ES2238522T3 - Metodo para preparar conjugados del factor viii y un polimero biocompatible. - Google Patents
Metodo para preparar conjugados del factor viii y un polimero biocompatible.Info
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Abstract
Un proceso para mejorar la función in vivo del factor VIII protegiendo dianas expuestas de dicho polipéptido, caracterizado por: (a) la inmovilización del factor VIII por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico; (b) la activación de un polímero biocompatible; (c) la conjugación del polímero biocompatible activado con sitios externos del factor VIII inmovilizado; y (d) la elución del conjugado del adsorbente
Description
Método para preparar conjugados del factor VIII y
un polímero biocompatible.
La presente invención se refiere a un proceso
para mejorar la función in-vivo de un
polipéptido protegiendo las dianas expuestas de dicho polipéptido,
inmovilizando el polipéptido en un adsorbente con especificidad de
grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico fabricados por
síntesis de química orgánica, activando el polímero biocompatible,
conjugando el polímero biocompatible activado de esta manera con el
polipéptido inmovilizado, y posteriormente eluyendo el conjugado del
adsorbente. Específicamente, el polipéptido es el factor VIII. La
invención es particularmente ventajosa para conjugados en los que el
polipéptido es el factor VIII con una alta actividad específica
usando monometoxi poli(óxido de alquileno) (mPEG) como polímero
biocompatible.
Es bien conocido que la estabilidad
in-vitro y la vida media in vivo de
los polipéptidos se puede aumentar por medio de la unión covalente
de polímeros biocompatibles (proceso denominado en lo sucesivo
conjugación o modificación). La modificación de la superficie de un
polipéptido también tiene la ventaja de que se reduce la
inmunogenicidad presentada por el polipéptido.
El documento US 4.907.300 (Fulton et al.)
describe un conjugado que comprende una proteína que tiene actividad
de factor VIII unida covalentemente a un ligando no antigénico.
La pegilación, es decir, el acoplamiento de
varios polietilenglicoles (PEG) a un polipéptido, es una técnica
ampliamente usada para aumentar la estabilidad
in-vitro y la vida media
in-vivo de, por ejemplo, proteínas. En la
pegilación se han propuesto muchas técnicas a lo largo de los años.
Aquí se hace referencia a Zalipsky, S. et al en
Poly(Ethylene Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical
Applications, Plenum, New York (1992), y Katre N.V., Adv. Drug
Deliv. Rev., 10, 91-114 (1993).
El documento WO 92/16555 (Enzon) describe
conjugados macromoleculares de polipéptidos o glicopolipéptidos
biológicamente activos con derivados de acil hidrazina de
polietilenglicol.
Además, el documento JP 59 172425 describe
derivados de factores de la coagulación sanguínea unidos a
polietilenglicol.
Para algunos polipéptidos, se ha reconocido una
pérdida de actividad o función como consecuencia de esta
conjugación, un efecto que aumenta por el grado de modificación
(Inada, Y. et al, Trends in Biotechnology, 13,
86-91 (1995)). Para solucionar este problema, se han
creado métodos para hacer que los acoplamientos sean más selectivos.
Por ejemplo, se ha aplicado mutagénesis de localización dirigida
para la interleuquina-2 recombinante
(rIL-2). Puede crearse una diana específica por
inserción de una cisteína (Goodson, R. J. y Katre, N.V.
Bio/Technology 8, 344-346 (1990); Katre 1993,
véase anteriormente). Tal ruta generalmente no es aplicable a
proteínas terapéuticas, ya que la substitución de aminoácidos puede
cambiar las características originales de la molécula y, por lo
tanto, es polémica. Como alternativa, el polímero puede dirigirse
hacia sitios glicosilados de una proteína, por ejemplo el factor IX,
como se describe en el documento WO 94/29370 (Enzon) o el factor
VIII como se describe en el documento WO 94/15625. Sin embargo, esto
implica la oxidación de los restos carbohidrato que puede
conseguirse por medio de la reacción de la glicoproteína con
peryodato sódico o enzimáticamente por galactosa oxidasa. Estas
condiciones a menudo son perjudiciales para la molécula.
En el documento WO 94/13322 (Farmitalia Carlo
Erba) se demuestra que la pegilación puede realizarse sin alterar la
función de ciertos sitios esenciales para la función de la proteína
particular ("primera substancia"). Esto se consigue protegiendo
los sitios poniendo en contacto la primera substancia con una
segunda substancia que se une específicamente a dichos sitios. Más
particularmente, la pegilación se realiza inmovilizando la proteína
particular en una resina con ligandos que tienen afinidad específica
por dicha proteína. Son segundas substancias, por ejemplo, moléculas
biológicas complementarias. Son ejemplos de parejas descritas en el
documento WO 94/13322 anticuerpo (primera
substancia)-antígeno correspondiente (segunda
substancia); inhibidor específico (primera
substancia)-enzima (segunda substancia); factor de
crecimiento (primera substancia)-receptor
correspondiente (segunda substancia), o los contrarios de cada una
de estas parejas.
Sin embargo, en un proceso destinado a la
producción farmacéutica, es ventajoso que el uso de substancias de
complejidad biológica pueda mantenerse al mínimo. Esto se debe
principalmente a los estrictos requisitos de documentación sobre
homogeneidad bioquímica y seguridad para el uso de dichas
substancias. Por lo tanto, sería ventajoso el uso de ligandos de
afinidad producidos por síntesis de química orgánica.
