ES2256066T3 - Elisa para vegf. - Google Patents

Elisa para vegf.

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ES2256066T3 ES00978702T ES00978702T ES2256066T3 ES 2256066 T3 ES2256066 T3 ES 2256066T3 ES 00978702 T ES00978702 T ES 00978702T ES 00978702 T ES00978702 T ES 00978702T ES 2256066 T3 ES2256066 T3 ES 2256066T3
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Abstract

Procedimiento para detectar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con reactivos de captura premezclados inmovilizados en un soporte sólido, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura son anticuerpos policlonal y monoclonal contra VEGF humano, y uniéndose dicho anticuerpo monoclonal específicamente al extremo C- terminal (residuos 111-165) del VEGF humano; (b) separar la muestra biológica de los reactivos de captura inmovilizados; (c) poner en contacto los reactivos de captura inmovilizados con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF; y (d) medir el nivel de VEGF unido a los reactivos de captura utilizando un medio de detección del anticuerpo detectable.

Description

ELISA para VEGF.
Campo técnico de la invención
La invención se refiere a inmunoensayos para la detección de VEGF que pueden utilizarse como procedimientos de diagnóstico y pronóstico y pacientes con cáncer, enfermedades cardiovasculares u otras patologías.
Descripción del estado de la técnica anterior relacionado
Actualmente se encuentra bien establecido que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de una diversidad de enfermedades. Éstas incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares como por ejemplo las retinopatías proliferativas o la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), la artritis reumatoide y la psoriasis (Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); y Garner A., Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease (Enfermedades vasculares. En: Patobiología de la enfermedad ocular). A dynamic approach. Gamer A. Klintworth G.K. Eds. 2ª Edición (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710). En el caso de tumores sólidos, la neovascularización permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. De acuerdo con lo anterior, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en las secciones de tumor y en la supervivencia del paciente en cáncer de pulmón así como en varios otros tumores (Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); y Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)).
La búsqueda de reguladores positivos de la angiogénesis ha proporcionado muchos candidatos, incluyendo aFGF, bFGF, TGF-\alpha, TGF-\beta, HGF, TNF-\alpha, angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al., supra y Klagsbrun et al., supra). Los reguladores negativos identificados hasta el momento incluyen la tromboespondina (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 6624-6628 (1990)), el fragmento N-terminal de 16 kilodaltons de la prolactina (Clapp et al., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), angiostatina (O'Reilly et al., Cell, 79: 315-328 (1994)) y endostatina (O'Reilly et al., Cell, 88: 277-285 (1996)).
El trabajo realizado últimamente a lo largo de varios años ha establecido el papel clave del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la regulación de la angiogénesis normal y anormal (Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)). El descubrimiento de que la pérdida incluso de un sólo alelo VEGF da como resultado letalidad embriónica apunta que dicho factor juega un papel irreemplazable en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular (Ferrara et al, supra).
Además, se ha mostrado que VEGF es un mediador clave de la neovascularización asociado con tumores y enfermedades intraoculares (Ferrara et al., supra). El ARNm de VEGF se sobreexpresa en la mayoría de los tumores humanos examinados (Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996); y Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)): Así pues, la concentración de VEGF en los fluidos oculares esta altamente relacionada con la presencia de una proliferación activa de vasos sanguíneos en los pacientes con retinopatías diabéticas y a retinopatías relacionadas con otras isquemias (Aiello et al., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994)). Además, algunos estudios han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por degeneración macular aguda (AMD) (López et al., Invest. Ophralmo. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996)).
VEGF es un factor de crecimiento que se une a la heparina con un peso molecular de 45 kD (Plouet et al., EMBO J., 8: 3801 (1989); Neufeld et al., Prog. Growth Factor Res., 5: 89 (1994)). Es una glicoproteína dimérica que consiste en dos subunidades idénticas. Aunque VEGF está codificado por un único gen, existen como mínimo cinco isoformas in vivo debido a un corte y empalme de ARNm alternativo. Estas isoformas, VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206 contienen 121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos, respectivamente. (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989); Houck et al., Mol. Endicrinol., 5: 1806 (1991); Tischer et al., J. Biol. Chem., 266; 11947 (1991); Neufeld et al., The FASEB Journal, 13: 9-22 (1999)). Las isoformas VEGF muestran diferentes afinidades para la heparina; VEGF121 se une a la heparina de forma débil, mientras que VEGF165, VEGF189 y VEGF206 se unen a la heparina con afinidad creciente. VEGF121 y VEGF165 se secretan y ambas isoformas se encuentran en la circulación. En contraste con lo anterior, VEGF189 y VEGF206 se encuentran mayoritariamente asociados con proteoglicanos que contienen sulfato de heparina en la matriz extracelular (Houck et al., J. Biol. Chem., 267: 26031 (1992); Park et al., Mol. Biol. Cell, 4: 1317 (1993)). De las cinco isoformas, VEGF165 es la variante expresada más abundantemente en la mayoría de células y tejidos.
Se han identificado cinco receptores de VEGF: VEGFR-1 (FLT-1), VEGFR-2 (KDR/FLK-1) y VEGFR-3, todos los cuales son tirosinquinasas señalizadoras y Neurofilina-1 y Neurofilina-2, ambas receptores específicos de la isoforma accesoria que se unen selectivamente a VEGF165 (de Vries et al., Science, 255: 989 (1992); Terman et al., Biochem. Biphys. Res. Común., 187: 1579 (1992); Millauer et al., Cell, 72: 835 (1993); Neufeld et al., supra). Los diferentes papeles de estos receptores en la biología de VEGF están siendo investigados activamente por numerosos grupos.
VEGF es producido por tejidos y no tiene que entrar en la circulación para ejercer su efecto biológico, sino que más bien actúa localmente como regulador paracrino. Esto plantea la cuestión del significado del VEGF circulante y qué papel juega en la biología normal o en una patología. Un estudio reciente de Yang et al. J. Pharm. Exp. Ther., 284: 103 (1998) descubrió que la eliminación de rhVEGF165 de la circulación es muy rápida, sugiriendo que VEGF endógeno en la circulación es más probablemente el resultado de la síntesis continua de VEGF. Adicionalmente, varios estudios han intentado correlacionar los niveles de VEGF circulante con la carga de tumor y han sugerido que los niveles de VEGF son un potencial marcador de pronóstico (Ferrai y Scagliotti, Euro. J. Cancer, 32A: 2368 (1996); Gasparini et al., J. Natl. Cancer Inst., 89: 139 (1997); Kohn, Cancer, 80: 2219 (1997); Baccala et al., Urology, 51: 327 (1998); Fujisaki et al., Am. J. Gastroenterol., 93: 249 (1998)). Claramente, la capacidad de medir con precisión el VEGF será importante para entender su(s) papel(es) potencial(es) en muchos procesos biológicos, como por ejemplo el mantenimiento de la permeabilidad vascular, el ciclo menstrual, la isquemia, la diabetes y el
cáncer.
La literatura describe ampliamente que en pacientes normales y enfermos existen concentraciones de VEGF endógeno ampliamente variables, desde niveles indetectables hasta niveles altos. Se ha descrito que VEGF 165/165 puede romperse proteolíticamente para dar otras tres formas: un heterodímero 165/110, un homodímero 110/110 y un fragmento C-terinal de 55 aminoácidos (Keyt et al., J. Biol. Chem., 271: 7788-7795 (1996); Keck et al., Arch. Biochem. Biophys., 344: 103-113 (1997)).
La capacidad de medir los niveles de VEGF endógeno depende de la disponibilidad de sensibles y específicos. Se han descrito ensayos de inmunoabsorción enzimática basados en colorimetría, quimioluminiscencia y fluorescencia (ELISAs) para VEGF. Houck et al., supra (1992); Yeo et al., Clin. Chem., 38: 71 (1992); Kondo et al., Biochim. Biophys. Acta, 1221: 211 (1994) ; Baker et al., Obstet. Gynecol., 86: 815 (1995); Hanatani et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59: 1958 (1995); Leith y Michelson, Cell Prolif., 28: 415 (1995); Shifren et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: 3112 (1996); Takano et al., Cancer Res., 56: 2185 (1996); Toi et al., Cancer, 77: 110 (1996) ; Brekken et al., Cancer Res., 58: 1952 (1998) ; Obermair et al., Br. J. Cancer, 77: 1870-1874 (1998) ; Webb et al., Clin. Sci., 94: 395-404 (1998). Se han aplicado con éxito ensayos ELISAs similares en la determinación de pequeñas cantidades de fármacos y otros componentes antigénicos en muestras de plasma y de orina, no implican etapas de extracción y son sencillos de llevar a cabo.
Houck et al., supra (1992) describe un ensayo ELISA colorimétrico que parece tener sensibilidad ng/ml, aunque claramente no es suficientemente sensible para detectar niveles de VEGF endógenos. Yeo et al., supra (1992) describe un ensayo inmunofluorimétrico resuelto en el tiempo de dos sitios, sin embargo no se detectó VEGF en suero normal (Yeo et al., Cancer Res., 53: 2912 (1993)). Baker et al., supra (1995), utilizando una versión modificada de este ensayo inmunofluorimétrico, describieron niveles detectables de VEGF en el plasma de mujeres embarazadas, con niveles mayores observados en mujeres con preeclampsia. Anthony et al., Ann. Clin. Biochem., 34: 276 (1997) han descrito datos similares en mujeres embarazadas utilizando un radioinmunoensayo. Hanatani et al., supra (1995) desarrollaron un ensayo ELISA quimioluminiscente capaz de medir VEGF circulante y describieron los niveles de VEGF en suero de 30 individuos normales (machos y hembras) a partir de 8-36 pg/ml. Brekken et al., supra (1998) describieron ensayos ELISA utilizando anticuerpos que tenían preferencia de unión a VEGF distinto de VEGF aislado o del complejo VEGF:Flk-1.
Se encuentra disponible comercialmente un kit ELISA para la detección de VEGF en R&D Systems (Abingdon, U.K.). El kit R&D VEGF ELISA se ha utilizado en ensayos sándwich donde se utiliza un anticuerpo monoclonal para capturar el antígeno VEGF diana y se utiliza un anticuerpo policlonal para detectar VEGF. Webb et al., supra (1998). No está claro si la presencia de procesos proteolíticos o la degradación de VEGF o la interferencia con otras proteínas del suero influencian los resultados de detección utilizando el kit R&D ELISA. Obermair et al., supra
(1998).
Keyt et al., J. Biol. Chem., 271: 7788-7795 (1996); Keyit et al. J. Biol. Chem., 271: 5638 (1996) ; y Shifren et al., supra (1996) también desarrollaron un ensayo ELISA colorimétrico basado en un par anticuerpo monoclonal dual. Aunque este ensayo ELISA era capaz de detectar niveles de VEGF elevados en pacientes de cáncer, carecía de la sensibilidad necesaria para medir niveles endógenos de VEGF en individuos normales. Rodríguez et al., J. Immunol. Methods, 219: 45 (1998) describió un ELISA fluorimétrico de dos sitios para VEGF que proporciona una sensibilidad de 10 pg/ml de VEGF en plasma o suero aislados. Sin embargo, este ensayo fluorimétrico solamente puede detectar especies de VEGF completamente intactas 165/165 y 165/110.
Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un ensayo de diagnóstico y pronóstico que detecte niveles mesurables de VEGF en una muestra biológica o en un modelo animal o en un paciente mayores que los mesurables por ELISAs existentes y que pueda medir todas las isoformas de VEGF.
Descripción resumida de la invención
Se ha desarrollado un procedimiento ELISA sándwich de anticuerpo de sitio múltiple y kits para VEGF y para antígeno para detectar VEGF en muestras biológicas y se ha utilizado como índice de diagnóstico/pronóstico. En comparación con los ensayos ELISAs para VEGF utilizados actualmente, el presente ensayo tiene mayor sensibilidad y es capaz de detectar la mayor parte de las isoformas del VEGF endógeno en circulación.
Más específicamente, la invención proporciona un procedimiento para la detección de VEGF en una muestra biológica, preferentemente extraída de pacientes con enfermedades vasculares, diabéticos o con cáncer, que comprende las etapas de:
(a)
poner en contacto e incubar la muestra biológica con reactivos de captura premezclados inmovilizados en un soporte sólido, siendo los reactivos de captura anticuerpos policlonales y monoclonales contra VEGF humano, y uniéndose dicho anticuerpo monoclonal específicamente al extremo C-terminal (residuos 111-165) de VEGF humano;
(b)
separar la muestra biológica de los reactivos de captura inmovilizados;
(c)
poner en contacto los reactivos de captura inmovilizados con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF; y
(d)
medir el nivel de VEGF unido a los reactivos de captura utilizando un medio de detección del anticuerpo detectable.
