DE60025526T2

DE60025526T2 - Elisa für vegf

Info

Publication number: DE60025526T2
Application number: DE60025526T
Authority: DE
Inventors: Tai David Belmont FEI; K. Kristen San Mateo TOMITA
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: US20070202558A1; CA2387390C; EP1230552B1; JP4620312B2; US7541160B2; AU774575B2; IL149171A0; AU774575C; WO2001036972A3; US6855508B2; ZA200202942B; KR100749982B1; CA2387390A1; US20030044865A1; JP2003515136A; CN1420987A; NZ518363A; CN100399030C; KR20020070434A; IL149171A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Immuntests zur Detektion von VEGF, die als diagnostische und prognostische Verfahren für Patienten mit Krebs, Herzgefäßerkrankungen oder anderen Krankheitsbildern verwendet werden können.
Beschreibung des Standes der Technik
Es ist mittlerweile durchwegs anerkannt, dass Angiogenese in die Pathogenese zahlreicher verschiedener Störungen eingebunden ist. Diese umfassen feste Tumoren, intraokulare neovaskuläre Syndrome wie proliferative Retinopathien oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD), rheumatoide Arthritis und Psoriasis (Folkman et al., J. Biol. Chem. 267, 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53, 217-239 (1991); und A. Garner, Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach, A. Garner, G.K. Klintworth (Hrsg.), 2. Auflage, Marcel Dekker, NY, 1625-1710 (1994)). Im Fall von festen Tumoren ermöglicht die Neovaskularisation den Tumorzellen, im Vergleich zu den normalen Zellen einen Wachstumsvorteil und proliferative Autonomie zu erlangen. Folglich wurde eine Korrelation zwischen der Dichte von Mikrogefäßen in Tumorschnitten und dem Patientenüberleben im Fall von Brustkrebs sowie bei mehreren anderen Tumoren beobachtet (Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324, 1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340, 1120-1124 (1992); und Macchiarini et al., Lancet 340, 145-146 (1992)).
Die Suche nach positiven Regulatoren von Angiogenese ergab zahlreiche Kandidaten, einschließlich aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, Angiogenin, IL-8 usw. (Folkman et al., s.o., und Klagsbrun et al., s.o.). Die bis heute identifizierten negativen Regulatoren umfassen Thrombospondin (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6624-6628 (1990)), das N-terminale 16-kDa-Fragment von Prolactin (Clapp et al., Endocrinology 133, 1292-1299 (1993)), Angiostatin (O'Reilly et al., Cell 79, 315-328 (1994)) und Endostatin (O'Reilly et al., Cell 88, 277-285 (1996)).
Die Arbeit, die im Laufe der letzten Jahre durchgeführt wurde, führte zur Definition der zentralen Rolle von Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) bei der Regulierung normaler und anormaler Angiogenese (Ferrara et al., Endocr. Rev. 18, 4-25 (1997)). Die Erkenntnis, dass der Verlust eines einzelnen VEGF-Allels zu embryonaler Letalität führt, weist auf eine unersetzliche Rolle hin, die dieser Faktor in der Entwicklung und Differenzierung des vaskulären Systems spielt (Ferrara et al., s.o.).
Weiters wurde gezeigt, dass VEGF ein zentraler Mediator von Neovaskularisation in Verbindung mit Tumoren und intraokularen Störungen ist (Ferrara et al., s.o.). Die VEGF-mRNA wird von einem Großteil der untersuchten menschlichen Tumoren überexprimiert (Beckman et al., J. Clin. Invest. 91, 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26, 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53, 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer. 73, 931-934 (1996); und Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146, 1029-1039 (1995)). Auch die Konzentration von VEGF in Augenflüssigkeiten korreliert sehr stark mit der Gegenwart aktiver Proliferation von Blutgefäßen bei Patienten mit Diabetes und anderen, mit Ischämie verbundenen Retinopathien (Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331, 1480-1487 (1994)). Weiters demonstrierten Studien die Lokalisierung von VEGF in chorioidal-neovaskulären Membranen bei Patienten, die unter akuter Makuladegeneration (AMD) litten (Lopez et al., Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37, 855-868 (1996)).
VEGF ist ein Heparin-bindender Wachstumsfaktor mit einem Molekulargewicht von 45 kD (Plouet et al., EMBO J. 8, 3801 (1989); Neufeld et al., Prog. Growth Factor Res. 5, 89 (1994)). Er ist ein dimeres Glykoprotein, das aus zwei identischen Untereinheiten besteht. Obwohl für VEGF ein einzelnes Gen kodiert, bestehen aufgrund alternativen mRNA-Spleißens mindestens fünf Isoformen in vivo. Diese Isoformen, VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 und VEGF206 enthalten 121, 145, 165, 189 bzw. 206 Aminosäuren (Leung et al., Science 246, 1306 (1989); Houck et al., Mol. Endocrinol. 5, 1806 (1991); Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947 (1991); Neufeld et al., The FASEB Journal 13, 9-22 (1999)). Die VEGF-Isoformen zeigen verschiedene Affinitäten zu Heparin; VEGF121 bindet Heparin schwach, während VEGF165, VEGF189 und VEGF206 Heparin mit steigender Affinität binden. VEGF 121 und VEGF165 werden sekretiert, und beide Isoformen sind im Blutkreislauf zu finden. Dahingegen werden VEGF189 und VEGF206 am häufigsten in Assoziation mit Heparinsulfat gefunden, das Proteoglykane in der extrazellulären Matrix enthält (Houck et al., J. Biol. Chem. 267, 26031 (1992); Park et al., Mol. Biol. Cell 4, 1317 (1993)). Von diesen fünf Isoformen ist VEGF165 jene, die in der Mehrheit der Zellen und Gewebe am reichlichsten exprimiert wird.
Fünf Rezeptoren für VEGF wurden identifiziert: VEGFR-1 (FLT-1), VEGFR-2 (KDR/FLK-1) und VEGFR-3, die alle signalgebende Tyrosinkinasen sind, und Neuropilin-1 und Neuropilin-2, die beide Isoform-spezifische Hilfs-Rezeptoren sind, die sich selektiv an VEGF165 binden (de Vries et al., Science 255, 989 (1992); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1579 (1992); Millauer et al., Cell 72, 835 (1993); Neufeld et al., s.o.). Intensive Forschungsarbeiten werden von verschiedenen Teams bezüglich der diversen Rollen dieser Rezeptoren in der VEGF-Biologie betrieben.
VEGF wird von Geweben produziert und muss nicht in den Blutkreislauf eintreten, um seine biologische Wirkung auszuüben, wirkt jedoch eher lokal als ein parakriner Regulator. Dies wirft die Frage der Bedeutung von zirkulierendem VEGF auf sowie die Frage, welche Rolle er im Rahmen der normalen Biologie und der Pathologie spielt. Eine erst jüngst durchgeführte Studie von Yang et al., J. Pharm. Exp. Ther. 284, 103 (1998), zeigte auf, dass die Clearance von rhVEGF165 aus dem Blutkreislauf sehr rasch erfolgt, was darauf schließen lässt, dass endogener VEGF im Blutkreislauf höchst wahrscheinlich das Resultat von kontinuierlicher Synthese von VEGF ist. Weiters wurde in mehreren Studien versucht, Konzentrationen von VEGF im Blutkreislauf mit Tumorbelastung in Verbindung zu bringen, und es wurde vorgeschlagen, VEGF-Konzentrationen als einen potenziellen prognostischen Marker zu verwenden (Ferrari & Scagliotti, Eur. J. Cancer 32A, 2368 (1996); Gasparini et al., J. Natl. Cancer Inst. 89, 139 (1997); Kohn, Cancer 80, 2219 (1997); Baccala et al., Urology 51, 327 (1998); Fujisaki et al., Am. J. Gastroenterol. 93, 249 (1998)). Eindeutig wird die Fähigkeit, VEGF exakt zu bemessen, wichtig sein, um seine mögliche(n) Rolle(n) in zahlreichen biologischen Prozessen wie beispielsweise Aufrechterhaltung vaskulärer Durchgängigkeit, Menstruationszyklus, Ischämie, Diabetes und Krebs zu verstehen.
In der Literatur wird ausführlich über variierende Konzentrationen von endogenem VEGF in normalen und erkrankten Patienten, von nicht nachweisbaren bis zu hohen Konzentrationen, berichtet. Es wurde berichtet, dass VEGF 165/165 proteolytisch in drei andere Formen gespalten werden kann: in ein 165/110-Heterodimer, ein 110/110-Homodimer und ein C-terminales 55-Aminosäure-Fragment (Keyt et al., J. Biol. Chem. 271, 7788-7795 (1996); Keck et al., Arch. Biochem. Biophys. 344, 103-113 (1997)).
Die Fähigkeit, endogene VEGF-Konzentrationen zu messen, hängt von der Verfügbarkeit empfindlicher und spezifischer Tests ab. Von auf kolorimetrischer Analyse, Chemolumineszenz und Fluorimetrie basierenden enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmungen (ELISAs) für VEGF wurde bereits berichtet. Houck et al. (1992), s.o., Yeo et al., Clin. Chem. 38, 71 (1992); Kondo et al., Biochem. Biophys. Acta 1221, 211 (1994); Baker et al., Obstet. Gynecol. 86, 815 (1995); Hanatani et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1958 (1995); Leith & Michelson, Cell Prolif. 28, 415 (1995); Shifren et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81, 3112 (1996); Takano et al., Cancer Res. 56, 2185 (1996); Toi et al., Cancer 77, 1101 (1996); Brekken et al., Cancer Res. 58, 1952 (1998); Obermair et al., Br. J. Cancer 77, 1870-1874 (1998); Webb et al., Clin. Sci. 94, 395-404 (1998). Ähnliche ELISAs wurden erfolgreich zur Bestimmung geringer Mengen an Wirkstoffen und anderen antigenen Komponenten in Plasma- und Urinproben eingesetzt, binden keine Extraktionsschritte ein und sind einfach durchzuführen.
Houck et al. (1992), s.o., beschreiben eine kolorimetrische ELISA, die über eine ng/ml-Empfindlichkeit zu verfügen scheint, was nicht ausreichend empfindlich ist, um endogene VEGF-Konzentrationen nachzuweisen. Yeo et al. (1992), s.o., beschreiben einen zeitaufgelösten immunfluorimetrischen Zwei-Stellen-Test, es wurde jedoch kein VEGF in normalen Seren nachgewiesen (Yeo et al., Cancer Res. 53, 2912 (1993)). Baker et al. (1995), s.o., erzielte unter Verwendung einer modifizierten Ver sion dieses immunfluorimetrischen Tests nachweisbare Konzentrationen von VEGF in Plasma aus schwangeren Frauen, wobei höhere Konzentrationen bei Frauen mit Präeklampsie beobachtet wurden. Ähnliche Daten für schwangere Frauen wurden von Anthony et al., Ann. Clin. Biochem. 34, 276 (1997), unter Verwendung eines Radioimmuntests erfasst. Hanatani et al. (1995), s.o., entwickelten eine chemolumineszierende ELISA, die in der Lage ist, zirkulierenden VEGF zu messen, und berichten von VEGF-Konzentrationen in Seren von 30 normalen Probanden (männlich und weiblich) von 8-36 pg/ml. Brekken et al. (1998), s.o., beschrieben ELISA-Tests unter Verwendung von Antikörpern mit Bindungspräferenz entweder zu VEGF alleine oder zum VEGF:Flk-1-Komplex.
Ein ELISA-Set für VEGF-Detektion ist im Handel bei R&D Systems (Abingdon, UK) erhältlich. Das VEGF-ELISA-Set von R&D wurde in Sandwich-Tests verwendet, worin ein monoklonaler Antikörper verwendet wird, um das Target-VEGF-Antigen einzufangen, und ein polyklonaler Antikörper verwendet wird, um den VEGF nachzuweisen. Webb et al. (1998), s.o.. Es ist nicht eindeutig, ob die Detektionsresultate unter Verwendung des R&D-ELISA-Sets durch die Gegenwart von proteolytischen Prozessen oder Abbau von VEGF oder durch Störung durch andere Serumproteine beeinflusst sind. Obermair et al. (1998), s.o.
Keyt et al., J. Biol. Chem. 271, 7788-7795 (1996); Keyt et al., J. Biol. Chem. 271, 5638 (1996); und Shifren et al. (1996), s.o., entwickelten ebenfalls eine kolorimetrische ELISA basierend auf einem dualen monoklonalen Antikörperpaar. Obwohl diese ELISA in der Lage war, erhöhte VEGF-Konzentrationen in Krebspatienten nachzuweisen, fehlte ihr die Empfindlichkeit, die erforderlich ist, um endogene Konzentrationen von VEGF in normalen Probanden zu messen. Rodriguez et al., J. Immunol. Methods 219, 45 (1998), beschrieben eine fluorimetrische Zwei-Stellen-VEGF-ELISA, die eine Empfindlichkeit von 10 pg/ml VEGF in reinem Plasma oder Serum ergab. Dieser fluorimetrische Test kann jedoch nur vollständig intakte 165/165- und 165/110-Spezies von VEGF nachweisen.
Somit besteht Bedarf an der Entwicklung eines diagnostischen und prognostischen Tests, der höhere messbare Konzentrationen von VEGF in einer biologischen Probe eines Tiermodells oder eines Patienten nachweist als bestehende ELISAs und der alle Isoformen von VEGF messen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Vielfach-Stellen-Antikörper-Sandwich-ELISA-Verfahren und Sets für VEGF als Antigen wurden entwickelt, um VEGF in biologischen Proben nachzuweisen, und wurden als ein diagnostischer/prognostischer Index verwendet. Verglichen mit den zur Zeit verwendeten VEGF-ELISAs verfügt der vorliegende Test über hohe Empfindlichkeit und ist in der Lage, die meisten der Isoformen von endogenem VEGF im Blutkreislauf nachzuweisen.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion von VEGF in einer biologischen Probe, vorzugsweise von Gefäß-, Diabetes- oder Krebspatienten, bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kontaktieren und Inkubieren der biologischen Probe mit vorgemischten Einfangreagenzien, immobilisiert an einem festen Träger, wobei die Einfangreagenzien polyklonale und monoklonale Antikörper gegen menschlichen VEGF sind, worin sich der monoklonale Antikörper spezifisch an den C-Terminus (Reste 111-165) von menschlichem VEGF bindet;
(b) Trennen der biologischen Probe von den immobilisierten Einfangreagenzien;
(c) Kontaktieren der immobilisierten Einfangreagenzien mit einem nachweisbaren Antikörper, der sich an die KDR- und FLT1-Rezeptorbindungsdomänen von VEGF bindet; und
(d) Messen der Konzentration von an die Einfangreagenzien gebundenem VEGF unter Verwendung eines Detektionsmittels für den nachweisbaren Antikörper.

