ES2584322T3 - ELISA para VEGF - Google Patents

Abstract

Un kit de anticuerpo-ELISA sandwich capaz de detectar de manera selectiva isoformas de VEGF y fragmentos de VEGF mayores de 110 aminoacidos desde el extremo N-terminal, incluyendo las isoformas VEGF121 y VEGF165, pero no VEGF110, en donde el kit comprende: (a) un reactivo de captura que comprende un anticuerpo monoclonal contra VEGF humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de detectar especificamente isoformas de VEGF y fragmentos de VEGF mayores de 110 aminoacidos desde el extremo N-terminal, incluyendo VEGF121 y VEGF165, pero no VEGF110; y (b) reactivos de deteccion que comprenden un anticuerpo detectable, en donde el anticuerpo detectable es MAb A4.6.1, obtenible a partir del hibridoma A4.6.1 depositado en la ATCC con el numero de referencia HB10709.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

ELISA para VEGF Solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica la prioridad sobre y el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos con n.° de serie 60/828.203, presentada el 4 de octubre de 2006.

Campo de la invencion

Esta invencion se relaciona con inmunoensayos para detectar determinadas poblaciones de VEGF que pueden usarse como metodos de diagnostico y pronostico para pacientes con cancer, patologias cardiovasculares u otras patologias.

Antecedentes

Actualmente, esta bien establecido que la angiogenesis esta implicada en la patogenesis de diversos trastornos. Estos incluyen tumores solidos, smdromes neovasculares intraoculares, tales como retinopatias proliferativas o degeneracion macular asociada con la edad (DMAD), artritis reumatoide, y psoriasis (rheumatoid arthritis, and psoriasis (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klags-brun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239

(1991) ; y Garner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth Gk, Eds. 2a edicion (Marcel Dekker, NY, 1994), pags. 1625-1710). En el caso de tumores solidos, la neovascularizacion permite que las celulas tumorales adquieran una ventaja en el crecimiento y autonomia proliferativa en comparacion con las celulas normales. Por consiguiente, se ha observado una correlacion entre la densidad de los microcapilares en secciones de tumores y la supervivencia del paciente en cancer de mama, asi como en algunos otros tumores (Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak et al. Lancet 340:1120-1124

(1992) ; y Macchiarini et al. Lancet 340:145-146 (1992)).

La busqueda de reguladores positivos de la angiogenesis ha ofrecido muchos candidatos, incluyendo, por ejemplo, aFGF, bFGF, TGF-a, TGF-p, HGF, TNF- a, angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al., citado anteriormente, y Klagsbrun et al., citado anteriormente). Algunos de los reguladores negativos identificados hasta ahora, incluyen trombospondina (Good et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990)), el fragmento N-terminal de 16 kilodalton de prolactina (Clapp et al. Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)), angiostatina (O'Reilly et al. Cell 79:315-328 (1994)), y endostatina (O'Reilly et al. Cell 88:277-285 (1996)).

El trabajo realizado durante algunos de los ultimos anos ha establecido el papel fundamental del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la regulacion de la angiogenesis normal y la anormal (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). El hallazgo de que incluso la perdida de un alelo individual de VEGF produce mortalidad embrionaria apunta a un irremplazable papel desempenado por este factor en el desarrollo y la diferenciacion del sistema vascular (Ferrara et al., citado anteriormente).

Ademas, se ha demostrado que el VEFG es un mediador clave de la neovascularizacion asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara et al., citado anteriormente). El ARNm de VEGF se sobreexpresa en la mayoria de los tumores humanos examinados (Berkman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown et al. Human Pathol,. 26:86-91 (1995); Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996); y Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)). Tambien, la concentracion de VEGF en los fluidos oculares tiene una correlacion alta con la presencia de proliferacion activa de vasos sanguineos en pacientes con retinopatias diabeticas y otras retinopatias relacionadas con isquemia (Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Ademas, los estudios han demostrado la localizacion de VEGF en las membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por degeneracion macular aguda (DMA) (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)).

Los tejidos producen VEGF pero que no tiene que entrar a la circulacion para ejercer su efecto biologico, pero actua mas bien localmente como un regulador paracrino. Un estudio reciente de Yang et al. J. Pharm. Exp. Ther. 284:103 (1998) encontro que la eliminacion de rhVEGFi65 de la circulacion es muy rapida, lo que sugiere que el VEGF endogeno en la circulacion es probablemente el resultado de la sintesis continua de VEGF. Ademas, varios estudios han tratado de correlacionar los niveles de VEGF circulante con la carga tumoral y han sugerido los niveles de VEGF como un marcador pronostico potencial (Ferrari and Scagliotti Eur. J. Cancer 32A:2368 (1996); Gasparini et al. J. Natl. Cancer Inst. 89:139 (1997); Kohn Cancer 80:2219 (1997); Baccala et al. Urology 51:327 (1998); Fujisaki et al. Am. J. Gastroenterol. 93:249 (1998)). Claramente, la capacidad de medir adecuadamente VEGF sera importante para entender su papel (o papeles) potencial en numerosos procesos biologicos, tales como el mantenimiento de la permeabilidad vascular, el ciclo menstrual, la isquemia, la diabetes, el cancer, los trastornos intraoculares, etc.

En la bibliografia se informa ampliamente de concentraciones variables de VEGF endogeno en pacientes normales y enfermos, que oscilan entre niveles indetectables y niveles altos. La capacidad de medir los niveles de VEGF

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

endogeno depende de la disponibilidad de ensayos sensibles y espedficos. Se ha informado de ensayos colorimetricos, de quimioluminiscencia y fluorimetricos basados en ensayos de inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA) para VEGF. Houck et al., citado anteriormente, (1992); Yeo et al. Clin. Chem. 38:71 (1992); Kondo et al. Biochim. Biophys. Acta 1221:211 (1994); Baker et al. Obstet. Gynecol. 86:815 (1995); Hanatani et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1958 (1995); Leith y Michelson Cell Prolif. 28:415 (1995); Shifren et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:3112 (1996); Takano et al. Cancer Res. 56:2185 (1996); Toi et al. Cancer 77:1101 (1996); Brekken et al. Cancer Res. 58:1952 (1998); Obermair et al. Br. J. Cancer 77:1870-1874 (1998); Webb et al. Clin. Sci. 94:395-404 (1998).

Por ejemplo, Houck et al., citado anteriormente (1992) describen un ELISA colorimetrico que parece tener una sensibilidad de ng/ml, que podria no ser suficientemente sensible para detectar los niveles de VEGF endogeno. Yeo et al., citado anteriormente (1992) describen un ensayo inmunofluorimetrico resuelto en tiempo de dos sitios, sin embargo, no se detecto VEGF en suero normal (Yeo et al. Cancer Res. 53:2912 (1993)). Baker et al., citado anteriormente (1995), usando una version modificada de este ensayo inmunofluorimetrico, informaron de niveles detectables de VEGF en el plasma de gestantes, observando mayores niveles en mujeres con preeclampsia. Anthony et al. Ann. Clin. Biochem. 34:276 (1997) informaron de datos similares en gestantes utilizando un radioinmunoensayo. Hanatani et al., citado anteriormente (1995) desarrollaron un ELISA quimioluminiscente capaz de medir VEGF circulante e informaron de niveles de VEGF en sueros de 30 individuos normales (hombres y mujeres) de 8-36 pg/ml. Brekken et al, citado anteriormente (1998) describieron ensayos ELISA usando anticuerpos que tenian preferencia de union tanto solo con VEGF como con el complejo VEGF:Flk-1.

Esta disponible en el mercado un kit de ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN) para la deteccion de VEGF. El kit de ELISA VEGF de R&D se ha utilizado en ensayos de tipo “sandwich" en donde se utiliza un anticuerpo monoclonal para capturar el antigeno diana en VEGF y se usa un anticuerpo policlonal para detectar el VEGF. Webb et al. citado anteriormente (1998). Vease tambien, por ejemplo, Obermair et al., citado anteriormente (1998).

Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996); Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:5638 (1996); y Shifren et al., citado anteriormente (1996) tambien desarrollaron un ELISA colorimetrico basado en un par de anticuerpos monoclonales duales. A pesar de que este ELISA era capaz de detectar niveles elevados de VEGF en pacientes con cancer, carecia de la sensibilidad necesaria para medir niveles endogenos de VEGF en individuos normales. Rodriguez et al. J. Immunol. Methods 219:45 (1998) describieron un ELISA fluorimetrico de dos sitios para VEGF que alcanzaba una sensibilidad de 10 pg/ml de VEGF en suero o plasma limpios. Sin embargo, este ensayo fluorimetrico detecta las especies 165/165 y 165/110 de VEGF totalmente intactas (se ha informado de que VEGF 165/165 puede escindirse proteoliticamente en otras tres formas: un heterodimero 165/110, un homodimero 110/110 y un fragmento C-terminal de 55 aminoacidos ((Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996); Keck et al. Arch. Biochem. Biophys. 344:103-113 (1997)).

Por tanto, existe una necesidad de desarrollar un ensayo de diagnostico y pronostico que detecte niveles altamente medibles de VEGF en una muestra biologica de un modelo animal o un paciente que los ELISA ya existentes, y/o pueda medir diferentes isoformas de VEGF.

Sumario

Para detectar formas de VEGF en muestras biologicas se desarrollaron metodos anticuerpo-ELISA de tipo “sandwich" para VEGF como un antigeno. El ELISA VEGF proporcionado en el presente documento es capaz de detectar isoformas de VEGF y fragmentos de VEGF mayores de 110 (“VEGF110"). La invencion proporciona kits, tal como se definen en las reivindicaciones, para dichos ELISA de VEGF.

