ES2247423T5 - Método de producción de un dispositivo recubierto homogéneamente que tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras - Google Patents

Description

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Metodo de produccion de un dispositivo recubierto homogeneamente que tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras

La presente invencion se refiere a un dispositivo de produccion de un dispositivo que tiene propiedades osteinductoras y osteoconductoras in vivo.

Se ha demostrado que diversos fosfatos de calcio, tales como el fosfato tricalcico beta (Ca3(PO4)2) (FTC beta), fosfato tricalcico alfa (FTC alfa) e hidroxiapatita (HA) han demostrado ser eficaces como materiales de sustitucion osea. El FTC beta, por ejemplo, es adecuado como material granulado y en trozos (bloques) para el tratamiento de los defectos oseos. Los materiales de sustitucion osea que contienen fosfato de calcio se utilizan normalmente cuando la regeneracion del hueso ya no es posible o solo es posible con dificultades. Ademas, los materiales de sustitucion osea se utilizan cuando la formacion de hueso adicional es un requisito previo para la fijacion posterior de un implante. Los fosfatos de calcio muestran un efecto osteoconductor, es decir, representan una estructura inerte que facilita la migracion de las celulas desde el hueso circundante. Sin embargo, la presencia de huesos o de celulas mesenquimatosas diferentes es una condicion previa para la nueva formacion de los huesos. El efecto de los fosfatos de calcio puede aumentarse significativamente anadiendo esquirlas oseas. Los huesos no son solo osteoconductores, sino tambien osteogenicos (estimulacion de las celulas oseas para la neosfntesis de material oseo) y osteoinductores, es decir, producen la transformacion de celulas madre mesenquimatosas no diferenciadas en osteoblastos y condrocitos. Por motivos de seguridad, se prefieren las esquirlas oseas autogenas para las preparaciones alogenicas o xenogenicas. Sin embargo, la produccion de huesos autogenicos siempre implica una segunda intervencion quirurgica que, en muchos casos, no es aceptada por el paciente.

Una alternativa al uso de huesos autogenicos es el uso de factores de crecimiento y diferenciacion oseos especfficos tales como GDF-5 o diferentes protefnas morfogeneticas oseas (PMO). Estos factores proteicos tienen un efecto osteoinductor que, sin embargo, solo pueden ejercer si se utilizan en forma inmovilizada. En la bibliograffa se describen fosfatos de calcio, colageno y colageno mineralizado (fosfato de calcio que contiene colageno) como soportes (hidroxiapatita y FTC beta) (Hotz, 1994), apatita hidroxflica procedente de extractos de algas (Gao, 1996), extractos oseos (Gombotz, 1996) y colageno (Friess, 1999). Los analisis de la potencia de los soportes recubiertos, que estan descritos en la bibliograffa, no presentan un aspecto uniforme, sino que muestran variaciones significativas que son una consecuencia del tipo de soporte seleccionado o del metodo de recubrimiento (Terheyden et al. (1997)). Se describen varios metodos. En el documento WO 98/21972, se logra el recubrimiento mediante la precipitacion rapida de GDF-5 sobre FTC beta, disolviendo primero el GDF-5 en un disolvente organico y precipitandolo despues anadiendo agua. Sin embargo, debido a la toxicidad de muchos disolventes, no se prefiere un procedimiento de este tipo para la produccion de composiciones farmaceuticas. Lind et al. (1996) llevan a cabo el recubrimiento de diversos materiales ceramicos de fosfato de calcio en presencia de gelatina (obtenida normalmente a partir de huesos de animales bovinos o cerdos) como protefna de proteccion. Sin embargo, debido al aumento del riesgo de infeccion, debe evitarse el uso de sustancias animales para la produccion de composiciones farmaceuticas y especialidades farmaceuticas. Friess et al. (1999) y Gao et al. (1996) describen el recubrimiento de colagenos con PMO-2. Sin embargo, debido a la baja resistencia a la compresion de los colagenos, tales soportes no son adecuados para todas las indicaciones. Esto se aplica particularmente a las indicaciones en las que el hueso recien formado tiene que sostener una carga de presion posterior. Ademas, hasta ahora las calidades farmaceuticas del colageno solo estan disponibles a partir de fuentes animales. El documento DE 196 47 853 describe implantes oseos que comprenden una matriz de fosfato de calcio recubierta con protefna (por ejemplo, PMO, GDF). Dichos implantes se utilizan para el aumento oseo tras defectos artificiales, defectos oseos tras la extirpacion de quistes o tumores, para tratar enfermedades del disco intervertebral y para la elevacion del seno.

El documento US 5.385.887 describe formulaciones de protefnas morfogeneticas oseas que se dice que han mejorado la solubilidad y/o la estabilidad. Se describe que dicha mejora de la solubilidad y estabilidad se logra utilizando una composicion de sacarosa, glicina y acido glutamico.

El documento US 5.422.340 describe discos de fosfato tricalcico impregnados con FCT-beta 1 y Alam et al., Biomaterials 22 (2001), 1643-1651 describe materiales ceramicos de fosfato de calcio bifasico impregnados con protefna morfogenetica osea humana recombinante.

Por tanto, aunque diversos artfculos describen el uso de soportes recubiertos con protefna para el aumento oseo, no se dispone de metodos eficaces y fiables para la fabricacion y la utilizacion para el tratamiento de los defectos oseos, aunque no obstante son sumamente deseables.

Por tanto, el problema tecnico que subyace a la presente invencion es proporcionar metodos de produccion de un dispositivos para tratar de manera eficaz y fiable defectos oseos que comprendan el aumento oseo.

El problema tecnico se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

En consecuencia, la presente invencion se refiere a un metodo de produccion de un dispositivo que tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras in vivo que comprende un soporte que contiene fosfato de calcio y una protefna osteoinductora, que bien es GDF-5 o PMO-2 y en el que dicho soporte esta completamente recubierto

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con dicha protefna osteoinductora y en el que cantidades esencialmente identicas de dicha protefna osteoinductora estan presentes en todas y cada una de las zonas de la superficie de dicho soporte, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(a) proporcionar una disolucion que comprende protefna osteoinductora disuelta y un tampon que contiene un acido debil que tiene un valor de pK entre 3 y 7, preferiblemente entre 4 y 6, aunque dicha disolucion carece de sustancias toxicas, manteniendo dicho tampon dicha protefna disuelta durante un tiempo suficiente para permitir el recubrimiento homogeneo de un soporte que contiene fosfato de calcio cuando se pone en contacto con dicho soporte y pudiendo equilibrar dicho tampon el incremento de pH producido por el contacto de la disolucion tampon con el soporte de fosfato de calcio de modo que la protefna no precipita inmediatamente debido a dicho incremento de pH;

(b) poner en contacto la disolucion de la etapa (a) con un soporte que contiene fosfato de calcio;

(c) permitir el recubrimiento homogeneo de la superficie de dicho soporte con dicha protefna disuelta; y

(d) secar el soporte recubierto obtenido en la etapa (c).