Vorzugsweise werden die Einfangreagenzien in einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,8:1 bis 1,2:1 von monoklonalem Antikörper zu polyklonalem Antikörper immobilisiert. Noch bevorzugter beläuft sich das Gewichtverhältnis auf etwa 1:1 von monoklonalem zu polyklonalem Antikörper.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Immuntest-Set zur Detektion von VEGF in einer biologischen Probe bereit, worin das Set Folgendes umfasst:

(a) als Einfangreagenzien polyklonale und monoklonale Antikörper gegen menschlichen VEGF, vorgemischt in einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,8:1 bis 1,2:1 von monoklonalem zu polyklonalem Antikörper, worin sich der monoklonale Antikörper spezifisch an den C-Terminus (Reste 111-165) von menschlichem VEGF bindet; und
(b) als Detektionsreagens einen nachweisbaren Antikörper, der sich an die KDR- und FLT1-Rezeptorbindungsdomänen von VEGF bindet.

Der Test hierin ist darin einzigartig, dass er ein Gemisch aus polyklonalem und monoklonalem Antikörper als die Einfangreagenzien verwendet und dass sich der monoklonale Einfang-Antikörper an den C-terminalen Abschnitt von VEGF bindet. Die meisten der davor offenbarten VEGF-ELISAs basieren entweder auf einem dualen monoklonalen Antikörperpaar für Einfang/Detektion oder auf einem monoklonalen Antikörper als Einfangreagens und einem polyklonalen Antikörper zur Detektion. Wird ein polyklonaler Antikörper alleine als der Einfang-Antikörper verwendet, so geht die gesamte Empfindlichkeit des Tests verloren. Die Fähigkeit des monoklonalen Einfang-Antikörpers, den VEGF-C-Terminus zu binden, stellt sicher, dass alle endogenen VEGF-Moleküle, einschließlich 165/165, 165/110 und 110/110, mittels des hierin beschriebenen Tests nachgewiesen werden können. Weiters bindet sich der Detektions-Antikörper der Erfindung an die biologisch aktiven Regionen von VEGF, d.h. die Bindungsdomänen für die KDR- und FLT1-Rezeptoren von VEGF, was sicherstellt, dass die nachgewiesenen VEGF-Moleküle beispielsweise von löslichen VEGF-Rezeptoren im Blutkreislauf nicht blockiert werden. Als solcher stellt der hierin beschriebene Test eine exaktere Messung von zirkulierenden VEGF-Molekülen, die sehr wahrscheinlich biologisch aktiv sind, bereit.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt einen Vergleich von zwei verschiedenen Herstellungen von affinitätsgereinigtem, polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen rhVEGF, wobei die Quadrate den bevorzugten Antikörper und die Kreise denselben Antikörper aus einer anderen Blutabnahme bezeichnen.
2 zeigt einen Vergleich von ELISAs der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer Guanidin-Elution gegenüber einer Glycin-Elution des affinitätsgereinigten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen VEGF.
3 zeigt einen Vergleich von typischen Standardkurven für drei verschiedene VEGF-ELISAs und mögliche Hakenwirkung von diesen ELISAs, worin die Kreise für den Ein-Stellen-Test mit MAb 3.5F8 alleine als Beschichtungs- und Detektionsmittel stehen, die Quadrate für den Zwei-Stellen-Test mit MAb 3.5F8 als Beschichtungs- und MAb A4.6.1 als Detektionsmittel stehen und die Rauten für den Vielfach-Stellen-Test der vorliegenden Erfindung mit MAb 3.5F8 und einem affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper als Beschichtungs- und MAb A4.6.1 als Detektionsmittel stehen.
4 zeigt Beschichtungsmaximierung von monoklonalem Antikörper MAb 3.5F8, worin die ELISA 0,4 (Kreise), 1 (Quadrate), 2 (Rauten) oder 4 (Dreiecke) μg/ml monoklonalen Antikörper und 1 μg/ml affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper verwendet.
5 zeigt Beschichtungsmaximierung von polyklonalem Kaninchen-Antikörper, worin die ELISA 0 (Kreise), 0,1 (Quadrate), 0,4 (Rauten), 1 (Dreiecke), 2 (umgekehrte Dreiecke mit gepunkteten Linien) oder 4 (umgekehrte Dreiecke mit durchgehen den Linien) μg/ml affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörper und 0,4 μg/ml MAb 3.5F8 verwendet.
6 zeigt die Wirkung von pH auf die Vielfach-Stellen-VEGF-ELISA, worin die Kreise für die ELISA bei pH 4, die Quadrate bei pH 5, die Rauten bei pH 6, die Dreiecke bei pH 7, die Halblinien-Rauten bei pH 8 und die umgekehrten Dreiecke bei pH 9 stehen.
7 zeigt eine Verdünnungslinearität von sechs normalen menschlichen EDTA-Plasmaproben, gespickt mit rhVEGF, in der Vielfach-Stellen-VEGF-ELISA.
Die 8A-8C zeigen Linearität von normalen Ratten-EDTA-Plasmaproben, gespickt mit rhVEGF, worin 8A eine stark gespickte Probe, 8B eine mittelmäßig gespickte Probe und 8C eine gering gespickte Probe zeigt und worin die Kreise für den Ratten-Pool 1, die Quadrate für den Ratten-Pool 2 und die Rauten für Ratte 1 stehen.
Die 9A-9B zeigen Linearität von EDTA-Plasmaproben aus jeweils vier weiblichen und vier männlichen Yorkshire-Schweinen, gespickt mit rhVEGF.
Die 10A-10C zeigen die Spezifität von drei verschiedenen ELISA-Tests für VEGF-Formen 165/165 (Kreise), 165/110 (Quadrate), 121/121 (Rauten) und 110/110 (Dreiecke). 10A zeigt die Spezifität der Ein-Stellen-ELISA unter Verwendung von MAb 3.5F8 als Beschichtungs- und Detektions-Antikörper, 10B zeigt die Spezifität des fluorimetrischen Zwei-Stellen-VEGF-ELISA-Tests unter Verwendung von MAb 3.5F8 als Beschichtungs- und MAb A4.6.1 als Detektions-Antikörper, und 10C zeigt die Spezifität der Vielfach-Stellen-VEGF-ELISA der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von MAb 3.5F8 und PAb als Beschichtungs-Antikörper und MAb A4.6.1 als Detektions-Antikörper.
Die 11A und 11B zeigen jeweils VEGF aus normalem menschlichem Plasma und Serum, nachgewiesen durch eine Zwei-Stellen-ELISA unter Verwendung von MAb 3.5F8 alleine als Beschichtungsreagens und durch die Vielfach-Stellen-ELISA der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von sowohl dem PAb als auch dem MAb 3.5F8 als Beschichtungsreagenzien.
12 zeigt die Mengen von Plasma-VEGF in Herzpatienten unter Verwendung aller drei in der Legende von 10 beschriebenen Tests, worin die Kreise für den Ein-Stellen-Test, die Quadrate für den Zwei-Stellen-Test und die Dreiecke für den Vielfach-Stellen-Test stehen.
13 zeigt Plasma-VEGF-Konzentrationen in normalen Spendern und Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen unter Verwendung des Zwei-Stellen-Tests mit MAb 3.5F8 als Beschichtungs- und MAb A4.6.1 als Detektions-Antikörper oder des Vielfach-Stellen-Tests der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von MAb 3.5F8 und affinitätsgereinigtem polyklonalem Antikörper als Beschichtungs- und MAb A4.6.1 als Detektions-Antikörper, worin N für die Anzahl der Patienten steht.
14 zeigt Serum-VEGF aus Lungenkrebspatienten, nachgewiesen durch eine Zwei-Stellen-ELISA unter Verwendung von MAb 3.5F8 alleine als Beschichtungsreagens und durch die Vielfach-Stellen-ELISA der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von sowohl PAb als auch MAb 3.5F8 als Beschichtungsreagenzien.
15 zeigt Serum-VEGF-Konzentrationen in normalen Spendern und Diabetes-Patienten (nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM) und insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM)) unter Verwendung der Zwei-Stellen-ELISA mit MAb 3.5F8 als Beschichtungs- und MAb A4.6.1 als Detektions-Antikörper.
Die 16A und 16B zeigen Diagramme, in denen ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper gegen DNase und ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper gegen VEGF als eines der Beschichtungsreagenzien im Vielfach-Stellen-Test der vorliegenden Erfindung mit dem Zwei-Stellen-Test unter Verwendung von MAb 3.5F8 als Beschichtungsreagens für menschliches Plasma verglichen werden. 16A zeigt die Korrelation von Plasma-VEGF, gemessen durch die Zwei-Stellen-ELISA un ter Verwendung von MAb 3.5F8 als das Beschichtungsreagens (x-Achse), mit Plasma-VEGF, gemessen durch einen Vielfach-Stellen-Test mit MAb 3.5F8 und einem polyklonalen Antikörper gegen DNase als die Beschichtungsreagenzien (volle Kreise), und mit Plasma-VEGF, gemessen durch einen Vielfach-Stellen-Test, wie hierin beschrieben, unter Verwendung von MAb 3.5F8 und dem PAb gegen VEGF als die Beschichtungsreagenzien (leere Kreise). 16B zeigt die Standardkurven der Zwei-Stellen-ELISA (volle Kreise), der Vielfach-Stellen-ELISA mit MAb 3.5F8 und einem polyklonalen Antikörper gegen DNase als die Beschichtungsreagenzien (volle Rauten) und einer Vielfach-Stellen-ELISA, wie hierin beschrieben, unter Verwendung von MAb 3.5F8 und des PAb gegen VEGF als die Beschichtungsreagenzien (volle Quadrate).
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
A. Definitionen
Die Bezeichnung "VEGF" wie hierin verwendet bezieht sich auf den 165 Aminosäuren umfassenden Gefäßendothelzellwachstumsfaktor und die verwandten, 121, 145, 189 und 206 Aminosäuren umfassenden Gefäßendothelzellwachstumsfaktoren, wie von Leung et al., Science 246, 1306 (1989), Houck et al., Mol. Endocrin. 5, 1806 (1991), und Neufeld et al., s.o., beschrieben, zusammen mit den natürlich vorkommenden Allelformen und den verarbeiteten Formen dieser Wachstumsfaktoren.
Die Bezeichnung "Detektion" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst sowohl qualitative als auch quantitative Messungen eines Targetmoleküls. In einem Aspekt wird das hierin beschriebene Detektionsverfahren verwendet, um nur die Gegenwart selbst von VEGF in einer biologischen Probe zu identifizieren. In einem anderen Aspekt wird das Verfahren verwendet, um zu testen, ob VEGF in einer Probe in einer nachweisbaren Konzentrationen vorhanden ist. In wiederum einem anderen Aspekt kann das Verfahren verwendet werden, um die Menge von VEGF in einer Probe zu quantifizieren und um darüber hinaus die VEGF-Konzentrationen aus verschiedenen Proben zu vergleichen.
Die Bezeichnung "biologische Probe" bezieht sich auf eine Körperprobe aus jedem beliebigen Tier, die jedoch vorzugsweise aus einem Säugetier, noch bevorzugter aus einem Menschen, stammt. Am meisten bevorzugt stammt eine solche biologische Probe aus Gefäß-, Diabetes- oder Krebspatienten. Solche Proben umfassen Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Glaskörperflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Gelenksflüssigkeit, Follikelflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Fruchtwasser, Milch, Vollblut, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Sputum, Tränen, Schweiß, Schleim und Gewebekulturmedium sowie Gewebeextrakte wie homogenisiertes Gewebe und Zellextrakte. Die bevorzugte biologische Probe hierin ist Serum, Plasma oder Urin.
