ES2225870T3 - Dispositivo osteogenico y su procedimiento de preparacion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA RELACIONADA CON UN DISPOSITIVO OSTEOGENICO Y SU PREPARACION. DICHO DISPOSITIVO INCLUYE UNA PROTEINA MORFOGENETICA OSEA (BMP), PREFERIBLEMENTE UN COMPLEJO BMP MODIFICADO QUE PUEDE OBTENERSE MEDIANTE LA MODIFICACION DEL PROCEDIMIENTO DE EXTRACCION DE CLORHIDRATO DE GUANIDINIO CONVENCIONAL, Y COLAGENOS, PREFERIBLEMENTE COLAGENO I O COLAGENO IV, IMPREGNADO Y/O ADSORBIDO SOBRE UN VEHICULO BIOCERAMICO, PREFERIBLEMENTE UN CUERPO MODELABLE (BLOQUE) QUE SE ORIGINA A PARTIR DE UN ESQUELETO DE CORAL. TAMBIEN SE DESCRIBE EL PROCEDIMIENTO PARA AISLAR DICHO COMPLEJO BMP MODIFICADO QUE CARECE DE UN COMPONENTE INMUNOGENICO, Y QUE CONSISTE ESENCIALMENTE DE UNA PROTEINA DE 100 - 700 KD Y UNA PROTEINA DE 15 - 25 KD CON PROPIEDADES OSTEOINDUCTORAS, Y PREFERIBLEMENTE LA PROTEINA DE 15 -25 KD PRESENTA UNAS PROPIEDADES DE ALMACENAJE MEJORADAS, ASI COMO SU USO EN EL DISPOSITIVO OSTEOGENICO CON PROPIEDADES OSTEOINDUCTORAS MEJORADAS.

Description

Dispositivo osteogénico y su procedimiento de preparación.

La presente invención se refiere a un dispositivo osteogénico que comprende un complejo de proteína morfogenética ósea (BMP) modificada, así como a un método para preparar dicho complejo, que presenta propiedades osteoinductoras mejoradas. La invención se refiere asimismo a la utilización de dicho complejo de proteína para la preparación de un dispositivo osteogénico con propiedades mejoradas.

Es un gran desafío en los campos de la cirugía ortopédica y periodontal encontrar sistemas para tratar pacientes que presentan trastornos y deformaciones esqueléticas, incluyendo la reparación de grandes defectos óseos originados por trauma, extirpación de tumores y malformaciones congénitas, reconstruir densidades óseas desgastadas por una endoprótesis implantada en operaciones de revisión y en fracturas de cicatrización retrasada o no unidas.

Los injertos óseos cancelosos autogénicos obtenidos de hueso humano han sido hasta el momento, la alternativa más fiable y efectiva para la sustitución ósea. Sin embargo, su restringida disponibilidad, el sufrimiento causado por la cirugía de explantación y el riesgo de transmisión del virus de la inmunodeficiencia humana y otras complicaciones han limitado su utilización clínica extensiva. También se han dado a conocer incidencias elevadas de fractura por estrés, no unión y falta de incorporación de injertos óseos cancelosos a medida que se incrementan los tamaños de defecto. Los materiales sintetizados que se han comercializado sólo pueden utilizarse como material de relleno o andamiaje de soporte sin actividad biológica de iniciación de la regeneración ósea. Un sustituto óseo deseable, tal como el buscado por investigadores y médicos clínicos podría ser una reconstitución de material sintético que poseyese una composición química, arquitectura geométrica, integridad mecánica y biocompatibilidad similares a las de la masa principal del hueso vivo, siendo capaces los factores biológicos de crecimiento de inducir o mejorar la regeneración ósea. Tal sustituto se espera que sustituye a los autoinjertos y se aplique extensivamente en todos los contextos relacionados con el trasplante de tejidos duros en la medicina clínica.

Se han desarrollado biomateriales sintetizados disponibles comercialmente y pueden utilizarse como material de relleno o de soporte interno o externo. Desgraciadamente, estos materiales carecen de actividad biológica de iniciación de la regeneración ósea. Se han descrito portadores sintéticos preparados a partir de materiales tales como los ácidos polilácticos y ácidos hialurónico, por ejemplo en la patente U.S. nº 5.366.508. La proteína morfogenética ósea (BMP) es un factor importante en dispositivos osteogénicos y participa activamente en el proceso de implantación.

La BMP ha sido el objetivo de un enorme esfuerzo de investigación a partir del reconocimiento de la significancia de la BMP en la biología del esqueleto y la publicación de los métodos para su extracción y purificación por Urist, uno de los pioneros en el campo de la investigación de la BMP. La BMP también ha sido utilizada ocasionalmente para tratar pacientes con unión retrasada de fracturas aunque todavía no se ha utilizado a gran escala para tratar pacientes.

Han sido hitos importantes en la historia de la BMP el descubrimiento de la efectividad de la BMP en la inducción de nueva formación ósea, el desarrollo de métodos de aislamiento de BMP de origen natural parcialmente purificada a partir de matriz ósea animal y el aislamiento de diferentes ADNc que codifican BMP, lo que ha permitido la preparación de BMP mediante técnicas de ADN recombinante.

Los resultados preliminares han llevado al desarrollo de una multitud de sistemas biológicos de liberación para la BMP in vivo. Aunque los experimentos con BMP de origen natural altamente purificada o con BMP recombinante administrados sin portadores han dado resultados positivos, la BMP sin portador se disuelve y difunde rápidamente en los líquidos corporales después de la implantación y poco después queda bloqueada la expresión de la osteoconductividad. De esta manera, se requiere un portador funcional apropiado de BMP para potenciar y modular la actividad de ésta.

El portador o sistema de liberación de la BMP osteoinductora en implantes presenta un efecto importante sobre la actividad biológica de la BMP. El portador protege a ésta de la difusión rápida hacia fuera y de la proteinización endógena. Permite conservar un gradiente persistente de concentración de BMP en concierto con la diferenciación de las células diana de la BMP y la osteogénesis. Además, proporciona un anclaje para la unión de las células sensibles a BMP.

Los sistemas de liberación de BMP no sólo se han discutido en una multitud de publicaciones, sino que también se han dado a conocer extensivamente en varias patentes y solicitudes de patente. Por ejemplo, la patente U.S. nº 5.443.531 da a conocer un sistema de liberación en el que BMP es adsorbido sobre un portador de hidroxiapatito en una columna de cromatografía.

Con el fin de mejorar las propiedades de los sistemas de liberación para administrar BMP en aplicaciones clínicas, se han utilizado colágenos, especialmente colágeno tipo IV, para impregnar los portadores y mejorar la actividad biológica. En las patentes U.S. nº 4.975.527 y nº 4.394.370 se dan a conocer portadores para BMP basados en colágeno. El potencial de inducción ósea y la respuesta dosis-dependiente de la BMP bovina en combinación con un portador colágeno tipo IV se discuten en Gao et al., Ann. Chir. Gynec. 82:77-84, 1993.

Un sustituto óseo deseable es un material sin los riesgos relacionados con los autoinjertos y con las propiedades de un material sintético, es decir, una composición química y una arquitectura geométrica e integridad y fortaleza mecánicas similares a la masa de los autoinjertos de hueso vivo y que al mismo tiempo presentase la actividad biológica, incluyendo factores de crecimiento, capaz de inducir o mejorar la regeneración ósea.

Gao et al. (Biomaterials 16:1175-1179, 1995) han publicado un artículo sobre la evaluación microscópica del contacto del implante óseo, entre el hidroxiapatito, vidrio bioactivo y fosfato tricálcico implantados en defectos diafisarios ovinos.

Se han obtenido resultados prometedores con las denominadas biocerámicas, tales como corales naturales originados en el esqueleto de corales. Los corales naturales han sido utilizados extensivamente como portadores. La utilización de carbonato cálcico originado en esqueleto coralino como material óseo bioreabsorbible ha sido descrita por ejemplo en la patente U.S. nº 5.433.751 y en la publicación de patente WO 93/02181.

La utilización de los portadores de coral natural en combinación con determinados factores de crecimiento, tales como TGF, se ha dado a conocer en las publicaciones de patente nº WO 94/26322 y nº DE 4130566 y con colágeno en la patente U.S. nº 4.975.527. La utilización del factor de crecimiento TGF en combinación con BMP también se da a conocer en la patente U.S. nº 5.393.739, que da a conocer una BMP purificada que muestra dos picos cuando se fracciona mediante RP-HPLC.

Aunque se ha sugerido una multitud de diferentes sistemas de liberación para la BMP y se han ensayado experimentalmente diferentes sistemas (Lindholm & Gao, Ann. Chir. Gynaecol. 82:3-12, 1993), hasta el momento no se ha descubierto ninguna combinación satisfactoria de BMP y portador para el tratamiento clínico de pacientes humanos.

También se ha demostrado que las BMP aisladas mediante los métodos convencionales además de inducción reducida de la formación ósea, causan reacciones inmunogénicas e inflamatorias. De esta manera, el problema a resolver mediante la presente invención es proporcionar dispositivos osteogénicos alternativos con propiedades inmunogénicas e inflamatorias reducidas.

El problema se resuelve mediante un método de purificación que proporciona un complejo modificado de BMP que carece de una proteína de 25 a 55 kD con propiedades inmunogénicas e inflamatorias.

El complejo BMP modificado (mBMPc) puede obtenerse mediante un método que comprende las etapas siguientes:

(a)

pulverizar o moler material óseo desmineralizado;

(b)

extraer el material óseo de la etapa (a) con hidrocloruro de guanidinio (GuHCl), preferentemente con una solución 1,5 a 5,0 M, más preferentemente con una solución 4 M;

(c)

llevar a cabo una filtración utilizando un sistema de flujo tangencial;

(d)

purificar mediante filtración en gel para obtener tres fracciones, caracterizadas por presentar diferente peso molecular, siendo la Fracción I una proteína de elevado PM (100 a 700 kD) con actividad osteoinductora de BMP, siendo la Fracción II una proteína inmunogénica de PM intermedio (25 a 55 kD) que carece de actividad BMP y siendo la Fracción III una proteína de bajo PM (15 a 25 kD) con actividad BMP osteoinductora; y

(e)

eliminar una fracción de proteína con propiedades inmunogénicas e inflamatorias que presenta un PM de 25 a 55 kD según determinación mediante filtración en gel.

En una realización preferida de la invención, se seca y esteriliza la fracción III de BMP osteoinductora y de bajo PM con capacidad de almacenamiento mejorada. En otra realización preferida de la invención, una mBMPc adecuada, las fracciones I y III de alto y bajo PM, se combinan, obteniendo una mezcla de dichas fracciones, y la mezcla se seca y esteriliza para su almacenamiento prolongado.

La invención se refiere asimismo a la utilización del complejo de BMP modificado para preparar un dispositivo osteogénico con propiedades osteoinductoras mejoradas. Los colágenos, preferentemente el colágeno I, colágeno IV o mezclas de colágeno comercialmente disponibles, se incuban con el complejo de BMP modificado.

El portador, preferentemente el cuerpo portador biocerámico, más preferentemente el coral natural derivado de un esqueleto coralino, se sumerge en la solución de BMP-colágeno y se incuba durante un tiempo suficiente para que el BMP impregne el colágeno. El BMP-colágeno-cuerpo biocerámico se dializa y se separan el cuerpo y la solución utilizadas para la diálisis. Cualquier resto precipitado, residuos o restos de BMP de la solución utilizada para la diálisis se adsorben en el portador poroso conformable, proporcionando un dispositivo osteogénico biocerámico. Dicho dispositivo se seca y esteriliza mediante métodos convencionales autorizados para su almacenamiento prolongado.