En tanto que las realizaciones o caracterfsticas especfficas de la presente descripcion no estan o ya no estan cubiertas por la redaccion o redaccion de las reivindicaciones, esto no es una eleccion ni tampoco una exencion con respecto a realizaciones que actuan de forma identica.

El termino “dispositivo”, tal como se utiliza segun la presente invencion, se refiere a una entidad que comprende al menos dos componentes. Uno de dichos componentes es una matriz de soporte. Preferiblemente, dicha matriz de soporte consiste en materiales ceramicos inorganicos. Dichos materiales ceramicos tienen una superficie particularmente elevada debido a la presencia de macroporos y microporos. Preferiblemente, dichos macroporos tienen un diametro de aproximadamente 100 a 400 nm, mientras que los microporos tienen un diametro inferior a 10 nm. Mas preferiblemente, dicho soporte es un fosfato de calcio tal como se hace referencia mas adelante.

Otro componente de dicho dispositivo es una protefna o polipeptido que tiene propiedades osteoinductoras (es decir, GDF-5 o PMO-2), tal como se explicara en detalle mas adelante. La protefna o polipeptido se inmoviliza sobre la superficie del soporte. Las protefnas y los polipeptidos osteoinductores aplicados segun la presente invencion tienen una afinidad particularmente alta por las matrices de soporte inorganicas, tales como el fosfato de calcio. Preferiblemente, la union de dicha protefna o polipeptido al soporte es reversible. De este modo, se permite la disolucion de dicha protefna una vez que el dispositivo se ha llevado a un entorno adecuado in vivo, tal como una cavidad osea. Preferiblemente, dicha disolucion de las protefnas es de liberacion lenta, lo que permite la difusion de la protefna en el tejido que rodea al dispositivo. Por tanto, el dispositivo sirve como una fuente in vivo para protefnas osteoinductoras que se liberan lentamente y que pueden distribuirse eficazmente de esta manera en los tejidos circundantes o tener un efecto en la forma inmovilizada.

Ademas, el dispositivo puede comprender excipientes adicionales. Estos excipientes sirven para la estabilizacion de la protefna, por ejemplo, sacaridos, aminoacidos, polioles o detergentes, o para el mantenimiento del pH, por ejemplo, sustancias tampon. Los excipientes preferidos englobados por esta invencion se tratan en detalle mas adelante.

El termino “osteoinductor” se refiere a la capacidad de transformacion de las celulas madre mesenquimatosas en osteoblastos y condrocitos. Un requisito previo para la osteoinduccion es una serial que se distribuye por el dispositivo hacia los tejidos circundantes en los que los precursores de osteoblastos mencionados anteriormente llegan a activarse. Osteoinduccion, tal como se utiliza en el presente documento, engloba la diferenciacion de las celulas mesenquimatosas en las celulas precursoras oseas, los osteoblastos. Ademas, la osteoinduccion tambien comprende la diferenciacion de dichos osteoblastos en osteocitos, las celulas maduras del hueso. Ademas, tambien se engloba en la osteinduccion, la diferenciacion de las celulas mesenquimatosas en condrocitos. En particular, en los huesos largos, los condroblastos y los condrocitos que se alojan en el pericondrio del hueso tambien pueden diferenciarse en osteocitos. Por tanto, la osteoinduccion requiere la diferenciacion de celulas no diferenciadas o menos diferenciadas en osteocitos que pueden formar el hueso. Por tanto, un requisito previo para la osteoinduccion es una serial que se distribuye por el dispositivo hacia los tejidos circundantes, en los que residen normalmente los precursores de los osteocitos mencionados anteriormente. Tal como se ha descrito anteriormente, las protefnas osteoinductoras utilizadas segun la presente invencion se liberan lentamente desde el dispositivo tras el implante y se distribuyen eficazmente en los tejidos circundantes. Ademas, las protefnas y los polipeptidos englobados por la presente invencion tienen propiedades osteoinductoras in vivo. Por ejemplo, es bien conocido en la tecnica que la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (FCT-P) engloba miembros que tienen propiedades osteoinductoras. Los miembros individuales de dicha superfamilia de FCT-p que tienen propiedades osteoinductoras particularmente buenas se enumeran mas adelante. En conclusion, las protefnas osteoinductoras del dispositivo de la presente invencion tras haberse liberado del soporte sirven como serial osteoinductora para los precursores de los osteocitos del tejido que rodea el sitio de implantacion del dispositivo.

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El termino “osteogenico” describe la smtesis de hueso nuevo por los osteoblastos. Segun la presente invencion, el hueso preexistente en los alrededores del sitio de implantacion del dispositivo crece en el dispositivo utilizando la estructura del dispositivo como una matriz sobre la que pueden adherirse los osteocitos.

El termino “soporte” engloba matrices tridimensionales, tales como los materiales ceramicos a los que se hizo referencia anteriormente. Ademas, tal como se describio anteriormente, dicho soporte tiene preferiblemente una superficie ampliada debido a la formacion de macro y microporos. El material de soporte tiene una alta afinidad por las protefnas osteoinductoras, aunque no obstante permite la liberacion de dichas protefnas in vivo. Segun la presente invencion, dicho soporte es, preferiblemente, un fosfato de calcio. El soporte comprendido en el dispositivo de la invencion puede llevarse a una forma adecuada para la administracion del dispositivo in vivo, tal como materiales ceramicos en forma de granulos, bloques, cubos, cementos y pastas amorfas. Ademas, el soporte puede recubrirse sobre una superficie metalica.

El termino “fosfato de calcio” engloba composiciones que comprenden iones calcio, iones fosfato y, opcionalmente, otros iones o atomos que son adecuados para el soporte de la presente invencion. Los fosfatos de calcio, tal como se utilizan segun la presente invencion, son cristales que tienen una estructura tridimensional adecuada para el dispositivo de la presente invencion, tal como se explico anteriormente. Mas adelante se facilita una lista de fosfatos de calcio preferidos y bien conocidos.

El termino “protema osteoinductora”, tal como se explico anteriormente, se refiere a miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (FCT-P) que tienen propiedades osteoinductoras, tal como el factor de crecimiento y diferenciacion 5; vease mas adelante. Estas protefnas osteoinductoras muestran una alta afinidad por los fosfatos de calcio. El fosfato de calcio puede estar presente, por ejemplo, en la forma de FTC beta, FTC ALFA o hidroxiapatita. Dependiendo de los macroporos (100 - 400 nm) y los microporos (< 10 nm), estos minerales inorganicos absorben disoluciones acuosas. Durante este proceso, protefnas tales como GDF-5 o PMO-2 se adsorben fuertemente sobre la superficie del soporte. Una condicion previa importante para este proceso es una solubilidad suficiente de las protefnas en la disolucion de recubrimiento.