El documento DE 3717210 se refiere a un proceso
para la modificación de biopolímeros, preferiblemente biopolímeros
que llevan carga, por medio de la inmovilización del biopolímero,
por ejemplo, sobre un adsorbente de intercambio iónico, la reacción
del biopolímero con reactivos, por ejemplo enzimas u otros reactivos
bioquímicos, para obtener un producto de reacción y, posteriormente,
la desorción del producto de reacción del adsorbente. El producto de
reacción preferiblemente es un ácido nucleico escindido con un
enzima de restricción. En el documento DE 3717210, el estado
adsorbido del biopolímero se utiliza para exponer mejor el
biopolímero a los reactivos, aumentando de este modo la eficacia de
la modificación. No hay ninguna indicación de que se protejan dianas
expuestas ni del propósito de retener la actividad del biopolímero,
lo cual proporcionaría la ventaja de la función del biopolímero
in-vivo. La invención del documento DE
3717210 simplemente se refiere a la localización de las propiedades
de biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, cambiando el carácter
original por un procesamiento real o aumentando el número de
entidades funcionales de la macromolécula, tal como la incorporación
de isótopos radiactivos.
Se han conjugado muchas proteínas destinadas al
uso terapéutico, comúnmente haciendo uso de diversas técnicas de
pegilación (Francis, G.E. et al, en Stability of Protein
Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3,
235-263 (1992); Inada, Y. et al, Trends in
Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). La mayoría
de los ejemplos hacen referencia a la administración intravenosa.
Sin embargo, se ha descrito la absorción después de la
administración subcutánea en plasma, pulmón, hígado y bazo de
algunos alergenos conjugados con mPEG y se ha comprobado que la
inmunoterapia con alergenos conjugados con mPEG administrados por
vía subcutánea es eficaz (Dreborg, S. y Akerblom, E.B., Crit. Rew.
Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365
(1990)). También se ha usado la administración intramuscular en
ensayos clínicos de adenosina desaminasa (Hershfield, M.S. et
al, New Eng. J. Med. 316, 589-596 (1987).
En algunos casos, también se ha afirmado que la pegilación es
beneficiosa para la vía oral. De este modo, en el documento
EP-A-0 614 373 de la Escuela de
Medicina del Monte Sinaí se ha descrito la pegilación de IgG para
administración oral. En Sakuragawa et al, Acta Med. Biol.,
34(3), 77-84 (1987) y en la Solicitud de
Patente Japonesa Nº 44509/83 de Nippon Chemifar Company se ha
descrito la pegilación del factor VIII y del factor IX para
administración oral.
El factor VIII es una proteína que participa en
la coagulación intrínseca de la sangre. Es un cofactor en la
reacción en la que el enzima factor IXa, en presencia de fosfolípido
y de iones de calcio, convierte el proenzima factor X en la forma
activa, factor Xa, conduciendo en ultimo lugar a un coágulo de
fibrina. El factor VIII humano se sintetiza como una molécula de una
sola cadena de aproximadamente 300 kDa y que consta de los dominios
estructurales
A1-A2-B-A3-C1-C2
(Gitschier et al., 1984, Nature 312, página 326; Wood
et al., 1984, Nature 312, página 330; Vehar et
al., 1984, Nature 312, página 337; Toole et al.,
1984, Nature, 312, página 342). El producto precursor se
procesa para dar dos cadenas polipeptídicas de 200 y 80 kDa en el
Golgi y las dos cadenas, que se mantienen juntas por uno o más iones
metálicos, se expresan en la sangre (Kaufman et al., 1988, J.
Biol. Chem., 263, página 6352; Andersson et al., 1986,
Proc. Natl. Acad. Sci., 83, página 2979). El dominio B del
factor VIII parece prescindible en lo que respecta a la función del
cofactor VIII, mientras que los dominios A y C tienen varios sitios
de interacción con otras macromoléculas que participan en la
hemostasis (Sandberg et al., 1993, Thrombos. Haemostas.,
69, páginas 1204 y Lind et al., 1995, Eur. J.
Biochem., 232, página 19).
Por los párrafos anteriores, es evidente que el
factor VIII es una proteína con varios sitios de interacción, cada
uno responsable de una unión específica. Por lo tanto, es difícil
modificar el factor VIII de modo que retenga completamente su
función biológica.
La técnica de pegilación se ha aplicado
previamente a mezclas de proteínas que contienen el factor VIII. De
este modo, en el documento WO 94/15625 (Enzon) se ha descrito que la
pegilación del factor VIII usando un enlace de carbamato (uretano) a
un grado de modificación determinado resultante de un exceso molar
de 100 veces de mPEG con respecto al factor VIII, puede aumentar la
vida media in-vivo en ratones de 13 horas a
55 horas. Convencionalmente, se considera que la vida media en
ratones es de aproximadamente 1 hora. De esta manera, 13 horas es
una vida media inusualmente larga en ratones. Además, debe tenerse
en cuenta que, con la extremada baja pureza de la preparación de
factor VIII de partida (20-50 IU/mg de proteína),
durante la reacción de acoplamiento predominaban otras proteínas
además del factor VIII. Una proteína importante normalmente presente
en las preparaciones del factor VIII de baja pureza es el factor de
von Willebrand, que tiene una función estabilizadora del factor VIII
y también podría contribuir muy bien a la protección del sitio
funcional correspondiente durante el proceso de conjugación. Tras la
conjugación, mPEG puede localizarse en cualquiera de las proteínas
presentes en la mezcla de proteínas de las que el factor VIII
normalmente constituye sólo una pequeña porción. La mezcla de
proteínas pegiladas que contenía el factor VIII se usó para
administración intravenosa. Sin embargo, un material de partida bien
definido es uno de los factores esenciales que constituyen las
condiciones controladas requeridas para la producción
farmacéutica.
Para conjugar el factor VIII también se han usado
otros polímeros. De esta manera, en la Patente de Estados Unidos
4.970.300 se ha descrito que puede aplicarse conjugación con
dextrano para prolongar la vida media del factor
VIII.
VIII.
