KR20110016440A - 연장된 반감기를 가진 제 ⅰⅹ 인자 접합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체적합성 폴리머 모이어티를 포함하기 위하여 변형된 제 IX 인자(Factor IX)의 접합체(conjugate)에 관한 것이다. 제 IX 인자 접합체는 실질적으로 제 IXa 인자(Factor IXa)에 의한 오염이 없다. 제 IX 인자 접합체는 증가된 반감기와 같은, 개선된 약물동력학적 물성을 가져, 투여량을 절감(dose sparing)하고 투여 빈도를 감소시킨다.
Description
본 발명은 제 IX 인자(Factor IX)의 생체적합성 폴리머 접합체(conjugate), 제 IX 인자 접합체를 포함하는 조성물 및 제 IX 인자 접합체로 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 제 IX 인자(Factor IX)의 생체적합성 폴리머 접합체(conjugate), 제 IX 인자 접합체를 포함하는 조성물 및 제 IX 인자 접합체로 혈우병을 치료하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 생체적합성 폴리머 모이어티를 포함하기 위하여 변형된 제 IX 인자(Factor IX)의 접합체(conjugate)를 제공한다.
제 IX 인자 접합체(conjugate)는 증가된 반감기와 같은, 개선된 약물동력학적 물성을 가져, 투여량을 절감(dose sparing)하고 투여 빈도를 감소시킨다.
도 1은 아미노산 서열, 구조 및 다양한 영역(domain)을 보여주는 제 IX 인자(Factor IX)의 구조도를 나타낸다.
도 2는 마우스 혈청에서 결합되지 않은 FIX-PEG의 순환 반감기를 나타낸다.
도 3은 마우스 혈청에서 10kDa FIX-PEG의 순환 반감기를 나타낸다.
도 4는 마우스 혈청에서 20kDa FIX-PEG의 순환 반감기를 나타낸다.
도 2는 마우스 혈청에서 결합되지 않은 FIX-PEG의 순환 반감기를 나타낸다.
도 3은 마우스 혈청에서 10kDa FIX-PEG의 순환 반감기를 나타낸다.
도 4는 마우스 혈청에서 20kDa FIX-PEG의 순환 반감기를 나타낸다.
1. 발명의 요약
본 출원인은 재조합 제 IX 인자(Factor IX)(이하에서 FIX로 칭함)는 하나 이상의 생체적합성 폴리머에 FIX를 결합시킴으로써 증강될 수 있어 FIX가 제 IXa 인자(Factor IXa)(이하에서 FIXa로 칭함)로부터 효과적으로 분리될 수 있다는 것을 확인하였다. 증강된 제조 물성은 또한 고순도의 FIX 접합체(conjugate)를 생산할 수 있는 능력을 포함한다.
FIX 접합체(conjugate)는, 예를 들어 생체적합성 폴리머에 결합되지 않은(unconjugated) FIX와 비교할 때, 치료적 이익을 제공할 수 있다. 그러한 치료적 이익은, 그러나 이에 제한되지 않는, 증가된 순환 반감기, 감소된 면역원성, 더 큰 활성, 더 낮은 투여 요구량 및 대체 경로를 통한 투여(예를 들어, 피하 투여)의 허용을 포함한다.
본 발명에 사용되는 용어 "제 IX 인자(Factor IX) 접합체(conjugate)" 또는 "FIX 접합체"는 변형되지 않은 제 IX 인자에 비해 개선된 약물동력학적 프로파일을 유발하는 생체적합성 폴리머 모이어티(moiety)를 포함하기 위하여 변형된 제 IX 인자를 의미한다. 약물동력학적 프로파일의 개선은 다음의 하나 이상의 파라미터의 개선으로 관측될 수 있다: 효능, 안정성, 곡선하 면적(AUC) 및 순환 반감기.
