CZ298579B6 - Konjugát polyolu a interferonu-beta - Google Patents

Konjugát polyolu a interferonu-beta Download PDF

Info

Publication number
CZ298579B6
CZ298579B6 CZ20003995A CZ20003995A CZ298579B6 CZ 298579 B6 CZ298579 B6 CZ 298579B6 CZ 20003995 A CZ20003995 A CZ 20003995A CZ 20003995 A CZ20003995 A CZ 20003995A CZ 298579 B6 CZ298579 B6 CZ 298579B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
beta
polyol
interferon
peg
ifn
Prior art date
Application number
CZ20003995A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20003995A3 (en
Inventor
Tayar@Nabil El
J. Roberts@Michael
Harris@Milton
Sawlivich@Wayne
Original Assignee
Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems Ars Holding N. V. filed Critical Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Publication of CZ20003995A3 publication Critical patent/CZ20003995A3/cs
Publication of CZ298579B6 publication Critical patent/CZ298579B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Konjugát polyolu a interferonu-beta, v nemž je polyolová skupina kovalentne vázána na Cys.sup.17.n.lidského interferonu-beta. Konjugáty tohoto typu mají zvýšenou úcinnost in vivo, zvýšenou rozpustnost pri neutrálním pH a zvýšenou stálost a je možnoje použít pro výrobu farmaceutických prostredku pro lécení infekcí, nádoru a autoimunitních a zánetlivých onemocnení.

Description

Oblast techniky
Vynález se týká konjugátů polyolu a interferonu-beta, v nichž je polyolová jednotka vázána na zbytek cysteinu v poloze 17, Cys17.
ío Dosavadní stav techniky
Interferon z lidských fibroblastů, IFN-beta, má protivirovou účinnost a může také stimulovat přirozené buňky zabíječe proti nádorovým buňkám. Jde o polypeptid s molekulovou hmotností přibližně 20 000, jehož tvorba je vyvolávána přítomností virů a RNA s dvojitým řetězcem.
Z nukleotidové sekvence genu pro interferon z fibroblastů, klonovaný rekombinantní technologií DNA odvodili Derynk a další v Nátuře, 285, 542-547, 1980 úplnou sekvenci aminokyselin této bílkoviny, která obsahuje 166 zbytků aminokyselin.
V publikaci Shepard a další, Nátuře, 294, 563-565, 1981 se popisuje mutace na bázi v poloze 842 (Cys-Tyr v poloze 141), při níž dochází k vymizení protivirové účinnosti a variantního klonu, z nějž byla vypuštěna sekvence nukleotidů 1119-1121.
V publikaci Mark a další, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 81(18): 5662-5666, 1984 se popisuje vytvoření umělé mutace tak, že se báze T v poloze 469 nahradí bází A, čímž dojde k záměně amino25 kyseliny Cys za Ser v poloze 17. Popisuje se, že výsledný IFN-beta je stejně účinný jako přirozený IFN-beta a mimo to je stálý při dlouhodobém skladování při teplotě -70 °C.
Kovalentní vazba hydrofilního polymeru polyethylenglykolu, PEG, známého také jako polyethylenoxid, PEO na různé molekuly, má důležité použití v biotechnologii a v lékařství. Ve své nej30 běžnější formě je PEG lineární polymer, který má na každém svém konci hydroxylovou skupinu HO-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH.
Tento vzorec je možno vyjádřit kratším způsobem jako HO-PEG-OH, kde -PEG- znamená kostru polymeru bez jeho koncových skupin. -PEG- tedy znamená -CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-.
PEG se běžně užívá jako methoxy-PEG-OH (m-PEG), přičemž na jednom konci této látky se nachází poměrně inertní methoxyskupina, kdežto druhý konec tvoří hydroxylová skupina, která je snadno chemicky modifikována
CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH.
Běžně se užívají také rozvětvené typy PEG. Tyto látky je možno vyjádřit vzorcem R(-PEG45 OH)n, kde R znamená centrální skupinu, například pentaerythritol nebo glycerol a m znamená počet rozvětvení. Symbol m může mít hodnotu 3 až 100 nebo i více. I v tomto případě hydroxylové skupiny snadno podléhají chemické modifikaci.
Další rozvětvená forma byla popsána v dokumentu WO 96/21 469 a má jediné zakončení, podlé50 hájící chemické modifikaci. Tento typ PEG je možno vyjádřit vzorcem (CH3O-PEG-)pR-X, kde p znamená 2 nebo 3, R znamená centrální skupinu, například zbytek lysinu nebo glycerolu a X znamená funkční skupinu, například karboxylovou skupinu, která se snadno podrobí chemické aktivaci. Ještě další rozvětvená forma obsahuje reaktivní skupiny, například karboxylové skupiny v průběhu řetězce PEG spíše než na jeho konci.
- 1 CZ 298579 B6
Kromě uvedených forem PEG je možno polymer také připravit tak, aby v řetězci obsahoval slabé nebo degradovatelné vazby. Například v US patentové přihlášce 06/026716 (Harris) se uvádí, že PEG je možno připravit s esterovými vazbami v polymemím řetězci, přičemž tyto vazby je možno hydrolyzovat. Hydrolýzou se polymer rozštěpí na fragmenty s nižší molekulovou hmotností podle reakčního schématu -PEG-COO2-PEG- + H2O -> -PEG-CO2H + HO-PEG-.
V textu přihlášky vynálezu se pod pojmem polyethylenglykol nebo PEG rozumí kterákoliv ze svrchu popsaných forem.
ío Kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu jsou chemicky blízce příbuzné PEG a je možno je použít v řadě použití místo PEG. Tyto látky je možno vyjádřit obecným vzorcem HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CHR-OH, kde R znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu.
PEG je užitečný polymer, který je vysoce rozpustný ve vodě a také v celé řadě organických roz15 pouštědel. Je netoxický a nevyvolává reakci imunitního systému. V případě vazby PEG chemickým způsobem na sloučeninu, nerozpustnou ve vodě, je výsledný konjugát obvykle rozpustný ve vodě a také v řadě organických rozpouštědel.
Konjugáty PEG a proteinů jsou v současné době běžně užívány při náhradě bílkovin a pro další léčebná použití. Například polyethylenglykolovaná adenosindeamináza, například ve formě prostředku AdagenR se užívá k léčení závažných kombinovaných onemocnění s imunodefíciencí, jako SCIDS, polyethylenglykolovaná L-aspargináza, například OncapsparR se užívá k léčení akutní lymfoblastické leukemie ALL a polyethylenglykolovaný interferon-alfa, například Intron (R) A se v současné době nachází ve stadiu klinických zkoušek fáze III pro léčení hepatitidy C.
Shrnutí poznatků o konjugátech PEG a proteinech s klinickým účinkem je možno nalézt v publikaci N. L. Bumham, Am. J. Hosp. Pharm., 15, 210-218, 1994.
Pro polyethylenglykolaci proteinů byla vyvinuta řada postupů. Vazbu PEG na reaktivní skupiny proteinu je možno typicky uskutečnit s využitím elektrofilně aktivovaných derivátů PEG. Vazba PEG na alfa- a epsilon-aminoskupiny lysinových zbytků a N-zakončení má za následek vznik konjugátu, tvořeného směsí produktů.
Obvykle je takový konjugát tvořen skupinou několika molekul PEG, vázaných na molekulu pro35 teinu, směs může obsahovat proteiny, zcela prosté PEG až proteiny, v nichž je PEG vázán na každou aminoskupinu. V molekule proteinu s jednoduchou modifikací může být PEG vázán na zbytky aminokyseliny v různých polohách.
