ES2263153T3 - Peptidos marcados con tecnecio 99 m para obtencion de imagenes. - Google Patents
Peptidos marcados con tecnecio 99 m para obtencion de imagenes.Info
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Abstract
SE HACE REFERENCIA A PEPTIDOS RADIOETIQUETADOS Y A METODOS PARA PRODUCIR DICHOS PEPTIDOS. ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A PEPTIDOS, METODOS Y EQUIPOS PARA CONSEGUIR DICHOS PEPTIDOS, ASI COMO METODOS PARA UTILIZAR DICHOS PEPTIDOS EN LA VISUALIZACION DE LUGARES DEL CUERPO DE UN MAMIFERO ETIQUETADOS CON TECNETIO-99M (TC-99M) VIA UNA MOLARIDAD DE ENLACE RADIOETIQUETADO UNIDA DE FORMA COVALENTE A UN PEPTIDO DE ENLACE ESPECIFICO MEDIANTE UNA CADENA LATERAL DE UN AMINOACIDO DEL PEPTIDO.
Description
Péptidos marcados con tecnecio 99 m para
obtención de imágenes.
Esta invención se relaciona con reactivos y
péptidos para radiodiagnóstico, y métodos para producir agentes para
radiodiagnóstico marcados. Específicamente, la invención se
relaciona con péptidos, métodos y equipos de reactivos para preparar
dichos péptidos, y métodos para usar dichos péptidos para obtener
imágenes de lugares del organismo de un mamífero marcados con
tecnecio 99 m (Tc 99 m) a través de una porción de unión al
radiomarcador que se une covalentemente a una cadena lateral de un
residuo de aminoácido del péptido de unión específica.
En el campo de la medicina nuclear, ciertas
afecciones patológicas se localizan, o se evalúa su extensión,
detectando la distribución de pequeñas cantidades de compuestos
trazadores marcados radiactivamente (denominados radiotrazadores o
radiofármacos). Los métodos para detectar estos radiofármacos se
conocen en general como técnicas de diagnóstico por imágenes o como
técnicas de diagnóstico por imágenes radiológicas.
En la obtención de imágenes radiológicas, el
radiomarcador es un radionucleido que emite radiación gamma y el
radiotrazador se localiza utilizando una cámara de detección de
radiación gamma (este proceso a menudo se denomina gammagrafía). El
lugar del que se toman imágenes es detectable porque el
radiotrazador se elige o bien para que se localice en un lugar
patológico (denominado contraste positivo) o, alternativamente, el
radiotrazador se elige específicamente para que no se localice en
dichos lugares patológicos (denominado contraste negativo).
Se deben considerar varios factores para una
obtención óptima de imágenes radiológicas en los seres humanos. Para
maximizar la eficacia de la detección, se prefiere un radionucleido
que emita energía gamma en el rango de 100 a 200 keV. Para reducir
al mínimo la dosis de radiación absorbida por el paciente, la
semidesintegración física del radionucleido debe ser tan corta como
el procedimiento de obtención de imágenes lo permita. Para permitir
que los exámenes se realicen cualquier día y en cualquier momento
del día, es ventajoso tener una fuente del radionucleido siempre
disponible en el centro clínico.
Se conoce una diversidad de radionucleidos que
son útiles para obtener imágenes radiológicas, incluidos ^{67}Ga,
^{99m}Tc (Tc 99 m), ^{111}In. ^{123}I, ^{125}I, y
^{169}Yb. El Tc 99 m es un radionucleido preferido porque emite
radiación gamma a 140 keV, tiene una semidesintegración física de 6
horas, y se puede producir fácilmente en el lugar utilizando un
generador de molibdeno 99/tecnecio 99 m.
La sensibilidad de los métodos de obtención de
imágenes que usan péptidos marcados radiactivamente es mucho mayor
que con otros radiofármacos conocidos por los técnicos en la
materia, puesto que la unión específica del péptido radiactivo
concentra la señal radiactiva sobre el área de interés. Se pueden
usar ventajosamente péptidos sintéticos pequeños que se unan
específicamente a los blancos de interés como la base para los
radiotrazadores. Esto es porque: 1. se pueden sintetizar
químicamente (en contraposición con la necesidad de producirlos en
un sistema biológico como bacterias o células de mamíferos, o de
tener que aislarlos de una sustancia derivada biológicamente como un
fragmento de una proteína); 2. son pequeños, en consecuencia un
radiotrazador unido a algo que no es el blanco se elimina
rápidamente del organismo, reduciendo de ese modo la radiactividad
de fondo (en otro lugar que no es el blanco) y permitiendo una buena
definición del blanco; y 3. los péptidos pequeños se pueden
manipular químicamente con facilidad para optimizar su afinidad por
un sitio de unión en particular.
Se prefieren como radiofármacos de rutina
moléculas de péptidos marcados pequeñas que se sinteticen
fácilmente. Existe una clara necesidad de péptidos sintéticos
pequeños marcados que se puedan inyectar directamente en un paciente
y que permitan obtener imágenes de lugares patológicos al
localizarse en dichos lugares. Los péptidos sintéticos pequeños
marcados con Tc 99 m ofrecen claras ventajas como radiotrazadores
para gammagrafía, debido a las propiedades del Tc 99 m como un
radionucleido para la obtención de imágenes y a la utilidad de los
péptidos sintéticos pequeños de unión específica como moléculas
radiotrazadoras.
En el estado anterior de la técnica se había
informado de péptidos radiomarcados.
Ege et al, Patente de los Estados Unidos
Nº 4,832,940 instruye sobre péptidos radiomarcados para obtener
imágenes de linfocitos T localizados.
Olexa et al, 1982, solicitud de Patente
Europea Nº 823017009 divulga un péptido radiomarcado aceptable desde
el punto de vista farmacéutico seleccionado entre el fragmento
E_{1} aislado de fibrina reticulada, el fragmento E_{2} aislado
de fibrina reticulada, y péptidos que tienen una secuencia de
aminoácidos intermedia entre los fragmentos E_{1} y E_{2}.
Ranby et al., 1988, PCT/US88/02276
divulga un método para detectar depósitos de fibrina en un animal
que comprende unir covalentemente un compuesto radiomarcado a la
fibrina.
Hadley et al., 1988, PCT/US88/03318
divulgan un método para detectar un coágulo de
fibrina-plaqueta in vivo que comprende los
pasos de (a) administración a un paciente de una proteína
trombolítica atenuada marcada, donde el marcador está selectivamente
unido a una porción de la proteína trombolítica distinta del dominio
de unión a la fibrina; y (b) detección del patrón de distribución de
la proteína trombolítica marcada en el paciente.
Lees et al., 1989, PCT/US89/01854
instruyen sobre péptidos radiomarcados para obtención de imágenes de
arterias.
Sobel, 1989, PCT/US89/02656 divulga un método
para localizar la posición de uno o más trombos en un animal usando
un activador del plasminógeno tisular enzimáticamente inactivo,
radiomarcado.
Stuttle, 1990, PCT/GB90/00933 divulga péptidos
marcados radiactivamente que contienen de 3 a 10 aminoácidos que
comprenden la secuencia arginina-glicina-ácido
aspártico (RGD), capaces de unirse a un lugar de unión de RGD in
vivo.
Maraganore et al., 1991. PCT/US90/04642
divulgan un inhibidor de trombos radiomarcado que comprende (a) una
porción inhibidora; (b) una porción ligadora; y (c) y una porción
sitio de unión a iones.
Rodwell et al., 1991, PCT/US91/03116
divulgan conjugados de "unidades de reconocimiento molecular"
con "dominios efectores".
Tubis et al., 1968, Int. J. Appl. Rad.
Isot. 19: 835-840 describen el marcado de un
péptido con tecnecio 99 m.
Sundrehagen, 1983, Int. J. Appl. Rad. Isot.
34: 1.003 describe el marcado de polipéptidos con tecnecio 99
m.
El uso de quelantes para el radiomarcado de
polipéptidos, y métodos para marcar péptidos y polipéptidos con Tc
99 m se conocían en el estado anterior de la técnica y se divulgan
en las solicitudes de Patente de los Estados Unidos en trámite Nº de
serie 07/653,012 y 07/807,062, las que se incorporan aquí como
referencia.
Aunque es óptima para la obtención de imágenes
radiológicas, la química del Tc 99 m no ha sido tan extensamente
estudiada como la de otros elementos y por esta razón no abundan los
métodos de radiomarcado con tecnecio. El Tc 99 m normalmente se
obtiene como pertecnetato de Tc 99 m (TcO_{4}; tecnecio en el
estado de oxidación +7), habitualmente de un generador de molibdeno
99/tecnecio 99 m. Sin embargo, el pertecnetato no se une bien a
otros compuestos. Por consiguiente, para radiomarcar un péptido, el
pertecnetato de Tc 99 m se debe convertir en otra forma. Dado que el
tecnecio no forma un ion estable en solución acuosa, se debe
mantener en dichas soluciones en la forma de un complejo de
coordinación que tenga suficiente estabilidad cinética y
termodinámica para evitar la descomposición y que dé como resultado
la conversión del Tc 99 m o bien en dióxido de tecnecio insoluble o
nuevamente en pertecnetato.