La figura 1 muestra un cromatograma de filtración en gel Sephacryl® S-200 de BMP semipurificada de alce. Se muestran las fracciones recogidas para análisis adicionales. Las fracciones I y III muestran la osteoinductividad en un bioensayo de ratón. Descripciones: tasa de flujo 0,9 ml/min. Tampón de corrido: K-fosfato 0,06 M, pH 6,9 + NaCl 150 mM + urea 6 M + detergentes. Volumen de inyección: 1,8 ml. Cantidad de inyección: 120 mg.

La figura 2 muestra una cromatografía de HPLC que define una preparación de BMP de alce parcialmente purificada como un multímero compuesto de tres fracciones principales con pesos moleculares comprendidos en los intervalos 11 a 40, 40 a 140 y 500 a 700 kD, respectivamente.

La figura 3 muestra las variaciones de incorporación de ^{45}Calcio en los diferentes tipos de implante en las bolsas musculares de ratones BALB en el 10º y 20º día después de la implantación. Los dispositivos osteogénicos utilizados están marcados de la manera siguiente: coral natural-colágeno-BMP (MC/COL/BMP), fosfato tricálcico-colágeno-BMP (TCP/COL/BMP), colágeno-BMP (COL-BMP), proteína morfogenética ósea como tal (BMP), coral natural-colágeno (NC/COL), fosfato tricálcico-colágeno (TCP-COL), coral natural (NC), fosfato tricálcico (TCP).

En la presente invención se utilizan varios términos propios del campo de la injertación ósea, aunque algunos términos se utilizan extensivamente con un significado algo modificado. Por lo tanto, a continuación se definen en más detalle los términos utilizados en la descripción y las reivindicaciones.

El término dispositivo osteogénico significa un sistema de liberación para BMP osteoinductora que incluye colágeno impregnado sobre material compuesto que consiste en por lo menos un portador poroso conformable, preferentemente un portador bioactivo, incluyendo biocorales, hidroxiapatito, vidrio bioactivo u otros materiales aceptables utilizados convencionalmente en cirugía ósea.

El término osteoinductor significa un proceso en el que un tejido o productos derivados del mismo, causan la diferenciación de un segundo tejido no diferenciado para formar tejido óseo. El proceso implica la interacción entre dos sistemas, el sistema inductor y el sistema reactivo. El sistema inductor en la osteoinducción incluye cartílago hipertrofiado, matriz ósea de nueva formación o desmineralizada, epitelio de transición y BMP. La diana reaccionante consiste en células de tejido mesenquimatoso que presentan la competencia para convertirse en osteoblastos.

El término osteoconducción se refiere a que el material implantado sirve de malla de soporte relativamente inerte para la sustitución serpeante de hueso huésped.

El término osteogénesis significa un proceso de formación in situ de hueso nuevo por pre-osteoblastos y osteoblastos supervivientes en autoinjertos o alrededor de tejido óseo dañado.

El término proteína morfogenética ósea (BMP) significa la BMP nativa parcial o totalmente purificada susceptible de ser obtenida de fuentes naturales de hueso mediante métodos de aislamiento ya conocidos y utilizados frecuentemente.

La proteína morfogenética ósea (BMP) es una glucoproteína no específica e hidrofóbica de matriz que pertenece a la familia de los factores de crecimiento \beta-transformantes (TGF-\beta). Al ser un factor de diferenciación y un mitógeno, la BMP desempeña un papel importante en la condrogénesis y la osteogénesis de la vida embriónica y también postfetal. Se ha extraído y caracterizado BMP natural en tejido de osteosarcoma bovino, humano, porcino, de conejo y de rata así como de alce y de reno. Las diferencias en la cantidad recuperada en el procedimiento de extracción y en la eficacia osteoconductiva en ensayo biológico demuestran que la BMP presenta diferencias específicas entre dichos diferentes orígenes. Sin embargo, para el tratamiento humano sólo pueden utilizarse tipos de BMP específicos y autorizados.

El término proteína morfogenética ósea (rBMP), especialmente la rBMP de origen humano (rhBMP), es una BMP susceptible de ser obtenida mediante técnicas convencionales de ADN recombinante.

El término complejo de proteína morfogenética ósea modificada (mBMPc) significa la proteína morfogenética ósea parcialmente purificada que comprende una mezcla de una fracción de alto PM (100 a 700 kD) de BMP y una fracción de bajo PM (15 a 25 kD) de BMP, estando dicho complejo esencialmente libre de una fracción de proteína inmunogénica e inflamatoria con un PM de 25 a 55 kD. Dicho mBMPc es susceptible de ser obtenido mediante un método que comprende por lo menos las etapas de extracción de hueso molido desmineralizado con GuHCl y fraccionamiento tal como se define en las reivindicaciones.

En la presente invención el término colágeno significa principalmente colágeno de tipo I, que es el colágeno principal en la matriz ósea, o colágeno de tipo IV, que es el componente principal de las membranas basales, las cuales están implicadas en la diferenciación y orientación celular, polarización membranal, permeabilidad selectiva a macromoléculas y migración de diversos tipos celulares, pero también se incluyen en la presente definición otros tipos de colágeno, especialmente colágenos atelopéptido y sus mezclas, incluyendo mezclas de colágeno comercialmente disponibles.

El término cerámica significa preferentemente portadores biocerámicos, consistente en cuerpos, bloques o cilindros conformables, tales como de hidroxiapatito, fosfato cálcico, vidrio bioactivo y especialmente de coral natural originado en esqueletos de coral natural.

El coral es el esqueleto calcáreo de diversas especies de invertebrados marinos. La estructura porosa y dimensiones de ciertos tipos de coral se asemeja microscópicamente a la del hueso trabecular humano. Los componentes inorgánicos dominantes del coral en la forma de cristal aragonito consisten principalmente en carbonato cálcico (CaCO_{3} en un 98%) pero también en cantidades menores de flúor, estroncio y magnesio.

Debido a que la BMP implantable se extiende rápidamente in vivo, una de las ramas más desafiantes de la investigación sobre BMP es la exploración de un sistema de liberación ideal que permita que la BMP sea efectivo en pequeñas cantidades durante un tiempo prolongado antes de que pueda trasladarse la BMP desde la ciencia básica de laboratorio a su aplicación clínica.

Se ha sondeado la utilidad como BMP de proteínas no colágena, colágenos, hidroxiapatito, fosfato tricálcico, ácido poliláctico y del titanio (Lindholm & Gao, Ann. Chir. Gyn. 82:3-12, 1993).

Estudios anteriores han definido el potencial óseo inductivo del colágeno de tipo IV como portador de BMP (Lindholm et al., en Lindholm TS (editor): New Trends in Bone Grafting. Acta Universitatis Tamperiensis, Universidad de Tampere, 1992, ser. B, vol. nº 40, páginas 45-50 y Gao et al., Ann. Chir. Gyn. 82:77-84, 1993).

El coral natural y sus derivados obtenidos de esqueletos minerales de corales también se utilizan como sustitutos reabsorbibles osteoconductores y osteofílicos de injertos óseos en periodontología. En la presente invención, se han diseñado experimentos para utilizar coral natural impregnado con colágeno de tipo IV y cerámica de fosfato tricálcico como vehículo compuesto para BMP. Debido a que no se ha dado a conocer ningún estudio comparativo cuantitativo de los efectos de los portadores compuestos sobre la bioactividad in vivo de la BMP, el presente estudio se fijó como objetivo establecer si el portador compuesto es superior al portador colágeno y cuál de los compuestos, el mayoritariamente de coral natural o el mayoritariamente de fosfato tricálcico, presentaba una osteoconducción mejor desde el punto de vista del metabolismo del calcio.

Mediante la combinación de polipéptidos osteoinductores bovinos purificados, tales como proteínas morfogenéticas óseas bovinas con diferentes materiales de portador, se produjo un dispositivo osteogénico para su utilización clínica. Las indicaciones para la utilización del dispositivo osteogénico son el tratamiento quirúrgico de la pseudoartrosis, no uniones de fracturas, defectos óseos, quistes óseos o la aceleración del proceso de reparación de fracturas en cirugía endoprostética.

En la práctica se utilizó la dosis mínima de BMP requerida para inducir la formación visible de hueso in vivo con el fin de evaluar la bioactividad de la BMP de diferente origen. Típicamente, eran necesarios más de 2 mg de BMP bovina parcialmente purificada para la osteoinducción intramuscular.

La deposición del calcio en el sitio implantado indica de manera metabólica osteogénesis en sus primeras etapas. El pico de precipitación de calcio en hueso de nueva formación habitualmente tiene lugar entre los 10 y 20 días en roedores. La incorporación significativamente incrementada de ^{45}calcio en los sitios implantados con las preparaciones compuestas indicaba cuantitativamente que los portadores compuestos, coral natural o fosfato tricálcico en combinación con colágeno de tipo IV, funcionaba mucho mejor en la liberación de bioactividad de BMP que los componentes individuales como portadores. El coral natural y el fosfato tricálcico son biocerámicas dominadas por el calcio con estructura multiporosa e histocompatibilidad. Al utilizar fosfato tricálcico o colágeno de tipo IV por sí solo como portador de la BMP, se obtuvo un resultado favorable. Se cree que la estructura porosa de la cerámica atrapa la BMP y la protege de la difusión hacia fuera in vivo y expande el área de contacto reactivo célula-BMP.

Se ha demostrado que el colágeno de tipo IV liga BMP natural y también desnaturalizada y potencia el efecto de ésta sobre la diferenciación y proliferación de células mesenquimatosas y osteoprogenitores in vitro. El colágeno de tipo IV también se une ávidamente a factores del crecimiento y de diferenciación liberadas de la BMP y las orienta en una conformación óptima para provocar nueva formación de hueso localmente. La estructura multiporosa de la cerámica en combinación con la modulación biológica del colágeno de tipo IV a bioactividad de la BMP en las preparaciones compuestas incrementó considerablemente el efecto local de ésta sobre células inducibles, mejorando la osteogénesis. El esqueleto cerámico en un portador compuesto, de esta manera, proporciona un andamiaje para la unión y proliferación de células inducibles y para la deposición mineral. La geometría e integridad mecánica que proporciona hacen que la preparación sea ideal para rellenar defectos óseos en sitios que soportan pesos. Es probable que los iones de calcio liberados por la disolución de cerámica dominada por Ca en las preparaciones compuestas también desempeñasen un papel activo en la regulación y expresión de la bioactividad de la BMP.

La preparación compuesta de coral natural-colágeno-BMP incrementó el potencial osteoinductor en comparación con la de tricalcio-colágeno-BMP, tal como se demuestra en la parte experimental de la presente descripción. La incorporación de ^{45}calcio, el hueso nuevamente formado en radiografía y el nuevo crecimiento de hueso hacia el interior de los poros en la histología, fueron de mayor magnitud con la preparación de coral natural-colágeno-BMP que con la de fosfato tricálcico-colágeno-BMP. Las diferencias se consideró que eran debidas principalmente a las varianzas en los ingredientes y recursos utilizados en las dos cerámicas en los portadores compuestos.