Tímto typem nespecifické polyethylenglykolace vzniká řada konjugátů, které jsou téměř neaktiv40 ní. Snížení aktivity je obvykle vyvoláno zastíněním aktivní vazné domény v bílkovině, k tomu dochází například v případě řady cytokinů a protilátek. Například v publikaci Katre a další, US 4 766 106 a US 4 917 888 se popisuje polyethylenglykolace IFN-beta a IL-2 při použití velkého přebytku methoxypolyethylenglykolyl-N-sukcinimidylglutarátu a methoxypolyethylenglykolyl-N-sukcinimidylsukcinátu. Obě bílkoviny byly produkovány v mikrobiálních hostitel45 ských buňkách, což umožnilo specifické mutace volného cysteinu na serin. Tato mutace byla potřebná pro mikrobiální expresi IFN-beta. IFN-beta, použitý při těchto pokusech byl běžně dodávaný BetaseronR, v němž byl zbytek cysteinu v poloze 17 nahrazen zbytkem šeřinu. Nepřítomnost glykosylace snížila rozpustnost této látky ve vodném roztoku. Při nespecifické polyethylenglykolaci sice došlo ke zvýšení rozpustnosti, hlavní problém však spočíval ve snížené účinnosti a v nízkém výtěžku.
V evropském patentovém spisu EP 593 868, který se týká konjugátu PEG a interferonu, se popisuje příprava konjugátů typu PEG-IFN-alfa. Avšak polyethylenglykolace je v tomto případě nespecifická, takže vzniká směs polohových izomerů těchto konjugátů, podobná situace je popsá55 na také v publikaci Monkarsh a další, ACS Symp. Ser., 680, 207-216, 1997.
-2CZ 298579 B6
V EP 675 201 (Kinstler a další) se popisuje selektivní modifikace N-terminálního zbytku faktoru pro růst a vývoj megakaryocytů, MGDF při použití mPEG-propionaldehydu. Tímto způsobem bylo možno dosáhnout reprodukovatelné polyethylenglykolace a farmakokinetiky v každé další šarži. V US 5 711 944 (Gilbert a další) se prokazuje, že je možno dosáhnout polyethylenglykolace IFN-alfa s optimální úrovní účinnosti. V tomto případě však bylo zapotřebí provést pracné čištění pro získání optimálního konjugátu.
Většina cytokinů i dalších bílkovin nemá specifické místo pro spojení s PEG a je tedy pravděpoío dobné, že vždy budou vznikat různé izomery, které budou zčásti nebo zcela neúčinné, takže dojde ke ztrátě účinnosti celé výsledné směsi.
Bylo by tedy zapotřebí dosáhnout monopolyethylenglykolace bílkovin, která by byla specifická pro určité místo proteinu a tímto způsobem připravit účinné konjugáty.
V publikaci Woghiren a další, Biokonjugate Chem., 4(5): 314-318, 1993 se popisuje syntéza thiolselektivního PEG derivátu pro tento způsob polyethylenglykolace, specifické pro určité místo v proteinu. Bylo prokázáno, že stálý derivát PEG s thiolovou ochrannou skupinou ve formě p-pyridyldisulfidové reaktivní skupiny se specificky váže na volné cysteinové zbytky v proteinu papainu. Nově vytvořená disulfidová vazba mezi papainem a PEG může být rozštěpena za mírných redukčních podmínek, čímž se regeneruje přírodní protein.
Dokument WO 87/00 056 popisuje „selektivně konjugované“ proteiny, avšak polohy připojení PEG jsou zcela nejasné. Patentový spis US 5 206 344 popisuje vazbu PERG na mutein skupiny
IL-2, nejde však o selektivní polyethylenglykolaci. Dokument US 5 166 322 popisuje varianty
IL-3 a jejich reakce s deriváty PEG. Opět však nejde o selektivní konjugaci.
Podle WO 97/11 957 je možno zlepšit účinnost polypeptidu in vivo tvorbou konjugátu s biologickým polymerem včetně PEG. Specifická účinnost je však nižší než účinnosti původního proteinu.
Konečně EP 690 127 popisuje modifikované faktory růstu a vývoje megakaryocytů MGDF včetně modifikace PEG. Polymer je vázán na N-terminální zakončení, jde pouze o molekuly MGDF s koncovým místem modifikace.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří konjugát polyolu a interferonu-beta, v němž je polyolová skupina kovalentně vázána na zbytek cysteinu v poloze 17, Cys17.
Specifické konjugace se dosahuje tak, že se nechá reagovat polyol, obsahující thiolové reaktivní skupiny se zbytkem Cys17 v interferonu-beta. Předpokládá se, že konjugáty tohoto typu budou mít in vivo zvýšenou účinnost. Cílem je také dosáhnout zvýšené rozpustnosti při neutrálním pH, zvýšené stálosti s menší tendencí ke tvorbě shluků, snížené tendence vyvolávat reakci imunitního systému, přičemž by současně nemělo docházet ke ztrátě účinnosti ve srovnání s přirozeným
IFN-beta.
V případě těchto konjugátů by bylo možno snížit počet dávek k dosažení téhož účinku, současně by byla zjednodušená příprava stabilních farmaceutických prostředků a pravděpodobně by bylo možno dosáhnout prodlouženého účinku.
Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.
-3CZ 298579 B6
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněn graf konjugátu PEG a IFN-beta před čištěním při použití kapilární elektroforézy CE.
Na obr. 2A až 2C je znázorněno čištění uvedeného konjugátu chromatografií na prostředku Superose 12, obr. 2A znázorňuje situaci po prvním průchodu, obr. 2B situaci po druhém průchodu a obr. 2C situaci po třetím průchodu.
ío Na obr. 3 je znázorněna chromatografie čištěného konjugátu PEG-IFN-beta po třetím průchodu chromatografickým sloupcem pomocí SDS-PAGE. Dráhy 1 a 4 jsou standardy pro molekulovou hmotnost proteinu, dráha 2 je dráha pro přírodní IFN-beta a v dráze 3 se nachází konjugát PEGIFN-beta.
Na obr. 4 je uveden graf čištěného konjugátu PEG-IFN-beta, v němž byl IFN-beta polyethylenglykolován při použití mPEG-OPSS5k, při použití kapilární elektroforézy CE.
Na obr. 5 je znázorněno spektrum čištěného konjugátu při prováděné spektrometrie (Maldi).
Na obr. 6 je znázorněno srovnání mezi protivirovým účinkem nativního IFN-beta a konjugátu PEG-IFN-beta. Buňky WISH byly inkubovány s uvedenými koncentracemi vzorku IFN-beta 24 hodin před uvedením do styku s cytopatickou dávkou viru vasikulámí stomatitidy. Cytopatický účinek byl stanoven po dalších 48 hodinách přeměnou MTT.
Na obr. 7 je znázorněn profil vazby IFN-beta a PEG-IFN při použití buněk Daudi.
Na obr. 8 je znázorněn farmakokinetický profil IFN-beta a PEG-IFN u myší po nitrožilním podání. Přerušovaná čára znamená zkoušku LOQ pro každou standardní křivku.
Na obr. 9 je znázorněn farmakokinetický profil IFN-beta a PEG-IFN u myší při podkožním podání. Přerušovaná čára znázorňuje zkoušku LOQ pro každou standardní křivku.
Vynález je založen na zjištění, že při napojení polyolové skupiny, zvláště PEG skupiny na Cys17 lidského IFN-beta neočekávaně dochází ke zvýšení účinnosti biologicky účinného IFN-beta ve srovnání s přírodním lidským interferonem-beta nebo alespoň nedochází ke snížení účinnosti.
To znamená, že při uvedené konjugaci má výsledný konjugát stejnou nebo zvýšenou biologickou účinnost ve srovnání s původním IFN-beta a současně má jiné žádoucí vlastnosti polyolu, například zvýšenou rozpustnost.