일 실시예에서, 본 발명의 고순도의 FIX 접합체는 실질적으로 FIXa가 없다. FIX 조성물의 오염원을 고려하면, 심지어 미량의 FIXa라도 인용에 의해 본 발명에 통합되는, Gray et al. Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9에 따른 위험한 혈전증을 유발할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "실질적으로 FIXa가 없는"은, FIX 및 FIX 접합체를 정제하는 것과 관련하여, 1 u FIXa/1000 IU FIX 미만의 FIXa의 양을 의미한다. 낮은 농도의 FIXa는 Gray et al. Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9에 설명된 방법에 따라 측정될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 오염원 FIXa의 양은 0.5 u FIXa/1000 IU FIX 미만일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 오염원 FIXa의 양은 0.25 u FIXa/1000 IU FIX 미만일 수 있다. 몇몇 실시예에서, FIXa의 양은 0.1 u FIXa/1000 IU FIX 미만일 수 있다.
생체적합성 폴리머와 FIX의 결합(conjugation)은 FIXa로부터 FIX 접합체의 분리성을 증강시켜서, 약학 조성물에서의 FIX 효용을 증강시킨다. 더구나, 생체적합성 모이어티는 분해와 항체 반응으로부터 FIX를 보호할 수 있다. FIX 접합체는 투여량-절감 효과(dose-sparing effect)를 유발하고 투여 빈도를 줄일 수 있는, 연장된 순환 반감기를 가질 수 있다. 일 실시예에서, FIX는 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티에 결합된다. 다른 일 실시예에서, FIX는 하나 이상의 폴리시알산 모이어티에 결합된다. 또다른 일 실시예에서, FIX는 알부민에 결합된다.
따라서, 첫번째 관점에서, 본 발명은 하나 이상의 시스테인 잔기(residue)를 통하여 FIX에 결합된 하나 이상의 생체적합성 폴리머를 나타낸다. 일 실시예에서, 하나 이상의 PEG 모이어티는 하나 이상의 시스테인 잔기를 통하여 FIX에 결합된다.
일 실시예에서, FIX 접합체의 생체적합성 폴리머 모이어티는 FIX에 이황화 결합을 형성하는, 2개의 시스테인 잔기에 결합될 수 있다. 따라서, 링커(linker)를 포함하는 PEG는 이황화 결합을 연결한다. 일 실시예에서, 생체적합성 폴리머는 하기의 화학식과 같이 FIX에 결합된다.
: 여기에서, 두 개의 -S-는 FIX에 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기로부터 유래된 것이며, 여기에서 Q는 직접 결합(direct bond), 알킬렌기(바람직하게 C1-10 알킬렌기), 또는 선택적으로-치환된 아릴기 또는 헤테로아릴기인 연결기(linking group)이며; 여기에서 아릴기는 페닐기, 벤조일기 및 나프틸기를 포함하며; 여기에서 적당한 헤테로아릴기는 피리딘, 피롤, 퓨란, 피란, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린을 포함하며; 여기에서 폴리머와의 연결(linkage)은 가수분해적으로 분리될 수 있는(labile) 결합에 의하거나, 가수분해적으로 분리되지 않는(non-labile bond) 결합에 의할 수 있다.
선택적으로 치환된 아릴기 또는 헤테로아릴기에 존재할 수 있는 치환기는 예를 들어, -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, -NR'CO2R, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N--NR'COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐(예를 들어, 불소 또는 염소), -C≡CR, -C=CR2 및 13C=CHR로부터 선택된 하나 이상의 같거나 다른 치환체로부터 선택될 수 있으며, 여기에서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기(바람직하게 C1 -6) 또는 아릴기(바람직하게 페닐기)를 나타낸다. 전자를 끌어당기는(electron withdrawing) 치환체의 존재가 더욱 바람직하다.
상기의 화학식의 일 실시예에서, PEG는 하기의 화학식과 같이 FIX에 결합된다.
FIX의 접합체는 실질적으로 FIXa가 없도록 제조될 수 있다. 일정 조건하에서 FIX 및 FIXa가 생체적합성 폴리머 기질과 반응하는 속도는 달라질 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 반응 속도의 차이는 FIX 및 FIXa의 다양한 크기(FIX는 FIXa보다 더 큰 11kDa 분자량을 가짐) 및/또는 다양한 입체형태적 구조에 기인될 수 있다. FIX의 구조는, FIXa에 대해 FIX의 활성이 제거된 활성 영역을 포함하는 도 1에 나타냈다. 그 결과, 결합된 잔기 곁사슬(residue side chain)은 FIX 또는 FIXa의 반응물질을 포함하는 폴리머에 더욱 입체적으로 접근할 수 있으며, 더욱 접근하기 쉬운 잔기는 반응물질을 포함하는 폴리머와 더 빨리 반응할 것이다. 이러한 반응성의 차이는 결국 FIX 및 FIXa의 동역학적 분리를 가능하게 한다.