Dichos complejos de coordinación de Tc 99 m (en
los estados de oxidación +1 a +6) son conocidos. Sin embargo, muchos
de estos complejos son inapropiados para el radiomarcado debido a la
geometría molecular del complejo de coordinación. A los efectos del
radiomarcado, es particularmente ventajoso que el complejo de
coordinación sea formado como un quelato en el cual todos los grupos
dadores que rodean al ion de tecnecio son proporcionados por un
único ligando quelante. Esto permite al Tc 99 m quelado unirse
covalentemente a un péptido a través de un único ligador entre el
quelante y el péptido.
A veces se hace referencia a estos ligandos como
quelantes bifuncionales que tienen una porción quelante y una
porción de ligamiento. Dichos compuestos eran conocidos en el estado
anterior de la técnica.
Byrne et al., Patente de los Estados
Unidos Nº 4,434,151 describen quelantes bifuncionales derivados de
homocisteína tiolactona que pueden acoplar radionucleidos a
compuestos que contienen amino terminal que son capaces de
localizarse en un órgano o tejido para que se les tomen
imágenes.
Fritzberg, Patente de los Estados Unidos Nº
4,444,690 describe una serie de quelantes de tecnecio basados en
propanoato de 2,3-bis(mercaptoacetamido).
Byrne et al., Patente de los Estados
Unidos Nº 4,571,430 describen nuevos quelantes bifuncionales de
homocisteína tiolactona para quelar radionucleidos que pueden
acoplar radionucleidos a compuestos que contienen un grupo amino
terminal que son capaces de localizarse en un órgano o tejido para
que se les tomen imágenes.
Byrne et al., Patente de los Estados
Unidos Nº 4,575,556 describen nuevos quelantes bifuncionales de
homocisteína tiolactona para quelar radionucleidos que pueden
acoplar radionucleidos a compuestos que contienen un grupo amino
terminal que son capaces de localizarse en un órgano o tejido para
que se les puedan tomar imágenes.
Davison et al., Patente de los Estados
Unidos Nº 4,673,562 describen complejos quelantes de tecnecio de
ligandos bisamido-bistio y sales de éstos,
utilizados principalmente como agentes de monitoreo de la función
renal.
Nicolotti et al., Patente de los Estados
Unidos Nº 4,861,869 describen agentes acoplantes bifuncionales
útiles para formar conjugados con moléculas biológicas como los
anticuerpos.
Fritzberg et al., Patente de los Estados
Unidos 4,965,392 describen diversos quelantes basados en
mercaptoacetilglicilglicina protegidos en el S para marcar
proteínas.
Fritzberg et al., solicitud de Patente
Europea Nº 86100360.6 describen complejos ditiol, diamino o ácido
diamidocarboxílico o complejos amina útiles para preparar agentes
marcados con tecnecio para la obtención de imágenes.
Dean et al., 1989, PCT/US89/02634
describe agentes acoplantes bifuncionales para marcar proteínas y
péptidos.
Flanagan et al., solicitud de Patente
Europea Nº 90306428.5 divulgan el marcado de fragmentos de péptidos
sintéticos con Tc 99 m a través de un conjunto de moléculas
quelantes orgánicas.
Albert et al., solicitud de Patente
Internacional WO 91/01144 divulgan técnicas de obtención de imágenes
radiológicas que usan péptidos radiomarcados relacionados con
factores de crecimiento, hormonas, interferones y citocinas y
compuestos por un péptido de reconocimiento específico unido
covalentemente a un grupo quelante radionucleido.
Dean, solicitud de Patente de los Estados Unidos
en trámite Nº 07/653,012 instruye sobre reactivos y métodos para
preparar péptidos que comprenden un grupo quelante de Tc 99 m unido
covalentemente a un péptido de unión específica para obtener
imágenes radiológicas in vivo, y se incorpora aquí como
referencia.
Baidoo y Lever, 1990, Bioconjugate Chem.
1: 132-137 describen un método para marcar
biomoléculas usando un grupo bisamina bistiol que produce un
complejo catiónico de tecnecio.
Es posible radiomarcar un péptido simplemente
agregando una porción que contenga un grupo tiol como cisteína o
ácido mercaptoacético. Dicho procedimiento fue descrito en el estado
anterior de la técnica.
Schochat et al., Patente de los Estados
Unidos Nº 5,061,641 divulga radiomarcado directo de proteínas
compuestas por al menos un grupo sulfhidrilo "colgante".
Dean et al., solicitud de Patente de los
Estados Unidos en trámite 07/807,062 instruyen sobre péptidos
radiomarcados a través de grupos unidos que contienen tioles libres,
y se incorpora aquí como referencia.
Goedemans et al., WO 89/07456 describen
el radiomarcado de proteínas usando compuestos tiol cíclicos,
particularmente 2-iminotiolano y derivados.
Thornback et al., solicitud EP Nº
90402206.8 describen la preparación y el uso de proteínas o péptidos
radiomarcados usando compuestos que contienen tiol, en particular
2-iminotiolano.
Stuttle, WO 90/15818 describe el marcado con Tc
99 m de oligopéptidos que contienen RGD.
Burns et al, 1985, solicitud de Patente
Europea 85104959.3 describen compuestos bisamina bistiol para
preparar agentes de Tc 99 m pequeños neutros para obtención de
imágenes cerebrales.
Kung et al., 1986, solicitud Patente
Europea 86105920.2 describen compuestos bisamina bistiol para
preparar agentes de Tc 99 m pequeños neutros para obtención de
imágenes.
Bergstein et al., 1988, solicitud de
Patente Europea 88102252.9 describen compuestos de bisamina bistiol
para preparar agentes de Tc 99 m pequeños neutros para obtención de
imágenes cerebrales.
Bryson et al., 1988, Inorg. Chem.
27: 2.154-2.161 describen complejos neutros
de tecnecio 99 m que son inestables frente al exceso de ligando.
Misra et al., 1989, Tet. Let. 30:
1.885-1.888 describen compuestos de bisamina bistiol
para radiomarcado.
Bryson et al., 1990, Inorg. Chem.
29: 2.948-2.951 describen quelantes que
contienen dos grupos amido, un grupo tiol y un grupo piridina
sustituido que pueden formar complejos de Tc-99
neutros.
Taylor et al., 1990, J. Nucl. Med.
31: 885 (Abst) describen un complejo de Tc 99 m neutro para
la obtención de imágenes cerebrales.
El uso de quelantes para radiomarcar péptidos, y
métodos para marcar péptidos con Tc 99 m se conocían en el estado
anterior de la técnica y se divulgan en las solicitudes de Patente
de los Estados Unidos en trámite Nº de serie 07/653,012, 07/807,062,
07/871,282, 07/886,752, 07/893,981, 07/955,466, 08/019,864,
08/073,577, 08/210,822, 08/236,402 y 08/241,625, y péptidos
radiomarcados para usar como agentes para gammagrafía para obtener
imágenes de trombos se conocían en el estado anterior de la técnica
y se divulgan en las solicitudes de Patente en trámite Nº de serie
07/886,752, 07/893,981 y 08/044,825 y las solicitudes de Patentes
Internacionales PCT/US92/00757, PCT/US92/10716, PCT/US93/02320,
PCT/US93/03687, PCT/US93/04794, PCT/US93/05372,
PCT/US93/06029,
PCT/US93/09387, PCT/US94/01894, PCT/US94/03878, y PCT/US94/05895.
PCT/US93/09387, PCT/US94/01894, PCT/US94/03878, y PCT/US94/05895.
La presente invención proporciona agentes para
gammagrafía que son péptidos marcados radiactivamente. Los péptidos
radiomarcados de la invención están compuestos por péptidos que se
unen específicamente a un blanco in vivo y que están
covalentemente unidos a una porción de unión a un radiomarcador
donde la porción se une a un radioisótopo. Es una ventaja particular
de la presente invención que la porción de unión al radiomarcador
está covalentemente unida a una cadena lateral de un residuo de
aminoácido que compone el péptido.
Este modo de unión covalente es ventajoso por
una cantidad de razones. Primero, la unión covalente a una cadena
lateral de un aminoácido constituyente del péptido evita la
interferencia de la porción de unión al radiomarcador unida
covalentemente con las propiedades de unión específicas del péptido
de unión específica. Segundo, este arreglo permite utilizar péptidos
cíclicos, que por definición no están compuestos por terminaciones
amino o carboxi libres, conjuntamente con porciones de unión al
radiomarcador como agentes para gammagrafía útiles según se divulga
aquí. Tercero, la unión covalente a la cadena lateral de un
aminoácido constituyente permite que cada agente para gammagrafía de
la invención sea diseñado más flexiblemente para lograr óptimos
aumentos en la eficacia y reducciones en la antigenicidad, etc. La
conjugación a una cadena lateral de un aminoácido también permite
que la porción de unión al radiomarcador se agregue al péptido
durante la síntesis como un conjugado aminoacídico, o después de que
se haya logrado la síntesis del péptido completo. Por último, se
sabe que los péptidos cíclicos son resistentes a la digestión por la
exoproteasa, incorporando de ese modo la estabilidad mejorada de
dichos péptidos in vivo en los agentes para gammagrafía de
la invención.