El carbonato cálcico en la estructura de cristal ortorrómbico denominado aragonito representa el 97% del coral natural. Tras implantar el coral natural in vivo, se dio una rápida modificación de la superficie antes de depositarse hueso nuevo. Se dio la disolución inicial de los iones calcio y carbonato liberados de la superficie hacia el líquido circundante y después la precipitación o deposición de una capa de fosfato cálcico y/o una conversión en la capa superficial del carbonato en carbonato-fosfato cálcico. La capa rica en fosfato cálcico en el coral natural era una base estructural crítica para la deposición de hueso nuevo y la degradación mediada por células. Se ha establecido que el esqueleto de coral natural es perfectamente biointegrable y también que presenta ligeras propiedades osteoinductoras. En consecuencia, una mayor incorporación de ^{45}Ca en los controles de coral natural con o sin colágeno que utilizando fosfato tricálcico con o sin colágeno evidencia un efecto osteogénico en las primeras etapas después de la implantación. Otro hecho importante es que el coral natural se obtiene del esqueleto mineral natural de los corales escleractíneos, la estructura de los cuales es diferente del fosfato tricálcico producido por el hombre. El origen y arquitectura naturales hacen que el coral asimile más BMP, regule la biofunción de la BMP y atraiga más células osteoprogenitoras.

Todavía no se ha elucidado el mecanismo en detalle. Debido a que el coral natural muestra una mejor bioabsorbilidad, resistencia mecánica y eficacia de liberación de la BMP, probablemente es una de las alternativas ideales de portadores de BMP desde el punto de vista clínico.

La formación dosis-dependiente de hueso es una medida importante de las propiedades biológicas de la BMP. Las cantidades de hueso inducido se incrementaron en proporción con las dosis de BMP de alce añadidas a la preparación compuesta. La incorporación de ^{45}Ca en las preparaciones compuestas con 4 mg de BMP de alce, por ejemplo, fue mucho menor que con 8 mg de BMP de alce en el 10º día y en el 20º día. La inducción dosis-dependiente de hueso por mBMP con cerámica y el colágeno no interfieren con la función biológica de la BMP de alce.

Las preparaciones compuestas, BMP de alce con o sin colágeno de tipo IV, provocaron una osteoinducción más intensa en el 10º día que en el 20º día. La explicación de este extraordinario fenómeno sigue sin esclarecerse. Debido a que no hay acuerdo sobre cómo la combinación de BMP y portador cerámico acelera o retrasa la secuencia temporal de la inducción ósea, el método de combinación que implica tres componentes del presente estudio podría facilitar la expresión del fenotipo BMP y la formación de hueso.

Las complicaciones constituidas por las formas homodiméricas y heterodiméricas que hay presentes en el complejo polipeptídico de la BMP pueden incrementar, reducir o incluso inhibir las actividades del sistema de inducción ósea. El problema inmunológico iniciado por la implantación de BMP heterogénico también puede manifestarse en la infiltración de células reactivas inflamatorias alrededor de las preparaciones cargadas con BMP de alce en diferentes grupos. La entidad bioactiva de los complejos de BMP de alce cualificadas con fracciones múltiples de diferente peso molecular contribuyeron a su potencial osteoinductor así como a la iniciación inmunogenética, la cual interrumpió o redujo la osteoinducción llegado el día 20º después de la implantación. Actualmente se están investigando los sucesos implicados en la inmunogenicidad de diferentes fracciones disociadas de BMP de alce.

La investigación intensiva de la BMP ha abierto un nuevo horizonte de desarrollo de sustitutos óseos bioactivos. La BMP, la glicoproteína que se aloja especialmente en la matriz del tejido duro, desempeña un papel importante en la condrogénesis y en la osteogénesis de la vidas embriónica y postfetal. Se han reparado con éxito grandes defectos óseos no cicatrizados utilizando BMP de origen natural, transportándola en un sistema de liberación adecuado. Se han conseguido resultados preliminares alentadores en la utilización de BMP humana parcialmente purificada transportada por injertos óseos autogénicos o de hueso alogénico autolisado del que se han extraído los antígenos en el tratamiento de no uniones femorales resistentes, aunque las limitaciones de posibles fuentes de injertos autogénicos cancelosos en los pacientes sigue siendo un problema frustrante.

Se han utilizado algunas biocerámicas como portadores de BMP en estudios experimentales. La porosidad, integridad mecánica y compatibilidad con los tejidos que se han establecido convierte a algunas de estas biocerámicas en candidatos a portadores de BMP. El punto clave de los problemas a resolver es cómo combinar BMP, un factor biológico, con cerámicas, sustancias inorgánicas, de manera efectiva conservando o incluso modulando la función biológica de la BMP en la reconstitución.

Mediante la utilización de cilindros de fosfato tricálcico impregnados con BMP ovino y colágeno de tipo IV, se ha establecido la potenciación de dicho sustituto óseo compuesto en la reparación de defectos óseos segmentarios en la tibia de ovejas. El presente estudio subclínico tiene el objetivo de examinar la posibilidad y perspectivas de desarrollo de un sustituto óseo bioactivo de aplicación clínica.

La aplicación más práctica de la investigación de BMP es el tratamiento de pacientes con no uniones no tratables de fracturas y grandes defectos óseos. El objetivo de muchos investigadores y médicos clínicos durante dos décadas ha sido salvar el espacio entre la investigación básica de la BMP y su aplicación clínica. El punto crítico en el tratamiento exitoso de los grandes defectos óseos, especialmente de extremidades que soportan pesos, es reconstruir la continuidad del hueso con una integridad mecánica establecida y de manera simultánea facilitar la regeneración ósea local.

La integridad mecánica del implante refuerza la inmovilización del sitio del defecto en una etapa temprana y proporciona un andamiaje para el tejido osteogénico. La osteogenicidad estimulada asegura la cicatrización del defecto. El desarrollo de las biocerámicas hasta el momento ha suministrado una amplia variedad de materiales biocompatibles de relleno óseo de aplicación clínica, pero todavía no se ha dado a conocer ninguna biocerámica que presente una osteoinductividad indudable.

En el caso de BMP humana de origen natural o recombinante, se han reparado con éxito grandes defectos óseos en modelos de rata, conejo, caninos, ovinos y humanos al combinar las proteínas osteogénicas con derivados del colágeno, ácido poliláctico y hueso alogénico autolisado del que se habían extraído los antígenos (AAA), respectivamente. Sin embargo, la falta de la geometría e integridad mecánica deseadas en estos portadores de BMP seguía haciendo que los implantes compuestos no fueran aplicables a la cirugía.

Mediante la utilización del sustituto óseo compuesto consistente en tres componentes, fosfato tricálcico cargado con BMP de origen natural y colágeno de tipo IV, nuestros resultados experimentales han demostrado, según nuestros datos por vez primera, que dicho sustituto óseo compuesto bioactivo presenta un perfil de resistencia mecánica, así como la capacidad, para inducir la cicatrización de un defecto diafisario segmentario en ovejas.

Un sistema de liberación apropiado lleva a cabo varias funciones esenciales para la osteoinducción de la BMP, incluyendo la liberación restrictiva de ésta a la dosis efectiva durante un periodo coincidente con la acumulación y proliferación de las células diana y la adaptación de cada etapa de la interacción entre las células y la formación ósea. El material debe ser biocompatible y biodegradable y debe proporcionar un sustrato de unión para la células osteoprogenitoras reclutadas.

Urist et al., Clin. Orthop. 187:277-280, 1993, describieron un disco de fosfato tricálcico como portador de BMP bovina. Tras 21 días de implantación, se había producido una cantidad de hueso nuevo de 12 veces la original en un implante de fosfato tricálcico-BMP en comparación con un implante de 1,0 mg de BMP solo en bolsas musculares de ratón. En nuestro estudio anterior se ha puesto de manifiesto el efecto potencial del colágeno de tipo IV sobre la osteoconductividad de la BMP bovina.

La hipótesis de trabajo a partir de la que se reconstituyó el sustituto óseo compuesto con tres componentes en el experimento fue que la integridad mecánica, biocompatibilidad, porosidad y disponibilidad para la unión de BMP en un cilindro de fosfato tricálcico en combinación con la potenciación por parte del colágeno de tipo IV de la capacidad osteogénica de la BMP, haría que el sustituto óseo compuesto fuera más accesible a su aplicación clínica.

Los resultados experimentales han demostrado una diferencia en la extensión del callo interfragmentario del sustituto óseo compuesto con 100 mg de BMP ovina y el sustituto óseo compuesto con 13 mg de BMP ovina o con fosfato tricálcico con colágeno de tipo IV a partir de las 3 semanas que resultó evidente a las 6 semanas después de la implantación. Lo anterior confirmó que la cascada de formación ósea inducida por la BMP habitualmente se expresaba entre los 7 días y las 4 semanas, dependiendo de la especie animal, portador y sitio de implante. Debido a que el periostio se conservó en el estudio, más células mesenquimatosas y células inducibles activadas de la capa cambium del periostio o endostio contribuyeron a una regeneración ósea exuberante más temprana circundando los implantes impregnados con BMP en las tibias de oveja.

En comparación con la reparación de un defecto segmentario en un fémur de oveja utilizando BMP recombinante, la formación de callo interfragmentario apareció más temprano en el presente estudio. Mediante análisis de imágenes computerizado se definió un área significativamente mayor y una intensidad más altamente integrada del callo interfragmentario en sustitutos óseos compuestos (CBS) con 100 mg de BMP de oveja que en sustitutos óseos compuestos con 13 mg de BMP de oveja o con implantes de cilindros de fosfato tricálcico, tanto a las 3 semanas como a las 6 semanas.

La inducción ósea dosis-dependiente de la BMP fue una de las características biológicas notables observadas. En general se conoce que cuanto mayor sea la superioridad de la especie en la escala zoológica y mayor sea el defecto creado, más BMP se necesita para cicatrizar el defecto. En los experimentos de la presente invención también se demostró que la cicatrización de defectos en huesos grandes en mamíferos superiores requería una dosis grande de BMP, aunque sin diferencias estadísticamente significativas en área e intensidad integrada del callo en diferentes tiempos ni en resistencia mecánica entre sustituto óseo compuesto con 13 mg de BMP de oveja y con cilindros de fosfato tricálcico.

Las distribuciones y formas del callo interfragmentario alrededor de los implantes de fosfato tricálcico impregnado con BMP y los implantes de fosfato tricálcico sin BMP revelaron una diferencia clara, especialmente a las 6 semanas. Este interesante fenómeno podría proporcionar evidencia adicional del efecto local de la BMP sobre la osteoinducción. En coherencia con el incremento observado en la cantidad de callo interfragmentario al utilizar sustituto óseo compuesto con 100 mg de BMP de oveja en la etapa temprana, se observó en un escaneo por tomografía computerizada (CT) que la densidad acumulada del callo se había incrementado significativamente al llegar al final del experimento. Dicho incremento demostró que se habían generado callos más maduros y mayor contenido mineral en el sustituto óseo compuesto con 100 mg de BMP ovino que en aquél con cilindros de fosfato tricálcico. La correlación entre el área del callo interfragmentario en la etapa temprana y el incremento de densidad del callo en la etapa más tardía en implantes impregnados con BMP podría significar que la BMP también promueve el proceso de remodelado óseo.

La resistencia mecánica se ha establecido como el estándar para evaluar la cicatrización biológica de fracturas en los estudios experimentales. La prueba de torsión se considera un parámetro exhaustivo y fiable de resistencia ósea. En los grupos de sustitutos óseos compuestos, mejoraron todos los parámetros de la prueba de torsión al incrementar la dosis de BMP ovina, en comparación con el grupo con cilindros de fosfato tricálcico. A pesar del efecto de protección frente al estrés de la inmovilización rígida mediante dos placas AO solapadas, la tibia osteotomizada con un implante de sustituto óseo compuesto con 100 mg de BMP ovina era incluso más resistente que la tibia contralateral con orificios coincidentes.

