. ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A PEPTIDOS, METODOS Y EQUIPOS PARA CONSEGUIR DICHOS PEPTIDOS, ASI COMO METODOS PARA UTILIZAR DICHOS PEPTIDOS EN LA VISUALIZACION DE LUGARES DEL CUERPO DE UN MAMIFERO ETIQUETADOS CON TECNETIO-99M (TC-99M) VIA UNA MOLARIDAD DE ENLACE RADIOETIQUETADO UNIDA DE FORMA COVALENTE A UN PEPTIDO DE ENLACE ESPECIFICO MEDIANTE UNA CADENA LATERAL DE UN AMINOACIDO DEL PEPTIDO.

Description

Péptidos marcados con tecnecio 99 m para obtención de imágenes.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se relaciona con reactivos y péptidos para radiodiagnóstico, y métodos para producir agentes para radiodiagnóstico marcados. Específicamente, la invención se relaciona con péptidos, métodos y equipos de reactivos para preparar dichos péptidos, y métodos para usar dichos péptidos para obtener imágenes de lugares del organismo de un mamífero marcados con tecnecio 99 m (Tc 99 m) a través de una porción de unión al radiomarcador que se une covalentemente a una cadena lateral de un residuo de aminoácido del péptido de unión específica.

2. Descripción del estado anterior de la técnica

En el campo de la medicina nuclear, ciertas afecciones patológicas se localizan, o se evalúa su extensión, detectando la distribución de pequeñas cantidades de compuestos trazadores marcados radiactivamente (denominados radiotrazadores o radiofármacos). Los métodos para detectar estos radiofármacos se conocen en general como técnicas de diagnóstico por imágenes o como técnicas de diagnóstico por imágenes radiológicas.

En la obtención de imágenes radiológicas, el radiomarcador es un radionucleido que emite radiación gamma y el radiotrazador se localiza utilizando una cámara de detección de radiación gamma (este proceso a menudo se denomina gammagrafía). El lugar del que se toman imágenes es detectable porque el radiotrazador se elige o bien para que se localice en un lugar patológico (denominado contraste positivo) o, alternativamente, el radiotrazador se elige específicamente para que no se localice en dichos lugares patológicos (denominado contraste negativo).

Se deben considerar varios factores para una obtención óptima de imágenes radiológicas en los seres humanos. Para maximizar la eficacia de la detección, se prefiere un radionucleido que emita energía gamma en el rango de 100 a 200 keV. Para reducir al mínimo la dosis de radiación absorbida por el paciente, la semidesintegración física del radionucleido debe ser tan corta como el procedimiento de obtención de imágenes lo permita. Para permitir que los exámenes se realicen cualquier día y en cualquier momento del día, es ventajoso tener una fuente del radionucleido siempre disponible en el centro clínico.

Se conoce una diversidad de radionucleidos que son útiles para obtener imágenes radiológicas, incluidos ^{67}Ga, ^{99m}Tc (Tc 99 m), ^{111}In. ^{123}I, ^{125}I, y ^{169}Yb. El Tc 99 m es un radionucleido preferido porque emite radiación gamma a 140 keV, tiene una semidesintegración física de 6 horas, y se puede producir fácilmente en el lugar utilizando un generador de molibdeno 99/tecnecio 99 m.

La sensibilidad de los métodos de obtención de imágenes que usan péptidos marcados radiactivamente es mucho mayor que con otros radiofármacos conocidos por los técnicos en la materia, puesto que la unión específica del péptido radiactivo concentra la señal radiactiva sobre el área de interés. Se pueden usar ventajosamente péptidos sintéticos pequeños que se unan específicamente a los blancos de interés como la base para los radiotrazadores. Esto es porque: 1. se pueden sintetizar químicamente (en contraposición con la necesidad de producirlos en un sistema biológico como bacterias o células de mamíferos, o de tener que aislarlos de una sustancia derivada biológicamente como un fragmento de una proteína); 2. son pequeños, en consecuencia un radiotrazador unido a algo que no es el blanco se elimina rápidamente del organismo, reduciendo de ese modo la radiactividad de fondo (en otro lugar que no es el blanco) y permitiendo una buena definición del blanco; y 3. los péptidos pequeños se pueden manipular químicamente con facilidad para optimizar su afinidad por un sitio de unión en particular.

Se prefieren como radiofármacos de rutina moléculas de péptidos marcados pequeñas que se sinteticen fácilmente. Existe una clara necesidad de péptidos sintéticos pequeños marcados que se puedan inyectar directamente en un paciente y que permitan obtener imágenes de lugares patológicos al localizarse en dichos lugares. Los péptidos sintéticos pequeños marcados con Tc 99 m ofrecen claras ventajas como radiotrazadores para gammagrafía, debido a las propiedades del Tc 99 m como un radionucleido para la obtención de imágenes y a la utilidad de los péptidos sintéticos pequeños de unión específica como moléculas radiotrazadoras.

En el estado anterior de la técnica se había informado de péptidos radiomarcados.

Ege et al, Patente de los Estados Unidos Nº 4,832,940 instruye sobre péptidos radiomarcados para obtener imágenes de linfocitos T localizados.

Olexa et al, 1982, solicitud de Patente Europea Nº 823017009 divulga un péptido radiomarcado aceptable desde el punto de vista farmacéutico seleccionado entre el fragmento E_{1} aislado de fibrina reticulada, el fragmento E_{2} aislado de fibrina reticulada, y péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos intermedia entre los fragmentos E_{1} y E_{2}.

Ranby et al., 1988, PCT/US88/02276 divulga un método para detectar depósitos de fibrina en un animal que comprende unir covalentemente un compuesto radiomarcado a la fibrina.

Hadley et al., 1988, PCT/US88/03318 divulgan un método para detectar un coágulo de fibrina-plaqueta in vivo que comprende los pasos de (a) administración a un paciente de una proteína trombolítica atenuada marcada, donde el marcador está selectivamente unido a una porción de la proteína trombolítica distinta del dominio de unión a la fibrina; y (b) detección del patrón de distribución de la proteína trombolítica marcada en el paciente.

Lees et al., 1989, PCT/US89/01854 instruyen sobre péptidos radiomarcados para obtención de imágenes de arterias.

Sobel, 1989, PCT/US89/02656 divulga un método para localizar la posición de uno o más trombos en un animal usando un activador del plasminógeno tisular enzimáticamente inactivo, radiomarcado.

Stuttle, 1990, PCT/GB90/00933 divulga péptidos marcados radiactivamente que contienen de 3 a 10 aminoácidos que comprenden la secuencia arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), capaces de unirse a un lugar de unión de RGD in vivo.

Maraganore et al., 1991. PCT/US90/04642 divulgan un inhibidor de trombos radiomarcado que comprende (a) una porción inhibidora; (b) una porción ligadora; y (c) y una porción sitio de unión a iones.

Rodwell et al., 1991, PCT/US91/03116 divulgan conjugados de "unidades de reconocimiento molecular" con "dominios efectores".

Tubis et al., 1968, Int. J. Appl. Rad. Isot. 19: 835-840 describen el marcado de un péptido con tecnecio 99 m.

Sundrehagen, 1983, Int. J. Appl. Rad. Isot. 34: 1.003 describe el marcado de polipéptidos con tecnecio 99 m.

El uso de quelantes para el radiomarcado de polipéptidos, y métodos para marcar péptidos y polipéptidos con Tc 99 m se conocían en el estado anterior de la técnica y se divulgan en las solicitudes de Patente de los Estados Unidos en trámite Nº de serie 07/653,012 y 07/807,062, las que se incorporan aquí como referencia.

Aunque es óptima para la obtención de imágenes radiológicas, la química del Tc 99 m no ha sido tan extensamente estudiada como la de otros elementos y por esta razón no abundan los métodos de radiomarcado con tecnecio. El Tc 99 m normalmente se obtiene como pertecnetato de Tc 99 m (TcO_{4}; tecnecio en el estado de oxidación +7), habitualmente de un generador de molibdeno 99/tecnecio 99 m. Sin embargo, el pertecnetato no se une bien a otros compuestos. Por consiguiente, para radiomarcar un péptido, el pertecnetato de Tc 99 m se debe convertir en otra forma. Dado que el tecnecio no forma un ion estable en solución acuosa, se debe mantener en dichas soluciones en la forma de un complejo de coordinación que tenga suficiente estabilidad cinética y termodinámica para evitar la descomposición y que dé como resultado la conversión del Tc 99 m o bien en dióxido de tecnecio insoluble o nuevamente en pertecnetato.

