ES2238522T3 - Metodo para preparar conjugados del factor viii y un polimero biocompatible. - Google Patents

Metodo para preparar conjugados del factor viii y un polimero biocompatible.

Info

Publication number
ES2238522T3
ES2238522T3 ES02013613T ES02013613T ES2238522T3 ES 2238522 T3 ES2238522 T3 ES 2238522T3 ES 02013613 T ES02013613 T ES 02013613T ES 02013613 T ES02013613 T ES 02013613T ES 2238522 T3 ES2238522 T3 ES 2238522T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
factor viii
mpeg
biocompatible polymer
process according
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02013613T
Other languages
English (en)
Inventor
Johanna Rostin
Helena Sandberg
Anna-Lisa Smeds
Eva Akerblom
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Swedish Orphan Biovitrum AB
Original Assignee
Biovitrum AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20399642&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2238522(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biovitrum AB filed Critical Biovitrum AB
Application granted granted Critical
Publication of ES2238522T3 publication Critical patent/ES2238522T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/813—Carrier is a saccharide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Polyamides (AREA)

Abstract

Un proceso para mejorar la función in vivo del factor VIII protegiendo dianas expuestas de dicho polipéptido, caracterizado por: (a) la inmovilización del factor VIII por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico; (b) la activación de un polímero biocompatible; (c) la conjugación del polímero biocompatible activado con sitios externos del factor VIII inmovilizado; y (d) la elución del conjugado del adsorbente