El termino “recubierto homogeneamente” significa que la superficie del soporte esta totalmente recubierta con dicha protefna osteoinductora, por lo que estan presentes cantidades esencialmente identicas de protefna en todas y cada una de las zonas de la superficie de dicho soporte. Un soporte recubierto homogeneamente segun esta invencion muestra, preferiblemente, una cobertura maxima con la protefna osteoinductora sobre su superficie. El recubrimiento homogeneo es un requisito previo para la liberacion eficaz y la distribucion homogenea y para la actividad de la protefna osteoinductora en el tejido que rodea al sitio de implantacion. Ademas, ha de entenderse que las protefnas osteoinductoras no estan agregadas y estan parcial o totalmente inactivadas debido a precipitacion o a microprecipitacion, en su lugar, el recubrimiento homogeneo debe lograr la union de protefnas no agregadas y biologicamente activas. Dicho recubrimiento homogeneo puede lograrse mediante el metodo de la presente invencion y se describe en los ejemplos adjuntos. Ademas, se describen medios y metodos para controlar el recubrimiento homogeneo, la cuantificacion y la caracterizacion de la protefna inmovilizada en los ejemplos adjuntos.

Ventajosamente, se ha encontrado segun la presente invencion que el dispositivo descrito anteriormente de la presente invencion tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras mejoradas y fiables in vivo tras la implantacion en un sujeto, preferiblemente un ser humano. Un requisito previo para un dispositivo de este tipo es un recubrimiento homogeneo del soporte con una protefna osteoinductora, no agregada y biologicamente activa. Se ha encontrado que incluso la agregacion producida por microprecipitacion conduce a un recubrimiento no homogeneo, dando como resultado al menos la disminucion significativa de las propiedades osteoinductoras, tal como se describe para otros dispositivos en la tecnica anterior, por ejemplo, en el documento WO98/21972. Ademas, se ha encontrado que pueden evitarse efectos secundarios no deseados, tales como reacciones toxicas y de inflamacion del sujeto tras la implantacion mediante el dispositivo de la presente invencion que carece de impurezas toxicas o contaminantes infecciosos. En particular, el uso de protefnas de proteccion (tales como por ejemplo, gelatina) como mediadores de solubilidad es totalmente innecesario para el dispositivo de la presente invencion.

La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de un dispositivo de la presente invencion que tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras in vivo, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una disolucion que comprende protefna osteoinductora disuelta y un tampon que contiene un acido debil que tiene un valor de pK entre 3 y 7, preferiblemente entre 4 y 6, aunque dicha disolucion carece de sustancias toxicas, manteniendo dicho tampon dicha protefna disuelta durante un tiempo suficiente para permitir el recubrimiento homogeneo de un soporte que contiene fosfato de calcio cuando se pone en contacto con dicho soporte y pudiendo equilibrar dicho tampon el incremento de pH producido por el contacto de la disolucion tampon con el soporte de fosfato de calcio de modo que la protefna no precipita inmediatamente debido a dicho incremento de pH;

(b) poner en contacto la disolucion de la etapa (a) con un soporte que contiene fosfato de calcio;

(c) permitir el recubrimiento homogeneo de la superficie de dicho soporte con dicha protefna disuelta; y

(d) secar el soporte recubierto obtenido en la etapa (c).

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Las definiciones de los terminos utilizados para describir el dispositivo de la invencion se aplican, cambiando lo que se deba cambiar, al metodo anteriormente mencionado y a los metodos a los que se hace referencia mas adelante.

El termino “secar” engloba los medios para eliminar Ifquidos, tal como una disolucion tampon en exceso, que todavfa estan presentes tras recubrir el soporte con la protefna osteoinductora. Preferiblemente, el secado se logra mediante secado a vacfo o liofilizacion.

El termino “tampon que mantiene dicha protema disuelta durante un tiempo para permitir el recubrimiento homogeneo” se refiere a un tampon en el que las protefnas osteoinductoras pueden disolverse eficazmente y que puede equilibrar el aumento de pH producido al poner en contacto la disolucion tampon con el soporte de fosfato de calcio, de manera que la protefna no precipite inmediatamente, por ejemplo, debido a un aumento de pH. La persona experta en la tecnica puede componer dicho tampon basandose en la solubilidad de la protefna osteoinductora que depende del pH, la fuerza ionica y la influencia del soporte sobre dichos parametros tras poner en contacto el soporte con dicha disolucion tampon. Segun la presente invencion, se ha encontrado que un tampon adecuado para el metodo de la presente invencion comprende una sustancia tampon en una baja concentracion, un acido debil, un alcohol o un sacarido.

Una ventaja de la presente invencion es el recubrimiento homogeneo que se logra mediante la limitacion del aumento del pH de la disolucion de recubrimiento durante el proceso de recubrimiento. El proceso descrito permite la distribucion homogenea y la inmovilizacion de la protefna osteoinductora en dicho soporte. Ademas, la eficacia del proceso de recubrimiento se mantiene mediante el soporte debido a las fuerzas capilares que resultan de la presencia de numerosos macro y microporos que debido a su tamano pueden absorber la disolucion en los poros. Ademas, a diferencia de otros metodos descritos en la tecnica, por ejemplo, en el documento WO98/21972, la protefna o polipeptido osteoinductor se aplica, segun el metodo de la presente invencion, mediante la union a los soportes, en lugar de mediante precipitacion o microprecipitacion. Estos hallazgos en que se basa la presente invencion, demuestran que la agregacion de las protefnas puede evitarse mediante el uso de aditivos adecuados, tal como se describe en el presente documento. Una condicion previa importante es el conocimiento de la solubilidad de la protefna osteoinductora dependiente del valor de pH, la fuerza ionica y las superficies presentes. La ralentizacion del aumento del pH producido por el contacto de la disolucion de recubrimiento con los fosfatos de calcio que reaccionan de una manera alcalina, en particular, desempena un importante papel durante el recubrimiento. Ventajosamente, mediante el metodo de la presente invencion tiene lugar la distribucion uniforme a traves de la superficie interna del material de soporte y la capacidad de unirse a las superficies antes de una precipitacion inducida por el pH de dicha protefna. Podrfa demostrarse que el aumento de pH que se produce durante el recubrimiento de los fosfatos de calcio se decelera suficientemente mediante el uso de un acido debil, tal como el acido acetico. Ademas, la adicion de combinaciones organicas tales como sacarosa demuestra ser adicionalmente ventajosa. Ademas, una fuerza ionica baja es una condicion previa importante para el recubrimiento satisfactorio. Ademas, las pruebas demuestran que tambien el volumen de la disolucion de recubrimiento tiene un efecto considerable sobre la calidad del recubrimiento. Finalmente, el metodo de la presente invencion se dirige a evitar disolventes organicos perjudiciales, tales como el acetonitrilo, que se utilizan habitualmente en los metodos descritos en la tecnica. Al evitar dichos disolventes organicos perjudiciales, pueden mejorarse el perfil de seguridad y la tolerancia local del dispositivo de la presente invencion.

En una realizacion preferida del metodo de la invencion, dicho tampon tiene una concentracion de tampon inferior a 100 mmol/l, inferior a 50 mmol/l o inferior a 20 mmol/l.