Dichos complejos de coordinación de Tc 99 m (en los estados de oxidación +1 a +6) son conocidos. Sin embargo, muchos de estos complejos son inapropiados para el radiomarcado debido a la geometría molecular del complejo de coordinación. A los efectos del radiomarcado, es particularmente ventajoso que el complejo de coordinación sea formado como un quelato en el cual todos los grupos dadores que rodean al ion de tecnecio son proporcionados por un único ligando quelante. Esto permite al Tc 99 m quelado unirse covalentemente a un péptido a través de un único ligador entre el quelante y el péptido.

A veces se hace referencia a estos ligandos como quelantes bifuncionales que tienen una porción quelante y una porción de ligamiento. Dichos compuestos eran conocidos en el estado anterior de la técnica.

Byrne et al., Patente de los Estados Unidos Nº 4,434,151 describen quelantes bifuncionales derivados de homocisteína tiolactona que pueden acoplar radionucleidos a compuestos que contienen amino terminal que son capaces de localizarse en un órgano o tejido para que se les tomen imágenes.

Fritzberg, Patente de los Estados Unidos Nº 4,444,690 describe una serie de quelantes de tecnecio basados en propanoato de 2,3-bis(mercaptoacetamido).

Byrne et al., Patente de los Estados Unidos Nº 4,571,430 describen nuevos quelantes bifuncionales de homocisteína tiolactona para quelar radionucleidos que pueden acoplar radionucleidos a compuestos que contienen un grupo amino terminal que son capaces de localizarse en un órgano o tejido para que se les tomen imágenes.

Byrne et al., Patente de los Estados Unidos Nº 4,575,556 describen nuevos quelantes bifuncionales de homocisteína tiolactona para quelar radionucleidos que pueden acoplar radionucleidos a compuestos que contienen un grupo amino terminal que son capaces de localizarse en un órgano o tejido para que se les puedan tomar imágenes.

Davison et al., Patente de los Estados Unidos Nº 4,673,562 describen complejos quelantes de tecnecio de ligandos bisamido-bistio y sales de éstos, utilizados principalmente como agentes de monitoreo de la función renal.

Nicolotti et al., Patente de los Estados Unidos Nº 4,861,869 describen agentes acoplantes bifuncionales útiles para formar conjugados con moléculas biológicas como los anticuerpos.

Fritzberg et al., Patente de los Estados Unidos 4,965,392 describen diversos quelantes basados en mercaptoacetilglicilglicina protegidos en el S para marcar proteínas.

Fritzberg et al., solicitud de Patente Europea Nº 86100360.6 describen complejos ditiol, diamino o ácido diamidocarboxílico o complejos amina útiles para preparar agentes marcados con tecnecio para la obtención de imágenes.

Dean et al., 1989, PCT/US89/02634 describe agentes acoplantes bifuncionales para marcar proteínas y péptidos.

Flanagan et al., solicitud de Patente Europea Nº 90306428.5 divulgan el marcado de fragmentos de péptidos sintéticos con Tc 99 m a través de un conjunto de moléculas quelantes orgánicas.

Albert et al., solicitud de Patente Internacional WO 91/01144 divulgan técnicas de obtención de imágenes radiológicas que usan péptidos radiomarcados relacionados con factores de crecimiento, hormonas, interferones y citocinas y compuestos por un péptido de reconocimiento específico unido covalentemente a un grupo quelante radionucleido.

Dean, solicitud de Patente de los Estados Unidos en trámite Nº 07/653,012 instruye sobre reactivos y métodos para preparar péptidos que comprenden un grupo quelante de Tc 99 m unido covalentemente a un péptido de unión específica para obtener imágenes radiológicas in vivo, y se incorpora aquí como referencia.

Baidoo y Lever, 1990, Bioconjugate Chem. 1: 132-137 describen un método para marcar biomoléculas usando un grupo bisamina bistiol que produce un complejo catiónico de tecnecio.

Es posible radiomarcar un péptido simplemente agregando una porción que contenga un grupo tiol como cisteína o ácido mercaptoacético. Dicho procedimiento fue descrito en el estado anterior de la técnica.

Schochat et al., Patente de los Estados Unidos Nº 5,061,641 divulga radiomarcado directo de proteínas compuestas por al menos un grupo sulfhidrilo "colgante".

Dean et al., solicitud de Patente de los Estados Unidos en trámite 07/807,062 instruyen sobre péptidos radiomarcados a través de grupos unidos que contienen tioles libres, y se incorpora aquí como referencia.

Goedemans et al., WO 89/07456 describen el radiomarcado de proteínas usando compuestos tiol cíclicos, particularmente 2-iminotiolano y derivados.

Thornback et al., solicitud EP Nº 90402206.8 describen la preparación y el uso de proteínas o péptidos radiomarcados usando compuestos que contienen tiol, en particular 2-iminotiolano.

Stuttle, WO 90/15818 describe el marcado con Tc 99 m de oligopéptidos que contienen RGD.

Burns et al, 1985, solicitud de Patente Europea 85104959.3 describen compuestos bisamina bistiol para preparar agentes de Tc 99 m pequeños neutros para obtención de imágenes cerebrales.

Kung et al., 1986, solicitud Patente Europea 86105920.2 describen compuestos bisamina bistiol para preparar agentes de Tc 99 m pequeños neutros para obtención de imágenes.

Bergstein et al., 1988, solicitud de Patente Europea 88102252.9 describen compuestos de bisamina bistiol para preparar agentes de Tc 99 m pequeños neutros para obtención de imágenes cerebrales.

Bryson et al., 1988, Inorg. Chem. 27: 2.154-2.161 describen complejos neutros de tecnecio 99 m que son inestables frente al exceso de ligando.

Misra et al., 1989, Tet. Let. 30: 1.885-1.888 describen compuestos de bisamina bistiol para radiomarcado.

Bryson et al., 1990, Inorg. Chem. 29: 2.948-2.951 describen quelantes que contienen dos grupos amido, un grupo tiol y un grupo piridina sustituido que pueden formar complejos de Tc-99 neutros.

Taylor et al., 1990, J. Nucl. Med. 31: 885 (Abst) describen un complejo de Tc 99 m neutro para la obtención de imágenes cerebrales.

El uso de quelantes para radiomarcar péptidos, y métodos para marcar péptidos con Tc 99 m se conocían en el estado anterior de la técnica y se divulgan en las solicitudes de Patente de los Estados Unidos en trámite Nº de serie 07/653,012, 07/807,062, 07/871,282, 07/886,752, 07/893,981, 07/955,466, 08/019,864, 08/073,577, 08/210,822, 08/236,402 y 08/241,625, y péptidos radiomarcados para usar como agentes para gammagrafía para obtener imágenes de trombos se conocían en el estado anterior de la técnica y se divulgan en las solicitudes de Patente en trámite Nº de serie 07/886,752, 07/893,981 y 08/044,825 y las solicitudes de Patentes Internacionales PCT/US92/00757, PCT/US92/10716, PCT/US93/02320, PCT/US93/03687, PCT/US93/04794, PCT/US93/05372, PCT/US93/06029,
PCT/US93/09387, PCT/US94/01894, PCT/US94/03878, y PCT/US94/05895.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona agentes para gammagrafía que son péptidos marcados radiactivamente. Los péptidos radiomarcados de la invención están compuestos por péptidos que se unen específicamente a un blanco in vivo y que están covalentemente unidos a una porción de unión a un radiomarcador donde la porción se une a un radioisótopo. Es una ventaja particular de la presente invención que la porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida a una cadena lateral de un residuo de aminoácido que compone el péptido.