Por ejemplo, los metodos para detectar formas selectivas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) mayores de 110 aminoacidos (VEGF110) en una muestra biologica comprenden las etapas de: (a) poner en contacto e incubar la muestra biologica con un reactivo de captura inmovilizado en un soporte solido, en donde el reactivo de captura es un anticuerpo que reconoce el mismo epitopo que el anticuerpo 5C3 contra VEGF humano, uniendose dicho anticuerpo monoclonal especificamente a restos mayores de 110 de VEGF humano; (b) separar la muestra biologica de los reactivos de captura inmovilizados; (c) poner en contacto el complejo formado por el reactivo de captura inmovilizado y la molecula diana con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de union a receptores FLT1 y/o KDR de VEGF; y (d) medir el nivel de VEGF110+ unido a los reactivos de captura usando un medio de deteccion para el anticuerpo detectable. En determinadas realizaciones, el anticuerpo detectable se une a un epitopo en VEGF 1-110. En determinadas realizaciones, se puede llevar a cabo un ELISA de comparacion para detectar diferentes tipos de VEGF. En determinadas realizaciones, la muestra biologica (por ejemplo, muestras de tumores o de lisados tumorales, plasma, suero u orina, etc.) se aisla de un sujeto humano.

En una realizacion, el reactivo de captura es el anticuerpo monoclonal 5C3. En una realizacion, el reactivo de captura inmovilizado recubre una placa de microtitulacion. En determinadas realizaciones, el anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal. En una realizacion, el anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal murino. En una realizacion, el anticuerpo monoclonal inmovilizado es el MAb 5C3 y el anticuerpo detectable es MAb A4.6.1. En determinadas realizaciones el anticuerpo detectable es directamente detectable. En una realizacion, el anticuerpo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

detectable se amplifica mediante un reactivo colorimetrico. En una realizacion, el anticuerpo detectable esta biotinilado y el medio de deteccion es avidina o estreptavidina-peroxidasa y 3,3’,5,5’- tetrametil benzidina.

En determinadas realizaciones de la invencion, el sujeto humano es un paciente con enfermedad vascular, diabetico o con cancer y la etapa de medicion (d) ademas comprende una comparacion con una curva patron para determinar el nivel de VEGF en comparacion con un individuo normal. Se proporcionan kits. Por ejemplo, un kit de inmunoensayo, para detectar formas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) mayores de 110 aminoacidos (VEGF110+) incluyendo VEGF121 y VEGF165 pero no VEGF110 en una muestra biologica puede comprender: (a) como reactivo de captura, un anticuerpo contra VEGF humano, en donde el anticuerpo monoclonal se une especificamente a los restos mayores de 110 de VEGF humano; y (b) como reactivo de deteccion, un anticuerpo detectable que se une a los dominios de union a los receptores KDR y/o FLT1 de VEGF. En determinadas realizaciones, el anticuerpo detectable se une a un epitopo en VEGF1-110. En determinadas realizaciones, el kit, tambien comprende un soporte solido para los reactivos de captura. Por ejemplo, los reactivos de captura pueden inmovilizarse en el soporte solido (por ejemplo, una placa de microtitulacion). En determinadas realizaciones, el kit tambien comprende un medio de deteccion (por ejemplo, medio colorimetrico, medio fluorimetrico, etc.) para los anticuerpos detectables. En determinadas realizaciones, el kit tambien comprende VEGF purificado como antigeno patron. En determinadas realizaciones de la invencion, puede proporcionarse un ELISA VEGF adicional o mas para estudios de comparacion con el ELISA VEGF110+. En una realizacion, el kit incluye un anticuerpo monoclonal como reactivo de captura, que es el anticuerpo monoclonal murino MAb 5C3 y un anticuerpo detectable, que es el MAb A4.6.1.

En otra realizacion adicional, la invencion proporciona un anticuerpo 5C3 anti-VEGF (que puede obtenerse del o producirse por el hibridoma depositado en la ATCC con el numero PTA-7737). La invencion tambien proporciona un anticuerpo que no se une a VEGF 1-110 y que se une al mismo epitopo de VEGF110+ que el anticuerpo monoclonal producido por la linea celular de hibridoma PTA-7737. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invencion esta conjugado con un marcador detectable. En una realizacion, se proporciona el hibridoma 5C3.1.1 depositado en la ATCC con el numero de deposito PTA-7737.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1, los Paneles A, B y C ilustran la deteccion de moleculas VEGF165 recombinante, VEGF121(1) (truncado, que probablemente carece de aproximadamente 9 aminoacidos del extremo carboxi segun el fabricante, R&D systems), VEGF121 (2) (de Pepro Tech), VEGF110 (fragmento N-terminal generado por digestion de VEGF con plasmina) y VEGF8-109 (VEGF artificial con los aminoacidos 8-109 de VEGF165) por diferentes ensayos ELISA para VEGF. (A) ELISA A que utiliza 3.5F8 para el recubrimiento y A4.6.1 biotinilado para la deteccion. (B) ELISA B que utiliza A4.6.1 para el recubrimiento y 2E3 biotinilado para la deteccion. (C) ELISA C que utiliza 5C3 para el recubrimiento y A4.6.1 biotinilado para la deteccion.

La Figura 2 ilustra la transferencia de proteinas de VEGF producida por celulas A673, usando 3.5F8 (izquierda) o A4.6.1 (derecha) para la exploracion. Las muestran son VEGF purificado de medio acondicionado de celulas A673 utilizando una columna de afinidad para A4.6.6. (carril 1) y proteinas recombinantes de VEGF, VEGF165, VEGF121 (que probablemente carece de aproximadamente 9 aminoacidos del extremo carboxi segun el fabricante, R&D systems) y VEGF8-109 producido por E. Coli (carriles 2,3, y 4, respectivamente).

La Figura 3 ilustra un diagrama de VEGF165, VEGF121 y VEGF110 (fragmento N-terminal generado por digestion de VEGF con plasmina) que muestra los sitios de union propuestos de los anticuerpos utilizados en los tres ensayos ELISA para VEGF.

Descripcion detallada

Definiciones

Antes de describir con detalle la presente invencion, debe entenderse que esta no esta limitada a composiciones o a sistemas biologicos particulares que, por supuesto, pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologia utilizada en el presente documento tiene como proposito describir unicamente realizaciones particulares, y no se pretende que sean limitantes. Tal y como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un", “una", “uno” y “el" o “la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, una referencia a “una molecula” incluye opcionalmente una combinacion de dos o mas de dichas moleculas, y similares.

El termino “VEGF”, como se usa en el presente documento, se refiere al factor de crecimiento celular endotelial vascular de 165 aminoacidos y a los factores de crecimiento celular vascular endotelial de 121-, 145-,189-, y 206 aminoacidos, como describen Leung et al. Science 246:1306 (1989), Houck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991), y Neufeld et al., citado anteriormente, junto con las formas alelicas producidas de forma natural y las procesadas de estos factores de crecimiento. Vease tambien, por ejemplo, la Fig.1 A y B de la Patente de Estados Unidos N° 6.057.428. El fragmento de VEGF activo puede liberarse del VEGF-unido a MEC por escision con plasmina, generando los 110 primeros aminoacidos (vease, por ejemplo, Keyt BA, et al.,; The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271: 7788-7795

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(1996)). Como se utiliza en el presente documento “VEGF110+”, se refiere a fragmentos de VEGF que son mayores de 110 aminoacidos (del N-terminal), pero no incluye los primeros 110 aminoacidos o fragmentos mas pequenos (por ejemplo, VEGG8-10).

El termino “detectar”” se usa en el sentido mas amplio para incluir mediciones tanto cualitativas como cuantitativas de una molecula diana. En un aspecto, el metodo de deteccion tal como se describe en el presente documento, se usa para identificar la mera presencia de VEGF110+ o VEGF en una muestra biologica. En otro aspecto, el metodo se usa para ensayar si tanto VEGF110+ como VEGF estan a un nivel detectable en una muestra. En otro aspecto adicional, el metodo se puede utilizar para cuantificar la cantidad de VEGF110+ o VEGF en una muestra y ademas comparar los niveles de VEGF110+ o VEGF de diferentes muestras.

La expresion “muestra biologica” se refiere a una muestra corporal de cualquier animal, pero preferentemente es de un mamifero, mas preferentemente de un ser humano. En determinadas realizaciones, dicha muestra biologica es de un paciente con enfermedad vascular, diabetico o con cancer. Dichos ejemplos incluyen fluidos biologicos tales como suero, plasma, fluido vitreo, fluido linfatico, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniotico, leche, sangre completa, orina, fluido cefalorraquideo, saliva, esputo, lagrimas, sudor, moco, lisados tumorales y medio de cultivo tisular, asi como extractos tisulares, tales como tejido homogeneizado, tejido tumoral y extractos celulares. En determinadas realizaciones, la muestra es una muestra corporal de cualquier animal, en una realizacion es de un mamifero, en una realizacion de un sujeto humano. En una realizacion, dicha muestra biologica es de pacientes clinicos.

La expresion “anticuerpo detectable” se refiere a un anticuerpo que es capaz de detectarse bien directamente mediante un marcador amplificado por un medio de deteccion, o indirectamente, por ejemplo, mediante otro anticuerpo que esta marcado. Para el marcaje directo, el anticuerpo se conjuga normalmente con un resto que es detectable por algun medio. En una realizacion, el anticuerpo detectable es un anticuerpo biotinilado.

La expresion “medio de deteccion” se refiere a un resto o a una tecnica que se utiliza para detectar la presencia del anticuerpo detectable en el ELISA del presente documento e incluye agentes de deteccion que amplifican el marcador inmovilizado tal como el marcador capturado en una placa de microtitulacion. En una realizacion, el medio de deteccion es un agente de deteccion colorimetrico tal como avidina o estreptavidina-HRP.

La expresion “reactivo de captura” se refiere a un reactivo capaz de unirse con y capturar una molecula diana en una muestra, de tal manera que, en condiciones apropiadas, el complejo formado por el reactivo de captura y la molecula diana pueden separarse del resto de la muestra. Normalmente, el reactivo de captura esta inmovilizado o puede inmovilizarse. En un inmunoensayo de tipo sandwich, el reactivo de captura es preferentemente un anticuerpo o una mezcla de diferentes anticuerpos contra un antigeno diana.