Die Bezeichnung "Einfangreagens" bezieht sich auf ein Reagens, das in der Lage ist, ein Targetmolekül in einer Probe so zu binden und einzufangen, dass unter geeigneten Bedingungen der Einfangreagens-Targetmolekül-Komplex von der übrigen Probe getrennt werden kann. Typischerweise ist das Einfangreagens immobilisiert oder immobilisierbar. In einem Sandwich-Immuntest ist das Einfangreagens vorzugsweise ein Antikörper oder ein Gemisch verschiedener Antikörper gegen ein Target-Antigen.
Die Bezeichnung "nachweisbarer Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der in der Lage ist, entweder direkt durch eine durch ein Detektionsmittel amplifizierte Markierung oder indirekt durch z.B. einen anderen Antikörper, der markiert ist, nachgewiesen zu werden. Zur direkten Markierung wird der Antikörper typischerweise an eine Gruppierung konjugiert, die durch ein bestimmtes Mittel nachweisbar ist. Der bevorzugte nachweisbare Antikörper ist ein biotinylierter Antikörper.
Die Bezeichnung "Detektionsmittel" bezieht sich auf eine Gruppierung oder ein Verfahren, die bzw. das verwendet wird, um die Gegenwart eines nachweisbaren Antikörpers in der ELISA der vorliegenden Erfindung nachzuweisen, und umfasst Detektionsreagenzien, die die immobilisierte Markierung, wie z.B. eine Markierung, die auf einer Mikrotiterplatte eingefangen ist, amplifizieren. Vorzugsweise ist das Detektionsmittel ein fluorimetrisches Detektionsmittel wie Avidin oder Streptavidin.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst monoklonale Antikörper (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierender Antikörper), polyklonale Antikörper, mehrwertige Antikörper, multispezifische Antikörper und Antikörperfragmente, solange sie die erwünschte Bindungsspezifität aufweisen.
Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wird, d.h. dass die einzelnen, die Population bildenden Antikörper bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Monoklonale Antikörper sind darin hochspezifisch, dass sie direkt gegen eine einzelne antigene Stelle gerichtet sind. Weiters ist im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten gerichtet sind (Epitope), jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante am Antigen gerichtet. Das Adjektiv "monoklonal" bezeichnet die Eigenschaft des Antikörpers, aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern gewonnen zu sein, und gilt nicht als ein Erfordernis zu verstehen, den Antikörper durch irgendein bestimmtes Verfahren herzustellen. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden, monoklonalen Antikörper durch das Hybridomverfahren gebildet werden, das als erstes von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder sie können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z.B. das US-Patent Nr. 4.816.567). Die "monoklonalen Antikörper" können auch beispielsweise unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), beschriebenen Verfahren aus Phagen-Antikörper-Bibliotheken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen insbesondere "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Abschnitt der schweren und/oder leichten Kette mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die aus einer bestimmten Spezies stammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, identisch oder dazu homolog ist/sind, während der Rest der Kette(n) mit den entspre chenden Sequenzen in Antikörpern, die aus einer anderen Spezies stammen oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, identisch oder dazu homolog ist/sind, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange diese die erwünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)).
"Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Antikörper, die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin abstammt. Im Großteil der Fälle sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste der hypervariablen Region des Rezipienten durch Reste der hypervariablen Region einer nicht-menschlichen Spezies (Spender-Antikörper) wie z.B. Maus, Ratte, Kaninchen oder nicht-menschlichen Primaten mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Gerüstregion- (FR-) Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch im Spender-Antikörper zu finden sind. Diese Modifikationen werden vollzogen, um Antikörperleistung weiter zu verfeinern. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domäne(n), in der/denen alle oder im Wesentlichen alle der hypervariablen Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen, und alle oder im Wesentlichen alle der FRs jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst gegebenenfalls auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Nähere Details sind in Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992), zu finden.
"Säugetier" für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als ein Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Kleintiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Schafe, Schweine, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Die Bezeichnungen "Krebs", "karzinomatös" und "maligne" beziehen sich auf oder beschreiben das physiologische Leiden in Säugetieren, das typischerweise durch ungeregeltes Zellwachstum charakterisiert ist. Beispiele für Krebs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Karzinom einschließlich Adenokarzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Spezifischere Beispiele für solche Krebsarten umfassen Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungekarzinom, Magen-Darm-Krebs, Hodgkin-Lymphom und Non-Hodgkin-Lymphom, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Glioblastom, Zervixkarzinom, Ovarialkarzinom, Leberkrebs wie Hepakarzinom und Hepatom, Blasenkrebs, Brustkrebs, Kolonkarzinom, Kolorektalkarzinom, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs wie Nierenzellkarzinom und Wilms-Tumoren, Basalzellenkrebs, Melanom, Prostatakrebs, Vulvakarzinom, Schilddrüsenkrebs, Hodenkrebs, Speiseröhrenkrebs und verschiedene Typen von Kopf- und Halskrebs. Die bevorzugten Krebsarten zur Behandlung hierin sind Brustkrebs, Kolonkarzinom, Lungenkarzinom und Melanom.
Die Adjektive "vaskulär" und "kardiovaskulär" werden synonym verwendet und beschreiben Patienten mit Indikationen, die Angiogenese und/oder Gefäßwachstum im Herzen stimulieren, und jenen, die Angiogenese und/oder Gefäßwachstum im Herzen inhibieren. Solche Störungen umfassen beispielsweise Arterienerkrankungen wie Atherosklerose, Bluthochdruck, entzündliche Gefäßerkrankungen, Raynaud-Krankheit und Raynaud-Phänomen, Aneurysmen und arterielle Restenose; Venen- und Lympherkrankungen wie Thrombophlebitis, Lymphangitis und Lymphödem; und andere Gefäßerkrankungen wie periphere Gefäßerkrankung, Krebsarten wie Gefäßgeschwulst, z.B. Hämangiom (kapillar und kavernös), Glomustumoren, Teleangiektasie, Bazillen-Angiomatose, Hämangioendotheliom, Angiosarkom, Hämangioperizytom, Kaposi-Sarkom, Lymphangiom und Lymphangiosarkom, Tumorangiogenese, Traumata wie Wunden, Verbrennungen und anderes verletztes Gewebe, Implantatfixierung, Narbenbildung, ischämische Reperfusionsverletzungen, rheumatoide Arthritis, zerebrovaskuläre Erkrankungen, Nierenerkrankungen wie akutes Nierenversagen und Osteoporose. Dies würde auch Angina, Myokardinfarkte wie akute Myokardinfarkte, Herzhypertrophie und Herzversagen wie kongestive Herzinsuffizienz (CHF) umfassen.
Die Bezeichnung "Diabetes" bezieht sich auf eine fortschreitende Erkrankung des Kohlenhydratstoffwechsels, die eine nicht angepasste Produktion oder Verwendung von Insulin einbindet und durch Hyperglykämie und Glykosurie gekennzeichnet ist. Diese Bezeichnung umfasst alle Formen von Diabetes, wie Typ-I- und Typ-II-Diabetes und insulinresistenten Diabetes, wie Mendenhall-Syndrom, Werner-Syndrom, Leprechaunismus, lipatrophischen Diabetes und andere Lipatrophien.
Die Bezeichnung "affinitätsgereinigt" bezieht sich auf das Reinigen einer Substanz durch Eluieren dieser über eine Affinitätschromatographiesäule.
B. Ausführungsformen der Erfindung
Der hierin beschriebene Test ist ein Vielfach-Stellen-Immuntest, der unter Verwendung der folgenden Schritte ausgeführt wird.
Erster Schritt
Im ersten Schritt des Tests hierin wird die biologische Probe mit den immobilisierten Einfang- (oder Beschichtungs-) Reagenzien kontaktiert und inkubiert, die ein monoklonaler Anti-VEGF-Antikörper und ein polyklonaler Antikörper, der gegen VEGF gerichtet ist, sind. Diese Antikörper können von jeder beliebigen Spezies abstammen, vorzugsweise jedoch ist der monoklonale Antikörper ein monoklonaler Maus- oder Ratten-Antikörper, noch bevorzugter ein Maus-Antikörper, und am bevorzugtesten MAb 3.5F8 (Rodriguez et al. (1998), s.o.), und der polyklonale Antikörper ist Anti-Kaninchen- oder Anti-Ziegen-Antikörper, bevorzugter Anti-Kaninchen-Antikörper. Weiters ist der polyklonale Antikörper vorzugsweise affinitätsgereinigt, um Hintergrund zu reduzieren. Somit ist in einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform der immobilisierte monoklonale Antikörper ein monoklonaler Maus-Antikörper, am bevorzugtesten MAb 3.5F8, und der immobilisierte polyklonale Antikörper ein affinitätsgereinigter Kaninchen-Antikörper. Die immobilisierten Einfangreagenzien werden miteinander vermischt, bevor sie immobilisiert werden. Immobilisierung erfolgt üblicherweise durch Unlöslichmachen der Einfangreagenzien entweder vor dem Testver fahren, wie bei Adsorption an einer wasserunlöslichen Matrix oder Oberfläche (US-Patent Nr. 3.720.760) oder durch nicht-kovalente oder kovalente Bindung (beispielsweise unter Verwendung von Glutaraldehyd- oder Carbodiimid-Vernetzung, mit oder ohne vorherige(r) Aktivierung des Trägers mit z.B. Salpetersäure und einem reduzierenden Mittel, wie im US-Patent Nr. 3.645.852 oder in Rotmans et al., J. Immunol. Methods 57, 87-98 (1983), beschrieben), oder nachher, z.B. durch Immunfällung.