En un primer aspecto de la presente invención,
se proporcionan péptidos radiomarcados capaces de proporcionar
imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero. Los
péptidos están compuestos por un péptido de unión específica que
tiene una secuencia de aminoácidos y una porción de unión al
radiomarcador unida covalentemente al péptido. Además, la porción de
unión al radiomarcador está covalentemente unida a una cadena
lateral de un aminoácido que compone el péptido. En una
materialización preferida, la porción de unión al radiomarcador está
unida covalentemente a la cadena lateral de un aminoácido que tiene
una cadena lateral que comprende una amina o un tiol, siendo el
aminoácido muy preferentemente lisina u homocisteína. En otra
materialización preferida, el radiomarcador es tecnecio 99 m.
Un aspecto de la invención proporciona un
reactivo para preparar un agente para gammagrafía para obtener
imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que
comprende un péptido de unión específica donde una porción de unión
al radiomarcador está unida covalentemente al péptido a través de
una cadena lateral de aminoácido de un aminoácido del péptido, donde
la porción de unión al radiomarcador tiene la fórmula:
I.C(pgp)^{s}-(aa)-C(pgp)^{s}
donde C(pgp)^{s} es
una cisteína protegida y (aa) es cualquier aminoácido primario
\alpha o \beta que no contenga un grupo tiol. En una
materialización preferida, el aminoácido es
glicina.
En otra materialización, la invención
proporciona un reactivo para preparar un agente para gammagrafía
para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un
mamífero, que comprende un péptido de unión específica donde una
porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida al
péptido a través de una cadena lateral de aminoácido de un
aminoácido del péptido, donde la porción de unión al radiomarcador
tiene la fórmula:
II.A-CZ(B)-\{C(R^{1}R^{2})\}_{n}-X
donde A es H, HOOC, H_{2}NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC o R^{4}; B es H, SH o -NHR^{3},
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4}; Z es H o
R^{4}; X es SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o
péptido) o R^{4}; R^{l}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son
independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o
ramificada o cíclico; n es 0, 1 ó 2; donde (péptido) es un péptido
de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos; y; (1) cuando B es -NHR^{3}
o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), X es SH y n es 1 ó 2;
(2) cuando X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o
péptido), B es SH y n es 1 ó 2; (3) cuando B es H o R^{4}, A es
HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC,
(aminoácido o péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1;
(4) cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es
-NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) y cuando X es
SH, B es -NHR^{3} o-N(R^{3})-(aminoácido
o péptido); (5) cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC y B es SH; (6) cuando Z es metilo, X es
metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o
péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC y B es SH y n es 0; y donde la porción
tiol está en la forma reducida y donde (aminoácido) es cualquier
aminoácido primario \alpha o \beta que no contenga un grupo
tiol.
En materializaciones particulares de este
aspecto de la invención, la porción de unión al radiomarcador tiene
una fórmula que es:
IIa.-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X},
IIb.-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2},
IIc.-(un
diaminoácido primario \alpha,\omega o
\beta,\omega)-(aminoácido)^{1}-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}
o
IId.-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}-(aminoácido)^{1}-(un
diaminoácido primario \alpha,\beta o
\beta,\gamma)
donde (aminoácido)^{1} y
(aminoácido)^{2} son cada uno independientemente cualquier
aminoácido \alpha o \beta de origen natural, modificado,
sustituido o alterado que no contenga un grupo tiol; A es H, HOOC,
H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido
o péptido)-OOC o R^{4}; B es H, SH o -NHR^{3},
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4}; Z es H o
R^{4}; X es SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o
péptido) o R^{4}; R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son
independientemente H un alquilo inferior de cadena lineal o
ramificada o cíclico; n es un entero que es o bien 0, 1 ó 2;
(péptido) es un péptido de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos; y:
(1) cuando B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o
péptido), X es SH y n es 1 ó 2; (2) cuando X es -NHR^{3} o
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2; (3)
cuando B es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o
péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1; (4) cuando A es
H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es -NHR^{3} o
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido) y cuando X es SH, B es
-NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido); (5) cuando X
es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o
péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC y B es SH; (6) cuando Z es metilo, X es
metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o
péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC y B es SH y n es 0; y donde el grupo
tiol está en la forma
reducida.
La invención también divulga un péptido
radiomarcado para obtener imágenes de lugares dentro del organismo
de un mamífero, que comprende un péptido de unión específica donde
una porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida al
péptido a través de una cadena lateral de aminoácido de un
aminoácido del péptido, donde la porción de unión al radiomarcador
tiene la fórmula:
{a los fines de esta invención, se
hará referencia a las porciones de unión al radiomarcador que tienen
esta estructura como porciones basadas en ácido picolínico
(Pic)}
o
{a los fines de esta invención, se
hará referencia a las porciones de unión al radiomarcador que tienen
esta estructura como porciones basadas en picolilamina (Pica)} donde
X es H o un grupo protector; (aminoácido) es cualquier aminoácido;
la porción de unión al radiomarcador está covalentemente unida al
péptido y al complejo de la porción de unión al radiomarcador y el
radiomarcador es eléctricamente neutro. En una materialización
preferida, el aminoácido es glicina y X es un grupo protector
acetamidometil. En otras materializaciones preferidas, el péptido
está covalentemente unido a una porción de unión al radiomarcador a
través de un aminoácido, muy preferentemente glicina y el
radiomarcador es tecnecio 99
m.
Además, se divulga un péptido radiomarcado para
obtener imágenes de lugares dentro del organismo de un mamífero, que
comprende un péptido de unión específica y una porción de unión al
radiomarcador bisamino bistiol covalentemente unida al péptido a
través de una cadena lateral de un aminoácido del péptido. La
porción de unión al radiomarcador bisamino bistiol en esta
materialización de la invención tiene una fórmula seleccionada del
grupo que consiste en:
donde cada R puede ser
independientemente H, CH_{3} o C_{2}H_{5}; cada
(pgp)^{s} puede ser independientemente un grupo protector
tiol o H; m, n y p son independientemente 2 ó 3; A es alquilo
inferior lineal o cíclico, arilo, heterociclilo, combinaciones o
derivados sustituidos de éstos; y X es péptido;
y
donde cada R es independientemente
H, CH_{3} o C_{2}H_{5}; m, n y p son independientemente 2 ó 3;
A es un alquilo inferior lineal o cíclico, arilo, heterociclilo,
combinaciones o derivados sustituidos de éstos; V es H o
CO-péptido; R' es H o péptido; siempre que cuando V
es H, R' es péptido y cuando R' es H, V es péptido. {A los fines de
esta invención, se hará referencia a las porciones de unión al
radiomarcador que tienen estas estructuras como porciones
"BAT"}. En una materialización preferida, el péptido está unido
covalentemente a la porción de unión al radiomarcador a través de un
aminoácido, muy preferentemente glicina y el radiomarcador es
tecnecio 99
m.
En las materializaciones preferidas de los
aspectos antes mencionados de esta invención, el compuesto de unión
específica es un péptido compuesto por entre 3 y 100 aminoácidos. La
materialización más preferida del radiomarcador es tecnecio 99
m.
Los péptidos de unión específica proporcionados
por la invención incluyen pero no exclusivamente los péptidos que
tienen las secuencias siguientes:
- formil-MLF
- (VGVAPG)_{3}amida
- {VPGVG)_{4}amida
- RALVDTLKFVTQAEGAKamida
- RALVDTEFKVKQEAGAKamida
- PLARITLPDFRLPEIAIPamida
- GQQHHLGGAKAGDV
- PLYKKIIKKLLES
- LRALVDTLKamida
- GGGLRALVDTLKamida
- GGGLRALVDTLKFVTQAEGAKamida
- GGGRALVDTLKALVDTLamida
- GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR
- PSPSPIHPAHHKRDRRQamida
- GGGF_{D}, Cpa.YW_{D}KTFTamida
- {SYNRGDSTC}_{3}-TSEA
- GGGLRALVDTLKamida
- GCGGGLRALVDTLKamida
- GCYRALVDTLKFVTQAEGAKamida
- GC(VGVAPG)_{3}amida
Los reactivos de la invención se pueden formar
donde los compuestos de unión específica o las porciones de unión al
radiomarcador están covalentemente unidas a una porción de
ligamiento polivalente. Las porciones de ligamiento polivalentes de
la invención están compuestas por al menos 2 grupos funcionales
ligadores idénticos capaces de unirse covalentemente a compuestos de
unión específica o porciones de unión al radiomarcador. Los grupos
funcionales ligadores preferidos son aminas primarias o secundarias,
grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico o grupos reactivos tiol.
En materializaciones preferidas, las porciones de ligamiento
polivalentes están compuestas por bis-succinimidilmetiléter
(BSME), ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico
(DMAB), tris(succinimidiletil)amina (TSEA),
N{2-(N',N'-bis(2-succinimidoetil)aminoetil)}-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-mercaptopropil)-6,9-diazanonanamida
(BAT-BS), bis-(acetamidoetil)éter,
tris(acetamidoetil)amina,
bis-(acetamidoetil)éter, bis-(acetamidometil)éter,
\alpha,\epsilon-bisacetillisina, lisina y
1,8-bis-acetamido-3,6-dioxaoctano.