Este modo de unión covalente es ventajoso por una cantidad de razones. Primero, la unión covalente a una cadena lateral de un aminoácido constituyente del péptido evita la interferencia de la porción de unión al radiomarcador unida covalentemente con las propiedades de unión específicas del péptido de unión específica. Segundo, este arreglo permite utilizar péptidos cíclicos, que por definición no están compuestos por terminaciones amino o carboxi libres, conjuntamente con porciones de unión al radiomarcador como agentes para gammagrafía útiles según se divulga aquí. Tercero, la unión covalente a la cadena lateral de un aminoácido constituyente permite que cada agente para gammagrafía de la invención sea diseñado más flexiblemente para lograr óptimos aumentos en la eficacia y reducciones en la antigenicidad, etc. La conjugación a una cadena lateral de un aminoácido también permite que la porción de unión al radiomarcador se agregue al péptido durante la síntesis como un conjugado aminoacídico, o después de que se haya logrado la síntesis del péptido completo. Por último, se sabe que los péptidos cíclicos son resistentes a la digestión por la exoproteasa, incorporando de ese modo la estabilidad mejorada de dichos péptidos in vivo en los agentes para gammagrafía de la invención.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporcionan péptidos radiomarcados capaces de proporcionar imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero. Los péptidos están compuestos por un péptido de unión específica que tiene una secuencia de aminoácidos y una porción de unión al radiomarcador unida covalentemente al péptido. Además, la porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida a una cadena lateral de un aminoácido que compone el péptido. En una materialización preferida, la porción de unión al radiomarcador está unida covalentemente a la cadena lateral de un aminoácido que tiene una cadena lateral que comprende una amina o un tiol, siendo el aminoácido muy preferentemente lisina u homocisteína. En otra materialización preferida, el radiomarcador es tecnecio 99 m.

Un aspecto de la invención proporciona un reactivo para preparar un agente para gammagrafía para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que comprende un péptido de unión específica donde una porción de unión al radiomarcador está unida covalentemente al péptido a través de una cadena lateral de aminoácido de un aminoácido del péptido, donde la porción de unión al radiomarcador tiene la fórmula:

I.C(pgp)^{s}-(aa)-C(pgp)^{s}

donde C(pgp)^{s} es una cisteína protegida y (aa) es cualquier aminoácido primario \alpha o \beta que no contenga un grupo tiol. En una materialización preferida, el aminoácido es glicina.

En otra materialización, la invención proporciona un reactivo para preparar un agente para gammagrafía para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que comprende un péptido de unión específica donde una porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida al péptido a través de una cadena lateral de aminoácido de un aminoácido del péptido, donde la porción de unión al radiomarcador tiene la fórmula:

II.A-CZ(B)-\{C(R^{1}R^{2})\}_{n}-X

donde A es H, HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R^{4}; B es H, SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4}; Z es H o R^{4}; X es SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4}; R^{l}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico; n es 0, 1 ó 2; donde (péptido) es un péptido de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos; y; (1) cuando B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), X es SH y n es 1 ó 2; (2) cuando X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2; (3) cuando B es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1; (4) cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) y cuando X es SH, B es -NHR^{3} o-N(R^{3})-(aminoácido o péptido); (5) cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC y B es SH; (6) cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC y B es SH y n es 0; y donde la porción tiol está en la forma reducida y donde (aminoácido) es cualquier aminoácido primario \alpha o \beta que no contenga un grupo tiol.

En materializaciones particulares de este aspecto de la invención, la porción de unión al radiomarcador tiene una fórmula que es:

IIa.-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X},

IIb.-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2},

IIc.-(un diaminoácido primario \alpha,\omega o \beta,\omega)-(aminoácido)^{1}-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X} o

IId.-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}-(aminoácido)^{1}-(un diaminoácido primario \alpha,\beta o \beta,\gamma)

donde (aminoácido)^{1} y (aminoácido)^{2} son cada uno independientemente cualquier aminoácido \alpha o \beta de origen natural, modificado, sustituido o alterado que no contenga un grupo tiol; A es H, HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R^{4}; B es H, SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4}; Z es H o R^{4}; X es SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4}; R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico; n es un entero que es o bien 0, 1 ó 2; (péptido) es un péptido de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos; y: (1) cuando B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), X es SH y n es 1 ó 2; (2) cuando X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2; (3) cuando B es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1; (4) cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) y cuando X es SH, B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido); (5) cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC y B es SH; (6) cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC y B es SH y n es 0; y donde el grupo tiol está en la forma reducida.

La invención también divulga un péptido radiomarcado para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que comprende un péptido de unión específica donde una porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida al péptido a través de una cadena lateral de aminoácido de un aminoácido del péptido, donde la porción de unión al radiomarcador tiene la fórmula:

1

{a los fines de esta invención, se hará referencia a las porciones de unión al radiomarcador que tienen esta estructura como porciones basadas en ácido picolínico (Pic)}

o

2

{a los fines de esta invención, se hará referencia a las porciones de unión al radiomarcador que tienen esta estructura como porciones basadas en picolilamina (Pica)} donde X es H o un grupo protector; (aminoácido) es cualquier aminoácido; la porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida al péptido y al complejo de la porción de unión al radiomarcador y el radiomarcador es eléctricamente neutro. En una materialización preferida, el aminoácido es glicina y X es un grupo protector acetamidometil. En otras materializaciones preferidas, el péptido está covalentemente unido a una porción de unión al radiomarcador a través de un aminoácido, muy preferentemente glicina y el radiomarcador es tecnecio 99 m.

Además, se divulga un péptido radiomarcado para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que comprende un péptido de unión específica y una porción de unión al radiomarcador bisamino bistiol covalentemente unida al péptido a través de una cadena lateral de un aminoácido del péptido. La porción de unión al radiomarcador bisamino bistiol en esta materialización de la invención tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

3

donde cada R puede ser independientemente H, CH_{3} o C_{2}H_{5}; cada (pgp)^{s} puede ser independientemente un grupo protector tiol o H; m, n y p son independientemente 2 ó 3; A es alquilo inferior lineal o cíclico, arilo, heterociclilo, combinaciones o derivados sustituidos de éstos; y X es péptido; y

4

donde cada R es independientemente H, CH_{3} o C_{2}H_{5}; m, n y p son independientemente 2 ó 3; A es un alquilo inferior lineal o cíclico, arilo, heterociclilo, combinaciones o derivados sustituidos de éstos; V es H o CO-péptido; R' es H o péptido; siempre que cuando V es H, R' es péptido y cuando R' es H, V es péptido. {A los fines de esta invención, se hará referencia a las porciones de unión al radiomarcador que tienen estas estructuras como porciones "BAT"}. En una materialización preferida, el péptido está unido covalentemente a la porción de unión al radiomarcador a través de un aminoácido, muy preferentemente glicina y el radiomarcador es tecnecio 99 m.

En las materializaciones preferidas de los aspectos antes mencionados de esta invención, el compuesto de unión específica es un péptido compuesto por entre 3 y 100 aminoácidos. La materialización más preferida del radiomarcador es tecnecio 99 m.

Los péptidos de unión específica proporcionados por la invención incluyen pero no exclusivamente los péptidos que tienen las secuencias siguientes:

: formil-MLF

: (VGVAPG)_{3}amida

: {VPGVG)_{4}amida

: RALVDTLKFVTQAEGAKamida

: RALVDTEFKVKQEAGAKamida

: PLARITLPDFRLPEIAIPamida

: GQQHHLGGAKAGDV

: PLYKKIIKKLLES

: LRALVDTLKamida

: GGGLRALVDTLKamida

: GGGLRALVDTLKFVTQAEGAKamida

: GGGRALVDTLKALVDTLamida

: GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR

: PSPSPIHPAHHKRDRRQamida

: GGGF_{D}, Cpa.YW_{D}KTFTamida

: {SYNRGDSTC}_{3}-TSEA

: GGGLRALVDTLKamida

: GCGGGLRALVDTLKamida

: GCYRALVDTLKFVTQAEGAKamida

: GC(VGVAPG)_{3}amida

Los reactivos de la invención se pueden formar donde los compuestos de unión específica o las porciones de unión al radiomarcador están covalentemente unidas a una porción de ligamiento polivalente. Las porciones de ligamiento polivalentes de la invención están compuestas por al menos 2 grupos funcionales ligadores idénticos capaces de unirse covalentemente a compuestos de unión específica o porciones de unión al radiomarcador. Los grupos funcionales ligadores preferidos son aminas primarias o secundarias, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico o grupos reactivos tiol. En materializaciones preferidas, las porciones de ligamiento polivalentes están compuestas por bis-succinimidilmetiléter (BSME), ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico (DMAB), tris(succinimidiletil)amina (TSEA), N{2-(N',N'-bis(2-succinimidoetil)aminoetil)}-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-mercaptopropil)-6,9-diazanonanamida (BAT-BS), bis-(acetamidoetil)éter, tris(acetamidoetil)amina, bis-(acetamidoetil)éter, bis-(acetamidometil)éter, \alpha,\epsilon-bisacetillisina, lisina y 1,8-bis-acetamido-3,6-dioxaoctano.