Preferentemente, los reactivos de captura se inmovilizan en una fracción en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal. Más preferentemente, la fracción en peso es aproximadamente 1:1 de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal.
Según otro aspecto, la invención proporciona un kit de inmunoensayo para detectar VEGF en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:
(a)
reactivos de captura, anticuerpos policlonales y monoclonales contra VEGF humano premezclados en una relación en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal, uniéndose específicamente el anticuerpo monoclonal a los extremo C-terminal (residuos 111-165) de VEGF humano; y
(b)
un reactivo de detección, un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF.
El ensayo según la invención es único en el sentido que utiliza una mezcla de anticuerpos policlonal/monoclonal como reactivos de captura y que el anticuerpo monoclonal de captura se une a la porción C-terminal de VEGF. La mayoría de los ensayos ELISAs para VEGF descritos se basan bien en un par de anticuerpos monoclonales dual para la captura/detección, o bien en un anticuerpo monoclonal como reactivo de captura y en un anticuerpo policlonal para la detección. Si se utiliza solamente un anticuerpo policlonal como el anticuerpo de captura, se pierde toda la sensibilidad del ensayo. La capacidad del anticuerpo de captura monoclonal de unirse al extremo C-terminal de VEGF asegura que todas las moléculas de VEGF endógeno, incluyendo 165/165, 165/110 Y 110/110 pueden detectarse mediante el ensayo descrito en la presente invención. Además, el anticuerpo de detección de la invención se une a las regiones biológicamente activas de VEGF, es decir, los dominios de unión para los receptores KDR y FLT1 de VEGF, lo cual asegura que las moléculas de VEGF detectadas no son susceptibles de estar bloqueadas, por ejemplo, por receptores de VEGF solubles en la circulación. De esta manera, el ensayo descrito en la presente invención proporciona una medida más precisa de las molécula de VEGF que lo más probable es que sean biológicamente activas.
Descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra una comparación de dos preparaciones diferentes de anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad contra rhVEGF, los cuadrados indicando el anticuerpo preferido y los círculos representando el mismo anticuerpo de un sangrado diferente.
La Fig. 2 muestra una comparación de ELISAs según la invención utilizando elución con guanidina frente a glicina del anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad contra VEGF.
La Fig. 3 muestra una comparación de curvas estándar típicas y de posibles efectos hook, de tres diferentes ELISAs para VEGF, donde los círculos muestran el ensayo de sitio único con MAb 3,5F8 como agente de detección, los cuadrados muestran en ensayo de dos sitios con MAb 3.5F8 como recubrimiento y MAb A4.6.1 como agente de detección y los diamantes muestran en ensayo de sitio múltiple según la invención con MAb 3.5F8 y un anticuerpo policlonal purificado por afinidad como recubrimiento y MAb A4.6.1 como agente de detección.
La Fig. 4 muestra una maximización de la recubrimiento del anticuerpo monoclonal MAb 3.5F8 donde el ensayo ELISA utiliza 0.4 (círculos), 1 (cuadrados), 2 (diamantes) o 4 (triángulos) \mug/ml de anticuerpo monoclonal y 1 \mug/ml de anticuerpo policlonal purificado por afinidad.
La Fig. 5 muestra una maximización de recubrimiento de anticuerpo policlonal de conejo donde el ensayo ELISA utiliza 0 (círculos), 0,1 (cuadrados), 0,4 (diamantes), 1 (triángulos), 2 (triángulos inversos con líneas discontinuas) o 4 (triángulos inversos con líneas sólidas) \mug/ml de anticuerpo policlonal purificado por afinidad y 0,4 \mug/ml de MAb 3.5F8.
La Fig. 6 muestra el efecto del pH sobre el ensayo ELISA para VEGF de sitio múltiple según la invención, donde los círculos representan el ensayo ELISA a pH 4, los cuadrados, pH 5, los diamantes, pH 6, los triángulos, pH 7, los diamantes de media línea, pH 8 y los diamantes inversos, pH 9.
La Fig. 7 muestra la linealidad de dilución de seis muestras de plasta EDTA humano en las que se ha pulsado rhVEGF en el ensayo ELISA para VEGF de sitio múltiple.
Las Figs. 8A-8C muestran linealidad de muestras de plasma EDTA de rata normales pulsadas con rhVEGF, donde la FIg. 8A muestra un gran pulso, la Fig. 8B muestra un pulso medio y la Fig. 8C muestra un pulso bajo y donde los círculos son muestra combinada de rata 1, los cuadradas muestra combinada de rata 2 y los diamantes son rata 1.
Las Figs. 9A-9B muestran linealidad de muestras de plasma EDTA de cuatro hembras y cuatro machos de cerdo de Yorkshire, respectivamente, pulsadas con rhVEGF.
Las Figs. 10A-10C muestran la especificidad de tres ensayos ELISA diferentes para las formas de VEGF 165/165 (círculos), 165/110 (cuadrados), 121/121 (diamantes) y 110/110 (triángulos). La Fig. 10A muestra la especificidad del ensayo ELISA de sitio único utilizando MAb 3,5F8 como recubrimiento y anticuerpo de detección (Fig. 10A): La Fig. 10B muestra la especificidad del ensayo ELISA para VEGF fluorimétrico de dos sitios utilizando MAb 3,5F8 como recubrimiento y MAb A 4.6.1 como anticuerpo de detección y la Fig. 10C muestra la especificidad del ensayo ELISA para VEGF de sitio múltiple según la invención utilizando MAb 3,5F8 y PAb como anticuerpos de recubrimiento y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección.
Las Figs. 11A y 11B muestran, respectivamente, VEGF de plasma humano normal y VEGF de suero humano normal detectado mediante un ensayo ELISA de dos sitios utilizando sólo MAb 3,5F8 como reactivo de recubrimiento y mediante el ensayo ELISA de sitio múltiple según la invención utilizando tanto el PAb como el MAb 3,5F8 como reactivos de recubrimiento.
La Fig. 12 muestra las cantidades de VEGF en plasma en pacientes cardíacos utilizando los tres tipos de ensayos descritos en la leyenda de la Fig. 10, donde los círculos representan el ensayo de sitio único, los cuadrados representan el ensayo de dos sitios y los triángulos representan el ensayo de sitio múltiple.
La Fig. 13 muestra los niveles de VEGF en plasma en donantes normales y en paciente cardiovasculares utilizando el ensayo de dos sitios con MAb 3.5F8 como recubrimiento y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección o el ensayo de sitio múltiple según la invención utilizando MAb 3.5F8 y un anticuerpo policlonal purificado por afinidad como recubrimiento y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección, donde N es el número de pacientes.
La Fig. 14 muestra los niveles de VEGF en suero extraído de pacientes con cáncer de pulmón detectado mediante un ensayo ELISA de dos sitios utilizando sólo MAb 3.5F8 como reactivo de recubrimiento y mediante el ensayo ELISA de sitio múltiple según la invención utilizando tanto PAb como MAb 3.5F8 como reactivos de recubri-
miento.
La Fig. 15 muestra los niveles de VEGF donantes normales y en pacientes diabéticos (diabetes mellitas no dependiente de insulina (NIDDM) y en diabetes mellitas dependiente de insulina (IDDM)) utilizando el ensayo ELISA de dos sitios con MAb 3.5F8 como recubrimiento y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección.
Las Figs. 16A y 16B muestran gráficos comparativos de un anticuerpo policlonal anti ADNasa purificado por afinidad y un anticuerpo policlonal anti VEGF purificado por afinidad como uno de los reactivos de recubrimiento en el ensayo de sitio múltiple según la invención, en comparación con el ensayo de dos sitios utilizando MAb 3.5F8 como reactivo de recubrimiento para plasma humano. La Fig. 16A muestra la correlación de VEGF en plasma medido mediante el ensayo ELISA de dos sitios utilizando MAb 3.5F8 como el reactivo de recubrimiento (eje x) con VEGF en plasma medido mediante el ensayo de sitio múltiple con MAb 3.5F8 y un anticuerpo policlonal anti ADNasa como reactivos de recubrimiento (círculos sólidos) y con VEGF en plasma medido mediante un ensayo de sitio múltiple tal y como se describe en la presente invención, utilizando MAb 3.5F8 y el PAb anti VEGF como reactivos de recubrimiento (círculos vacíos). La Fig. 16 B muestra las curvas estándar del ensayo ELISA de dos sitios (círculos sólidos), el ensayo ELISA de sitio múltiple con MAb 3.5F8 y un anticuerpo policlonal anti ADNasa como reactivos de recubrimiento (diamantes sólidos) y un ensayo de sitio múltiple tal y como se describe en la presente invención utilizando MAb 3.5F8 y el PAb anti VEGF como reactivos de recubrimiento (cuadrados sólidos).
Descripción detallada de las realizaciones preferidas A. Definiciones
El término "VEGF" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere al factor de crecimiento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos y a los factores de crecimiento celular endotelial vascular relacionados de 121-, 145-, 189- y 206 aminoácidos, tal y como describen Leung et al., Science, 246: 1306 (1989), Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991) y Neufeld et al., supra, junto a las formas alélicas y procesadas de dichos factores de crecimiento, existentes en la naturaleza.
El término "detectar" se utiliza en su sentido más amplio, incluyendo tanto las medidas cualitativas como cuantitativas de una molécula diana. Según un aspecto de la invención, el procedimiento de detección descrito en la presente invención se utiliza para identificar la mera presencia de VEGF en una muestra biológica. Según otro aspecto, el procedimiento se utiliza para analizar si VEGF en una muestra se encuentra en un nivel detectable. Según otro aspecto, el procedimiento puede utilizarse para cuantificar la cantidad de VEGF en una muestra y además para comparar los niveles de VEGF de diferentes muestras.
El término "muestra biológica" se refiere a una muestra del cuerpo de cualquier animal, pero preferentemente es de mamífero, más preferentemente de humano. Más preferentemente, dicha muestra biológica es de pacientes de enfermedades vasculares, diabéticos o con cáncer. Dichas muestran incluyen los fluidos biológicos como por ejemplo el suero, el plasma, el fluido vítreo, el fluido linfático, el fluido sinovial, el fluido folicular, el fluido seminal, el fluido amniótico, la lecha, la sangre entera, la orina, el fluido cerebroespinal, la saliva, el esputo, tcars, la transpiración, el mucus y medio de cultivo de tejido, así como extractos de tejido como por ejemplo el tejido homogeneizado y los extractos celulares. La muestra biológica preferida según la invención es suero, plasma u orina.
El término "reactivo de captura" se refiere a un reactivo capaz de unir y capturar una molécula diana en una muestra de manera que bajo condiciones adecuadas, el complejo reactivo-molécula diana puede separarse del resto de la muestra. Típicamente, el reactivo de captura se inmoviliza o puede inmovilizarse. En un inmunoensayo sándwich, el reactivo de captura es preferentemente un anticuerpo o una mezcla de diferentes anticuerpos contra un antígeno diana.
El término "anticuerpo detectable" se refiere a un anticuerpo que es capaz de ser detectado bien directamente mediante una marca amplificada por un medio de detección, o bien indirectamente mediante, por ejemplo, otro anticuerpo que está marcado. Para el marcaje directo, el anticuerpo se conjuga típicamente a una estructura que es detectable de alguna manera. El anticuerpo detectable preferido es un anticuerpo biotinilado.
El término "medio de detección" se refiere a una estructura o técnica que se utiliza para detectar la presencia del anticuerpo detectable en el ensayo ELISA según la invención e incluye agentes de detección que amplifican la marca inmovilizada, por ejemplo una marca capturada sobre una placa de microvaloración. Preferentemente, el medio de detección es un agente de detección fluorimétrica, por ejemplo avidita o estreptavidina.
El término "anticuerpo" se utiliza en su sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizadores), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de anticuerpo, mientras exhiban la especificidad de unión deseada.