Description

Método para preparar conjugados del factor VIII y un polímero biocompatible.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un proceso para mejorar la función in-vivo de un polipéptido protegiendo las dianas expuestas de dicho polipéptido, inmovilizando el polipéptido en un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico fabricados por síntesis de química orgánica, activando el polímero biocompatible, conjugando el polímero biocompatible activado de esta manera con el polipéptido inmovilizado, y posteriormente eluyendo el conjugado del adsorbente. Específicamente, el polipéptido es el factor VIII. La invención es particularmente ventajosa para conjugados en los que el polipéptido es el factor VIII con una alta actividad específica usando monometoxi poli(óxido de alquileno) (mPEG) como polímero biocompatible.
Antecedentes de la invención
Es bien conocido que la estabilidad in-vitro y la vida media in vivo de los polipéptidos se puede aumentar por medio de la unión covalente de polímeros biocompatibles (proceso denominado en lo sucesivo conjugación o modificación). La modificación de la superficie de un polipéptido también tiene la ventaja de que se reduce la inmunogenicidad presentada por el polipéptido.
El documento US 4.907.300 (Fulton et al.) describe un conjugado que comprende una proteína que tiene actividad de factor VIII unida covalentemente a un ligando no antigénico.
La pegilación, es decir, el acoplamiento de varios polietilenglicoles (PEG) a un polipéptido, es una técnica ampliamente usada para aumentar la estabilidad in-vitro y la vida media in-vivo de, por ejemplo, proteínas. En la pegilación se han propuesto muchas técnicas a lo largo de los años. Aquí se hace referencia a Zalipsky, S. et al en Poly(Ethylene Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York (1992), y Katre N.V., Adv. Drug Deliv. Rev., 10, 91-114 (1993).
El documento WO 92/16555 (Enzon) describe conjugados macromoleculares de polipéptidos o glicopolipéptidos biológicamente activos con derivados de acil hidrazina de polietilenglicol.
Además, el documento JP 59 172425 describe derivados de factores de la coagulación sanguínea unidos a polietilenglicol.
Para algunos polipéptidos, se ha reconocido una pérdida de actividad o función como consecuencia de esta conjugación, un efecto que aumenta por el grado de modificación (Inada, Y. et al, Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). Para solucionar este problema, se han creado métodos para hacer que los acoplamientos sean más selectivos. Por ejemplo, se ha aplicado mutagénesis de localización dirigida para la interleuquina-2 recombinante (rIL-2). Puede crearse una diana específica por inserción de una cisteína (Goodson, R. J. y Katre, N.V. Bio/Technology 8, 344-346 (1990); Katre 1993, véase anteriormente). Tal ruta generalmente no es aplicable a proteínas terapéuticas, ya que la substitución de aminoácidos puede cambiar las características originales de la molécula y, por lo tanto, es polémica. Como alternativa, el polímero puede dirigirse hacia sitios glicosilados de una proteína, por ejemplo el factor IX, como se describe en el documento WO 94/29370 (Enzon) o el factor VIII como se describe en el documento WO 94/15625. Sin embargo, esto implica la oxidación de los restos carbohidrato que puede conseguirse por medio de la reacción de la glicoproteína con peryodato sódico o enzimáticamente por galactosa oxidasa. Estas condiciones a menudo son perjudiciales para la molécula.
En el documento WO 94/13322 (Farmitalia Carlo Erba) se demuestra que la pegilación puede realizarse sin alterar la función de ciertos sitios esenciales para la función de la proteína particular ("primera substancia"). Esto se consigue protegiendo los sitios poniendo en contacto la primera substancia con una segunda substancia que se une específicamente a dichos sitios. Más particularmente, la pegilación se realiza inmovilizando la proteína particular en una resina con ligandos que tienen afinidad específica por dicha proteína. Son segundas substancias, por ejemplo, moléculas biológicas complementarias. Son ejemplos de parejas descritas en el documento WO 94/13322 anticuerpo (primera substancia)-antígeno correspondiente (segunda substancia); inhibidor específico (primera substancia)-enzima (segunda substancia); factor de crecimiento (primera substancia)-receptor correspondiente (segunda substancia), o los contrarios de cada una de estas parejas.
Sin embargo, en un proceso destinado a la producción farmacéutica, es ventajoso que el uso de substancias de complejidad biológica pueda mantenerse al mínimo. Esto se debe principalmente a los estrictos requisitos de documentación sobre homogeneidad bioquímica y seguridad para el uso de dichas substancias. Por lo tanto, sería ventajoso el uso de ligandos de afinidad producidos por síntesis de química orgánica.
El documento DE 3717210 se refiere a un proceso para la modificación de biopolímeros, preferiblemente biopolímeros que llevan carga, por medio de la inmovilización del biopolímero, por ejemplo, sobre un adsorbente de intercambio iónico, la reacción del biopolímero con reactivos, por ejemplo enzimas u otros reactivos bioquímicos, para obtener un producto de reacción y, posteriormente, la desorción del producto de reacción del adsorbente. El producto de reacción preferiblemente es un ácido nucleico escindido con un enzima de restricción. En el documento DE 3717210, el estado adsorbido del biopolímero se utiliza para exponer mejor el biopolímero a los reactivos, aumentando de este modo la eficacia de la modificación. No hay ninguna indicación de que se protejan dianas expuestas ni del propósito de retener la actividad del biopolímero, lo cual proporcionaría la ventaja de la función del biopolímero in-vivo. La invención del documento DE 3717210 simplemente se refiere a la localización de las propiedades de biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, cambiando el carácter original por un procesamiento real o aumentando el número de entidades funcionales de la macromolécula, tal como la incorporación de isótopos radiactivos.
Se han conjugado muchas proteínas destinadas al uso terapéutico, comúnmente haciendo uso de diversas técnicas de pegilación (Francis, G.E. et al, en Stability of Protein Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3, 235-263 (1992); Inada, Y. et al, Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). La mayoría de los ejemplos hacen referencia a la administración intravenosa. Sin embargo, se ha descrito la absorción después de la administración subcutánea en plasma, pulmón, hígado y bazo de algunos alergenos conjugados con mPEG y se ha comprobado que la inmunoterapia con alergenos conjugados con mPEG administrados por vía subcutánea es eficaz (Dreborg, S. y Akerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)). También se ha usado la administración intramuscular en ensayos clínicos de adenosina desaminasa (Hershfield, M.S. et al, New Eng. J. Med. 316, 589-596 (1987). En algunos casos, también se ha afirmado que la pegilación es beneficiosa para la vía oral. De este modo, en el documento EP-A-0 614 373 de la Escuela de Medicina del Monte Sinaí se ha descrito la pegilación de IgG para administración oral. En Sakuragawa et al, Acta Med. Biol., 34(3), 77-84 (1987) y en la Solicitud de Patente Japonesa Nº 44509/83 de Nippon Chemifar Company se ha descrito la pegilación del factor VIII y del factor IX para administración oral.
El factor VIII es una proteína que participa en la coagulación intrínseca de la sangre. Es un cofactor en la reacción en la que el enzima factor IXa, en presencia de fosfolípido y de iones de calcio, convierte el proenzima factor X en la forma activa, factor Xa, conduciendo en ultimo lugar a un coágulo de fibrina. El factor VIII humano se sintetiza como una molécula de una sola cadena de aproximadamente 300 kDa y que consta de los dominios estructurales A1-A2-B-A3-C1-C2 (Gitschier et al., 1984, Nature 312, página 326; Wood et al., 1984, Nature 312, página 330; Vehar et al., 1984, Nature 312, página 337; Toole et al., 1984, Nature, 312, página 342). El producto precursor se procesa para dar dos cadenas polipeptídicas de 200 y 80 kDa en el Golgi y las dos cadenas, que se mantienen juntas por uno o más iones metálicos, se expresan en la sangre (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, página 6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, página 2979). El dominio B del factor VIII parece prescindible en lo que respecta a la función del cofactor VIII, mientras que los dominios A y C tienen varios sitios de interacción con otras macromoléculas que participan en la hemostasis (Sandberg et al., 1993, Thrombos. Haemostas., 69, páginas 1204 y Lind et al., 1995, Eur. J. Biochem., 232, página 19).
Por los párrafos anteriores, es evidente que el factor VIII es una proteína con varios sitios de interacción, cada uno responsable de una unión específica. Por lo tanto, es difícil modificar el factor VIII de modo que retenga completamente su función biológica.
La técnica de pegilación se ha aplicado previamente a mezclas de proteínas que contienen el factor VIII. De este modo, en el documento WO 94/15625 (Enzon) se ha descrito que la pegilación del factor VIII usando un enlace de carbamato (uretano) a un grado de modificación determinado resultante de un exceso molar de 100 veces de mPEG con respecto al factor VIII, puede aumentar la vida media in-vivo en ratones de 13 horas a 55 horas. Convencionalmente, se considera que la vida media en ratones es de aproximadamente 1 hora. De esta manera, 13 horas es una vida media inusualmente larga en ratones. Además, debe tenerse en cuenta que, con la extremada baja pureza de la preparación de factor VIII de partida (20-50 IU/mg de proteína), durante la reacción de acoplamiento predominaban otras proteínas además del factor VIII. Una proteína importante normalmente presente en las preparaciones del factor VIII de baja pureza es el factor de von Willebrand, que tiene una función estabilizadora del factor VIII y también podría contribuir muy bien a la protección del sitio funcional correspondiente durante el proceso de conjugación. Tras la conjugación, mPEG puede localizarse en cualquiera de las proteínas presentes en la mezcla de proteínas de las que el factor VIII normalmente constituye sólo una pequeña porción. La mezcla de proteínas pegiladas que contenía el factor VIII se usó para administración intravenosa. Sin embargo, un material de partida bien definido es uno de los factores esenciales que constituyen las condiciones controladas requeridas para la producción farmacéutica.
Para conjugar el factor VIII también se han usado otros polímeros. De esta manera, en la Patente de Estados Unidos 4.970.300 se ha descrito que puede aplicarse conjugación con dextrano para prolongar la vida media del factor
VIII.
En la mayoría de las técnicas de acoplamiento, el reactivo polimérico reacciona con los grupos \varepsilon-amino de los restos de lisina del polipéptido. Estos grupos a menudo están distribuidos por toda la superficie del polipéptido, y pueden ocasionar fácilmente una conjugación adyacente a un sitio funcional. Como consecuencia, por medio de un acoplamiento aleatorio, a menudo se altera la actividad o función. Nuestra experiencia es que cuando se aplican estas técnicas a preparaciones muy puras, tales como un factor VIII recombinante con actividad coagulante del que se ha delecionado el domino B, esta actividad disminuye de forma severa ya a un grado de modificación de aproximadamente 5 mPEG/molécula de factor VIII.
Sumario de la invención
Los inventores de la presente invención han descubierto que puede retenerse en un alto grado la actividad específica de polipéptidos conjugados, simplemente inmovilizando el polipéptido en un adsorbente con especificidad de grupo antes de la reacción de acoplamiento, y posteriormente desorbiendo el conjugado por técnicas convencionales. Esto es bastante sorprendente, ya que previamente se ha considerado esencial el uso de adsorbentes con propiedades de unión específicas con respecto al polipéptido en cuestión para conseguir una protección de ciertos dominios importantes para las funciones biológicas.
El beneficio de modificar polímeros biocompatibles a menudo depende del grado de modificación. De esta manera, normalmente se requiere un alto grado de modificación, es decir, un alto número de polímeros biocompatibles por molécula de polipéptido, para una protección eficaz contra la actividad proteolítica. Con la ayuda de la presente invención, en la que los polímeros biocompatibles se introducen más selectivamente, se ha retenido mejor la actividad específica. De esta manera, los inventores de la presente invención han descubierto que el factor VIII puede protegerse de forma eficaz contra la degradación en un entorno in-vitro que muestra tener un efecto de degradación sobre esta molécula. Este efecto puede lograrse con un grado de modificación de sólo 4-5 mPEG/factor VIII.
El uso de adsorbentes con especificidad de grupo de acuerdo con la presente invención es económicamente más favorable comparado con los adsorbentes descritos en la técnica anterior. El uso de adsorbentes con especificidad de grupo también facilitará el registro de conjugados como agentes terapéuticos.
El presente proceso hace posible mejorar la función in-vivo de polipéptidos, especialmente mejorando la función farmacocinética incluyendo la biodisponibilidad, y reduciendo la inmunogenicidad mostrada por los polipéptidos.
De esta manera, la presente invención se refiere a un proceso para mejorar la función in-vivo del factor VIII protegiendo dianas expuestas de dicho polipéptido,
a) inmovilizando el factor VIII por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico fabricados por síntesis de química orgánica;
b) activando el polímero biocompatible;
c) conjugando el polímero biocompatible activado con el factor VIII inmovilizado; y posteriormente
d) eluyendo el conjugado del adsorbente.
Descripción detallada de la invención
En la presente invención, la expresión "sitio de interacción" se refiere a varios sitios esenciales para la función biológica del polipéptido particular.
En la presente invención, la expresión "dianas expuestas" se refiere a sitios externos en el polipéptido en cuestión con tendencia a experimentar reacciones no deseadas in-vivo. Los ejemplos de dianas expuestas incluyen epítopos antigénicos y sitios para la escisión proteolítica. Sin embargo, ciertos sitios para la escisión proteolítica se denominan sitios de interacción.