El termino “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido mas amplio e incluye especificamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos lo suficientemente largos para exhibir la actividad biologica deseada.

Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, que preferentemente comprende la region variable o de union al antigeno de estos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpos monocatenarios y anticuerpos multiespecificos formados por fragmentos de anticuerpos.

Para los propositos del presente documente, un “anticuerpo intacto” es uno que comprende los dominios variables de las cadenas ligera y pesada, asi como una region Fc.

Los “anticuerpos nativos” son frecuentemente glicoprotemas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L, Light) identicas y dos cadenas pesadas (H, Heavy) identicas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de uniones disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracatenarios regularmente separados. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (Vh) seguido de un numero de dominios constante. Cada cadena ligera tiene, en un extremo, un dominio variable (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

La expresion “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por las posibles mutaciones producidas de forma natural, que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente especificos, dirigiendose contra un solo sitio antigenico. Adicionalmente, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

convencionales (policlonales), que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinates diferentes (epftopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinate en el antigeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que se sintetizan por el cultivo de hibridomas, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal" indica el caracter del anticuerpo que se obtiene de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, y no debe interpretarse como que se requiere la produccion del anticuerpo por cualquier metodo en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invencion pueden fabricarse por el metodo del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden fabricarse por metodos de ADN recombinante (vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N° 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales" tambien pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando las tecnicas descritas en Clackson et al. Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento incluyen especificamente anticuerpos “quimericos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o de la cadena ligera es identica con u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico con u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como los fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto que estos exhiban la actividad biologica deseada (Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quimericos de interes del presente documento incluyen anticuerpos “primatizados" que comprenden secuencias de union a antigeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo; monos del viejo mundo, tales como babuino, mono Rhesus o momo cinomolgo) y secuencias de la region constante humanas (Patente de Estados Unidos N° 5.693.780).

Las formas “humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos, que contienen secuencias minimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo, o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los restos de la region marco conservada (FR, Framework Region) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan posteriormente para refinar el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprendera tambien al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc); normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, veanse Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). En una realizacion, se proporciona un anticuerpo 5C3 humanizado y se utilizan los metodos proporcionados en el presente documento.

El termino “variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a traves de los dominios variables de los anticuerpos. Esta concentrada en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena pesada como de cadena ligera. Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco conservadas (FR). Cada uno de los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cuatro FR, que adoptan en gran parte una configuration en lamina-p, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura en lamina-p. En cada cadena, las regiones hipervariables se mantienen juntas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formation del sitio de union al antigeno de los anticuerpos (veanse Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5a Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no se involucran directamente en la union de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participation del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA).

La digestion de los anticuerpos con papaina produce dos fragmentos de union a antigeno identicos denominados fragmentos “Fab", cada uno de ellos con un solo sitio de union a antigeno y un fragmento “Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar facilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de union a antigeno y que incluso es capaz de entrecruzarse con el antigeno.

El fragmento “Fv" es el fragmento de anticuerpo minimo que contiene un sitio de reconocimiento antigenico y un sitio de union a antigeno completos. Esta region consiste en un dimero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en fuerte asociacion no covalente. Es en esta configuracion en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de union a antigeno en la superficie del dimero Vh-Vl. Conjuntamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de union a antigeno. Sin

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables espedficas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y de unirse al antigeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de union entero.

El fragmento Fab' tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o mas cisteinas de la region bisagra del anticuerpo. En el presente documento, Fab'-SH recibe el nombre de Fab' donde el resto (o restos) de cisteina de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab') del anticuerpo se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteinas bisagra entre ellos. Tambien se conocen otros acoplamientos quimicos de fragmentos de anticuerpos.

Las “cadenas ligeras” de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (T), basados en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y algunas de estas pueden dividirse ademas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, 8, £, y y |j, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

Los fragmentos “Fv monocatenario” o “Fvmc” del anticuerpo comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en el que estos dominios estan presentes en una sola cadena polipeptidica. Preferentemente, el polipeptido Fv ademas comprende un engarce polipeptidico entre los dominios Vh y Vl que permite al FVmc formar la estructura deseada para la union antigenica. Para una revision del FVmc, vease Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pags. 269-315 (1994).

La expresion “region hipervariable” cuando se usa en el presente documento, se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union antigenica. La region hipervariable comprende restos de aminoacidos de una “region determinante de complementariedad” o “CDR” (por ejemplo, restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos restos de un “bucle hipervariable” (por ejemplo, restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los restos “marco conservados” o “FR” son aquellos restos del dominio variable diferentes de los restos de la region hipervariable, como se define en el presente documento.

Los “mamiferos” con propositos de tratamiento se refieren a cualquier animal clasificado como un mamifero, incluyendo seres humanos, animales domesticos y de granja, y animales de zoo, los destinados al deporte, o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. Preferentemente el mamifero es un ser humano.

Los terminos “cancer”, “canceroso”, y “maligno” se refieren a o describen la afeccion fisiologica en mamiferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cancer incluyen, pero sin limitacion, carcinoma, incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen el cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon (incluyendo cancer microcitico pulmonar, cancer no microcitico pulmonar, adenocarcinoma del pulmon y carcinoma escamoso del pulmon), cancer del peritoneo, cancer hepatocelular, gastrico o cancer de estomago (incluyendo cancer gastrointestinal), cancer estromal gastrointestinal, cancer de pancreas, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de higado (por ejemplo, carcinoma hepatico y hepatoma), cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer rectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandula salival, cancer de rinon o renal, cancer de higado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma de celulas basales, cancer testicular, cancer de esofago, carcinoma hepatico, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, mesotelioma, mieloma multiple, y varios tipos de cancer de cabeza y cuello, asi como el linfoma de celulas B (incluyendo linfoma no Hodgkin (LNH) folicular /de grado bajo; LNH linfocitico pequeno (LP); LNH folicular/de grado intermedio; LNH difuso de grado intermedio; LNH inmunoblastico de grado alto; LNH linfoblastico de grado alto; LNH de celulas pequenas no escindidas de grado alto; LNH de enfermedad voluminosa; linfoma de celulas del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); Linfoma de Hodgkin, leucemia linfocitica cronica (LLC), leucemia linfoblastica aguda (LLA), leucemia de celulas pilosas; leucemia mieloblastica cronica, y trastorno linfoproliferativo despues de un trasplante (TLDT), asi como la proliferacion vascular anomala asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), y sindrome de Meigs.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Los terminos “vascular" y “cardiovascular" se usan indistintamente y describen pacientes como indicios que estimulan la angiogenesis y/o la cardiovascularizacion, y aquellos que inhiben la angiogenesis y/o cardiovascularizacion. Dichos trastornos incluyen, por ejemplo, enfermedades arteriales tales como, ateroesclerosis, hipertension, vasculitis inflamatoria, enfermedad de Reynaud y fenomeno de Reynaud, aneurismas y restenosis arterial, trastornos venosos y linfaticos tales como tromboflebitis, linfangitis y linfedema, y otros trastornos vasculares tales como enfermedad vascular periferica, AMD, canceres tales como tumores vasculares, por ejemplo, hemangioma (capilar y cavernoso), tumores glomicos, telangiectasia, angiomatosis bacilar, hemangioendotelioma, angiosarcoma, hemangiopericitoma, sarcoma de Kaposi, linfangioma y linfangiosarcoma, angiogenesis tumoral, traumatismos tales como heridas, quemaduras, y otras lesiones tisulares, fijacion de implantes, cicatrizacion, lesion por isquemia-reperfusion, artritis reumatoide, enfermedad cerebrovascular, enfermedades renales tales como insuficiencia renal aguda, y osteoporosis. Esto tambien incluiria la angina de pecho, infarto de miocardio, asi como infartos agudos de miocardio, hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiaca, asi como insuficiencia cardiaca congestiva (CHF).

El termino "diabetes" se refiere a una enfermedad progresiva del metabolismo de los carbohidratos que implica una produccion o utilizacion inadecuada de la insulina y se caracteriza por hiperglucemia y glucosuria. Este termino incluye todas las formas de diabetes, tales como diabetes de tipo I y de tipo II y la diabetes resistente a la insulina, tales como Sindrome de Mendenhall, Sindrome de Werner, leprecaunismo, diabetes lipoatrofica y otras lipoatrofias.

La expresion “purificado por afinidad" se refiere a purificar una sustancia por elucion de esta a traves de una columna de cromatografia por afinidad.