El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones existentes en la naturaleza, que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante sobre el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población substancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante un procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención pueden estar hechos mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente U.S. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también a partir de bibliotecas de anticuerpos en fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales según la invención incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica(s) u homóloga(s) a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, mientras muestren la actividad biológica deseada (patente U.S. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se ha reemplazado los residuos de la región hipervariable del recipiente por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como por ejemplo ratón, rata, conejo o un primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana se han reemplazado por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Dichas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente como mínimo uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o substancialmente todas las regiones hipervariables corresponderán a las de una inmunoglobulina no humano y todas o substancialmente todas las FRs son las de la secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender también opcionalmente como mínimo una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de la inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
El término "mamífero" para objetivos de tratamiento se refiere a un animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos, y animales de granja y animales de zoo, animales para deporte o animales de compañía, como por ejemplo perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es humano.
Los términos "cáncer", "cancerígeno" y "maligno" se refieren o describen el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Algunos ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, incluyendo el adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Algunos ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovarios, el cáncer de hígado como por ejemplo el carcinoma hepático y el heepatoma, el cáncer de vejiga, el cáncer de pecho, el cáncer de colón, el cáncer colorectal, el carcinoma de endometrio, el carcinoma de la glándula salivar, el cáncer de riñones, por ejemplo el carcinoma de células renales y el tumor de Wilm, el carcinoma de células basales, el melanoma, el cáncer de próstata, el cáncer vulvar, el cáncer tiroideo, el cáncer testicular, el cáncer de esófago y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Los cánceres preferidos para el tratamiento según la invención son el de pecho, colon, pulmones y el melanoma.
Las frases "vascular" y "cardiovascular" se utilizan de forma intercambiable y describen pacientes con indicaciones que estimulan la angiogénesis y/o la cardiovascularización y aquellas que inhiben la angiogénesis y/o la cardiovascularización. Dichas enfermedades incluyen, por ejemplo, la enfermedad arterial, por ejemplo la aterosclerosis, la hipertensión, la vasculitis inflamatoria, la enfermedad de Reynaud y el fenómeno de Reynaud, aneurismas y reestenosis aricrial; enfermedades venosas y linfáticas como por ejemplo la tromboflebitis, la limfangitis y el linfedema; y otras enfermedades vasculares como por ejemplo la enfermedad vascular periférica, el cáncer del tipo tumores vasculares, por ejemplo el hemangioma (capilar y cavernoso), los tumores glomus, la telangiectasia, la angiomatosis bacilar, el hemangioendotelioma, el angiosarcoma, el hemangiopericitoma, el sarcoma de Kaposi, el linfangioma y el linfangiosarcoma, la angiogénesis de tumor, los traumatismos como por ejemplo las heridas, las quemaduras y otro tejido herido, la fijación de implante, las cicatrices, la lesión de repercusión isquémica, la artritis reumatoide, la enfermedad cerebrovascular, las enfermedades renales como por ejemplo el fallo renal agudo y la osteoporosis. Esto incluiría también la angina, los infartos de miocardio como por ejemplo los infartos de miocardio agudos, la hipertrofia cardiaca y el fallo cardíaco, como por ejemplo el fallo cardíaco congestivo (CHF).
El término "diabetes" se refiere a una enfermedad progresiva del metabolismo de carbohidratos que implica una producción inadecuada o una utilización de insulina y se caracteriza por hiperglicemia y glicosuria. Este término incluye todas las formas de diabetes, por ejemplo la diabetes tipo I y tipo II y las diabetes resistente a la insulina, por ejemplo el Síndrome de Mendenhall, el síndrome de Werner, el leprecaunismo, la diabetes lipoatrófica y otras lipoatrofias.
El término "purificado por afinidad" se refiere a la purificación de una sustancia mediante su elución a través de una columna de cromatografía de afinidad.
B. Formas de llevar a cabo la invención
El ensayo descrito en la presente invención es un inmunoensayo de sitio múltiple que utiliza las siguientes etapas:
Primera etapa
En una primera etapa del ensayo según la invención, la muestra biológica se pone en contacto y se incuba con los reactivos de captura (o recubrimiento) inmovilizados, que son un anticuerpo monoclonal anti-VEGF y un anticuerpo policlonal dirigido contra VEGF. Estos anticuerpos pueden provenir de cualquier especie, pero preferentemente el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino o de rata, más preferentemtente murino, y más preferentemente MAb 3.5F8 (Rodríguez et al., supra (1998)) y el anticuerpo policlonal es un anticuerpo anti-conejo o anti-cabra, más preferentemente anti-conejo. Además, preferentemente el anticuerpo policlonal se ha purificado por afinidad, para disminuir el ruido de fondo. Así, en una realización específica preferida, el anticuerpo monoclonal inmovilizado es un anticuerpo monoclonal murino, más preferentemente MAb 3.5F8 y el anticuerpo policlonal inmovilizado es un anticuerpo de conejo purificado por afinidad. Los reactivos de captura inmovilizados se mezclan antes de inmovilizarse. Convencionalmente, la inmovilización se lleva a cabo insolubilizando los reactivos de captura antes del procedimiento de ensayo, mediante adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (patente U.S. No. 3.720.760) o mediante un acoplamiento covalente o no-covalente (por ejemplo, utilizando un entrecruzamiento con glutaraldehido o carbodiimida, con o sin activación previa del soporte, por ejemplo, con ácido nítrico y con un agente reductor tal y como se describe en la patente U.S. No. 3.645.852 o en Rotmans et al., J. Immunol. Methods, 57:87-98 (1983)), o después, por ejemplo mediante inmunoprecipitación.
La fase sólida utilizada para la inmovilización puede ser un soporte o transportador inerte que es esencialmente insoluble en agua y útil en los ensayos inmunométricos, incluyendo soportes en forma, por ejemplo, de superficies, partículas, matrices porosas, etc. Algunos ejemplos de soportes utilizados comúnmente incluyen pequeñas láminas, Sephadex, cloruro de polivinilo, tamices plásticos, y placas de ensayo o tubos de ensayo fabricados a partir de polietileno, polipropileno, poliestireno y similares, incluyendo placas de microvaloración de 96 pozos, así como materiales particulados como por ejemplo papel de filtro, azarosa, dextrano entrecruzado y otros polisacáridos. Alternativamente, matrices insolubles en agua reactivas como por ejemplo carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y substratos reactivos descritos en las patentes U.S. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 y 4,330,440 se emplean de forma adecuada para la inmovilización de los reactivos de captura. En una realización preferida, los reactivos de captura inmovilizados se recubren sobre una placa de microvaloación y en particular la fase sólida preferida utilizada es una placa de microvaloración multi-pozo que puede utilizarse para analizar diferentes muestras de una vez. La más preferida es una placa ELISA de 96 pozos de microensayo, como por ejemplo la que vende Nune Maxisorb o Immulon.
La fase sólida se recubre con los reactivos de captura premezclados tal y como se ha definido más arriba, que pueden estar unidos mediante una interacción no-covalente o covalente o mediante una unión física, según se desee. Algunas técnicas de acoplamiento incluyen las descritas en la patente U.S. No. 4,376,110 y las referencias citadas en la misma. Si es una interacción covalente, la placa u otra fase sólida se incuba con un agente de entrecruzamiento junto con el reactivo de captura en condiciones bien conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo 1 hora a temperatura ambiente.
Algunos agentes utilizados comúnmente para acoplar los reactivos de captura premezclados al substrato de fase sólida incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncioanles, incluyendo los ésteres de disuccinimidilo como por ejemplo 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales como por ejemplo bis-N-maleimido-1,8-octano. Algunos agentes de derivatización como por ejemplo metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermedios fotoactivables capaces de formar entrecruzamientos en la presencia de luz.
Si se utilizan placas de 96 pozos, se recubren preferentemente con la mezcla de reactivos de captura (diluidos típicamente en un tampón, por ejemplo carbonato sódico 0.05 M mediante incubación durante como mínimo 10 horas, más preferentemente como mínimo durante una noche, a temperaturas de aproximadamente 4-20ºC, más preferentemente aproximadamente 4-8ºC y a un pH de aproximadamente 8-12, más preferentemente aproximadamente 9-10, y más preferentemente aproximadamente 9.6. Si se desean tiempos de recubrimiento más cortos (1-2 horas), pueden utilizarse placas de 96 pozos con fondos de filtro de nitrocelulosa (Millipore MULTISCREEN^{TM}) o recubrir a 37ºC. Las placas pueden almacenarse y recubrirse con mucha antelación al propio ensayo y entonces puede llevarse a cabo en ensayo simultáneamente sobre diferentes muestras de manera manual, semiautomática o automática, por ejemplo utilizando robots.
Entonces, las placas recubiertas se tratan típicamente con un agente de bloqueo que se une no específicamente y satura los sitios de unión para impedir la unión no deseada del ligando libre a los sitios sobrantes sobre los pozos de la placa. Algunos ejemplos de agentes bloqueantes apropiados para este fin incluyen, por ejemplo, gelatina, albúmina del suero bovina, albúmina de huevo, caseína y leche no grasa. El tratamiento bloqueante se lleva a cabo típicamente en condiciones de temperatura ambiente durante aproximadamente 1-4 horas, preferentemente aproximadamente de 1,5 a 3 horas.
Después del recubrimiento y bloqueo, el estándar de VEGF (VEGF purificado) o la muestra biológica a analizar, diluida apropiadamente, se añade a la fase inmovilizada. La velocidad de dilución preferida es de aproximadamente 5-15%, preferentemente aproximadamente 10% en volumen. Algunos tampones que pueden utilizarse para la dilución con esta finalidad incluyen (a) PBS conteniendo un 0,5% de BASA, un 0,05% de detergente TWEEN 20^{TM} (P20), un 0,05% de antibiótico PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM, un 0,25% de surfactante Chaps, un 0,2% de beta-gamma globulina y NaCl 0,35 M; (b) PBS conteniendo un 0,5% de BSA, un 0,05% de P20 y un 0,05% de PROCLIN^{TM} 300, pH 7; (c) PBS conteniendo un 0,5% de BSA, un 0,05% de P20 y un 0,05% de PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM y NaCl 0,35 M, pH 6,35; (d) PBS conteniendo un 0,5% de BSA, un 0,05% de P20 y un 0,05% de PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM, un 0,2% de beta-gamma globulina y NaCl 0,35 M; y (e) PBS conteniendo un 0,5% de BSA, un 0,05% de P20 y un 0,05% de PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM, un 0,25% de Chaps y NaCl 0,35 M. El tampón (c) es el tampón preferido para el ensayo según la invención, dado que tiene la mejor diferenciación entre cada estándar así como la mayor relación señal-ruido. PROCLIN^{TM} 300 actúa como un preservativo y TWEEN 20^{TM} actúa como detergente para eliminar la unión no específica. El EDTA y la sal o el tampón (c) añadido actúa para disminuir el ruido de fondo sobre los otros tampones, incluyendo el tampón (b).
La relación en peso de los reactivos de captura (anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal) es preferentemente aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1, más preferentemente aproximadamente 1:1. La cantidad de reactivos de captura utilizada es suficientemente grande para dar una buena señal en comparación con los estándares de VEGF, pero no en exceso molar en comparación con el nivel de VEGF endogéno esperado máximo en la muestra. Para alcanzar una sensibilidad suficiente, se prefiere que la cantidad de muestra biológica añadida sea tal que los reactivos de captura inmovilizados estén en exceso molar respecto a la concentración molar máxima de VEGF libre anticipado en la muestra biológica después de una dilución apropiada de la muestra. Dicho nivel anticipado depende principalmente de cualquier correlación conocida entre los niveles de concentración del VEGF libre en la muestra biológica particular analizada con el estado clínico del paciente. Así, por ejemplo, los pacientes de cáncer pueden tener una concentración máxima esperada de VEGF libre en su suero que es bastante elevada, mientras que se esperará que un niño o adulto normal tenga un nivel mucho menor de VEGF libre en su suero basándose en lo que se ha descrito en la literatura.
Sin embargo, si se encuentra presente una cantidad demasiado elevada de los reactivos de captura, los reactivos de captura competirán con los reactivos de captura anti-VEGF presentes en la muestra biológica en la unión de VEGF, proporcionando resultados inexactos. Así, mientras que la concentración de los reactivos de captura se determinará en general mediante el rango de concentración de interés del VEGF, teniendo en cuenta cualquier dilución necesaria de la muestra biológica, la concentración final de los reactivos de captura se determinará normalmente empíricamente para maximizar la sensibilidad del ensayo a lo largo del rango de interés. Sin embargo, como una guía general, el exceso molar es adecuadamente menor que aproximadamente diez veces la concentración molar esperada del VEGF libre en la muestra biológica después de cualquier dilución apropiada de la muestra. Más preferentemente, la cantidad de anticuerpos monoclonales inmovilizados es aproximadamente 0,4 \mug/ml y la cantidad de anticuerpos policlonales inmovilizados es aproximadamente 0,4 \mug/ml.