La presente invención hace que sea posible, en una medida hasta ahora inalcanzable, reducir la influencia de reacciones indeseadas in-vivo, por ejemplo, la escisión proteolítica y posiblemente la agregación, mientras que al mismo tiempo deja sin afectar los sitios de interacción fundamentales para la función biológica del polipéptido. Esto se ha descrito en la aplicación de conjugación con mPEG del factor VIII (recombinante). Mas específicamente, inmovilizando el polipéptido por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos fabricados por síntesis de química orgánica, los sitios de interacción del polipéptido se excluyen de la conjugación con el polímero biocompatible. Además, por medio de la conjugación del polímero biocompatible activado con el polipéptido en los sitios externos deseados, las dianas expuestas se ocultan de la acción de, por ejemplo, proteasas.
En la presente solicitud, "polipéptidos" se refiere a proteínas y oligopéptidos con al menos 20 aminoácidos en la cadena. El número de aminoácidos del polipéptido producido de acuerdo con la presente invención convenientemente está en el intervalo de 30 hasta 4.500 aminoácidos, y preferiblemente en el intervalo de 40 hasta 3.000 aminoácidos. Los polipéptidos pueden ser de mamífero, más específicamente de origen humano, o pueden producirse por técnicas de ADN recombinante. Los polipéptidos que pueden conjugarse de acuerdo con la presente invención incluyen polipéptidos que presentan actividad coagulante o que tienen una función de soporte para la coagulación. Los polipéptidos pueden ser de longitud completa, es decir, la secuencia de aminoácidos es idéntica a la secuencia correspondiente encontrada en mamíferos en general y en los seres humanos en particular. Los polipéptidos también pueden ser derivados de deleción de los polipéptidos de longitud completa, en los que falta uno o más aminoácidos. Específicamente, el polipéptido es el factor VIII de la coagulación.
El factor VIII de longitud completa presente en el plasma humano tiene una masa molecular de aproximadamente 300 kDa. Los concentrados del factor VIII derivados del plasma humano contienen varias formas fragmentadas del factor VIII completamente activas como se describe en Andersson et al., (véase anteriormente). La forma activa más pequeña tiene una masa molecular de aproximadamente 170 kDa y consta de dos cadenas de aproximadamente 90 kDa y aproximadamente 80 kDa que se mantienen unidas por uno o más iones metálicos (véase el documento EP-A-0 197 901). Por lo tanto, el factor VIII biológicamente activo producido de acuerdo con la presente invención, convenientemente tiene una masa molecular en el intervalo de aproximadamente 170 kDa hasta aproximadamente 300 kDa.
Pharmacia AB de Estocolmo, Suecia, ha desarrollado un producto de factor VIII recombinante que corresponde a la forma del factor VIII plasmático de 170 kDa en concentrados de factor VIII terapéuticos. La molécula de factor VIII recombinante truncada se denomina r-VIII SQ y se produce en células de ovario de hámster chino (CHO) en un proceso de cultivo celular en medio sin suero. La actividad específica de r-VIII SQ es de aproximadamente 15.000 IU VIII:C por mg de proteína total. En el documento WO-A-91/09122 cedido a Pharmacia AB se ha descrito la estructura y bioquímica de r-VIII SQ.
En la presente invención, el factor VIII puede ser el factor VIII plasmático o el factor VIII recombinante. Cuando es factor VIII es recombinante, puede ser el factor VIII de longitud completa o, preferiblemente, un derivado de deleción del factor VIII de longitud completa que tiene actividad coagulante. En este contexto, un derivado de deleción se define como un factor VIII de coagulación, en el que se ha perdido el total o una parte del domino B mientras que se mantiene la actividad coagulante. Los dominios restantes se unen de forma adecuada por un enlazador de aminoácidos. En P. Lind et al., Eur. J. Biochem., vol. 232 (1995) páginas 19-27 se proporcionan ejemplos de construcciones de diversos enlazadores.
La presente invención puede usarse de forma ventajosa para introducir de forma selectiva polímeros biocompatibles en una amplia diversidad de productos del factor VIII. De esta manera, la presente invención puede usarse para estabilizar adicionalmente el factor VIII plasmático in-vivo, que ya está estabilizado por asociación con su proteína de soporte, el factor de von Willebrand (vWf).
Es una ventaja que el producto final esté bien definido. Por lo tanto, la actividad específica del factor VIII en el proceso de acoplamiento de la presente invención debe ser al menos de aproximadamente 1.000 IU/mg de proteína total, y convenientemente al menos de 2.000 IU/mg de proteína total. La actividad específica del factor VIII preferiblemente está en el intervalo de 5.000 hasta 20.000 IU/mg de proteína total, y más preferiblemente en el intervalo de 10.000 hasta 17.000 IU/mg de proteína total.
La actividad del factor VIII en el procedimiento de acoplamiento puede ser al menos de aproximadamente 1.000 IU/ml, y convenientemente al menos de 2.000 IU/ml. La actividad del factor VIII preferiblemente está dentro del intervalo de 5.000 hasta 50.000 IU/ml y más preferiblemente de 20.000 hasta 40.000 IU/ml.
El polímero biocompatible de la presente invención puede seleccionarse entre el grupo compuesto por homopolímeros, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo. Los polímeros biocompatibles pueden ser de cadena lineal o ramificada. El poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo convenientemente se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros de polietilenglicol y homopolímeros de polipropilenglicol. El polímero biocompatible preferiblemente es un homopolímero de polietilenglicol (PEG). El peso molecular del PEG puede estar en el intervalo de aproximadamente 300 hasta 20.000, convenientemente en el intervalo de 1.500 hasta 10.000 y preferiblemente en el intervalo de 3.000 hasta 5.000.
El polímero biocompatible debe estar protegido en un extremo para evitar la derivatización cruzada. Son ejemplos de grupos adecuados para este fin grupos alcoxi inferiores de cadena lineal o ramificada, preferiblemente el grupo monometoxi. Un polímero biocompatible particularmente preferido en la presente invención es monometoxi polietilenglicol (mPEG).
También son concebibles otros polímeros biocompatibles, por ejemplo, dextrano, polivinilpirrolidona y DL aminoácidos.
El polímero biocompatible debe activarse antes de la reacción de acoplamiento para posibilitar la formación de enlaces covalentes. Para este fin, el extremo del polímero biocompatible frente al polipéptido debe tener unido un grupo hidroxilo que sea susceptible de activación. Hay varias formas de activar el polímero biocompatible dependiendo del aminoácido seleccionado para la unión covalente. Son derivados de mPEG adecuados para el acoplamiento con grupos amino mPEG succinimidil succinato, mPEG succinimidil succinamida, mPEG succinimidil propionato, succinimidil carbonato de mPEG, succinimidil éster de mPEG carboximetilado, mPEG-oxicarbonilimidazol, mPEG nitrofenil carbonatos, mPEG triclorofenil carbonato, mPEG tresilato (el último descrito por Nilsson K. Mosbach K., Methods in Enzymology, Vol 104, páginas 56-69 (1984)), (todos los reactivos mencionados comercializados por Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA), mPEG anhídrido maleico y mPEG anhídrido metilmaleico (Garman A., Kalindjian S.B., FEB Vol 223: 2, páginas 361-365), y anhídridos mixtos de mPEG succinato, mPEG ácido acético o mPEG ácido propiónico, respectivamente (Dreborg S. y Akerblom E, véase anteriormente).
Los restos de cisteína pueden conjugarse con mPEG maleimida, mPEG vinilsulfona y mPEG ortopiridildisulfuro (comercializado por Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA). En el caso de la conjugación del grupo guanidino de la arginina, son reactivos adecuados derivados de mPEG de fenilglioxal (Zalipski, véase anteriormente).
Los carbohidratos primero deben oxidarse de forma que estén presentes grupos aldehído y después pueden conjugarse con mPEG hidrazida (Zalipski, véase anteriormente).
El procedimiento de acoplamiento se realiza a un pH adecuado para el aminoácido a conjugar. También debe considerarse el pH adecuado para el polipéptido en general, así como la dependencia del pH de la reactividad del polímero biocompatible. Por lo tanto, normalmente, el pH para el acoplamiento está en el intervalo de aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8, fijándose el límite inferior para evitar un procedimiento de acoplamiento prolongado y el límite superior para proporcionar condiciones suaves para el polipéptido. El intervalo de pH anterior es adecuado en la conjugación que implica lisinas. Por lo tanto, en los ejemplos de la presente solicitud, hemos conjugado una substancia que tiene actividad de FVIII en tales condiciones suaves. En ciertos casos, también pueden ser adecuados valores de pH fuera de este intervalo. De esta manera, la conjugación que implica cisteínas convenientemente se realiza a un pH por debajo de aproximadamente 7, mientras que las argininas convenientemente se conjugan a un pH en el intervalo de aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 9,3.
El procedimiento de acoplamiento debe realizarse a una temperatura por encima de 0ºC, convenientemente en el intervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 40ºC y preferiblemente en el intervalo de 10 hasta 30ºC. De nuevo, debe considerarse una temperatura adecuada para el polipéptido en general, así como la influencia de la temperatura sobre la reactividad del polímero biocompatible. En los ejemplos de la presente solicitud, todas las etapas de acoplamiento se realizaron a temperatura ambiente.
El adsorbente usado en la presente invención tiene especificidad de grupo en relación con el polipéptido a inmovilizar. Los adsorbentes con especificidad de grupo tienen afinidad por varios polipéptidos. Además, a menudo se unen menos fuertemente y la elución puede realizarse en condiciones más suaves que con adsorbentes monoespecíficos, uniéndose estos últimos a uno solo o a un número muy pequeño de polipéptidos. En Jansson J.C. et al, Protein Purification, Principles. High Resolution Methods, and Applications, VCH Publishers, página 274-285 (1989), se proporcionan adsorbentes con especificidad de grupo adecuados. Además, el adsorbente de la presente invención se caracteriza porque lleva ligandos fabricados por síntesis de química orgánica.
Específicamente, son ligandos adecuados para uso en la presente invención grupos de intercambio aniónico, preferiblemente fuertes, tales como aminoetilo cuaternario (QAE), tri-metilaminoetilo (TMAE) o aminometilo cuaternario (Q), más preferiblemente aminometilo cuaternario (Q). Además, los ligandos pueden acoplarse fuertemente a la matriz, o con un espaciador, tal como alquilamina, hexilamina, diaminodipropilamina, etilaminasuccinamida (Persson & Lagerström, en Packings and stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K.K., ed., Marcel Dekker Inc. 1990, página 754), o con un tentáculo ramificado al que se unen los ligandos (es un ejemplo adecuado Fractogel™ EMD, producido por Merck de Alemania).
Después de dicho procedimiento de acoplamiento, el polipéptido conjugado se eluye por técnicas convencionales. En este contexto, es esencial que se consideren las condiciones fisicoquímicas para evitar la degradación de los polipéptidos conjugados. De esta manera, si la ruta de acoplamiento implica un enlace de conjugación lábil en un cierto intervalo de pH, debe evitarse ese intervalo.
En el procedimiento de acoplamiento, cuando el polipéptido se inmoviliza en el adsorbente, el polipéptido puede ponerse en contacto con un agente bloqueante soluble, con el fin de excluir sitios adicionales de la conjugación. Tal agente bloqueante debe fabricarse por síntesis de química orgánica, y además debe conjugarse con cualquiera de los ligandos identificados interiormente unidos a un polímero seleccionado, por ejemplo, entre poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno), homopolímeros de polietilenglicol u homopolímeros de polipropilenglicol. El agente bloqueante también puede llevar entidades que tienen afinidad específica por el polipéptido.
Después de la elución, el agente bloqueante soluble en contacto se desorbe por aplicación de condiciones químicas adecuadas. Por ejemplo, si el agente bloqueante se adsorbió por interacción hidrófoba, podría desorberse reduciendo la intensidad iónica, o simplemente reduciendo la temperatura. El agente bloqueante soluble posteriormente se separa del conjugado por cromatografía de exclusión molecular en condiciones convencionales.
La matriz del adsorbente en la presente invención puede ser cualquier resina comercial conocida que sea compatible con las moléculas biológicas. De esta manera, la matriz puede seleccionarse entre diversas matrices muy hidrófilas, por ejemplo, matrices de agarosa tales como una amplia diversidad de matrices de Sepharose™ vendidas por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia, matrices de polímeros orgánicos tales como TSK-GEL:s vendida por Tosoh Corp. de Tokyo, Japón, o matrices de polímeros orgánicos muy porosos vendidas por Per Septive Biosystems de Boston, Estados Unidos. También son adecuadas matrices de membrana, por ejemplo, Sartobind™ vendida por Sartorius de Alemania y MemSep™ vendido por Millipore de Estados Unidos. La matriz preferiblemente es una matriz de agarosa. Son matrices de agarosa adecuadas en la presente invención, aparte de Sheparose™, Minileak™ vendida por Kem-En-Tec A/S de Copenhage, Dinamarca y Bio-Gel A vendido por Bio-Rad, de Bruselas, Bélgica. Preferiblemente, la matriz se reticula permitiendo un flujo rápido (FF) y, por lo tanto, una alta capacidad de producción. Más preferiblemente, se realiza una cromatografía de la presente invención en un gel de Sepharose™ FF. Además, también pueden usarse ventajosamente resinas compuestas de copolímeros de oligoetilenglicol, metacrilato de glicidilo y dimetacrilato de pentaeritritol, tal como Fractogel™ (comercializado por Merck de Alemania), celulosa y vidrio poroso.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible que se puede obtener por el presente proceso son nuevos. Con el presente proceso, la actividad del polipéptido después de la conjugación puede ser al menos un 30% de la actividad antes de dicha conjugación, convenientemente al menos un 50% y preferiblemente al menos un 70% de la actividad antes de dicha conjugación.
Los conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible que se puede obtener por el presente proceso pueden usarse como medicamentos. Especialmente, pueden usarse como medicamentos conjugados del factor VIII y un polímero biocompatible producido de acuerdo con el presente proceso. Es especialmente ventajoso usar un conjugado del factor VIII y un polímero biocompatible, donde el grado de conjugación está en el intervalo de 1 hasta 15 moléculas de PEG protegido terminalmente con monoalquilo/factor VIII, convenientemente en el intervalo de 2 hasta 10 moléculas de PEG protegido terminalmente con monoalquilo/factor VIII, preferiblemente en el intervalo de 3 hasta 7 moléculas de PEG protegido terminalmente con monoalquilo/factor VIII. En este contexto, el factor VIII conjugado convenientemente se produce por una técnica de ADN recombinante, preferiblemente un derivado de deleción recombinante del factor VIII de longitud completa que tiene actividad coagulante, y más preferiblemente un factor VIII SQ recombinante obtenido por deleción (r-VIII SQ).