En la mayoría de las técnicas de acoplamiento, el
reactivo polimérico reacciona con los grupos
\varepsilon-amino de los restos de lisina del
polipéptido. Estos grupos a menudo están distribuidos por toda la
superficie del polipéptido, y pueden ocasionar fácilmente una
conjugación adyacente a un sitio funcional. Como consecuencia, por
medio de un acoplamiento aleatorio, a menudo se altera la actividad
o función. Nuestra experiencia es que cuando se aplican estas
técnicas a preparaciones muy puras, tales como un factor VIII
recombinante con actividad coagulante del que se ha delecionado el
domino B, esta actividad disminuye de forma severa ya a un grado de
modificación de aproximadamente 5 mPEG/molécula de factor VIII.
Los inventores de la presente invención han
descubierto que puede retenerse en un alto grado la actividad
específica de polipéptidos conjugados, simplemente inmovilizando el
polipéptido en un adsorbente con especificidad de grupo antes de la
reacción de acoplamiento, y posteriormente desorbiendo el conjugado
por técnicas convencionales. Esto es bastante sorprendente, ya que
previamente se ha considerado esencial el uso de adsorbentes con
propiedades de unión específicas con respecto al polipéptido en
cuestión para conseguir una protección de ciertos dominios
importantes para las funciones biológicas.
El beneficio de modificar polímeros
biocompatibles a menudo depende del grado de modificación. De esta
manera, normalmente se requiere un alto grado de modificación, es
decir, un alto número de polímeros biocompatibles por molécula de
polipéptido, para una protección eficaz contra la actividad
proteolítica. Con la ayuda de la presente invención, en la que los
polímeros biocompatibles se introducen más selectivamente, se ha
retenido mejor la actividad específica. De esta manera, los
inventores de la presente invención han descubierto que el factor
VIII puede protegerse de forma eficaz contra la degradación en un
entorno in-vitro que muestra tener un efecto
de degradación sobre esta molécula. Este efecto puede lograrse con
un grado de modificación de sólo 4-5 mPEG/factor
VIII.
El uso de adsorbentes con especificidad de grupo
de acuerdo con la presente invención es económicamente más favorable
comparado con los adsorbentes descritos en la técnica anterior. El
uso de adsorbentes con especificidad de grupo también facilitará el
registro de conjugados como agentes terapéuticos.
El presente proceso hace posible mejorar la
función in-vivo de polipéptidos,
especialmente mejorando la función farmacocinética incluyendo la
biodisponibilidad, y reduciendo la inmunogenicidad mostrada por los
polipéptidos.
De esta manera, la presente invención se refiere
a un proceso para mejorar la función in-vivo
del factor VIII protegiendo dianas expuestas de dicho
polipéptido,
a) inmovilizando el factor VIII por interacción
con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de
intercambio aniónico fabricados por síntesis de química
orgánica;
b) activando el polímero biocompatible;
c) conjugando el polímero biocompatible activado
con el factor VIII inmovilizado; y posteriormente
d) eluyendo el conjugado del adsorbente.
En la presente invención, la expresión "sitio
de interacción" se refiere a varios sitios esenciales para la
función biológica del polipéptido particular.
En la presente invención, la expresión "dianas
expuestas" se refiere a sitios externos en el polipéptido en
cuestión con tendencia a experimentar reacciones no deseadas
in-vivo. Los ejemplos de dianas expuestas
incluyen epítopos antigénicos y sitios para la escisión
proteolítica. Sin embargo, ciertos sitios para la escisión
proteolítica se denominan sitios de interacción.
La presente invención hace que sea posible, en
una medida hasta ahora inalcanzable, reducir la influencia de
reacciones indeseadas in-vivo, por ejemplo,
la escisión proteolítica y posiblemente la agregación, mientras que
al mismo tiempo deja sin afectar los sitios de interacción
fundamentales para la función biológica del polipéptido. Esto se ha
descrito en la aplicación de conjugación con mPEG del factor VIII
(recombinante). Mas específicamente, inmovilizando el polipéptido
por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que
lleva ligandos fabricados por síntesis de química orgánica, los
sitios de interacción del polipéptido se excluyen de la conjugación
con el polímero biocompatible. Además, por medio de la conjugación
del polímero biocompatible activado con el polipéptido en los sitios
externos deseados, las dianas expuestas se ocultan de la acción de,
por ejemplo, proteasas.
En la presente solicitud, "polipéptidos" se
refiere a proteínas y oligopéptidos con al menos 20 aminoácidos en
la cadena. El número de aminoácidos del polipéptido producido de
acuerdo con la presente invención convenientemente está en el
intervalo de 30 hasta 4.500 aminoácidos, y preferiblemente en el
intervalo de 40 hasta 3.000 aminoácidos. Los polipéptidos pueden ser
de mamífero, más específicamente de origen humano, o pueden
producirse por técnicas de ADN recombinante. Los polipéptidos que
pueden conjugarse de acuerdo con la presente invención incluyen
polipéptidos que presentan actividad coagulante o que tienen una
función de soporte para la coagulación. Los polipéptidos pueden ser
de longitud completa, es decir, la secuencia de aminoácidos es
idéntica a la secuencia correspondiente encontrada en mamíferos en
general y en los seres humanos en particular. Los polipéptidos
también pueden ser derivados de deleción de los polipéptidos de
longitud completa, en los que falta uno o más aminoácidos.
Específicamente, el polipéptido es el factor VIII de la
coagulación.
El factor VIII de longitud completa presente en
el plasma humano tiene una masa molecular de aproximadamente 300
kDa. Los concentrados del factor VIII derivados del plasma humano
contienen varias formas fragmentadas del factor VIII completamente
activas como se describe en Andersson et al., (véase
anteriormente). La forma activa más pequeña tiene una masa molecular
de aproximadamente 170 kDa y consta de dos cadenas de
aproximadamente 90 kDa y aproximadamente 80 kDa que se mantienen
unidas por uno o más iones metálicos (véase el documento
EP-A-0 197 901). Por lo tanto, el
factor VIII biológicamente activo producido de acuerdo con la
presente invención, convenientemente tiene una masa molecular en el
intervalo de aproximadamente 170 kDa hasta aproximadamente 300
kDa.