Las condiciones de incubación de la muestra y los reactivos de captura inmovilizados se seleccionan de manera que se maximice la sensibilidad del ensayo y que se minimice la disociación. Preferentemente, la incubación se lleva a cabo a temperaturas bastante constantes, desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 40ºC, preferentemente desde aproximadamente 36ºC hasta aproximadamente 38ºC, para obtener un coeficiente de variante (CV) menor y menos variable que por ejemplo a temperatura ambiente. El tiempo de incubación depende en primer lugar de la temperatura, siendo generalmente no mayor que aproximadamente 10 horas, para evitar un ensayo insensible. Preferentemente, el tiempo de incubación es desde aproximadamente 0,5 a 3 horas, y más preferentemente 1,5-3 horas a 36-38ºC, para maximizar la unión de VEGF libre a los reactivos de captura. La duración de la incubación puede ser mayor si se añade un inhibidor de proteasas para impedir que las proteasas presentes en el fluido biológico degraden el VEGF.
En este estadio, el pH de la mezcla de incubación se encontrará habitualmente en el rango de aproximadamente 6-9,5, preferentemente en el rango de aproximadamente 6-7 y más preferentemente aproximadamente de 6,0 a 6,5 y más preferentemente, el pH del diluyente del ensayo (ELISA) es 6,35 \pm 0,1. Un pH acídico, por ejemplo pH 4-5, disminuyó la recuperación de VEGF. El pH del tampón de incubación se escoge de manera que mantenga un nivel significativo de unión específica de los reactivos de captura al VEGF a capturar. Pueden emplearse diferentes tampones para alcanzar y mantener el pH deseado durante esta etapa, incluyendo el borato, fosfato, carbonato, tris-HCl o tris-fosfato, acetato, barbital y similares. El tampón particular empleado no es crítico para la invención, pero en ensayos individuales puede preferirse un tampón sobre otro.
Segunda etapa
En la segunda etapa del procedimiento de ensayo según la presente invención, la muestra biológica se separa (preferentemente mediante lavado) de los reactivos de captura inmovilizados para separar el VEGF no capturado. La solución utilizada para el lavado es generalmente un tampón ("tampón de lavado") con un pH determinado utilizando las consideraciones y tampones descritos más arriba para la etapa de incubación, con un rango de pH preferentemente de aproximadamente 6-9. El lavado puede realizarse en tres o más veces. La temperatura de lavado es generalmente desde temperaturas refrigeradas a temperaturas moderadas, manteniendo una temperatura constante durante el período de ensayo, típicamente desde aproximadamente 0-40ºC, más preferentemente aproximadamente 4-30ºC. Por ejemplo, el tampón de lavado puede colocarse en hielo a 4ºC en un recipiente antes del lavado y puede utilizarse un lavador de placa para esta etapa. Un agente de entrecruzamiento o u otro agente adecuado puede añadirse también en este estadio para permitir que el VEGF no unido se una covalentemente a los reactivos de captura si hay cualquier indicio de que el VEGF disociado puede disociarse en cierto grado en las etapas posteriores.
Tercera etapa
En la siguiente etapa, los reactivos de captura inmovilizados se ponen en contacto con anticuerpos detectables, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 20-40ºC, más preferentemente aproximadamente 36-38ºC, a la temperatura y tiempo exactos para poner en contacto ambos, que depende primariamente del medio de detección empleado. Por ejemplo, cuando se utiliza 4-metilumbeliferil-\beta-galactosidasa (MUG) y estreptavidina-\beta-galactosidasa como medio de detección, preferentemente el contacto se lleva a cabo a lo largo de una noche (por ejemplo aproximadamente 15-17 horas o más) para ampliar la señal al máximo. Aunque el anticuerpo detectable puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, preferentemente es un anticuerpo monoclonal, más preferentemente murino y más preferentemente MAb A4.6.1. Así pues, el anticuerpo detectable preferido es detectable directamente y preferentemente tiene una marca fluorimétrica. La marca fluorimétrica tiene una mayor sensibilidad de ensayo en comparación con la marca colorimétrica convencional. Más preferentemente, el anticuerpo detectable está biotinilado y el medio de detección es avidita o estreptavidina-\beta-galactosidasa y MUG.
Preferentemente, se añade a la placa un exceso molar de un anticuerpo respecto a la concentración máxima de VEGF libre esperado (tal y como se ha descrito más arriba) después de lavar la placa. Dicho anticuerpo (que es detectable directa o indirectamente) es preferentemente un anticuerpo policlonal, aunque puede emplearse cualquier anticuerpo. La afinidad del anticuerpo debe ser suficientemente elevada para poder detectar pequeñas cantidades de VEGF libre, pero no tan elevada para provocar que el VEGF sea arrastrado por los reactivos de captura.
Cuarta etapa
En la última etapa del procedimiento de ensayo, el nivel de VEGF libre que se encuentra unido ahora a los reactivos de captura se mide utilizando un medio de detección de un anticuerpo detectable. Si la muestra biológica es de un paciente con enfermedad vascular, diabético o con cáncer, la etapa de medición comprende preferentemente comparar la reacción que tiene lugar como resultado de las tres etapas anteriores con una curva estándar para determinar el nivel de VEGF en comparación con un individuo normal.
Producción de anticuerpo
Los anticuerpos policlonales anti VEGF se producen generalmente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de VEGF y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el VEGF o un fragmento que contenga la secuencia de aminoácidos diana a una proteína que sea inmunogénica en la especie a inmunidar, por ejemplo, hemocianina de la lapa californiana, albúmina del suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de semillas de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo éster de la maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisterna), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCl_{2} o R_{1}N = C = NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los anticuerpos utilizados como recubrimiento o como anticuerpos detectables pueden obtenerse a partir de cualquier fuente vertebrada, por ejemplo murina, primate, lagomorpha, cabra, conejo, rata, pollo, bovina, ovina, equina, canina, felina o porcina. Los anticuerpos quiméricos o humanizados pueden emplearse también, tal y como se ha descrito, por ejemplo, en la patente US Num. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452 (1985); y la patente WO 98/45331 publicada el 15 de octubre de 1998, así como en las referencias adicionales indicadas más arriba.
Los animales pueden inmunizarse contra los conjugados o derivados inmunogénicos combinando 1 mg o 1 \mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en diferentes sitios. Un mes después, los animales se estimularon con 1/5 a 1/10 la cantidad original de conjugado en adyuvante incompleto de Freund mediante inyección subcutánea en diferentes sitios. De 7 a 14 días después, los animales se sangraron y se ensaya el suero en una valoración anti-VEGF. Los animales se estimularon hasta la meseta de valoración. Preferentemente, el animal se estimularon con el conjugado de VEGF, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un agente de entrecruzamiento diferente. También pueden realizarse los conjugados en un cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. Así, algunos agentes agregantes como alúmina se utilizan para aumentar la respuesta inmune. Algunos procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales se han descrito en numerosos libros de texto de inmunología, por ejemplo de Davis et al., Microbiology, 3ª edición (Harper & Row, New York, New York 1980).
Los anticuerpos monoclonales se preparan recuperando células de bazo a partir de animales inmunizados e inmortalizando las células de manera conveniente, por ejemplo mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con el virus Epstein-Barr, y analizando los clones que expresan el anticuerpo deseado. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976). Los anticuerpos monoclonales o la región de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal, por ejemplo Fab o fragmentos (Fab), pueden producirse alternativamente mediante procedimientos recombinantes.
Algunos ejemplos de anticuerpos adecuados incluyen aquellos ya utilizados en RIAs conocidos para la proteína en cuestión, por ejemplo, aquellos anticuerpos dirigidos contra VEGF tal y como se ha descrito en las referencias indicadas en la introducción de la presente invención.
Detección
El anticuerpo añadido a los reactivos de captura inmovilizados se marcan directamente o bien se detectan indirectamente mediante la adición, después de separar por lavado el exceso del primer anticuerpo, de un exceso molar de un segundo anticuerpo marcado dirigido contra la IgG de la especie animal del primer anticuerpo. En el último ensayo indirecto, se añade a la muestra un antisuero marcado contra el primer anticuerpo para producir el anticuerpo marcado in situ.
La marca utilizada para el primer o segundo anticuerpo es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión de VEGF libre al anticuerpo. Algunos ejemplos de marcas adecuadas son las numerosas marcas descritas para su utilización en inmunoensayo, incluyendo estructuras que pueden detectarse directamente, por ejemplo fluorocromo, quimioluminiscente y marcas radioactivas, así como estructuras como por ejemplo enzimas, que deben reaccionar o derivarse para ser detectadas. Algunos ejemplos de dichas marcas incluyen los radioisótopos ^{32}P, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H y ^{131}I, fluoróforos como por ejemplo quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa bacteriana (patente US Num. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, la peroxidasa de rábano rusticano (HRP), la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la lisozima, la sacarida, las oxidasas, por ejemplo la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, las oxidasas heterocíclicas como por ejemplo la uricasa y la xantina oxidasa, acoplada con una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de un tinte como por ejemplo HRP, la lactoperoxidasa o la microperoxidasa, biotina/avidina, biotina/espreptavidina, biotina/estreptavidina-\beta-galactosidasa con MUG, marcas de spin, marcas con bacteriófagos, radicales libres estables y similares. Tal y como se ha indicado más arriba, se prefiere la detección fluorimétrica.
Se encuentran disponibles algunos procedimientos convencionales para unir dichas marcas covalentemente a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, algunos agentes de acoplamiento como por ejemplo dialdehidos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, bis-diazo benzidina y similares pueden utilizarse para tag los ancituerpos con las marcas fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticas descritas más arriba. Véase, por ejemplo, las patentes U.S. Num. 3,940,475 (fluorimetría) y 3,645,090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014 - 1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. y Cytochem., 30: 407-412 (1982). Las marcas preferidas en la presente invención son fluorescentes, para aumentar la amplificación y la sensibilidad a 8 pg/ml, más preferentemente biotina con estreptavidina-\beta-galactosidasa y MUG para amplificar la señal.
La conjugación de dicha marca, incluyendo las enzimas, al anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para un experto técnico medio en las técnicas de inmunoensayo. Véase, por ejemplo, O'Sullivan et al., "Procedimientos para la preparación de conjugados enzima-anticuerpo para su utilización en inmunoensayos enzimáticos" en Procedimientos en Enzimología, ed. J.J. Langone y H. Van Vunakis, vol. 73 (Academic Press, New York, New Cork, 1981), pág. 147-166.
Después de la adición del ultimo anticuerpo marcado, la cantidad de anticuerpo unido se determina eliminando el exceso de anticuerpo marcado no unido mediante lavado y después midiendo la cantidad de marca unida utilizando un procedimiento de detección apropiado para la marca, y correlacionando la cantidad medida con la cantidad de VEGF libre en la muestra biológica. Por ejemplo, en el caso de enzimas, la cantidad de color desarrollada y medida será una medida directa de la cantidad de VEGF presente. Específicamente, si HRP es la marca, el color se detecta utilizando el substrato OPD a 490 nm de absorbancia.
En un ejemplo, después de lavar de la fase inmovilizada un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente dirigido contra el primer anticuerpo no marcado, se desarrolla color o quimioluminiscencia y se mide incubando el reactivo de captura inmovilizado con un substrato de la enzima. Entonces se calcula la cantidad de concentración de VEGF libre comparando con el color o quimioluminiscencia generada mediante una muestra de estándar de VEGF analizada en paralelo.
Kits
De manera conveniente, el procedimiento de ensayo de la presente invención puede proporcionarse en forma de kit. Dicho kit es una combinación empaquetada que incluye los elementos básicos siguientes:
(a)
reactivos de captura que comprenden anticuerpos policlonal y monoclonal contra la molécula de VEGF humana, donde el anticuerpo monoclonal se une específicamente al extremo C-terminal de la molécula de VEGF, en una relación en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto el anticuerpo policlonal; y
(b)
reactivos de detección que comprenden anticuerpos detectables (marcados o no marcados) que se unen a los dominios KDR y FTL1 del receptor de VEGF.
Estos elementos básicos se han definido más arriba.