Pod pojmem „IFN-beta“ se v textu přihlášky rozumí interferon z lidských fibroblastů, který se získává izolací z biologických tekutin nebo rekombinantní technikou s použitím DNA z prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk a také soli tohoto interferonu, jeho funkční deriváty, prekurzory a účinné frakce za předpokladu, že tyto látky obsahují cysteinový zbytek, který se v přírodní formě nachází v poloze 17.
Polyolová skupina v konjugátu polyolu a IFN-beta podle vynálezu může být jakákoliv ve vodě rozpustná mono- nebo bifunkční polyalkylenoxidová skupina s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Typicky je použitým polyolem polyalkylenglykol, jako polyethylenglykol PEG. Je zřejmé, že je možno použít i jiné polyoly, jako polypropylenglykol a také kopolymeiy polyethylenglykolu a polypropylenglykolu.
V textu přihlášky se pod pojmem „skupina PEG“ rozumí lineární i rozvětvený PEG, methoxy PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelný PEG, PEG s reaktivními skupinami
-4CZ 298579 B6 v průběhu řetězce, dendrimer PEG, kopolymery PEG s jedním nebo větším počtem dalších polyolů a také kopolymery PEG a PLGA, to znamená kyselinou polymléčnou a polyglykolovou.
Pod pojmem „soli“ se v textu přihlášky rozumí soli, vytvořené na karboxylové skupině a také soli, vytvořené na aminoskupině. Tyto soli je možno připravit známým způsobem. Soli na karboxylové skupině zahrnují anorganické soli, jako soli sodné, draselné a vápenaté a také soli s organickými bázemi, například s aminy, jako triethanolaminem, argininem nebo lysinem. Soli na aminoskupině zahrnují například soli s anorganickými kyselinami, jako kyselinou chlorovodíkovou a soli s organickými kyselinami, jako kyselinou octovou.
Pod pojmem „funkční deriváty“ se v textu přihlášky rozumí deriváty, které je možno připravit z funkčních skupin na postranních řetězcích aminokyselin nebo na terminálních N- nebo Ckoncových skupinách pomocí známých postupů a do rozsahu vynálezu spadají tyto funkční deriváty v případě, že jsou farmaceuticky přijatelné, to znamená, že nenarušují účinnost proteinu a nejsou toxické. Takovými deriváty jsou například estery nebo alifatické amidy karboxylových skupin a N-acylové deriváty volných aminoskupin nebo O-acylové deriváty volných hydroxylových skupin, vytvořené na acylových skupinách, například na alkanoylových nebo aroylových skupinách.
Pod pojmem „prekurzoiy“ se rozumí sloučeniny, které je možno převést nebo které jsou převáděny na IFN-beta v lidském nebo živočišném organismu.
„Aktivní frakce“ proteinu jsou podle vynálezu takové fragmenty nebo prekurzory polypeptidového řetězce, které jako takové nebo v kombinaci s příbuznými molekulami mají stejnou účinnost jako IFN-beta. Molekuly, použité pro kombinaci mohou být například zbytky cukrů nebo fosfátů nebo může jít o agregáty polypeptidových molekul.
Konjugáty podle vynálezu je možno připravit známými postupy. Podle jednoho z možných provedení vynálezu se IFN-beta nechá reagovat s polyethylenglykolačním činidlem ve vhodném rozpouštědle a požadovaný konjugát se izoluje a čistí, například chromatografickými postupy.
Chromatografickým postupem je jakýkoliv postup, který se užívá k oddělení složek směsi nanesením této směsi na nosič nebo stacionární fázi, kterou protéká jako mobilní fáze rozpouštědlo. Dělicí principy chromatografie jsou založeny na odlišné fyzikální povaze stacionární a mobilní fáze.
Některé specifické typy chromatografických postupů, které jsou dobře známé z literatury zahrnují kapalinovou chromatografii, vysokotlakou chromatografii, chromatografii na iontoměniči, absorpční chromatografii, chromatografii afinitní, hydrofobní, dělicí, chromatografii v reverzní fázi, filtraci na gelu, ultrafiltraci nebo chromatografii na tenké vrstvě.
Pod pojmem „thiolreaktivní polyethylenglykolační činidlo“ se v textu přihlášky rozumí jakýkoliv derivát PEG, schopný reagovat s thiolovou skupinou cysteinového zbytku. Může jít například o PEG, obsahující funkční skupinu ze skupiny orthopyridyldisulfídová skupina, vinylsulfonová, maleimidová, jodacetimidová skupina a podobné skupiny. Podle výhodného provedení vynálezu je polyethylenglykolačním činidlem derivát orthopyridyl disulfidu OPSS s PEG.
Polyethylenglykolační činidlo se užívá ve své monomethoxylované formě, v níž je pro konjugaci k dispozici pouze jedno zakončení nebo v bifunkční formě, kde se konjugace mohou účastnit obě zakončení, může například dojít ke tvorbě konjugátu s dvěma molekulami IFN-beta, kovalentně vázanými na jedinou skupinu PEG. Molekulová hmotnost je s výhodou v rozmezí 500 až 100 000.
Konjugace podle vynálezu typicky probíhá podle následujícího reakčního schématu:
-5CZ 298579 B6
Protein-SH + mPEG-S-S
pH<7
-—*- mPEG-S-S-Protein g-merkaptoethanol
Proteín-S-H + mPEG-S-H + KOCH2CH2-S-S-CK2CH2OH
Ve druhém řádku svrchu uvedeného schématu se uvádí postup pro rozštěpení vazby mezi PEG a proteinem. Derivát mPEG-OPSS je vysoce selektivní pro volné sulfhydíylové skupiny a iychle reaguje při kyselém pH, při němž je IFN-beta stálý. Vysokou selektivnost je možno prokázat při přeměně konjugátu na nativní formu IFN-beta a PEG.
Bylo prokázáno, že disulfidová vazba, která vzniká mezi proteinem a skupinami PEG je stálá v krevním oběhu, může však být rozrušena po vstupu do buňky. Předpokládá se proto, že tento konjugát, který do buněk nevstupuje bude v oběhu stálý až do svého vyloučení ledvinami.
Je nutno uvést, že svrchu uvedená reakce je specifická pro určité místo, vzhledem k tomu, že ostatní dva cysteinové zbytky, které se nacházejí v polohách 31 a 141 přírodního lidského IFNbeta, nemohou reagovat spoužitým polyethylenglykolačním činidlem vzhledem ktomu, že již jsou součástí disulfidových můstků.
Vynález se rovněž týká způsobu postupné vazby dvou nebo většího počtu skupin PEG na polypeptid. Tento postup je založen na zjištění, že aktivovaný PEG s nižší molekulovou hmotností reaguje úplněji než PEG s vyšší molekulovou hmotností se stericky bráněným reakčním místem na proteinu. Je nutno zajistit, aby nákladné proteiny, užívané k léčebným účelům byly použity ke tvorbě konjugátu s PEG tak, aby se výsledek vyplatil. Mimo to pro snížení glomerulámí filtrace a pro optimalizaci farmakologických vlastností výsledného konjugátu PEG a proteinu by měl mít konjugát vhodný rozměr, ekvivalentní proteinu s molekulovou hmotností 70 000. To znamená, že v případě, že se bude vázat pouze jedna skupina PEG, užije se s výhodou derivát PEG s moleku25 lovou hmotností vyšší než 20 000. V případě, že v místě modifikace existuje sterická zábrana, může reaktivní skupina velké skupiny PEG obtížně dosahovat do místa modifikace a výsledky reakce budou neuspokojivé, zejména bude dosaženo nízkých výtěžků. Výhodný způsob polyethylenglykolace polypeptidu podle vynálezu zvyšuje výtěžek polyethylenglykolace, specifické pro určitou polohu tak, že se nejprve naváže malá heterobifunkční nebo homobifunkční skupina
PEG, která vzhledem ke svému poměrně malému rozměru může reagovat i v místech se sterickou zábranou. Pak se na tyto malé skupiny mohou navázat velké molekuly derivátů PEG, čímž je možno dosáhnout vysokého výtěžku požadovaného polyethylenglykolovaného proteinu.