En el presente estudio también se encontró que los parámetros de la prueba de torsión presentaban desviaciones estándar grandes, aunque a las 16 semanas se observó un porcentaje significativamente mayor de rigidez ósea contra la tibia contralateral en la tibia osteotomizada cicatrizada que había sido implantada con sustituto óseo compuesto con 100 mg de BMP ovina en comparación con la rigidez observada con los implantes de cilindros de fosfato tricálcico. El sustituto óseo compuesto no sólo incrementó la formación de callo interfragmentario sino también indujo el crecimiento óseo hacia el interior de los poros del fosfato tricálcico, de esta manera observándose histológicamente una buena osteointegración entre el hueso nuevo y el implante de sustituto óseo compuesto. El hecho de que la línea de fractura en la interfase implante-hueso sólo apareciese durante las pruebas mecánicas en uno de cada 6 sustitutos óseos compuestos con 100 mg de BMP ovina también proporciona evidencia de una buena osteointegración.

La osteointegración y remodelado establecidos, el anclaje de los cilindros de fosfato tricálcico en el defecto y el tiempo de observación prolongado se explicaron como contribuciones de la mayor rigidez ósea del sustituto óseo compuesto con 100 mg de BMP ovina. Los patrones generales de fractura espiral también eran consistentes con la etapa biomecánica de cicatrización. En la prueba de torsión, las tibias contralaterales, en la que se habían practicado orificios coincidentes, se utilizaron como auto-control para evaluar la resistencia relativa de las tibias cicatrizadas. La idea era crear una condición doble de prueba y reducir las varianzas de las medias de los parámetros originados por la influencia de las diferencias de peso corporal y edad sobre la resistencia ósea. Sin embargo, el efecto reductor de las tibias de oveja con orificios sobre el resultado mecánico de las tibias intactas todavía no ha sido ilustrado.

En conclusión, el sustituto óseo compuesto con tres componentes proporcionó las ventajas de osteoinducción, osteoconducción y resistencia mecánica. En la actualidad, los avances en la investigación de biomateriales han proporcionado mejores posibilidades de encontrar un biomaterial apropiado como esqueleto para los sustitutos óseos compuestos. La limitada disponibilidad e impureza de la BMP de origen natural podría salvarse preparando BMP recombinante. Con el desarrollo de técnicas de reconstitución, se hará disponible un sustituto óseo compuesto deseable para el hombre. La relevancia más sustancial del presente estudio experimental ha sido poner de relieve la necesidad y ventajas de desarrollar un sustituto óseo bioactivo sintético para la práctica médica.

No sólo es un gran reto para la humanidad el desarrollo de nuevos y mejores sistemas de liberación para la BMP que puedan utilizarse en el tratamiento de pacientes con trastornos y deformaciones esqueléticas, sino que también es importante para mejorar las propiedades de los componentes utilizados en los dispositivos osteogénicos.

La proteína morfogenética ósea BMP generalmente se aísla mediante los métodos desarrollados por Urist et al., en Lindholm TS (editor): New Trends in Bone Grafting, Acta Universitatis Tamperiensis, Universidad de Tampere, 1992, ser. B, vol. nº 40, páginas 27-39; Urist et al., PNAS 76:1828-1932, 1979, etc. También se describe la BMP, su aislamiento, purificación y propiedades por ejemplo en las patentes siguientes: patentes U.S. nº 5.433.751, nº 4.294.753, nº 4.455.256, nº 4.563.489, nº 4.596.574, nº 4.789.732 y nº 4.795.804.

Los métodos de extracción desarrollados por Urist et al. en la actualidad se utilizan en la mayoría de laboratorios y se caracterizan por la utilización de la extracción con hidrocloruro de guanidinio (GuHCl) y además se caracterizan por las características siguientes. En primer lugar, se muele la matriz ósea y se gelatiniza con el fin de liberar las proteínas de origen no colagénico. La extracción se lleva a cabo en presencia de cloruro cálcico e inhibidores de proteasa. Se eliminan los lípidos, los cuales alteran el procedimiento de purificación, del material crudo. De esta manera, las BMP susceptible de ser obtenidas mediante los métodos convencionales de laboratorio a partir de la matriz ósea nativa se gelatinizan y se encuentran esencialmente libres de lípidos. Pueden contener trazas de inhibidores de proteinasa así como un exceso de iones Ca^{++}.

La proteína morfogenética ósea también se ha preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Tales métodos se dan a conocer, por ejemplo, en las publicaciones de patente nº WO 90/11366 y nº WO 95/24474. Dicho rhBMP se encuentra libre de cualquier depósito, residuo o resto de la matriz ósea nativa que pudiese haber quedado unido a la BMP nativa tras la extracción con los métodos utilizados generalmente. rhBMP carece, por ejemplo, de lípidos y de otras sustancias posiblemente presentes en la BMP derivada de hueso natural.

Los inventores en la presente solicitud inesperadamente han descubierto que si se modifican algo los métodos convencionales de laboratorio, se obtiene un nuevo tipo de BMP. Dicho nuevo tipo de BMP, es decir, el complejo de BMP modificada (mBMPc) de la presente invención, en combinación con colágeno y portadores conformables, tales como biocerámicas, incluyendo corales naurales, proporciona resultados de formación ósea sorprendentemente buenos.

Las BMP nativas extraídas mediante métodos diferentes de los de la presente invención no han demostrado ser tan efectivos como las mBMPc extraídas mediante el método de la presente invención en combinación con los materiales portadores utilizados en el dispositivo osteogénico de la presente invención. Sin embargo, no sólo es importante el material portador en la bioresorción de hueso. El tipo de complejo de BMP utilizado y sus propiedades son muy importantes para obtener las propiedades osteoinductoras deseadas.

Los presentes solicitantes han obtenido los mejores resultados con mBMPc, indicando que la BMP gelatinizada o rhBMB carece de algunos componentes esenciales que son esenciales para conseguir un buen implante. En consecuencia, los solicitantes han descubierto que pueden conseguirse propiedades osteoconductoras sorprendentemente buenas con un dispositivo osteogénico que incluye un complejo de BMP modificada que se ha aislado mediante una modificación de los métodos de Urist, que se define en las reivindicaciones, en combinación con colágeno de tipo IV y un portador de coral natural.

En consecuencia, en la realización preferida de la presente invención, la BMP es extraída mediante métodos descritos por Jortikka, L. et al. (Ann. Chir. Gynaecol. 82:25-30, 1993) y Jortikka et al. (Ann. Chir. Gynaecol. 82:31-36, 1993). Tales métodos se basan en el método descrito por Urist et al.; en Lindholm TS (editor): New Trends in Bone Grafting. Acta Universitatis Tamperiensis, Universidad de Tampere, 1992, ser. B, vol. nº 40, páginas 27-39. Las diferencias esenciales entre los métodos de extracción de Urist y los utilizados para preparar el complejo de BMP modificada utilizado en el dispositivo osteogénico de la presente invención se indican posteriormente.

En el método de la presente invención, no se gelatiniza la matriz ósea molida debido a que los presentes solicitantes han advertido que la separación, aflojamiento o liberación de las proteínas no colagénicas con guanidinio-HCl (GuHCl) es tan efectivo sin gelatinización como con ella. De esta manera, se obtiene un producto no gelatinizado. Durante el procedimiento de extracción resulta posible, y en ocasiones ventajoso aunque no necesario, utilizar colagenasa.

Otra característica diferenciadora es que, en el método de la presente invención, no se utiliza cloruro cálcico al llevar a cabo la extracción con GuHCl y, en consecuencia, el efecto quelador de los iones Ca^{++} no está presente en el procedimiento de extracción. De esta manera, no hay exceso de iones Ca^{++} en el producto obtenido mediante el método de la presente invención.

Además, los presentes solicitantes han advertido que las proteasas no están activas en GuHCl 1,5 a 5,0 M, preferentemente 4 M. De esta manera, no se utilizan inhibidores de proteasa en las etapas de extracción de la presente invención y se obtiene un complejo de BMP modificada que no contiene ningún residuo (traza) de inhibidores de proteasa, las cuales pueden resultar dañinas o perjudiciales para el paciente.

Debido a que se utiliza un aparato de ultrafiltración tangencial, no resulta necesaria la extracción de los lípidos. La acción de dicho aparato no se ve alterada por éstos y, en consecuencia, puede evitarse la eliminación de los lípidos previamente a la concentración. Debido a que la última etapa en la preparación del producto crudo es la HPLC-filtración en gel, no hay necesidad de eliminar otras moléculas de proteína con una solución diluida de GuHCl en las etapas intermedias del procedimiento de extracción. Por el mismo motivo no es necesaria una extracción con Tritón X-100.

La última y esencial etapa en la producción de la preparación cruda es la HPLC-filtración en gel, en la que se obtienen tres fracciones separadas. Dichas fracciones diferenciadas se denominan Fracción I, II y III. La Fracción I contiene una proteína de elevado PM (100 a 700 kD). La Fracción II contiene una proteína de PM intermedio (25 a 55 kD) y la Fracción III contiene una proteína de bajo PM (15 a 25 kD). La Fracción II de PM intermedio (25 a 55 kD) causa reacciones inflamatorias aparentes y ninguna formación ósea. Debido a que la Fracción II parece ser inmunogénica, se descarta y no se utiliza. Las otras dos fracciones obtenidas mediante la HPLC-filtración en gel: la Fracción I, es decir, la fracción de BMP de alto PM, y la Fracción III, es decir, la fracción de BMP de bajo PM, son recogidas.

Dichas dos fracciones pueden utilizarse separadamente. Especialmente preferente por su buena capacidad de almacenamiento es la Fracción III. Opcionalmente, se combinan (se mezclan) las Fracciones I y III y dicha preparación parcialmente purificada puede utilizarse como tal o purificarse adicionalmente mediante enfoque isoeléctrico preparativo o mediante SDS-PAGE preparativa (aparato BioRad). En el tratamiento clínico, la utilización de preparaciones parcialmente preparadas parece proporcionar las mejores propiedades osteoconductoras.

En consecuencia, el complejo de BMP modificada, susceptible de ser obtenido mediante el método descrito anteriormente, es un complejo de proteína no gelatinizada, no colagénica, no quelada que contiene lípidos, que comprende una mezcla de por lo menos dos BMP de diferente PM (100 a 700 kD y 15 a 25 kD) y en el que el complejo carece de la fracción inmunogénica de 25 a 55 kD. La preparación cruda puede liofilizarse, esterilizarse y presenta una capacidad de almacenamiento prolongada.

La preparación puede utilizarse directamente para preparar los dispositivos osteogénicos de la invención, pero también es posible revivir la preparación liofilizada de BMP y utilizarla tras el almacenamiento a fin de preparar el dispositivo osteogénico de la presente invención.

El material de proteína morfogenética ósea (BMP) soluble en agua no colágenico susceptible de ser obtenido mediante el método descrito anteriormente se mezcla con colágenos solubles, preferentemente colágeno de tipo IV o colágeno de tipo I, y se utiliza para impregnar coral natural, el cual puede utilizarse opcionalmente en combinación con hidroxiapatito, vidrio bioactivo u otros materiales portadores adecuados.

La invención se describe con mayor detalle en los ejemplos y experimentos siguientes, que proporcionan resultados comparativos.

Ejemplo 1 Purificación de polipéptidos osteoconductores, BMP, a partir de hueso cortical bovino

El material de partida para el aislamiento de los polipéptidos osteoconductores, tales como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), era hueso cortical bovino, controlado y autorizado por veterinarios de distrito antes de su utilización. Inmediatamente después de la muerte de los animales, se extirpaban los huesos corticales largos y se congelaban y almacenaban en frío hasta el inicio del procedimiento de extracción. La purificación de BMP se inició dentro de las 30 horas.