Preferentemente, el kit comprende además un soporte sólido para los reactivos de captura, que puede proporcionarse como un elemento separado o en el cual ya se han inmovilizado los reactivos de captura. Así, los anticuerpos de captura en el kit pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido o pueden inmovilizarse en un soporte incluido en el kit o proporcionarse separadamente del kit. Preferentemente, los reactivos de captura se recubren sobre una placa de microvaloración. El reactivo de detección puede ser anticuerpos marcados que se detectan directamente o anticuerpos no marcados que se detectan mediante anticuerpos marcados dirigidos contra los anticuerpos no marcados obtenidos en diferentes especies. Si la marca es una enzima, el kit contendrá habitualmente substratos y cofactores requeridos por la enzima y si la marca es un fluoróforo, un precursor de un tinte que proporciona el cromóforo detectable. Si el reactivo de detección no está marcado, el kit puede comprender además un medio de detección de los anticuerpos detectables, por ejemplo los anticuerpos detectables dirigidos a los anticuerpos no marcados, preferentemente en un formato detectable fluorimétricamente.
En una realización específica preferida, la relación en peso de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal en el kit es aproximadamente 1:1, el anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal murino biotinilado, el anticuerpo monoclonal es murino o de rata, más preferentemente murino, y más preferentemente MAb 3.5F8, el anticuerpo policlonal se ha purificado por afinidad y más preferentemente a partir de cabra o conejo, más referentemente de conejo, y la cantidad de anticuerpos monoclonales murinos es de 0,4 \mug/ml y la cantidad de anticuerpos policlonales de conejo es de 0,4 \mug/ml. Preferentemente, los reactivos de captura se inmovilizan en este kit. Así, preferentemente, el anticuerpo detectables es MAb A4.6.1.
El kit contiene también típicamente instrucciones para llevar a cabo el ensayo y/o VEGF como estándar de antígeno (por ejemplo VEGF purificado, preferentemente VEGF producido de manera recombinante), así como otros aditivos como por ejemplos estabilizadores, tampones de lavado o de incubación y similares.
Algunos ejemplos de estándares de VEGF son el VEGF humano recombinante producido en células de mamífero disponibles comercialmente en Genentech. Inc., San Francisco Sur, California.
Los componentes del kit pueden proporcionarse en relaciones predeterminadas, variando las cantidades relativas de los diferentes reactivos de la forma adecuada para proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que maximizan substancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes, que proporcionaran en solución una disolución del reactivo con la concentración adecuada para combinar con la muestra a analizar.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar una realización descrita aquí para practicar la invención, pero la invención no debe considerarse limitada por dichos ejemplos.
Ejemplo 1
2. Materiales y Métodos 2.1. Reactivos
Se utilizó VEGF-165 (rhVEGF) humana recombinada purificada expresada en Escherichia coli (Genentech, San Francisco Sur, CA) como estándar y para los controles (preparados en diluyente ELISA tal y como se define más abajo y almacenados a -70ºC). La estreptavidina-\beta-galactosidasa (Strep-\beta-gal) se compró en Boehringer Mannheim. W. Alemania; MUG se compró en Sigma, St. Louis, MO. El dimetilsulfóxido (DMSO) se compró en Sigma.
2.2. Anticuerpos anti VEGF
Los anticuerpos anti rhVEGF165 se prepararon tal y como se ha descrito en Kim et al., Growth Factors, 7: 53 (1992). Brevemente, se hiperinmunizaron intraperitonealmente ratones BALB/c con una dosis de 10 mg de rhVEGF165 conjugado con hemocianina de lapa californiana. Se fusionaron células bazo con una línea de mieloma de ratón y se analizó la presencia de MAbs anti rhVEGF en los sobrenadantes de cultivo de los pozos que contenían hibridomas, mediante ELISA. Los hibridomas positivos se clonaron dos veces utilizando la técnica de dilución limitante. Los anticuerpos monoclonales utilizados en este ELISA se han caracterizado en Kim et al., supra (1992). Se cree que uno de los anticuerpos de captura, MAb 3.5F8, se une cerca del dominio de unión a heparina, a los residuos de aminoácido 111-165, con una K_{d} de 13 pM. Rodríguez et al., supra (1998).
El anticuerpo policlonal de conejo (PAb) utilizado como el otro anticuerpo de recubrimiento, se generó inyectando VEGF en un conejo utilizando un protocolo estándar y se purificó pasándolo a través de una columna de afinidad a la cual se había acoplado VEGF para capturar el anticuerpo policlonal, separando de esta manera las inmunoglobulinas de la muestra. Las moléculas que nos eon el anticuerpo deseado se separaron mediante lavado y el anticuerpo unido se eluyó con glicina 0,2 M, pH 2, entonces el pH se llevó a pH neutro antes de la diálisis durante una noche en PBS a 4ºC y el eluyente que contenía el anticuerpo se utilizó para el ensayo de sitio múltiple.
El anticuerpo de detección, MAb A4.6.1 une rhVEGF165 con una Kd de 86 pM. Diferentes evidencias sugieren que dicho MAb une rhVEGF cerca de la región KDR de unión a receptor Kim et al., supra).
2.3. Biotinilación de MAb A4.6.1
El MAb A4.6.1 se biotiniló con ácido biotinilamidocapróico - N-hidroxisuccinimida éster (Biotina-X-NHS) (Research Organics, Cleveland, OH) según el siguiente protocolo. El MAb A4.6.1 se dializó contra NaHCO3 100 mM, pH 8,5, durante una noche a 2-8ºC. Un total de 60 \mul de una solución de Biotina-X-NHS 5 mg/ml en DMSO se añadió al MAb (ajustado después de la diálisis a una concentración de 2-10 mg/ml) utilizando una relación 1:10 (peso/peso) de Biotina: MAb. Se incubó esta mezcla durante dos horas a temperatura ambiente con agitación suave y la reacción se paró mediante la adición de 5 \mul de etanolamina. Después de la conjugación, el anticuerpo se dializó extensivamente contra PBS a 2-8ºC con agitación suave y se cambió el PBS cada dos horas durante un total de tres veces.
2.4. ELISA VEGF de sitio múltiple
Dos MAbs 3.5F8 (recubrimiento) y A4.6.1 biotinilado (detección) y un PAb (recubrimiento) tal y como se ha descrito más arriba, se utilizaron para desarrollar un ELISA de VEGF específico y sensible. En dicho ELISA, se mezclaron 100 \mul/pozo de cada MAh 3.5F8 y el PAb purificado por afinidad y entonces se añadió a placas de microvaloración de 96 pozos MziSorpTM (Nunc. Roskilde, Dinamarca) a 0,4 \mug/ml por cada pozo en carbonato sódico 0,05 M, pH 9.6. Después de una incubación de 24-74 horas a 2-8ºC, las placas recubiertas se lavaron 3 veces con 400 \mul de tampón de lavado para ELISA (PBS que contenía un 0,05% de detergente TWEEN-20^{TM}) utilizando un lavador de placa BIOTEK EL304^{TM} (Instrumentos Biotek, Winooski, VT) y se bloqueó con diluyente de bloqueo ELISA a 200 \mul/pozo (PBS que contenía un 0,5% de BASA, un 0,05% de detergente TWEEN-20^{TM} y un 0,05% de antibiótico PROCLIN^{TM} 300, pH 7,2) durante 1-3 horas a temperatura ambiente con agitación. Después de bloquear, las placas de lavaron de nuevo 3 veces con 400 \mul de tampón de lavado ELISA. Entonces, se añadieron 100 \mul/pozo de estándares, muestras o controles para duplicar los pozos y se incubó durante 1,5-2 horas a 37ºC con agitación. Para la cuantificación de rhVEGF165 en plasma humano, la curva estándar se preparó en diluyente ELISA (PBS que contenía un 0,5% de BASA, un 0,05% de TWEEN-20^{TM}, un 0,05% de PROCLIN^{TM} 300, EDTA 5 mM y NaCl 0,35M, pH 6,3 \pm 0,1). La curva estándar era 128 pg/ml diluida serialmente 1:2 hasta 2 pg/ml. Después de la incubación muestra/estándar, las placas se lavaron seis veces con 400 \mul de tampón de lavado ELISA y se añadió a las placas 100 \mul/pozo de MAb A4.6.1 - Biotina, recién diluido 1:200 hasta su concentración óptima en diluyente ELISA. Después de una incubación de 1,5-2 horas a 37ºC con agitación, las placas se lavaron seis veces tal y como se ha descrito más arriba y se añadió a las placas 100 \mul/pozo de strep-\beta-gal, diluido 1:40K en diluyente ELISA. Después de una incubación de 45-60 minutos a 37ºC con agitación, las placas se lavaron 6 veces tal y como se ha descrito más arriba y se añadió a las placas 100 \mul/pozo de MUG/DMSO (1/100), recién diluido a 340 \mug/ml en una solución de NaPO_{4} 0,1M, que contenía MgCl_{2} 1 mM a pH \pm 7,3. La reacción de substrato se incubó durante 15-17 horas a 37ºC con agitación en la oscuridad (la placa estaba envuelta en papel de aluminio). La reacción se paró por adición de 150 \mul/pozo de glicina 0,15M, pH 10,5 \pm 0,1. La unidad de fluorescencia (FSU) del contenido de los pozos se leyó en un lector de placa fluorescente CYTOFLUOR 4000^{TM} (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) utilizando filtros de excitación y de emisión a 360 nm y a 460 nm, respectivamente. Se utilizó un programa de ajuste de curva de cuatro parámetros para generar una curva estándar, a partir de la cual se interpolaron las concentraciones de muestra y control. Las lecturas FSU fueron estables durante como mínimo 30 minutos a temperatura ambiente después de añadir 150 \mul de glicina.
2.5 Muestras de plasma humano
La capacidad de medir VEGF de forma precisa en plasma humano se confirmó utilizando diferentes aproximaciones. El efecto del plasma sobre la sensibilidad y rendimiento del ensayo se evaluó utilizando rhVEGF165. Se añadieron cantidades conocidas de rhVEGF165 a muestras individuales de plasma humano y se determinó el porcentaje de recuperación como sigue: (1) la cantidad de VEGF endógeno en la muestra, determinado a partir de una muestra paralela, se restó de la cantidad total de VEGF medido en la muestra; (2) el valor de VEGF "recuperado" se dividió entonces por la cantidad de VEGF añadido a la muestra y se multiplicó por 100. La linealidad de dilución de rhVEGF165 añadido a plasmas humanos individuales también se evaluó. En estos estudios, después de la adición de rhVEGF165, cada muestra de plasma se diluyó 1:10 en diluyente ELISA seguido por diluciones 1:2 en serie en diluyente ELISA. Se prepararon controles (estándares) de alta matriz y de baja matriz en plasma EDTA humano claro (congelado). Se diluyeron 1/10 en diluyente ELISA hasta una concentración final del 10% de plasma.
Los niveles de VEGF endógeno se midieron en muestras individuales de plasma humano. Se colocó sangre de individuos sanos normales en tubos Vacutainer (Becton Dickenson, San Jose, CA) con un 15% de K3 EDTA. Los tubos se centrifugaron a 2000xg durante 20 minutos y se recogió el plasma. Las muestras de plasma se diluyeron 1:10 en diluyente ELISA para su utilización en el ensayo. La linealidad de dilución del VEGF endógeno en muestras seleccionadas también se evaluó tal y como se ha descrito más arriba.
3. Resultados 3.1 Estabilidad de la Muestra
La estabilidad de plasma EDTA humano claro se examinó en tres ciclos de congelación - descongelación. El plasma se sometió a un tratamiento en hielo seguido de un mezclado suave en agua caliente para descongelar. Los datos en la Tabla 1 más abajo demuestran que no hay un efecto significativo sobre la cuantificación de VEGF después de los tratamientos congelación - descongelación. Por lo tanto, el plasma EDTA humano es estable durante tres ciclos de congelación - descongelación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Estabilidad congelación - descongelación neta del plasma EDTA humano normal
hu EDTA Plasma Dos sitios Sitio múltiple
32 22.11 78.84 Fresco
25.4 75.16 1 congelación-descongelación
14.85 75.16 2 congelaciones-descongelac.
18.88 72.08 3 congelaciones-descongelac.
media 20.31 75.31
desv. std 4.51 2.77
% CV 2.2 4
TABLA 1 (continuación)
hu EDTA Plasma Dos sitios Sitio múltiple
33 35.44 100.24 Fresco
35.87 101.71 1 congelación-descongelación
35.44 101.71 2 congelaciones-descongelac.