ELISA

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una glicoproteina homodimerica y es un factor angiogenico fundamental en la formacion de vasos sanguineos durante el desarrollo y en angiogenesis patologica asociada a tumores. La expresion de VEGF se potencia en respuesta a hipoxia, y potencialmente a otros factores tales como factores de crecimiento, hormonas y oncogenes, (vease, por ejemplo, Ferrara N: Vascular endothelial growth factor: Basic science and clinical progress. Endocrine Reviews 25: 581-611 (2004)). El gen del VEGF humano tiene ocho exones separados por intrones. El corte y empalme alternativo del ARN da como resultado la generacion de al menos cuatro isoformas principales cuyos monomeros tienen 121, 165,189 y 206 aminoacidos (veanse, por ejemplo, Houck KA, et al.,; The vascular- endothelial growth factor family: identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. Mol Endocrinol 5: 1806-1814 (1991); y, Tischer E, et al.,; The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem 266: 11947-11954 (1991)). Tambien se ha informado de isoformas menos frecuentes que incluyen aquellas cuyos monomeros tienen 145 (vease, por ejemplo, Poltorak Z., et al.,; VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isofom that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 272: 7151-7158 (1997)) y 183 (vease, e.g., Jingjing L, et al.,; Human Muller cells express VEGF183. a novel spliced variant of vascular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 40:752-759 (1999)) aminoacidos. Todas las isoformas de VEGF se unen a dos tirosina quinasas receptoras, VEGFR-1 (vease, por ejemplo, De Vries C, et al.; The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science 255:989-991 (1992)) y VEGFR-2 (vease, por ejemplo, Terman BI, et al,; Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 6:1677-1683 (1991)). El VEGF165 tambien interacciona con neuropilina (vease, por ejemplo, Soker S. et al.,; Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptorfor vascular endothelial growth factor. Cell 92: 735-745 (1998)). El VEGF189 y el VEGF206 se unen a heparina con una alta afinidad y se secuestran mayoritariamente en la matriz extracelular (MEC). El VEGF165 se une a heparina con afinidad intermedia y es parcialmente soluble y se une parcialmente a la superficie celular y a la MEC. El VEGF121 no se une a heparina y es facilmente soluble. Mediante analisis por PCR de transcripcion reversa se encontro que el VEGF121 y el VEGF165 eran las variantes mas dominantemente expresadas en especimenes de tumores de cancer de mama y de ovario y en lineas celulares, mientras que no se detecto la expresion de VEGF206. Se encontro que la expresion de VEGF183 y VEGF189 no era detectable o lo era a bajos niveles en las lineas celulares y se detecto en algunos de los especimenes de tumores (vease, por ejemplo, Stimpfl M, et al.,; Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259 (2002)).

El fragmento activo de VEGF puede liberarse del VEGF unido a MEC por escision con plasmina, generando los primeros 110 aminoacidos (vease, por ejemplo, The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271: 7788-7795 (1996)). Este podria ser un mecanismo para regular localmente la biodisponibilidad de VEGF durante los procesos fisiologicos y patologicos de la angiogenesis. Veanse, por ejemplo, Houck KA, et al. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem 1992;267:26031-26037 (1992); Keyt BA, et al. The carboxy-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenicpotency. J Biol Chem. 271:7788-7795 (1996); y, Roth D, et al. Plasmin modulates vascular endothelial growth factor-A-mediated angiogenesis during wound repair. Am Pathology 168: 670-684. (10-12) (2006). Sin embargo, en muestras biologicas no se han descrito concentraciones de VEGF110. Tambien pueden liberarse fragmentos activos de VEGF de VEGF unido a la MEC por escision con metaloproteinasas de la matriz (MMP). Esto se confirma por el hallazgo de fragmentos degradados de VEGF con aminoacidos adicionales en 1-110 en liquido ascitico de pacientes con cancer

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de ovario. Se detectaron tanto plasmina como MMP3, en liquido asdtico. Vease por ejemplo, Lee S, Shahla MJ, et al. Processing of VEGF-A by matrix metallo-proteinases regulates bioavailability and vascular patterning in tumors. J Cell Biology 169:681-691 (2005).

Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para varios antigenos incluyen aquellos basados en colorimetria, quimioluminiscencia y fluorimetria. Los ELISA se han aplicado con exito en la determinacion de cantidades bajas de farmacos y otros componentes antigenicos en muestras de plasma y orina, no implican etapas de extraccion y son sencillos de realizar. El ensayo descrito en el presente documento, es un ELISA que utiliza anticuerpos como reactivos de captura y anticuerpos detectables para VEGF y VEGF110-. En determinadas realizaciones, el ELISA esta basado en celulas. En la primera etapa del ensayo la muestra biologica que se sospecha que contiene VEGF o que contiene VEGF110+ se pone en contacto y se incuba con los anticuerpos de captura (o de recubrimiento) de forma que los anticuerpos de captura capturan o se unen al VEGF o al VEGF110+ de forma que pueden detectarse en una etapa de deteccion. La etapa de deteccion implica el uso del anticuerpo detectable, que, cuando se pone en contacto con cualquiera de VEGF o VEGF110+ , se une a la proteina de interes, si esta presente, y se utiliza un medio de deteccion para detectar el marcador en el anticuerpo y por lo tanto la presencia o cantidad de VEGF o VEGF110+ presente. Este ELISA puede compararse con un ELISA que reconoce VEGF total (por ejemplo, patente de Estados Unidos N° 6.855.508; aquellos descritos en el presente documento, y aquellos conocidos en la tecnica) o isoformas de VEGF para determinar el tipo de VEGF presente.

Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el ensayo utiliza las siguientes etapas.

Primera etapa

En la primera etapa del ensayo del presente documento, la muestra biologica se pone en contacto y se incuba con el reactivo de captura (o de recubrimiento) inmovilizado, que es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF. Este anticuerpo puede ser de cualquier especie, pero preferentemente, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal murino o de rata, mas preferentemente murino y lo mas preferentemente el MAb 5C3 que deriva del hibridoma identificado en el presente documento. De este modo, en una realizacion especifica preferida, el anticuerpo monoclonal inmovilizado es un anticuerpo monoclonal murino, lo mas preferentemente MAb 5C3. La inmovilizacion se realiza de manera convencional insolubilizando el reactivo de captura, bien antes del procedimiento del ensayo, por adsorcion a una matriz o superficie insoluble en agua (Patente de Estados Unidos N° 3.720.760) o por acoplamiento covalente o no covalente (por ejemplo, usando entrecruzamiento con glutaraldehido o carbodiimida, con o sin activacion previa del soporte, por ejemplo, con acido nitrico y un agente reductor tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 3.645.852 o en Rotmans et al. J. Immunol. Methods 57:87-98 (1.983)), o despues, por ejemplo, por inmunoprecipitacion.

La fase solida usada para la inmovilizacion puede ser cualquier soporte inerte o transportador que sea esencialmente insoluble en agua y util en ensayos inmunometricos, que incluyen soportes en forma de, por ejemplo, superficies, particulas, matrices porosas, etc. Los ejemplos de soportes de uso comun incluyen laminas pequenas, Sephadex, cloruro de polivinilo, perlas de plastico, y placas de ensayo o tubos de ensayo fabricados con polietileno, polipropileno, poliestireno, y similares, que incluyen placas de microtitulacion de 96 pocillos, asi como materiales particulados tales como papel de filtro, agarosa, dextrano reticulado y otros polisacaridos. De forma alternativa, se emplean matrices reactivas insolubles en agua, tales como carbohidratos activados con bromuro de cianogeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de Estados Unidos Nos 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 de forma apropiada para la inmovilizacion del reactivo de captura. En una realizacion, el reactivo de captura inmovilizado recubre una placa de microtitulacion, y en particular la fase solida preferida es una placa de microtitulacion de pocillos multiples que puede utilizarse para analizar varias muestras al mismo tiempo, por ejemplo, una placa de microensayo ELISA de 96 pocillos tal como la que se comercializa como Nunc Maxisorb o Immulon. En determinadas realizaciones, la placa es una placa ELISA de 96 pocillos MICROTEST™ o MAXISORP™, tal como las que se comercializan como NuNc MAXISORB™ o IMMULON™.

La fase solida esta recubierta con el reactivo de captura tal como se define anteriormente, que puede unirse mediante una interaction covalente o no covalente o union fisica, segun se desee. Las tecnicas para la adhesion incluyen aquellas que se describen en la patente de Estados Unidos N° 4.376.110 y en las referencias que se citan en el presente documento. Si la interaccion es covalente, la placa u otra fase solida se incuba con un agente reticulante junto con el reactivo de captura en condiciones bien conocidas en la tecnica, por ejemplo, tal como durante 1 hora a temperatura ambiente.

Los agentes reticulantes que se usan comunmente para unir el reactivo de captura con el sustrato en fase solida incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehido, esteres de N-hidroxi-succinimida, por ejemplo, esteres con acido 4-azido-salicNico, imidoesteres homobifuncionales, que incluyen esteres de disuccinimidilo tales como 3,3 '-ditiobis-(succinimidil-propionato), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes derivatizantes, tales como metil-3-[(p-azidofenil)-ditio] propioimidato producen productos intermedios fotoactivables capaces de formar reticulaciones en presencia de luz.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Si se utilizan placas de 96 pocillos, que estan normalmente recubiertas con el reactivo de captura (normalmente diluido en un tampon tal como carbonato de sodio 0,05 M por incubacion durante al menos aproximadamente 10 horas, mas preferentemente al menos durante una noche, a temperaturas de aproximadamente 4-20 °C, o aproximadamente 4-8 °C, y a un pH de aproximadamente 8-12, o aproximadamente pH 9-10, o aproximadamente pH 9,6). Si se desean tiempos de recubrimiento mas cortos, se pueden recubrir, por ejemplo, placas de 96 pocillos a temperatura ambiente durante dos horas. Las placas pueden apilarse y recubrirse mucho antes al propio ensayo, y despues el ensayo puede llevarse a cabo en varias muestras simultaneamente de modo manual, semi-automatico, o automatico, tal como utilizando robotica.

Despues, las placas recubiertas se tratan normalmente con un agente bloqueante que se une de manera inespecifica y satura los sitios de union para evitar la union no deseada del ligando libre a los sitios sobrantes de los pocillos de la placa. Los ejemplos de agentes bloqueantes adecuados para este proposito incluyen, por ejemplo, gelatina, albumina de suero bovino, albumina de huevo, caseina y leche desnatada. El tratamiento de bloqueo normalmente tiene lugar en condiciones de temperatura ambiente durante aproximadamente 1-4 horas, preferentemente durante aproximadamente 1 a 3 horas, o durante una noche a 0-4 ° C.