El material de hueso cortical bovino se pulverizó en partículas de 1 a 2 mm^{3} y se desmineralizó con HCl 0,6 N. Se extrajeron las proteínas no colágenas de las partículas de hueso desmineralizado en hidrocloruro de guanidinio 4 M (GuHCl). El material proteico soluble en GuHCl se dializó frente a agua y se recogió el material insoluble en agua. Este material se disolvió nuevamente en GuHCl y se descartó el material no disuelto. Finalmente, se dializó el GuHCl con el material proteico frente a tampón citrato 0,2 M, pH 3,1.

El material insoluble en tampón citrato se filtró en gel y las fracciones que contenían polipéptidos osteoconductores, BMP, se agruparon y fraccionaron utilizando SDS PAGE preparativa. Nuevamente se agruparon las fracciones osteoconductoras y se fraccionaron adicionalmente utilizando cromatografía de HPLC en fase reversa. Como resultado, se recogieron 3 polipéptidos diferenciables (figura 2).

El ensayo biológico de las propiedades osteoconductoras BMP de las fracciones se llevó a cabo en un ensayo de bolsa muscular de ratón, el cual demostró capacidad de formación de hueso nuevo. Para más detalles sobre el procedimiento de bioensayo, ver el Ejemplo 4.

Se encontraron dos fracciones de polipéptidos osteoconductores con actividad BMP y dichas fracciones, Fracción I y III, se combinaron y precipitaron con agua y se lavaron dos veces con agua destilada. Alternativamente, se llevó a cabo el mismo procedimiento con sólo la Fracción III. Finalmente, se lavó el material con agua esterilizada en condiciones asépticas y se almacenó a -20ºC.

Ejemplo 2 Preparación de polipéptidos osteoconductores parcialmente purificados con actividad BMP de alce prematuro (Alces alces)

Se congelaron un total de 102 kg de huesos largos frescos procedentes de alce prematuro (Alces alces) no más tarde de un día después de la muerte de los animales. Se retiraron mecánicamente las epífisis, periostio y médula ósea. Tras congelar en nitrógeno líquido, se serró el hueso cortical limpio y se molió en partículas de 0,5 a 1,0 mm^{3}.

Los huesos pulverizados se desmineralizaron en 0,6 moles/l de HCl durante 72 horas y se extrajeron en 4 moles/l de guanidinio-HCl (GuHCl) durante 96 horas sin eliminación de grasa ni gelatinización de la matriz ósea desmineralizada. La solución extraída con GuHCl se filtró a través de un filtro de 0,30 \mum mediante un sistema de flujo tangencial y se ultrafiltró a través de un filtro con un punto de corte de 10 kD (Minitan, Millipore, Maryland, U.S.A.).

La solución concentrada en GuHCl que contenía el complejo de BMP se dializó frente a agua durante 24 horas y el material insoluble en agua se dializó nuevamente frente a seis volúmenes de 0,25 moles/l de tampón citrato, pH 3,1. A continuación, se recogió un total de 5,85 g de BMP de alce parcialmente purificado del material insoluble en tampón citrato tras la liofilización al final del procedimiento.

La recuperación de BMP de alce parcialmente purificada fue de 57,35 mg/kg de hueso fresco. El procedimiento preparativo utilizado en la presente invención es una modificación de un método previamente descrito por Jortikka, L. et al., Clin. Orthop. 297:33-37, 1993 y Urist et al.; en Lindholm T.S. (editor): New Trends in Bone Grafting. Acta Universitatis Tamperiensis, Universidad de Tampere, 1992, ser. B, vol. nº 40, páginas 27-39.

Ejemplo 3 Caracterización de polipéptidos osteoconductores parcialmente purificados con actividad BMP de alce prematuro

Con el fin de caracterizar BMP de alce parcialmente purificada, se disolvieron 120 mg de preparación liofilizada en 1 ml de 6 moles/l de urea y se cromatografiaron utilizando una columna HPLC de filtración en gel Sephacryl® S-200. Se muestra el cromatograma en la figura 1. Las fracciones eluidas se recogieron y compararon con los marcadores de peso molecular de la tiroglobulina, \beta-amilasa, alcohol deshidrogenasa, ovoalbúmina, anhidrasa carbónica y mioglobina. Las fracciones recogidas se liofilizaron separadamente para su caracterización adicional y bioensayo.

Se trataron 20 \mug de Fracciones I y III liofilizadas, con actividad óseo-inductora demostrada en bioensayo de músculo femoral de ratón (ver Ejemplo 4, posteriormente), con dodecil sulfato sódico (SDS) y se aplicaron en gel de poliacrilamida de enfoque isoeléctrico (intervalo de pH comprendido entre 3,5 y 9,5) para determinar los puntos isoeléctricos de las proteínas. Se utilizó un kit de calibración de enfoque isoeléctrico como estándar (Pharmacia AB, Uppsala, Suecia). El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie al 0,005%. Los puntos isoeléctricos de las Fracciones I y III, que evidenciaron actividad BMP en el bioensayo de músculo femoral de ratón, se encontraban comprendidos entre 5,3 y 5,6 en condiciones reducidas.

Ejemplo 4 Bioensayo de BMP

Con el fin de caracterizar BMP parcialmente purificada mediante HPLC de filtración en gel, se disolvieron 0,5 mg de BMP en 2,0 ml de GuHCl 4 M y se aplicaron a una columna de cromatografía HPLC Sepharyl 200 de 300 mm de longitud (Pharmacia Diagnostics, Suecia). Las fracciones eluidas se recogieron automáticamente y se compararon con las proteínas estándar a una absorbancia de 280 nm. Tras la dispersión en cápsulas de gelatina N 0,5, se implantaron 0,5, 1, 2, 5, 10 y 15 mg de la BMP parcialmente purificada separadamente en bolsas musculares en las patas traseras de ratones BALB para su bioensayo. Tras 10 y 21 días de la implantación, se evaluó la formación ectópica de hueso nuevo mediante roentgenografía e histología.

Los bioensayos de BMP semipurificada se llevaron a cabo inmediatamente después del procedimiento de extracción y se repitieron quince meses después, al llevar a cabo también la fraccionación y bioensayos de las Fracciones I-III y el enfoque isoeléctrico.

Ejemplo 5 Conservación de la BMP

El material extraido y liofilizado se conservó en estado seco en tubos cerrados y secos de vidrio estéril en una secadora a +1ºC.

Ejemplo 6 Preparación del dispositivo osteogénico Impregnación de la BMP con colágeno

Se preparó BMP purificado soluble en agua tal como se ha descrito anteriormente. El colágeno de tipo IV disponible comercialmente (Sigma Corp. NO. C 5533 procedente de membrana basal de placenta humana) son las alternativas al colágeno de utilización en el hombre.

Se disolvieron BMP purificada soluble en agua y colágeno en NaCl a temperatura ambiente y la mezcla se incubó a 4ºC durante 12 horas, con el fin de permitir a la BMP que se uniese completamente con el colágeno.

Ejemplo 7 Preparación del dispositivo osteogénico Adsorción del colágeno impregnado con BMP con un portador

Se requieren biocerámicas autorizadas para su utilización en el hombre como sustrato o portador poroso. Alternativamente, puede utilizarse hueso cortical desmineralizado humano. Si se utiliza material óseo humano, éste debe ser sometido a ensayo y aceptado por el Bone Bank System en el departamento de ortopedia y traumatología, Hospital universitario de Tampere, Finlandia. En tales casos, la desmineralización del material óseo humano con HCl 0,6 N y el procesado posterior se llevan a cabo de acuerdo con los métodos convencionales descritos en la literatura.

Entre las biocerámicas autorizadas para su utilización en el hombre, pueden utilizarse como esqueletos en los dispositivos osteogénicos los materiales siguientes, sea como tales o en combinaciones adecuadas:

(1) Biocoral® (Inoteb Corp., Saint Gonnery, Francia);

(2) hidroxiapatito (Bioland Corp., Toulouse, Francia);

(3) fosfato tricálcico (sistema de reparación esquelética, Norian Corp., CA, U.S.A.);

(4) fosfato tricálcico (Howmedica, Warsaw, U.S.A.); y

(5) vidrio bioactivo

La adsorción del colágeno impregnado con BMP al sustrato o bloques portadores porosos se llevó a cabo siguiendo las etapas siguientes:

(1) Se sumergió el bloque portador en una solución de mezcla de colágeno impregnado con BMP en un recipiente y se introdujo en un horno de vacío a una temperatura comprendida entre 25 y 30ºC hasta liberar todas las burbujas en el sustrato. El recipiente con la solución de colágeno impregnado con BMP que contenía adicionalmente los bloques portadores sumergidos se mantuvo a 4ºC durante 6 horas con el fin de atrapar más BMP en el sustrato o portador poroso.

(2) La solución de mezcla con el bloque de sustrato poroso se vertió en tubos de dialización (corte de entre 12.000 y 14.000 daltons) y éstos se dializaron frente a tampón glicina 10 mM, pH 5,9, agitando a 4ºC durante 24 horas.

(3) Tras completar la dialización, se retiraron los bloques de la solución de dialización y se introdujeron en un modelo plástico conformable preparada en diversas formas y tamaños para adaptarse a las dimensiones de los bloques portadores y finalmente se centrifugó la solución dializada (3.200 rpm durante 20 minutos).

(4) Se descartó el sobrenadante de la solución centrifugada que no contenía colágeno impregnado con BMP y después se recubrieron los bloques portadores individuales en el modelo conformable con alícuotas de precipitado resuspendido, el cual contenía algún resto o residuo de BMP impregnado en los viales de centrifugación.

(5) Los dispositivos osteogénicos en los modelos plásticos conformables se sometieron a liofilización.

La dosis de BMP y colágeno en el dispositivo osteogénico preparado se midió en microgramos por centímetro cúbico de portador. Dichas dosis eran de 100 \mug de BMP y 500 a 1.000 \mug de colágeno/cm^{3} de portador.

Ejemplo 8 Reconstitución de implantes compuestos

Los cilindros de fosfato tricálcico (B247, DePuy, Warsaw, IL, U.S.A.) y barras de coral natural (Biocoral®, Inoteb, Saint-Gonnery, Francia) eran biomateriales disponibles comercialmente con una arquitectura similar a la del hueso humano. La porosidad del fosfato tricálcico y el coral natural se encuentra comprendida entre el 20 y el 50% y el tamaño de poro, entre 150 y 500 micrométros, presentando gran número de canales de interconexión. Las cerámicas se mecanizaron para formar discos de 4 mm de diámetro y 2 mm de grosor. El colágeno de tipo IV (Sigma, St. Louise, MO, U.S.A.) se disolvió en HCl 0,25 M que contenía NaCl 0,5 M, se dializó frente a agua y se centrifugó para eliminar impurezas.

Se redisolvieron mBMP parcialmente purificada y colágeno de tipo IV dializados en proporción 4 a 1 en solución de GuHCl 4 M y se incubaron a 20ºC durante la noche. A continuación, se sumergieron los discos de fosfato tricálcico y de coral natural en las soluciones de mezcla que contenían concentraciones elevadas o reducidas de BMP de alce, respectivamente. Las soluciones de mezcla triple se dializaron frente a diez volúmenes de tampón glicina 10 mM, pH 5,9, bajo agitación durante 24 horas. Las soluciones de mezcla se centrifugaron a 3.200 rpm tras transferir los discos de fosfato tricálcico y de coral natural a pequeños tubos individuales. La alícuota de precipitado en los viales de centrifugación se dispersó en pequeños tubos que contenían el disco de fosfato tricálcico o de coral natural. Los tubos se sometieron a liofilización durante 48 horas.