Los polipéptidos conjugados de la presente invención convenientemente se usan para administración subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa. Especialmente, el factor VIII conjugado puede usarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia A y, en particular, para la administración subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa de tal medicamento.
La presente invención también se refiere a un método para preparar conjugados del factor VIII para uso en el tratamiento de la hemofilia A por medio de la administración subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa de un conjugado de factor VIII y un polímero biocompatible producido de acuerdo con el presente proceso.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo con fines ilustrativos y de ninguna manera deben considerarse limitantes del alcance de la presente invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1 Preparación de factor VIII recombinante
La producción del factor VIII recombinante SQ (r-VIII SQ) se realizó esencialmente como se describe en la patente WO-A-9109122, ejemplo 1-3. Una línea de células CHO con deficiencia de DHFR (DG44N.Y.) se sometió a electroporación con un vector de expresión que contenía el gen r-VIII SQ y un vector de expresión que contenía el gen de la dihidrofolato reductasa. Después de la selección en medios selectivos, se amplificaron las colonias supervivientes por medio del crecimiento en cantidades crecientes por etapas de metotrexato. El sobrenadante de las colonias resultantes se investigó individualmente para determinar la actividad del factor VIII. Se eligió un clon de producción, posteriormente se adaptó al crecimiento en suspensión sin suero en un medio definido y finalmente se creó un proceso de cultivo celular a gran escala. Después de ciertos periodos de tiempo se recoge el sobrenadante y se purifica adicionalmente como se describe más adelante.
El medio acondicionado se aclaró por filtración, el pH se ajustó y después el filtrado se introdujo en una columna de S Sepharose™ FF (volumen de la columna 3 l). Después del lavado, el factor VIII se eluyó con un tampón salino que contenía CaCl_{2} 5 M y Triton™ X-100 al 0,02%. Esta etapa de cromatografía de intercambio catiónico se realizó a 2-8ºC. El eluato de la etapa de S Sepharose™ FF (eluato-S) se congeló hasta que se realizó una purificación adicional.
Se descongelaron 700 ml del eluato S y la temperatura se ajustó a temperatura ambiente. Se realizó inactivación del virus por incubación durante 30 minutos con tri-n-butil-fosfato (TNBP) y Triton™ X-100 a una concentración final del 0,3% (v/v) y 1,0% (v/v), respectivamente. Una columna de inmunoafinidad con anticuerpo monoclonal (mAb) con un volumen de 260 ml se equilibró con un tampón de eluato S que contenía las cantidades correspondientes de agentes químicos de inactivación de virus. Después se introdujo en la columna de mAb la solución del factor VIII y posteriormente se lavó. La elución se realizó con un tampón que contenía etilenglicol al 50%.
Una columna de Q Sepharose™ se preequilibró a una alta concentración de cloruro sódico y después se equilibró con un tampón de la misma composición que el tampón de elución de la columna de inmunoafinidad. Se introdujo el eluato de mAb y la columna después se lavó con tampón de equilibrio seguido de un tampón de lavado de intensidad iónica fisiológica. La columna se eluyó elevando la concentración de cloruro sódico a 0,6 M. No se usó detergente para el lavado y la elución de la columna Q. Una columna de butil-Sheparose™ 4 FF se equilibró con un tampón que contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 1,4 M, CaCl_{2} 50 mM y Tween™ 80 al 0,02%, pH 6,8. Al eluato-Q se le añadió NH_{4}Ac a una concentración final de 1,0 M y Tween™ 80 al 0,02%. Esta solución se introdujo en la columna de butil-gel a un caudal lineal de 60 cm/hora. La columna después se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio y después se eluyó a un caudal lineal de 35 cm/hora con un tampón que contenía histidina 50 mM, NH_{4}Ac 0,5 M, CaCl_{2} 50 mM y Tween™ 80 al 0,02%, pH 6,8. La pureza de esta preparación era muy alta, proporcionando una actividad específica de 12.000-17.000 IU/ mg de proteína.
Análisis
En los ejemplos 1-8, se analizó la actividad del factor VIII con un ensayo cromogénico (Chromogenix AB de Mölndal, Suecia) a menos que se indique otra cosa. La cantidad de factor VIII se determinó espectrofotométricamente a A280 y por medio del análisis de aminoácidos. La cantidad de mPEG acoplado al polipéptido se midió con un método de RMN de protón (Dreborg, S. y Akerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)).
Ejemplo 2
(Ejemplo comparativo)
Factor VIII conjugado con un anhídrido mixto de mPEG succinato
La composición de tampón del eluato de HIC, preparada de acuerdo con el ejemplo 1, se sometió a intercambio por cromatografía de exclusión molecular realizada en una columna de Superose 12 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia), previamente equilibrada con un tampón de la siguiente composición: hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM pH 7,8. A alícuotas de la solución de r-VIII SQ se les añadió un exceso molar de 35, 60 y 100 veces (con respecto al rVIII) de un anhídrido mixto de mPEG succinato (PM 3.000). Las mezclas se dejaron reaccionar durante 1,5 horas en un dispositivo rotatorio a temperatura ambiente. Para retirar el exceso de mPEG ácido succínico y para separar la población heterogénea del rVIII conjugado de acuerdo con el tamaño, se realizó una cromatografía de exclusión molecular, ahora usando una columna de Superose 6 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia). A partir de cada reacción de acoplamiento, se analizaron por separado las fracciones correspondientes a la primera y segunda mitad del pico de la proteína (denominadas grupo 1 y grupo 2 en la tabla I). La tabla I presenta los resultados de la conjugación de r-VIII SQ con el anhídrido mixto del mPEG succinato
TABLA I
1
Como es evidente en la tabla I, la actividad específica de rVIII se redujo espectacularmente, incluso con este bajo grado de conjugación.
Ejemplo 3 Factor VIII adsorbido sobre un gel de Q Sepharose™ FF durante el acoplamiento con un anhídrido mixto de mPEG succinato
Se protegieron lisinas reactivas rodeadas por cargas negativas de la molécula del factor VIII de la conjugación con mPEG por adsorción del factor VIII sobre un gel de intercambio aniónico. Se usó una columna rellena con Q Sepharose™ FF (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia), equilibrada con un tampón de la siguiente composición: L-histidina 50 mM, NaCl 0,15 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 6,5, para adsorber el factor VIII. En la columna se introdujo un eluato de HIC preparado de acuerdo con el ejemplo I. Para conseguir condiciones apropiadas para el acoplamiento de mPEG, la columna se lavó con un tampón que contenía hepes 0,25 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 7,8 antes de la adición del mPEG. El gel se transfirió a un recipiente de reacción, se añadió un anhídrido mixto de mPEG succinato (PM 3.000) a la suspensión a una cantidad correspondiente al exceso molar con respecto al factor VIII que se indica en la tabla II. La reacción se incubó con rotación durante 1,5 horas. La columna después se volvió a rellenar y el rVIII conjugado se eluyó con un tampón de L-histidina 50 mM, NaCl 0,6 M, CaCl_{2} 4 mM, pH 6,8. Se realizaron 4 preparaciones a una cantidad constante de r-VIII SQ introducida por cantidad de gel. Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente. La tabla II presenta los resultados del r-VIII SQ conjugado adsorbido sobre un gel de Q Sepharose™ FF.
TABLA II
2
Como es evidente en la tabla II, la actividad específica del r-VIII SQ conjugado se retiene en un grado significativamente mayor en comparación con el r-VIII SQ conjugado del ejemplo 2.
Ejemplo 4 FVIII adsorbido en un gel de Q Sepharose™ FF durante el acoplamiento con tresilato de mPEG
En este ejemplo, todas las etapas de adsorción, acoplamiento y elución de r-VIII SQ en el gel de Q Sepharose™ FF se realizaron como en el ejemplo 3. Para conjugar el factor VIII se usó mPEG tresilato (PM 5.000). La tabla III presenta los resultados de r-VIII SQ conjugado adsorbido en un gel de Q Sepharose™ con mPEG tresilato de acuerdo con la invención.
TABLA III
3
En este caso, la actividad específica fue ligeramente menor que en el ejemplo 3, probablemente debido al mayor peso molecular de mPEG.
Ejemplo 5 Factor VIII adsorbido en un gel de intercambio aniónico con tentáculos durante el acoplamiento con un anhídrido mixto de mPEG succinato
Se usó una columna rellena con Fractogel™ EMD TMAE 650 (comercializada por Merck) para adsorber r-VIII SQ. Todas las etapas se realizaron como en el ejemplo 3. La tabla IV presenta los resultados de la conjugación de r-VIII SQ adsorbido en un gel de intercambio aniónico con tentáculos con un anhídrido mixto de mPEG succinato de acuerdo con la invención.
TABLA IV
4
Ejemplo 6 Activación con Trombina del factor VIII conjugado con mPEG
La activación con trombina de r-VIII SQ conjugado se ensayó en un ensayo in-vitro bien conocido para los especialistas en la técnica. Se ensayó una muestra preparada de acuerdo con el ejemplo 3, que daba como resultado un grado de derivatización de 4 mPEG/r-VIII SQ. El r-VIII SQ conjugado pudo activarse por trombina humana de una manera dependiente de la dosis. Posteriormente siguió la inactivación. En la figura 1, se muestra la curva de los cambios de actividad obtenidos cuando se añadió 1 unidad NIH de trombina por 1 unidad de r-VIII SQ conjugado. Para el ensayo inmediato de las muestras de la mezcla de reacción se usó un método de coagulación de una etapa realizado esencialmente de acuerdo con Mikaelsson et al., 1983, Blood 62, página 1006. Se obtuvo una activación de 30 veces en 1 minuto, seguida de inactivación. Los modelos de activación-inactivación obtenidos con la trombina estaban de acuerdo con los estudios previamente indicados sobre la interacción del factor VIII-trombina (Fulcher et al., 1983, Blood, 61, página 807, Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, página 2979, Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25, página 505, Rotblat et al., 1985, Biochemistry, 24, página 4294).
Ejemplo 7 Ensayos de estabilidad del factor VIII mPEGilado en un extracto de tejido porcino
Para evaluar la influencia de la conjugación con mPEG sobre la estabilidad del factor VIII en una solución representativa del medio subcutáneo, se realizó un ensayo in-vitro usando extracto de tejido porcino. Se produjeron dos preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG como se describe en el ejemplo 3, se incubaron en el extracto y se analizó la actividad coagulante en alícuotas a 0, 2, 4, 6 y 24 horas usando un ensayo cromogénico. Durante las primeras 6 horas, el grado de conjugación se correlacionaba con la actividad que quedaba.
TABLA V
6
Los resultados de la tabla V y la figura 2 muestran claramente que la conjugación con mPEG mejoró significativamente la estabilidad del factor VIII.
Ejemplo 8 Estudio de biodisponibilidad del factor VIII mPEGilado en monos Cynomolgus
Para evaluar la influencia de la conjugación de mPEG sobre la estabilidad in-vivo del factor VIII, se realizó un estudio farmacocinético. Se produjeron dos preparaciones de factor VIII conjugado con mPEG como se describe en el ejemplo 3 y se determinaron sus actividades específicas, como se indica en la tabla VI. Para conseguir una alta homogeneidad del material derivatizado producido por el procedimiento de acoplamiento, se realizó una fraccionación de cada preparación dos veces por cromatografía de exclusión molecular. Se usó una columna Superdex 200 PG XK 16/60 (comercializada por Pharmacia Biotech de Uppsala, Suecia) equilibrada con L-histidina 19 mM, NaCl 0,31 M, CaCl_{2} 3,4 mM, Tween 80 al 0,02%, pH 7,0. Se realizó una reducción del volumen de las soluciones de factor VIII antes de la segunda cromatografía de exclusión molecular en concentradores Centriplus 30 esterilizados en autoclave; dispositivos de ultrafiltración por centrifugación (límite 30 kDa, comercializados por Amicon Inc. MA, USA). Las soluciones se concentraron tres veces a 2.500 xg durante 45 minutos. Las fracciones reunidas obtenidas después de la segunda cromatografía de exclusión molecular posteriormente se diluyeron en un tampón de acuerdo con la formulación final; L-Histidina 19 mM, NaCl 0,31 M, CaCl_{2} 3,4 mM, Tween 80 al 0,02%, sacarosa 17,5 mM, pH 7,0. Las soluciones de proteína finalmente se filtraron usando filtros Millex GV de 0,22 \mum (comercializados por Millipore, MA, USA) y posteriormente se introdujeron en frascos esterilizados en autoclave. Las soluciones se almacenaron a -70ºC hasta el uso. A seis monos Cynomolgus hembra se les administraron dosis intravenosas individuales de la preparación 1 de 250 IU/kg y dosis subcutáneas individuales de la preparación 2 de 1.500 IU/kg en diferentes ocasiones. Todas las soluciones se diluyeron 1:1 con agua para inyección antes de la administración. El sitio de inyección para la administración subcutánea era la región dorsal izquierda o derecha del animal, y para la administración intravenosa las venas cefálicas izquierda o derecha respectivamente. Se recogieron muestras de sangre de todos los animales a través de una punción en la vena femoral y se introdujeron en tubos que contenían citrato sódico como anticoagulante (10% del volumen total) a las siguientes duraciones después de la inyección:
Administración intravenosa: 0 (antes de la dosificación), 0,25, 1, 2, 4, 8, 24, 30, 48 h.
Administración subcutánea; 0 (antes de la dosificación), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30, 48 h.
En un estudio separado en la misma especie se realizó un estudio farmacocinético del factor VIII no conjugado. En la tabla VI se muestran las dosis, la vía de administración y los resultados (media (\pm desviación típica (SD))).
TABLA VI
7
I.V. = intravenoso
S.C.= subcutáneo
^{1)}F = \hskip0.3cm AUC (S.C.) X DOSIS (I.V.)
\hskip1.1cm AUC (I.V.) X DOSE (S.C.)
donde AUC es el área bajo la curva de concentración en plasma-tiempo.
Como es evidente en la tabla VI, la administración subcutánea de las dos preparaciones del factor VIII conjugado con mPEG produjo una biodisponibilidad notablemente mayor en comparación con la administración subcutánea de r-VIII SQ no conjugado. El análisis estadístico usando el ensayo t de Student confirmó que la diferencia era significativa.