La invención también comprende complejos de los
péptidos de la invención con Tc 99 m y métodos para radiomarcar los
péptidos de la invención con Tc 99 m. Los complejos radiomarcados
proporcionados por la invención se forman haciendo reaccionar los
péptidos de la invención con Tc 99 en presencia de un reductor. Los
reductores preferidos incluyen pero no exclusivamente ion ditionito,
ion estannoso, y ion ferroso. Los complejos de la invención también
se forman marcando los péptidos de la invención con Tc 99 m por
intercambio de ligandos de un complejo de Tc 99 m previamente
reducido según lo estipulado aquí.
La invención también proporciona juegos de
reactivos para preparar los péptidos de la invención radiomarcados
con Tc 99 m. Los juegos de reactivos para marcar el péptido de la
invención con Tc 99 m están compuestos por un vial sellado que
contiene una cantidad predeterminada de un péptido de la invención y
una cantidad suficiente de reductor para marcar el péptido con Tc 99
m.
Esta invención proporciona métodos para la
preparación de péptidos de la invención por síntesis química in
vitro. En una materialización preferida, los péptidos se
sintetizan mediante síntesis peptídica en fase sólida.
Esta invención proporciona métodos para usar
péptidos marcados con Tc 99 m para obtener imágenes de un lugar
dentro del organismo de un mamífero obteniendo gammagrafías in
vivo. Estos métodos comprenden la administración de una cantidad
diagnóstica eficaz de un péptido radiomarcado con Tc 99 m de la
invención y la detección de la radiación gamma emitida por el Tc 99
m localizado en el lugar dentro del organismo del mamífero.
Las materializaciones preferidas específicas de
la presente invención se tornarán evidentes a partir de la
descripción más detallada siguiente de ciertas materializaciones
preferidas y las reivindicaciones.
La Figura 1 muestra una imagen de
^{99m}Tc-P587 en una rata que tiene un tumor.
La presente invención proporciona péptidos
marcados con Tc 99 m para obtener imágenes de lugares blanco dentro
del organismo de un mamífero que comprenden una secuencia de
aminoácidos covalentemente unida a través de una cadena lateral de
aminoácido a una porción de unión al radiomarcador donde la porción
de unión al radiomarcador se une a un radioisótopo.
El marcado con Tc 99 m es una ventaja de la
presente invención porque las propiedades nucleares y radiactivas de
este isótopo lo convierten en un agente ideal para gammagrafía. Este
isótopo tiene una energía de un único fotón de 140 keV y a un
período de semidesintegración de aproximadamente 6 horas, y se
obtiene fácilmente con un generador de
^{99}Mo-^{99m}Tc. Otros radionucleidos conocidos
en el estado anterior de la técnica tienen períodos de
semidesintegración efectivos mucho más largos (por ejemplo,
^{111}In, que tiene un período de semidesintegración de 67,4 h) o
son tóxicos (por ejemplo, ^{125}I).
En las porciones de unión al radiomarcador y los
péptidos unidos covalentemente a tales porciones que contienen un
tiol unido covalentemente a grupos protectores de tiol
[(pgp)^{S}] proporcionados por la invención, los grupos
protectores de tiol pueden ser iguales o diferentes y pueden ser
pero no exclusivamente:
-CH_{2}-arilo (arilo es fenilo
o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);
-CH-(arilo)_{2}, (arilo es fenilo o
fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);
-C-(arilo)_{3}, (arilo es fenilo o
fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);
-CH_{2}(4-metoxifenilo);
-CH-(4-piridil)(fenilo)_{2};
-C(CH_{3})_{3}
-9-fenilfluorenilo;
-CH_{2}NHCOR (R es alquilo o arilo sustituidos
o sin sustituir);
-CH_{2}NHCOOR (R es alquilo o arilo
sustituidos o sin sustituir);
-CONHR (R es alquilo o arilo sustituidos o sin
sustituir);
-CH_{2}-S-CH_{2}-fenilo
Los grupos protectores preferidos tienen la
fórmula -CH_{2}-NHCOR donde R es un alquilo
inferior que tiene 1 y 8 átomos de carbono, fenilo o fenilo
sustituido con alquilo inferior, hidroxilo, alcoxi inferior,
carboxi, o alcoxicarbonilo inferior. El grupo protector que más se
prefiere es un grupo acetamidometilo.
Cada péptido de unión específica contenido en
una materialización de la invención está compuesto por una secuencia
de aminoácidos. El término aminoácido como se usa en esta invención
tiene la intención de incluir todos los aminoácidos L y D, de origen
natural o de otro origen.
Los péptidos de la presente invención se pueden
sintetizar químicamente in vitro. Los péptidos de la presente
invención pueden en general ser preparados de manera ventajosa en un
sintetizador de aminoácidos. Los péptidos de esta invención se
pueden sintetizar donde la porción de unión al radiomarcador está
unida covalentemente al péptido durante la síntesis química in
vitro, utilizando técnicas bien conocidas por los técnicos con
experiencia en el tema. Dichos péptidos unidos covalentemente a la
porción de unión al radiomarcador durante la síntesis son ventajosos
porque se pueden determinar lugares específicos de enlace
covalente.
Es una ventaja particular de la presente
invención que una porción de unión al radiomarcador está unida
covalentemente al péptido a través de una cadena lateral de un
aminoácido del péptido blanco de unión específica. Esto se puede
llevar a cabo o bien acoplando la porción de unión al radiomarcador
al péptido por formación de un enlace covalente con una cadena
lateral de aminoácido particular o a través de la incorporación de
un aminoácido conjugado a una porción de unión al radiomarcador
durante la síntesis peptídica.
En el primer caso, por ejemplo, la porción de
unión al radiomarcador ClCH_{2}CO.
Gly-Gly-Cys-Lys.amida
(protegida durante la síntesis, entre otras cosas por tritilación
del grupo tiol del residuo de cisteína) se acopla a pH
8-10 al péptido de unión al receptor de
somatostatina
ciclo.(N-CH_{2}).Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy
para formar el péptido
ciclo.(N-CH_{2}).Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy
(CH_{2}CO).Gly-Gly-Cis-Lys.amida
(después de la desprotección). En esta fórmula, se entenderá que la
porción de unión al radiomarcador está unida covalentemente al átomo
de azufre de la cadena lateral de homocisteína.
Alternativamente, la porción de unión al
radiomarcador BAT (ácido
N^{6}-N^{9}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanoico)
se incorpora en el péptido de unión a leucocitos
formil.Met-Leu-Phe-Lys.amida
usando el derivado de lisina preparado,
N\alpha(Fmoc)-N\epsilon(N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6},
N^{9}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltio-propil)-6,9-diazanonanoil)lisina
durante la síntesis peptídica.
Otras porciones de unión al radiomarcador de la
invención se pueden introducir en el péptido blanco específico
durante la síntesis peptídica. La porción de unión al radiomarcador
que contiene ácido picolínico se puede unir covalentemente al grupo
\epsilon-amino de la lisina para obtener, por
ejemplo,
\alphaN(Fmoc)-Lys-\epsilonN[Pic-Gly-Cys(grupo
protector)], que se puede incorporar en cualquier posición en la
cadena del péptido. Esta secuencia es particularmente ventajosa
porque ofrece una modalidad fácil de incorporación en el péptido de
unión que es el blanco.
Para formar un complejo de tecnecio radiactivo
con los péptidos de esta invención, el complejo de tecnecio,
preferentemente una sal de pertecnectato de Tc 99 m, se hace
reaccionar con los péptidos de esta invención en presencia de un
reductor. Los reductores preferidos son iones ditionito, estannoso y
ferroso; el reductor que más se prefiere es cloruro estannoso. En
otra materialización preferida, el reductor es un reductor en fase
sólida. Se provee convenientemente de complejos y medios para
preparar dichos complejos en forma de un juego de reactivos que
comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada
de un péptido de la invención que va a ser marcado y una cantidad
suficiente de reductor para marcar el péptido con Tc 99 m.
Alternativamente, se puede formar el complejo haciendo reaccionar un
péptido de esta invención con un complejo lábil preformado de
tecnecio y otro compuesto conocido como un ligando de transferencia.
Este proceso se conoce como intercambio de ligandos y es bien
conocido por los técnicos con experiencia en el tema. El complejo
lábil se puede formar usando dichos ligandos de transferencia como
tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo. Entre las sales
de pertecnetato de Tc 99 m útiles con la presente invención se
incluyen las sales de metales alcalinos como las sales de sodio, las
sales de amonio o de alquilamonio inferiores.
En una materialización preferida de la
invención, se proporciona un juego de reactivos para preparar
péptidos marcados con tecnecio. Los péptidos de la invención se
pueden sintetizar químicamente utilizando métodos y medios bien
conocidos por los técnicos con experiencia en el tema y se describen
a continuación. Los péptidos preparados de este modo están
compuestos por entre 3 y 100 residuos de aminoácidos, y están unidos
covalentemente a una porción de unión al radiomarcador donde la
porción de unión al radiomarcador se une a un radioisótopo. Una
cantidad apropiada del péptido se introduce en un vial que contiene
un reductor, como cloruro estannoso o un reductor en fase sólida, en
una cantidad suficiente para marcar el péptido con Tc 99 m. También
puede estar incluida una cantidad apropiada de un ligando de
transferencia como los descritos (como tartrato, citrato, gluconato
o manitol, por ejemplo). Los péptidos marcados con tecnecio de
acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el
agregado de una cantidad apropiada de Tc 99 m o de complejo de Tc 99
m en los viales y mediante reacción en las condiciones que se
describen en el Ejemplo 3 a continuación.