Cada preparación compuesta coral natural-colágeno-BMP, fosfato tricálcico-colágeno-BMP contenía 8 mg de BMP de alce en el grupo de dosis elevada y 4 mg de BMP en la de dosis reducida.

Mediante el mismo procedimiento, se prepararon combinaciones de BMP, fosfato tricálcico y coral natural con colágeno de tipo IV (colágeno-BMP, fosfato tricálcico-colágeno y coral natural-colágeno) como controles de portador. se utilizaron BMP de alce, fosfato tricálcico y coral natural solos como controles de componente. Todos los implantes se expusieron a óxido de etileno para su esterilización antes de la implantación.

Ejemplo 9 Esterilización y almacenamiento del dispositivo osteogénico

Para esterilizar el dispositivo hay disponibles varios métodos convencionales. Sin embargo, algunos de ellos, por ejemplo la radiación gamma, no está autorizada en algunos países, y la esterilización por calor no es aceptable debido a que causa la desnaturalización de las proteínas.

En consecuencia, se esterilizó el dispositivo osteogénico con gas dióxido de etileno durante 2 horas en un esterilizador sellado y se evaporó por ventilación durante 2 a 3 horas.

Ejemplo 10 Preparación de sustituto óseo compuesto para ovejas

El cilindro de fosfato tricálcico era un biocerámica disponible comercialmente con una arquitectura y química similares al hueso humano. Los cilindros conformados tenían 15 mm de diámetro y 16 mm de longitud con un bloqueador de 3 mm de longitud en cada extremo. Se perforó longitudinalmente un orificio central de 4 mm de diámetro con el fin de reproducir un canal medular. Se disolvió el colágeno de tipo IV en solución de HCl 0,25 M que contenía NaCl 0,5 M y se dializó para eliminar impurezas. La proteína morfogenética ósea extraída químicamente de las tibias y fémures frescos de oveja con GuHCl 4 M en nuestro laboratorio se purificó parcialmente a través de un filtro de 0,65 \mum mediante un sistema de flujo tangencial, se dializó y se liofilizó.

La dosis mínima de BMP ovina parcialmente purificada, extraída tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, que indujo formación ósea ectópica detectable radiológicamente en bolsas musculares de ratones BALB fue de 4,8 mg a las 3 semanas de la implantación. Se disolvió BMP ovina a dosis alta o baja y colágeno de tipo IV purificado, en solución de GuHCl 4 M en una proporción de 5 a 1 y se incubó a 20ºC durante la noche. El cilindro de fosfato tricálcico se sumergió en la solución de mezcla y después se dializó frente a diez volúmenes de tampón glicina 10 mM, pH 5,9 durante 24 horas. La centrifugación de la solución de mezcla dializada se llevó a cabo tras transferir el cilindro de fosfato tricálcico a un molde plástico conformable.

Se recubrió la superficie del cilindro correspondiente de fosfato tricálcico en el molde con el precipitado que contenía el resto de BMP ovina en el vial de centrifugación. Tras liofilizar, cada sustituto óseo compuesto contenía 13 mg de BMP ovina en el grupo de dosis baja de sustituto óseo compuesto (CBSL) y 100 mg de BMP ovina en el grupo de dosis alta de sustituto óseo compuesto (CBSH). Los cilindros de fosfato tricálcico impregnados con una dosis correspondiente de colágeno de tipo IV se prepararon mediante el mismo procedimiento al utilizado con el control. Todos los implantes preparados se sometieron a exposición con óxido de etileno para su esterilización antes de implantarlos.

Experimento 1

Actividad óseo-inductora de la BMP de alce parcialmente purificada y de las Fracciones I, II y III

La actividad óseo-inductora de la BMP de alce parcialmente purificada y de las Fracciones I, II y III de la filtración en gel Sephacryl® S-200 (figura 2) se bioensayaron en ratones BALB de 28 a 35 días de edad. Se implantaron separadamente cápsulas con dosis diferentes en bolsas bilaterales de músculo femoral en los ratones.

Experimento 2

Resultados de nueva formación ósea en ratones utilizando el complejo modificado de BMP osteoconductiva

Poco después de la extracción de la BMP de alce obtenida en el Ejemplo 2, la formación ectópica de hueso nuevo en las bolsas musculares era detectable radiográficamente e histológicamente a una dosis de 2 mg de BMP a los 21 días de la implantación. Al incrementar la dosis de BMP de alce parcialmente purificada de 5 a 10 mg, aumentó parcialmente la cantidad de hueso de nueva formación en las radiografías a los 21 días. Sin embargo, no hubo incremento adicional de hueso de nueva formación con esta cantidad de BMP. Los análisis histológicos revelaron que el tejido nuevamente formado comprendía en su mayor parte un osículo de hueso trenzado que presentaba médula ósea.

Al repetir el bioensayo con BMP purificada 15 meses después, en las radiografías sólo se detectó una cantidad pequeña de tejido ectópico calcificado en comparación con los primeros bioensayos y posteriormente, 21 días después de la implantación, la cantidad y densidad del tejido calcificado eran claramente menores en comparación con las observadas con las dosis correspondientes a los 10 días. El análisis histológico reveló una masa de cartílago a los 10 días y una pequeña isla de tejido trenzado a los 21 días de la implantación. Se observaron más células inflamatorias alrededor del hueso nuevamente formado a los 21 días que a los 10 días.

El resultado de la filtración en gel consistía en tres fracciones de proteína de diferente peso molecular (figura 1). Se identificaron las Fracciones I, II y III con pesos moleculares de 700-100, 55-25 y 25-15 kD, respectivamente. Los puntos isoeléctricos de las Fracciones I y III, que mostraban actividad BMP en el bioensayo de músculo femoral de ratón, estaban comprendidos entre 5,3 y 5,6 en condición reducida. Podían distinguirse tres bandas diferentes de proteína dentro de este intervalo de pI en ambas fracciones con actividad BMP. Las dos fracciones óseo-inductoras de BMP de alce eran proteínas ácidas tras el fraccionamiento de una etapa.

Se indujo la formación ósea ectópica radiográficamente visible en este experimento con 4,5 mg de Fracción I de BMP y con 5,5 mg de Fracción III. La cantidad y densidad de hueso ectópico inducidos por la misma dosis de Fracciones I y III eran radiológicamente mayores a los 21 días que a los 10 días, en contraste con la BMP parcialmente purificada tras quince meses de la extracción.

Histológicamente, las Fracciones I y III de BMP indujeron la formación de cartílago completamente desarrollado en 10 días y pudo observarse una transformación inicial de cartílago a hueso trenzado. Se desarrolló un osículo completo con tejido medular óseo normal en 21 días. Se observó un remodelado más avanzado del osículo nuevamente formado con la Fracción I que con la Fracción III a los 21 días de la implantación. No hubo apenas infiltración de células inflamatorias con las Fracciones I y III, ni a los 10 ni a los 21 días, en contraste con la BMP de alce parcialmente purificada o la Fracción II.

La Fracción II inició un parche radiográficamente visible de calcificación ectópica en 10 días aunque éste se había reducido a los 21 días de la implantación. El análisis por microscopía de las muestras reveló que las calcificaciones estaban compuestas de un parche de sustancia cristalina granular sin estructura ósea o cartilaginosa.

Una gran cantidad de células inflamatorias alrededor de los cristales expresaron una reacción inflamatoria severa. No se observaron microscópicamente trazas de formación de hueso nuevo a los 21 días de la implantación. En comparación con el complejo de BMP parcialmente purificado en dosis idénticas tras quince meses de almacenamiento, las Fracciones I y III indujeron ectópicamente más hueso nuevo maduro en una etapa más temprana y simultáneamente una menor reacción inflamatoria.

Sin embargo, la actividad óseo-inductora de la BMP parcialmente purificada inicialmente después de la extracción se correspondía bien con la actividad de las Fracciones I y III de la filtración en gel llevada a cabo a los 15 meses.

Experimento 3

Potencial osteoinductor de la BMP de las cerámicas de coral natural y de fosfato tricálcico impregnadas con BMP de alce y con colágeno de tipo IV según determinaciones en ratones

Mediante la utilización de proteína morfogenética ósea de alce parcialmente purificada obtenida por los métodos descritos en el Ejemplo 2 y las cerámicas de coral natural y de fosfato tricálcico impregnadas con colágeno de tipo IV, se estableció el potencial osteoinductor de los compuestos mediante incorporación de ^{45}Ca en ratones BALB. Los implantes compuestos se prepararon mediante un método combinado de diálisis y recubrimiento.

Se asignaron 132 ratones BALB a 12 grupos experimentales dependiendo de los diferentes componentes y dosis de BMP de alce en el compuesto (ver Tabla 1). La incorporación de ^{45}Ca en las diferentes preparaciones de compuesto fue notablemente superior a la de colágeno-BMP y BMP sola (p<0,01). El pico más elevado de incorporación de ^{45}Ca tuvo lugar en el caso de coral natural-colágeno con 8 mg de BMP en el décimo día. Dicha incorporación fue significativamente mayor que con fosfato tricálcico-colágeno y 8 mg de BMP de alce, de colágeno-BMP o de BMP solo.

TABLA 1

1

Se evaluó la formación ectópica de hueso nuevo mediante radiografía (100 mA, 20 kV, 0,08 s/exp.; Mamex de Maq, Soredex, Orion Corporation Ltd.) y secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina y azur II a los 10 y 21 días después de la implantación.

En los implantes de compuesto con componentes idénticos también se observaron diferencias entre los cargados con 8 y con 4 mg de BMP de alce tanto en el 10º día como en el 20º día (p<0,01). Los portadores compuestos, coral natural-colágeno, fosfato tricálcico-colágeno, regularon positivamente el potencial osteoconductor de la BMP. El compuesto de coral natural-colágeno-BMP presentaban una inductividad ósea todavía más potente que el compuesto fosfato tricálcico-colágeno-BMP. La estructura multiporosa, geometría y diferentes propiedades químicas de las cerámicas en combinación con las modulaciones biológicas del colágeno de tipo IV sobre BMP probablemente potenciaron el efecto local de la BMP sobre las células inducibles.

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Experimento 4

Implantación y métodos analíticos

Se asignaron ciento treinta y dos ratones BALB de 28 a 32 días de edad a 12 grupos experimentales. Las variables independientes incluían la presencia de implantes compuestos o portadores solos, BMP de alce con o sin colágeno y coral natural o fosfato tricálcico solos. La implantación se llevó a cabo bilateralmente en bolsas musculares en las patas traseras del ratón. Se resumen en la Tabla 2 el agrupamiento de los animales y materiales implantados. El periodo de observación fue de 10 y de 20 días.

TABLA 2

2

*Tasa osteoconductora: nº de muestras positivas/nº de implantes. El significado de las abreviaturas en la

tabla se explica en el texto.

Veinticuatro horas después del sacrificio, cada ratón recibió una inyección intraperitoneal de solución diluida de ^{45}Ca libre de portador (Amersham, Inglaterra) a 4 \muCi/kg de peso corporal. Las patas traseras con implantes diseccionadas se radiografiaron mediante mamografía (100 mA, 20 KV, 0,06 s) antes de muestrear. El tejido, incluyendo el implante y el hueso nuevamente formado, se tomó en bloque como un espécimen.

Se tomó una pieza del músculo y del fémur de una pata trasera como referencia para la incorporación de ^{45}Ca en diferentes tejidos originados en el mismo animal. Todos los especímenes se pesaron y se digirieron en una mezcla de 0,2 ml de ácido perclórico al 70% y 0,4 ml de peróxido al 33%, 70ºC durante 3 horas (Mahin et al., Anal. Biochem. 16:500-509, 1966). Después, se pipetearon 0,6 ml de solución digerida en un vial de centelleo difuso y se añadieron 5 ml de cóctel de centelleo (OptiPhase Hi-Safe 3', Wallac, Inglaterra).