Pharmacia AB de Estocolmo, Suecia, ha
desarrollado un producto de factor VIII recombinante que corresponde
a la forma del factor VIII plasmático de 170 kDa en concentrados de
factor VIII terapéuticos. La molécula de factor VIII recombinante
truncada se denomina r-VIII SQ y se produce en
células de ovario de hámster chino (CHO) en un proceso de cultivo
celular en medio sin suero. La actividad específica de
r-VIII SQ es de aproximadamente 15.000 IU VIII:C por
mg de proteína total. En el documento
WO-A-91/09122 cedido a Pharmacia AB
se ha descrito la estructura y bioquímica de r-VIII
SQ.
En la presente invención, el factor VIII puede
ser el factor VIII plasmático o el factor VIII recombinante. Cuando
es factor VIII es recombinante, puede ser el factor VIII de longitud
completa o, preferiblemente, un derivado de deleción del factor VIII
de longitud completa que tiene actividad coagulante. En este
contexto, un derivado de deleción se define como un factor VIII de
coagulación, en el que se ha perdido el total o una parte del domino
B mientras que se mantiene la actividad coagulante. Los dominios
restantes se unen de forma adecuada por un enlazador de aminoácidos.
En P. Lind et al., Eur. J. Biochem., vol. 232 (1995) páginas
19-27 se proporcionan ejemplos de construcciones de
diversos enlazadores.
La presente invención puede usarse de forma
ventajosa para introducir de forma selectiva polímeros
biocompatibles en una amplia diversidad de productos del factor
VIII. De esta manera, la presente invención puede usarse para
estabilizar adicionalmente el factor VIII plasmático
in-vivo, que ya está estabilizado por
asociación con su proteína de soporte, el factor de von Willebrand
(vWf).
Es una ventaja que el producto final esté bien
definido. Por lo tanto, la actividad específica del factor VIII en
el proceso de acoplamiento de la presente invención debe ser al
menos de aproximadamente 1.000 IU/mg de proteína total, y
convenientemente al menos de 2.000 IU/mg de proteína total. La
actividad específica del factor VIII preferiblemente está en el
intervalo de 5.000 hasta 20.000 IU/mg de proteína total, y más
preferiblemente en el intervalo de 10.000 hasta 17.000 IU/mg de
proteína total.
La actividad del factor VIII en el procedimiento
de acoplamiento puede ser al menos de aproximadamente 1.000 IU/ml, y
convenientemente al menos de 2.000 IU/ml. La actividad del factor
VIII preferiblemente está dentro del intervalo de 5.000 hasta 50.000
IU/ml y más preferiblemente de 20.000 hasta 40.000 IU/ml.
El polímero biocompatible de la presente
invención puede seleccionarse entre el grupo compuesto por
homopolímeros, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de
alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo. Los polímeros
biocompatibles pueden ser de cadena lineal o ramificada. El
poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo
convenientemente se selecciona entre el grupo compuesto por
homopolímeros de polietilenglicol y homopolímeros de
polipropilenglicol. El polímero biocompatible preferiblemente es un
homopolímero de polietilenglicol (PEG). El peso molecular del PEG
puede estar en el intervalo de aproximadamente 300 hasta 20.000,
convenientemente en el intervalo de 1.500 hasta 10.000 y
preferiblemente en el intervalo de 3.000 hasta 5.000.
El polímero biocompatible debe estar protegido en
un extremo para evitar la derivatización cruzada. Son ejemplos de
grupos adecuados para este fin grupos alcoxi inferiores de cadena
lineal o ramificada, preferiblemente el grupo monometoxi. Un
polímero biocompatible particularmente preferido en la presente
invención es monometoxi polietilenglicol (mPEG).
También son concebibles otros polímeros
biocompatibles, por ejemplo, dextrano, polivinilpirrolidona y DL
aminoácidos.
El polímero biocompatible debe activarse antes de
la reacción de acoplamiento para posibilitar la formación de enlaces
covalentes. Para este fin, el extremo del polímero biocompatible
frente al polipéptido debe tener unido un grupo hidroxilo que sea
susceptible de activación. Hay varias formas de activar el polímero
biocompatible dependiendo del aminoácido seleccionado para la unión
covalente. Son derivados de mPEG adecuados para el acoplamiento con
grupos amino mPEG succinimidil succinato, mPEG succinimidil
succinamida, mPEG succinimidil propionato, succinimidil carbonato de
mPEG, succinimidil éster de mPEG carboximetilado,
mPEG-oxicarbonilimidazol, mPEG nitrofenil
carbonatos, mPEG triclorofenil carbonato, mPEG tresilato (el último
descrito por Nilsson K. Mosbach K., Methods in Enzymology, Vol 104,
páginas 56-69 (1984)), (todos los reactivos
mencionados comercializados por Shearwater Polymers, Inc.,
Huntsville, AL, USA), mPEG anhídrido maleico y mPEG anhídrido
metilmaleico (Garman A., Kalindjian S.B., FEB Vol 223: 2, páginas
361-365), y anhídridos mixtos de mPEG succinato,
mPEG ácido acético o mPEG ácido propiónico, respectivamente (Dreborg
S. y Akerblom E, véase anteriormente).
Los restos de cisteína pueden conjugarse con mPEG
maleimida, mPEG vinilsulfona y mPEG ortopiridildisulfuro
(comercializado por Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA).
En el caso de la conjugación del grupo guanidino de la arginina, son
reactivos adecuados derivados de mPEG de fenilglioxal (Zalipski,
véase anteriormente).