Los péptidos marcados radiactivamente provistos
por la presente invención se proporcionan con una cantidad adecuada
de radiactividad. Para formar complejos radiactivos de Tc 99 m, en
general se prefiere formar complejos radiactivos en soluciones que
contienen radiactividad a concentraciones entre aproximadamente 0,01
mili Curie (mCi) y 100 mCi por mL.
Los péptidos marcados con tecnecio provistos por
la presente invención se pueden usar para visualizar lugares en el
organismo de un mamífero. De conformidad con esta invención, los
péptidos marcados con tecnecio se administran en una dosis
inyectable única. Cualquiera de los vehículos comunes conocidos por
los técnicos con experiencia en el tema, como solución salina
estéril o plasma, se pueden utilizar después del radiomarcado para
la preparación de la solución inyectable para diagnosticar mediante
imágenes diversos órganos, tumores y similares de conformidad con
esta invención. En general, la unidad de dosificación a administrar
tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a 100 mCi,
preferentemente de 1 mCi a 20 mCi. La unidad de dosificación de la
solución a inyectar es de aproximadamente 0,01 mL a 10 mL. Después
de la administración intravenosa, la obtención de imágenes del
órgano o tumor in vivo puede tener lugar en unos pocos
minutos. Sin embargo, la obtención de imágenes puede tener lugar, si
se desea, en horas o incluso más tiempo, después que el péptido
radiomarcado es inyectado en un paciente. En la mayoría de los
casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulará
en el área de la que se van a obtener imágenes en aproximadamente
0,1 de hora para permitir la toma de gammagrafías. Cualquier método
convencional de gammagrafía con fines diagnósticos se puede utilizar
de conformidad con esta
invención.
invención.
Los péptidos y complejos marcados con tecnecio
99 m provistos por la invención se pueden administrar por vía
intravenosa en cualquier medio convencional para inyección
intravenosa como un medio salino acuoso, o en plasma sanguíneo.
Dichos medios también pueden contener adyuvantes farmacéuticos
convencionales como, por ejemplo, sales aceptables desde el punto de
vista farmacéutico para ajustar la presión osmótica, tampones,
conservantes y similares. Entre los medios preferidos se encuentran
la solución salina isotónica y el plasma.
Los métodos para preparar y marcar estos
compuestos se ilustran en mayor profundidad en los ejemplos
siguientes. Estos ejemplos ilustran ciertos aspectos del método
descrito precedentemente y resultados ventajosos. Estos ejemplos se
muestran a título ilustrativo y no con carácter limitante.
La síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) se
llevó a cabo a una escala de 0,25 milimol (mmol) usando un
sintetizador de péptidos Applied Biosystems Modelo 431A y usando
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como protección
del amino terminal, acoplando con
diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol o
2-(1H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluroniohexafluorofosfato/hidroxibenzotriazol
(HBTU/HOBT) y usando resina
p-hidroximetilfenoxi-metilpoliestireno (HMP)
para los ácidos carboxilo terminal o resina Rink amida para las
amidas carboxilo terminal. Los productos unidos a resina se cortaron
rutinariamente usando una solución compuesta por ácido
trifluoroacético, agua, tioanisol, etanoditiol, y trietilsilano,
preparada en las proporciones de 100:5:5:2,5:2 durante 1,5 a 3 h a
temperatura ambiente.
Cuando fue apropiado se introdujeron los grupos
\alphaN-formilo tratando el péptido cortado,
desprotegido con exceso de anhídrido acético en 98% de ácido fórmico
y agitando durante cerca de 18 horas seguido de purificación por
HPLC. Cuando fue apropiado se introdujeron grupos acetilo
N-terminales tratando el péptido amino
N-terminal libre unido a la resina con 20% v/v de
anhídrido acético en NMP (N-metilpirrolidinona)
durante 30 min. Cuando fue apropiado se introdujeron, grupos
2-cloroacetilo y 2-bromoacetilo o
bien usando el ácido 2-halo-acético
apropiado como el último residuo a ser acoplado durante la SPPS o
bien tratando el péptido amino N-terminal libre
unido a la resina o bien con ácido
2-halo-acético/diisopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida
en NMP o el anhídrido
2-halo-acético/diisopropiletilamina
en NMP. Cuando fue apropiado, se ciclaron péptidos
2-haloacetilados purificados por HPLC agitando una
solución de 0,1-1,0 mg/mL en tampón de bicarbonato
o de amoníaco (pH 8) con o sin EDTA 0,5-1,0 mM
durante 1 a 48 horas, seguido de acidificación con ácido acético,
liofilización y purificación por HPLC. Cuando fue apropiado, se
realizaron ciclaciones por enlace disulfuro Cys-Cys
tratando los péptidos precursores con grupo tiol libre de cisteína a
0,1 mg/mL en tampón a pH 7 con alícuotas de
K_{3}Fe(CN)_{6} 0,006 M hasta persistencia de un
color amarillo estable. El oxidante en exceso se redujo con cisteína
en exceso, la mezcla se liofilizó y después se purificó por
HPLC.
Cuando fue apropiado se introdujo el grupo
"Pica" conjugando picolilamina a un péptido precursor
utilizando diisopropilcarbodiimida y
N-hidroxisuccinimida. Cuando fue apropiado se
introdujeron los ligandos BAT o bien usando el ácido BAT apropiado
como el último residuo a acoplar durante la SPPS o bien tratando el
péptido amino N-terminal libre unido a la resina con
ácido
BAT/diisopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida en
NMP. Cuando fue apropiado, se conjugó [BAM] al péptido activando
primero el carboxilato del péptido con una mezcla de
diisopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida o
HBTU/HOBt en DMF, NMP o CH_{2}Cl_{2}, seguido de acoplamiento en
presencia de diisopropiletilamina; después del acoplamiento, el
conjugado se desprotegió como se describió
antes.
antes.
Cuando fue apropiado, se prepararon aductos BSME
haciendo reaccionar péptidos que contenían un solo tiol (5 a 50
mg/mL en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8) con 0,5
equivalentes molares de BMME (bis-maleimidometil-
éter) disuelto previamente en acetonitrilo a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 18 horas. La solución se concentró y el producto se purificó por HPLC.
éter) disuelto previamente en acetonitrilo a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 18 horas. La solución se concentró y el producto se purificó por HPLC.
Cuando fue apropiado, se prepararon aductos de
TSEA haciendo reaccionar un péptido que contenía un único tiol (a
concentraciones de 10 a 100 mg/mL de péptido en DMF, o 5 a 50 mg/mL
de péptido en fosfato de sodio 50 mM (pH 8)/acetonitrilo o THF) con
0,33 equivalentes molares de TMEA
(tris(2-maleimidoetil)amina; según se
divulga en U.S. Nº de serie 08/044,825, que se incorpora aquí como
referencia) disuelto previamente en el acetonitrilo o la DMF, con o
sin 1 equivalente molar de trietanolamina, a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 a 18 h. Dichas mezclas de reacción que
contenían aductos se concentraron y después los aductos se
purificaron usando
HPLC.
HPLC.
Cuando fue apropiado, se prepararon aductos de
BAT-BS haciendo reaccionar un péptido que contenía
un único tiol (a concentraciones de 2 a 50 mg/mL de péptido en
fosfato de sodio 50 mM (pH 8)/acetonitrilo o THF) con 0,5
equivalentes molares de BAT-BM
(N-[2-(N',N'-bis(2-maleimidoetil)aminoetil)]-N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6},N^{9},-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-6,9-diazanonanamida;
según se divulga en U.S. Nº de serie 08/044,825, que se incorpora
aquí como referencia) disuelto previamente en acetonitrilo o THF, a
temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 18 h. Después la
solución se evaporó a sequedad y los conjugados
[BAT-BS]-péptido se desprotegieron
por tratamiento con 10 mL de TFA y 0,2 mL de trietilsilano durante 1
h. La solución se concentró, los aductos se precipitaron con éter y
después se purificaron por HPLC.
Se purificaron péptidos crudos por cromatografía
líquida de alta presión (HPLC) preparativa utilizando una columna
Waters Delta Pak C18 y gradiente de elución usando ácido
trufluoroacético (TFA) al 0,1% en agua con acetonitrilo. Se evaporó
el acetonitrilo de las fracciones eluidas que después se
liofilizaron. La identidad de cada producto se confirmó por
espectroscopía de masa de bombardeo atómico rápido (FABMS).
0,1 mg de un péptido preparado como en el
Ejemplo 2 se disolvió en 0,1 mL de agua o tampón de fosfato de
potasio 50 mM (pH = 5, 6 ó 7,4). Se preparó gluceptato de Tc 99 m
reconstituyendo un vial de Glucoscan (E.I. DuPont de Nemours, Inc.)
con 1,0 mL de pertecnetato sódico de Tc 99 m que contenía hasta 200
mCi y se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Después se agregaron 25 \mul de gluceptato de Tc 99 m al péptido y
se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente o a 100ºC
durante 15 a 30 minutos y después se filtró a través de un
filtro
de 0,2 \mum.
de 0,2 \mum.