Způsob postupného navázání dvou nebo většího počtu skupin PEG na polypeptid podle vynálezu zahrnuje postup, při němž se nejprve naváže na polypeptid heterobifunkční nebo homobifunkční skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností a pak se naváže monofunkční nebo bifunkční skupina PEG na volné zakončení této skupiny, která již je vázána na polypeptid. Tímto způsobem je postupně možno navázat na polypeptid dvě nebo větší počet skupin PEG. Polypeptidem je s výhodou IFN-beta, výhodným místem pro vazbu je Cys17, uložený v místě se sterickou zábra40 nou. Výsledný konjugát je možno čistit při použití jednoho nebo většího počtu čisticích postupů, jako jsou chromatografie na iontoměniči, chromatografie na gelu s vyloučením molekul s určitou molekulovou hmotností, hydrofobní interakční chromatografie, afinitní chromatografie a chromatografie v reverzní fázi.
Skupina PEG s nízkou molekulovou hmotností může být vyjádřena obecným vzorcem
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X,
-6CZ 298579 B6 kde W a X jsou skupiny, které nezávisle reagují s aminoskupinou, sulfhydrylovou skupinou, karboxylovou skupinou nebo hydroxylovou funkční skupinou, čímž dochází k vazbě skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid. W a X se s výhodou nezávisle volí ze skupiny orthopyridyldisulfid, maleimidy, vinylsulfony, jodacedamidy, aminy, thioly, karboxylo5 vé skupiny, aktivní estery, benzotriazoluhličitany, p-nitrofenolkarbonáty, izokyanáty a biotin. Skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností mají s výhodou molekulovou hmotnost v rozmezí 100 až 5000.
Monofunkční a bifunkční skupiny PEG pro vazbu na volné zakončení skupiny PEG s nízkou ío molekulovou hmotností, které jsou již vázány na polypeptid, mají s výhodou molekulovou hmotnost v rozmezí 100 až 200 000, s výhodou jde o methoxy PEG, rozvětvené typy PEG, hydrolyticky nebo enzymaticky degradovatelné skupiny PEG, skupiny PEG s reaktivními skupinami v průběhu řetězce nebo dendrimery PEG. Monofunkční nebo bifunkční skupiny PEG je možno vyjádřit obecným vzorcem
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z, kde Y je reaktivní skupina pro koncovou skupinu volného zakončení skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností, která již je vázána na polypeptid a Z znamená skupinu -OCH3 nebo skupinu, která je reaktivní a může tvořit bifunkční konjugát.
Konjugát PEG a polypeptidu, získaný svrchu uvedeným způsobem postupné vazby dvou nebo většího počtu skupin PEG může být použit při výrobě farmaceutického prostředku pro léčení chorob nebo poruch, při nichž se jako účinná látka při léčení používá polypeptid.
Součást podstaty vynálezu tvoří také konjugáty v čištěné formě, které jsou vhodné pro použití jako součást farmaceutického prostředku, jako účinná složka pro léčení některých chorob, k diagnostice bakteriálních a virových infekcí a také autoimunitních onemocnění, zánětlivých chorob a nádorů. Farmaceutický prostředek tohoto typu rovněž tvoří součást podstaty vynálezu.
Jako příklady svrchu uvedených chorob lze uvést zejména septický šok, AIDS, revmatoidní arthritis, lupus erythematosus a roztroušenou sklerózu.
Konjugáty, připravené způsobem podle vynálezu, je tedy možno podávat ve farmakologicky účinném množství nemocným, kteří jsou ohroženi některým ze svrchu uvedených onemocnění, nebo u nichž se již některé z těchto onemocnění vyskytlo.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu je možno podávat jakýmkoliv způsobem, který je kompatibilní s účinnou složkou tohoto prostředku. Výhodné je parenterální podání, například podání podkožní, nitrosvalové nebo nitrožilní. Dávka účinné látky závisí na různých faktorech, zejména na věku, hmotnosti a celkovém stavu nemocného a vždy ji určí ošetřující lékař.
Předpokládá se dávka v rozmezí 10 mikrogramů až 1 mg denně pro nemocného s hmotností 75 kg, výhodná denní dávka se bude pohybovat v rozmezí 20 až 200 mikrogramů.
Farmaceutický prostředek pro parenterální podání může být připraven v injekční formě, která obsahuje účinnou složku a vhodné nosné prostředí. Tato prostředí jsou v oboru známá, jde např. o vodu, fyziologický roztok chloridu sodného, Ringerův roztok a/nebo roztok dextrózy. Nosné prostředí může obsahovat malá množství pomocných látek k udržení stálosti a osmotického tlaku farmaceutického prostředku. Tyto lékové formy se připravují obvyklým způsobem.
Vynález byl svrchu popsán v souvislosti s několika specifickými provedeními, je však zřejmé, že vynález zahrnuje také různé modifikace a obvyklé změny postupů, které by mohl provést každý odborník.
-7CZ 298579 B6
Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 ío Příprava konjugátu PEG-INF-beta
Modifikace IFN-beta s použitím mPEG5k-OPSS
Pro přípravu konjugátu PEG-IFN-beta byl užit rekombinantní lidský IFN-beta, stálý při kon15 centraci 0,37 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,6. Postup se provádí tak, že se přibližně 1,0 ml 6 M roztoku močoviny přidá ke 2 ml IFN-beta v koncentraci 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 x 10“8 mol). Pak se přidá mPEG5k-OPSS v molámím přebytku 50 mol najeden mol IFN-beta a reakce se nechá probíhat v polypropylenové lahvičce 2 hodiny při teplotě 37 °C nebo 1 hodinu při teplotě 50 °C. Reakční směs se analyzuje pomocí kapilární elektroforézy CE ke zjištění rozsahu tvorby konjugátu PEG-IFN-beta před jakýmkoliv čištěním, jak je znázorněno na obr. 1. Typický výtěžek této reakce je 50 % PEG-IFN-beta. Reakční produkty se z reakční směsi odfiltrují při použití filtru ve formě injekční stříkačky s průměrem 0,22 m a zfiltrovaný roztok se pak nanese na sloupec pro oddělení látek od určité molekulové hmotnosti, náplň sloupce tvoří Superose 12 nebo Superdex 75 (Pharmacia), jako eluční činidlo se užije pufr s obsahem 50 mM fosfátu sodného a 150 mM NaCl o pH 7,0. Na obr. 2A je znázorněn profil eluce při čištění uvedeného konjugátu na sloupci s obsahem prostředku Superose 12. Materiál s obsahem požadovaného konjugátu byl analyzován pomocí SDS-PAGE, jak je znázorněno na obr. 3. Frakce, obsahující uvedený konjugát byly spojeny a koncentrát byl znovu nanesen na obdobný sloupec k dalšímu čištění konjugátu vzhledem k velké blízkosti frakcí s obsahem nativního IFN-beta, jak je znázor30 něno na obr. 2B. Tento postup byl ještě po třetí opakován k zajištění dostatečné čistoty, jak je znázorněno na obr. 2C. Na obr. 4 a 5 jsou pak znázorněny výsledky kapilární elektroforézy a hmotové spektrum (Maldi) čištěného konjugátu PEG-IFN-beta.