Die für Immobilisierung verwendete Festphase kann jedes beliebige inerte Trägermaterial oder jeder beliebige inerte Träger sein, das bzw. der im Wesentlichen wasserunlöslich und in immunometrischen Tests nützlich ist, einschließlich Träger in Form von z.B. Oberflächen, Partikeln, porösen Matrices usw. Beispiele für üblicherweise verwendete Träger umfassen kleine Blättchen, Sephadex, Polyvinylchlorid, Kunststoffperlen und Testplatten oder Teströhrchen, die aus Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und dergleichen hergestellt sind, einschließlich 96-Well-Mikrotiterplatten, sowie Teilchenmaterial wie Filterpapier, Agarose, vernetztes Dextran und andere Polysaccharide. Alternativ dazu können reaktive, wasserunlösliche Matrices wie Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die in den US-Patenten Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; und 4.330.440 beschriebenen reaktiven Substrate auf geeignete Weise für Einfangreagens-Immobilisierung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die immobilisierten Einfangreagenzien auf eine Mikrotiterplatte beschichtet, und insbesondere ist die verwendete bevorzugte Festphase eine Mehrfach-Well-Mikrotiterplatte, die verwendet werden kann, um mehrere Proben zugleich zu analysieren. Am meisten bevorzugt ist eine Mikrotest-96-Well-ELISA-Platte wie jene, die unter dem Namen Nunc Maxisorb oder Immulon vertrieben wird.
Die Festphase wird mit den vorgemischten Einfangreagenzien wie zuvor definiert beschichtet, die durch eine nicht-kovalente oder kovalente Wechselwirkung oder physikalische Bindung, wie erwünscht, gebunden werden können. Verfahren zur Bindung umfassen jene, die im US-Patent Nr. 4.376.110 und den darin zitierten Verweisen beschrieben werden. Im Fall von kovalenter Bindung wird die Platte oder andere Festphase mit einem Vernetzer zusammen mit dem Einfangreagens unter Bedin gungen, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie beispielsweise 1 h lang bei Raumtemperatur, inkubiert.
Üblicherweise verwendete Vernetzer zur Bindung der vorgemischten Einfangreagenzien an das Festphasensubstrat umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleinimide wie Bis-N-maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Quervernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden.
Bei der Verwendung von 96-Well-Platten werden diese vorzugsweise mit dem Gemisch von Einfangreagenzien (typischerweise in einem Puffer wie 0,05 M Natriumcarbonat verdünnt) durch Inkubation für zumindest etwa 10 h, noch bevorzugter zumindest über Nacht, bei Temperaturen von etwa 4-20 °C, noch bevorzugter von etwa 4-8 °C, und einem pH von etwa 8-12, noch bevorzugter von etwa 9-10, und am meisten bevorzugt von etwa 9,6, beschichtet. Sind kürzere Beschichtungszeiten (1-2 h) erwünscht, so können 96-Well-Platten mit Nitrocellulosefilterböden (Millipore MULTISCREEN^TM) verwendet oder bei 37 °C beschichtet werden. Die Platten können lange vor der Durchführung des eigentlichen Tests gestapelt und beschichtet werden, und später kann der Test gleichzeitig an mehreren Proben auf manuelle, halbautomatische oder automatische Weise, wie unter Verwendung von Robotertechnik, durchgeführt werden.
Die beschichteten Platten werden dann typischerweise mit einem Blocker behandelt, der sich nicht-spezifisch an die Bindungsstellen bindet und diese sättigt, um unerwünschte Bindung des freien Liganden an die überschüssigen Stellen an den Wells der Platte zu unterbinden. Beispiele für geeignete Blocker für diesen Zweck umfassen z.B. Gelatine, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Casein und fettfreie Milch. Die Blockierungsbehandlung findet typischerweise unter den Bedingungen von Umge bungstemperatur über eine Dauer von etwa 1-4 h, vorzugsweise etwa 1,5 bis 3 h, hinweg statt.
Nach dem Beschichten und Blockieren wird der VEGF-Standard (gereinigter VEGF) oder die zu analysierende biologische Probe, in geeigneter Weise verdünnt, zur immobilisierten Phase zugesetzt. Das bevorzugte Verdünnungsverhältnis beträgt etwa 5-15 Vol.-%, vorzugsweise etwa 10 Vol.-%. Puffer, die zur Verdünnung für diesen Zweck verwendet werden können, umfassen (a) PBS, die 0,5 % BSA, 0,05 % TWEEN 20^TM Detergens (P20), 0,05 % PROCLIN^TM 300 Antibiotikum, 5 mM EDTA, 0,25 % Chaps-Tensid, 0,2 % beta-gamma-Globulin und 0,35 M NaCl enthält; (b) PBS, die 0,5 % BSA, 0,05 % P20 und 0,05 % PROCLIN^TM 300, pH 7, enthält; (c) PBS, die 0,5 % BSA, 0,05 % P20, 0,05 % PROCLIN^TM 300, 5 mM EDTA und 0,35 M NaCl, pH 6,35, enthält; (d) PBS, die 0,5 % BSA, 0,05 % P20, 0,05 % PROCLIN^TM 300, 5 mM EDTA, 0,2 % beta-gamma-Globulin und 0,35 M NaCl enthält; und (e) PBS, die 0,5 % BSA, 0,05 % P20, 0,05 % PROCLIN^TM 300, 5 mM EDTA, 0,25 % Chaps und 0,35 M NaCl enthält. Puffer (c) ist der bevorzugte Puffer für den Test hierin, da er die beste Differenzierung zwischen jedem Standard sowie den größten Signal-Rausch-Abstand aufweist. PROCLIN^TM 300 wirkt als ein Konservierungsstoff, und TWEEN 20^TM wirkt als ein Tensid, um nicht spezifische Bindung zu eliminieren. Die Wirkung der zugesetzten EDTA und des Salzes von Puffer (c) ist die Senkung des Hintergrunds gegenüber anderen Puffern einschließlich Puffer (b).
Das Gewichtsverhältnis der Einfangreagenzien (monoklonaler Antikörper zu polyklonalem Antikörper) beträgt vorzugsweise etwa 0,8:1 bis etwa 1,2:1, noch bevorzugter etwa 1:1. Die Menge an verwendeten Einfangreagenzien ist ausreichend groß, um im Vergleich mit den VEGF-Standards ein gutes Signal zu ergeben, jedoch nicht in molarem Überschuss im Vergleich zur maximalen erwarteten endogenen VEGF-Konzentration in der Probe. Für ausreichende Empfindlichkeit wird bevorzugt, dass die Menge der zugesetzten biologischen Probe so ist, dass die immobilisierten Einfangreagenzien in molarem Überschuss zur maximalen Molkonzentration von freiem VEGF, die in der biologischen Probe nach geeigneter Verdünnung der Probe erwartet wird, vorhanden sind. Diese erwartete Konzentration hängt hauptsächlich von jeg licher bekannten Korrelation zwischen den Konzentrationsniveaus des freien VEGF in der bestimmten, zu analysierenden biologischen Probe und dem klinischen Leiden des Patienten zusammen. Somit können beispielsweise Krebspatienten eine maximale erwartete Konzentration von freiem VEGF in ihrem Serum aufweisen, die relativ hoch ist, während basierend auf dem Wissensstand laut der vorhandenen Literatur von einem normalen Kind oder einem normalen Erwachsenen erwartet wird, dass es/er eine viel geringere Konzentration von freiem VEGF in ihrem Serum aufweisen.
Sind jedoch zu viele Einfangreagenzien vorhanden, so müssen die Einfangreagenzien mit dem in der biologischen Probe vorhandenen Anti-VEGF um den gebundenen VEGF konkurrieren, was zu unexakten Resultaten führt. Somit wird, während die Konzentration der Einfangreagenzien im Allgemeinen durch den Konzentrationsbereich von Interesse des VEGF bestimmt wird, wobei jegliche erforderliche Verdünnung der biologischen Probe berücksichtigt wird, die Endkonzentration der Einfangreagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Tests im Bereich von Interesse zu maximieren. Als eine allgemeine Richtlinie jedoch ist der molare Überschuss geeigneterweise weniger als das etwa Zehnfache der maximalen erwarteten Molkonzentration von freiem VEGF in der biologischen Probe, und dies nach jeglicher geeigneten Verdünnung der Probe. Am bevorzugtesten beträgt die Menge an immobilisierten monoklonalen Antikörpern etwa 0,4 μg/ml und die Menge an immobilisierten polyklonalen Antikörpern etwa 0,4 μg/ml.
Die Inkubationsbedingungen für die Probe und das immobilisierte Einfangreagens werden so ausgewählt, dass Empfindlichkeit des Tests maximiert und Dissoziation minimiert wird. Vorzugsweise erfolgt die Inkubation bei relativ konstanten Temperaturen im Bereich von etwa 0 °C bis etwa 40 °C, vorzugsweise von etwa 36 °C bis 38 °C, um einen weniger variablen, niedrigeren Variationskoeffizienten (CV) als z.B. bei Raumtemperatur zu erhalten. Die Dauer der Inkubation hängt primär von der Temperatur ab und beträgt im Allgemeinen nicht mehr als 10 h, um Unempfindlichkeit des Tests zu vermeiden. Vorzugsweise liegt die Inkubationszeit im Bereich von etwa 0,5 bis 3 h und noch bevorzugter 1,5 bis 3 h bei 36-38 °C, um Bindung von freiem VEGF an Einfangreagenzien zu maximieren. Die Inkubationszeit kann auch län ger ausfallen, wenn ein Proteaseinhibitor zugesetzt wird, um zu unterbinden, dass Proteasen in der biologischen Flüssigkeit den VEGF abbauen.
In dieser Phase liegt der pH des Inkubationsgemisches üblicherweise im Bereich von etwa 6-9,5, vorzugsweise im Bereich von etwa 6-7, noch bevorzugter im Bereich von etwa 6,0 bis 6,5, und am meisten bevorzugt beträgt der pH des Test- (ELISA) Verdünnungsmittels 6,35 ± 0,1. Saurer pH wie pH 4-5 reduzierte die Gewinnung von VEGF. Der pH des Inkubationspuffers wird so ausgewählt, dass ein signifikantes Niveau von spezifischer Bindung der Einfangreagenzien an den einzufangenden VEGF aufrechterhalten wird. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den erwünschten pH während dieses Schritts zu erreichen und aufrechtzuerhalten, einschließlich Borat, Phosphat, Carbonat, Tris-HCl oder Tris-Phosphat, Acetat, Barbital und dergleichen. Der bestimmte verwendete Puffer ist für die Erfindung nicht maßgeblich, in einzelnen Tests kann jedoch ein Puffer gegenüber einem anderen bevorzugt werden.
Zweiter Schritt
Im zweiten Schritt des Testverfahrens der vorliegenden Erfindung wird die biologische Probe (vorzugsweise durch Waschen) von den immobilisierten Einfangreagenzien getrennt, um nicht eingefangenen VEGF zu entfernen. Die für das Waschen verwendete Lösung ist im Allgemeinen ein Puffer ("Waschpuffer") mit einem pH, der unter Berücksichtigung der oben für den Inkubationsschritt genannten Überlegungen und Puffer bestimmt wurde, wobei ein bevorzugter pH-Bereich etwa 6-9 ist. Das Waschen kann dreimal oder öfter erfolgen. Die Waschtemperatur liegt im Allgemeinen im Bereich von Kühlschranktemperaturen bis mäßige Temperaturen, wobei während der Testdauer eine konstante Temperatur gehalten wird, typischerweise von etwa 0-40 °C, vorzugsweise von etwa 4-30 °C. Der Waschpuffer kann beispielsweise vor dem Waschschritt in Eis bei 4 °C in einen Behälter gegeben werden, und ein Plattenwascher kann für diesen Schritt verwendet werden. Ein Vernetzer oder ein anderes geeignetes Mittel kann in dieser Phase auch zugesetzt werden, um zu ermöglichen, dass sich der nun gebundene VEGF kovalent an die Einfangreagenzien bindet, wenn Bedenken bestehen, dass sich der gefangene VEGF in den darauf folgenden Schritten zu einem gewissen Ausmaß dissoziiert.