Claims (8)

1. Un proceso para mejorar la función in vivo del factor VIII protegiendo dianas expuestas de dicho polipéptido, caracterizado por:
(a)
la inmovilización del factor VIII por interacción con un adsorbente con especificidad de grupo que lleva ligandos de intercambio aniónico;
(b)
la activación de un polímero biocompatible;
(c)
la conjugación del polímero biocompatible activado con sitios externos del factor VIII inmovilizado; y
(d)
la elución del conjugado del adsorbente
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho factor VIII es el factor VIII recombinante.
3. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el polímero biocompatible se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros, copolímeros o copolímeros de bloque de poli(óxidos de alquileno) protegidos terminalmente con monoalquilo.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3, donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo se selecciona entre el grupo compuesto por homopolímeros de polietilenglicol y homopolímeros de polipropilenglicol.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 4, donde el poli(óxido de alquileno) protegido terminalmente con monoalquilo es un monometoxi polietilenglicol (mPEG).
6. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde los ligandos de intercambio aniónico se seleccionan entre el grupo compuesto por aminometilo cuaternario, aminoetilo cuaternario y trimetilaminoetilo o una mezcla de los mismos.
7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia A.
8. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en la fabricación de un medicamento adaptado para administración subcutánea para el tratamiento de la hemofilia A.
ES02013613T 1995-09-29 1996-09-27 Metodo para preparar conjugados del factor viii y un polimero biocompatible. Expired - Lifetime ES2238522T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9503380A SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Protein derivatives
SE9503380 1995-09-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2238522T3 true ES2238522T3 (es) 2005-09-01