Se midió la radioactividad en muestras homogéneas en un contador de centelleo líquido (Wallac 1410, Pharmacia, Finlandia) con biblioteca de espectro interno, la incorporación de ^{45}Ca en el hueso nuevamente formado, músculo y fémur se calculó como DPM/mg de tejido, respectivamente. Se recuperaron un par de muestras en cada grupo, se fijaron y enfriaron con etanol al 70% y se incluyeron en metilmetacrilato (MMA). Se realizó una sección de material no desmineralizado de 10 \mum de grosor utilizando un método de corte y molido (Exakt-Apparatebau, Hamburgo, Alemania) y se tiñó con toluidino azul para su análisis por microscopía óptica. Para el análisis estadístico se realizó una ANOVA-GLM y pruebas de Scheffe. Las diferencias significativas se definieron al nivel de p<0,01.

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Experimento 5

Resultados Caracterización y bioactividad de BMP de alce

La cromatografía HPLC estableció que la preparación de mBMP parcialmente purificada era un multímero que presentaba un peso molecular comprendido entre 11 y 700 kD. Los componentes dominantes comprendían fracciones de polipéptido de bajo peso molecular, de 11 a 40 kD en el espectro (figura 2). La capacidad inductora de hueso ectópico de la BMP de alce se confirmó radiográficamente e histológicamente a los 10 y 21 días de la implantación. La formación de hueso nuevo en la bolsa muscular era detectable radiográficamente a una dosis de tan sólo 2,0 mg de BMP de alce parcialmente purificada. A medida que se incrementaba la dosis de 0,5 a 15 mg, aumentaba claramente la cantidad de hueso de nueva formación. El análisis histológico mostró que el hueso nuevamente formado estaba compuesto principalmente de cartílago hipertrófico normal y hueso trenzado con tejido medular.

Experimento 6

Incorporación de ^{45}Ca

La incorporación de ^{45}Ca en los diferentes grupos de ensayo con implantes compuestos fue notablemente superior a la de los controles de colágeno-BMP, BMP, coral natural-colágeno, fosfato tricálcico-colágeno, coral natural y fosfato tricálcico solos. El pico más elevado de incorporación de ^{45}Ca tuvo lugar en el compuesto de coral natural-colágeno-BMP con dosis elevada de BMP de alce (28,06 \pm 2,83 DPM/mg tejido) en el 10º día. Dicha incorporación fue significativamente mayor que en el compuesto de fosfato tricálcico-colágeno-BMP (19,45 \pm 3,05 DPM/mg de tejido), colágeno-BMP y BMP (6,09 \pm 0,43 y 5,6 \pm 0,24 DPM/mg de tejido) con dosis elevada de BMP de alce en el día 10º, respectivamente.

Se observó la misma tendencia en los grupos con dosis elevada de BMP de alce en el 20º día y con dosis reducida de BMP de alce tanto en el 10º día como en el 20º día, en comparación con los grupos correspondientes en el 10º día, se observaron incorporaciones significativamente menores de ^{45}Ca en el implante compuesto, grupos de colágeno-BMP y de BMP en el 20º día. También se demostraron discrepancias entre los implantes compuestos que presentaban idénticos componentes, tanto con dosis elevadas como con dosis reducidas de BMP de alce y en los mismos periodos de observación (p<0,01). La incorporación de ^{45}Ca en los diferentes controles de cerámicas fue más o menos similar a la del músculo. Sin embargo, se observó una incorporación de ^{45}Ca más elevada en el coral natural, con o sin colágeno, que en el fosfato tricálcico con o sin colágeno en el 10º día y no en el 20º día (figura 3).

No hubo diferencias significativas de incorporación de ^{45}Ca en los músculos o fémures entre ratones implantados con BMP de alce y los no implantados, ni entre el 10º y el 20º día. La implantación de BMP de alce en bolsas locales de músculo aparentemente no afectó al metabolismo sistémico del calcio.

Experimento 7

Evaluación radiológica e histológica

De manera compatible con los resultados obtenidos con el trazador ^{45}Ca, radiológicamente se observó osteoinducción ectópica en implantes compuestos, grupos de colágeno-BMP y BMP, pero no en todos los controles de cerámicas con o sin colágeno en el 10º día y en el 20º día después de la implantación. Hueso de nueva formación rodeaba y bordeaba los discos de cerámica, los cuales mostraban un claro contraste contra la sombra de los músculos en las películas de rayos X. Veinte días después de la implantación, la cantidad y densidad de hueso de nueva formación eran claramente menores en comparación con los de los grupos correspondientes a los 10 días. En la Tabla 2 se muestran las tasas de osteoinducción en los diferentes grupos y tiempos. Los análisis histológicos revelaron que el hueso nuevamente formado comprendía en su mayor parte parches de hueso trenzado normal y cartílago formados en 10 días y no en 20 días. Algo del hueso trenzado y del cartílago se encontraba fragmentado y muchos cariocitos se infiltraban en las secciones 20 días después de la implantación. Se observó formación negativa de hueso y proliferación de tejido fibroso sin infiltración aparente de cariocitos en los controles sin BMP.

Experimento 8

Inducción y cicatrización óseas en ovejas

Se utilizaron defectos diafisarios segmentarios de tibias en dieciocho ovejas para evaluar el potencial de inducción y cicatrización óseas por un sustituto óseo compuesto que comprendía un cilindro de fosfato tricálcico impregnado con BMP ovina de origen natural y colágeno de tipo IV. Los sustitutos óseos compuestos se cargaron con una dosis reducida, 13 mg, y con una dosis elevada, 100 mg, de BMP ovina, respectivamente. Los cilindros de fosfato tricálcico impregnados con solo colágeno de tipo IV se utilizaron como controles. De acuerdo con la inducción ósea dosis-dependiente de la BMP ovina, se cuantificó un área significativamente mayor y una intensidad más altamente integrada de callo externo de nueva formación en el sustituto óseo compuesto de dosis elevada que en el sustituto óseo compuesto de dosis reducida o en los cilindros de fosfato tricálcico, utilizando un analizador computerizado de imágenes, tanto a las 3 como a las 6 semanas. La prueba de torsión demostró que la capacidad de torca máxima, la deformación angular máxima, la absorción de energía y la rigidez ósea de tibias osteotomizadas y cicatrizadas con implantes se recuperaba entre el 49 y el 80% al utilizar los cilindros de fosfato tricálcico, 72 a 109% con sustitutos óseos compuestos de dosis reducida y 117 a 175% con sustitutos óseos compuestos de dosis elevada, contra las tibias contralaterales correspondientes a las 16 semanas. Se observó una rigidez ósea significativamente mayor en los sustitutos óseos compuestos de dosis elevada en comparación con los sustitutos óseos compuestos de dosis reducida. Dotado de osteoinductividad, osteoconductividad y resistencia mecánica, el sustituto cónico compuesto definido en el presente estudio es más accesible a su aplicación clínica.

Experimento 9

Procedimientos quirúrgicos

Se utilizó un modelo de defecto segmentario tibial para evaluar la cicatrización ósea en dieciocho ovejas adultas, 14 hembras y 4 machos, con un peso corporal medio de 44,11 \pm 6,35 kg. Se mantuvieron en rediles para ovejas durante 4 a 7 días antes de la operación.

Se indujo la anestesia con Propolol (2 mg/kg) y se mantuvo con 2 a 2,5% de halotano en oxígeno en un sistema de ventilación semicerrado tras la incubación. Bajo condiciones estériles, se expusieron las tibias derechas mediante aproximación medial. Se pretaladraron y roscaron los orificios proximales y distales de la placa previamente a la resección del hueso largo. Los defectos segmentarios unilaterales, estandarizados a 16 mm de longitud, se crearon subperiostialmente con una sierra Gigli. Tras irrigar exhaustivamente el campo de operación, se sustituyeron los defectos con 6 sustitutos óseos compuestos de dosis reducida y con 6 implantes de cilindros de fosfato tricálcico, respectivamente. Los implantes se aseguraron firmemente en el defecto con bloqueadores en cada extremo insertados en el canal medular. Las tibias osteotomizadas se inmovilizaron con dos placas de autocompresión curvadas y solapadas, de 4 mm de grosor y con 8 y 6 orificios respectivamente y tornillos corticales en el lado medial de las tibias. Los músculos y piel se cerraron por capas. Se administró a cada oveja una dosis de bencilpenicilina (66.000 I.U.) intravenosa una hora antes de la operación y penicilina procaína (36.000 I.U.) intramuscular cada día durante 4 días consecutivos después de la operación con el fin de protegerles de posibles infecciones. Se permitió a los animales que caminasen sin restricciones inmediatamente después de la cirugía.

Experimento 10

Cuantificación en imágenes

Se hicieron radiografías craneocaudales y lateromediales en secuencia de las tibias osteotomizadas a las 3, 6, 12 y 16 semanas de la cirugía. Todos los radiogramas obtenidos entre las 3 y 12 semanas se escanearon mediante un escáner computerizado de densidad óptica del Bio Image System (6 XRS, Millipore Corporation, U.S.A.) conectado a un Sunspark Station EIPX y se analizaron con software 2D del sistema para seguir cuantitativamente los cambios en área e intensidad integrada en las imágenes craneocaudales y lateromediales de cada muestra, los valores se estandarizaron a un cuarto del área total y de la intensidad integrada del callo, respectivamente.

La unidad se definió como un mm^{2} de área y densidad óptica de intensidad integrada. Tras eliminar el tejido blando y las placas, las tibias de las ovejas se tomografiaron mediante tomografía computerizada (CT) en secciones axiales consecutivas en intervalos de 3 mm para cuantificar el área transversal y densidad medias del callo. La densidad se expresó en unidades Hunsfield (10).

Experimento 11

Ensayo mecánico

Todas las tibias recogidas de ambos lados se mantuvieron húmedas en solución salina fisiológica, se sellaron en bolsas de plástico separadamente y se congelaron a -20ºC hasta la realización del ensayo mecánico.

El ensayo mecánico se llevó a cabo utilizando una máquina modificada de pruebas de torsión (Lepola et al., Clin. Orthop. 297:55-61, 1993). Se prefijó una velocidad angular constante de 6,5 grados por segundo, tal como en el estudio por Strömberg et al., Acta Orthop. Scand. 47:257-263, 1976). La máquina incluía circuitos electrónicos para la medición de la deformación de excitación y de la torca. El extremo no rotativo de la máquina estaba dotado de un sensor de torca basado en el medidor de deformación. La capacidad máxima de carga de la máquina era de 250 Nm. Los errores totales de la máquina eran inferiores al 1%. Se registraron las curvas de carga torsional con una impre-
sora.

Se descongelaron las tibias a temperatura ambiente durante 4 horas y a continuación ambos extremos se recortaron e incluyeron en moldes circulares no simétricos de aluminio utilizando resina de poliéster. Se mantuvieron la orientación del molde y la centralidad del hueso con un soporte de molde especialmente diseñado al efecto.

El brazo torsional era de 135 mm. Los especímenes se saturaron en solución salina durante la preparación y el ensayo. La prueba de torsión se llevó a cabo aplicando la carga a una velocidad angular de 6,5 grados por segundo hasta que la tibia alcanzaba el punto de fractura. Se utilizó la tibia contralateral en la que se habían practicado orificios correspondientes como control apareado frente a la tibia osteotomizada.

Se calculó el porcentaje de capacidad máxima de torca (MTC), ángulo máximo de deformación (MA), absorción de energía (AE) y rigidez ósea (BS) en las tibias osteotomizadas frente a las contralaterales.