Dritter Schritt
Im nächsten Schritt werden die immobilisierten Einfangreagenzien mit nachweisbaren Antikörpern kontaktiert, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 20-40 °C, noch bevorzugter von etwa 36-38 °C, wobei die exakte Temperatur und Dauer des Kontaktierens der beiden primär von dem verwendeten Detektionsmittel abhängen. Wenn beispielsweise 4-Methylumbelliferyl-β-galactosid (MUG) und Streptavidin-β-Galactosidase als Detektionsmittel verwendet werden, wird das Kontaktieren vorzugsweise über Nacht (z.B. etwa 15-17 h oder mehr) durchgeführt, um das Signal bis zum Maximum zu amplifizieren. Wenn der nachweisbare Antikörper auch ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein kann, ist er vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, noch bevorzugter ein Maus-Antikörper, und am bevorzugtesten MAb A4.6.1. Auch ist der bevorzugte nachweisbare Antikörper direkt nachweisbar, und vorzugsweise weist er eine fluorimetrische Markierung auf. Die fluorimetrische Markierung weist zum Test, im Vergleich zur herkömmlichen kolorimetrischen Markierung, größere Empfindlichkeit auf. Noch bevorzugter ist der nachweisbare Antikörper biotinyliert und das Detektionsmittel Avidin oder Streptavidin-β-Galactosidase und MUG.
Vorzugsweise wird ein molarer Überschuss eines Antikörpers in Bezug auf die maximale Konzentration von erwartetem, freiem VEGF (wie zuvor beschrieben) zur Platte zugesetzt, nachdem sie gewaschen wurde. Dieser Antikörper (der direkt oder indirekt nachweisbar ist) ist vorzugsweise ein polyklonaler Antikörper, wenn auch jeder beliebige Antikörper verwendet werden kann. Die Affinität des Antikörpers muss ausreichend hoch sein, sodass geringe Mengen des freien VEGF nachgewiesen werden können, jedoch nicht so hoch, dass sie ein Wegziehen des VEGF von den Einfangreagenzien verursacht.
Vierter Schritt
Im letzten Schritt des Testverfahrens wird die Konzentration von freiem VEGF, der nun an die Einfangreagenzien gebunden ist, unter Verwendung eines Detektionsmittels für den nachweisbaren Antikörper gemessen. Stammt die biologische Probe von einem Gefäß-, Diabetes- oder Krebspatienten, so umfasst der Messschritt vorzugsweise das Vergleichen der Reaktion, die als ein Resultat der oben genannten drei Schritte eintritt, mit einer Standardkurve, um die Konzentration von VEGF im Vergleich mit einem normalen Probanden zu vergleichen.
Antikörperbildung
Polyklonale Antikörper gegen den VEGF werden in Tieren normalerweise durch mehrfache subkutane (sk) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des VEGF und eines Adjuvans gezüchtet. Es kann nützlich sein, den VEGF oder ein Fragment, das die Target-Aminosäuresequenz enthält, an ein Protein, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsininhibitor, unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R'N=C=NR, worin R und R' verschiedene Alkylgruppen sind, zu konjugieren.
Die als das die Beschichtungs- oder nachweisbaren Antikörper verwendeten Antikörper können aus jedem herkömmlichen Wirbeltier wie Maus, Primat, Lagomorpha, Ziege, Kaninchen, Ratte, Huhn, Rind, Schaf, Pferd, Hund, Katze oder Schwein stammen. Chimäre oder humanisierte Antikörper können auch verwendet werden, wie im US-Patent Nr. 4.816.567; in Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985); und der WO 98/45331, veröffentlicht am 15. Oktober 1998, sowie in den zuvor genannten, zusätzlichen Verweisen beschrieben wird.
Tiere können gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg oder 1 μg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina von komplettem Freundschem Adjuvans und intradermales Injizieren der Lösung an mehreren Stellen immunisiert werden. Ein Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der anfänglichen Menge an Konjugat in inkomplettem Freundschem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Anti-VEGF-Titer getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer gesättigt ist. Vorzugsweise wird das Tier mit einem Konjugat von VEGF, jedoch konjugiert an ein anderes Protein und/oder durch einen anderen Vernetzer, geboostet. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen gebildet werden. Auch werden aggregierende Mittel wie Alaun verwendet, um die Immunantwort zu steigern. Verfahren zur Bildung polyklonaler Antikörper werden in zahlreichen Lehrbüchern zur Immunologie beschrieben, wie beispielsweise in Davis et al., Microbiology, 3. Auflage, Harper & Row, New York (1980).
Monoklonale Antikörper werden durch Gewinnung von Milzzellen aus immunisierten Tieren und Immortalisieren der Zellen auf herkömmliche Weise, z.B. durch Fusion mit Myelomzellen oder durch Epstein-Barr-Virus-Transformation, und Screenen auf Klone, die den erwünschten Antikörper exprimieren, hergestellt. Siehe z.B. Kohler & Milstein, Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976). Monoklonale Antikörper oder die Antigen-Bindungsregion eines monoklonalen Antikörpers, wie z.B. Fab- oder (Fab)₂-Fragmente, können alternativ dazu mittels Rekombinationsverfahren gebildet werden.
Beispiele für geeignete Antikörper umfassen jene, die bereits in bekannten RIAs für das betreffende Protein verwendet wurden, z.B. jene Antikörper, die gegen VEGF gerichtet sind, wie in den in der Einführung hierin genannten Verweisen beschrieben wird.
Detektion
Der zu den immobilisierten Einfangreagenzien zugesetzte Antikörper wird entweder direkt markiert oder indirekt durch Zusetzen, nach dem Abwaschen von überschüssigem erstem Antikörper, eines molaren Überschusses eines zweiten markierten Antikörpers, der gegen IgG der Tierspezies des ersten Antikörpers gerichtet ist, nachgewiesen. Im zweiten, indirekten Test werden markierte Antiseren gegen den ersten Antikörper zur Probe zugesetzt, um den markierten Antikörper in situ zu bilden.
Die entweder für den ersten oder den zweiten Antikörper verwendete Markierung ist jede beliebige nachweisbare Funktionalität, die die Bindung von freiem VEGF an den Antikörper nicht stört. Beispiele für geeignete Markierungen sind jene zahlreichen Markierungen, die zur Verwendung im Immuntest bekannt sind, einschließlich Gruppierungen, die direkt nachgewiesen werden können, wie fluorochrome, chemolumineszierende und radioaktive Markierungen, sowie Gruppierungen wie Enzyme, die umgesetzt oder derivatisiert werden müssen, um nachgewiesen zu werden. Beispiele für solche Markierungen umfassen die Radioisotope ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H und ¹³¹I, Fluorophore wie Seltenerdmetallchelate oder Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Umbelliferon, Luciferasen, z.B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase (US-Patent Nr. 4.737.456), Luciferin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen, z.B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase, heterozyklische Oxidasen wie Uricase und Xanthinoxidase, gebunden mit einem Enzym, das Wasserstoffperoxid verwendet, um einen Farbstoff-Vorläufer wie HRP zu oxidieren, Lactoperoxidase oder Mikroperoxidase, Biotin/Avidin, Biotin/Streptavidin, Biotin/Streptavidin-β-Galactosidase mit MUG, Spinmarker, Bakteriophagenmarkierungen, stabile freie Radikale und dergleichen. Wie zuvor angemerkt wird die Detektion mittels Fluorimetrie bevorzugt.
Herkömmliche Verfahren sind verfügbar, um diese Markierungen kovalent an Proteine oder Polypeptide zu binden. Bindemittel wie Dialdehyde, Carbodiimide, Dimaleinimide, Bis-Imidate, Bis-diazotiertes Benzidin und dergleichen können verwendet werden, um die Antikörper mit den zuvor beschriebenen fluoreszierenden, chemolumineszierenden und Enzymmarkierungen zu markieren. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 3.940.475 (Fluorimetrie) und 3.645.090 (Enzyme); Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods 40, 219-230 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407-412 (1982). Bevorzugte Markierungen sind hierin fluoreszierende Marker, um die Amplifikation und Empfindlichkeit auf 8 pg/ml zu steigern, noch bevorzugter Biotin mit Streptavidin-β-Galactosidase und MUG zur Amplifikation des Signals.
Die Konjugation solcher Markierungen einschließlich der Enzyme an den Antikörper ist für Fachleute auf dem Gebiet der Immuntestverfahren ein herkömmliches manipulatives Verfahren. Siehe beispielsweise O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", in: Methods in Enzymology, J.J. Langone & H. Van Vunakis (Hrsg.), Bd. 73, Academic Press, New York, New York, 147-166 (1981).
Nach Zusatz des letzten markierten Antikörpers wird die Menge an gebundenem Antikörper durch Entfernen von überschüssigem ungebundenem markiertem Antikörper durch Waschen und anschließendes Messen der Menge der gebundenen Markierung unter Verwendung eines für die Markierung geeigneten Detektionsverfahrens und Korrelieren der gemessenen Menge mit der Menge an freiem VEGF in der biologischen Probe bestimmt. Im Fall von Enzymen beispielsweise ist die Menge von entwickelter und gemessener Farbe eine direkte Messung der Menge von vorhandenem VEGF. Insbesondere wenn HRP die Markierung ist, wird die Farbe unter Verwendung des Substrats OPD bei 490-nm-Absorption nachgewiesen.
In einem Beispiel wird, nachdem ein enzymmarkierter zweiter Antikörper, der gegen den ersten unmarkierten Antikörper gerichtet ist, von der immobilisierten Phase abgewaschen wurde, die Farbe oder Chemolumineszenz entwickelt und durch Inkubie ren des immobilisierten Einfangreagens mit einem Substrat des Enzyms gemessen. Anschließend wird die Höhe der Konzentration von freiem VEGF durch Vergleichen mit der Farbe oder Chemolumineszenz, die gleichzeitig durch den Standard-VEGF gebildet wird, berechnet.
Sets
Praktischerweise kann das Testverfahren dieser Erfindung in der Form eines Sets geliefert werden. Solch ein Set ist eine verpackte Kombination aus den Grundelementen von:

(a) Einfangreagenzien, bestehend aus polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen menschliches VEGF-Molekül, worin sich der monoklonale Antikörper spezifisch an den C-Terminus des VEGF-Moleküls bindet, in einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,8:1 bis 1,2:1 von monoklonalem zu polyklonalem Antikörper; und
(b) Detektionsreagenzien, bestehend aus nachweisbaren (markierten oder unmarkierten) Antikörpern, die sich an die KDR- und FLT1-Rezeptorbindungsdomänen von VEGF binden.

Diese Grundelemente wurden hierin bereits definiert.
Vorzugsweise umfasst das Set weiters einen festen Träger für die Einfangreagenzien, der als ein getrenntes Element geliefert werden kann oder an dem die Einfangreagenzien bereits immobilisiert sind. Somit können die Einfang-Antikörper im Set an einem festen Träger immobilisiert sein oder sie können an einem solchen Träger immobilisiert werden, der mit dem Set oder separat geliefert wird. Vorzugsweise werden die Einfangreagenzien auf eine Mikrotiterplatte beschichtet. Das Detektionsreagens kann in Form markierter Antikörper vorliegen, die direkt nachgewiesen werden, oder als unmarkierte Antikörper, die durch markierte Antikörper, die gegen die unmarkierten Antikörper gerichtet sind, die in einer anderen Spezies gezüchtet wurden, nachgewiesen werden. Ist die Markierung ein Enzym, so umfasst das Set üblicher weise Substrate und Co-Faktoren, die vom Enzym erfordert werden, und wenn die Markierung ein Fluorophor ist, einen Farbstoffvorläufer, der das nachweisbare Chromophor liefert. Ist das Detektionsreagens unmarkiert, so kann das Set weiters ein Detektionsmittel für die nachweisbaren Antikörper, wie z.B. die markierten Antikörper, die gegen die unmarkierten Antikörper gerichtet sind, vorzugsweise in einem fluorimetrisch nachzuweisendem Format, umfassen.
In einer bevorzugten spezifischen Ausführungsform ist das Gewichtsverhältnis von monoklonalem Antikörper zu polyklonalem Antikörper im Set etwa 1:1, der nachweisbare Antikörper ist ein biotinylierter monoklonaler Maus-Antikörper, der monoklonale Antikörper ist Maus oder Ratte, noch bevorzugter Maus, und am bevorzugtesten MAb 3.5F8, der polyklonale Antikörper ist affinitätsgereinigt und stammt noch bevorzugter von Ziege oder Kaninchen, am bevorzugtesten von Kaninchen, und die Menge monoklonaler Maus-Antikörper beträgt 0,4 μg/ml, und die Menge polyklonaler Kaninchen-Antikörper beträgt 0,4 μg/ml. Vorzugsweise werden die Einfangreagenzien in diesem Set immobilisiert. Auch ist der nachweisbare Antikörper bevorzugt MAb A4.6.1.
Das Set enthält auch typischerweise Anweisungen zur Durchführung des Tests und/oder VEGF als einen Antigen-Standard (z.B. gereinigten VEGF, vorzugsweise rekombinant gebildeten VEGF) sowie andere Additive wie Stabilisatoren, Wasch- und Inkubationspuffer und dergleichen.
Beispiele für Standards für VEGF sind rekombinante menschliche VEGF, hergestellt in Säugetierzellen, die bei Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, erhältlich sind.
Die Komponenten des Sets werden in vorbestimmten Verhältnissen bereitgestellt, wobei die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien geeignet variiert werden, um Konzentrationen der Reagenzien in Lösung bereitzustellen, die die Empfindlichkeit des Tests wesentlich maximieren. Insbesondere können die Reagenzien als trockene, üblicherweise lyophilisierte Pulver bereitgestellt werden, die Arzneimittelträger umfassen, welche bei Auflösung eine Reagenslösung liefern, die die geeignete Konzentration für Kombination mit der zu testenden Probe aufweist.
Die folgenden Beispiele dienen als Veranschaulichung einer nun bekannten Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung, die Erfindung wird jedoch nicht als auf diese Beispiele beschränkt betrachtet.
BEISPIEL 1
2. Materialien und Verfahren
2.1. Reagenzien
Gereinigter rekombinanter menschlicher VEGF165 (rhVEGF), exprimiert in Escherichia coli (Genentech, South San Francisco, CA), wurde als Standard und für die Kontrollen verwendet (hergestellt in ELISA-Verdünnungsmittel wie nachstehend definiert und gelagert bei –70 °C). Streptavidin-β-Galactosidase (Strep-β-gal) wurde bei Boehringer Mannheim, Westdeutschland, erworben; MUG wurde bei Sigma, St. Louis, MO, erworben. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde bei Sigma erworben.
2.2 Antikörper gegen VEGF
Antikörper gegen rhVEGF165 wurden wie in Kim et al., Growth Factors 7, 53 (1992), beschrieben hergestellt. Kurz zusammengefasst wurden BALB/c-Mäuse intraperitoneal mit einer 10-mg-Dosis von rhVEGF165, konjugiert an Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin, hyperimmunisiert. Milzzellen wurden mit einer Maus-Myelomlinie fusioniert, und Kulturüberstände aus den Wells, die Hybridome enthalten, wurden mittels ELISA auf die Gegenwart von MAbs gegen rhVEGF165 gescreent. Positive Hybridomen wurden zweimal unter Verwendung des Grenzwert-Verdünnungsverfahrens kloniert. Die in dieser ELISA verwendeten monoklonalen Antikörper wurden in Kim et al. (1992), s.o., charakterisiert. Von einem der Einfang-Antikörper, MAb 3.5F8, wird angenommen, dass er sich in der Nähe der Heparinbin dungsdomäne, Aminosäuren 111-165, mit einer K_d von 13 pM bindet. Rodriguez et al. (1998), s.o.
Der als der andere Beschichtungs-Antikörper verwendete polyklonale Kaninchen-Antikörper (PAb) wurde durch Injizieren von VEGF in ein Kaninchen unter Verwendung einer Standard-Arbeitsvorschrift gebildet und durch Durchführen durch eine Affinitätssäule, an die VEGF gebunden war, um den polyklonalen Antikörper einzufangen, gereinigt, wodurch die Immunglobuline aus der Probe entfernt wurden. Die Moleküle, die nicht der erwünschte Antikörper waren, wurden abgewaschen, und der gebundene Antikörper wurde mit 0,2 M Glycin, pH 2, eluiert, dann wurde der pH vor der Dialyse über Nacht in PBS bei 4 °C auf einen neutralen Wert gebracht, und der den Antikörper enthaltende Eluent wurde für den Vielfach-Stellen-Test verwendet.
Der Detektions-Antikörper, MAb A4.6.1, bindet rhVEGF165 mit einer Kd von 86 pM. Mehrere Beweislinien weisen darauf hin, dass dieser MAb rhVEGF in der Nähe der KDR-Rezeptorbindungsregion bindet (Kim et al. (1992), s.o.).
2.3 Biotinylierung von MAb A4.6.1
Der MAb A4.6.1 wurde mit Biotinylamidohexansäure-N-hydroxysuccinimidester (Biotin-X-NHS) (Research Organics, Cleveland, OH) gemäß der folgenden Arbeitsvorschrift biotinyliert. Der MAb A4.6.1 wurde gegen 100 mM NaHCO₃, pH 8,5, über Nacht bei 2-8 °C dialysiert. Insgesamt wurden 60 μl einer 5-mg/ml-Lösung von Biotin-X-NHS in DMSO zum MAb (nach Dialyse auf eine Konzentration von 2-10 mg/ml eingestellt) bei einem 1:10-Gewichtverhältnis von Biotin:MAb zugesetzt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur zwei Stunden lang unter leichtem Schütteln inkubieren gelassen, und die Reaktion wurde durch den Zusatz von 5 μl Ethanolamin gestoppt. Nach Konjugation wurde der Antikörper bei 2-8 °C unter leichtem Schütteln eingehend gegen PBS dialysiert, und PBS wurde alle zwei Stunden und insgesamt dreimal ausgetauscht.
2.4 Vielfach-Stellen-VEGF-ELISA
Zwei MAbs, 3.5F8 (Beschichtung) und biotinylierter A4.6.1 (Detektion), und ein PAb (Beschichtung) wie zuvor beschrieben wurden verwendet, um eine spezifische und empfindliche VEGF-ELISA zu entwickeln. In dieser ELISA wurden 100 μl/Well jeweils von MAb 3.5F8 und dem affinitätsgereinigtem PAb zusammengemischt und dann zu MaxiSorp^TM-96-Well-Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) zu 0,4 μg/ml jeweils in 0,05 M Natriumcarbonat, pH 9,6, zugesetzt. Nach 24-74 Stunden Inkubation bei 2-8 °C wurden die beschichteten Platten dreimal mit 400 μl ELISA-Waschpuffer (PBS mit 0,05 % TWEEN-20^TM-Tensid) unter Verwendung eines Plattenwaschers BIOTEK EL304^TM (Biotek Instruments, Winooski, VT) gewaschen und mit ELISA-Blockierungsverdünnungsmittel bei 200 μl/Well (PBS mit 0,5 % BSA, 0,05 TWEEN-20^TM und 0,05 % PROCLIN^TM 300 Antibiotikum, pH 7,2) 1-3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur unter Rühren blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Platten wiederum dreimal mit 400 μl ELISA-Waschpuffer gewaschen. Dann wurden 100 μl/Well Standards, Proben oder Kontrollen zu den Wells in doppelter Ausführung zugesetzt und 1,5-2 h lang bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Zur Quantifizierung von rhVEGF165 in menschlichem Plasma wurde die Standardkurve in ELISA-Verdünnungsmittel (PBS mit 0,5 % BSA, 0,05 % TWEEN-20^TM, 0,05 % PROCLIN^TM 300, 5 mM EDTA und 0,35 M NaCl, pH 6,3 ± 0,1) gebildet. Die Standardkurve belief sich auf 128 pg/ml, seriell 1:2 auf 2 pg/ml verdünnt. Nach der Proben/Standard-Inkubation wurden die Platten sechsmal mit 400 μl ELISA-Waschpuffer gewaschen, und 100 μl/Well von MAb A4.6.1-Biotin, frisch 1:200 auf seine optimale Konzentration in ELISA-Verdünnungsmittel verdünnt, wurden zu den Platten zugesetzt. Nach 1,5-2 h Inkubation bei 37 °C unter Schütteln wurden die Platten sechsmal wie zuvor beschrieben gewaschen, und 100 μl/Well von strep-β-gal, 1:40K in ELISA-Verdünnungsmittel verdünnt, wurden zu den Platten zugesetzt. Nach einer 45- bis 60-minütigen Inkubation bei 37 °C unter Schütteln wurden die Platten sechsmal wie zuvor beschrieben gewaschen, und 100 μl/Well von MUG/DMSO (1/100), frisch in einer Lösung von 0,1 M NaPO₄, die 1 mM MgCl₂ bei pH 7,3 ± 0,1 enthält, auf 340 μg/ml verdünnt, wurden zu den Platten zugesetzt. Die Substratreaktion wurde 15-17 h lang bei 37 °C unter Schütteln im Dunkeln (Platten waren mit einer Folie umwickelt) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusetzen von 150 μl/Well von 0,15 M Glycin, pH 10,5 ± 0,1, gestoppt. Die fluoreszierende Einheit (FSU) der Well-Inhalte wurde an einem Fluoreszenz-Plattenleser CYTOFLUOR 4000^TM (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) unter Verwendung von 360-nm-Anregungs- und 460-nm-Emissionsfiltern gelesen. Ein Kurvenanpassungsprogramm mit vier Parametern wurde verwendet, um eine Standardkurve zu bilden, aus der Proben- und Kontrollkonzentrationen interpoliert wurden. FSU-Ablesungen waren zumindest 30 min lang bei Raumtemperatur stabil, nachdem 150 μl Glycin zugesetzt worden waren.
2.5 Menschliche Plasmaproben
Die Fähigkeit, VEGF in menschlichem Plasma exakt zu messen, wurde unter Verwendung mehrerer Ansätze bewertet. Die Wirkung von Plasma auf die Testempfindlichkeit und -leistung wurde unter Verwendung von rhVEGF165 bewertet. Bekannte Mengen von rhVEGF165 wurden zu einzelnen Proben von menschlichem Plasma zugesetzt, und die prozentuelle Gewinnung wurde wie folgt bestimmt: (1) die Menge von endogenem VEGF in der Probe, bestimmt aus einer Parallelprobe, wurde von der Gesamtmenge von VEGF, die in der Probe gemessen wurde, subtrahiert; (2) der "gewonnene" VEGF-Wert wurde dann durch die Menge von zur Probe zugesetztem VEGF dividiert und mit 100 multipliziert. Die Verdünnungslinearität von rhVEGF165, der zu einzelnen Proben menschlichen Plasmas zugesetzt wurde, wurde auch bewertet. In diesen Studien wurde nach rhVEGF165-Zusatz jede Plasmaprobe 1:10 in ELISA-Verdünnungsmittel verdünnt, gefolgt von seriellen 1:2-Verdünnungen in ELISA-Verdünnungsmittel. Hoch- und niederkonzentrierte Matrix- (Standard) Kontrollen wurden in unverdünntem menschlichem EDTA-Plasma (gefroren) hergestellt. Sie wurden 1/10 auf eine Endkonzentration von 10 % Plasma in ELISA-Verdünnungsmittel verdünnt.
Endogene VEGF-Konzentrationen wurden in einzelnen Proben menschlichen Plasmas gemessen. Blut aus normalen gesunden Probanden wurde in 15-%-K3-EDTA-Vacutainer-Röhrchen (Becton Dickenson, San Jose, CA) gefüllt. Die Röhrchen wurden bei 2.000xg 20 min fang zentrifugiert, und das Plasma wurde abgenommen.
Plasmaproben wurden 1:10 in ELISA-Verdünnungsmittel zur Verwendung im Test verdünnt. Die Verdünnungslinearität von endogenem VEGF in selektierten Proben wurde auch wie zuvor beschrieben bewertet.
3. Resultate
3.1 Probenstabilität
Die Stabilität von unverdünntem menschlichem EDTA-Plasma wurde für drei Gefrier-Auftau-Zyklen untersucht. Das Plasma erhielt eine Trockeneisbehandlung, gefolgt von leichtem Mischen in warmem Wasser, um es aufzutauen. Die Daten in Tabelle 1 unten zeigen, dass es keine signifikante Wirkung auf die quantitative Bestimmung von VEGF nach den Gefrier-Auftau-Behandlungen gab. Folglich ist menschliches EDTA-Plasma für drei Gefrier-Auftau-Zyklen stabil.
TABELLE 1: Netto-Gefrier-Auftau-Stabilität von normalem menschlichem EDTA-Plasma