El tampon contiene un acido debil. El termino “acido debil” se refiere a compuestos organicos o inorganicos que contienen al menos un atomo de hidrogeno unido de manera ionogenica. Los acidos debiles son bien conocidos en la tecnica y se describen en los libros de texto habituales, tales como Rompp, lexico de qufmica. Dichos acidos debiles que tienen bajos grados de disociacion y se describen por valores de pKa de entre 3 y 7, preferiblemente de entre 4 y 6.

Mas preferiblemente, dicho acido debil es acido acetico o acido succfnico.

En una realizacion preferida del metodo de la invencion, dicho tampon comprende sacaridos. El termino “sacaridos” engloba mono, di y polisacaridos. La estructura y la composicion de los mono, di y polisacaridos son bien conocidas en la tecnica y se describen en libros de texto habituales, tales como Rompp, lexico de qufmica.

Mas preferiblemente, dicho sacarido es un disacarido. Mas preferiblemente, dicho disacarido es sacarosa o trehalosa.

En una realizacion preferida de la invencion, dicho fosfato de calcio es fosfato tricalcico beta, fosfato tricalcico alfa, apatita o un cemento que contiene fosfato de calcio. Dichos fosfatos de calcio son particularmente muy adecuados como soportes para el dispositivo de la presente invencion. Sus propiedades in vivo se han descrito en Hotz, 1994, Gao, 1996, y en el documento WO98/21972.

Segun la invencion, dicha protefna osteoinductora es GDF-5 o PMO-2. Ambas protefnas son miembros de la familia FCT-p. Se ha demostrado que la familia FCT-p de factores de crecimiento y diferenciacion participa en numerosos procesos biologicos que comprenden la formacion de hueso. Todos los miembros de dicha familia son polipeptidos

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secretados que comprenden una estructura de dominio caracterfstico. En el propio extremo N-terminal, los miembros de la familia de FCT-p comprenden un peptido senal o secuencia lider de secrecion. Esta secuencia va seguida, en el extremo C-terminal, por el prodominio y por la secuencia del polipeptido maduro. La secuencia del polipeptido maduro comprende siete cistefnas conservadas, seis de las cuales son necesarias para la formacion de enlaces disulfuro intramoleculares, mientras que otra es necesaria para la dimerizacion de dos polipeptidos. El miembro de la familia FCT-p biologicamente activo es un dfmero, compuesto preferiblemente por dos polipeptidos maduros. Los miembros de la familia FCT-p se secretan normalmente como proprotefnas que comprenden, ademas de la secuencia madura, el prodominio. Los prodominios se escinden extracelularmente y no forman parte de la molecula de senalizacion. Sin embargo, se ha informado de que el (los) prodominio(s) pueden necesitarse para la estabilizacion extracelular de los polipeptidos maduros.

En el contexto de la presente invencion, el termino “miembro de la familia FCT-p” o las protemas de dicha familia a las que se hace referencia mas adelante, abarcan todas las variantes biologicamente activas de dichas protefnas o miembros de todas las variantes, asf como sus precursores inactivos. Por tanto, las protefnas que comprenden simplemente la secuencia madura, asf como las protefnas que comprenden la protefna madura y el prodominio o la protefna madura, el prodominio y la secuencia lider, estan dentro del alcance de la invencion, asf como fragmentos biologicamente activos de las mismas. Si un fragmento de un miembro de FCT-p tiene actividad biologica puede determinarse facilmente mediante ensayos biologicos descritos, por ejemplo, en: Katagiri T, Yamaguchi A, Ikeda T, Yoshiki S, Wozney JM, Rosen V, Wang EA, Tanka H, Omura S, Suda T, (1990): The non-osteogenic mouse pluripotent cell line, C3H10T1/2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295-299 o Nishitoh H, Ichijo H, Kimura M, Matsumoto T, Makishima F, Yamaguchi A, Yamashita H, Enomoto S, Miyazono K (1996): Identification of type I and type II serine/threonine kinase receptors for growth/differentiation factor-5. J. Biol. Chem. 271: 21345-21352.

Preferiblemente, la actividad biologica segun la invencion puede determinarse mediante modelos in vivo, tal como se describe en los ejemplos adjuntos. Ademas, en la presente invencion se engloban variantes de los miembros de FCT-p que tienen secuencias de aminoacidos que son identicas en al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% a las secuencias de aminoacidos de los miembros de la familia FCT-p.

Un resumen de los miembros de la superfamilia FCT-p se facilita en: Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-37. Las secuencias de aminoacidos de los miembros de la familia FCT-p pueden obtenerse a partir de bases de datos bien conocidas, tales como Swiss-Prot a traves de Internet (
http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html). Las secuencias de aminoacidos para PMO-2 y GDF-5, miembros de la familia FCT-p con un potencial osteoinductor particularmente alto, tambien se muestran en SEQ ID N°: 1 a 3, respectivamente.

La PMO-2 es un miembro de la subfamilia de PMO. Se ha demostrado que los miembros de la subfamilia de la protefna morfogenetica osea (PMO) participan, entre otros, en la induccion y la remodelacion del tejido oseo. Las PMO se aislaron originalmente de la matriz osea. Estas protefnas se caracterizan por su capacidad para inducir nueva formacion osea en sitios ectopicos. Varios estudios in vivo demostraron la potenciacion de la osteogenesis y la condrogenesis de las celulas precursoras por las PMO y el aumento de la posibilidad de que cada molecula de PMO desempene un papel distinto durante el desarrollo del esqueleto. Mas detalles acerca de las propiedades moleculares y biologicas de las PMO se describen en: Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-27, Schmitt J, Hwang K, Winn, SR, Hollinger J (1999): Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. J Orthop Res 17: 269-278 y Lind M (1996): Growth factors: possible new clinical tools. A review. Acta Orthop Scand 67: 407-17.

La secuencia de aminoacidos para la preproforma de PMO-2 se deposita con el numero de registro P12643 de Swiss-Prot y se muestra mas adelante. Los aminoacidos 1 a 23 corresponden a la secuencia senal, los aminoacidos 24 a 282 corresponden al propeptido y los aminoacidos 283 a 396 corresponden a la protefna madura. Preferiblemente, PMO-2 se refiere a la preproforma, a la proforma o al peptido PMO-2 maduro, respectivamente. Ademas, tambien se engloban fragmentos de dichas protefnas que tienen esencialmente la misma actividad biologica, preferiblemente propiedades osteoinductoras. Mas adelante se facilita mas informacion sobre las secuencias para PMO-2.

Tambien se ha demostrado que el factor de crecimiento y diferenciacion (GDF) participa, entre otros, en la induccion y la remodelacion del tejido oseo. El factor de crecimiento y diferenciacion 5 (GDF-5), tambien conocido como protefna morfogenetica derivada del cartflago 1 (CDMP-1) es un miembro del subgrupo de la familia PMO, que tambien incluye otras protefnas relacionadas, preferiblemente, GDF-6 y GDF-7. La forma madura de la protefna es un homodfmero de 27 kDa. Varios estudios in vivo e in vitro demuestran el papel de GDP-5 durante la formacion de diferentes caracterfsticas morfologicas en el esqueleto de los mamfferos. Las mutaciones de GDF-5 son responsables de anomalfas en el esqueleto, incluyendo la disminucion de la longitud de los huesos largos de las extremidades, el desarrollo anomalo de las articulaciones en las extremidades y el esternon (Storm y Kingsley

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(1999), Development Biology, 209, 11-27). La secuencia de aminoacidos entre el raton y el ser humano esta altamente conservada.