Los carbohidratos primero deben oxidarse de forma
que estén presentes grupos aldehído y después pueden conjugarse con
mPEG hidrazida (Zalipski, véase anteriormente).
El procedimiento de acoplamiento se realiza a un
pH adecuado para el aminoácido a conjugar. También debe considerarse
el pH adecuado para el polipéptido en general, así como la
dependencia del pH de la reactividad del polímero biocompatible. Por
lo tanto, normalmente, el pH para el acoplamiento está en el
intervalo de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8, fijándose el
límite inferior para evitar un procedimiento de acoplamiento
prolongado y el límite superior para proporcionar condiciones suaves
para el polipéptido. El intervalo de pH anterior es adecuado en la
conjugación que implica lisinas. Por lo tanto, en los ejemplos de la
presente solicitud, hemos conjugado una substancia que tiene
actividad de FVIII en tales condiciones suaves. En ciertos casos,
también pueden ser adecuados valores de pH fuera de este intervalo.
De esta manera, la conjugación que implica cisteínas
convenientemente se realiza a un pH por debajo de aproximadamente 7,
mientras que las argininas convenientemente se conjugan a un pH en
el intervalo de aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 9,3.
El procedimiento de acoplamiento debe realizarse
a una temperatura por encima de 0ºC, convenientemente en el
intervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 40ºC y
preferiblemente en el intervalo de 10 hasta 30ºC. De nuevo, debe
considerarse una temperatura adecuada para el polipéptido en
general, así como la influencia de la temperatura sobre la
reactividad del polímero biocompatible. En los ejemplos de la
presente solicitud, todas las etapas de acoplamiento se realizaron a
temperatura ambiente.
El adsorbente usado en la presente invención
tiene especificidad de grupo en relación con el polipéptido a
inmovilizar. Los adsorbentes con especificidad de grupo tienen
afinidad por varios polipéptidos. Además, a menudo se unen menos
fuertemente y la elución puede realizarse en condiciones más suaves
que con adsorbentes monoespecíficos, uniéndose estos últimos a uno
solo o a un número muy pequeño de polipéptidos. En Jansson J.C.
et al, Protein Purification, Principles. High Resolution
Methods, and Applications, VCH Publishers, página
274-285 (1989), se proporcionan adsorbentes con
especificidad de grupo adecuados. Además, el adsorbente de la
presente invención se caracteriza porque lleva ligandos fabricados
por síntesis de química orgánica.
Específicamente, son ligandos adecuados para uso
en la presente invención grupos de intercambio aniónico,
preferiblemente fuertes, tales como aminoetilo cuaternario (QAE),
tri-metilaminoetilo (TMAE) o aminometilo cuaternario
(Q), más preferiblemente aminometilo cuaternario (Q). Además, los
ligandos pueden acoplarse fuertemente a la matriz, o con un
espaciador, tal como alquilamina, hexilamina, diaminodipropilamina,
etilaminasuccinamida (Persson & Lagerström, en Packings and
stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K.K., ed.,
Marcel Dekker Inc. 1990, página 754), o con un tentáculo ramificado
al que se unen los ligandos (es un ejemplo adecuado Fractogel™ EMD,
producido por Merck de Alemania).
Después de dicho procedimiento de acoplamiento,
el polipéptido conjugado se eluye por técnicas convencionales. En
este contexto, es esencial que se consideren las condiciones
fisicoquímicas para evitar la degradación de los polipéptidos
conjugados. De esta manera, si la ruta de acoplamiento implica un
enlace de conjugación lábil en un cierto intervalo de pH, debe
evitarse ese intervalo.
En el procedimiento de acoplamiento, cuando el
polipéptido se inmoviliza en el adsorbente, el polipéptido puede
ponerse en contacto con un agente bloqueante soluble, con el fin de
excluir sitios adicionales de la conjugación. Tal agente bloqueante
debe fabricarse por síntesis de química orgánica, y además debe
conjugarse con cualquiera de los ligandos identificados
interiormente unidos a un polímero seleccionado, por ejemplo, entre
poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo,
copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno),
homopolímeros de polietilenglicol u homopolímeros de
polipropilenglicol. El agente bloqueante también puede llevar
entidades que tienen afinidad específica por el polipéptido.
Después de la elución, el agente bloqueante
soluble en contacto se desorbe por aplicación de condiciones
químicas adecuadas. Por ejemplo, si el agente bloqueante se adsorbió
por interacción hidrófoba, podría desorberse reduciendo la
intensidad iónica, o simplemente reduciendo la temperatura. El
agente bloqueante soluble posteriormente se separa del conjugado por
cromatografía de exclusión molecular en condiciones
convencionales.