La invención también comprende complejos de los péptidos de la invención con Tc 99 m y métodos para radiomarcar los péptidos de la invención con Tc 99 m. Los complejos radiomarcados proporcionados por la invención se forman haciendo reaccionar los péptidos de la invención con Tc 99 en presencia de un reductor. Los reductores preferidos incluyen pero no exclusivamente ion ditionito, ion estannoso, y ion ferroso. Los complejos de la invención también se forman marcando los péptidos de la invención con Tc 99 m por intercambio de ligandos de un complejo de Tc 99 m previamente reducido según lo estipulado aquí.

La invención también proporciona juegos de reactivos para preparar los péptidos de la invención radiomarcados con Tc 99 m. Los juegos de reactivos para marcar el péptido de la invención con Tc 99 m están compuestos por un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada de un péptido de la invención y una cantidad suficiente de reductor para marcar el péptido con Tc 99 m.

Esta invención proporciona métodos para la preparación de péptidos de la invención por síntesis química in vitro. En una materialización preferida, los péptidos se sintetizan mediante síntesis peptídica en fase sólida.

Esta invención proporciona métodos para usar péptidos marcados con Tc 99 m para obtener imágenes de un lugar dentro del organismo de un mamífero obteniendo gammagrafías in vivo. Estos métodos comprenden la administración de una cantidad diagnóstica eficaz de un péptido radiomarcado con Tc 99 m de la invención y la detección de la radiación gamma emitida por el Tc 99 m localizado en el lugar dentro del organismo del mamífero.

Las materializaciones preferidas específicas de la presente invención se tornarán evidentes a partir de la descripción más detallada siguiente de ciertas materializaciones preferidas y las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una imagen de ^{99m}Tc-P587 en una rata que tiene un tumor.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona péptidos marcados con Tc 99 m para obtener imágenes de lugares blanco dentro del organismo de un mamífero que comprenden una secuencia de aminoácidos covalentemente unida a través de una cadena lateral de aminoácido a una porción de unión al radiomarcador donde la porción de unión al radiomarcador se une a un radioisótopo.

El marcado con Tc 99 m es una ventaja de la presente invención porque las propiedades nucleares y radiactivas de este isótopo lo convierten en un agente ideal para gammagrafía. Este isótopo tiene una energía de un único fotón de 140 keV y a un período de semidesintegración de aproximadamente 6 horas, y se obtiene fácilmente con un generador de ^{99}Mo-^{99m}Tc. Otros radionucleidos conocidos en el estado anterior de la técnica tienen períodos de semidesintegración efectivos mucho más largos (por ejemplo, ^{111}In, que tiene un período de semidesintegración de 67,4 h) o son tóxicos (por ejemplo, ^{125}I).

En las porciones de unión al radiomarcador y los péptidos unidos covalentemente a tales porciones que contienen un tiol unido covalentemente a grupos protectores de tiol [(pgp)^{S}] proporcionados por la invención, los grupos protectores de tiol pueden ser iguales o diferentes y pueden ser pero no exclusivamente:

-CH_{2}-arilo (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);

-CH-(arilo)_{2}, (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);

-C-(arilo)_{3}, (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);

-CH_{2}(4-metoxifenilo);

-CH-(4-piridil)(fenilo)_{2};

-C(CH_{3})_{3}

-9-fenilfluorenilo;

-CH_{2}NHCOR (R es alquilo o arilo sustituidos o sin sustituir);

-CH_{2}NHCOOR (R es alquilo o arilo sustituidos o sin sustituir);

-CONHR (R es alquilo o arilo sustituidos o sin sustituir);

-CH_{2}-S-CH_{2}-fenilo

Los grupos protectores preferidos tienen la fórmula -CH_{2}-NHCOR donde R es un alquilo inferior que tiene 1 y 8 átomos de carbono, fenilo o fenilo sustituido con alquilo inferior, hidroxilo, alcoxi inferior, carboxi, o alcoxicarbonilo inferior. El grupo protector que más se prefiere es un grupo acetamidometilo.

Cada péptido de unión específica contenido en una materialización de la invención está compuesto por una secuencia de aminoácidos. El término aminoácido como se usa en esta invención tiene la intención de incluir todos los aminoácidos L y D, de origen natural o de otro origen.

Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar químicamente in vitro. Los péptidos de la presente invención pueden en general ser preparados de manera ventajosa en un sintetizador de aminoácidos. Los péptidos de esta invención se pueden sintetizar donde la porción de unión al radiomarcador está unida covalentemente al péptido durante la síntesis química in vitro, utilizando técnicas bien conocidas por los técnicos con experiencia en el tema. Dichos péptidos unidos covalentemente a la porción de unión al radiomarcador durante la síntesis son ventajosos porque se pueden determinar lugares específicos de enlace covalente.

Es una ventaja particular de la presente invención que una porción de unión al radiomarcador está unida covalentemente al péptido a través de una cadena lateral de un aminoácido del péptido blanco de unión específica. Esto se puede llevar a cabo o bien acoplando la porción de unión al radiomarcador al péptido por formación de un enlace covalente con una cadena lateral de aminoácido particular o a través de la incorporación de un aminoácido conjugado a una porción de unión al radiomarcador durante la síntesis peptídica.

En el primer caso, por ejemplo, la porción de unión al radiomarcador ClCH_{2}CO. Gly-Gly-Cys-Lys.amida (protegida durante la síntesis, entre otras cosas por tritilación del grupo tiol del residuo de cisteína) se acopla a pH 8-10 al péptido de unión al receptor de somatostatina ciclo.(N-CH_{2}).Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy para formar el péptido ciclo.(N-CH_{2}).Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy (CH_{2}CO).Gly-Gly-Cis-Lys.amida (después de la desprotección). En esta fórmula, se entenderá que la porción de unión al radiomarcador está unida covalentemente al átomo de azufre de la cadena lateral de homocisteína.

Alternativamente, la porción de unión al radiomarcador BAT (ácido N^{6}-N^{9}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanoico) se incorpora en el péptido de unión a leucocitos formil.Met-Leu-Phe-Lys.amida usando el derivado de lisina preparado, N\alpha(Fmoc)-N\epsilon(N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6}, N^{9}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltio-propil)-6,9-diazanonanoil)lisina durante la síntesis peptídica.

Otras porciones de unión al radiomarcador de la invención se pueden introducir en el péptido blanco específico durante la síntesis peptídica. La porción de unión al radiomarcador que contiene ácido picolínico se puede unir covalentemente al grupo \epsilon-amino de la lisina para obtener, por ejemplo, \alphaN(Fmoc)-Lys-\epsilonN[Pic-Gly-Cys(grupo protector)], que se puede incorporar en cualquier posición en la cadena del péptido. Esta secuencia es particularmente ventajosa porque ofrece una modalidad fácil de incorporación en el péptido de unión que es el blanco.

Para formar un complejo de tecnecio radiactivo con los péptidos de esta invención, el complejo de tecnecio, preferentemente una sal de pertecnectato de Tc 99 m, se hace reaccionar con los péptidos de esta invención en presencia de un reductor. Los reductores preferidos son iones ditionito, estannoso y ferroso; el reductor que más se prefiere es cloruro estannoso. En otra materialización preferida, el reductor es un reductor en fase sólida. Se provee convenientemente de complejos y medios para preparar dichos complejos en forma de un juego de reactivos que comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada de un péptido de la invención que va a ser marcado y una cantidad suficiente de reductor para marcar el péptido con Tc 99 m. Alternativamente, se puede formar el complejo haciendo reaccionar un péptido de esta invención con un complejo lábil preformado de tecnecio y otro compuesto conocido como un ligando de transferencia. Este proceso se conoce como intercambio de ligandos y es bien conocido por los técnicos con experiencia en el tema. El complejo lábil se puede formar usando dichos ligandos de transferencia como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetato de Tc 99 m útiles con la presente invención se incluyen las sales de metales alcalinos como las sales de sodio, las sales de amonio o de alquilamonio inferiores.

En una materialización preferida de la invención, se proporciona un juego de reactivos para preparar péptidos marcados con tecnecio. Los péptidos de la invención se pueden sintetizar químicamente utilizando métodos y medios bien conocidos por los técnicos con experiencia en el tema y se describen a continuación. Los péptidos preparados de este modo están compuestos por entre 3 y 100 residuos de aminoácidos, y están unidos covalentemente a una porción de unión al radiomarcador donde la porción de unión al radiomarcador se une a un radioisótopo. Una cantidad apropiada del péptido se introduce en un vial que contiene un reductor, como cloruro estannoso o un reductor en fase sólida, en una cantidad suficiente para marcar el péptido con Tc 99 m. También puede estar incluida una cantidad apropiada de un ligando de transferencia como los descritos (como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo). Los péptidos marcados con tecnecio de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el agregado de una cantidad apropiada de Tc 99 m o de complejo de Tc 99 m en los viales y mediante reacción en las condiciones que se describen en el Ejemplo 3 a continuación.