La secuencia de aminoacidos para la preproforma de GDF-5 esta depositada con el numero de registro P 43026 en Swiss-Prot o se muestra en la SEQ ID N°: 3. Los aminoacidos 1 a 27 corresponden a la secuencia lfder, los aminoacidos 28 a 381 corresponden a la proforma y los aminoacidos 382 a 501 corresponden a la protefna madura. Preferiblemente, GDF-5 se refiere a la preproforma, a la proforma o al peptido GDF-5 maduro. Ademas, tambien se engloban los fragmentos de GDF-5 que tienen esencialmente la misma actividad biologica, preferiblemente propiedades osteoinductoras. Mas preferiblemente, dicho fragmento comprende los aminoacidos 383 a 501 de la secuencia mostrada en SEQ ID N°: 3.

Segun la invencion, el tampon carece de sustancias toxicas.

El termino “sustancias toxicas”, preferiblemente, engloba aquellos aditivos y disolventes organicos toxicos que se utilizan en los metodos descritos en la tecnica, por ejemplo, el acetonitrilo. Dichas sustancias pueden producir inflamacion y otras reacciones tras la implantacion de los dispositivos que contienen dichas sustancias. Dichos dispositivos son terapeuticamente menos aceptables debido a dichos efectos secundarios no deseados que no pueden evitarse mediante los metodos de recubrimiento descritos en la tecnica. Ademas, la directriz internacional para el desarrollo de protefnas terapeuticas exige que deben evitarse sustancias toxicas y perjudiciales en el proceso de fabricacion (para mas detalles vease: Conferencia Internacional sobre Armonizacion (ICH), Tema Q3C;
www.emea.eu.int/). Sin embargo, el dispositivo que es obtenible mediante el metodo de la presente invencion carece ventajosamente de dichas sustancias toxicas y, por tanto, es terapeuticamente muy aceptable y cumple los requisitos de las autoridades normativas.

Ademas, en otra realizacion preferida del metodo de la invencion, dicho dispositivo carece de material infeccioso.

Ademas de las sustancias toxicas, el material infeccioso comprendido en el dispositivo puede producir infecciones graves en un sujeto en el que se ha trasplantado el dispositivo. Sin embargo, se utiliza gelatina potencialmente infecciosa derivada de huesos bovinos o porcinos como una protefna de proteccion en muchos metodos del estado de la tecnica (Und, 1996).

El producto que es obtenible mediante el metodo de la invencion puede formularse como una composicion farmaceutica o un dispositivo medico. La composicion de dicho producto puede comprender compuestos adicionales, como estabilizantes, sustancias tampon y otros excipientes. La cantidad del producto obtenible mediante la presente invencion aplicado al paciente se determinara por el medico que le atienda y otros factores clfnicos; preferiblemente segun cualquiera de los metodos descritos anteriormente. Tal como se conoce bien en las tecnicas medicas, la cantidad aplicada a un paciente depende de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el area de superficie corporal, la edad, el sexo, el momento y la via de administracion, la salud general y otros farmacos que se le esten administrando simultaneamente. El progreso puede monitorizarse mediante la evaluacion periodica.

Gracias a la presente invencion, es posible tratar varios defectos oseos que incluyen cavidades grandes. En particular, las cavidades grandes no podfan tratarse eficazmente o solo con la utilizacion de material de hueso autogeno. Sin embargo, debido a las propiedades osteoinductoras y osteoconductoras fiables y eficientes del dispositivo que se puede obtener mediante el metodo de la invencion, el tratamiento de los defectos oseos que requiere la reparacion o un aumento oseo importante es ahora posible sin una segunda cirugfa.

El dispositivo que es obtenible mediante el metodo de la invencion se puede usar para la preparacion de una composicion farmaceutica que va a utilizarse para el aumento oseo.

Las definiciones de los terminos a los que se hizo referencia anteriormente se aplican, cambiando lo que se deba cambiar, al uso mencionado anteriormente de la presente invencion y los descritos mas adelante.

El termino “aumento oseo” se refiere a la formacion terapeutica de hueso, que esta indicada con el fin de tratar defectos oseos, cavidades en huesos, o enfermedades y trastornos acompanados por perdida de tejido oseo o para preparar el entorno posterior de un implante. Las enfermedades y trastornos descritos a continuacion son bien conocidos en la tecnica y se describen en detalle en libros de texto medicos habituales, tales como Pschyrembel o Stedman.

Preferiblemente, dicho aumento oseo sigue a defectos por traumatismo, cancer o artificiales.

El dispositivo que es obtenible mediante el metodo de la invencion tambien se puede usar para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar defectos oseos.

Mas preferiblemente, dichos defectos oseos son defectos en los huesos largos o defectos oseos tras apicoectomfa, extirpacion de quistes o tumores, extraccion de dientes o extraccion quirurgica de dientes retenidos.

La invencion tambien se refiere al uso del dispositivo de la invencion o de un dispositivo que es obtenible mediante el metodo de la invencion para llenar cavidades y para la regeneracion de tejido guiada por soporte en periodontologfa.

El dispositivo que es obtenible mediante el metodo de la invencion para la preparacion de una composicion 5 farmaceutica que va a utilizarse para la elevacion del piso sinusal, el aumento de la cresta maxilar y mandibular atrofiada y la estabilizacion de los implantes inmediatos.

Tambien dentro del alcance de la presente invencion esta un metodo de preparacion del dispositivo segun la reivindicacion 1 para tratar una o mas de las enfermedades a las que se hace referencia segun los usos de la presente invencion, en el que dicho metodo comprende al menos la etapa de administrar el dispositivo de la 10 invencion o un dispositivo que se puede obtener mediante el metodo de la invencion en una forma farmaceuticamente aceptable a un sujeto. Preferiblemente, dicho sujeto es un ser humano.