La matriz del adsorbente en la presente invención
puede ser cualquier resina comercial conocida que sea compatible con
las moléculas biológicas. De esta manera, la matriz puede
seleccionarse entre diversas matrices muy hidrófilas, por ejemplo,
matrices de agarosa tales como una amplia diversidad de matrices de
Sepharose™ vendidas por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia,
matrices de polímeros orgánicos tales como TSK-GEL:s
vendida por Tosoh Corp. de Tokyo, Japón, o matrices de polímeros
orgánicos muy porosos vendidas por Per Septive Biosystems de Boston,
Estados Unidos. También son adecuadas matrices de membrana, por
ejemplo, Sartobind™ vendida por Sartorius de Alemania y MemSep™
vendido por Millipore de Estados Unidos. La matriz preferiblemente
es una matriz de agarosa. Son matrices de agarosa adecuadas en la
presente invención, aparte de Sheparose™, Minileak™ vendida por
Kem-En-Tec A/S de Copenhage,
Dinamarca y Bio-Gel A vendido por
Bio-Rad, de Bruselas, Bélgica. Preferiblemente, la
matriz se reticula permitiendo un flujo rápido (FF) y, por lo tanto,
una alta capacidad de producción. Más preferiblemente, se realiza
una cromatografía de la presente invención en un gel de Sepharose™
FF. Además, también pueden usarse ventajosamente resinas compuestas
de copolímeros de oligoetilenglicol, metacrilato de glicidilo y
dimetacrilato de pentaeritritol, tal como Fractogel™ (comercializado
por Merck de Alemania), celulosa y vidrio poroso.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero
biocompatible que se puede obtener por el presente proceso son
nuevos. Con el presente proceso, la actividad del polipéptido
después de la conjugación puede ser al menos un 30% de la actividad
antes de dicha conjugación, convenientemente al menos un 50% y
preferiblemente al menos un 70% de la actividad antes de dicha
conjugación.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero
biocompatible que se puede obtener por el presente proceso pueden
usarse como medicamentos. Especialmente, pueden usarse como
medicamentos conjugados del factor VIII y un polímero biocompatible
producido de acuerdo con el presente proceso. Es especialmente
ventajoso usar un conjugado del factor VIII y un polímero
biocompatible, donde el grado de conjugación está en el intervalo de
1 hasta 15 moléculas de PEG protegido terminalmente con
monoalquilo/factor VIII, convenientemente en el intervalo de 2 hasta
10 moléculas de PEG protegido terminalmente con monoalquilo/factor
VIII, preferiblemente en el intervalo de 3 hasta 7 moléculas de PEG
protegido terminalmente con monoalquilo/factor VIII. En este
contexto, el factor VIII conjugado convenientemente se produce por
una técnica de ADN recombinante, preferiblemente un derivado de
deleción recombinante del factor VIII de longitud completa que tiene
actividad coagulante, y más preferiblemente un factor VIII SQ
recombinante obtenido por deleción (r-VIII SQ).
Los polipéptidos conjugados de la presente
invención convenientemente se usan para administración subcutánea,
intramuscular, intradérmica o intravenosa. Especialmente, el factor
VIII conjugado puede usarse para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de la hemofilia A y, en particular, para la
administración subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa
de tal medicamento.
La presente invención también se refiere a un
método para preparar conjugados del factor VIII para uso en el
tratamiento de la hemofilia A por medio de la administración
subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa de un
conjugado de factor VIII y un polímero biocompatible producido de
acuerdo con el presente proceso.
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo con
fines ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse limitantes
del alcance de la presente invención, que se define por las
reivindicaciones adjuntas.
La producción del factor VIII recombinante SQ
(r-VIII SQ) se realizó esencialmente como se
describe en la patente WO-A-9109122,
ejemplo 1-3. Una línea de células CHO con
deficiencia de DHFR (DG44N.Y.) se sometió a electroporación con un
vector de expresión que contenía el gen r-VIII SQ y
un vector de expresión que contenía el gen de la dihidrofolato
reductasa. Después de la selección en medios selectivos, se
amplificaron las colonias supervivientes por medio del crecimiento
en cantidades crecientes por etapas de metotrexato. El sobrenadante
de las colonias resultantes se investigó individualmente para
determinar la actividad del factor VIII. Se eligió un clon de
producción, posteriormente se adaptó al crecimiento en suspensión
sin suero en un medio definido y finalmente se creó un proceso de
cultivo celular a gran escala. Después de ciertos periodos de tiempo
se recoge el sobrenadante y se purifica adicionalmente como se
describe más adelante.
El medio acondicionado se aclaró por filtración,
el pH se ajustó y después el filtrado se introdujo en una columna de
S Sepharose™ FF (volumen de la columna 3 l). Después del lavado, el
factor VIII se eluyó con un tampón salino que contenía CaCl_{2} 5
M y Triton™ X-100 al 0,02%. Esta etapa de
cromatografía de intercambio catiónico se realizó a
2-8ºC. El eluato de la etapa de S Sepharose™ FF
(eluato-S) se congeló hasta que se realizó una
purificación adicional.
Se descongelaron 700 ml del eluato S y la
temperatura se ajustó a temperatura ambiente. Se realizó
inactivación del virus por incubación durante 30 minutos con
tri-n-butil-fosfato
(TNBP) y Triton™ X-100 a una concentración final del
0,3% (v/v) y 1,0% (v/v), respectivamente. Una columna de
inmunoafinidad con anticuerpo monoclonal (mAb) con un volumen de 260
ml se equilibró con un tampón de eluato S que contenía las
cantidades correspondientes de agentes químicos de inactivación de
virus. Después se introdujo en la columna de mAb la solución del
factor VIII y posteriormente se lavó. La elución se realizó con un
tampón que contenía etilenglicol al 50%.
Una columna de Q Sepharose™ se preequilibró a una
alta concentración de cloruro sódico y después se equilibró con un
tampón de la misma composición que el tampón de elución de la
columna de inmunoafinidad. Se introdujo el eluato de mAb y la
columna después se lavó con tampón de equilibrio seguido de un
tampón de lavado de intensidad iónica fisiológica. La columna se
eluyó elevando la concentración de cloruro sódico a 0,6 M. No se usó
detergente para el lavado y la elución de la columna Q. Una columna
de butil-Sheparose™ 4 FF se equilibró con un tampón
que contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 1,4 M, CaCl_{2} 50 mM y
Tween™ 80 al 0,02%, pH 6,8. Al eluato-Q se le añadió
NH_{4}Ac a una concentración final de 1,0 M y Tween™ 80 al 0,02%.
Esta solución se introdujo en la columna de
butil-gel a un caudal lineal de 60 cm/hora. La
columna después se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de
equilibrio y después se eluyó a un caudal lineal de 35 cm/hora con
un tampón que contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 0,5 M, CaCl_{2}
50 mM y Tween™ 80 al 0,02%, pH 6,8. La pureza de esta preparación
era muy alta, proporcionando una actividad específica de
12.000-17.000 IU/ mg de proteína.