Modifikace IFN-beta s použitím mPEG30K-OPSS
Rekombinantní lidský IFN-beta byl připraven jako stálá látka v roztoku při koncentraci 0,36 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,6. Postup byl prováděn tak, že se přibližně 36 mg mPEG30K-OPSS ve 3 ml deionizované vody přidá ke 3 ml IFN-beta s koncentrací 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4,9 x 10“8 mol) a reakce probíhala v polypropylenové lahvičce 2 hodiny při teplotě 50 °C. Pak byla reakční směs analyzována na rozsah modifikace pomocí kapilární elektroforézy. Typický výtěžek této reakce je nižší než 30 %. Roztok pak byl nanesen na sloupec s obsahem prostředku Superose 12 (Pharmacia), jako eluční činidlo byl užit pufr s obsahem 5 mM fosfátu sodného a 150 mM NaCl o pH 7,0. Frakce s obsahem konjugátu byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE.
Příklad 2
Biologická účinnost konjugátu
Aby bylo možno stanovit účinky polyethylenglykolace na protivirovou účinnost lidského rekombinantního IFN-beta, byly lidské amniotické buňky WISH předem inkubovány s čerstvě připraveným IFN-beta ze stejné šarže, která byla užita pro polyethylenglykolaci nebo s konjugátem PEG-IFN-beta. Protivirová účinnost byla měřena cytopathickou zkouškou WISH-VSV a byla
-8CZ 298579 B6 stanovena na základě antivirového biologického účinku způsobem podle publikace Novick a další, J. Immunol., 129: 2244-2247, 1982. Při této zkoušce byly užity následující materiály:
- buňky WISH ATCC CCL 25,
- zásobní virus vesikulámí stomatitidy, ATCC V-520-001-522, skladovaný při -70 °C,
- lidský rekombinantní IFN-beta (InterPharm Laboratories LTD, 32, typ 0,75, šarže 205035) v množství 82 x 106 IU/ml, specifická účinnost 222 x 106 IU/mg,
- konjugát PEG-IFN-beta, připravený podle příkladu 1, uložený v PBS o pH 7,4,
- růstové prostředí WISH (prostředí MEM s vysokým obsahem glukózy a Earlovou směsí solí + 10 % FBS + 1,0 % L-glutaminu + penicilin/streptomycin (100 j./ml, 100 mikrogramů/ml),
- prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH (prostředí MEM s vysokým obsahem glukózy a Earlovou směsí solí + 5 % FBS + 1,0 % L-glutaminu + penicilin/streptomycin (100 j./ml, 100 mikrogramů/ml),
- MTT v koncentraci 5 mg/ml v PBS, skladování při -70 °C.
Zkouška byla provedena následujícím způsobem:
Vzorky IFN-beta byly zředěny na dvojnásobnou výchozí koncentraci v prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH.
Vytvoří se trojnásobné zředění vzorků IFN-beta v prostředí k provedení zkoušky s buňkami WISH na plotně s 96 plochými vyhloubeními, takže každé vyhloubení obsahuje 50 μΐ zředěného vzorku IFN-beta, do kontrolních vyhloubení se uloží pouze 50 μΐ prostředí.
Buňky WISH se v růstové log fázi oddělí roztokem trypsinu a EDTA, promyjí se prostředím k provedení zkoušky a upraví na konečnou koncentraci 0,8 x 106 buněk/ml.
Do každého vyhloubení se přidá 50 μΐ suspenze buněk WISH, to znamená 4 x 104 buněk najedno vyhloubení. Konečná koncentrace IFN-beta, již jsou vystaveny buňky, je nyní předem určená koncentrace.
Po inkubaci 24 hodin v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého v inkubátoru s vysokým obsahem vlhkosti se přidá do každého vyhloubení 50 μΐ zásobního VSV v ředění 1:10 v prostředí k prove40 dění zkoušky, jde o předem určenou dávku, která rozruší 100 % buněk WISH v průběhu 48 hodin, materiál se nepřidává do kontrolních vyhloubení bez viru, do nichž se přidá pouze stejný objem prostředí pro provedení zkoušky.
Po dalších 48 hodinách se do všech vyhloubení přidá 25 μΐ roztoku MTT, načež se buňky inku45 bují ještě 2 hodiny v inkubátoru.
Pak se obsah vyhloubení odstraní převrácením plotny a do každého vyhloubení se uloží 200 μΐ 100% ethanolu.
Po 1 hodině se plotny odečítají při vlnové délce 595 nm při použití systému Soft max Pro (software) a spektrofotometru Spectramax (Molecular Devices).
-9CZ 298579 B6
Tabulka 1. Protivirová účinnost polyethylenglykolovaného vzorku IFN-beta a vzorku se simulovanou polyethylenglykolací.
Vzorek IFN-beta* EC50**
Konjugát PEG-IFN-beta 3,9 ± 0,7 pg/ml
IFN-beta 16,4 ± 1,0 pg/ml
* Koncentrace zásobního roztoku ve vzorcích IFN-beta byla stanovena analýzou aminokyselin.
** EC50 (± směrodatná odchylka, S.D.) byla stanovena pomocí softwaru Microcal Origin 4.1.
Jak je shrnuto na obr. 6 a v tabulce 1, udržuje si konjugát PEG-IFN-beta úroveň protivirové účinnosti, která je vyšší než protivirová účinnost čerstvě připraveného původního IFN-beta. Pozorování, že získaný konjugát má přibližně 4krát vyšší biologickou účinnost než čerstvě připravený IFN-beta, může také být důsledkem zvýšené stálosti konjugátu ve srovnání s přírodním IFN-beta po přidání těchto látek do prostředí k provedení zkoušek s buňkami WISH.
Příklad 3
Zkoušky in vitro na relativní účinnost vzorků PEG-IFN
Relativní biologická účinnost PEG-IFN-beta s molekulovou hmotností PEG 30 000 byla stanovena s použitím buněk WISH podle příkladu 2, získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 2. Byly provedeny 3 nezávislé zkoušky třemi odlišnými pracovníky v odlišných časech.
Tabulka 2. Relativní protivirová účinnost PEG-IFN-beta
Relativní t (3 zkoušky) ičinnost Interferonu*
Vzorek Zkouška 1 Zkouška 2 Zkouška 3 Průměr (S.D.)
PEG(30000)- 3,2krát 3,Ikrát 1,8krát 3,0x(0,78)
IFN-beta vyšší vyšší vyšší vyšší
PEG(2x20000)- 4,2krát 1,3krát 0,85krát 2,lx(l,8)
IFN-beta vyšší vyšší vyšší vyšší
* EC50 ve srovnání se standardem IFN-beta pro každou zkoušku.
** Srovnání je založeno na koncentraci IFN-beta 330 pg/ml. Pomocí AAA byly stanoveny zásobní koncentrace pro PEG (30 000)-IFN-beta 5,41 pg/ml a pro PEG (2x20 000)-IFN-beta 6,86 pg/ml.
Vazba PEG-IFN-beta na buněčné receptory byla vyhodnocena v přítomnosti předem určeného množství 125I-IFN-alfa2a. IFN-alfa2a byl radioaktivně značen 125I při použití chloraminu T.