CV = Variationskoeffizient

3.2 Detektionsgrenze
Etwa 20 Replikate der Blindprobe, 1, 2, 4 und 8 pg/ml Standard, wurden im Vielfach-Stellen-VEGF-ELISA hierin getestet. Die Detektionsgrenze wurde durch die Analyten- (VEGF) Konzentration, für die die gemessene mittlere FSU-Antwort minus zwei Standardabweichungen höher als die mittlere FSU-Antwort plus zwei Standardabweichungen der Blindproben-Fluoreszenzemission war (460 nm), bestimmt. Die Resultate in Tabelle 2 zeigen, dass die Detektionsgrenze 8 pg/ml in ELISA-Verdünnungsmittel ist. Da Plasmaproben typischerweise 1:10 verdünnt werden, um Matrixinterferenz zu minimieren, kann nur eine geringe Menge von 80 pg/ml oder 1,6 pM VEGF in der ursprünglichen Probe gemessen werden.
TABELLE 2: Detektionsgrenze (0,4 μg/ml)
3.3 Testen und Herstellung von Anti-VEGF-PAb
Zwei verschiedene Präparate von polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen rhVEGF, gereinigt aus demselben Kaninchen, jedoch von einer anderen Blutabnahme, wurden im Test unter Verwendung von MAb 3.5F8 als monoklonaler Antikörper und unter Verwendung von 0,4 μg/ml von jedem Antikörpertyp verglichen. Die Resultate, angegeben in 1, zeigen, dass beide Antikörper zur Verwendung geeignet sind.
Elution von polyklonalem Kaninchen-Antikörper wurde mit Glycin, gefolgt von Guanidin, durchgeführt, und die resultierenden Antikörper wurden im Test unter den hierin bevorzugten Bedingungen verwendet. Die Resultate in 2 und Tabelle 3 zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den zwei Elutionsverfahren gibt. Dennoch scheint die Glycinelution leicht empfindlicher zu sein. Ein Vergleich von normalen menschlichen EDTA-Plasmaproben sowie die hoch- und niederkonzentrierte Matrix-Kontrollen zeigen bei beiden Präparaten ähnliche quantitative Bestimmung. Der Guanidin-Peak ist stärker an den VEGF gebunden als der Glycin-Peak.
TABELLE 3: Vergleich von Glycin und Guanidin als Eluenten
3.4 Robustheit/Widerstandsfähigkeit
Präzision zwischen den Tests und innerhalb der einzelnen Tests wurde für die nieder- und hochkonzentrierten Matrix-Kontrollen durch statistische ANOVA-Analyse bewertet. Matrix-Kontrollen wurden durch Spicken von rhVEGF in unverdünntes menschliches EDTA-Plasma bei geringen und hohen Konzentrationen, die in den Testbereich fallen, hergestellt. Die Resultate zeigen, dass die Variabilität zwischen den Tests (CV) von 11 bis 17 % reicht, während die Variabilität innerhalb der Tests von 8 bis 14 % reicht. Die Daten sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
TABELLE 4: Reproduzierbarkeit der Matrix-Kontrollen
3.5 Hakenwirkung
Mehrere Proben in der Vergangenheit zeigten Nicht-Linearität von ansteigendem VEGF gemessen mit ansteigenden Probenverdünnungen. Daher wurde die Vielfach-Stellen-ELISA hierin auf eine Hakenwirkung (Parallel-Vergleich mit den Ein-Stellen- und Zwei-Stellen-ELISAs) getestet. rhVEGF wurde von 16 ng/ml auf 1 pg/ml in Testpuffer verdünnt. Die Resultate (in 3 dargestellt) zeigen, dass es keinen signifikanten Abfall bei der VEGF-Quantifizierung gab. Es kann jedoch von 512 pg/ml an ein leichter Abfall und ein Sättigungseffekt beobachtet werden. Da die im Vielfach-Stellen-ELISA-Test verwendeten Probenverdünnungen hierin zu Konzentrationen von weniger als 128 pg/ml führen, ist die Hakenwirkung kein Anlass für Bedenken.
3.6 Beschichtungsmaximierung
Die Verfahren zur Bestimmung von Beschichtungsmaximierung waren dieselben wie die zuvor im Abschnitt zu den Verfahren beschriebenen, außer dass die Konzentration entweder der PAb- oder der MAb-3.5F8-Beschichtung variierte. Insbesondere für 4 wurde die Konzentration von MAb 3.5F8 von 0,4 bis 4 μg/ml variiert, während die Konzentration von polyklonalem Antikörper konstant (bei 1 μg/ml) gehalten wurde, und für 5 und Tabelle 5 wurde die Konzentration von polyklonalem Antikörper von 0,4 bis 4 μg/ml variiert, während die Konzentration von MAb 3.5F8 konstant (bei 0,4 μg/ml) gehalten wurde.
Während die 0,1- und 0,4-μg/ml-Konzentrationen von MAb 3.5F8 und PAb bei der konstanten Konzentration des anderen Beschichtungs-Antikörpers für die niedrige und hohe Kontrolle bei der VEGF-Quantifizierung im Wesentlichen dieselbe war, wird die obere Grenze der Beschichtungskonzentration (z.B. 0,4 μg/ml) bevorzugt, um die Chancen zu erhöhen, dass der VEGF eingefangen wird. Während die Konzentration von 1 μg/ml von MAb 3.5F8 und PAb die in jedem Fall gemessene Menge an VEGF steigerte, ergab eine solche Konzentration auch einen höheren Hintergrund. Somit zeigen die Resultate, dass die bevorzugten Konzentrationen für beide Einfangreagenzien etwa 0,4 μg/ml beträgt.
TABELLE 5: Beschichtungsmaximierung des polyklonalen Antikörpers plus MAb 3.5F8
3.7 pH-Profil der Vielfach-Stellen-VEGF-ELISA
Ein pH-Profil wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine Änderung des pH des Testpuffers die Gewinnung von VEGF in normalem menschlichem EDTA-Plasma steigern oder senken würde. Das Ändern des pH konnte Bindungsproteine oder andere Komplexe, sofern welche vorhanden waren, die die MAb-A4.6.1-Detektion stören würden, dissoziieren.
Das Verfahren zur Untersuchung des pH-Profils des Tests war dasselbe wie oben im Abschnitt zu den Verfahren beschrieben, außer dass für die Probeninkubation und Biotininkubation der Testpuffer unter Verwendung von NaOH oder HCl eingestellt wurde, was zu Testpuffern mit pHs in einem Bereich von 4 bis 9 führte. Eine Standardkurve, eine nieder- und hochkonzentrierte Matrix und vier Proben von normalem menschlichem EDTA-Plasma wurden aus Verdünnungen bewertet, die unter Verwendung dieser Testpuffer mit variierendem pH durchgeführt wurden.
Die Resultate in 6 und Tabelle 6 zeigen, dass es keine Gewinnung von VEGF bei pH 4 und 5 gab. pH 6-9 zeigten jedoch gute VEGF-Plasmagewinnung, wobei die Testkontrolle in einem akzeptablen Bereichs lag. Es gab keinen signifikanten Unterschied bei der VEGF-Quantifizierung als Konsequenz des Variierens des pH des Testpuffers von 6 bis 9. Der bevorzugte Testpuffer ist jedoch einer mit einem pH von etwa 6,35 ± 0,1, der zu maximaler VEGF-Bindung führt und für alle Verdünnungsschritte des Tests geeignet ist.
TABELLE 6: VEGF-Gewinnung aus normalem menschlichem EDTA-Plasma bei variierendem pH
3.8 Verdünnungslinearität
Etwa 85 pg/ml rhVEGF wurde in unverdünntes menschliches EDTA-Plasma gespickt und seriell auf 1/10, 1/20, 1/40 und 1/80 verdünnt und analysiert. Die Resultate in Tabelle 7 und 7 zeigen, dass in EDTA-Plasma gespickter rhVEGF eine lineare Korrelation zur erwarteten Konzentration mit einer Korrelationskoeffizienten von 0,996 zeigte. Der prozentuelle Unterschied zwischen Verdünnungs-korrigierten Konzentrationswerten, die für aufeinander folgende Reihenverdünnungen bestimmt wurden, überstieg einen Mittelwert von 19 % ± 7,5 % nicht, wie in Tabelle 7 gezeigt ist.
TABELLE 7: Verdünnungslinearität von normalem menschlichem EDTA-Plasma
3.9 Exaktheit – Quantifizierung von VEGF in menschlichem Plasma
Endogene VEGF-Konzentrationen wurden in frisch abgenommenem Plasma von mehreren normalen gesunden Probanden gemessen. Die einzelnen Proben von menschlichem EDTA-Plasma wurden mit den geringsten, niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen von rhVEGF gespickt, sodass diese in den Bereich der Standardkurve fielen. Endogene VEGF-Konzentrationen wurden bestimmt und von der gemessenen Konzentration abgezogen, um einen Vergleich zum "Target-Spike" zu erhalten. Die Resultate in Tabelle 8 zeigen, dass die mittleren Gewinnungen in 99 %, 113 %, 106 % und 118 % für die hohen, mittleren, niedrigen bzw. noch niedrigeren "Spikes" betrugen.
TABELLE 8: Spike-Gewinnung von rhVEGF in menschlichem EDTA-Plasma

* 0,4 μg/ml Mab-3.5F8- + 0,4 μg/ml PAb-Beschichtung

3.10 Exaktheit – Quantifizierung von VEGF in normalem Ratten-EDTA-Plasma
Eine einzelne und zwei gepoolte EDTA-Plasmaproben aus männlichen Ratten wurden mit geringer, mittlerer und hoher Konzentration von rhVEGF gespickt, sodass sie in den Bereich der Standardkurve fallen. Konzentrationen von endogenem VEGF wurden bestimmt und von der gemessenen Konzentration subtrahiert, um einen Vergleich zum Target-Spike zu erhalten (Verdünnungskontrolle). Die Spikes wurden dann 1:2 in ELISA-Verdünnungsmittel verdünnt, um Verdünnungslinearität zu bestimmen. Die Resultate in Tabelle 9 zeigen, dass die Mittelwerte der Gewinnungen in % im Bereich von 84 bis 103 % für die hohen, mittleren und niedrigen Spikes, die größer als 6,25 pg/ml waren, liegen.
TABELLE 9: VEGF-Spike-Gewinnung in normalem Ratten-EDTA-Plasma
3.11 Linearität von normalem Ratten-EDTA-Plasma in ELISA-Verdünnungsmittel
Ratten-EDTA-Plasma (2 männliche Pools, 1 einzelne Probe) wurden auf Verdünnungslinearität getestet. Unverdünnte Plasmaproben wurden mit geringen (20 pg/ml), mittleren (44 pg/ml) und hohen (98 pg/ml) Konzentrationen von rhVEGF gespickt und wurden seriell 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 in ELISA-Verdünnungsmittel verdünnt. Die Resultate in Tabelle 10 und den 8A-8C zeigen, dass normale Rattenplasmaproben nach einer minimalen 1/20-Verdünnung im Testbereich von 8-128 pg/ml linear verdünnen.
TABELLE 10: Zusammenfassung von Linearität für Rattenplasmaproben (in Korrelationskoeffizienteneinheiten (R))
3.12 Exaktheit – Quantifizierung von VEGF in EDTA-Plasma aus normalem Yorkshire-Schwein
Acht EDTA-Plasmaproben aus Yorkshire-Schweinen (vier männlichen und vier weiblichen) wurden mit niedrigen, mittleren und hohen Konzentrationen von rhVEGF gespickt, sodass sie in den Testbereich der Standardkurve fallen. Endogene VEGF-Konzentrationen wurden bestimmt und von der gemessenen Konzentration subtrahiert, um einen Vergleich zum Target-Spike (Verdünnungskontrolle) zu erhalten. Spikes wurden dann 1/10, 1/20, 1/40, 1/80 in ELISA-Verdünnungsmittel verdünnt, um Verdünnungslinearität zu bestimmen. Die in 9A (weibliche Tiere) und 9B (männliche Tiere) und in Tabelle 11 dargestellten Resultate zeigen, dass normale Rattenplasmaproben nach einer minimalen 1/20-Verdünnung im Testbereich von 8-128 pg/ml linear verdünnen.
TABELLE 11: Zusammenfassung zu Linearität von Proben aus Yorkshire-Schweinen
3.13 Detektion verschiedener Formen von VEGF unter Verwendung von drei ELISAs
Ziel dieses Versuchs war zu bestimmen, ob die Vielfach-Stellen-ELISA der vorliegenden Erfindung alle Varianten von VEGF messen konnte. Die 10A, 10B und 10C zeigen einen Vergleich der Ein-Stellen-, Zwei-Stellen- bzw. Vielfach-Stellen-ELISAs für VEGF. Ein Vergleich dieser Diagramme zeigt, dass der Vielfach-Stellen-Test hierin in der Lage ist, mehr VEGF-Varianten einzufangen.
3.14 Detektion unter Verwendung von Zwei-Stellen oder Vielfach-Stellen-ELISA oder unter Verwendung von PAb als Beschichtung
Die Vielfach-Stellen-ELISA der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von PAb und MAb 3.5F8 als Beschichtungs-Antikörper wurde zur Bewertung der Menge von VEGF in normalen menschlichen Proben mit einer ELISA unter Verwendung von MAb 3.5F8 oder PAb alleine als Beschichtungs-Antikörper verglichen. Die Resultate in Tabelle 12 zeigen, dass die Menge von nachgewiesenem VEGF in pg/ml für den Vielfach-Stellen-Test sehr viel höher als für den Test mit PAb alleine oder MAb 3.5F8 alleine war.
TABELLE 12: Menge von VEGF in Proben von normalem menschlichem Plasma unter Verwendung von PAb alleine, MAb alleine oder PAb und MAb zusammen