Despues del recubrimiento y el bloqueo, se anade el patron de VEGF (VEGF purificado) o la muestra biologica a analizar, adecuadamente diluida, a la fase inmovilizada. La tasa de dilucion preferida es de aproximadamente 1-15 %, preferentemente de aproximadamente 10 %, en volumen. Los tampones que pueden utilizarse para la dilucion para este proposito incluyen (a) PBS que contiene BSA al 0,5 %, detergente TWEEN 20™( P20 ) al 0,05 %, antibiotico PROCLIN™ 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM, tensioactivo de Chaps al 0,25 %, beta-gamma globulina al 0,2 %, y NaCl 0,35 M, pH 7,4; (b) PBS que contiene albumina de suero bovino al 0,5 %, polisorbato 20 al 0,05 %, EDTA 5 mM, CHAPS al 0,25 %, y globulinas bovinas al 0,2 %, y NaCl 0,35 M; pH 7,4; (c) PBS que contiene BSA al 0,5 %, polisorbato 20 ( P20 ) al 0,05 %, y PROCLIN ™ 300 al 0,05 %, pH 7; (d) PBS que contiene BSA al 0,5 %, P20 al 0,05 %, PROCLIN™ 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM , y NaCl 0,35 M, pH 6,35 ; ( e) PBS que contiene BSA al 0,5 %, P20 al 0,05 %, PROCLIN™ 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM, beta-gamma globulina al 0,2 %, y NaCl 0,35 M, pH 7,4; y (f) PBS que contiene BSA al 0,5 %, P20 al 0,05 %, PROCLIN™ 300 al 0,05 %, EDTA 5 mM, CHAPS al 0,25 %, y NaCl 0,35 M, pH 7,4. El PROCLIN™ 300 actua como un conservante, y el Tween 20™ actua como un detergente para eliminar la union no especifica.

Mientras la concentracion de los reactivos de captura generalmente se determinara por el intervalo de concentration de interes del VEGF teniendo en cuenta cualquier dilucion necesaria de la muestra biologica, la concentracion final del reactivo de captura se determinara normalmente de forma empirica para maximizar la sensibilidad del ensayo por encima del intervalo de interes.

Las condiciones de incubacion de la muestra y del reactivo de captura inmovilizado se seleccionan para maximizar la sensibilidad del ensayo y para minimizar la disociacion. Preferentemente, la incubacion se realiza a temperaturas bastante constantes, que varian de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 40 °C, preferentemente de aproximadamente 20 °C a 25 °C. El tiempo de incubacion depende principalmente de la temperatura, siendo generalmente no superior a aproximadamente 10 horas para evitar un ensayo insensible. Preferentemente, el tiempo de incubacion es de aproximadamente 0,5 a 3 horas, y mas preferentemente 1,5-3 horas a temperatura ambiente para maximizar la union de VEGF110+ o VEGF libre a los reactivos de captura. La duration de la incubacion puede prolongarse si se anade un inhibidor de proteasas para prevenir que las proteasas del fluido biologico degraden el VEGF.

En esta fase, el pH de la mezcla de incubacion estara normalmente en el intervalo de aproximadamente 4-9,5, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 6-9, mas preferentemente aproximadamente 7-8, y mas preferentemente el pH del diluyente del ensayo (ELISA) es un pH de 7,4. El pH del tampon de incubacion se selecciona para mantener un nivel significativo de union especifica del reactivo de captura para que el VEGF110+ o el VEGF se capturen. Se pueden emplear diversos tampones para alcanzar y mantener el pH deseado durante esta etapa, incluidos borato, fosfato, carbonato, Tris-HCl o Tris-fosfato, acetato, barbital y similares. El tampon particular empleado no es critico para la invention, pero en ensayos individuales se puede preferir un tampon sobre otro.

Segunda etapa

En la segunda etapa del metodo de ensayo del presente documento, que es opcional, la muestra biologica se separa (preferentemente por lavado) del reactivo de captura inmovilizado para eliminar las moleculas no capturadas. La solution usada para el lavado generalmente es un tampon (“tampon de lavado") con un pH determinado utilizando las consideraciones y tampones que se describen anteriormente para la etapa de incubacion, con un intervalo de pH preferente de aproximadamente 6-9. El lavado debe realizarse tres o mas veces. La temperatura de lavado va generalmente desde la de refrigeration, hasta temperaturas moderadas, con una temperatura que se mantiene constante durante el periodo del ensayo, normalmente de aproximadamente 0-40 °C; mas preferentemente de aproximadamente 4-30 °C. Por ejemplo, el tampon de lavado se puede colocar en hielo a 4 °C en un deposito antes del lavado, y en esta etapa se puede utilizar un lavaplacas. En esta fase se puede anadir tambien un agente reticulante u otro agente apropiado para permitir que el VEGF110+ o el VEGF ahora unido se una covalentemente al reactivo de captura si existe algun interes de que el VEGF110+ o el VEGF capturado pueda disociarse hasta cierto

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

grado en las etapas posteriores.

T ercera etapa

En la siguiente etapa, el reactivo de captura inmovilizado se pone en contacto con anticuerpos detectables, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 20-40 °C; mas preferentemente aproximadamente 20-25 °C, con la temperatura y el tiempo exactos para ponerlos a los dos en contacto dependiendo fundamentalmente del medio de deteccion empleado. Por ejemplo, cuando se utiliza estreptavidina-peroxidasa y 3,3',5,5'-tetrametil benzidina como medio de deteccion, por ejemplo, en una realizacion, el contacto se realiza (por ejemplo, durante aproximadamente 1 hora o mas) para amplificar la senal al maximo. Preferentemente se anade un exceso molar de un anticuerpo con respecto a la concentracion maxima de VEGF110+ y VEGF libre esperada a la placa despues lavarla (tal como se describe anteriormente). Este anticuerpo es directa o indirectamente detectable. Mientras que el anticuerpo detectable puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, por ejemplo, en determinadas realizaciones es un anticuerpo monoclonal, en una realizacion murino, y en una realizacion MAb A6.4.1. Ademas, el anticuerpo detectable puede ser directamente detectable, y en una realizacion tiene un marcador colorimetrico, y en otra realizacion tiene un marcador fluorimetrico. Mas preferentemente, el anticuerpo detectable esta biotinilado y el medio de deteccion es avidina o estreptavidina-peroxidasa y 3,3', 5,5'-tetrametil benzidina. La lectura del medio de deteccion puede ser colorimetrica o fluorimetrica. La afinidad del anticuerpo debe ser lo suficientemente alta para que se puedan detectar pequenas cantidades de VEGF110+ o de VEGF libre, pero no tan alta como para producir la extraccion de VEGF110+ o VEGF de los reactivos de captura.

Cuarta etapa

En la ultima etapa del metodo del ensayo, el nivel de VEGF libre que ahora esta unido al reactivo de captura se mide usando un medio de deteccion para el anticuerpo detectable. Si la muestra biologica es de un paciente con enfermedad vascular, diabetico o con cancer, la etapa de medicion comprende preferentemente comparar la reaccion que se produce como resultado de las tres etapas anteriores con una curva patron para determinar el nivel de VEGF110+ o VEGF en comparacion con un individuo normal, o preferentemente comprende comparar la reaccion que se produce como resultado de las tres etapas anteriores con otro ELISA VEGF que reconoce diferentes isoformas de VEGF total para determinar el nivel de los tipos de VEGF cuando se comparan los ELISA, y opcionalmente en comparacion con un individuo normal.

Produccion de anticuerpos

Los anticuerpos policlonales para el VEGF generalmente se suscitan en animales por inyecciones multiples subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) de VEGF y un adyuvante. Puede ser util conjugar el VEGF o un fragmento que contenga la secuencia de aminoacidos diana con una proteina que sea inmunogenica en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa americana, seroalbumina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de semilla de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, ester de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugacion a traves de restos de cistema), N-hidroxisuccinimida (a traves de restos de lisina), glutaraldehido, anhidrido succinico, SOCl2, o R1N = C = NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.

Los anticuerpos usados como el recubrimiento o los anticuerpos detectables pueden obtenerse de cualquier fuente de vertebrados conveniente, tal como murina, primates, lagomorfos, cabra, conejo, rata, pollo, bovina, ovina, equina, canina, felina o porcina. Tambien pueden emplearse anticuerpos quimericos o humanizados, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567; Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); Neuberger et al. Nature 312: 604 (1984); Takeda et al. Nature 314:452 (1985); y en el documento WO 98/45331 publicado el 15 de octubre de 1998, asi como en las referencias adicionales indicadas anteriormente.

Los animales pueden inmunizarse contra los conjugados inmunogenicos o derivados combinando 1 mg o 1 ^g de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solucion por via intradermica en multiples sitios. Un mes mas tarde los animales se vacunan de nuevo con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en adyuvante incompleto de Freund por inyeccion subcutanea en multiples sitios. De 7 a 14 dias mas tarde los animales se desangran y el titulo de anti-VEGF se ensaya en suero. Los animales se vacunan de nuevo hasta que el titulo se estabiliza. Preferentemente, el animal se vacuna de nuevo con el conjugado de VEGF, pero conjugado con una proteina diferente y/o a traves de un agente reticulante diferente. Los conjugados tambien se pueden preparar en cultivo de celulas recombinantes como proteinas de fusion. Tambien, se utilizan agentes agregantes como el alumbre para mejorar la respuesta inmunitaria. Los metodos para la produccion de anticuerpos policlonales se describen en numerosos libros de texto de inmunologia, tales como Davis et al. Microbiology, 3a Edicion, (Harper & Row, Nueva York, Nueva York, 1980).

Los anticuerpos monoclonales se preparan recuperando esplenocitos de animales inmunizados e inmortalizando las celulas de manera convencional, por ejemplo, por fusion con celulas de mieloma o transformation con el virus de Epstein-Barr, y exploration de clones que expresan el anticuerpo deseado. Vease, por ejemplo, Kohler y Milstein Eur. J. Immunol. 6:511 (1976). Los anticuerpos monoclonales, o la region de union al antigeno de un anticuerpo monoclonal, tales como fragmentos Fab o (Fab)2, como alternativa, pueden producirse por metodos recombinantes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Los ejemplos de anticuerpos adecuados incluyen aquellos ya utilizados en RIA conocidos para la proteina en cuestion, por ejemplo, aquellos anticuerpos dirigidos contra VEGF tal como se describe en las referencias proporcionadas en la introduccion del presente documento.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF 5C3, que es obtenible a partir de o producido por el hibridoma depositado en la ATCC con el numero PTA-7737, se utiliza, opcionalmente con otro anticuerpo anti-VEGF, A4.6.1. La invencion tambien puede usar un anticuerpo que no se une al VEGF 1-110 y se une al mismo epitopo de VEGF110+ que el anticuerpo monoclonal producido por la linea celular de hibridoma PTA-7737. Se proporciona un hibridoma 5C3.1.1 depositado en la ATCC con numero de deposito PTA-7737.