Los péptidos marcados radiactivamente provistos por la presente invención se proporcionan con una cantidad adecuada de radiactividad. Para formar complejos radiactivos de Tc 99 m, en general se prefiere formar complejos radiactivos en soluciones que contienen radiactividad a concentraciones entre aproximadamente 0,01 mili Curie (mCi) y 100 mCi por mL.

Los péptidos marcados con tecnecio provistos por la presente invención se pueden usar para visualizar lugares en el organismo de un mamífero. De conformidad con esta invención, los péptidos marcados con tecnecio se administran en una dosis inyectable única. Cualquiera de los vehículos comunes conocidos por los técnicos con experiencia en el tema, como solución salina estéril o plasma, se pueden utilizar después del radiomarcado para la preparación de la solución inyectable para diagnosticar mediante imágenes diversos órganos, tumores y similares de conformidad con esta invención. En general, la unidad de dosificación a administrar tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a 100 mCi, preferentemente de 1 mCi a 20 mCi. La unidad de dosificación de la solución a inyectar es de aproximadamente 0,01 mL a 10 mL. Después de la administración intravenosa, la obtención de imágenes del órgano o tumor in vivo puede tener lugar en unos pocos minutos. Sin embargo, la obtención de imágenes puede tener lugar, si se desea, en horas o incluso más tiempo, después que el péptido radiomarcado es inyectado en un paciente. En la mayoría de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulará en el área de la que se van a obtener imágenes en aproximadamente 0,1 de hora para permitir la toma de gammagrafías. Cualquier método convencional de gammagrafía con fines diagnósticos se puede utilizar de conformidad con esta
invención.

Los péptidos y complejos marcados con tecnecio 99 m provistos por la invención se pueden administrar por vía intravenosa en cualquier medio convencional para inyección intravenosa como un medio salino acuoso, o en plasma sanguíneo. Dichos medios también pueden contener adyuvantes farmacéuticos convencionales como, por ejemplo, sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico para ajustar la presión osmótica, tampones, conservantes y similares. Entre los medios preferidos se encuentran la solución salina isotónica y el plasma.

Los métodos para preparar y marcar estos compuestos se ilustran en mayor profundidad en los ejemplos siguientes. Estos ejemplos ilustran ciertos aspectos del método descrito precedentemente y resultados ventajosos. Estos ejemplos se muestran a título ilustrativo y no con carácter limitante.

Ejemplo 1 Síntesis peptídica en fase sólida

La síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) se llevó a cabo a una escala de 0,25 milimol (mmol) usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems Modelo 431A y usando 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como protección del amino terminal, acoplando con diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol o 2-(1H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluroniohexafluorofosfato/hidroxibenzotriazol (HBTU/HOBT) y usando resina p-hidroximetilfenoxi-metilpoliestireno (HMP) para los ácidos carboxilo terminal o resina Rink amida para las amidas carboxilo terminal. Los productos unidos a resina se cortaron rutinariamente usando una solución compuesta por ácido trifluoroacético, agua, tioanisol, etanoditiol, y trietilsilano, preparada en las proporciones de 100:5:5:2,5:2 durante 1,5 a 3 h a temperatura ambiente.

Cuando fue apropiado se introdujeron los grupos \alphaN-formilo tratando el péptido cortado, desprotegido con exceso de anhídrido acético en 98% de ácido fórmico y agitando durante cerca de 18 horas seguido de purificación por HPLC. Cuando fue apropiado se introdujeron grupos acetilo N-terminales tratando el péptido amino N-terminal libre unido a la resina con 20% v/v de anhídrido acético en NMP (N-metilpirrolidinona) durante 30 min. Cuando fue apropiado se introdujeron, grupos 2-cloroacetilo y 2-bromoacetilo o bien usando el ácido 2-halo-acético apropiado como el último residuo a ser acoplado durante la SPPS o bien tratando el péptido amino N-terminal libre unido a la resina o bien con ácido 2-halo-acético/diisopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida en NMP o el anhídrido 2-halo-acético/diisopropiletilamina en NMP. Cuando fue apropiado, se ciclaron péptidos 2-haloacetilados purificados por HPLC agitando una solución de 0,1-1,0 mg/mL en tampón de bicarbonato o de amoníaco (pH 8) con o sin EDTA 0,5-1,0 mM durante 1 a 48 horas, seguido de acidificación con ácido acético, liofilización y purificación por HPLC. Cuando fue apropiado, se realizaron ciclaciones por enlace disulfuro Cys-Cys tratando los péptidos precursores con grupo tiol libre de cisteína a 0,1 mg/mL en tampón a pH 7 con alícuotas de K_{3}Fe(CN)_{6} 0,006 M hasta persistencia de un color amarillo estable. El oxidante en exceso se redujo con cisteína en exceso, la mezcla se liofilizó y después se purificó por HPLC.

Cuando fue apropiado se introdujo el grupo "Pica" conjugando picolilamina a un péptido precursor utilizando diisopropilcarbodiimida y N-hidroxisuccinimida. Cuando fue apropiado se introdujeron los ligandos BAT o bien usando el ácido BAT apropiado como el último residuo a acoplar durante la SPPS o bien tratando el péptido amino N-terminal libre unido a la resina con ácido BAT/diisopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida en NMP. Cuando fue apropiado, se conjugó [BAM] al péptido activando primero el carboxilato del péptido con una mezcla de diisopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida o HBTU/HOBt en DMF, NMP o CH_{2}Cl_{2}, seguido de acoplamiento en presencia de diisopropiletilamina; después del acoplamiento, el conjugado se desprotegió como se describió
antes.

Cuando fue apropiado, se prepararon aductos BSME haciendo reaccionar péptidos que contenían un solo tiol (5 a 50 mg/mL en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8) con 0,5 equivalentes molares de BMME (bis-maleimidometil-
éter) disuelto previamente en acetonitrilo a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 18 horas. La solución se concentró y el producto se purificó por HPLC.

Cuando fue apropiado, se prepararon aductos de TSEA haciendo reaccionar un péptido que contenía un único tiol (a concentraciones de 10 a 100 mg/mL de péptido en DMF, o 5 a 50 mg/mL de péptido en fosfato de sodio 50 mM (pH 8)/acetonitrilo o THF) con 0,33 equivalentes molares de TMEA (tris(2-maleimidoetil)amina; según se divulga en U.S. Nº de serie 08/044,825, que se incorpora aquí como referencia) disuelto previamente en el acetonitrilo o la DMF, con o sin 1 equivalente molar de trietanolamina, a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 18 h. Dichas mezclas de reacción que contenían aductos se concentraron y después los aductos se purificaron usando
HPLC.

Cuando fue apropiado, se prepararon aductos de BAT-BS haciendo reaccionar un péptido que contenía un único tiol (a concentraciones de 2 a 50 mg/mL de péptido en fosfato de sodio 50 mM (pH 8)/acetonitrilo o THF) con 0,5 equivalentes molares de BAT-BM (N-[2-(N',N'-bis(2-maleimidoetil)aminoetil)]-N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6},N^{9},-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-6,9-diazanonanamida; según se divulga en U.S. Nº de serie 08/044,825, que se incorpora aquí como referencia) disuelto previamente en acetonitrilo o THF, a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 18 h. Después la solución se evaporó a sequedad y los conjugados [BAT-BS]-péptido se desprotegieron por tratamiento con 10 mL de TFA y 0,2 mL de trietilsilano durante 1 h. La solución se concentró, los aductos se precipitaron con éter y después se purificaron por HPLC.

Se purificaron péptidos crudos por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) preparativa utilizando una columna Waters Delta Pak C18 y gradiente de elución usando ácido trufluoroacético (TFA) al 0,1% en agua con acetonitrilo. Se evaporó el acetonitrilo de las fracciones eluidas que después se liofilizaron. La identidad de cada producto se confirmó por espectroscopía de masa de bombardeo atómico rápido (FABMS).