La pureza del péptido marcado con Tc 99 m se
determinó por HPLC usando las condiciones siguientes: se cargó una
columna analítica Waters DeltaPure RP-18, 5 \mu,
150 mm x 3,9 mm con cada péptido radiomarcado y los péptidos
eluyeron a una velocidad de flujo del solvente igual a 1 mL/min. El
gradiente de elución se realizó empezando con 10% del solvente A
(CF_{3}COOH al 0,1%/H_{2}O) hasta 40% del solvente B_{90}
(CF_{3}COOH al 0,1%/CH_{3}CN al 90%/H_{2}O) en el transcurso
de 20 min.
Los componentes radiactivos se detectaron con un
detector radiométrico en línea unido a un registrador de
integración. El gluceptato de Tc 99 m y el pertecnetato sódico de Tc
99 m eluyeron a los 1 a 4 minutos en esas condiciones, en tanto el
péptido marcado con Tc 99 m eluyó mucho tiempo después.
La tabla siguiente ilustra el exitoso marcado de
péptidos con Tc 99 m preparados según el Ejemplo 2 usando el método
descrito aquí.
Péptidos | FABMS MH^{+} | Rendimiento | HPLC R_{T} (min) |
radioquímico (%) | |||
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy. | 1.129 | 98^{2} | 15,1; 17,2 |
(CH_{3}CO.GGC.amida) | |||
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy. | 1.258 | 99^{2} | 15,0 |
(CH_{3}CO.GGCK.amida) | |||
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy. | 1.285 | 99^{1} | 15,1 |
(CH_{3}CO.GGCR.amida) | |||
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy. | 1.386 | N.D. | N.D. |
(CH_{3}CO.GGCKK.amida) | |||
ciclo(N-metil)FYW_{D}KV.Hcy. | 1.244 | 98^{3} | 7,0 |
(CH_{3}CO.GGC.Orn.amida) | |||
* Los superíndices se refieren a las siguientes condiciones de marcado: |
- ^{1} =
- en HPCD al 10% a temperatura ambiente
- ^{2} =
- en etanol/agua 50/50 a temperatura ambiente
- ^{3} =
- en NaCl al 0,9% a 100ºC
Métodos HPLC (indicados por superíndice después
de R_{T}):
- \quad
- Columna Waters-1, 100% de solución A \rightarrow 100% de solución B en 10 min
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Péptidos | FABMS MH^{+} | Rendimiento | HPLC R_{T} (min) |
radioquímico % | |||
formil-MLFK.(BAT).amida | 884 | 99 | 12,6 |
formil-MLFK.(BAT) | 884 | 96 | 11,9; 12,8 |
formil-MLFK.(BAT).KKKKK.amida | 1.524 | 96 | 11,7; 12,2 |
formil-MLFK.(BAT).GSGSGS.amida | 1.315 | 97 | 11,9; 12,8 |
formil -MLFK.(BAT).E | 1.013 | 99 | 12.3 |
formil-MLFK.(BAT).EGE | 1.200 | 98 | 13.7 |
(formil-MLFK.(BAT).GGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida)_{2}- | 3.477 | 99 | 11,9; 12,4 |
BSME | |||
YRALVDTLKFVTQAEGAK.(BAT).amida | 2.329 | 98 | 11.4 |
K.(BAT).D.Nal.C_{Me}YW_{D}KVC_{ME}T.amida | 1.573 | 97 | 12,0; 12,5 |
(DTPA).{_{D}-Nal.SYW_{D}KVTK.(BAT)}_{2}.amida | 3.210 | 97 | 12,1; 12,5 |
Péptidos | FABMS MH^{+} | Rendimiento | HPLC R_{T} (min) |
radioquímico % | |||
(DTPA).{_{D}-Nal.SYW_{D}KVTK.(BAT)}_{2}.amida | 1.801 | 96 | 11,8; 12,0 |
(DTPA)K(BAT)._{D}-Nal.C_{Me}YW_{D}KVC_{Me}T.amida | 1.949 | 96 | 11,8; 12,0 |
pGlu.GVNDNEEGFFSARK.(BAT).amida | 1.997 | N.D. | N.D. |
* Las condiciones de marcado siguientes se usaron con los péptidos apropiados: |
- 1.
- El péptido se disuelve en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4) y se marca a temperatura ambiente.
- 2.
- El péptido se disuelve en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4) y se marca a 100ºC.
- 3.
- El péptido se disuelve en agua y se marca a temperatura ambiente.
- 4.
- El péptido se disuelve en agua y se marca a 100ºC.
- 5.
- El péptido se disuelve tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 6,0) y se marca a 100ºC.
- 6.
- El péptido se disuelve en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 5,0) y se marca a temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
** Métodos de
HPLC:
- general:
- solvente A = CF_{3}COOH al 0,1%/H_{2}O
- \quad
- solvente B_{70} = CF_{3}COOH al 0,1%/CH_{3}CN al 70%/H_{2}O
- \quad
- solvente B_{90} = CF_{3}COOH al 0,1%/CH_{3}CN al 90%/H_{2}O
- \quad
- velocidad de flujo del solvente = 1 mL/min
\vskip1.000000\baselineskip
- Columna Vydak =
- columna analítica Vydak 218TP54 RP-18, 5 \mu x 220 mm x 4,6 mm con columna de protección
- Columna Brownlee =
- columna Brownlee Spheri-5 RP-18, 5 \mu x 22O mm x 4,6 mm
- Columna Waters =
- Waters Delta-Pak C18, 5 \mum, 39 x 150 mm
\vskip1.000000\baselineskip
- Método 1:
- Columna Brownlee 100% de A hasta 100% de B_{70} en 10 min
- Método 2:
- Columna Vydak 100% de A hasta 100% de B_{90}, en 10 min
- Método 3:
- Columna Vydak 100% de A hasta 100% de B_{70} en 10 min
- Método 4:
- Columna Brownlee 100% de A hasta 100% de B_{90} en 10 min
- Método 5:
- Columna Waters 100% de A hasta 100% de B_{90} en 10 min
Las abreviaturas de una sola letra para los
aminoácidos se pueden encontrar en G. Zubay, Biochemistry
(2da. Ed.), 1988 (MacMillen Publishing: Nueva York) p. 33; Ac =
acetilo; Pic = picolinoilo
(piridina-2-carbonilo) = ácido
6-aminocaproico; Hly = homolisina; Acm =
acetamidometilo; pGlu = ácido piro-glutámico; Mob =
4-metoxibencilo; Pica = picolilamina
(2-(aminometil)piridina); Apc =
L-[S-(3-aminopropil)cisteína; F_{D} =
D-fenilalanina; W_{D}=
_{D}-triptofano; Y_{D} =
_{D}-tirosina; Cpa =
L-(4-clorofenil)alanina; Thp = ácido
4-amino-tetrahidrotiopiran-4-carboxílico;
ma = ácido mercaptoacético; D-Nal =
D-2-naftilalanina; Dpg =
dipropilglicina; Nle = norleucina; BAT = ácido
N^{6},N^{9}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanoico;
ácido BAT (protegido) = ácido
N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-6,9-diazanonanoico;
BAM =
N^{1},N^{4}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-1,4,10-triazadecano;
BAM (protegido) =
N^{1}-(t-butoxicarbonil)-N^{1},N^{4}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-1,4,10-triazadecano;
[BAT-BM] =
N-[2-(N',N'-bis(2-maleimidoetil)aminoetil]-N^{9}-(t-butoxicarbonil)-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-6,9-diazanonanamida;
[BAT-BS] =
N-[2-(N',N'-bis(2-succinimidoetil)aminoetil]-N^{6},N^{9}-bis(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanonanamida;
[BMME] = bis-maleimidometiléter; [BSME] =
bis-succinimidometiléter; [DTPA] = ácido
dietilenetriaminopentaacético; Amp =
4-amidinofenilalanina.
Se dividen veintidós conejos blancos de Nueva
Zelanda (NZW) de ambos sexos que pesan entre 2 y 3 kg en dos grupos.
El grupo de control de los conejos se aloja y se alimenta con comida
comercial para conejos (Purina). Al grupo HC se lo alimenta con una
dieta estándar rica en colesterol (comida para conejo mezclada con
una concentración de 1% p/p de colesterol) desde la semana 7 hasta
la semana 28 de vida. A todos los animales se les da agua a
voluntad.
Se prepara P215 ({BAT}.RALVDTLKFVTQAEGAK.amida)
marcada con Tc 99 m como se describe en el Ejemplo 1.
Aproximadamente 250 a 400 \mug del péptido se marcan con 140 a 160
mCi de Tc 99 m y se preparan en unidades de dosificación de 7 a 8
mCi (12,5 a 20,0 \mug/conejo; 6 a 7/\mug/kg) en dosis de 0,2 mL
de volumen. Los conejos adultos se dosifican con péptido marcado con
Tc 99 m por vía intravenosa en una vena lateral del oído mediante
infusión lenta en bolo (aproximadamente 0,1 mL/min). Se usa una
cámara gamma equipada con un colimador de abertura diminuta
(abertura de 5 mm) y ventana de energía fijada para Tc 99 m y
programada para acumular 500.000 cuentas o explorar durante un
tiempo deseado para adquirir las imágenes. Poco antes de la
obtención de imágenes, se anestesia a los animales con una mezcla de
ketamina y xilazina (5:1, 1 mL/kg intramuscularmente).