Family

ID=20399642

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02013607T Expired - Lifetime ES2236396T3 (es) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugados de factor ixy un polimero biocompatible.
ES02013613T Expired - Lifetime ES2238522T3 (es) 1995-09-29 1996-09-27 Metodo para preparar conjugados del factor viii y un polimero biocompatible.
ES96932915T Expired - Lifetime ES2187676T3 (es) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugados de un polipeptido y un polimero biocompatible.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02013607T Expired - Lifetime ES2236396T3 (es) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugados de factor ixy un polimero biocompatible.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES96932915T Expired - Lifetime ES2187676T3 (es) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugados de un polipeptido y un polimero biocompatible.

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6048720A (es)
EP (3) EP1258497B1 (es)
JP (1) JP3911023B2 (es)
AT (3) ATE283351T1 (es)
AU (1) AU706246B2 (es)
BR (1) BR9610695A (es)
CA (1) CA2231801C (es)
DE (3) DE69633952T2 (es)
DK (3) DK1258497T3 (es)
ES (3) ES2236396T3 (es)
HU (1) HU221208B1 (es)
NO (2) NO321096B1 (es)
NZ (1) NZ319322A (es)
PL (1) PL185821B1 (es)
PT (3) PT871649E (es)
SE (1) SE9503380D0 (es)
WO (1) WO1997011957A1 (es)
ZA (1) ZA968139B (es)