Deteccion

El anticuerpo que se anade a los reactivos de captura inmovilizados, se marcara bien directamente, o se detectara indirectamente por la adicion, despues de separar por lavado el exceso del primer anticuerpo, de un exceso molar de un segundo anticuerpo marcado dirigido contra la IgG de la especie animal del primer anticuerpo. En este ultimo ensayo indirecto, a la muestra se anaden antisueros marcados contra el primer anticuerpo para producir el anticuerpo marcado in situ.

El marcador usado para el primer o segundo anticuerpo es cualquiera que sea funcionalmente detectable que no interfiera con la union de VEGF110+ o de VEGF libre al anticuerpo. Los ejemplos de marcadores adecuados son aquellos numerosos marcadores conocidos para su uso en inmunoensayos, que incluyen restos que pueden detectarse directamente, tales como fluorocromos, marcadores quimioluminiscentes y radiactivos, asi como restos, tales como enzimas, que para detectarse deben reaccionar o derivatizarse. Ejemplos de dichos marcadores incluyen los radioisotopos, 32P, 14C , 125I, 3H, 131I y fluoroforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana (Patente de Estados Unidos N° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidasa de rabano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidosacaridasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterociclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peroxido de hidrogeno para oxidar un precursor colorante tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/estreptavidina-p-galactosidasa con MUG, marcadores de spin, marcadores de bacteriofagos, radicales libres estables, y similares. Como se senalo anteriormente, la deteccion fluorimetrica es un ejemplo.

Se dispone de metodos convencionales para unir estos marcadores de forma covalente a las proteinas o polipeptidos. Por ejemplo, pueden utilizarse agentes de acoplamiento tales como dialdehidos, carbodiimidas, dimaleimidas, bisimidatos, bisbenzidinas, diazotizadas, y similares para marcar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimaticos descritos anteriormente. Veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos. N° 3.940.475 (fluorimetria) y N° 3.645.090 (enzimas); Hunter et al., Nature 144:945 (1962); David et al. 13:1014-1021 Biochemistry (1974); Pain et al. J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981); y Nygren J. Histochem; y Cytochem. 30:407-412 (1982). En determinadas realizaciones, los marcadores de la presente invencion son fluorescentes para aumentar la amplificacion y la sensibilidad a 8 pg/ml, mas preferentemente biotina con estreptavidina-p-galactosidasa y MUG para amplificar la senal. En determinadas realizaciones, se utiliza un marcador colorimetrico, por ejemplo, donde el anticuerpo detectable esta biotinilado y el medio de deteccion es avidina o estreptavidina-peroxidasa y 3,3', 5,5'-tetrametil benzidina.

La conjugacion de dichos marcadores, incluidas las enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento de manipulacion convencional para un experto en las tecnicas de inmunoensayo. Vease, por ejemplo, O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, Nueva York, Nueva York, 1981), pags 147-166.

Tras anadir el ultimo anticuerpo marcado, la cantidad de anticuerpo unido se determina eliminando el exceso de anticuerpo marcado no unido mediante lavado y despues, midiendo la cantidad de marcador unido usando un metodo de deteccion apropiado para el marcador, y correlacionando la cantidad medida con la cantidad de VEGF110+ o VEGF libre en la muestra biologica. Por ejemplo, en el caso de enzimas, la cantidad de color que se revela y se mide sera una medida directa de la cantidad del VEGF110+ o VEGF presente. Especificamente, si el marcador es HRP, el color se detecta utilizando el sustrato 3,3', 5,5'-tetrametil benzidina a una absorbancia de 450 nm.

En un ejemplo, despues de lavar de la fase inmovilizada un segundo anticuerpo marcado con una enzima dirigido contra el primer anticuerpo no marcado, se revela el color o se mide la quimioluminiscencia incubando el reactivo de captura inmovilizado con un substrato de la enzima. Despues se calcula la cantidad de concentracion de VEGF110+ libre o VEGF comparando con el color o la quimioluminiscencia generados por el procesamiento en paralelo del patron VEGF.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Kits

De acuerdo con la invencion, el metodo de ensayo de esta divulgacion se proporciona en forma de un kit. Dicho kit es una combinacion de envasado que incluye los elementos basicos de:

(a) reactivo de captura compuesto por el anticuerpo monoclonal contra la molecula de VEGF humano, en donde el anticuerpo monoclonal reconoce a VEGF110+; y

(b) reactivos de deteccion que comprenden anticuerpos detectables (marcados o no marcados) que se unen a los dominios de union de los receptores KDR y FLT1 de VEGF. Estos elementos basicos se definen anteriormente en el presente documento. En determinadas realizaciones, los reactivos de deteccion comprenden un anticuerpo detectable (o anticuerpos detectables) que se unen al epitopo de VEGF1-110.

Preferentemente, el kit comprende ademas un soporte solido para los reactivos de captura, que puede proporcionarse como un elemento distinto o en el que los reactivos de captura ya estan inmovilizados. Por tanto, los anticuerpos de captura en el kit pueden inmovilizarse sobre un soporte solido, o pueden inmovilizarse sobre dicho soporte que se incluye con el kit o proporcionarse por separado del kit.

Preferentemente, los reactivos de captura recubren una placa de microtitulacion. El reactivo de deteccion puede ser anticuerpos marcados directamente o anticuerpos no marcados que detectan los anticuerpos marcados dirigidos contra los anticuerpos no marcados suscitados en una especie diferente. Cuando el marcador es una enzima, el kit incluira normalmente sustratos y cofactores requeridos por la enzima, y donde el marcador es un fluoroforo, un precursor de colorante que proporciona el cromoforo detectable. Cuando el reactivo de deteccion no esta marcado, el kit tambien puede comprender un medio de deteccion para los anticuerpos detectables, tales como los anticuerpos marcados dirigidos contra los anticuerpos no marcados, preferentemente en un formato de deteccion fluorimetrica. Cuando el marcador es una enzima, el kit incluira normalmente sustratos y cofactores requeridos por la enzima, donde el marcador es un fluoroforo, un precursor de colorante que proporciona el cromoforo detectable, y donde el marcador es biotina, una avidina tal como avidina, estreptavidina, o estreptavidina conjugada con HRP o p-galactosidasa con MUG.

En una realizacion especifica, el reactivo de captura es un anticuerpo monoclonal, preferentemente de roedor, mas preferentemente murino o de rata, aun mas preferentemente murino y lo mas preferentemente el MAb 5C3. Asimismo, en determinadas realizaciones, el anticuerpo detectable es un anticuerpo monoclonal biotinilado, el anticuerpo monoclonal es de roedor, mas preferentemente murino o de rata, aun mas preferentemente murino, aun mas preferentemente MAb A4.6.1. En determinadas realizaciones, el reactivo de captura se inmoviliza en este kit.

En determinadas realizaciones, el kit puede contener multiples ELISA para estudios de comparacion para la deteccion de diversas formas de VEGF y VEGF110+ tal como como se describe en el presente documento.

El kit tambien contiene normalmente instrucciones para llevar a cabo el ensayo, y/o VEGF como patron de antigeno (por ejemplo, VEGF purificado, preferentemente VEGF producido de modo recombinante, y VEGF110), asi como otros aditivos tales como estabilizadores, tampones de lavado y de incubacion, y similares.

Los ejemplos de patrones para VEGF son los VEGF humanos recombinantes producidos en celulas de mamifero disponibles de Genentech, Inc., South San Francisco, California, y de aquellas empresas y procedimientos descritos en el presente documento.

Los componentes del kit se proporcionan en proporciones predeterminadas, con las cantidades relativas de los diversos reactivos variados adecuadamente para proporcionar concentraciones en solucion de los reactivos que maximizan substancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes, que en disolucion proporcionaran una solucion de reactivo que tiene la concentracion apropiada para combinar con la muestra a ensayar.

Deposito de Materiales

El siguiente material se ha depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209, Estados Unidos (ATCC):

El hibridoma 5C3.1.1 se deposito en la ATCC con el numero de acceso PTA-7737 depositado el 19 de julio de 2006.