Las imágenes de la cámara gamma se obtienen a
40º-45º apenas por debajo del corazón (vista izquierda anterior
oblicua [LAOS]) para delinear el arco aórtico y mirar la aorta
descendente. Las imágenes se adquieren 1 y 2 h y ocasionalmente 3 y
5 h después de la inyección. Se inyecta anestesia complementaria
según sea necesario antes de cada obtención de imagen.
A las 2,5 h (después de 2 h de exploración), los
animales se sacrifican con una dosis intravenosa de pentobarbital
sódico. Después de la autopsia, la aorta se retira y los vasos
ramificados se disecan separados de la válvula aórtica hacia la
región abdominal media. Uso un colimador de orificio paralelo,
también se toman imágenes de la aorta ex corpora. A
continuación, las aortas se abren longitudinalmente y se tiñen con
Sudán IV, quedando de ese modo la placa aterosclerótica de un color
rojo ladrillo intenso. El endotelio aórtico exento de lípidos y sin
lesionar retiene su color normal, aspecto
blanco-rosado brillante en esas condiciones.
Correlaciones positivas entre las imágenes con
P215 marcado con Tc 99 m in vivo y ex corpora y los
patrones de depósito del Sudán IV en las aortas de conejos tratados
con HC indican que este agente para gammagrafía es capaz de formar
imágenes de la placa aterosclerótica.
Se sedan perros Mongrel (de 25 a 35 lb., en
ayuno de toda la noche) con una combinación de ketamina y
aceprozamina intramuscularmente y después se anestesian con
pentobarbital sódico por vía intravenosa. Se introduce un
angiocatéter de calibre 18 en la mitad distal de la vena femoral
derecha y se coloca una espiral de acero inoxidable Dacron® de 8 mm
enroscada para embolización (Cook Co., Bloomington IN) en la vena
femoral aproximadamente a la mitad del fémur en cada animal. Se
retira el catéter, se sutura la herida y se documenta la ubicación
de la espiral por radiografía. Después se deja que los animales se
recuperen durante toda la noche.
Al día siguiente de la colocación del espiral,
se vuelve a anestesiar a cada animal, se le coloca goteo de solución
salina intravenoso en cada pata delantera y se introduce un catéter
vesical urinario para recoger la orina. El animal se coloca en
posición supina bajo una cámara gamma equipada con un colimador de
baja energía, para todo propósito y centrada en el fotopico para Tc
99 m. Las imágenes se adquieren en un sistema de computadora Mac
NucLear.
Se inyecta P357 marcado con Tc 99 m
{(CH_{2}CO-Y_{D},Apc.GDCGGC_{Acm}GC_{Acm}GGC.amida)_{2}-[BAT-BS]}
{185 a 370 mBq (5 a 10 mCi) Tc 99 m y 0,2 a 0,4 mg de P357) en una
línea intravenosa de una pata delantera en su punto de inserción. La
segunda línea se mantiene para la recolección de sangre. Se
adquieren imágenes anteriores de las piernas para 500.000 cuentas o
20 min (lo que sea más corto), aproximadamente 10 a 20 min y
aproximadamente 1, 2, 3 y 4 h después de la inyección. Después de la
obtención de la imagen final, cada animal se anestesia profundamente
con pentobarbital. Se extraen dos muestras de sangre en una punción
cardíaca usando una jeringa heparinizada seguido de la dosis de
sacrificio de una solución saturada de cloruro de potasio
administrada por inyección intravenosa intercardíaca o en bolo. Se
disecan cuidadosamente la vena femoral que contiene el trombo y
muestras del músculo del muslo. Después se diseca el trombo fuera
del vaso y se coloca en un tubo de ensayo previamente pesado.
Después se pesan las muestras del trombo y se cuentan en un contador
de posiciones gamma en el canal del Tc 99 m. También se cuentan las
fracciones conocidas de las dosis inyectadas.
Se determinan el peso del trombo fresco, el
porcentaje de dosis inyectada (% de DI)/g en el trombo y la sangre
obtenida apenas antes del sacrificio y las relaciones trombo/sangre
y trombo/músculo. Se determinan las relaciones trombo/fondo mediante
el análisis de las cuentas/píxel medidos en regiones de interés
(ROI) extraídos sobre el trombo y el músculo adyacente de las
imágenes almacenadas en la computadora.
Estos resultados se usan para demostrar que se
pueden localizar eficientemente trombos en venas profundas in
vivo.
Para demostrar la eficacia de los reactivos
peptídicos marcados con Tc 99 m según lo estipulado antes, se
inocularon intramuscularmente conejos blancos de Nueva Zelanda en la
pantorrilla izquierda con una cepa potente de E. coli.
Después de 24 h, los animales se sedaron con una inyección i.m. de
ketamina y xilazina, y después se les inyectó i.v. péptido marcado
con Tc 99 m (\leq150 \mug, 2 a 10 mCi). Los animales se
colocaron en posición supina en el campo de visión de una cámara
gamma (colimador LEAP/centrado en el fotopico para Tc 99 m) y se les
tomaron imágenes en el transcurso de la primera hora post inyección,
y después a intervalos de aproximadamente 1 h en el transcurso de
las siguientes 3 horas post inyección. Se dejó que los animales se
recuperaran entre las adquisiciones de imágenes y se los volvió a
anestesiar según fue necesario.
Una vez finalizada la última toma de imagen, se
sacrificó cada animal mediante sobredosis de fenobarbital i.v. y se
disecó para obtener muestras de sangre y del tejido muscular
infectado y de control. Las muestras de tejido se pesaron, y junto
con una cantidad estándar de la dosis inyectada, se contaron usando
un contador gamma y se determinó el porcentaje de dosis inyectada
(por gramo de tejido) remanente en los tejidos. Se calcularon
relaciones entre el porcentaje de dosis inyectada por gramo de
tejido muscular infectado y no infectado y entre el tejido muscular
infectado y la sangre, para cada péptido. Estos resultados se
presentan en la tabla siguiente para el reactivo marcado con Tc 99 m
de la invención, que tiene la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
formilMLFK(BAT).amida
Péptido | A | B | C | D | E |
formilMLFK(BAT).amida | 0,0215 | 0,0028 | 7,68 | 0,006 | 3,58 |
A = DI %/gramo de músculo infectado | |||||
B = DI %/gramo de músculo de control | |||||
C = Relación entre músculo infectado: músculo de control | |||||
D = DI %/gramo de sangre | |||||
E = Relación entre músculo infectado: sangre |
La obtención de imágenes in vivo de los
receptores de somatostatina expresados por las células tumorales de
ratas se realizó esencialmente según describen Bakker et al.
(1991, Life Sciences 49:
1.593-1.601).
Células de tumor pancreático de ratas CA20948,
descongeladas del homogeneizado del tumor recogido congelado, se
implantaron intramuscularmente en una suspensión de 0,05 a 0,1
mL/animal, en el muslo trasero derecho de ratas de Lewis de 6
semanas. Los tumores se dejaron crecer hasta aproximadamente 0,5 a 2
g, y el homogeneizado del tumor se usó para implantar un segundo
conjunto virgen de ratas de Lewis. Se repitió el pasaje de esta
manera para generar generaciones sucesivas de animales portadores
del tumor. Los animales portadores de tumor utilizados para los
estudios in vivo fueron generalmente del tercer al quinto
pasaje y tenían tumores de 0,2 a 2 g.
Para estudios de especificidad de localización
del radiotrazador en los tumores, a los animales seleccionados se
les administró una dosis subcutánea de bloqueo de SSTR (4 mg/kg) de
octreotida 30 minutos antes de la inyección del radiotrazador.
(Bakker et al demostraron que este protocolo producía una
disminución de la captación tumoral de la
^{111}In-[DTPA]octreotida en 40%.)
\newpage
Se encerraron ratas de Lewis del tercer a quinto
pasaje portadoras de tumor CA20948 y se les inyectó intravenosamente
a través de la vena dorsal de la cola una dosis de 0,15 a 0,20 mCi
de péptido marcado con ^{99 \ m}Tc correspondiente a 3 a 8 \mug
de péptido en 0,2 a 0,4 mL.
A determinados tiempos, se sacrificaron los
animales por dislocación cervical y se realizó una autopsia
selectiva. Las muestras de tejido obtenidas se pesaron y se contaron
junto con una alícuota de la dosis inyectada en un contador de
posiciones gamma.
Los resultados de biodistribución a los 90
minutos de los péptidos radiomarcados seleccionados se presentan en
la Tabla I. Notablemente, ^{99m}Tc-P587,
^{99m}Tc-P617, ^{99m}Tc-P726, y
^{99m}TC-P736 mostraron una gran captación por
parte del tumor y las relaciones tumor/sangre demostraron su alta
especificidad de captación por parte del tejido blanco (tumor).
La Figura 1 muestra una imagen de
^{99m}Tc-P587 en una rata portadora de un tumor.
La alta captación en el tumor en la pierna inferior (flecha) es
claramente visible.