Ejemplo 3 Un método general para radiomarcado con Tc 99 m

0,1 mg de un péptido preparado como en el Ejemplo 2 se disolvió en 0,1 mL de agua o tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH = 5, 6 ó 7,4). Se preparó gluceptato de Tc 99 m reconstituyendo un vial de Glucoscan (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) con 1,0 mL de pertecnetato sódico de Tc 99 m que contenía hasta 200 mCi y se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se agregaron 25 \mul de gluceptato de Tc 99 m al péptido y se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente o a 100ºC durante 15 a 30 minutos y después se filtró a través de un filtro
de 0,2 \mum.

La pureza del péptido marcado con Tc 99 m se determinó por HPLC usando las condiciones siguientes: se cargó una columna analítica Waters DeltaPure RP-18, 5 \mu, 150 mm x 3,9 mm con cada péptido radiomarcado y los péptidos eluyeron a una velocidad de flujo del solvente igual a 1 mL/min. El gradiente de elución se realizó empezando con 10% del solvente A (CF_{3}COOH al 0,1%/H_{2}O) hasta 40% del solvente B_{90} (CF_{3}COOH al 0,1%/CH_{3}CN al 90%/H_{2}O) en el transcurso de 20 min.

Los componentes radiactivos se detectaron con un detector radiométrico en línea unido a un registrador de integración. El gluceptato de Tc 99 m y el pertecnetato sódico de Tc 99 m eluyeron a los 1 a 4 minutos en esas condiciones, en tanto el péptido marcado con Tc 99 m eluyó mucho tiempo después.

La tabla siguiente ilustra el exitoso marcado de péptidos con Tc 99 m preparados según el Ejemplo 2 usando el método descrito aquí.

TABLA I

Péptidos	FABMS MH^{+}	Rendimiento	HPLC R_{T} (min)
		radioquímico (%)
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.	1.129	98^{2}	15,1; 17,2
(CH_{3}CO.GGC.amida)
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.	1.258	99^{2}	15,0
(CH_{3}CO.GGCK.amida)
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.	1.285	99^{1}	15,1
(CH_{3}CO.GGCR.amida)
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.	1.386	N.D.	N.D.
(CH_{3}CO.GGCKK.amida)
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.	1.244	98^{3}	7,0
(CH_{3}CO.GGC.Orn.amida)
* Los superíndices se refieren a las siguientes condiciones de marcado:

^{1} =: en HPCD al 10% a temperatura ambiente

^{2} =: en etanol/agua 50/50 a temperatura ambiente

^{3} =: en NaCl al 0,9% a 100ºC

Métodos HPLC (indicados por superíndice después de R_{T}):

\quad: Columna Waters-1, 100% de solución A \rightarrow 100% de solución B en 10 min

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TABLA II

Péptidos	FABMS MH^{+}	Rendimiento	HPLC R_{T} (min)
		radioquímico %
formil-MLFK.(BAT).amida	884	99	12,6
formil-MLFK.(BAT)	884	96	11,9; 12,8
formil-MLFK.(BAT).KKKKK.amida	1.524	96	11,7; 12,2
formil-MLFK.(BAT).GSGSGS.amida	1.315	97	11,9; 12,8
formil -MLFK.(BAT).E	1.013	99	12.3
formil-MLFK.(BAT).EGE	1.200	98	13.7
(formil-MLFK.(BAT).GGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida)_{2}-	3.477	99	11,9; 12,4
BSME
YRALVDTLKFVTQAEGAK.(BAT).amida	2.329	98	11.4
K.(BAT).D.Nal.C_{Me}YW_{D}KVC_{ME}T.amida	1.573	97	12,0; 12,5
(DTPA).{_{D}-Nal.SYW_{D}KVTK.(BAT)}_{2}.amida	3.210	97	12,1; 12,5

TABLA II (continuación)

Péptidos	FABMS MH^{+}	Rendimiento	HPLC R_{T} (min)
		radioquímico %
(DTPA).{_{D}-Nal.SYW_{D}KVTK.(BAT)}_{2}.amida	1.801	96	11,8; 12,0
(DTPA)K(BAT)._{D}-Nal.C_{Me}YW_{D}KVC_{Me}T.amida	1.949	96	11,8; 12,0
pGlu.GVNDNEEGFFSARK.(BAT).amida	1.997	N.D.	N.D.
* Las condiciones de marcado siguientes se usaron con los péptidos apropiados:

1.: El péptido se disuelve en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4) y se marca a temperatura ambiente.

2.: El péptido se disuelve en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4) y se marca a 100ºC.

3.: El péptido se disuelve en agua y se marca a temperatura ambiente.

4.: El péptido se disuelve en agua y se marca a 100ºC.

5.: El péptido se disuelve tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 6,0) y se marca a 100ºC.

6.: El péptido se disuelve en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 5,0) y se marca a temperatura ambiente.

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** Métodos de HPLC:

general:: solvente A = CF_{3}COOH al 0,1%/H_{2}O

\quad: solvente B_{70} = CF_{3}COOH al 0,1%/CH_{3}CN al 70%/H_{2}O

\quad: solvente B_{90} = CF_{3}COOH al 0,1%/CH_{3}CN al 90%/H_{2}O

\quad: velocidad de flujo del solvente = 1 mL/min

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Columna Vydak =: columna analítica Vydak 218TP54 RP-18, 5 \mu x 220 mm x 4,6 mm con columna de protección

Columna Brownlee =: columna Brownlee Spheri-5 RP-18, 5 \mu x 22O mm x 4,6 mm

Columna Waters =: Waters Delta-Pak C18, 5 \mum, 39 x 150 mm

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Método 1:: Columna Brownlee 100% de A hasta 100% de B_{70} en 10 min

Método 2:: Columna Vydak 100% de A hasta 100% de B_{90}, en 10 min

Método 3:: Columna Vydak 100% de A hasta 100% de B_{70} en 10 min

Método 4:: Columna Brownlee 100% de A hasta 100% de B_{90} en 10 min

Método 5:: Columna Waters 100% de A hasta 100% de B_{90} en 10 min

Las abreviaturas de una sola letra para los aminoácidos se pueden encontrar en G. Zubay, Biochemistry (2da. Ed.), 1988 (MacMillen Publishing: Nueva York) p. 33; Ac = acetilo; Pic = picolinoilo (piridina-2-carbonilo) = ácido 6-aminocaproico; Hly = homolisina; Acm = acetamidometilo; pGlu = ácido piro-glutámico; Mob = 4-metoxibencilo; Pica = picolilamina (2-(aminometil)piridina); Apc = L-[S-(3-aminopropil)cisteína; F_{D} = D-fenilalanina; W_{D}= _{D}-triptofano; Y_{D} = _{D}-tirosina; Cpa = L-(4-clorofenil)alanina; Thp = ácido 4-amino-tetrahidrotiopiran-4-carboxílico; ma = ácido mercaptoacético; D-Nal = D-2-naftilalanina; Dpg = dipropilglicina; Nle = norleucina; BAT = ácido N^{6},N^{9}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanoico; ácido BAT (protegido) = ácido N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-6,9-diazanonanoico; BAM = N^{1},N^{4}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-1,4,10-triazadecano; BAM (protegido) = N^{1}-(t-butoxicarbonil)-N^{1},N^{4}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-1,4,10-triazadecano; [BAT-BM] = N-[2-(N',N'-bis(2-maleimidoetil)aminoetil]-N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-6,9-diazanonanamida; [BAT-BS] = N-[2-(N',N'-bis(2-succinimidoetil)aminoetil]-N^{6},N^{9}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanamida; [BMME] = bis-maleimidometiléter; [BSME] = bis-succinimidometiléter; [DTPA] = ácido dietilenetriaminopentaacético; Amp = 4-amidinofenilalanina.

Ejemplo 3 Localización y obtención de imágenes in vivo de la placa aterosclerótica usando Compuesto P215 marcado con Tc 99 m en el modelo de conejo con hipercolesterolemia

Se dividen veintidós conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) de ambos sexos que pesan entre 2 y 3 kg en dos grupos. El grupo de control de los conejos se aloja y se alimenta con comida comercial para conejos (Purina). Al grupo HC se lo alimenta con una dieta estándar rica en colesterol (comida para conejo mezclada con una concentración de 1% p/p de colesterol) desde la semana 7 hasta la semana 28 de vida. A todos los animales se les da agua a voluntad.