Hibridoma

N ° de Acceso en la ATCC Fecha de deposito

5C3.1.1

PTA-7737 19 de julio de 2006

A4.6.1

HB 10709 29 de marzo de 1991.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El deposito se hizo en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Deposito de Microorganismos con la finalidad del Procedimiento de Patentes y su Reglamento (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del deposito durante 30 anos a partir de la fecha de deposito. Los depositos seran puestos a disposition por la ATCC bajo los terminos del Tratado de Budapest, y seran sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que asegura la disponibilidad al publico, permanente y sin restricciones, de la progenie del cultivo del deposito tras la publication de la patente pertinente de los Estados Unidos o tras abrir al publico de cualquier solicitud de patente de los Estados Unidos o extranjera, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas de los Estados Unidos para tener derecho a este de acuerdo con 35 USC § 122 y las normas de acuerdo con el Comisionado (incluyendo 37 CFR § 1.14 con particular referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en deposito pereciese o se perdiese o se destruyese cuando se cultiva en condiciones adecuadas, los materiales seran reemplazados con prontitud por otros iguales, previa notification. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para el uso practico de la invention contraviniendo los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

Se considera que la memoria descriptiva es suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en practica la invencion. La invencion no debe limitarse en su alcance por la construction depositada, ya que la realization depositada pretende ser unicamente una ilustracion de determinados aspectos de la invencion y cualquier construccion que sea funcionalmente equivalente se encuentra dentro del alcance de la invencion. El deposito de material del presente documento no constituye una admision de que la description escrita sea inadecuada para permitir la puesta en practica de cualquier aspecto de la invencion, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe entenderse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones especificas que representa. De hecho, se haran evidentes para los expertos en la materia varias modificaciones de la invencion ademas de aquellas mostradas y descritas en el presente documento a partir de la descripcion anterior y se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en este documento son para fines unicamente ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Se sabe que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que se expresa como diferentes isoformas debido al corte y empalme alternativo del ARN, juega un papel clave en la angiogenesis tumoral. Se midieron las concentraciones de VEGF165 y de VEGF total y se evaluo la cantidad relativa de VEGF110, que es un fragmento activo generado por digestion con plasmina de VEGF. Un ELISA A (ELISA VEGF165-206) detecta VEGF165 e isoformas mas grandes, pero no VEGF121. ELISA B (VEGF110-206 ELISA) detecta VEGF165 e isoformas, VEGF121 y VEGF110. ELISA C (ELISA VEGF121-206) detecta VeGF 165 e isoformas mas grandes, VEGF121 y fragmentos de VEGF con un peso molecular mayor que el de VEGF110, pero no VEGF110 (denominado como "VEGF110+" en el presente documento).

Materiales y metodos

Reactivos y celulas: Se produjeron en E. coli VEGF165 recombinante (Genentech), VEGF121 (PeproTech, Rocky Hill, Nueva Jersey), VEGF8 -109 (que consiste en los aminoacidos 8-109 de VEGF165) y VEGF121 truncado (R&D Systems, Minneapolis, MN). Segun el fabricante, por espectrometria de masas, el VEGF121 truncado tiene un extremo N intacto, pero tiene una masa de 26 KDa, coherente con el truncamiento de aproximadamente nueve aminoacidos desde el extremo carboxilo. Este migro entre VEGF110 y VEGF121 cuando se analizo por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Se preparo VEGF110 por digestion con plasmina de VEGF165 (Keyt bA, et al,; the carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271: 7788-7795 (1996)). El peso molecular medido por espectrometria de masas era de 25.390, que coincidia con la masa teorica de 25.389. La concentration se determino usando el metodo del acido bicinconinico (Pierce, Rockford, IL). Los pesos moleculares utilizados para calcular la concentracion de VEGF8-109, VEGF121 y VEGF165 fueron de 23,8, 28,9 y 38,2 kDa, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales anti-VEGF A4.6.1, 3.5F8, 2E3 y 5C3 se generaron inmunizando ratones con VEGF165 producido en celulas CHO (Kim KJ, et al.,; The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7: 53-64 (1992)). Se cultivaron lineas celulares de mama SK-BR-3, BT-474, T-47D y MCF-7, asi como lineas celulares de ovario eS-2, OVCAR-3 y SK-OV-3 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) en RPMI, L-glutamina 2 mM y FBS al 10 % (excepto 20 % para OVCAR-3) a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5%.

Punficacion de VEGF en medios acondicionados de celulas A673: se cultivaron celulas A673 (American Type Culture Collection,) en F12/DMEM 50:50, L-glutamina 2 mM y FBS al 5% a una confluencia del 60% y despues en medio aserico (Genentech) hasta la confluencia. El VEGF se purifico de los sobrenadantes utilizando una columna

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

de Sefarosa A4.6.1 que se preparo con Sefarosa activada con CNBr (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). El eluato de la columna y los controles de VEGF recombinante (0,2 |jg por carril) se procesaron en geles de T ris-Glicina al 18 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras y se transfirieron a nitrocelulosa. La transferencia se bloqueo con Tris—HCl 0,5 M, pH 7,5, NaCl 1,5 M, EDTA 50 mM, Triton 100 al 0,5 % que contenia albumina de suero bovino al 3 % y se exploro con 200 ng/ml de 3.5F8 o A4.6.1 seguido de 2 ng/ml de anti-Fc de raton de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch). Las senales se revelaron utilizando SuperSignal West Dura (Pierce) y se registraron en una pelicula de rayos X.

Ensayos ELISA para VEGF para medir concentraciones de VEGF

ELISA A (ELISA VEGF165-206). A menos que se indique lo contrario, se uso un ELISA A fluorimetrico para medir VEGF en las muestras. El ELISA fluorimetrico A uso 3.5F8 para el recubrimiento y A4.6.1 biotinilado seguido de streptavidina-p galactosidasa para la deteccion y 4-metilumbeliferil-p-D galactosido como el sustrato (Rodriguez CR, et al,; A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothedial growth factor 165 in human plasma. J Immunol Methods 219: 45-55 (1998)). Los patrones de VEGF165 fueron 1-128 pg/ml, o 0,026-3,35 pM. El ELISA A colorimetrico uso 3.5F8 para el recubrimiento y A4.6.1 biotinilado para la deteccion, siguiendo el protocolo usado para el ELISA C descrito a continuacion. Los patrones de VEGF165 fueron 1,6-200 pg/ml.

ELISA B (ELISA VEGF110-206) (denominado anteriormente ELISA VEGF121-206, Konecny GE, et al,; Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10: 1706-1716 (2004)): Se recubrieron placas de micropocillos de 96 pocillos MaxiSorp con 0,5 jg/ml de anticuerpo A4.6.1 en tampon carbonato 50 mM, pH 9,6 a 100 jl/pocillo a 4°C durante toda la noche. Despues de esta etapa y entre las siguientes etapas de incubacion a temperatura ambiente las placas se lavaron con PBS, pH 7,4, que contenia polisorbato 2 al 0,05%. Las placas se bloquearon con albumina de suero bovino al 0,5%, Proclin™300 10 ppm (Supelco, Bellefonte, PA) en PBS (150 jl/pocillo) durante 1 h. Los patrones de VEGF (VEGF165 1,56-200 pg/ml o vEgf 0,0409-5,24 pM en dilucion en serie de factor dos) y las muestras diluidas en serie (dilucion minima 1:10) en PBS, en dilucion en serie de factor dos o tres, pH 7,4, que contiene albumina de suero bovino al 0,5%, polisorbato 20 al 0,05%, EDTA 5 mM, CHAPS al 0,25%, Y-globulinas bovinas al 0,2% (Sigma, St. Louis, MO) y NaCl 0,35 M (tampon de muestra) se anadieron a las placas (100 jl/pocillo) y se incubaron durante 2 h. El VEGF unido se detecto en las placas por incubacion con 2E3 biotinilado (u otro anticuerpo que se une al dominio de union al receptor de VEGF) durante 1 h seguido de estreptavidina-HRP (Amersham, Copenhague, Dinamarca) durante 30 min, biotinil-tiramida (ELAST ELISA amplification System, Perkin Elmer Life Sciences Inc., MA) durante 15 min y estreptavidina-HRP durante 30 min. Se anadio el sustrato TMB (3,3', 5,5'-tetrametil benzidina) (Kirkegaard & Perry Laboratories) y la reaccion se detuvo anadiendo acido fosforico 1 M. Se leyo la absorbancia a 450 nm en un lector apilador Titertek (ICN, Costa Mesa, CA). Las curvas de titulacion se ajustaron usando un programa de regresion de cuatro parametros de ajuste de curvas (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Los puntos de datos que se encontraban en el intervalo de la curva patron se usaron para calcular las supuestas concentraciones de VEGF en las muestras. La recuperacion de VEGF165 1,56 -200 pg/ml en plasma humano-EDTA al 10% (Golden West Biologicals Inc., Temecula, CA) fue de 92-120 % despues restar el supuesto VEGF endogeno 2,1 pg/ml en el plasma al 10 % usado en este estudio.

ELISA C (VEGF121-206 ELISA): Se recubrieron placas de micropocillos con 1 jg/ml de anticuerpo anti-VEGF 5C3 y se bloquearon como se ha descrito anteriormente. Se anadieron a las placas patrones de VEGF (VEGF165 4,00-512 pg/ml o VEGF 0,105-13,4 pM en una dilucion en serie de factor 2) y las muestras diluidas en serie en tampon de muestra. Se incubaron las placas durante 2 horas. El VEGF unido se detecto anadiendo A4.6.1 biotinilado seguido de estreptavidina-HRP y TMB como sustrato. Las placas se leyeron y los datos se analizaron como se ha descrito anteriormente: La recuperacion de VEGF165 4,00-512 pg/ml en plasma al 10 % fue de 77-101 % despues de restar el supuesto VEGF endogeno 1,6 pg/ml en el plasma al 10 % usado en este estudio.