Las tablas siguientes muestran las secuencias de aminoacidos para PMO-2 y GDF-5:

PMO-2 humana (numero de registro prim. de Swiss-Prot: P12643); SEQ ID N° 1:

Clave

Desde Hasta Longitud

SENAL

1 23 23

PROPEP

24 282 259

hPMO-2

283 396 114

10 20 30 40 50

I I I I I

MOAJGTRCLIA LLLPQULLGG AAGLVPELGR RKFAAASSGR PSSQPSDEVL 70 GO 30 LOO L10

I I I I I

FGLKQRFTP5 KDAWPPYML ELYRRHSGQP GSPAPDHRIiE HAkSftAfTTVR 130 140 L50 160 170

I I I I I

LPETSGKTTR RFFFNLSSIF TEEFIT5AEL, QVFREQMQQA LGNNSSFHKR

190 200 210 220 230

I I I I i

TAHSKFPVTR LLDTRLVNQN ASRWESPEWT PAVMRWTAQG HAWHGFWEV 250 2S0 270 200 200

I I I I I

KJHTVRIS&SL HQOEHSWSQI RPLLVTFGHD GKGHPLHKRE KRQAKH3TORK 310 320 330 340 350

I I I I I

LYVDPSUV'GW WEWIVAFFGY HAFYCHGECP FPUUOHLKET HHAIVQTLVH 370 300 390

i ] I

CVPTElrSAIS E1LYUJEHEKV VLKWYQDWV EGOGCR 15

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60

I

SEFELFLLSM

120

SFHHEESLEE

100

1

INTYEIIKPA

240

I

AKLEEKQGVS

300

I

RLKSSCKRHP

360

I

EVN3KIFK&C

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GDF-5 humano (numero de registro prim. de Swiss-Prot: P 43026); SEQ ID N° 3:

Clave

Desde Hasta Longitud

SENAL

1 27 27

PROPEP

28 381 354

hGDF-5

382 501 120

10 20 30 40 50 60

I I ) I f I

MRLPKLlLTFL LWYlAWLDLE FICTVLGAPD LGQRPQGSRF GLAJtAEAKER PPIABNVPRP 70 00 90 100 HD 120

I i I J ! I

GGHSYGGGAT NAHARAKGGT GQTGGLTQPK KDEPKELFFR FtHJPEPKPGH PFQXRQhTOR 130 140 150 160 170 ISO

I ] I I I |

TVTFKGQLPG GRAPPKAGSV PSSFLLKKAR EFGFPKEPKE PFRPPPITPH EYHLSLYRTL

190 200 210 220 230 240

I I i I I

5DADRKGGNS 5VKLEAGLAN TITSFIDKGQ DDRjGPWRKQ RYVFUISAIjE KDGLLGAEUt

250 260 . 270 280 290 300

I I I I I I

ILRKKPSDTA KPAVPRSRAA AQLKLSSCPS GRQPAALEDV RSVPOLDGSG WEVTDUfKLF

310 320 330 340 350 360

i I i i — r t

ENFKNSAQLC LELEAJWERGK TVDLRGLGFD RAAflQVHEKA LFLVFGRT’KK kulffneika

370 300 390 400 410 420

] I I I i j

RSGQDDKTVY EYLFSQHEKR RAPLATRQGK RPSKNUKARC SKKALHVNTE BMGWDDWIIA

430 440 450 460 470 480

[ J I I i I

PLEYEAFHCE GLCEFPLRSH EEFTUHAVIQ TLiMSMDPES TPFTCCVPTR LSPISILFID

490 500

I I

SAHNWYKCfY edmvvescgc r 5

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10

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20

25

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45

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Las figuras muestran:

Figura 1: Solubilidad de GDF-5 en acido acetico 5 mM, H3PO4 5 mM /NaOH, NaCl 150 mM a diferentes valores de pH.

Figura 2: Solubilidad de GDF-5 en arginina 20 mM / acido acetico a diferentes valores de pH.

Figura 3: Solubilidad de GDF-5 en dos tampones que tienen diferentes fuerzas ionicas y valores de pH (HAc = acido acetico).

Figura 4: Aumento del pH durante el recubrimiento en presencia de HCl 10 mmol/l.

Figura 5: Aumento del pH en presencia de acetonitrilo al 75%.

Figura 6: Dependencia del pH de las disoluciones de recubrimiento que tienen diferentes concentraciones de acido acetico durante el recubrimiento.

Figura 7: Homogeneidad de la distribucion de GDF-5 sobre FTC beta (100 pg de GDF-5 sobre 100 mg de FTC beta) lograda por el recubrimiento en presencia de acido acetico 10 mmol/l con (derecha) y sin sacarosa (izquierda).

Figura 8: Homogeneidad de la distribucion de GDF-5 sobre FTC beta (100 pg de GDF-5 sobre 100 mg de FTC beta) lograda por el recubrimiento en presencia de glicina 20 mmol/l / NaOH, pH 10.

Figura 9: Analisis histomorfometrico de un implante recubierto en presencia de glicina 20 mmol/l / NaOH, pH 10. Figura 10: Homogeneidad de la distribucion de rhPMO-2 sobre FTC beta.

Figura 11: Homogeneidad de la distribucion de GDF-5 sobre FTC beta lograda por el recubrimiento en presencia de sacarosa (izquierda) y trehalosa (derecha).

La invencion se describira ahora mediante la referencia a los siguientes ejemplos biologicos que son meramente ilustrativos y no se interpretan como una limitacion del alcance de la presente invencion.

Ejemplo 1: Cuantificacion de GDF-5 en disolucion por RP-HPLC

El contenido de GDF-5 se determino mediante analisis de HPLC en fase inversa (RP). Se analizaron alfcuotas de la muestra utilizando una columna Poros C8-18 (R2/10, 2,1* 30 mm, Applied Biosystems). Se utilizo acido formico al 0,1% en acetonitrilo al 21% (disolvente A) y acido formico al 0,1% en acetonitrilo al 84% (disolvente B) como disolventes a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min. El perfil de elucion se registro midiendo la absorbancia a 220 nm. Las cantidades de GDF-5 se calcularon a partir del area de pico a 220 nm utilizando una curva patron.

Ejemplo 2: Extraccion y cuantificacion de la protefna inmovilizada

Metodo A:

Se suspendio FTC beta recubierto (40 mg) en 700 pl de matriz de disolucion (acido cftrico 1,22 mol/l, HCl 1,22 mol/l, urea 8 mol/l) y se incubo durante 60 min. a 4°C. Tras la centrifugacion (13200*g, 2 min) se analizaron 50 pl del sobrenadante mediante RP-HPLC (vease el ejemplo 1). La curva patron se tomo con diversas cantidades de GDF-5 en la disolucion de matriz respectiva.

Metodo B:

Se suspendio FTC beta recubierto (40 mg) en 700 pl de matriz de disolucion (Tris 10 mmol/l / HCl, pH 7,4, urea 8 mol/l, EDTA 100 mmol/l) y se incubo durante 60 min. a 4°C y se centrifugo (5 min. a 13.500*g). Posteriormente, el sobrenadante se cuantifico tal como se describe en el metodo A o se analizo adicionalmente.

Ejemplo 3: Solubilidad de rhGDF-5 a diferentes valores de pH

GDF-5 se ajusta a una concentracion de 4 mg/ml en HCl 10 mmol/l. Se diluyen 1:100 alfcuotas (50 pl) de la disolucion madre con acido acetico 5 mmol/l, H3PO4 5 mmol/l / NaOH, NaCl 150 mmol/l con diferentes valores de pH cada uno. Las muestras se incubaron durante 15 min. y se centrifugaron (2 min. a 13.200*g). Se determinaron el valor del pH y el contenido de protefna en el sobrenadante. En una segunda prueba, la disolucion madre se diluyo con arginina 20 mmol/l / HOAc con diferentes valores de pH cada uno. Los datos en las figuras 1 y 2 muestran que

5

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GDF-5 en tampones con fuerza ionica baja (< 20 mmol/l) solo es soluble en una disolucion acida (pH < 5) o alcalina (> pH 10). Sin embargo, en el intervalo de pH de entre 6,0 y 9,5, la solubilidad es < 5 pg/ml.