39.19 101.71 3 congelaciones-descongelac.
media 36.49 101.34
desv. std 1.81 0.73
% CV 5 1
34 17.51 78.18 Fresco
25.03 94.6 1 congelación-descongelación
22.11 94.6 2 congelaciones-descongelac.
24.72 83.95 3 congelaciones-descongelac.
media 22.34 87.83
desv. std 3.48 8.16
% CV 16 9
39 29.35 84.62 Fresco
31.11 81.39 1 congelación-descongelación
28.02 75.16 2 congelaciones-descongelac.
31.11 71.51 3 congelaciones-descongelac.
media 29.90 78.17
desv. std 1.50 5.93
% CV 5 8
38 23.43 83.95 Fresco
29.94 80.07 1 congelación-descongelación
21.8 83.95 2 congelaciones-descongelac.
24.72 66.84 3 congelaciones-descongelac.
media 24.97 78.70
desv. std 3.52 8.12
% CV 14 10
12 6
desv. std = desviación estándar
CV = coeficientes de variación 
\vskip1.000000\baselineskip
3.2 Límite de detección
Aproximadamente 20 réplicas del blanco, 1, 2, 4 y 8 pg/ml de estándar, se ensayaron en el ELISA para VEGF de sitio múltiple según la invención. El límite de detección se determinó mediante la concentración de analito (VEGF) a la cual la respuesta FSU media medida menos dos desviaciones estándar era mayor que la respuesta FSU media más dos desviaciones estándar de la emisión de fluorescencia (460 nm) del blanco. Los resultados de la Tabla 2 demuestran que el límite de detección es 8 pg/ml en diluyente ELISA. Dado que las muestras de plasma se diluyen típicamente 1:10 para minimizar la interferencia de la matriz, puede medirse una cantidad tan ínfima como 80 pg/ml o 1,6 pM de VEGF en la muestra original.
TABLA 2 Límite de Detección (0,4 \mug/ml, 0,4 \mug/ml)
réplicas std 0 pg/ml std 1 pg/ml std 2 pg/ml std 4 pg/ml std 8 pg/ml
FSUs FSUs FSUs FSUs FSUs
1 1103 1277 1351 1546 2216
2 1091 1382 1359 1617 2292
3 1103 1336 1413 1745 2241
4 1180 1328 1986 1770 2266
5 1235 1321 1382 1654 2216
6 1135 1382 1631 1735 2216
7 1180 1306 1328 1692 2266
8 1154 1125 1512 1654 2241
9 1079 1351 1366 1682 2279
10 1129 1559 1529 1678 2384
11 1129 1314 1445 1654 2266
12 1263 1413 1299 1617 2228
13 1079 1382 1336 1631 2216
14 1235 1284 1851 1716 2565
15 1135 - - - 1711 1780 2266
16 1129 - - - 1590 2077 2266
17 1017 - - - 1445 1654 2279
18 1351 - - - 1445 1740 2371
19 1079 - - - 1546 1599 2318
20 2025 - - - 1626 1663 2228
Media 1192 1340 1508 1695 2281
desv.std. 211 94 183 108 82
+1 SD 1402 1434 1690 1803 2363
+2 SD 1613 1528 1873 1911 2445
-1 SD 981 1246 1325 1587 2199
-2 SD 770 1152 1142 1479 2117 
\vskip1.000000\baselineskip
3.3 Evaluación y Preparación de PAb anti-VEGF
Se compararon en el ensayo dos preparaciones diferentes de anticuerpo policlonal de conejo contra rhVEGF purificado del mismo conejo pero de diferente sangrado, utilizando MAb 3.5F8 como el anticuerpo monoclonal y utilizando 0,4 \mug/ml de cada tipo de anticuerpo. Los resultados, indicados en la Fig. 1, muestran que ambos anticuerpos son adecuados para su utilización.
Le elusión del anticuerpo policlonal de conejo se llevó a cabo con glicina seguido de guanidina y los anticuerpos resultantes se utilizaron en el ensayo con las condiciones preferidas según la invención. Los resultados en la Fig. 2 y en la Tabla 3 muestran que no hay una diferencia significativa entre los dos procedimientos de elusión. Sin embargo, la elusión con glicina parece ser ligeramente más sensible. La comparación de muestras de plasma EDTA humano normal así como los controles de Alta Matriz y Baja Matriz muestran una cuantificación similar en ambas preparaciones. El pico de guanidina se encuentra unido más estrechamente al VEGF que el pico de glicina.
TABLA 3 Comparación de glicina y guanidina como eluyentes
Plasma EDTA PAb (glicina) + MAbs 3.5 PAb (guanidina) + MAbs 3.5 % recuperación
humano normal F8/A4.6.1 (pg/ml) F8/A4.6.1 (pg/ml)
1 37 48 77
2 41 34 123
3 112 90 124
4 79 62 128
5 49 36 136
6 40 57 71
7 59 45 132
8 35 31 116
Alta Matriz 99 102 97
Baja Matriz 9 8 115
% de recuperación media 112 
\vskip1.000000\baselineskip
3.4 Robustez y solidez
Se evaluó la precisión inter-ensayo e intra-ensayo para los controles de baja y alta matriz mediante un análisis estadístico ANOVA. Los controles de matriz se prepararon añadiendo rhVEGF en plasma EDTA humano claro a concentraciones bajas y altas para caer dentro del rango de ensayo. Los resultados muestran que la variabilidad inter-ensayo (CV) va de 11-17%, mientras que la variabilidad intra-ensayo va de 8-14%. Los datos se resumen en la
Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Reproducibilidad de los controles de matriz
Nombre del Ensayo Alta (pg/ml) Baja (pg/ml)
Kn324p2 107.5 6.8
Kn324p2 111.2 11.6
Kn324p3 93.8 10.4
Kn324p3 96.7 11.2
Kn320p7 103.6 13.7
Kn320p7 103.6 13.7
Kn320p8 99.7 14.3
Kn320p8 102.0 14.7
Kn322p2 110.6 13.3
Kn322p2 102.0 - - -
Kn322p3 97.0 14.4
Kn322p3 103.9 13.9
Kn322p1 99.0 12.0
Kn322p1 95.2 12.3
Kn320p3 101.1 15.3
Kn320p3 98.0 14.5
Kn320p2 105.1 14.9
Kn320p2 100.5 14.2
Kn320p1 106.0 14.1
TABLA 4 (continuación)
Nombre del Ensayo Alta (pg/ml) Baja (pg/ml)
Kn320p1 103.4 13.9
Kn319p2 87.1 10.2
Kn319p2 100.2 9.3
Kn319p1 97.6 9.4
Kn319p1 99.6 9.1
Kn316p1 92.4 11.7
Kn316p1 97.9 11.3
Kn313p1 117.8 18.8
Kn313p1 111.4 16.2
Kn212p2 92.4 14.6
Kn212p2 92.4 15.7
Kn311p1 123.9 14.2
Kn212p1 103.8 13.9
Kn212p1 93.2 13.7
Kn331p1 106.2 12.9
Kn331p1 109.2 13.3
Kn331p2 99.8 11.9
Controles de Matriz Intra-ensayo (% CV) Inter-ensayo (% CV)
Baja 14.0 11.0
Alta 8.0 17.0 
\vskip1.000000\baselineskip
3.5 Efecto Hook
Diversas muestras han mostrado en el pasado no-linealidad en el incremento de VEGF medido al aumentar la dilución de la muestra. Por lo tanto, en el ensayo ELISA de sitio múltiple según la invención se analizó el efecto Hook (comparación punto a punto con el ELISA de sitio único y de dos sitios), rhVEGF se diluyó de 16 ng/ml a 1pg/ml en tampón de ensayo. Los resultados (mostrados en la figura 3) muestran que no hay una caída significativa en la cuantificación de VEGF. Sin embargo, puede observarse una ligera caída y un efecto meseta a partir de 512 pg/ml en adelante. Dado que las diluciones de muestra utilizadas en el ensayo ELISA de sitio múltiple según la invención dan lugar a concentraciones menores de 128 pg/ml, el efecto hook no incumbe.
3.6 Maximización de recubrimiento
Los procedimientos para la determinación de la maximización de recubrimiento fueron los mismos que los descritos más arriba en la sección Procedimientos, excepto por el hecho de que se varió la concentración de PAb o de MAb3.5F8. Más específicamente, para la Fig. 4 la concentración de MAb 3.5F8 se varió de 0,4 \mug/ml a 4 \mug/ml manteniendo constante la concentración del anticuerpo policlonal (a 1 \mug/ml). Y para la Fig. 5 y la Tabla 5, la concentración del anticuerpo policlonal se varió de 0,4 \mug/ml a 4 \mug/ml manteniendo constante la concentración de MAb 3.5F8 (a 0,4 \mug/ml).
Mientras que las concentraciones 0,1 \mug/ml y 0,4 \mug/ml de MAb 3.5F8 y del PAb a concentración constante del otro anticuerpo de recubrimiento eran esencialmente las mismas en la cuantificación de VEGF para el control bajo y alto, el límite superior de la concentración de recubrimiento (es decir, 0,4 \mug/ml) se prefiere para tener mejores posibilidades de capturar VEGF. Mientras que la concentración de 1 \mug/ml de MAb 3.5F8 y PAb aumentó la cantidad de VEGF medido en cada caso, dicha concentración también dio un mayor ruido de fondo. Así, los resultados muestran que las concentraciones preferidas para ambos reactivos de captura es aproximadamente 0,4 \mug/ml.
TABLA 5 Maximización de recubrimiento del anticuerpo policlonal más MAb 3.5F8
MAb 3.5F8 PAb 0,4 \mug/ml 0,4 \mug/ml 0,4 \mug/ml 0,4 \mug/ml
1 \mu/ml 0,4 \mug/ml 0,1 \mug/ml 0
Alta Matriz (pg/ml) 100.4 89.3 94.0 97.3
Baja Matriz (pg/ml) 22.4 9.7 10.1 5.4
Ocho donantes de plasma 97.3 33.5 42.5 10.7
humano normal (pg/ml): 202.5 106.5 77.0 19.7
162.3 52.9 59.0 26.8
92.0 27.5 29.8 11.1
115.6 41.4 42.5 11.0
202.5 70.8 69.7 15.8
409.9 196.6 207.9 94.9
512.1 25.7 275.0 113.0
3.7 Perfil de pH del ELISA para VEGF de sitio múltiple
Se llevó a cabo un perfil de pH para determinar si cambiando el pH del tampón de ensayo aumentaría o disminuiría la recuperación de VEGF en plasma EDTA humano normal. Cambiando el pH, las proteínas de unión u otros complejos, si los hubieran, podrían disociarse, lo cual interferiría con la detección del MAb A4.6.1.
El procedimiento para examinar el perfil de pH del ensayo fue el mismo que el descrito en la sección Procedimientos más arriba, excepto por la incubación de la muestra y la incubación con biotina, el tampón de ensayo se ajustó utilizando NaOH o HCl, dando como resultado tampones de ensayo que van de pH 4 a 9. Una curva estándar, una matriz baja y alta y cuatro muestras de plasma EDTA humano normal se evaluaron a partir de diluciones realizadas utilizando estos tampones de ensayo de pH variable.
Los resultados de la Fig. 6 y la Tabla 6 muestran que no hubo recuperación de VEGF a pH 4 y 5. Sin embargo, el pH 6-9 reveló una buena recuperación de plasma VEGF con el control de ensayo dentro de un rango aceptable. No hubo una diferencia significativa en la cuantificación de VEGF como consecuencia de variar el pH del tampón de ensayo de 6 a 9. Sin embargo, el tampón de ensayo preferido tiene un pH de aproximadamente 6.35 \pm 0,1, lo que da como resultado una unión máxima de VEGF y es apropiada para todas las etapas de dilución del ensayo.
TABLA 6 Recuperación de VEGF de plasma EDTA humano normal a pH variable
pH Plasma EDTA 4 5 6 pg/ml 7 pg/ml 8 pg/ml 9 pg/ml
humano normal
1 - - - - - - 198.9 122.0 173.3 204.0
2 - - - - - - 141.4 81.7 138.7 138.6
3 - - - - - - 240.7 150.3 220.9 243.5
4 - - - - - - 112.2 113.2 176.7 190.3
Controles pg/ml pg/ml pg/ml pg/ml
Matriz Alta - - - - - - 104.5 105.0 93.8 124.0
Matriz Baja - - - - - - 25.7 25.1 19.7 16.9
3.8 Linealidad de dilución
Aproximadamente 85 pg/ml de rhVEGF se añadió a plasma EDTA humano normal claro y se diluyó serialmente a 1/10, 1/20, 1/40 y 1/80 y se analizó. Los resultados, en la Tabla 7 y en la Fig. 7, muestran que el rhVEGF añadido al plasma EDTA mostró una correlación lineal con la concentración esperada, con un coeficiente de correlación de 0,996. El porcentaje de diferencia entre los valores de la concentración corregida por la dilución, determinados para diluciones en serie sucesivas, no excedieron la media de 19% \pm 7,5, tal y como se muestra en la Tabla 7.