En los ejemplos 1-8, se analizó
la actividad del factor VIII con un ensayo cromogénico (Chromogenix
AB de Mölndal, Suecia) a menos que se indique otra cosa. La cantidad
de factor VIII se determinó espectrofotométricamente a A280 y por
medio del análisis de aminoácidos. La cantidad de mPEG acoplado al
polipéptido se midió con un método de RMN de protón (Dreborg, S. y
Akerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4),
315-365 (1990)).
(Ejemplo
comparativo)
La composición de tampón del eluato de HIC,
preparada de acuerdo con el ejemplo 1, se sometió a intercambio por
cromatografía de exclusión molecular realizada en una columna de
Superose 12 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala,
Suecia), previamente equilibrada con un tampón de la siguiente
composición: hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM pH 7,8. A alícuotas de la
solución de r-VIII SQ se les añadió un exceso molar
de 35, 60 y 100 veces (con respecto al rVIII) de un anhídrido mixto
de mPEG succinato (PM 3.000). Las mezclas se dejaron reaccionar
durante 1,5 horas en un dispositivo rotatorio a temperatura
ambiente. Para retirar el exceso de mPEG ácido succínico y para
separar la población heterogénea del rVIII conjugado de acuerdo con
el tamaño, se realizó una cromatografía de exclusión molecular,
ahora usando una columna de Superose 6 (comercializada por Pharmacia
Biotech de Uppsala, Suecia). A partir de cada reacción de
acoplamiento, se analizaron por separado las fracciones
correspondientes a la primera y segunda mitad del pico de la
proteína (denominadas grupo 1 y grupo 2 en la tabla I). La tabla I
presenta los resultados de la conjugación de r-VIII
SQ con el anhídrido mixto del mPEG succinato
Como es evidente en la tabla I, la actividad
específica de rVIII se redujo espectacularmente, incluso con este
bajo grado de conjugación.
Se protegieron lisinas reactivas rodeadas por
cargas negativas de la molécula del factor VIII de la conjugación
con mPEG por adsorción del factor VIII sobre un gel de intercambio
aniónico. Se usó una columna rellena con Q Sepharose™ FF
(comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia),
equilibrada con un tampón de la siguiente composición:
L-histidina 50 mM, NaCl 0,15 M, CaCl_{2} 4 mM, pH
6,5, para adsorber el factor VIII. En la columna se introdujo un
eluato de HIC preparado de acuerdo con el ejemplo I. Para conseguir
condiciones apropiadas para el acoplamiento de mPEG, la columna se
lavó con un tampón que contenía hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM, pH
7,8 antes de la adición del mPEG. El gel se transfirió a un
recipiente de reacción, se añadió un anhídrido mixto de mPEG
succinato (PM 3.000) a la suspensión a una cantidad correspondiente
al exceso molar con respecto al factor VIII que se indica en la
tabla II. La reacción se incubó con rotación durante 1,5 horas. La
columna después se volvió a rellenar y el rVIII conjugado se eluyó
con un tampón de L-histidina 50 mM, NaCl 0,6 M,
CaCl_{2} 4 mM, pH 6,8. Se realizaron 4 preparaciones a una
cantidad constante de r-VIII SQ introducida por
cantidad de gel. Todas las etapas se realizaron a temperatura
ambiente. La tabla II presenta los resultados del
r-VIII SQ conjugado adsorbido sobre un gel de Q
Sepharose™ FF.
Como es evidente en la tabla II, la actividad
específica del r-VIII SQ conjugado se retiene en un
grado significativamente mayor en comparación con el
r-VIII SQ conjugado del ejemplo 2.
En este ejemplo, todas las etapas de adsorción,
acoplamiento y elución de r-VIII SQ en el gel de Q
Sepharose™ FF se realizaron como en el ejemplo 3. Para conjugar el
factor VIII se usó mPEG tresilato (PM 5.000). La tabla III presenta
los resultados de r-VIII SQ conjugado adsorbido en
un gel de Q Sepharose™ con mPEG tresilato de acuerdo con la
invención.
En este caso, la actividad específica fue
ligeramente menor que en el ejemplo 3, probablemente debido al mayor
peso molecular de mPEG.
Se usó una columna rellena con Fractogel™ EMD
TMAE 650 (comercializada por Merck) para adsorber
r-VIII SQ. Todas las etapas se realizaron como en el
ejemplo 3. La tabla IV presenta los resultados de la conjugación de
r-VIII SQ adsorbido en un gel de intercambio
aniónico con tentáculos con un anhídrido mixto de mPEG succinato de
acuerdo con la invención.
La activación con trombina de
r-VIII SQ conjugado se ensayó en un ensayo
in-vitro bien conocido para los especialistas
en la técnica. Se ensayó una muestra preparada de acuerdo con el
ejemplo 3, que daba como resultado un grado de derivatización de 4
mPEG/r-VIII SQ. El r-VIII SQ
conjugado pudo activarse por trombina humana de una manera
dependiente de la dosis. Posteriormente siguió la inactivación. En
la figura 1, se muestra la curva de los cambios de actividad
obtenidos cuando se añadió 1 unidad NIH de trombina por 1 unidad de
r-VIII SQ conjugado. Para el ensayo inmediato de las
muestras de la mezcla de reacción se usó un método de coagulación de
una etapa realizado esencialmente de acuerdo con Mikaelsson et
al., 1983, Blood 62, página 1006. Se obtuvo una activación de 30
veces en 1 minuto, seguida de inactivación. Los modelos de
activación-inactivación obtenidos con la trombina
estaban de acuerdo con los estudios previamente indicados sobre la
interacción del factor VIII-trombina (Fulcher et
al., 1983, Blood, 61, página 807, Andersson et al., 1986,
Proc. Natl. Acad. Sci., 83, página 2979, Eaton et al., 1986,
Biochemistry, 25, página 505, Rotblat et al., 1985,
Biochemistry, 24, página 4294).