Se prepara P215 ({BAT}.RALVDTLKFVTQAEGAK.amida) marcada con Tc 99 m como se describe en el Ejemplo 1. Aproximadamente 250 a 400 \mug del péptido se marcan con 140 a 160 mCi de Tc 99 m y se preparan en unidades de dosificación de 7 a 8 mCi (12,5 a 20,0 \mug/conejo; 6 a 7/\mug/kg) en dosis de 0,2 mL de volumen. Los conejos adultos se dosifican con péptido marcado con Tc 99 m por vía intravenosa en una vena lateral del oído mediante infusión lenta en bolo (aproximadamente 0,1 mL/min). Se usa una cámara gamma equipada con un colimador de abertura diminuta (abertura de 5 mm) y ventana de energía fijada para Tc 99 m y programada para acumular 500.000 cuentas o explorar durante un tiempo deseado para adquirir las imágenes. Poco antes de la obtención de imágenes, se anestesia a los animales con una mezcla de ketamina y xilazina (5:1, 1 mL/kg intramuscularmente).

Las imágenes de la cámara gamma se obtienen a 40º-45º apenas por debajo del corazón (vista izquierda anterior oblicua [LAOS]) para delinear el arco aórtico y mirar la aorta descendente. Las imágenes se adquieren 1 y 2 h y ocasionalmente 3 y 5 h después de la inyección. Se inyecta anestesia complementaria según sea necesario antes de cada obtención de imagen.

A las 2,5 h (después de 2 h de exploración), los animales se sacrifican con una dosis intravenosa de pentobarbital sódico. Después de la autopsia, la aorta se retira y los vasos ramificados se disecan separados de la válvula aórtica hacia la región abdominal media. Uso un colimador de orificio paralelo, también se toman imágenes de la aorta ex corpora. A continuación, las aortas se abren longitudinalmente y se tiñen con Sudán IV, quedando de ese modo la placa aterosclerótica de un color rojo ladrillo intenso. El endotelio aórtico exento de lípidos y sin lesionar retiene su color normal, aspecto blanco-rosado brillante en esas condiciones.

Correlaciones positivas entre las imágenes con P215 marcado con Tc 99 m in vivo y ex corpora y los patrones de depósito del Sudán IV en las aortas de conejos tratados con HC indican que este agente para gammagrafía es capaz de formar imágenes de la placa aterosclerótica.

Ejemplo 4 Obtención de imágenes in vivo usando el Compuesto P357 marcado con Tc 99 m de Trombosis de venas profundas en un modelo canino

Se sedan perros Mongrel (de 25 a 35 lb., en ayuno de toda la noche) con una combinación de ketamina y aceprozamina intramuscularmente y después se anestesian con pentobarbital sódico por vía intravenosa. Se introduce un angiocatéter de calibre 18 en la mitad distal de la vena femoral derecha y se coloca una espiral de acero inoxidable Dacron® de 8 mm enroscada para embolización (Cook Co., Bloomington IN) en la vena femoral aproximadamente a la mitad del fémur en cada animal. Se retira el catéter, se sutura la herida y se documenta la ubicación de la espiral por radiografía. Después se deja que los animales se recuperen durante toda la noche.

Al día siguiente de la colocación del espiral, se vuelve a anestesiar a cada animal, se le coloca goteo de solución salina intravenoso en cada pata delantera y se introduce un catéter vesical urinario para recoger la orina. El animal se coloca en posición supina bajo una cámara gamma equipada con un colimador de baja energía, para todo propósito y centrada en el fotopico para Tc 99 m. Las imágenes se adquieren en un sistema de computadora Mac NucLear.

Se inyecta P357 marcado con Tc 99 m {(CH_{2}CO-Y_{D},Apc.GDCGGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida)_{2}-[BAT-BS]} {185 a 370 mBq (5 a 10 mCi) Tc 99 m y 0,2 a 0,4 mg de P357) en una línea intravenosa de una pata delantera en su punto de inserción. La segunda línea se mantiene para la recolección de sangre. Se adquieren imágenes anteriores de las piernas para 500.000 cuentas o 20 min (lo que sea más corto), aproximadamente 10 a 20 min y aproximadamente 1, 2, 3 y 4 h después de la inyección. Después de la obtención de la imagen final, cada animal se anestesia profundamente con pentobarbital. Se extraen dos muestras de sangre en una punción cardíaca usando una jeringa heparinizada seguido de la dosis de sacrificio de una solución saturada de cloruro de potasio administrada por inyección intravenosa intercardíaca o en bolo. Se disecan cuidadosamente la vena femoral que contiene el trombo y muestras del músculo del muslo. Después se diseca el trombo fuera del vaso y se coloca en un tubo de ensayo previamente pesado. Después se pesan las muestras del trombo y se cuentan en un contador de posiciones gamma en el canal del Tc 99 m. También se cuentan las fracciones conocidas de las dosis inyectadas.

Se determinan el peso del trombo fresco, el porcentaje de dosis inyectada (% de DI)/g en el trombo y la sangre obtenida apenas antes del sacrificio y las relaciones trombo/sangre y trombo/músculo. Se determinan las relaciones trombo/fondo mediante el análisis de las cuentas/píxel medidos en regiones de interés (ROI) extraídos sobre el trombo y el músculo adyacente de las imágenes almacenadas en la computadora.

Estos resultados se usan para demostrar que se pueden localizar eficientemente trombos en venas profundas in vivo.

Ejemplo 5 Gammagrafía y Biodistribución de los péptidos marcados con Tc 99 m

Para demostrar la eficacia de los reactivos peptídicos marcados con Tc 99 m según lo estipulado antes, se inocularon intramuscularmente conejos blancos de Nueva Zelanda en la pantorrilla izquierda con una cepa potente de E. coli. Después de 24 h, los animales se sedaron con una inyección i.m. de ketamina y xilazina, y después se les inyectó i.v. péptido marcado con Tc 99 m (\leq150 \mug, 2 a 10 mCi). Los animales se colocaron en posición supina en el campo de visión de una cámara gamma (colimador LEAP/centrado en el fotopico para Tc 99 m) y se les tomaron imágenes en el transcurso de la primera hora post inyección, y después a intervalos de aproximadamente 1 h en el transcurso de las siguientes 3 horas post inyección. Se dejó que los animales se recuperaran entre las adquisiciones de imágenes y se los volvió a anestesiar según fue necesario.

Una vez finalizada la última toma de imagen, se sacrificó cada animal mediante sobredosis de fenobarbital i.v. y se disecó para obtener muestras de sangre y del tejido muscular infectado y de control. Las muestras de tejido se pesaron, y junto con una cantidad estándar de la dosis inyectada, se contaron usando un contador gamma y se determinó el porcentaje de dosis inyectada (por gramo de tejido) remanente en los tejidos. Se calcularon relaciones entre el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido muscular infectado y no infectado y entre el tejido muscular infectado y la sangre, para cada péptido. Estos resultados se presentan en la tabla siguiente para el reactivo marcado con Tc 99 m de la invención, que tiene la fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

formilMLFK(BAT).amida

Péptido	A	B	C	D	E
formilMLFK(BAT).amida	0,0215	0,0028	7,68	0,006	3,58
A = DI %/gramo de músculo infectado
B = DI %/gramo de músculo de control
C = Relación entre músculo infectado: músculo de control
D = DI %/gramo de sangre
E = Relación entre músculo infectado: sangre

Ejemplo 6 Localización y toma de imágenes in vivo de tumores que expresan al receptor de somatostatina (SSTR) en ratas

La obtención de imágenes in vivo de los receptores de somatostatina expresados por las células tumorales de ratas se realizó esencialmente según describen Bakker et al. (1991, Life Sciences 49: 1.593-1.601).

Células de tumor pancreático de ratas CA20948, descongeladas del homogeneizado del tumor recogido congelado, se implantaron intramuscularmente en una suspensión de 0,05 a 0,1 mL/animal, en el muslo trasero derecho de ratas de Lewis de 6 semanas. Los tumores se dejaron crecer hasta aproximadamente 0,5 a 2 g, y el homogeneizado del tumor se usó para implantar un segundo conjunto virgen de ratas de Lewis. Se repitió el pasaje de esta manera para generar generaciones sucesivas de animales portadores del tumor. Los animales portadores de tumor utilizados para los estudios in vivo fueron generalmente del tercer al quinto pasaje y tenían tumores de 0,2 a 2 g.

Para estudios de especificidad de localización del radiotrazador en los tumores, a los animales seleccionados se les administró una dosis subcutánea de bloqueo de SSTR (4 mg/kg) de octreotida 30 minutos antes de la inyección del radiotrazador. (Bakker et al demostraron que este protocolo producía una disminución de la captación tumoral de la ^{111}In-[DTPA]octreotida en 40%.)