Ejemplo 4: Solubilidad de GDF-5 en dos tampones que tienen diferente fuerza ionica a diferentes valores de PH

Se ajusta GDF-5 a una concentracion de 4 mg/ml en HCl 10 mmol/l. Se diluyen 1:100 alfcuotas (50 pl) de la disolucion madre con acido acetico 10 mmol/l /NaOH y con acido acetico 5 mmol/l, H3PO4 5 mmol/l / NaOH, NaCl 150 mmol/l con diferentes valores de pH cada uno. Las muestras se incubaron durante 15 min. y se centrifugaron (2 min. a 13.200*g). Se determinaron el valor del pH y el contenido de protefna en el sobrenadante. Los datos en la figura 3 muestran que con todos los valores de pH medidos, la solubilidad de GDF-5 en un tampon con fuerza ionica superior, que corresponde al estado fisiologico, es significativamente inferior que en el tampon con fuerza ionica baja (aproximadamente 10 mmol/l).

Ejemplo 5: Solubilidad de GDF-5 en diferentes disolventes

Se disolvio GDF-5 liofilizado en acetonitrilo puro, se incubo durante 15 min. a temperatura ambiente y se centrifugo (13.200*g, 2 min). No pudo detectarse GDF-5 en el sobrenadante.

Se disolvio GDF-5 liofilizado (50 pg) con 50 pl de acetonitrilo al 75%, se incubo durante 15 min. a temperatura ambiente y se centrifugo (13.200*g, 2 min). En el sobrenadante, se midio el pH y se determino el contenido de GDF- 5. Se detecto el 100% del GDF-5 utilizado y el valor del pH de la disolucion era de 3,0. Posteriormente, se ajusto el valor del pH a 7,4 anadiendo NaOH, se incubo durante 15 min. a temperatura ambiente de nuevo y se centrifugo. Solo se detectaron 3 pg/ml correspondientes a una solubilidad de 60 pg/ml.

Los datos muestran que GDF-5 no es soluble en acetonitrilo puro, pero que es soluble en disoluciones acuosas acidas que contienen acetonitrilo. Segun los resultados encontrados en los sistemas acuosos, la solubilidad disminuye en mezclas de acetonitrilo - agua con el aumento del pH.

Ejemplo 6: Cambio del valor del pH de la disolucion de GDF-5 durante el recubrimiento de FTC beta

En un recipiente de reaccion, se mezclan 200 mg de FTC beta con 200 pl de una disolucion de recubrimiento que contiene GDF-5 (1 mg/ml; producida a partir de un liofilizado producido a partir de una disolucion en HCl). El valor del pH de la suspension se observa durante 30 min. Los resultados ilustrados en las figuras 4-5 muestran que tras aproximadamente 2 min, el pH de la suspension alcanza el intervalo de pH > 6,5, que es crftico para la solubilidad de GDF-5, cuando se utilizan disoluciones de recubrimiento no tamponadas tales como por ejemplo HCl 10 mmol/l o acetonitrilo al 75% (el pH acido inicial en el acetonitrilo al 75% resulta de las cantidades restantes de HCl presente). Debido a la solubilidad insuficiente, tiene lugar la precipitacion de la protefna y la formacion de agregacion, que puede detectarse mediante tincion de Coomassie (vease el ejemplo 7).

El uso de una disolucion de recubrimiento tamponada con acetato (figura 6) produce una reduccion del aumento del pH durante el recubrimiento. Mientras el pH aumenta hasta 8 en las disoluciones no tamponadas, el pH de la disolucion de recubrimiento tamponada con acetato (40-80 mmol/l) alcanza su maximo a pH 5,4. De esta forma, se garantiza una solubilidad suficiente durante el proceso de recubrimiento. El GDF-5 utilizado puede extenderse uniformemente y unirse al soporte sin que tenga lugar precipitacion (vease el ejemplo 7).

Tambien se logra un retraso del aumento del pH utilizando etanol al 60%. El retraso es suficiente para lograr una distribucion uniforme de GDF-5 a traves del soporte (vease el ejemplo 7).

Ejemplo 7: Deteccion de la homogeneidad del recubrimiento

La protefna adsorbida se hace visible tinendo con azul brillante de Coomassie sobre el soporte. La distribucion del color azul se correlaciona con la distribucion de la protefna respectiva sobre el soporte de FTC beta.

Se incuban 3-4 granulos recubiertos con 200 pl de disolucion de tincion (60% de PBS, 40% de metanol, 0,4% de azul brillante de Coomassie R250) en una cavidad de una placa de 96 pocillos y se incuban durante 30 min. a temperatura ambiente. Un soporte no recubierto se trata de la misma forma como control. El exceso de agente de tincion se elimina mediante lavado con 60% de PBS, 40% de metanol, hasta que el soporte no recubierto utilizado como control se decolora completamente. El soporte tenido se seca a 40°C y se documenta fotograficamente.

Ejemplo 8: Recubrimiento de granulos (I)

Se colocan 200 mg de FTC-p (tamano del granulo de 0,5 - 1,0 mm) en forma seca en un recipiente de vidrio 2R. La disolucion madre de rhGDF-5 (4 mg/ml en HCl 10 mM) se diluye hasta 1 pg/ml por medio del tampon de recubrimiento correspondiente. Se pipetean 200 pl de disolucion GDF-5 obtenida de esta manera sobre el FTC beta y se absorben. El material granulado humedo se incuba durante 1 hora a 25°C y despues se seca a vacfo.

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Ejemplo 9: Recubrimiento de granulos (II)

Se colocan 200 mg de FTC-p (tamano del granulo de 0,5 - 1,0 mm) en forma seca en un recipiente de vidrio 2R. La disolucion madre de rhGDF-5 (4 mg/ml en HCl 10 mM) se diluye hasta 1 pg/ml por medio del tampon de recubrimiento correspondiente. Se pipetean 200 pl de disolucion GDF-5 obtenida de esta manera sobre el FTC beta y se absorben. El material granulado humedo se incuba durante 1 hora a 25°C y despues se liofiliza.

Ejemplo 10: Recubrimiento de bloques

Un bloque de FTC beta que tiene una masa de 360 mg se coloca en un recipiente de reaccion adecuado (Eppendorf), se mezcla con 500 pl de la disolucion de recubrimiento, se incuba durante una hora y se seca a vacfo o se liofiliza.

Ejemplo 11: Comparacion de los diferentes metodos de recubrimiento

Debido al uso de disoluciones de recubrimiento tamponadas con acetato, la formacion de precipitacion pudo reducirse significativamente. Otra mejora se logro anadiendo sacarosa. La calidad del recubrimiento con y sin sacarosa se ilustra en la figura 7. Mientras que todavfa pueden reconocerse precipitados individuales como manchas de color azul oscuro sin sacarosa, el recubrimiento en presencia de sacarosa da como resultado un recubrimiento sin manchas.