- 10CZ 298579 B6
Značený interferon byl oddělen od volného jodu průchodem reakčních složek sloupcem s obsahem prostředku Sephadex G25 s následným spojením frakcí, obsahujících bílkovinu (Pharmacia). Množství značeného interferonu bylo stanoveno kvantitativně zkouškou ELISA (Biosource, USA) a byla stanovena specifická aktivita. Buňky Daudi byly vypěstovány a sklizeny v exponen5 ciální fázi a 2 x 106 buněk bylo inkubováno 3 hodiny s 0,5 nM 125I-IFN-alfa2a při teplotě místnosti v přítomnosti různých koncentrací PEG-IFN-beta nebo IFN-alfa2a v pufru k provedení zkoušky, jde o prostředí RPMI 1640, obsahující 2 % fetálního telecího séra a 0,1 % azidu sodíku. Na konci inkubace byl buněčný materiál odstředěn přes vrstvu ftalátového oleje a radioaktivita, vázaná na buněčný materiál byla stanovena počítačem gama-záření. Vazba PEG(30 000)-IFN10 beta a PEG(2x20 000)-IFN-beta na receptor byla velmi podobná vazbě IFN-beta, jak je znázorněno na obr. 7.
Mimo to byla stanovena relativní účinnost na buňkách Daudi (buňky lidského lymfomu B) při zkoušce na zástavu proliferace, jak je uvedeno v tabulce 3. Všechny typy interferonu byly roz15 puštěny ve dvojnásobné koncentraci 200 ng/ml. Vzorky byly 3krát zředěny v průběhu délky plotny v konečném objemu 100 μΐ. Do každého vyhloubení bylo uloženo 1 x 105 buněk v objemu 100 μΐ a buňky byly inkubovány v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou celkem 72 hodin při teplotě 37 °C v přítomnosti oxidu uhličitého. Po 48 hodinách byl přidán do vyhloubení triciovaný 3H-thymidin v množství 1 pCi/vyhloubení v objemu 20 μΐ. Na konci inkubace, trvající 72 hodin byl obsah ploten odebrán při použití zařízení Tomtek Plate Harvester. Výsledky, shrnuté v tabulce 3, prokazují, že po polyethylenglykolaci nedošlo k žádné prokazatelné ztrátě účinnosti IFN. Ve skutečnosti byla účinnost konjugátu o něco vyšší než účinnost volného IFN-beta. Toto pozorování může být způsobeno tvorbou neúčinných agregátů ve volném IFN nebo také rozdílem v použitých metodách (analýza aminokyselin pro vzorky PEG-IFN a HPLC v reverzní fázi pro
IFN-beta).
Tabulka 3. Zkouška na inhibici proliferace, buňky Daudi
Dávka ICso* Vzestup proti IFN
IFN-beta (plotna 1) 1153,1 -
PEG(30000)-IFN(71 A) 695,6 l,6x
IFN-beta (plotna 2) 1005,8 -
PEG(40000)-IFN (71 B) 629,4 1,7x
* pg/ml
Příklad 4
Farmakokinetické zkoušky na myších
Nitrožilní podání 40
Myším bylo podáno 100 ng IFN-beta PEG(30000)-IFN-beta nebo PEG(2x20000)-IFN-beta a krev byla odebírána v předem určených časových intervalech. Pak byly stanoveny koncentrace IFN-beta v krevním séru specifickou zkouškou ELISA (Toray Industries), výsledky jsou uvedeny na obr. 8. Pokud byl prováděn tak, že 28 myších samic kmene B6D2F1 ve stáří 6 až 8 týdnů s hmotností přibližně 20 g bylo rozděleno do 4 skupin následujícím způsobem: skupina 1 obsaho-11 CZ 298579 B6 vala 9 myší, jimž bylo jednorázově podáno 200 μΐ materiálu s obsahem 500 ng/ml lidského IFNbeta, konečná dávka byla 100 ng/myš. Skupina 2 obsahovala rovněž 9 myší, jimž bylo podáno v objemu 200 μΐ ekvivalentní množství PEG(30000)-IFN-beta. Skupině 3 bylo podáno 200 μΐ ekvivalentního množství PEG(2x20000)-IFN-beta, skupina 4 obsahovala 3 myši jako negativní kontroly. Krevní vzorky v množství přibližně 200 μΐ, byly odebírány v 9 předem určených časových intervalech z retroorbitální žilní pleteně pomocí kapiláry. Krevní vzorky se v průběhu 1 hodiny při teplotě místnosti srazily a pak byly odstředěny v mikroodstředivce. Sérum bylo uloženo při teplotě -70 °C až do zpracování všech vzorků. Pak byla séra podrobena zkouškám na přítomnost biologicky účinného lidského IFN-beta svrchu uvedenou zkouškou (Toray Industío ries). Výsledky prokazují, že plocha pod křivkou, AUC je značně zvětšena u vzorků s obsahem PEG-IFN ve srovnání se vzorky s obsahem volného IFN-beta, takže vzorky PEG-IFN mají zřejmě vyšší účinnost ve srovnání s volným IFN-beta, mimo to je výsledek pro PEG(2x20000)IFN-beta vyšší ve srovnání s výsledkem pro PEG(30000)-IFN-beta.
Podkožní podání
Myším byl podkožně podán IFN-beta a PEG-IFN v dávce 100 mg/myš. Na obr. 9 je znázorněno, že celková plocha pod křivkou AUC je podstatně zvětšena pro vzorky PEG-IFN ve srovnání se vzorky, které obsahovaly volný IFN-beta. Farmakokinetické zkoušky jsou v souladu s těmito poznatky, vzorky s obsahem PEG-IFN mají delší biologický poločas a zvýšenou AUC.
Příklad 5
Vazba skupiny PEG s nízkou molekulovou hmotností na polypeptid Vazba interferonu-beta na OPSS-PEG2k-hydrazid
Protein-S-S-?EG2K-C-NH-NH2
Rekombinantní lidský interferon-beta se připraví v roztoku v koncentraci 0,33 mg/ml v 50 mM pufru s octanem sodným o pH 3,8. Pak se přibližně 3,6 mg (přebytek 40 mol na 1 mol bílkoviny) heterobifunkčního reakčního Činidla pro zavedení PEG, OPSS-PEG2k-hydrazidu ve 2 ml deionizované vody přidá ke 3 ml IFN-beta s koncentrací 0,33 mg/ml (celkem 0,99 mg) a reakce se nechá probíhat v polypropylenové nádobce 1 hodinu při teplotě 45 °C. Pak se reakční směs analyzuje kapilární elektroforézou ke stanovení rozsahu modifikace. Typické výtěžky se pohybují v rozmezí 90 až 97 % v závislosti na čistotě interferonu B a reakčního činidla pro zavedení PEG. Pak byl roztok nanesen na sloupec, naplněný materiálem Superdex 75 (Pharmacia), k eluci byl užit pufr s 5 mM fosfátem sodným a 150 mM chloridem sodným o pH 7,0. Frakce s obsahem požadovaného materiálu byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE. Frakce s obsahem monopolyethylenglykolovaného interferonu-beta byly spojeny a užity v dalším stupni pro modifikaci PEG s vysokou molekulovou hmotností.
-12CZ 298579 B6
Vazba interferonu-beta na (OPSS)2-PEG340o
Rekombinantní lidský interferon-beta byl připraven v koncentraci 0,33 mg/ml v 50 mM pufru s acetátem sodným o pH 3,8. Pak bylo přibližně 6,1 mg (přebytek 40 mol na 1 mol bílkoviny) homobifunkčního reakčního činidla pro zavedení PEG, (OPSS)2-PEG34oo ve 2 ml deionizované vody přidáno ke 3 ml interferonu-beta s koncentrací 0,33 mg/ml (celkové množství 0,99 mg), reakce probíhala 2 hodiny v polypropylenové nádobce při teplotě 50 °C. Reakce byla sledována za neredukujících podmínek na SDS-PAGE, výsledná reakční směs byla analyzována kapilární elektroforézou ke stanovení rozsahu modifikace. Typická modifikace při této reakci s interferonem-beta byla více než 95 %. Výsledný roztok byl nanesen na sloupec s náplní Superdex 75 (Pharmacia), k eluci byl užit pufr s 50 mM fosfátem sodným a 150 mM chloridem sodným o pH 7,0. Příslušné frakce byly spojeny a analyzovány pomocí SDS-PAGE, frakce, obsahující mono15 polyethylenglykolovaný interferon-beta byly spojeny.