Families Citing this family (171)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT405740B (de) * 1996-12-13 1999-11-25 Immuno Ag Von willebrand-faktor-derivat sowie ein verfahren zur isolierung von proteinen
CZ298579B6 (cs) 1998-04-28 2007-11-14 Applied Research Systems Ars Holding N. V. Konjugát polyolu a interferonu-beta
US7425541B2 (en) * 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
EP1154796B1 (en) 1999-02-22 2007-06-20 University of Connecticut Novel albumin-free factor viii formulations
US6635676B2 (en) * 1999-04-28 2003-10-21 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
US7655252B2 (en) 1999-04-28 2010-02-02 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
IT1318484B1 (it) * 2000-04-21 2003-08-25 Univ Roma Derivati di colina per il trattamento della malattia di alzheimer.
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
US6423826B1 (en) * 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
WO2002004483A1 (en) * 2000-07-07 2002-01-17 Samokhin Gennady P Biologically active protein conjugates formed by first protecting active site
US7083787B2 (en) * 2000-11-15 2006-08-01 Globeimmune, Inc. Yeast-dendritic cell vaccines and uses thereof
JP2010209109A (ja) * 2001-06-25 2010-09-24 Regents Of The Univ Of Michigan 抗微生物ナノエマルジョンの組成物および方法
CA2452582C (en) * 2001-07-11 2013-01-22 Maxygen Holdings, Ltd. G-csf conjugates
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
SG159381A1 (en) * 2001-10-10 2010-03-30 Novo Nordisk As Remodeling and glycoconjugation of peptides
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
SE0104186D0 (sv) * 2001-12-12 2001-12-12 Darcy Birse Method and device
EP3669887A1 (en) * 2002-01-18 2020-06-24 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
US20030149246A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Russell John C. Macromolecular conjugates and processes for preparing the same
US20050153416A1 (en) * 2002-03-02 2005-07-14 Nikolaos Dimoudis Conjugates of the c domain of human gelatinase a and polyethylene glycol, methods of purification and uses thereof
MXPA04012496A (es) * 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
DK1545613T3 (da) * 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
ES2911435T3 (es) * 2003-02-26 2022-05-19 Nektar Therapeutics Conjugados de polímero-resto de Factor VIII
WO2004103270A2 (en) * 2003-04-02 2004-12-02 Suntory Pharmaceutical Research Laboratories Llc Compounds and methods for treatment of thrombosis
WO2006127896A2 (en) * 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1626983B8 (en) * 2003-05-12 2010-12-22 Affymax, Inc. Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof
TR201907313T4 (tr) * 2003-05-23 2019-06-21 Nektar Therapeutics İki PEG zinciri içeren PEG türevleri.
US7947261B2 (en) 2003-05-23 2011-05-24 Nektar Therapeutics Conjugates formed from polymer derivatives having particular atom arrangements
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
KR101520209B1 (ko) * 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
AU2004296860B2 (en) * 2003-12-03 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20050171002A1 (en) * 2004-02-03 2005-08-04 Mohanty Dillip K. Polyoxyalkylene compound and method for making
AU2005228945B2 (en) 2004-03-19 2010-09-30 Baxter Healthcare S.A. Factor IXa for the treatment of bleeding disorders
KR20070027621A (ko) * 2004-06-08 2007-03-09 알자 코포레이션 4-성분 축합 반응에 의한 고분자 콘쥬게이트의 제조
KR101100059B1 (ko) * 2004-06-30 2011-12-29 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
AU2014280936B2 (en) * 2004-06-30 2016-12-15 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
AU2005292135B2 (en) * 2004-09-29 2011-09-29 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Inhibitors of hepatitits C virus
HUE026826T2 (en) 2004-10-29 2016-07-28 Ratiopharm Gmbh Modeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
AU2012203813B2 (en) * 2004-11-12 2013-10-24 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
KR101654011B1 (ko) * 2004-11-12 2016-09-05 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
AU2013203348B2 (en) * 2004-11-12 2016-03-03 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
AU2005332660A1 (en) * 2004-11-12 2006-12-14 Seattle Genetics, Inc. Auristatins having an aminobenzoic acid unit at the N terminus
AU2016203693B2 (en) * 2004-11-12 2018-08-23 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
DK1835938T3 (da) * 2004-12-27 2013-11-04 Baxter Int Polymer-von Willebrand-faktor-konjugater
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
WO2006121569A2 (en) * 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP2722051B1 (en) 2005-07-07 2018-11-07 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the C-terminus
US8871720B2 (en) * 2005-07-07 2014-10-28 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the C-terminus
US7395967B2 (en) * 2005-07-21 2008-07-08 University Of Washington Methods and systems for counterbalancing a scanning beam device
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
US7750116B1 (en) * 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
JP2009532351A (ja) * 2006-03-31 2009-09-10 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド ペグ化第ｖｉｉｉ因子
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
ES2516694T3 (es) * 2006-07-21 2014-10-31 Ratiopharm Gmbh Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
KR101556248B1 (ko) * 2006-10-04 2015-09-30 노보 노르디스크 에이/에스 글리세롤이 연결된 페길화된 당 및 글리코펩티드
PT2101821E (pt) 2006-12-15 2014-10-03 Baxter Int Fator conjugado viia-ácido (poli)siálico com prolongamento do tempo de meia vida in vivo
US8754194B2 (en) 2006-12-22 2014-06-17 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
MX2009007146A (es) * 2006-12-27 2009-07-09 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados porcion del factor ix-polimero que tienen ligadura que se puede liberar.
JP5702066B2 (ja) 2006-12-27 2015-04-15 ネクター セラピューティクス 解離可能な連結を有するフォンウィルブランド因子および第ｖｉｉｉ因子のポリマー共役体
PL2144923T3 (pl) 2007-04-03 2013-12-31 Biogenerix Ag Sposoby leczenia z użyciem glikopegilowanego G-CSF
CN103990116A (zh) * 2007-04-26 2014-08-20 拜尔健康护理有限责任公司 稳定用于冷冻储藏的重组蛋白液体溶液的方法
US8747872B2 (en) 2007-05-02 2014-06-10 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
US9493499B2 (en) 2007-06-12 2016-11-15 Novo Nordisk A/S Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography
EP2167117B1 (en) * 2007-06-13 2012-08-15 CSL Behring GmbH Use of vwf stabilized fviii preparations for extravascular administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
PE20090481A1 (es) 2007-07-16 2009-05-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-cd79b e inmunoconjugados humanizados y metodos de uso
CN111499748A (zh) 2007-07-16 2020-08-07 健泰科生物技术公司 抗cd79b抗体和免疫偶联物及使用方法
US20090035848A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-05 Robert Hickey Moving bed biofilm reactor (mbbr) system for conversion of syngas components to liquid products
US8173597B2 (en) * 2007-11-09 2012-05-08 Baxter International Inc. Modified recombinant factor VIII and von Willebrand factor and methods of use
EP3269737B1 (en) 2008-01-31 2024-06-19 Genentech, Inc. Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2009108806A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Novo Nordisk A/S Conjugated factor viii molecules
EP2297330A4 (en) * 2008-06-04 2012-03-14 Bayer Healthcare Llc FVII MUTINES FOR THE TREATMENT OF MORBUS WILLEBRAND
EP2291523B1 (en) 2008-06-24 2014-12-17 CSL Behring GmbH Factor viii, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life
WO2010045321A2 (en) * 2008-10-15 2010-04-22 Baxter International Inc. Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
EP2352515A4 (en) * 2008-11-03 2012-04-25 Bayer Healthcare Llc METHOD FOR TREATING HEMOPHILIA
BRPI0921429B1 (pt) 2008-11-07 2022-07-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Formulação farmacêutica liofilizada estável, e, método para preparar um fator liofilizado estável
CA2743904A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 The Regents Of The University Of Michigan Cancer vaccine compositions and methods of using the same
WO2010091122A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Amunix, Inc. Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same
CA2769244A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP2459224B1 (en) 2009-07-27 2016-06-01 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
US20120263701A1 (en) 2009-08-24 2012-10-18 Volker Schellenberger Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
HUE036233T2 (hu) 2009-12-06 2018-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc VIII-FC Faktor kimérás és hibrid polipeptidek, és ezek használati módszerei
EP2552967A4 (en) 2010-04-02 2014-10-08 Amunix Operating Inc BINDING FUSION PROTEINS, BINDING FUSION PROTEIN MEDICINAL CONJUGATES, XTEN MEDICAMENT CONJUGATES, AND METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
KR20140002601A (ko) 2010-07-09 2014-01-08 바이오겐 이데크 헤모필리아 인코포레이티드 키메라 응고 인자
KR20130125789A (ko) * 2010-12-16 2013-11-19 노보 노르디스크 에이/에스 수성 인자ⅷ 용액
HUE049352T2 (hu) 2010-12-22 2020-09-28 Baxalta GmbH Anyagok és módszerek egy vízoldható zsírsavszármazéknak egy fehérjéhez való konjugálására
EP3527218A1 (en) 2011-06-10 2019-08-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
EP4169525A1 (en) 2011-07-08 2023-04-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
US10656167B2 (en) 2011-07-25 2020-05-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Assays to monitor bleeding disorders
CN104271150A (zh) 2012-01-12 2015-01-07 比奥根艾迪克Ma公司 嵌合因子viii多肽及其用途
EA029560B1 (ru) 2012-01-12 2018-04-30 Байоджен Эмэй Инк. Применение химерного фактора свертывания крови для уменьшения ингибирующего иммунного ответа у субъекта
LT2814840T (lt) 2012-02-15 2020-02-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktoriaus viii kompozicijos ir jų gavimo ir naudojimo būdai
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
PL2814502T3 (pl) 2012-02-15 2018-02-28 Csl Behring Gmbh Warianty czynnika von Willebranda mające ulepszone powinowactwo do wiązania czynnika VIII
WO2013130683A2 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
MY190257A (en) * 2012-04-16 2022-04-11 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subcutaneous therapeutic agents
US20150080309A1 (en) 2012-04-24 2015-03-19 Nova Nordisk A/S Compounds Suitable for Treatment of Haemophilia
WO2013185114A2 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric clotting factors
EP4079316A1 (en) 2012-06-08 2022-10-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
PT2882450T (pt) 2012-07-11 2020-02-19 Bioverativ Therapeutics Inc Complexo de fator viii com xten e a proteína fator de von willebrand, e utilizações do mesmo
US10001495B2 (en) 2012-07-25 2018-06-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
EP2908847B1 (en) 2012-10-18 2022-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP2914293A4 (en) 2012-10-30 2016-04-20 Biogen Ma Inc METHOD OF USE OF FVIII POLYPEPTIDE
US10131682B2 (en) 2012-11-24 2018-11-20 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to a cell binding molecules
DK3889173T3 (da) 2013-02-15 2023-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc Optimeret faktor viii-gen
JP6330026B2 (ja) 2013-03-15 2018-05-23 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子ポリペプチド製剤
UY35463A (es) 2013-03-15 2014-10-31 Biogen Idec Inc Formulaciones de polipéptido fc-factor ix.
ES2657291T3 (es) 2013-04-22 2018-03-02 Csl Ltd. Un complejo covalente de factor de von Willebrand y factor VIII asociado por un puente disulfuro
MX2015016567A (es) 2013-06-28 2016-03-31 Biogen Ma Inc Enlazador escindible por trombina con xten y usos del mismo.
EP3043813B1 (en) 2013-08-08 2021-01-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric fviii molecules
EP3033097B1 (en) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
WO2015070014A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant fusion compound
US10325687B2 (en) 2013-12-06 2019-06-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
DK4176894T3 (da) 2014-01-10 2024-05-27 Bioverativ Therapeutics Inc Kimære faktor viii-proteiner og anvendelser deraf
KR20230136616A (ko) 2014-02-04 2023-09-26 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온교환 크로마토그래피의 용도
CN114262344A (zh) 2014-02-28 2022-04-01 杭州多禧生物科技有限公司 带电荷链接体及其在共轭反应上的应用
EP3164150B1 (en) 2014-07-02 2020-11-04 CSL Behring Lengnau AG Modified von willebrand factor
CA3069221C (en) 2014-09-23 2023-04-04 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
KR20170125941A (ko) 2015-03-06 2017-11-15 체에스엘 베링 리컴비넌트 퍼실리티 아게 개선된 반감기를 갖는 변형된 폰 빌레브란트 인자
EP3298036B1 (en) 2015-05-22 2022-04-06 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von willebrand factor
RU2017145014A (ru) 2015-05-22 2019-06-24 Цсл Беринг Ленгнау Аг Усеченные полипептиды фактора фон виллебранда для лечения гемофилии
CA2991973C (en) 2015-07-12 2021-12-07 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of a cell-binding molecule
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
AU2016301303B2 (en) 2015-08-03 2021-10-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX fusion proteins and methods of making and using same
AU2016353353B2 (en) 2015-11-13 2020-07-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Viral vectors encoding recombinant FVIII variants with increased expression for gene therapy of hemophilia A
CA3005565A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Baxalta Incorporated Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
MX2018008337A (es) 2016-01-07 2018-09-17 CSL Behring Lengnau AG Factor de von willebrand truncado mutado.
RU2018128613A (ru) 2016-01-07 2020-02-07 Цсл Беринг Ленгнау Аг Мутированный фактор фон виллебранда
PT3411478T (pt) 2016-02-01 2022-09-13 Bioverativ Therapeutics Inc Genes do fator viii otimizados
EP3476937A4 (en) 2016-06-24 2019-12-04 Mogam Institute for Biomedical Research CHIMERIC PROTEIN WITH FVIII AND VWF FACTORS AND USE THEREOF
TW201828974A (zh) 2016-11-11 2018-08-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林重組技能公司 用於血管外施予以治療或預防凝血疾病之截短型類血友病因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）多肽類
EP3538133B1 (en) 2016-11-11 2021-02-17 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
KR20220150408A (ko) 2016-11-14 2022-11-10 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 결합 링커, 그러한 결합 링커를 함유하는 세포 결합 분자-약물 결합체, 링커를 갖는 그러한 결합체의 제조 및 사용
EP3548066A1 (en) 2016-12-02 2019-10-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilic arthropathy using chimeric clotting factors
BR112019011198A2 (pt) 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação
SG11202000764RA (en) 2017-08-09 2020-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acid molecules and uses thereof
BR112020015228A2 (pt) 2018-02-01 2020-12-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Uso de vetores lentivirais que expressam fator viii
TW202014181A (zh) 2018-04-04 2020-04-16 美商希吉隆醫療公司 可植入顆粒及相關方法
AU2019270184A1 (en) 2018-05-18 2020-11-26 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of treating hemophilia A
MX2021000582A (es) 2018-07-16 2021-04-12 Baxalta Inc Terapia genica de hemofilia a mediante el uso de vectores virales que codifican variantes del factor viii (fviii) recombinantes con mayor expresion.
MX2021001599A (es) 2018-08-09 2021-07-02 Bioverativ Therapeutics Inc Moleculas de acido nucleico y sus usos para la terapia genica no viral.
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
TW202039546A (zh) 2019-01-16 2020-11-01 美商巴克斯歐塔公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
EP3986444A1 (en) 2019-06-19 2022-04-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii-fc for treating hemophilia and low bone mineral density
EP4073106A2 (en) 2019-12-12 2022-10-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
EP4355768A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
AU2022332276A1 (en) 2021-08-23 2024-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii genes
WO2023056331A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acids encoding factor viii polypeptides with reduced immunogenicity
WO2024081309A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Sigilon Therapeutics, Inc. Engineered cells and implantable elements for treatment of disease