TABLA 7 Linealidad de dilución de plasma EDTA humano normal
Plasma EDTA Humano pg/ml [medidos] Dilución Concentración % de Diferencia
Normal (muestras) Corregida
S1 103 10 1026 - - -
62 20 1237 21
35 40 1416 14
20 80 1599 13
S2 109 10 1088 - - -
59 20 1176 8
35 40 1416 20
22 80 1788 26
S3 104 10 1039 - - -
60 20 1202 16
32 40 1278 6
21 80 1677 31
S4 88 10 878 - - -
52 20 1036 18
32 40 1278 23
19 80 1528 20
S5 93 10 926 - - -
57 20 1136 23
32 40 1278 12
18 80 1433 12
S6 119 10 1192 - - -
81 20 1612 35
47 40 1893 17
29 80 2298 21
3.9 Precisión - cuantificación de VEGF en plasma humano
Los niveles de VEGF endógeno se midieron en plasma recién recogido a partir de diferentes individuos sanos normales. Las muestras individuales de plasma EDTA humano se pulsaron con concentraciones muy baja, baja, media y alta de rhVEGF de manera que cayeran dentro del rango de ensayo de la curva estándar. Las concentraciones de VEGF endógeno se determinaron y se restaron de la concentración medida para poder comparar con el pulso buscado. Los resultados de la Tabla 8 muestran que los % de recuperación medios fueron 99%, 113%, 106% y 118% para los pulsos alto, medio, bajo y muy bajo, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 8 Recuperación de pulso de rhVEGF en plasma EDTA humano
Adición Alta
[Endógeno] [Medido] [Medido-Endógeno] [Buscado] % recuperación
18.6 100.5 81.9 85.3 96
22.5 114.8 92.3 85.3 108
30.3 111.0 80.8 85.3 95
22.8 96.2 73.4 85.3 86
18.4 103.2 84.9 85.3 100
34.1 121.1 87.0 85.3 102
% Recuperación medio 99
Adición Media
[Endógeno] [Medido] [Medido-Endógeno] [Buscado] % recuperación
21.0 98.3 47.1 49.3 96
9.1 89.1 80.1 49.3 162
10.8 66.8 55.9 49.3 113
21.0 59.5 38.5 49.3 78
9.1 66.8 57.8 49.3 117
% Recuperación medio 113 
\vskip1.000000\baselineskip
Adición Baja
[Endógeno] [Medido] [Medido-Endógeno] [Buscado] % recuperación
4.5 32.9 28.4 22.9 124
10.0 32.9 22.9 22.9 100
14.9 38.3 23.4 22.9 102
8.6 31.2 22.6 22.9 99
9.3 33.7 24.4 22.9 107
15.9 40.9 25.0 23.5 106
36.2 58.8 22.6 23.5 96
38.9 66.4 27.5 23.5 117
% Recuperación medio 106 
\vskip1.000000\baselineskip
Adición Muy Baja
[Endógeno] [Medido] [Medido-Endógeno] [Buscado] % recuperación
4.3 24.9 20.2 17.8 114
4.6 26.1 21.5 17.8 120
7.4 27.9 20.4 17.8 114
6.6 26.4 19.9 17.8 111
10.8 33.1 22.2 17.8 124
5.5 29.6 24.0 17.8 135
3.9 22.7 18.6 17.8 105
% Recuperación medio 118 
\vskip1.000000\baselineskip
3.10 Precisión - cuantificación de VEGF en plasma EDTA de rata normal
Una muestra de plasma EDTA de rata individual y dos muestras combinadas de plasma EDTA de ratas macho se pulsaron con una concentración baja, media y alta de rhVEGF de manera que cayera en el rango de ensayo de la curva estándar. Las concentraciones de VEGF endógeno se determinaron y restaron de la concentración medida para poder comparar con la adición buscada (control de dilución). A continuación, las muestras pulsadas se diluyeron 1:2 en diluyente ELISA para determinar la linealidad de la dilución. Los resultados de la Tabla 9 muestran que el porcentaje medio de recuperación va del 84% al 103% para los pulsos alto, medio y bajo que eran mayores que 6,25 pg/ml.
TABLA 9 Recuperación del pulso de VEGF en plasma EDTA de rata normal
[Esperado] [Medido] [Medido] [Medido]
Control de Combin. % de Combin. % de Indiv. rata % de % de
Dilución 1 de ratas recupe- 2 de ratas recupe- macho recupe- recupe-
pg/ml macho ración macho ración Pg/ml ración ración
pg/ml pg/ml media
Adición Alta
151 160 106 155 103 148 98 103
98 106 109 85 87 92 95 97
53 58 109 43 81 43 82 91
24 25 105 15 61 18 76 81
Adición Media
44 41 94 40 92 39 89 92
22 27 125 20 93 16 71 96
11 13 115 7 66 7 65 82
5 5 104 0 0 1 15 40
Adición Baja
20 18 88 19 93 12 62 81
10 14 135 9 86 6 63 95
6 6 102 1 18 0 0 40
3 2 152 0 0 0 - - - 26
Adición Muy Baja
10 10 98 8 76 5 49 74
5 8 149 3 47 2 42 79
4 8 202 0 0 0 0 67
Endógeno LTS 43 39 
\vskip1.000000\baselineskip
3.11 Linealidad de plasma EDTA de rata normal en diluyente ELISA
Se analizó la linealidad de dilución en plasma EDTA de rata (2 muestras combinadas de macho, 1 individual). A las muestras de plasma claras se pulsaron con concentraciones baja (20 pg/ml), media (44 pg/ml) y alta (98 pg/ml) de rhVEGF y se diluyeron serialmente 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 en diluyente ELISA. Los resultados de la Tabla 10 y las Figs. 8A-8C muestran que las muestras de plasma de rata normal diluyen linealmente después de una dilución mínima 1/20 en el rango de ensayo de 8-128 pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10 Resumen de linealidad de muestras de plasma de rata (en unidades de coeficiente de correlación (R))
Adición Comb. Rata 1 Comb. Rata 2 Rata 1 Valor R medio
Alta 0.996 0.996 0.999 0.997
Media 1 0.999 0.994 0.998
Baja 0.929 0.993 0.98 0.967 
\newpage
3.12 Precisión - cuantificación de VEGF en plasma EDTA de cerdo Yorkshire normal
Ocho muestras de plasma EDTA de cerdo de Yorkshire (cuatro machos y cuatro hembras) se pulsaron con concentraciones baja, media y alta de rhVEGF de manera que cayera en el rango de ensayo de la curva estándar. Las concentraciones de VEGF endógeno se determinaron y restaron de la concentración medida para poder comparar con la adición buscada (control de dilución). A continuación, las muestras pulsadas se diluyeron 1/10, 1/20, 1/40 y 1/80 en diluyente ELISA para determinar la linealidad de la dilución. Los resultados, mostrados en la Fig. 9A (hembras) y 9B (machos) y en la Tabla 11 muestran que las muestras de plasma de rata normal diluyen linealmente después de una dilución mínima 1/20 en el rango de ensayo de 8-128 pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 11 Resumen de linealidad de muestras de cerdo Yorkshire
Género Coeficiente de Correlación (R)
Hembra 0.99718
Hembra 0.99917
Hembra 0.99998
Hembra 0.99958
Macho 1
Macho 0.99965
Macho 0.99995
Macho 0.99961
Medio 0.99939
desviación estándar 0.00093491
% CV 0.094 
\vskip1.000000\baselineskip
3.13 Detección de diversas formas de VEGF utilizando tres ELISAs
Este experimento se diseñó para determinar si el ELISA de sitio múltiple según la presente invención podía medir todas las variantes de VEGF. Las Figuras 10A, 10B y 10C muestran una comparación de ELISA para VEGF de sitio único, de dos sitios y de sitio múltiple, respectivamente. Comparando estos gráficos puede observarse que el ensayo de sitio múltiple según la invención es capaz de capturar más variantes de VEGF.
3.14 Detección utilizando dos sitios, sitio múltiple o PAb como recubrimiento
El ELISA de sitio múltiple según la invención utilizando PAb y MAb 3.5F8 como anticuerpos de recubrimiento se comparó con un ELISA utilizando sólo MAb 3.5F8 o PAb como anticuerpo de recubrimiento para evaluar la cantidad de VEGF en muestras humanas normales. Los resultados, mostrados en la Tabla 12, muestran que la cantidad de VEGF detectada en pg/ml era mucho mayor para el ensayo de sitio múltiple que para el ensayo con PAb sólo o MAb 3.5F8 sólo.
TABLA 12 Cantidad de VEGF en muestras de plasma humano normales utilizando PAb sólo, MAb sólo o PAb y MAb
Muestra NHP # Reactivo de Captura
MAb 3.5F8 PAb anti VEGF PAb anti VEGF + MAb 3.5F8
(pg/ml medio) (pg/ml medio) (pg/ml medio)
1 49 173 225
2 26 LTS 149
3 39 124 211
4 41 103 189
5 27 LTS 153
6 29 LTS 149
7 16 LTS 159
8 25 LTS 144
9 21 LTS 122
10 36 148 185
11 24 72 171
12 23 LTS 145
13 40 103 200
14 34 83 143
15 42 LTS 200
16 20 85 152
17 51 196 285
18 25 LTS 145
19 20 LTS 154
20 20 LTS 143
21 23 LTS 155
22 28 77 163
23 39 180 285
24 24 87 168
25 45 148 261
26 21 131 179
27 34 LTS 189
28 18 LTS 131
29 50 159 251
30 73 LTS 359
31 21 85 149
TABLA 12 (continuación)
Muestra NHP # Reactivo de Captura
MAb 3.5F8 PAb anti VEGF PAb anti VEGF + MAb 3.5F8
(pg/ml medio) (pg/ml medio) (pg/ml medio)
32 42 214 237
33 33 LTS 234
34 30 152 206
35 21 87 154
36 76 307 445
37 28 70 225
38 53 51 304
39 32 84 193
40 28 LTS 106
41 44 105 275
42 32 44 217
43 28 69 197
44 25 LTS 69
45 50 114 285
46 28 38 176
47 21 67 125
48 28 27 192
49 29 LTS 159
50 18 27 107
LTS = no detectable 
\vskip1.000000\baselineskip
3.15 Comparación de los niveles de VEGF en plasma humano normal y en suero humano normal utilizando ELISA de dos sitios y de sitio múltiple
Las muestras de plasma y de suero de donantes humanos normales se analizaron mediante ELISa de dos sitios con MAb 3.5F8 como anticuerpo de captura y PAb A4.6.1 como anticuerpo de detección y el ensayo de sitio m múltiple según la invención utilizando el PAb y MAbs y procedimientos anotados en los Procedimientos. Los resultados, resumidos en las Figuras 11A y 11B para plasma y suero, respectivamente, indican que el ensayo de sitio múltiple según la invención detecta más VEGF en ambos tipos de muestras que el ensayo de dos sitios.
3.16 Comparación de los niveles de VEGF en pacientes normales y cardiopatológicos utilizando ELISA de sitio único, de dos sitios y de sitio múltiple
Algunas muestras de donantes humanos normales y de donantes con enfermedad cardiaca que se apuntaron a las pruebas clínicas patrocinadas por Genentech, Inc., para evaluar la eficacia de TNK, una variante t-PA, se analizaron mediante el ELISA de Sitio Único con MAb 3.5F8 como agente de recubrimiento y de detección, con el ELISA de dos sitios con MAb 3.5F8 como anticuerpo de captura y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección y mediante el ensayo de sitio múltiple según la invención utilizando el PAb y los MAbs y los procedimientos indicados en los Procedimientos. La Figura 12 muestra las cantidades de VEGF en plasma en pacientes cardíacos utilizando los tres tipos de ensayo, y la Figura 13 y la Tabla 13 resumen las cantidades de VEGF en pacientes normales y cardíacos utilizando los ensayos de dos sitios y de sitio múltiple, la cantidad media de VEGF, la desviación estándar, el % de CV y s.e.m. Los resultados indican que el ensayo de sitio múltiple según la invención detecta más VEGF en ambos tipos de muestras que el ensayo de dos sitios.