Resultados y analisis

Ensayos ELISA para VEGF: El ELISA A anteriormente descrito, usa 3.5F8 para el recubrimiento y A4.6.1 biotinilado para la deteccion (Rodriguez CR, et al.,; A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factor165 in human plasma. J Immunol Methods 219: 45-55, 1998). Detecta VEGF165 (VEGF165) pero no VEGF121(1) (VEGFi2i(1)), que es de R&D systems y carece de aproximadamente 9 aminoacidos del extremo carboxi, y VEGF121(2) (VEGFi2i(2)), que es de PeproTech (Fig. 1A). El 3.5F8 se une a VEGF165 pero no a VEGF121 de BIAcore. El A4.6.1 se une al dominio de union al receptor (Kim KJ, et al.,; The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7: 53-64, 1992) que esta presente en todas las isoformas y en VEGF110. El 3.5F8 se une probablemente cerca de los aminoacidos 116 y 118, que no estan presentes en VEGF121. El 5C3 se une probablemente cerca de los aminoacidos 111-113, que no estan presentes en VEGF110 (Fig 3). El ELISA A puede detectar probablemente isoformas de VEGF que contenian secuencias de VEGF165 que incluyen VEGF183, VEGF189 y VEGF206 (vease, por ejemplo, Stimpfl M, et al.,; Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259, 2002). El ELISA B (denominado anteriormente) VEGF121-206 ELISA, Konecny GE, et al., Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10: 1706-1716,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

2004) usa A4.6.1 para el recubrimiento y 2E3 biotinilado para la detection. A4.6.1 y 2E3 se unen al dominio de union al receptor que esta presente en las tres moleculas. Veanse, por ejemplo, Kim Kj, et al. The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7:53-64 (1992); y, Muller YA, et al. Vascular endothelial growth factor: Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site. Proc Natl Acad Sci USA 94:7192-7197 (1997). Tambien se pueden utilizar otros anticuerpos que se unen a esas regiones. Este ELISA detecta VEGF165, VEGF121, VEGF121 truncado (que carece de aproximadamente 9 aminoacidos del extremo carboxi), VEGF110 y VEGF8-109 igualmente bien (Fig. 1B). Este ELISA puede detectar VEGF total, incluyendo fragmentos mas grandes de VEGF110 generados por digestion con metaloproteinasas de la matriz. El ELISA C, descrito en el presente documento, que usa 5C3 para el recubrimiento y A4.6.1 biotinilado para la deteccion, detecta VEGF165, VEGF121, y VEGF121 truncado igualmente bien pero no detecta VEGF110 o VEGF8-109 (Fig. 1, C). El 5C3 se une a VEGF121 pero no a VEGF8-109 de BIAcore. Este ELISA puede detectar todas las moleculas de VEGF detectadas por el VEGF110-206 excepto VEGF110 y fragmentos mas pequenos.

Las sensibilidades de ELISA A, ELISA B y ELISA C fueron 10, 16 y 40 pg/ml de VEGF165 (o 0,26, 0,41 y 1,05 pM para diferentes isoformas y fragmentos de VEGF) para VEGF en muestras usando una dilution minima de 1:10, respectivamente. El ELISA B y el ELISA C fueron reproducibles (Tablas 1 y 2). El ELISA B y el ELISA C fueron especificos para VEGF (VEGF-A). VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D a concentraciones de hasta 50 ng/ml unicamente dieron senales de fondo. El factor de crecimiento insulinico 1, la hormona del crecimiento, el factor de crecimiento nervioso recombinante, el factor de necrosis tumoral (Genentech), el factor de crecimiento derivado de plaquetas AB, el factor de crecimiento placentario, el factor de crecimiento transformante p1 (R&D Systems) (hasta 200 ng/ml) solamente dieron senales de fondo. La heparina (Leo Laboratories, Bucks, RU y Dublin, Irlanda) (hasta 100 U/ml) no tuvo ningun efecto significativo sobre el ensayo.

Tabla 1. ELISA B (ELISA VEGF110-206): El intervalo patron fue de 1,56-200 pg/ml para VEGF165 (VEGF 0,0409-5,24 pM) en tampon. La proportion de la DO del patron de 1,56 pg/ml en relation con el blanco

fue de 1,37 + 0,11. CV es el coeficiente de variation.__________________________________________

Control3__________________Media (pg/ml)____________Inter %CV_____________Intra %CV______

Bajo

3,07 17,7 13,5

Medio

38,0 9,50 6,54

Alto

127 9,11 6,95

aLos controles medio y alto se realizaron anadiendo VEGF165 recombinante a plasma humano EDTA. El control bajo se realizo anadiendo VEGF165 a plasma al 70 % ya que el plasma contenia VEGF endogeno. Los controles se diluyeron a 1:10 y se ensayaron por duplicado en 34 ensayos independientes._______________________________________________________________________

Tabla 2. ELISA C (VEGF121-206 ELISA). El intervalo patron fue de 4,00-512 pg/ml para VEGF165 (VEGF 0,105-13,4 pM). La proporcion de la DO del patron de 4 pg/ml en relacion con el blanco fue de _______2,72 + 0,37. CV es el coeficiente de variacion._______________________________________

Control3

Media (pg/ml) Inter %CV Intra %CV

Bajo

3,28 20,6 8,35

Medio

11,7 6,56 2,39

Alto

56,5 2,57 1,37

3 Los controles se realizaron anadiendo VEGF165 recombinante a plasma humano EDTA. Los controles se diluyeron a 1:10 y se ensayaron por duplicado en 15 ensayos independientes.___________________

VEGF en medios acondicionados de lmeas celulares: Se midieron medios acondicionados de seis clones de CHO estables transfectados con ADNc de VEGF165 (Meng et al., 2000) con los tres ELISA, en los que como patron se uso VEGF no glicosilado producido en E. coli. El VEGF165 recombinante glicosilado en medios acondicionados de seis clones de CHO estables produjo concentraciones muy similares en los tres ensayos ELISA. Las concentraciones medidas por ELISA B fueron 28, 63, 64, 43, 3,8 y 3,2 nM, respectivamente. Las relaciones de las concentraciones de VEGF medidas por ELISA A y ELISA C en comparacion con las de ELISA B fueron 0,90 + 0,08 y 1,08 + 0,10, respectivamente. Por lo tanto, los tres ensayos ELISA cuantificaron VEGF glicosilado igualmente bien y hubo poca proteolisis de VEGF165 en las condiciones de cultivo.

Las concentraciones de VEGF en medio acondicionado de celulas A673 medidas por ELISA A, B ELISA y ELISA C fueron 0,15, 0,29 y 0,24 nM de VEGF, respectivamente. La concentration medida por el ELISA A fue menor, lo que indica que el VEGF121 estaba presente. Cuando el VEGF se purifico del medio acondicionado utilizando una columna de afinidad para A4.6.1 y se analizo por transferencia de proteinas, se detectaron dos bandas, probablemente de VEGF165 glicosilado y no glicosilado, mediante 3.5F8. La banda inferior tenia la misma movilidad que el VEGF165 purificado producido en E. coli (Fig. 2, izquierda). El tratamiento con N-glicanasa convirtio la banda superior en la banda inferior. Se detectaron por A4.6.1 dos bandas adicionales de peso molecular inferior, probablemente de VEGF121 glicosilado (que se superponen parcialmente con la banda del supuesto VEGF165 no glicosilado) y no glicosilado (figura 2, derecha). La banda inferior tenia la misma movilidad que la del VEGF121 purificado producido en E. coliy el tratamiento con N-glicanasa convirtio la banda superior en la banda inferior.

Las concentraciones de VEGF en medios acondicionados de lineas de celulas de mama SK-BR-3, BT-474, T-47D y MCF-7 medidas por el ELISA B fueron 3,6, 16, 13, y 13 pM, respectivamente. Las relaciones de las concentraciones de VEGF medidas por el ELISA de A y las medidas por el ELISA B fueron 0,49, 0,42, 0,43 y 0,38 (o 49, 42 %, 43 % o 38 %), respectivamente, de acuerdo con 43, 35, 40 y 41 % de expresion de VEGF165 en estas lineas celulares 5 respectivas (Stimpfl M, et al.: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast

and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8: 2253-2259, 2002). Las relaciones de las concentraciones de VEGF medidas por el ELISA C con respecto a las medidas por el ELISA B fueron 1,1-1,2 en estas lineas celulares, lo que indica que habia poco VEGF110. Las concentraciones de VEGF en medios acondicionados de lineas celulares de ovario Es-2, OVCAR-3 y SK-OV-3 medidas por el ELISA B fueron 32, 11 y 20 pM, respectivamente. Las relaciones 10 de las concentraciones de VEGF medidas por el ELISA A con respecto a las medidas por el ELISA B fueron 0,24,

0,20, y 0,32 (o 24 %, 20 % y 32 %), respectivamente, en comparacion con 38, 42 y 24 % de expresion de VEGF165 en estas lineas celulares respectivas (Stimpfl et al, citado anteriormente). Las relaciones de las concentraciones de VEGF medidas por el ELISA C con respecto a las medidas por el ELISA B fueron 0,64-0,79 para estas lineas celulares, lo que indica que puede haber VEGF110 (o fragmentos mas pequenos).

15

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un kit de anticuerpo-ELISA sandwich capaz de detectar de manera selectiva isoformas de VEGF y fragmentos de VEGF mayores de 110 aminoacidos desde el extremo N-terminal, incluyendo las isoformas VEGF121 y VEGF165, pero no VEGF110, en donde el kit comprende:

   (a) un reactivo de captura que comprende un anticuerpo monoclonal contra VEGF humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de detectar especificamente isoformas de VEGF y fragmentos de VEGF mayores de 110 aminoacidos desde el extremo N-terminal, incluyendo VEGF121 y VEGF165, pero no VEGF110; y

   (b) reactivos de detection que comprenden un anticuerpo detectable, en donde el anticuerpo detectable es MAb A4.6.1, obtenible a partir del hibridoma A4.6.1 depositado en la ATCC con el numero de referencia HB10709.
2. 2. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el reactivo de captura es capaz de reconocer las formas de 121, 145, 165, 183, 189 y 206 aminoacidos de VEGF humano.
3. 3. El kit de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que ademas comprende un soporte solido para el reactivo de captura.
4. 4. El kit de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde el soporte solido se proporciona en forma de un elemento separado del kit.
5. 5. El kit de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde el reactivo de captura ya esta inmovilizado en el soporte.
6. 6. El kit de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el reactivo de captura se encuentra recubierto sobre una placa de microtitulacion.
7. 7. El kit de cualquier reivindicacion anterior, que ademas comprende un medio de deteccion para los anticuerpos detectables.
8. 8. El kit de la reivindicacion 7, en donde el medio de deteccion es colorimetrico.
9. 9. El kit de cualquier reivindicacion anterior, que ademas comprende VEGGF purificado como patron de antigeno.
10. 10. El kit de cualquier reivindicacion anterior, en donde el anticuerpo de captura es MAb 5C3, que puede obtenerse a partir del hibridoma 5C3.1.1 depositado en la ATCC con el numero de referencia PTA-7737.