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
SE8501050D0 (sv) * 1985-03-05 1985-03-05 Kabivitrum Ab Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof
DE3717210C2 (de) * 1987-05-22 1993-11-25 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
SE465222C5 (sv) * 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5169627A (en) * 1991-10-28 1992-12-08 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Oral pharmaceutical composition containing a polyethylene glycol-immunoglobulin G conjugate for reconstitution of secretory immunity and method of reconstituting secretory immunity
GB9225448D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
WO1994015625A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
DE69625085T2 (de) 2003-07-17
EP1260582B1 (en) 2004-11-24
ZA968139B (en) 1997-05-29
BR9610695A (pt) 1999-07-06
ES2236396T3 (es) 2005-07-16
EP1260582A1 (en) 2002-11-27
HUP9901203A3 (en) 2000-02-28
CA2231801A1 (en) 1997-04-03
US6048720A (en) 2000-04-11
EP0871649A1 (en) 1998-10-21
PL325958A1 (en) 1998-08-17
DE69633952D1 (de) 2004-12-30
HUP9901203A2 (hu) 1999-07-28
DK1258497T3 (da) 2005-06-06
EP1258497B1 (en) 2005-02-16
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29
EP1258497A2 (en) 2002-11-20
DE69633952T2 (de) 2006-03-02
ATE289321T1 (de) 2005-03-15
NO981408L (no) 1998-03-27
PT1258497E (pt) 2005-06-30
NO981408D0 (no) 1998-03-27
ATE283351T1 (de) 2004-12-15
DK0871649T3 (da) 2003-03-24
EP0871649B1 (en) 2002-11-27
NZ319322A (en) 1998-08-26
ATE228531T1 (de) 2002-12-15
CA2231801C (en) 2010-07-27
HU221208B1 (en) 2002-08-28
PT871649E (pt) 2003-04-30
JPH11513378A (ja) 1999-11-16
DK1260582T3 (da) 2005-03-29
NO20051950L (no) 1998-03-27
ES2187676T3 (es) 2003-06-16
PL185821B1 (pl) 2003-08-29
DE69634373T2 (de) 2005-12-29
AU706246B2 (en) 1999-06-10
PT1260582E (pt) 2005-03-31
AU7151796A (en) 1997-04-17
WO1997011957A1 (en) 1997-04-03
DE69634373D1 (de) 2005-03-24
JP3911023B2 (ja) 2007-05-09
EP1258497A3 (en) 2002-11-27
DE69625085D1 (de) 2003-01-09
NO321096B1 (no) 2006-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2238522T3 (es) Metodo para preparar conjugados del factor viii y un polimero biocompatible.
ES2313912T3 (es) Procedimiento para la produccion de una composicion de plasmina acidificada inactiva de manera reversible.
KR101904630B1 (ko) Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
JP5876208B2 (ja) 延長されたｉｎｖｉｖｏ半減期を有する第ＶＩＩａ因子−（ポリ）シアル酸結合体
ES2235154T3 (es) Factor viii hibrido humano y porcino.
US20120121613A1 (en) Protein conjugate having an endopeptidase- cleavable bioprotective moiety
WO2007062610A2 (es) Dendrímero con peg de cuatro ramas para la conjugación a proteínas y péptidos
KR20110016440A (ko) 연장된 반감기를 가진 제 ⅰⅹ 인자 접합체
Podlasek et al. Streptokinase binds to lactate dehydrogenase subunit-M, which shares an epitope with plasminogen.
MXPA98002416A (es) Conjugados de un polipeptido y un polimero biocompatible
JPS6048932A (ja) ポリエチレングリコ−ル修飾人免疫グロブリンを含有する静注用人免疫グロブリン製剤