LTS = nicht nachweisbar

3.15 Vergleich von VEGF-Konzentrationen in normalem menschlichem Plasma und normalem menschlichem Serum unter Verwendung von Zwei-Stellen- und Vielfach-Stellen-ELISAs
Plasma- und Serumproben von normalen menschlichen Spendern wurden mittels Zwei-Stellen-ELISA mit MAb 3.5F8 als Einfang-Antikörper und PAb A4.6.1 als Detek tions-Antikörper und mittels des Vielfach-Stellen-Tests der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des PAb und der MAbs und der im Abschnitt zu den Vorgangsweisen beschriebenen Verfahren analysiert. Die in den 11A und 111B für Plasma bzw. Serum zusammengefassten Resultate weisen darauf hin, dass der Vielfach-Stellen-Test hierin in beiden Probentypen mehr VEGF nachweist als der Zwei-Stellen-Test.
3.16 Vergleich von VEGF-Konzentrationen in normalen und herzerkrankten Patienten unter Verwendung von Ein-Stellen-, Zwei-Stellen- und Vielfach-Stellen-ELISAs
Proben von normalen menschlichen Spendern und von Spendern mit Herzerkrankungen, die für von Genentech, Inc., finanzierte klinische Versuche ausgesucht wurden, um die Wirksamkeit von TNK, einer t-PA-Variante, zu bewerten, wurden durch die Ein-Stellen-ELISA mit MAb 3.5F8 als Beschichtungs- und Detektionsmittel, durch die Zwei-Stellen-ELISA mit MAb 3.5F8 als Einfang-Antikörper und MAb A4.6.1 als Detektions-Antikörper und durch die Vielfach-Stellen-ELISA der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des PAb und der MAbs und der im Abschnitt zur Vorgehensweise beschriebenen Verfahren analysiert. 12 zeigt die Mengen von Plasma-VEGF in herzerkrankten Patienten, die unter Verwendung aller drei Tests ermittelt wurden, und 13 und Tabelle 13 fassen die Mengen von VEGF in normalen und herzerkrankten Patienten, ermittelt unter Verwendung des Zwei-Stellen-Tests und des Vielfach-Stellen-Tests, durch die mittlere Menge von VEGF, die Standardabweichung, % CV und mittleren Standardfehler zusammen. Die Resultate weisen darauf hin, dass der Vielfach-Stellen-Test der vorliegenden Erfindung in beiden Probentypen mehr VEGF als der Zwei-Stellen-Test nachweist.
TABELLE 13: Empfindlichkeit von Zwei-Stellen- und Vielfach-Stellen-Tests auf VEGF in normalen und herzerkrankten Patienten
3.17 Vergleich von Serum-VEGF-Konzentrationen in Lungenkrebspatienten unter Verwendung von Zwei-Stellen- und Vielfach-Stellen-ELISAs
Serumproben aus Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom wurden durch die Zwei-Stellen-ELISA mit MAb 3.5F8 als Einfang-Antikörper und MAb A4.6.1 als Detektions-Antikörper und durch die Vielfach-Stellen-ELISA der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des PAb und der MAbs und der im Abschnitt zur Vorgehensweise beschriebenen Verfahren analysiert. Die in 14 gezeigten Resultate weisen darauf hin, dass der Vielfach-Stellen-Test hierin mehr VEGF in Lungenkrebsproben nachweist als der Zwei-Stellen-Test.
3.18 Konzentrationen von Serum-VEGF in Diabetes-Patienten
Serum-VEGF-Konzentrationen in normalen Menschen und in Patienten mit NIDDM (Typ-I-Diabetes) und IDDM (Typ-II-Diabetes) wurden unter Verwendung der zuvor beschriebenen Zwei-Stellen-ELISA (MAb 3.5F8 als Beschichtungsmittel und MAb A4.6.1 als Detektionsmittel) gemessen. 15 zeigt, dass die Konzentrationen von Serum-VEGF unter Verwendung dieses Tests in NIDDM- und IDDM-Patienten höher als in normalen Patienten waren. Da in anderen erkrankten Patienten der Vielfach-Stellen-Test mehr VEGF als der Zwei-Stellen-Test nachweist, könnte angenommen werden, dass der Vielfach-Stellen-Test der vorliegenden Erfindung zur Detektion erhöhter Konzentrationen von VEGF in Diabetes-Patienten geeignet sein würde.
3.19 Spezifität von PAb gegen VEGF gegenüber PAb gegen DNase im Vielfach-Stellen-Test
Die Zwei-Stellen- und Vielfach-Stellen-ELISAs wurden wie zuvor beschrieben für normale menschliche Plasmaproben durchgeführt. Darüber hinaus wurde ein Vielfach-Stellen-Test unter Verwendung von PAb gegen DNase und nicht PAb gegen VEGF als Beschichtungsmittel durchgeführt. Alle wiesen eine Konzentration von 0,4 μg/ml auf. 16 und Tabelle 14 zeigen, dass der durch den Vielfach-Stellen-VEGF-Test nachgewiesene VEGF spezifisch ist. Die Resultate aus der ELISA unter Verwendung von PAb gegen DNAse plus MAb 3.5F8 zeigen beinahe identische Resultate wie die ELISA unter Verwendung von MAb 3.5F8 alleine als Einfangreagens, mit einer Steigung von 1,04 (16A).
TABELLE 14: Menschliches EDTA-Plasma, bewertet bezüglich der VEGF-Mengen
3.20 Zusammenfassung bevorzugter Tests und Resultate
4. Diskussion
Nur wenig ist über die Konzentrationen der zirkulierenden Formen von VEGF in normalen Personen während der Wachstumsphase, der Schwangerschaft und im hohen Alter oder in pathophysiologischen Erkrankungszuständen bekannt. Hierin wird die Entwicklung und Charakterisierung von einem empfindlichen Test mit hohem Durchsatz beschrieben, der in der Lage ist, verschiedene Isoformen von VEGF und ihre Konzentrationen in menschlichem Plasma zu messen. Dieser Test stellt ein wichtiges Werkzeug für die Messung von VEGF-Konzentrationen sowohl in gesunden Probanden als auch bei verschiedenen Erkrankungszuständen dar.
Die Vielfach-Stellen-ELISA der vorliegenden Erfindung kann 165/165-, 165/110-, 121/121- und 110/110-VEGF-Varianten in gleich guter Weise messen. Mit diesem Test wurde eine höhere Plasma-VEGF-Konzentration in normalen Spendern gemessen (192 ± 68 pg/ml, n = 50). Für dieselben 18 Patienten mit Herzgefäßerkrankungen wurde ein signifikant höherer Plasma-VEGF als bei normalen Spendern nachgewie sen (279 ± 157 pg/ml, n = 18, p < 0,001). Siehe 13. Tatsächlich bildete monoklonaler Antikörper MAb 3.5F8 plus affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper gegen ein irrelevantes Protein kein zusätzliches Signal über jenem von MAb 3.5F8 alleine. Es wurde daraus geschlossen, dass neben intaktem VEGF auch andere VEGF-Varianten und Isoformen im Blutkreislauf, sowohl von normalen Spendern als auch von Herzgefäßpatienten, vorhanden sind. Die Fähigkeit zu zeigen, dass die Rezeptorbindungsdomäne von VEGF für Bindung zugänglich ist, kann eine wichtige Eigenschaft für jeden beliebigen Test sein, der darauf abzielt, die biologische Aktivität von VEGF im Blutkreislauf zu verstehen.
Das fluorimetrische Substrat, strep-β-gal/MUG, wird zur Verwendung im Detektionssystem bevorzugt, sodass die ELISA endogene VEGF-Konzentrationen in normalen Probanden nachweisen kann. Die Verwendung von diesem Substrat und die Bestimmung des besten ELISA-Verdünnungsmittels führten zu viel geringerer Hintergrundabsorption, was bevorzugt war, um eine Steigerung der Testempfindlichkeit zu erreichen.
Die hierin beschriebenen Vielfach-Stellen-ELISA ist aufgrund der Auswahl der für Einfang und Detektion verwendeten Antikörper hoch spezifisch. Einer der Beschichtungs-Antikörper, MAb 3.5F8, bindet sich nahe der Heparinbindungsregion von VEGF (Reste 111-165), und der andere Beschichtungs-Antikörper, der polyklonale Kaninchen-Antikörper, bindet VEGF. Der Detektions-Antikörper, MAb A4.6.1, bindet sich in der KDR-Rezeptorbindungsregion (Reste 1-110) des Moleküls und ergibt dadurch eine spezifische ELISA für VEGF.
Die Spezifität von dieser Vielfach-Stellen-ELISA ist wichtig, da die Biologie von VEGF dadurch besser verstanden werden kann. Keyt et al., s.o. (S. 7788), zeigten, dass die verschiedenen, in dieser Studie untersuchten VEGF-Varianten variierende Bioaktivitäten in vitro aufweisen. Die Kenntnis der Testspezifität ist auch für die Bewertung klinischer Daten und das Vergleichen von Daten aus verschiedenen Laboratorien äußerst wichtig.
Veröffentlichte Berichte (Kondo et al. (1994), s.o.; Takano et al. (1996), s.o., Rodriguez et al., s.o.) wiesen darauf hin, dass Serum-VEGF-Konzentrationen in Krebspatienten erhöht waren. Unter Anbetracht der Tatsache, dass Angiogenese ein allgemeines Phänomen in der Entwicklung fester Tumoren ist und dass Expression von VEGF, einem Tumor-Angiogenesefaktor, in zahlreichen Tumorzellen verschiedener Ursprünge beobachtet wird, kann die Messung von VEGF-Konzentrationen im Blutkreislauf als ein nicht-invasiver diagnostischer Marker für zahlreiche verschiedene feste Tumoren dienen.
Abschließend kann gesagt werden, dass eine empfindliche ELISA, die die meisten molekularen Formen von VEGF misst, entwickelt wurde. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Antikörper in Tieren gegen menschlichen VEGF gezüchtet, wobei der C-terminale spezifische Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist und der Gesamt-VEGF-spezifische Antikörper ein polyklonaler Antikörper, vorzugsweise affinitätsgereinigt, ist. Diese zwei Antikörper werden als Beschichtungs-Antikörper (immobilisierte Einfangreagenzien) an einem festen Träger wie Mikrotiterplatten verwendet. Die zur Detektion verwendeten Antikörper können entweder polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein, vorausgesetzt, sie sind für die KDR- und FLT1-Bindungsdomänenregionen von menschlichem VEGF spezifisch.
Exakte und empfindliche ELISAs wie jene, die hierin beschrieben wurden, werden als wichtig für ein besseres Verständnis von VEGF-Konzentrationen in verschiedenen Erkrankungsphasen erachtet. Ein besseres Verständnis sowohl der VEGF-Konzentrationen als auch der dominanten Isoformen, die sowohl in normalen Probanden als auch in pathophysiologischen Erkrankungszuständen vorhanden sind, fördert das Wissen um die Rolle von VEGF in normaler und pathologischer Pathogenese.
Während die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, gilt zu verstehen, dass sie auch weiteren Modifikationen unterzogen werden kann, und diese Anmeldung soll jegliche Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung gemäß, im Allgemeinen, den Grundlagen der Erfindung abdecken, einschließlich jener Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die im Rahmen der üblichen und bekannten Praxis auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung liegen und die an den hierin zuvor sowie in den beiliegenden Ansprüchen beschriebenen, wesentlichen Eigenschaften angewandt werden können.

Claims

Verfahren zur Detektion von Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) in einer biologischen Probe, die folgenden Schritte umfassend: (a) das Kontaktieren und Inkubieren der biologischen Probe mit vorgemischten Einfangreagenzien, die an einem festen Träger immobilisiert sind, worin die Einfangreagenzien polyklonale und monoklonale Antikörper gegen menschlichen VEGF sind, wobei sich der monoklonale Antikörper spezifisch an den C-Terminus (Reste 111-165) von menschlichem VEGF bindet; (b) das Trennen der biologischen Probe von den immobilisierten Einfangreagenzien; (c) das Kontaktieren der immobilisierten Einfangreagenzien mit einem nachweisbaren Antikörper, der sich an die KDR- und FLT1-Rezeptor-Bindungsdomänen von VEGF bindet; und (d) das Messen der Konzentration an VEGF, der an die Einfangreagenzien gebunden ist, unter Verwendung eines Detektionsmittels für den nachweisbaren Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biologische Probe von einem menschlichen Probanden stammt.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der menschliche Proband ein Patient mit Gefäßerkrankungen, Diabetes oder Krebs ist und der Messschritt (d) weiters einen Vergleich mit einer Standardkurve umfasst, um die Konzentration an VEGF im Vergleich zu einer normalen Person zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biologische Probe Plasma, Serum oder Urin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Einfangreagenzien in einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,8:1 bis 1,2:1 von monoklonalem Antikörper zu polyklonalem Antikörper immobilisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Gewichtsverhältnis von monoklonalem Antikörper zu polyklonalem Antikörper etwa 1:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Menge an immobilisierten monoklonalen Antikörpern etwa 0,4 μg/ml und die Menge an immobilisierten polyklonalen Antikörpern etwa 0,4 μg/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die immobilisierten Einfangreagenzien auf eine Mikrotiterplatte beschichtet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der nachweisbare Antikörper direkt nachweisbar ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der nachweisbare Antikörper durch ein fluorimetrisches Reagens amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin der nachweisbare Antikörper biotinyliert ist und das Detektionsmittel Avidin- oder Streptavidin-β-Galactosidase und 4-Methylumbelliferyl-β-Galactosid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der immobilisierte monoklonale Antikörper von Maus und der immobilisierte polyklonale Antikörper von Kaninchen oder Ziege abstammt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der immobilisierte polyklonale Antikörper affinitätsgereinigt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der nachweisbare Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der nachweisbare Antikörper ein monoklonaler Maus-Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 15, worin der immobilisierte monoklonale Antikörper MAb 3.5F8 und der nachweisbare Antikörper MAb A4.6.1 ist.
Immuntestset zur Detektion von Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) in einer biologischen Probe, umfassend: (a) als Einfangreagenzien polyklonale und monoklonale Antikörper gegen menschlichen VEGF, vorgemischt in einem Gewichtsverhältnis von etwa 0,8:1 bis 1,2:1 von monoklonalem zu polyklonalem Antikörper, worin sich der monoklonale Antikörper spezifisch an den C-Terminus (Reste 111-165) von menschlichem VEGF bindet; und (b) als Detektionsreagens einen nachweisbaren Antikörper, der sich an die KDR- und FLT1-Rezeptor-Bindungsdomänen von VEGF bindet.
Set nach Anspruch 17, weiters umfassend einen festen Träger für die Einfangreagenzien.
Set nach Anspruch 18, worin die Einfangreagenzien an dem festen Träger immobilisiert sind.
Set nach Anspruch 19, worin die Einfangreagenzien auf eine Mikrotiterplatte beschichtet sind.
Set nach Anspruch 17, weiters umfassend ein Detektionsmittel für die nachweisbaren Antikörper.
Set nach Anspruch 21, worin das Detektionsmittel fluorimetrisch ist.
Set nach Anspruch 17, weiters umfassend gereinigten VEGF als einen Antigen-Standard.
Set nach Anspruch 17, worin das Gewichtsverhältnis von monoklonalem Antikörper zu polyklonalem Antikörper etwa 1:1 beträgt, der monoklonale Antikörper von Maus abstammt, der polyklonale Antikörper affinitätsgereinigt ist und die Menge an monoklonalen Antikörpern 0,4 μg/ml und die Menge an polyklonalen Antikörpern 0,4 μg/ml beträgt.
Set nach Anspruch 24, worin die Einfangreagenzien immobilisiert sind und der polyklonale Antikörper ein Kaninchen- oder Ziegen-Antikörper ist.
Set nach Anspruch 25, worin der nachweisbare Antikörper monoklonaler Maus-Antikörper MAb A4.6.1 und der monoklonale Einfangreagens-Antikörper MAb 3.5F8 ist.