\newpage

Se encerraron ratas de Lewis del tercer a quinto pasaje portadoras de tumor CA20948 y se les inyectó intravenosamente a través de la vena dorsal de la cola una dosis de 0,15 a 0,20 mCi de péptido marcado con ^{99 \ m}Tc correspondiente a 3 a 8 \mug de péptido en 0,2 a 0,4 mL.

A determinados tiempos, se sacrificaron los animales por dislocación cervical y se realizó una autopsia selectiva. Las muestras de tejido obtenidas se pesaron y se contaron junto con una alícuota de la dosis inyectada en un contador de posiciones gamma.

Los resultados de biodistribución a los 90 minutos de los péptidos radiomarcados seleccionados se presentan en la Tabla I. Notablemente, ^{99m}Tc-P587, ^{99m}Tc-P617, ^{99m}Tc-P726, y ^{99m}TC-P736 mostraron una gran captación por parte del tumor y las relaciones tumor/sangre demostraron su alta especificidad de captación por parte del tejido blanco (tumor).

La Figura 1 muestra una imagen de ^{99m}Tc-P587 en una rata portadora de un tumor. La alta captación en el tumor en la pierna inferior (flecha) es claramente visible.

La captación de ^{99m}P587-Tc en tumores en ratas se comparó con y sin tratamiento de inyección previa de octreotida, un análogo de la somatostatina que se sabe que se une al receptor de somatostatina in vivo. En estos experimentos, el bloqueo del receptor por administración de octreotida antes de la administración de ^{99m}Tc-P587 reduce la captación tumoral específica del péptido radiomarcado en un 76%. Estos resultados confirmaron que la unión de ^{99m}TC-P587 in vivo fue específica del SSTR.

TABLA III

		% de ID/g
N°	Péptidos	Tumor	Sangre	Tumor/sangre

P736	ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.GGCRK.amida)	2,1	0,24	9

P587	ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.GGCK.amida)	3,4	0,61	6

P617	ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.GGCR.amida)	6,7	0,73	9

P726	ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.KKC.amida)	2,5	0,30	8

Se debe entender que la divulgación precedente recalca ciertas materializaciones específicas de la invención y que todas las modificaciones o las opciones equivalentes están comprendidas por el espíritu y el alcance de la invención como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Un reactivo para preparar un agente para gammagrafía para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que comprende un péptido de unión específica que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de 3 a 100 aminoácidos y una porción de unión a tecnecio 99 m unida covalentemente a él, donde la porción de unión a tecnecio 99 m está unida covalentemente a una cadena lateral de un residuo de aminoácido del péptido de unión específica y donde la porción de unión a tecnecio 99 tiene una fórmula:

Cp(aa)Cp

donde Cp es una cisteína protegida y (aa) es cualquier aminoácido primario \alpha o \beta que no contenga un grupo tiol.

2. Un reactivo de la reivindicación 1 donde la cisteína protegida de la porción de unión al tecnecio 99 m que tiene la fórmula 1 tiene un grupo protector de la fórmula

-CH_{2}NH-CO-R

donde R es un alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, 2-,3-,4-piridilo, fenilo, o fenilo sustituido con alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, carboxi, o alcoxicarbonilo inferior.

3. Un reactivo de la reivindicación 1 donde la porción de unión a tecnecio 99 m tiene la fórmula:

5

4. Un reactivo para la preparación de un agente para gammagrafía para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que comprende un péptido de unión específica que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de 3 a 100 aminoácidos y una porción de unión a tecnecio 99 m unida covalentemente a él, donde está unida covalentemente a una cadena lateral de un residuo de aminoácido del péptido de unión específica, y donde la porción de unión a tecnecio 99 m comprende una porción que contiene un solo grupo tiol de fórmula:

A-CZ(B)-\{C(R^{1}R^{2})\}_{n}-X

donde

: A es H, HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R^{4};

: B es H, SH, -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), o R^{4};

: X es H, SH, -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4};

: Z es H o R^{4};

: R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico.

: n es 0, 1 ó 2;

: (péptido) es un péptido de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos;

y

cuando B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), X es SH, y n es 1 ó 2;

cuando X es -NHR^{3} -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2;

cuando B es H o R^{4}. A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC, X es SH, y n es 0 ó 1;

cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) y cuando X es SH, B es -NHR^{3} o N(R^{3})-(aminoácido o péptido);

cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC y B es SH;

cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC, B es SH y n es 0;

y donde la porción tiol está en la forma reducida y (aminoácido) es cualquier aminoácido primario \alpha o \beta que no contenga un grupo tiol.

5. Un reactivo de la reivindicación 4 donde la porción de unión a tecnecio 99 m se selecciona de las porciones que tienen las fórmulas:

IIa.-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X},

IIb.-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2},

donde

: (aminoácido)^{1} y (aminoácido)^{2} son cada uno independientemente cualquier aminoácido \alpha o \beta de origen natural, modificado, sustituido o alterado que no contenga un grupo tiol;

: A es H, HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R^{4}

: B es H, SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4};

: X es SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4};

: Z es H o R^{4}:

: R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico;

: (péptido) es un péptido de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos;

: n es un número entero que es 0, 1 ó 2; y

cuando B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), X es SH y n es 1 ó 2;

cuando X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2;

cuando B es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1;

cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es -NHR^{3} o-N(R^{3})-(aminoácido o péptido) y cuando X es SH, B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido);

cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (péptido)-OOC y B es SH y n es 0;

y donde la porción tiol está en la forma reducida.

6. Un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el péptido de unión específica se selecciona de los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos:

: formil-MLF

: (VGVAPG)_{3}amida

: {VPGVG)_{4}amida

: RALVDTLKFVTQAEGAKamida

: RALVDTEFKVKQEAGAKamida

: PLARITLPDFRLPEIAIPamida

: GQQHHLGGAKAGDV

: PLYKKIIKKLLES

: LRALVDTLKamida

: GGGLRALVDTLKamida

: GGGLRALVDTLKFVTQAEGAKamida

: GGGRALVDTLKALVDTLamida

: GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR

: PSPSPIHPAHHKRDRRQamida

: GGGF_{D},Cpa.YW_{D}KTFTamida

: {SYNRGDSTC}_{3}-TSEA

: GGGLRALVDTLKamida

: GCGGGLRALVDTLKamida

: GCYRALVDTLKFVTQAEGAKamida,

y

: GC(VGVAPG)_{3}amida

7. Un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el péptido de unión específica es un péptido cíclico.

8. Un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el péptido de unión específica y la porción de unión a tecnecio 99 m están covalentemente unidos a través de un residuo de lisina o un residuo de homocisteína.

9. Un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el reactivo comprende además una porción de ligamiento polivalente unida covalentemente a una multiplicidad de compuestos de unión específica y/o ligada covalentemente a una multiplicidad de porciones de unión al radiomarcador para componer un reactivo para la preparación de un agente para gammagrafía, donde el peso molecular del agente para gammagrafía polivalente multimérico es menor que aproximadamente 20.000 dalton, opcionalmente donde la porción de ligamiento polivalente es bis-succinimidilmetiléter, ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico, N-[2-(N,N-bis(2-succinimido-etil)aminoetil)]-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-mercaptopropil)-6,9-diazanonanamida, tris(succinimidiletil)amina, tris(acetamidoetil)amina, bis-(acetamidoetil)éter, bis-(acetamidometil)éter, \alpha,\epsilon-bisacetilisina, lisina y 1,8-bis-acetamido-3,6-dioxa-octano, o un derivado de éstos.

10. Un agente para gammagrafía que comprende un reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la porción de unión a tecnecio 99 m está unida a tecnecio 99 m.

11. Un complejo formado haciendo reaccionar un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con tecnecio 99 m en presencia de un reductor, p. ej. ion ditionito, ion estannoso, o ion ferroso, o formado mediante el marcado del reactivo con tecnecio 99 m por intercambio de ligandos de un complejo de tecnecio 99 m previamente reducido.

12. Un juego de reactivos para elaborar una preparación radiofarmacéutica, donde dicho juego de reactivos comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y una cantidad suficiente de reductor para marcar el reactivo con tecnecio 99 m.

13. Un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar como un producto farmacéutico para obtener imágenes de un lugar dentro del organismo de un mamífero cuando el reactivo se marca con tecnecio 99 m.

14. Un proceso de preparación del reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el péptido se sintetiza químicamente in vitro, opcionalmente mediante síntesis peptídica en fase sólida.

15. Un complejo de tecnecio 99 m de un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

16. El uso de un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la preparación de un medicamento para obtener imágenes de un lugar dentro del organismo de un mamífero.