TABLA 13 Sensibilidad de los ensayos de dos sitios y de sitio múltiple para VEGF en pacientes normales y cardíacos
Donantes Normales Pacientes Cardíacos
Dos Sitios Sitio Múltiple Dos Sitios Sitio Múltiple
pg/ml medio 32.61 192.40 37.54 279.23
Desv. Std 13.05 67.66 23.89 156.69
% CV 40.02 35.17 63.65 56.11
s.e.m. (error medio estándar) 1.84 9.56 5.34 35
3.17 Comparación de los niveles de VEGF en suero en pacientes con cáncer de pulmón utilizando ELISA de dos sitios y de sitio múltiple
Muestras del suero de pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas se analizaron mediante ELISA de dos sitios con MAb 3.5F8 como anticuerpo de captura y MAb A4.6.1 como anticuerpo de detección y mediante el ensayo de sitio múltiple según la invención utilizando el PAb y los MAbs y los procedimientos indicados en los Procedimientos. Los resultados, mostrados en la Figura 14, indican que el ensayo de sitio múltiple según la invención detecta más VEGF en pacientes con cáncer de pulmón que el ensayo de dos sitios.
3.18 Niveles de VEGF en suero en pacientes diabéticos
Los niveles de VEGF en suero en humanos normales y en pacientes con NIDDM (diabetes Tipo I) y IDDM (Diabetes Tipo II) se midieron utilizando ELISA de dos sitios (MAb 3.5F8 como agente de recubrimiento y MAb A4.6.1 como agente de detección) descrito más arriba. La Figura 15 muestra que los niveles de VEGF en suero en pacientes NIDDM y en pacientes IDDM era mayor que en pacientes normales utilizando este ensayo. Dado que el ensayo de sitio múltiple detecta más VEGF que el ensayo de dos sitios en otros pacientes enfermos, se esperaría que el ensayo
de sitio múltiple según la invención sería adecuado para detectar niveles elevados de VEGF en pacientes diabéticos.
3.19 Especificidad de PAb para VEGF versus PAb para la ADNasa en un ensayo de sitio múltiple
Se llevó a cabo un ELISA de dos sitios y un ELISA de sitio múltiple tal y como se ha descrito más arriba, para muestras de plasma humano normal. Adicionalmente, se llevó a cabo un ELISA de sitio múltiple utilizando PAb para la ADNasa en vez de PAb para VEGF como reactivo de recubrimiento. Todas estaban en la concentración de 0,4 \mug/ml. La Figura 16 y la Tabla 14 muestra que el VEGF detectado mediante un ensayo VEGF de sitio múltiple es específico. Los resultados del ELISA utilizando PAb para la ADNasa más MAb 3.5F8 muestran resultados casi idénticos que el ELISA utilizando MAb 3.5F8 sólo como reactivo de captura, con una pendiente de 1.04 (fig. 16A).
TABLA 14 Evaluación de cantidades de VEGF en plasma EDTA humano
Plasma EDTA Humano MAb 3.5F8 (0.4 \mug/ml) PAb para VEGF (0.4 \mug/ml) PAb para ADNasa (0.4 \mug/ml)
y MAb 3.5F8 (0.4 \mug/ml) y MAb 3.5F8 (0.4 \mug/ml)
Elevada Matriz (pg/ml) 147.9 147.4 119.2
Baja Matriz (pg/ml) 12.8 18.3 12.5
Siete Donantes de 61.1 164.0 59.5
Plasma Humanos 33.8 120.4 48.5
Normales (pg/ml): 34.6 174.3 64.5
47.4 104.5 102.1
28.3 70.4 79.6
67.6 113.0 71.8
61.1 105.9 65.4
3.20 Resumen de los ensayos y resultados preferidos
100
101
102
103
104
4. Discusión
Se conoce poco acerca de los niveles de las formas circulantes de VEGF en individuos normales durante el crecimiento, el embarazo, la edad anciana o en estados de enfermedad patofisiológica. En la presente invención se describe el desarrollo y caracterización de un ensayo de alto rendimiento sensible, capaz de medir diversas isoformas de VEGF y sus niveles en plasma humano. Este ensayo representa una importante herramienta para medir niveles de VEGF tanto en individuos normales como en diversos estados de enfermedad.
El ELISA para VEGF de sitio múltiple según la invención puede medir las variantes 165/165, 165/110, 121/121 y 110/110 igualmente bien. Con este ensayo, se detectó una cantidad mayor de VEGF en plasma en donantes normales (192 \pm 68 pg/ml, n=50). Para los mismos 18 pacientes cardiovasculares, se detectó una cantidad significativamente mayor de VEGF en plasma en comparación con los donantes normales (279 \pm 157 pg/ml, n= 18, p < 0,001). Véase la Fig. 13. De hecho, el anticuerpo monoclonal MAb 3.5F8 más el anticuerpo policlonal purificado por afinidad contra una proteína irrelevante no generó ninguna señal adicional por encima de la de MAb 3.5F8 solo. Se concluye que aparte de VEGF intacto, en la circulación tanto de donantes normales como de pacientes cardiovasculares, se encuentran presentes otras variantes e isoformas de VEGF. La capacidad de demostrar que el dominio de unión a receptor de VEGF es accesible para la unión puede ser una característica importante para cualquier ensayo que pretenda comprender la actividad biológica de VEGF en la circulación.
El substrato fluorométrico, strep-\beta-gal/MUG se prefiere para su utilización en el sistema de detección, de manera que el ELISA pueda detectar niveles de VEGF endógeno en individuos normales. La utilización de este substrato y la determinación del mejor diluyente ELISA dio como resultado una absorbancia de fondo mucho menor, que se prefería para conseguir el aumento en la sensibilidad de ensayo.
EL ensayo ELISA de sitio múltiple descrito en la invención es altamente específico debido a la elección de los anticuerpos utilizados para la captura y la detección. Uno de los anticuerpos de recubrimiento, MAb 3.5F8, se une cerca de la región de unión a heparina de VEGF (residuos 111-165) y el otro anticuerpo de recubrimiento, el anticuerpo policlonal de conejo, une VEGF. El anticuerpo de detección, MAb A4.6.1 se une a la región de unión KDR del receptor (residuos 1-110) de la molécula, rindiendo un ELISA específico para VEGF.
La especificidad de este ensayo ELISA de sitio múltiple será importante, dado que se comprende mejor la biología del VEGF. Keyt et al., supra (p. 7788) han demostrado que las diferentes variantes de VEGF examinadas en este estudio tienen bioactividades variables in Vitro. El conocimiento de especificidad de ensayo también será extremadamente importante para la evaluación de datos clínicos y para comparar datos entre laboratorios.
Algunas publicaciones (Kondo et al., supra (1994); Takano et al., supra (1996); Rodríguez et al., supra) han observado que los niveles de VEGF en suero se encontraban elevados en pacientes de cáncer. Considerando que la angiogénesis es un fenómeno general en la progresión de tumor sólido y que la expresión de VEGF, un factor de angiogénesis de tumor se observa en un gran variedad de células tumorales de orígenes diversos, la medida de los niveles de VEGF circulante tiene potencial como marcador de diagnóstico no invasivo para un amplio espectro de tumores sólidos.
En conclusión, se ha desarrollado un ELISA sensible que mide la mayoría de las formas moleculares de VEGF. De acuerdo con la presente invención, se generan anticuerpos en animales contra el VEGF humano, siendo el anticuerpo específico para la región C-terminal un anticuerpo monoclonal y siendo el anticuerpo específico para el VEGF completo un anticuerpo policlonal, preferentemente purificado por afinidad. Estos dos anticuerpos se utilizan como anticuerpos de recubrimiento (reactivos de captura inmovilizados) sobre un soporte sólido, por ejemplo placas de microvaloración. El anticuerpo utilizado para la detección puede ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales, siempre y cuando sean específicos para las regiones KDR y FTL1 del dominio de unión del VEGF humano.
Los ensayos ELISAs precisos y sensibles como el descrito en la presente invención se consideran importantes para ayudar a comprender los niveles de VEGF en diferentes estados de enfermedad. Una mejor comprensión de los niveles de VEGF y de las isoformas dominantes presentes en individuos normales y en estados de enfermedad patofisiológica aumentará el conocimiento del papel de VEGF en la angiogénesis normal y patológica.
Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones preferidas de la misma, se entiende que permite modificaciones adicionales y se pretende que esta aplicación cubra cualquier variación, uso o adaptación de la invención, siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo dichas modificaciones de la presente invención siempre y cuando entren dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y pudiéndose aplicar a las características esenciales indicadas en la presente invención y tal como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (26)

1. Procedimiento para detectar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una muestra biológica, que comprende las siguientes etapas:
(a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con reactivos de captura premezclados inmovilizados en un soporte sólido, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura son anticuerpos policlonal y monoclonal contra VEGF humano, y uniéndose dicho anticuerpo monoclonal específicamente al extremo C-terminal (residuos 111-165) del VEGF humano;
(b) separar la muestra biológica de los reactivos de captura inmovilizados;
(c) poner en contacto los reactivos de captura inmovilizados con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF; y
(d) medir el nivel de VEGF unido a los reactivos de captura utilizando un medio de detección del anticuerpo detectable.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la muestra biológica se aísla a partir de un sujeto humano.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el sujeto humano es un paciente con enfermedad vascular, diabético o con cáncer y que la etapa de medida (c) comprende además una comparación con una curva estándar para determinar el nivel de VEGF comparado con un individuo normal.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la muestra biológica es plasma, suero u orina.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura se inmovilizan en una fracción en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto al policlonal.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que la fracción en peso es aproximadamente 1:1 de anticuerpo monoclonal respecto al policlonal.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que la cantidad de anticuerpos monoclonales inmovilizados es aproximadamente 0,4 \mug/ml y la cantidad de anticuerpos policlonales inmovilizados es aproximadamente 0,4 \mug/ml.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura inmovilizados se recubren sobre una placa de microvaloración.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable se detecta directamente.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable se amplifica mediante un reactivo fluorimétrico.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable está biotinilado y que el medio de detección es avidina o estreptavindin-\beta-galactosidasa y 4-metilumbeliferil-\beta-galactosidasa.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo monoclonal inmovilizado es murino y el anticuerpo policlonal inmovilizado es de rata o cabra.
13. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo policlonal inmovilizado se ha purificado por afinidad.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal murino.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que el anticuerpo monoclonal inmovilizado es MAb 3,5F8 y que el anticuerpo detectable es MAb A4.6.1.
17. kit de inmunoensayo para detectar el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit:
(a) reactivos de captura, anticuerpos policlonal y monoclonal contra VEGF humano premezclados en una relación en peso de aproximadamente 0,8:1 a 1,2:1 de anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal, uniéndose específicamente el anticuerpo monoclonal al extremo C-terminal (residuos 111-165) del VEGF humano; y
(b) un reactivo de detección, un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión KDR y FLT1 del receptor de VEGF.
18. Kit según la reivindicación 17, que comprende además un soporte sólido para los reactivos de captura.
19. Kit según la reivindicación 18, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura se inmovilizan sobre el soporte sólido.
20. Kit según la reivindicación 19, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura se recubren sobre una placa de microvaloración.
21. Kit según la reivindicación 17, que comprende además un medio de detección de los anticuerpos detectables.
22. Kit según la reivindicación 21, caracterizado por el hecho de que el medio de detección es fluorimétrico.
23. Kit según la reivindicación 17, que comprende además VEGF purificado como antígeno estandar.
24. Kit según la reivindicación 17, caracterizado por el hecho de que la relación en peso del anticuerpo monoclonal respecto al anticuerpo policlonal es aproximadamente 1:1, el anticuerpo monoclonal es murino, el anticuerpo policlonal se ha purificado por afinidad y la cantidad de anticuerpos monoclonales es de 0,4 \mug/ml y la cantidad de anticuerpos policlonales es de 0,4 \mug/ml.
25. Kit según la reivindicación 24, caracterizado por el hecho de que los reactivos de captura están inmovilizados y el anticuerpo policlonal es un anticuerpo de conejo o de cabra.
26. Kit según la reivindicación 25, caracterizado por el hecho de que al anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal murino MAb A4.6.1 y el reactivo de captura es en anticuerpo monoclonal MAb 3.5F8.
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