Příklad 6
Vazba druhé skupiny PEG na polyethylenglykolovaný polypeptid s obsahem PEG s nízkou molekulovou hmotností
Modifikace IFN-S-S-PEG2k-hydrazidu působením mPEG30k“-aldehydu, ALD
PmeirrS-S-PEGjK—ČTJH-NHj + O ProieiirS-S-PEGjj;—C’NH*NaCH*iBPEG30jí
II mPEGjo};—CH2CHjCH
Ke spojeným frakcím IFN-S-S-PEG2k-hydrazidu z příkladu 5 se přidá mPEG30k-ALD v přebytku 20 mol na 1 mol proteinu. Reakce probíhá při teplotě místnosti 25 °C celkem 4 hodiny, vzorek reakční směsi se pak uloží na vrchol sloupce s náplní Superose 6 (Pharmacia) ke stano30 vení výtěžku modifikace. Tento výtěžek při uvedené reakci je typicky vyšší než 80 % v závislosti na čistotě reakčního činidla pro zavedení PEG a na reakčních podmínkách.
Vynález byl popsán na základě svých některých provedení, je však zřejmé, že by bylo možno zvolit ještě širokou škálu ekvivalentních parametrů, jako je koncentrace a další reakční podmín35 ky, které by rovněž spadaly do rozsahu vynálezu.
Bylo by však možno uskutečnit ještě řadu dalších modifikací. Vynález proto zahrnuje jakékoliv variace, použití nebo změny, které jsou založeny na principech vynálezu a u nichž jde pouze o běžné úpravy, které může uskutečnit běžný odborník.
V případě, že se uvádějí známé postupy, neznamená to, že by zmiňované postupy byly známým stavem techniky vzhledem k poznatkům, uvedeným v přihlášce vynálezu.

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    5 1. Konjugát polyolu a interferonu-beta, v němž je polyolová skupina kovalentně vázána na
    Cys17 lidského interferonu-beta.
  2. 2. Konjugát polyolu a interferonu-beta podle nároku 1, v němž je polyolovou skupinou polyalkylenglykolová skupina.
  3. 3. Konjugát polyolu a interferonu-beta podle nároku 2, v němž je polyalkylenglykolovou skupinou polyethylenglykolová skupina PEG.
  4. 4. Konjugát polyolu a interferonu-beta podle některého z nároků 1 až 3, který má stejnou nebo 15 vyšší účinnost interferonu-beta ve srovnání s přírodním lidským interferonem-beta.
  5. 5. Způsob výroby konjugátu polyolu a interferonu-beta podle nároku 1, vyznačující se tím, že se nechá reagovat interferon-beta s thiolreaktivním činidlem pro zavedení polyolové skupiny na specifické místo za kovalentní vazby polyolové skupiny na Cys17 lidského interfe20 ronu-beta za vzniku konjugátu polyolu a interferonu-beta, načež se vzniklý konjugát polyolu a interferonu-beta izoluje.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se jako thiolreaktivní činidlo pro zavedení polyolové skupiny užije thiolreaktivní polyethylenglykolační činidlo.
  7. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že thiolreaktivní činidlo pro zavedení polyolové skupiny je monomethoxylováno.
  8. 8. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že thiolreaktivní činidlo pro 30 zavedení polyolové skupiny je bifunkění.
  9. 9. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že thiolreaktivní činidlo je polyolový derivát, jehož funkční skupina se volí ze skupiny orthopyridyl disulfid, vinylsulfon, maleimid a jodacetimid.
  10. 10. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že thiolreaktivní činidlo pro zavedení polyolové skupiny je orthopyridyldisulfidový derivát monomethoxylovaného polyolu.
  11. 11. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se reakce provádí při kyselém 40 pH, při němž je interferon-beta stálý.
  12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje konjugát polyolu a interferonu-beta podle některého z nároků 1 až 4 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnými látkami.
  13. 13. Použití konjugátu polyolu a interferonu-beta podle některého z nároků 1 až 4 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení infekcí, nádorů a autoimunitních a zánětlivých onemocnění.
    50
  14. 14. Konjugát polyolu a interferonu-beta podle některého z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo.
  15. 15. Použití podle nároku 13, při němž léčenou chorobou je septický šok, AIDS, revmatoidní arthritis, lupus erythematosus a roztroušená skleróza.
CZ20003995A 1998-04-28 1999-04-28 Konjugát polyolu a interferonu-beta CZ298579B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20003995A3 CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
CZ298579B6 true CZ298579B6 (cs) 2007-11-14

Family

ID=22177687

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003995A CZ298579B6 (cs) 1998-04-28 1999-04-28 Konjugát polyolu a interferonu-beta
CZ20050048A CZ298597B6 (cs) 1998-04-28 1999-04-28 Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20050048A CZ298597B6 (cs) 1998-04-28 1999-04-28 Zpusob postupné vazby polyethylenglykolových skupin na polypeptid

Country Status (31)

Country Link
US (3) US6638500B1 (cs)
EP (2) EP1421956B1 (cs)
JP (2) JP4574007B2 (cs)
KR (1) KR100622796B1 (cs)
CN (2) CN100335503C (cs)
AR (1) AR020070A1 (cs)
AT (2) ATE275422T1 (cs)
AU (1) AU762621B2 (cs)
BG (2) BG64694B1 (cs)
BR (1) BR9910023A (cs)
CA (2) CA2330451A1 (cs)
CY (1) CY1108022T1 (cs)
CZ (2) CZ298579B6 (cs)
DE (2) DE69936409T2 (cs)
DK (2) DK1075281T3 (cs)
EA (2) EA005495B1 (cs)
EE (1) EE05214B1 (cs)
ES (2) ES2224649T3 (cs)
HK (2) HK1038194A1 (cs)
HU (1) HUP0300548A3 (cs)
IL (1) IL139286A (cs)
NO (2) NO329749B1 (cs)
NZ (1) NZ507456A (cs)
PL (2) PL196533B1 (cs)
PT (2) PT1421956E (cs)
SI (2) SI1075281T1 (cs)
SK (2) SK286654B6 (cs)
TR (2) TR200003161T2 (cs)
TW (2) TWI232882B (cs)
UA (2) UA79430C2 (cs)
WO (1) WO1999055377A2 (cs)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
PT1121382E (pt) 1998-10-16 2006-10-31 Biogen Idec Inc Proteinas de fusao do interferao beta e as respectivas utilizacoes
EE04967B1 (et) * 1998-10-16 2008-02-15 Biogen, Incorporated Glkoslitud interferoon-beeta, selle kasutamineja seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon, meetod interferoon-beeta-1a aktiivsuse pikendamiseks ja leiutisekohase valgu valmistamiseks
AU769425B2 (en) * 1999-04-23 2004-01-29 Alza Corporation Conjugate having a cleavable linkage for use in a liposome
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
TR200101086A3 (cs) * 1999-10-15 2001-08-21
AU2223401A (en) * 1999-12-24 2001-07-09 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Branched polyalkylene glycols
AR027509A1 (es) 2000-01-10 2003-04-02 Maxygen Aps Conjugados g-csf
ES2325877T3 (es) 2000-02-11 2009-09-23 Bayer Healthcare Llc Moleculas de tipo factor vii o viia.