De acuerdo con una prueba piloto con tibias intactas de oveja, los errores estándar del método fueron las siguientes:

MTC 4,7%, MA 8,4%, BS 8,6% y AE 13,1%. Los sitios de las líneas de fractura se registraron y se compararon entre tibias implantadas y sustitutos óseos compuestos y con los cilindros de fosfato tricálcico.

Experimento 12

Histología

Tras las pruebas mecánicas, se serraron transversalmente en rodajas de 0,4 a 2,0 mm de grosor utilizando una sierra de cinta de diamante (Accutome 5, Struers Tech A/S, Copenhagen, Dinamarca) los bloques de especímenees que incluían los materiales implantados, se fijaron inmediatamente en formaldehído neutro al 10% y se incluyeron en metilmetacrilato. Se preparó una sección histológica no desmineralizada de 12 a 20 \mum de grosor utilizando un método de corte y molido y se tiñó con tinción de Van Gieson para su análisis por microscopía óptica.

Experimento 13

Análisis estadístico y resultados

Se utilizaron el programa de análisis de la varianza GLM-ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Duncan para el análisis estadístico de todos los datos cuantitativos. Un resultado se consideró significativo si p<0,05.

Durante el periodo experimental se excluyó una oveja en el grupo de fosfato tricálcico-colágeno a las 5 semanas debido a una fractura con separación del cóndilo distal de la tibia osteotomizada y pérdida de la inmovilización. Una oveja con una dosis reducida de BMP ovina se sacrificó debido a la exposición de las placas y la infección del sitio osteotomizado a las 8 semanas de la cirugía. Dieciséis ovejas completaron el estudio al final de las 16 semanas.

Experimento 14

Análisis de imágenes

Se demostró radiográficamente la formación visible de callo en todos los grupos a las 3 semanas de la cirugía. El grado de crecimiento del callo alcanzó su máximo a las 6 semanas y posteriormente decreció entre las 12 y las 16 semanas. La radiodensidad del callo aumentó gradualmente entre la 3º y la 16º semana. Se depositó hueso nuevo alrededor de los sitios osteotomizados excepto en la cara inferior de la placa. El callo interfragmentario de nueva formación estaba localmente curvado alrededor de los grupos de sustitutos óseos compuestos y no distribuido longitudinalmente bajo el periostio como en el grupo de cilindros de fosfato tricálcico.

El análisis computerizado de imágenes mostraba que el área e intensidad integrada del callo interfragmentario eran mucho mayores en los sustitutos óseos compuestos supercargados con 100 mg de BMP ovina que en sustitutos óseos compuestos con 13 mg de BMP ovina o con cilindros de fosfato tricálcico entre la 3º y 12º semana después de la implantación. Se observaron diferencias significativas en el área e intensidad integrada del callo entre los tres grupos y en diferentes semanas.

Al terminar el experimento, se observó una buena osteointegración del callo de nueva formación y los implantes en las secciones transversales del escaneo de tomografía computerizada (CT). No se observa demarcación aparente entre los implantes y el callo interfragmentario. En consonancia con el análisis computerizado de imágenes, la discrepancia en la densidad media del callo en secciones axiales consecutivas del escaneo CT era significativa entre diferentes grupos a las 16 semanas. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa simultánea en el área del callo entre los diferentes grupos (Tabla 3).

La biodegradación de los cilindros de fosfato tricálcico se observó radiográficamente y tomográficamente con escaneo CT. La resorción de los cilindros de fosfato tricálcico tuvo lugar en la circunferencia y a lo largo de la pared interna del orificio central del cilindro a partir de las 6 semanas de la implantación. Algunos de los cilindros de fosfato tricálcico se fragmentaron y algunos quedaron intactos hasta el final del experimento. Aparentemente se dio más degradación del cilindro de fosfato tricálcico en el grupo de sustitutos óseos compuestos que en el grupo de fosfato tricálcico-colágeno.

TABLA 3

3

\text{*}Diferencia significativa (análisis de GLM-ANOVA)

Experimento 15

Prueba mecánica

En la Tabla 4 se resumen los datos de la prueba de torsión.

La capacidad de torca máxima, máxima deformación angular de rotura, absorción de energía y rigidez ósea de las tibias osteotomizadas con implantes se recuperaron en un 49 a 80% con fosfato tricálcico-colágeno, 72 a 109% con sustitutos óseos compuestos de dosis reducida y 117 a 175% con sustitutos óseos compuestos de dosis elevada, frente a las tibias contralaterales correspondientes a las 16 semanas. En comparación con el control de fosfato tricálcico-colágeno, los parámetros mecánicos incrementados se observaron en los grupos de sustitutos óseos compuestos de dosis reducida y de sustitutos óseos compuestos de dosis elevada.

En el grupo de los sustitutos óseos compuestos de dosis elevada todos los parámetros de las tibias cicatrizadas eran similares a los de la tibia contralateral con orificios coincidentes. Los valores porcentuales medios de rigidez ósea eran significativamente diferentes en el sustituto óseo compuesto de dosis elevada de fosfato tricálcico-colágeno y el sustituto óseo compuesto de dosis baja, aunque no se demostró diferencia significativa entre fosfato tricálcico-colágeno y sustituto óseo compuesto de dosis baja al aparearlos utilizando una GLM-ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Duncan.

TABLA 4

4

\text{*}Diferencia significativa (análisis de GLM-ANOVA)

Todos los especímenes se rompieron en un patrón de fractura espiral consistente con la fuerza torsional aplicada. La línea de fractura a través de la interfase de contacto implante-hueso se dio en 2 de los 5 cilindros de fosfato tricálcico, en 2 de los 5 sustitutos óseos compuestos de dosis baja y en uno de los 6 sustitutos óseos compuestos de dosis elevada.

Experimento 16

Histología

Se pudo observar la formación de hueso nuevo en los poros internos, canales interconectados y periferia de los cilindros de fosfato tricálcico cargados con o sin BMP ovina. El hueso lamelar, bien remodelado, era morfológicamente normal y no se observaba infiltración de células inflamatorias alrededor de los implantes ni en el grupo de sustitutos óseos compuestos ni en el de fosfato tricálcico-colágeno a las 16 semanas. Se observó hueso nuevo remodelado más avanzado en sustitutos óseos compuestos cargados con una dosis baja o alta de BMP ovina. Las áreas de hueso remodelado adyacentes a los orificios centrales en los cilindros de fosfato tricálcico aparentemente estaban colonizadas por células de médula ósea normales. No había tejido fibroso interpuesto en la interfase entre el hueso de nueva formación y el cilindro de fosfato tricálcico. Se observó más absorción y disolución de los cilindros de fosfato tricálcico cerca del callo endoperiostial y canal medular en el grupo de los sustitutos óseos compuestos que en el de fosfato tricálcico-colágeno.

En conclusión, el sustituto óseo compuesto con tres componentes proporcionó las ventajas de osteoinducción, osteoconducción y resistencia mecánica. En la actualidad, los avances en la investigación de biomateriales han proporcionado mejores posibilidades de identificación de un biomaterial apropiado como esqueleto para sustitutos óseos compuestos. Las limitadas fuentes y la impureza de la BMP de origen natural podría evitarse preparando BMP recombinante. Con el desarrollo de las técnicas de reconstitución, se hará disponible un sustituto óseo compuesto deseable para la sustitución de injertos autogénicos o alogénicos en el ser humano. El aspecto sustancialmente más relevante del presente estudio experimental ha sido el énfasis sobre la necesidad y las ventajas del desarrollo de un sustituto óseo bioactivo sintético para la práctica médica.

Experimento 17

Inducción y cicatrización óseas en humanos

Se iniciará una prueba clínica en marzo de 1996. En dicha prueba clínica se utilizarán materiales compuestos de Biocoral^{TM}-BMP bovina y de fosfato tricálcico-BMP bovina para tratar pacientes con fracturas óseas que muestran dificultades para cicatrizar. Los materiales compuestos se preparan tal como se ha indicado anteriormente y las pruebas a llevar a cabo son esencialmente las mismas que las descritas anteriormente.

Claims (10)

1. Dispositivo osteogénico que comprende una proteína morfogenética ósea (BMP), un componente colágeno, un cuerpo portador poroso conformable y factores de crecimiento opcionales, caracterizado porque la BMP es un complejo de proteína morfogenética ósea (BMP) modificada que comprende una BMP parcialmente purificada que carece de una fracción de proteína con propiedades inmunogénicas e inflamatorias, que presenta un peso molecular (PM) de 25 a 55 kD según determinación mediante filtración en gel, consistiendo dicho complejo de BMP modificada en una fracción de proteína con actividad BMP osteoinductora con un PM de 100 a 700 kD según determinación mediante filtración en gel y/o una fracción de proteína con actividad BMP osteoinductora con un PM de 15 a 25 kD según determinación mediante filtración en gel.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de BMP modificada consiste esencialmente en una fracción de proteína con actividad BMP osteoinductora con un PM de 15 a 25 kD según determinación mediante filtración en gel y dicha fracción se caracteriza además por presentar una capacidad de almacenamiento prolongada.

3. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de BMP modificada consiste esencialmente en una fracción de proteína con actividad BMP osteoinductora con un PM de 100 a 700 kD según determinación mediante filtración en gel.

4. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el colágeno se selecciona de entre el grupo que consiste en mezclas de colágeno, colágenos atelopéptidos, colágeno de tipo IV y colágeno de tipo I.

5. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el componente colágeno es colágeno de tipo IV.

6. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el cuerpo portador poroso conformable se selecciona de entre un grupo que comprende hidroxiapatito, fosfato tricálcico, vidrio bioactivo y coral natural originados en un esqueleto de coral.

7. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque el cuerpo portador poroso conformable es un coral natural seleccionado de un esqueleto de coral.

8. Método para producir el complejo de BMP modificada para el dispositivo osteogénico según la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo de BMP modificada es susceptible de ser obtenido mediante un método que comprende las etapas siguientes:

(a)

pulverizar el material óseo desmineralizado;

(b)

extraer el material óseo de la etapa (a) con hidrocloruro de guanidinio (GuHCl);

(c)

llevar a cabo una filtración utilizando un sistema de flujo tangencial;

(d)

llevar a cabo una filtración en gel mediante la que puede obtenerse un complejo de BMP parcialmente purificada que muestra tres picos que comprenden tres fracciones de proteína, caracterizadas por presentar diferente peso molecular, siendo la Fracción I una proteína de alto PM (100 a 700 kD) con actividad BMP osteoinductora, siendo la Fracción II una proteína inmunogénica de PM intermedio (25 a 55 kD) que carece de actividad BMP y siendo la Fracción III una proteína de bajo PM (15 a 25 kD) que presenta actividad BMP osteoinductora; y

(e)

eliminar de la BMP parcialmente purificada una fracción de proteína con propiedades inmunogénicas e inflamatorias que presenta un PM de 25 a 55 kD según determinación mediante filtración en gel.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque para la purificación se lleva a cabo por lo menos una cromatografía de alto rendimiento (HPLC) y filtración en gel.

10. Utilización del complejo de BMP modificado, en la que dicho complejo de BMP modificado comprende una fracción de proteína con actividad BMP osteoinductora que presenta un PM de 100 a 700 kD según determinación mediante filtración en gel y/o una fracción de proteína con actividad BMP osteoinductora que presenta un PM de 15 a 25 kD según determinación mediante filtración en gel, para la preparación de un dispositivo osteogénico con propiedades osteoinductoras mejoradas, siendo dicha mejora la falta de propiedades inmunogénicas e inflamatorias y una capacidad de almacenamiento prolongada.