Para evaluar la influencia de la conjugación con
mPEG sobre la estabilidad del factor VIII en una solución
representativa del medio subcutáneo, se realizó un ensayo
in-vitro usando extracto de tejido porcino.
Se produjeron dos preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG
como se describe en el ejemplo 3, se incubaron en el extracto y se
analizó la actividad coagulante en alícuotas a 0, 2, 4, 6 y 24 horas
usando un ensayo cromogénico. Durante las primeras 6 horas, el grado
de conjugación se correlacionaba con la actividad que quedaba.
Los resultados de la tabla V y la figura 2
muestran claramente que la conjugación con mPEG mejoró
significativamente la estabilidad del factor VIII.
Para evaluar la influencia de la conjugación de
mPEG sobre la estabilidad in-vivo del factor
VIII, se realizó un estudio farmacocinético. Se produjeron dos
preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG como se describe en
el ejemplo 3 y se determinaron sus actividades específicas, como se
indica en la tabla VI. Para conseguir una alta homogeneidad del
material derivatizado producido por el procedimiento de
acoplamiento, se realizó una fraccionación de cada preparación dos
veces por cromatografía de exclusión molecular. Se usó una columna
Superdex 200 PG XK 16/60 (comercializada por Pharmacia Biotech de
Uppsala, Suecia) equilibrada con L-histidina 19 mM,
NaCl 0,31 M, CaCl_{2} 3,4 mM, Tween 80 al 0,02%, pH 7,0. Se
realizó una reducción del volumen de las soluciones de factor VIII
antes de la segunda cromatografía de exclusión molecular en
concentradores Centriplus 30 esterilizados en autoclave;
dispositivos de ultrafiltración por centrifugación (límite 30 kDa,
comercializados por Amicon Inc. MA, USA). Las soluciones se
concentraron tres veces a 2.500 xg durante 45 minutos. Las
fracciones reunidas obtenidas después de la segunda cromatografía de
exclusión molecular posteriormente se diluyeron en un tampón de
acuerdo con la formulación final; L-Histidina 19 mM,
NaCl 0,31 M, CaCl_{2} 3,4 mM, Tween 80 al 0,02%, sacarosa 17,5 mM,
pH 7,0. Las soluciones de proteína finalmente se filtraron usando
filtros Millex GV de 0,22 \mum (comercializados por Millipore, MA,
USA) y posteriormente se introdujeron en frascos esterilizados en
autoclave. Las soluciones se almacenaron a -70ºC hasta el uso. A
seis monos Cynomolgus hembra se les administraron dosis
intravenosas individuales de la preparación 1 de 250 IU/kg y dosis
subcutáneas individuales de la preparación 2 de 1.500 IU/kg en
diferentes ocasiones. Todas las soluciones se diluyeron 1:1 con agua
para inyección antes de la administración. El sitio de inyección
para la administración subcutánea era la región dorsal izquierda o
derecha del animal, y para la administración intravenosa las venas
cefálicas izquierda o derecha respectivamente. Se recogieron
muestras de sangre de todos los animales a través de una punción en
la vena femoral y se introdujeron en tubos que contenían citrato
sódico como anticoagulante (10% del volumen total) a las siguientes
duraciones después de la inyección:
Administración intravenosa: 0 (antes de la
dosificación), 0,25, 1, 2, 4, 8, 24, 30, 48 h.
Administración subcutánea; 0 (antes de la
dosificación), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30, 48 h.
En un estudio separado en la misma especie se
realizó un estudio farmacocinético del factor VIII no conjugado. En
la tabla VI se muestran las dosis, la vía de administración y los
resultados (media (\pm desviación típica (SD))).
I.V. = intravenoso | |
S.C.= subcutáneo | |
^{1)}F = \hskip0.3cm AUC (S.C.) X DOSIS (I.V.) | |
\hskip1.1cm AUC (I.V.) X DOSE (S.C.) | |
donde AUC es el área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo. |
Como es evidente en la tabla VI, la
administración subcutánea de las dos preparaciones del factor VIII
conjugado con mPEG produjo una biodisponibilidad notablemente mayor
en comparación con la administración subcutánea de
r-VIII SQ no conjugado. El análisis estadístico
usando el ensayo t de Student confirmó que la diferencia era
significativa.
Claims (8)
1. Un proceso para mejorar la función in
vivo del factor VIII protegiendo dianas expuestas de dicho
polipéptido, caracterizado por:
- (a)
- la inmovilización del factor VIII por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico;
- (b)
- la activación de un polímero biocompatible;
- (c)
- la conjugación del polímero biocompatible activado con sitios externos del factor VIII inmovilizado; y
- (d)
- la elución del conjugado del adsorbente
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
donde dicho factor VIII es el factor VIII recombinante.
3. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 2, donde el polímero biocompatible se
selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros, copolímeros o
copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno) protegidos
terminalmente con monoalquilo.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con
monoalquilo se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros
de polietilenglicol y homopolímeros de polipropilenglicol.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4,
donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con
monoalquilo es un monometoxi polietilenglicol (mPEG).
6. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, donde los ligandos de intercambio
aniónico se seleccionan entre el grupo compuesto por aminometilo
cuaternario, aminoetilo cuaternario y trimetilaminoetilo o una
mezcla de los mismos.
7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, para uso en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de la hemofilia A.
8. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, para uso en la fabricación de un
medicamento adaptado para administración subcutánea para el
tratamiento de la hemofilia A.
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