La importancia de la homogeneidad del recubrimiento se aclara al comparar dos preparaciones que se produjeron durante la investigacion utilizando disoluciones de recubrimiento en etanol al 60% y glicina 20 mmol / NaOH, pH 10, respectivamente. Mientras que se logro una distribucion homogenea en presencia de etanol al 60%, tiene lugar una formacion de precipitacion significativa sobre la superficie del soporte en presencia de glicina (figura 8). Ambos soportes se compararon en un modelo de defectos en la boveda craneal de la rata (vease mas adelante).

Ejemplo 12: Modelo de defectos de espesor total en la boveda craneal en ratas

Se obtuvo FTC beta recubierto con rhGDF-5 (50 pg/25 mg de FTC beta) utilizando diferentes tampones de recubrimiento (glicina 20 mmol/l / NaOH, pH 10 (C1) y etanol al 60% (C2)). Las ratas se anestesiaron mediante inyeccion intramuscular de tiletamina - zolazepam (ZOLETIL® VIRBAC, CARROS, Francia, 50 mg/kg, i.m.). Se corto el pelo de la parte dorsal del craneo. A continuacion la piel se lavo con un jabon germicida (VETEDINE®, VETOQUINOL, LURE, Francia). El sitio quirurgico se lavo con un antiseptico, tal como povidona yodada (disolucion VETEDINE®, VETOQUINOL, LURE, Francia). Se realizo una incision de 20 mm de longitud en el cuero cabelludo a lo largo de la sutura sagital, y la piel, la musculatura y el periostio, se reflejaron dejando al descubierto los huesos parietales. Se utilizo un trepano de 6 mm (COVELY, GENAY, Francia) para crear el defecto en la parte dorsal del hueso parietal, lateral a la sutura sagital bajo irrigacion constante con solucion fisiologica esteril (AGUETTANT, LYON, Francia). Se crearon dos defectos identicos por animal. Se tuvo cuidado para evitar la lesion de la duramadre y para evitar la puncion del seno sagital superior. Una vez aplicados los implantes, el periostio y los musculos se suturaron en su sitio y se suturo el cuero cabelludo (hilo de polipropileno, ProlOne®, ETHNOR, ISSY LES MOULINEAUX, Francia).

Tras un seguimiento de 6 semanas, los animales se anestesiaron mediante inyeccion intramuscular de ZOLETIL® (50 mg/kg), despues se sacrificaron mediante la inyeccion de una dosis letal de DOLETHALND (pentobarbital sodico, VETOQUINOL, LURE, Francia).

Se tomaron muestras de los explantes y se fijaron en disolucion de formalina tamponada al 10%. A continuacion, las muestras se deshidrataron en disoluciones de alcohol de concentraciones crecientes y se incluyeron en PMMA (poli(metacrilato de metilo), Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Se obtuvo una seccion de 20 pm de espesor mediante una tecnica de microcode y molienda adaptada de Donath (Donath K. Breuner G., A method for the study of undecalcified bone and teeth with attached soft tissues. J. Oral. Pathol. 11, 318-326, 1982). Se tino una seccion con Paragon modificado para analisis cualitativo y semi-cuantitativo mediante microscopfa optica.

Las secciones histologicas se observaron utilizando un microscopio Polyvar (REICHERT) equipado con un objetivo x4, x10, x25 y x40.

Se observaron grandes cantidades de medula osea y celulas osteoblasticas en el sitio tratado con C2. Por el contrario, la formacion osea fue escasa con C1. La degradacion del material del implante tambien aumento con C2 en comparacion con C1. Para los resultados de los analisis histomorfometricos de los materiales de implante, vease la tabla 1 y la figura 9.

5

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15

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Tabla 1

Muestra

% de tejido oseo % de implante % de tejido lagunar % de tejido fibroso

C1

8,9 39,2 2,1 49,8

C2

43,4 18,5 21,4 16,7

Ejemplo 13: Recubrimiento de FTC beta con PMO-2

Se colocan 200 mg de FTC beta (tamano de granulo de 0,5 - 1,0 mm) en un recipiente de vidrio 2R. La disolucion madre de PMO-2 se diluye hasta 1 mg/ml con el tampon de recubrimiento correspondiente (acido acetico 10 mmol/l, sacarosa al 10%). Se incuban 200 pl de la disolucion de recubrimiento con FTC beta (1 h, 4°C) y se liofilizan. La distribucion de PMO-2 sobre el soporte recubierto se mostro mediante tincion de Commassie (figura 10).

Ejemplo 14: Comparacion del proceso de recubrimiento en presencia de sacarosa y trehalosa

Se colocan 200 mg de FTC beta (tamano de granulo de 0,5 - 1,0 mm) en un recipiente de vidrio 2R. La disolucion madre de GDF-5 (4 mg/ml en HCl 10 mmol/l) se diluye hasta 1 mg/ml con el tampon de recubrimiento correspondiente. Las dos variantes del tampon de recubrimiento contienen sacarosa al 10% y trehalosa al 10%, respectivamente. Se incuban 200 pl de la disolucion de recubrimiento con FTC beta (1 h, 4°C) y se liofilizan. La distribucion de GDF-5 sobre el soporte recubierto se mostro mediante tincion de Commassie (figura 11).

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5

Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

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   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de produccion de un dispositivo que tiene propiedades osteoinductoras y osteoconductoras in vivo, que comprende un soporte que contiene fosfato de calcio y una protema osteoinductora, en el que dicha protema osteoinductora bien es GDF-5 o PMO-2 y en el que dicho soporte esta completamente recubierto con dicha protema osteoinductora y en el que cantidades esencialmente identicas de dicha protema osteoinductora estan presentes en todas y cada una de las zonas de la superficie de dicho soporte, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

   (a) proporcionar una disolucion que comprende protema osteoinductora disuelta y un tampon que contiene un acido debil que tiene un valor de pK entre 3 y 7, preferiblemente entre 4 y 6, aunque dicha disolucion carece de sustancias toxicas, manteniendo dicho tampon dicha protema disuelta durante un tiempo suficiente para permitir el recubrimiento homogeneo de un soporte que contiene fosfato de calcio cuando se pone en contacto con dicho soporte y pudiendo equilibrar dicho tampon el incremento de pH producido por el contacto de la disolucion tampon con el soporte de fosfato de calcio de modo que la protema no precipita inmediatamente debido a dicho incremento de pH;

   (b) poner en contacto la disolucion de la etapa (a) con un soporte que contiene fosfato de calcio;

   (c) permitir el recubrimiento homogeneo de la superficie de dicho soporte con dicha protema disuelta; y

   (d) secar el soporte recubierto obtenido en la etapa (c).
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho tampon tiene una concentracion de tampon inferior a 100 mmol/l, inferior a 50 mmol/l o inferior a 20 mmol/l.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 2, en el que dicho acido debil es el acido acetico o el acido succmico.
4. 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho tampon ademas comprende

   sacaridos.
5. 5. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicho sacarido es un disacarido.
6. 6. El metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicho disacarido es sacarosa o trehalosa.
7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho dispositivo carece de material infeccioso.