La captación de ^{99m}P587-Tc
en tumores en ratas se comparó con y sin tratamiento de inyección
previa de octreotida, un análogo de la somatostatina que se sabe que
se une al receptor de somatostatina in vivo. En estos
experimentos, el bloqueo del receptor por administración de
octreotida antes de la administración de
^{99m}Tc-P587 reduce la captación tumoral
específica del péptido radiomarcado en un 76%. Estos resultados
confirmaron que la unión de ^{99m}TC-P587 in
vivo fue específica del SSTR.
% de ID/g | ||||
N° | Péptidos | Tumor | Sangre | Tumor/sangre |
P736 | ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.GGCRK.amida) | 2,1 | 0,24 | 9 |
P587 | ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.GGCK.amida) | 3,4 | 0,61 | 6 |
P617 | ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.GGCR.amida) | 6,7 | 0,73 | 9 |
P726 | ciclo (N-metil)FYW_{D}KV.Hcy.(CH_{3}CO.KKC.amida) | 2,5 | 0,30 | 8 |
Se debe entender que la divulgación precedente
recalca ciertas materializaciones específicas de la invención y que
todas las modificaciones o las opciones equivalentes están
comprendidas por el espíritu y el alcance de la invención como se
establece en las reivindicaciones adjuntas.
Claims (16)
1. Un reactivo para preparar un agente para
gammagrafía para obtener imágenes de lugares dentro del organismo de
un mamífero, que comprende un péptido de unión específica que tiene
una secuencia de aminoácidos que comprende de 3 a 100 aminoácidos y
una porción de unión a tecnecio 99 m unida covalentemente a él,
donde la porción de unión a tecnecio 99 m está unida covalentemente
a una cadena lateral de un residuo de aminoácido del péptido de
unión específica y donde la porción de unión a tecnecio 99 tiene una
fórmula:
Cp(aa)Cp
donde Cp es una cisteína protegida
y (aa) es cualquier aminoácido primario \alpha o \beta que no
contenga un grupo
tiol.
2. Un reactivo de la reivindicación 1 donde la
cisteína protegida de la porción de unión al tecnecio 99 m que tiene
la fórmula 1 tiene un grupo protector de la fórmula
-CH_{2}NH-CO-R
donde R es un alquilo inferior que
tiene de 1 a 6 átomos de carbono, 2-,3-,4-piridilo,
fenilo, o fenilo sustituido con alquilo inferior, hidroxi, alcoxi
inferior, carboxi, o alcoxicarbonilo
inferior.
3. Un reactivo de la reivindicación 1 donde la
porción de unión a tecnecio 99 m tiene la fórmula:
4. Un reactivo para la preparación de un agente
para gammagrafía para obtener imágenes de lugares dentro del
organismo de un mamífero, que comprende un péptido de unión
específica que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende de 3
a 100 aminoácidos y una porción de unión a tecnecio 99 m unida
covalentemente a él, donde está unida covalentemente a una cadena
lateral de un residuo de aminoácido del péptido de unión específica,
y donde la porción de unión a tecnecio 99 m comprende una porción
que contiene un solo grupo tiol de fórmula:
A-CZ(B)-\{C(R^{1}R^{2})\}_{n}-X
donde
- A es H, HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R^{4};
- B es H, SH, -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido), o R^{4};
- X es H, SH, -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4};
- Z es H o R^{4};
- R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico.
- n es 0, 1 ó 2;
- (péptido) es un péptido de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos;
y
cuando B es -NHR^{3} o
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido), X es SH, y n es 1 ó
2;
cuando X es -NHR^{3}
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2;
cuando B es H o R^{4}. A es HOOC, H_{2}NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC, X es SH, y n es 0 ó 1;
cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es
SH, X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) y
cuando X es SH, B es -NHR^{3} o N(R^{3})-(aminoácido o
péptido);
cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC y B es SH;
cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC,
H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido
o péptido)-OOC, B es SH y n es 0;
y donde la porción tiol está en la forma
reducida y (aminoácido) es cualquier aminoácido primario \alpha o
\beta que no contenga un grupo tiol.
5. Un reactivo de la reivindicación 4 donde la
porción de unión a tecnecio 99 m se selecciona de las porciones que
tienen las fórmulas:
IIa.-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2}-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X},
IIb.-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}-(aminoácido)^{1}-(aminoácido)^{2},
IIc.-(un
diaminoácido primario \alpha,\omega o
\beta,\omega)-(aminoácido)^{1}-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}
o
IId.-{A-CZ(B)-{C(R^{1}R^{2})}_{n}-X}-(aminoácido)^{1}-(un
diaminoácido primario \alpha,\beta o
\beta,\gamma)
donde
- (aminoácido)^{1} y (aminoácido)^{2} son cada uno independientemente cualquier aminoácido \alpha o \beta de origen natural, modificado, sustituido o alterado que no contenga un grupo tiol;
- A es H, HOOC, H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o péptido)-OOC o R^{4}
- B es H, SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4};
- X es SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(aminoácido o péptido) o R^{4};
- Z es H o R^{4}:
- R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico;
- (péptido) es un péptido de aproximadamente 2 a 10 aminoácidos;
- n es un número entero que es 0, 1 ó 2; y
cuando B es -NHR^{3} o
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido), X es SH y n es 1 ó 2;
cuando X es -NHR^{3} o
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido), B es SH y n es 1 ó 2;
cuando B es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1;
cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es
SH, X es -NHR^{3} o-N(R^{3})-(aminoácido
o péptido) y cuando X es SH, B es -NHR^{3} o
-N(R^{3})-(aminoácido o péptido);
cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC,
(aminoácido o péptido)-NHOC, (aminoácido o
péptido)-OOC y B es SH;
cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC,
H_{2}NOC, (aminoácido o péptido)-NHOC,
(péptido)-OOC y B es SH y n es 0;
y donde la porción tiol está en la forma
reducida.
6. Un reactivo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 donde el péptido de unión específica se
selecciona de los péptidos que tienen las secuencias de
aminoácidos:
- formil-MLF
- (VGVAPG)_{3}amida
- {VPGVG)_{4}amida
- RALVDTLKFVTQAEGAKamida
- RALVDTEFKVKQEAGAKamida
- PLARITLPDFRLPEIAIPamida
- GQQHHLGGAKAGDV
- PLYKKIIKKLLES
- LRALVDTLKamida
- GGGLRALVDTLKamida
- GGGLRALVDTLKFVTQAEGAKamida
- GGGRALVDTLKALVDTLamida
- GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR
- PSPSPIHPAHHKRDRRQamida
- GGGF_{D},Cpa.YW_{D}KTFTamida
- {SYNRGDSTC}_{3}-TSEA
- GGGLRALVDTLKamida
- GCGGGLRALVDTLKamida
- GCYRALVDTLKFVTQAEGAKamida,
y
- GC(VGVAPG)_{3}amida
7. Un reactivo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 donde el péptido de unión específica es un
péptido cíclico.
8. Un reactivo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 donde el péptido de unión específica y la
porción de unión a tecnecio 99 m están covalentemente unidos a
través de un residuo de lisina o un residuo de homocisteína.
9. Un reactivo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 donde el reactivo comprende además una
porción de ligamiento polivalente unida covalentemente a una
multiplicidad de compuestos de unión específica y/o ligada
covalentemente a una multiplicidad de porciones de unión al
radiomarcador para componer un reactivo para la preparación de un
agente para gammagrafía, donde el peso molecular del agente para
gammagrafía polivalente multimérico es menor que aproximadamente
20.000 dalton, opcionalmente donde la porción de ligamiento
polivalente es bis-succinimidilmetiléter, ácido
4-(2,2-dimetilacetil)benzoico,
N-[2-(N,N-bis(2-succinimido-etil)aminoetil)]-N^{6},N^{9}-bis(2-metil-2-mercaptopropil)-6,9-diazanonanamida,
tris(succinimidiletil)amina,
tris(acetamidoetil)amina,
bis-(acetamidoetil)éter, bis-(acetamidometil)éter,
\alpha,\epsilon-bisacetilisina, lisina y
1,8-bis-acetamido-3,6-dioxa-octano,
o un derivado de éstos.
10. Un agente para gammagrafía que comprende un
reactivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9
donde la porción de unión a tecnecio 99 m está unida a tecnecio 99
m.
11. Un complejo formado haciendo reaccionar un
reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con tecnecio 99
m en presencia de un reductor, p. ej. ion ditionito, ion estannoso,
o ion ferroso, o formado mediante el marcado del reactivo con
tecnecio 99 m por intercambio de ligandos de un complejo de tecnecio
99 m previamente reducido.
12. Un juego de reactivos para elaborar una
preparación radiofarmacéutica, donde dicho juego de reactivos
comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada
de un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y una
cantidad suficiente de reductor para marcar el reactivo con tecnecio
99 m.
13. Un reactivo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para usar como un producto farmacéutico para
obtener imágenes de un lugar dentro del organismo de un mamífero
cuando el reactivo se marca con tecnecio 99 m.
14. Un proceso de preparación del reactivo de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el
péptido se sintetiza químicamente in vitro, opcionalmente
mediante síntesis peptídica en fase sólida.
15. Un complejo de tecnecio 99 m de un reactivo
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
16. El uso de un reactivo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 en la preparación de un medicamento para
obtener imágenes de un lugar dentro del organismo de un
mamífero.
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