DE60236796D1 (de) 2001-01-30 2010-08-05 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Verzweigte polyalkylenglykole
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
EP1366075B1 (en) 2001-02-27 2009-05-27 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
AU2002325819B2 (en) 2001-07-11 2008-06-19 Maxygen, Inc. G-CSF Conjugates
CN1630530A (zh) 2002-01-18 2005-06-22 比奥根艾迪克Ma公司 聚亚烷基聚合物及其用途
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
WO2004060300A2 (en) * 2002-12-26 2004-07-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
BR0317742A (pt) * 2002-12-26 2005-11-22 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados poliméricos de interferon-beta com potência biológica aumentada
ATE431403T1 (de) 2003-03-20 2009-05-15 Bayer Healthcare Llc Fvii oder fviia varianten
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
WO2005074650A2 (en) * 2004-02-02 2005-08-18 Ambrx, Inc. Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
CN1984673A (zh) 2004-05-17 2007-06-20 阿雷斯贸易股份有限公司 干扰素水凝胶制剂
EA010979B1 (ru) 2004-06-01 2008-12-30 Арес Трейдинг С.А. Стабилизированные жидкие препаративные формы интерферона
BRPI0510527A (pt) 2004-06-01 2007-10-30 Ares Trading Sa método de estabilização de proteìnas
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
KR101320936B1 (ko) 2004-12-21 2013-10-23 넥타르 테라퓨틱스 안정화된 중합체성 티올 시약
BRPI0518661A2 (pt) 2004-12-22 2008-12-02 Ambrx Inc mÉtodos para expressço e purificaÇço do hormânio do crescimento humano recombinante
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
US7816320B2 (en) * 2004-12-22 2010-10-19 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid at position 35
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
CN101257926A (zh) * 2005-08-04 2008-09-03 尼克塔治疗亚拉巴马公司 G-csf部分与聚合物的轭合物
EA015901B1 (ru) 2005-08-26 2011-12-30 Арес Трейдинг С.А. Способ получения гликозилированного интерферона бета
EA013816B1 (ru) 2005-09-01 2010-08-30 Арес Трейдинг С.А. Лечение неврита зрительного нерва
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CA2653748A1 (en) * 2006-05-02 2007-11-15 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
AU2007253264A1 (en) 2006-05-24 2007-11-29 Novo Nordisk Health Care Ag Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
AU2007253254B2 (en) 2006-05-24 2013-01-17 Merck Serono Sa Cladribine regimen for treating multiple sclerosis
BRPI0810622A2 (pt) 2007-05-02 2020-10-13 Ambrx, Inc. polipeptídeos de interferon beta modificados e seus usos
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
RS52417B (en) 2007-12-20 2013-02-28 Merck Serono S.A. PEG-INTERFERON-BETA FORMULATIONS
JP5702150B2 (ja) 2008-02-08 2015-04-15 アンブルックス, インコーポレイテッドAmbrx, Inc. 修飾されているレプチンポリペプチドおよびそれらの使用
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
US20100112660A1 (en) * 2008-05-30 2010-05-06 Barofold, Inc. Method for Derivatization of Proteins Using Hydrostatic Pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
WO2011101242A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
EP2569331A1 (en) 2010-05-10 2013-03-20 Perseid Therapeutics LLC Polypeptide inhibitors of vla4
EP2593130A2 (en) 2010-07-15 2013-05-22 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
EP2616486B1 (en) 2010-09-15 2019-01-02 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Factor viii variants having a decreased cellular uptake
US9913880B2 (en) 2011-02-18 2018-03-13 Stemdr Inc. Method of treating sepsis or septic shock
JP2014522641A (ja) 2011-07-01 2014-09-08 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング リラキシン融合ポリペプチドおよびその使用
CA2850469C (en) * 2011-10-01 2020-07-07 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
EP3406347A3 (en) 2012-02-27 2019-02-13 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
CA2865879A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
MY171183A (en) 2013-03-29 2019-09-30 Glytech Inc Polypeptide glycosylated with sialylated sugar chain
WO2016013911A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
LT3183264T (lt) 2014-08-19 2021-01-11 Biogen Ma Inc. Pegilinimo būdas
ES2903448T3 (es) 2015-05-01 2022-04-01 Allysta Pharmaceuticals Inc Peptidomiméticos de adiponectina para el tratamiento de trastornos oculares
MY189024A (en) * 2015-06-19 2022-01-20 Eisai R&D Man Co Ltd Cys80 conjugated immunoglobulins
AU2018254410A1 (en) * 2017-04-17 2019-10-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Optimization of enzyme replacement therapy for treatment of homocystinuria
US20220118050A1 (en) 2019-01-28 2022-04-21 Toray Industries, Inc. Polyethylene glycol-modified form of hepatocyte growth factor or active fragment thereof
BR112021012472A2 (pt) 2019-01-28 2021-11-30 Toray Industries Forma modificada por polietileno glicol de um fator de crescimento de hepatócito ou um fragmento ativo do mesmo, e, medicamento

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
EP0690127A1 (en) * 1994-03-31 1996-01-03 Amgen Inc. Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
WO1997011957A1 (en) * 1995-09-29 1997-04-03 Pharmacia & Upjohn Ab Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
ES2174915T3 (es) 1993-11-10 2002-11-16 Enzon Inc Productos de conjugacion mejorados de un interferon con un polimero.
ATE299892T1 (de) * 1994-05-18 2005-08-15 Nektar Therapeutics Methoden und zusammensetzungen für die trockenpuderarznei aus interferonen
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
EP0921817B1 (en) * 1997-01-29 2001-03-28 PolyMASC Pharmaceuticals plc Pegylation process
DE69838552T2 (de) * 1997-07-14 2008-05-21 Bolder Biotechnology, Inc., Louisville Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
EP0690127A1 (en) * 1994-03-31 1996-01-03 Amgen Inc. Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
WO1997011957A1 (en) * 1995-09-29 1997-04-03 Pharmacia & Upjohn Ab Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer

Also Published As

Publication number Publication date
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
HK1038194A1 (en) 2002-03-08
SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31
PL344490A1 (en) 2001-11-05
CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
AU3767499A (en) 1999-11-16
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
AU762621B2 (en) 2003-07-03
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
BG109291A (en) 2006-04-28
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
CN1187094C (zh) 2005-02-02
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
TWI266800B (en) 2006-11-21
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
NO329749B1 (no) 2010-12-13
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
BG104871A (en) 2001-07-31
UA66857C2 (uk) 2004-06-15
NZ507456A (en) 2003-10-31
PT1075281E (pt) 2004-11-30
BG64694B1 (bg) 2005-12-30
BR9910023A (pt) 2000-12-26
NO20100324L (no) 2000-12-28
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
TWI232882B (en) 2005-05-21
SK286654B6 (sk) 2009-03-05
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
PT1421956E (pt) 2007-07-13
AR020070A1 (es) 2002-04-10
PL196533B1 (pl) 2008-01-31
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
IL139286A0 (en) 2001-11-25
NO20005337L (no) 2000-12-28
CN1637020A (zh) 2005-07-13
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
NO332224B1 (no) 2012-07-30
HK1076115A1 (en) 2006-01-06
US6638500B1 (en) 2003-10-28
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
EA003789B1 (ru) 2003-10-30
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
CN1302209A (zh) 2001-07-04
IL139286A (en) 2005-12-18
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
CN100335503C (zh) 2007-09-05
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
US7700314B2 (en) 2010-04-20
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
SK286217B6 (sk) 2008-05-06
UA79430C2 (en) 2007-06-25
EE200000614A (et) 2002-04-15
US7357925B2 (en) 2008-04-15
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ298579B6 (cs) Konjugát polyolu a interferonu-beta
JP2980569B2 (ja) インターフェロン複合体
HUT75533A (en) Improved interferon polymer conjugates
KR20100063108A (ko) 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ａ, 이의 합성 방법 및 용도
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130428