재조합에 의해 제조된 FIX는 오염원으로서 적은 양의 FIXa를 포함할 수 있다. 종종 이러한 양은 1 u FIXa/1000 IU FIX으로, 극히 작을 수 있다(Gray et al. Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4): 675-9). 어떠한 조건에서 FIX-PEG와 같은 FIX 접합체의 형성 속도는 FIXa-PEG의 형성 속도보다 더 빠를 수 있다. 이러한 경우, FIX에 대한 PEG 성분의 화학양론적 양 또는 화학양론적 양보다 작은(sub-stoichiometric) 양은 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 이러한 경우, 모든 PEG 성분은 FIX-PEG 접합체를 형성하는데 소비되는 반면, FIXa는 반응하지 않은 채로 남게 된다. 분자량 및 극성과 같은, FIX-PEG 접합체의 물성은, 정제 단계에서 사용될 수 있는, 그러나 이에 제한되지 않는, 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는, 당업계에 알려진 정제 방법을 사용하여 FIXa로부터 FIX-PEG 접합체를 용이하게 분리할 수 있게 한다.
어떠한 조건에서 FIXa-PEG와 같은 FIXa 접합체의 형성 속도는 FIX-PEG의 형성 속도보다 빠르다. 이러한 조건에서, FIXa 대비 과도한 화학양론적 양의 PEG 성분이 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 이러한 경우, 모든 FIXa가 FIXa-PEG의 형성에 소비된 반면, 모든 FIX는 아니더라도 대부분의 FIX가 결합되지 않은 상태로 반응하지 않고 남아있는지 확인하는 것이 중요하다. 분자량 및 극성과 같은, FIXa-PEG 접합체의 물성은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결합되지 않은 FIX로부터 FIXa-PEG 접합체를 용이하게 분리될 수 있게 한다. 일 실시예에서, 결합되지 않은 FIX는 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그 후 결과물인 순수한 FIX는 PEG에 결합될 수 있어서 순수한 FIX-PEG 접합체를 형성한다.
FIX 접합체는 변형되지 않은 FIX(예를 들어, PEG가 부착된 것과 같은 생체적합성 폴리머가 없는 FIX)의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. FIX 접합체는 제 IXa 인자를 생산하기 위하여, 제 XIa 인자, 제 VIIa인자 및 조직 인자(tissue factor)에 의해 생체내에서 활성화될 수 있다. FIX 접합체의 생물학적 활성은 본 발명에서 설명된 분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
변형되지 않은 FIX와 비교할 때, 본 발명의 FIX 접합체는 곡선하 면적(AUC), Cmax, 제거율(CL), 반감기, 혈장 체류 시간(residence time) 및 생체이용률을 포함하는 약물동력학적 프로파일의 하나 이상의 파라미터에서의 향상을 나타낼 수 있다.
펩티드 약물을 환자에게 투여하는 것에 관련하여 본 발명에서 사용된, "곡선하 면적" 또는 "AUC"는 0에서부터 무한대까지의 시간에 대한 함수로서 환자의 체순환에서 약물의 농도를 나타내는 총 곡선하 면적(AUC)으로 정의된다.
본 발명에서 사용된 용어 "제거율(clearance)" 또는 "신장 제거율(renal clearance)"은 분(minute) 당 분비되는 약물의 양을 포함하는 혈장의 부피로 정의된다.
환자에게 펩티드 약물을 투여하는 것과 관련하여 본 발명에서 사용된 용어 "반감기" 또는 "t1 /2"은 환자에서 약물의 혈장 농도가 1/2까지 감소하는데 걸리는 시간으로 정의된다. 복합적인 제거 메커니즘, 재분배, 및 당업계에 잘 알려진 기타 다른 메커니즘에 좌우되는 펩티드 약물과 관련된 반감기가 하나를 초과하여 존재할 수 있다. 통상적으로, 알파 반감기 및 베타 반감기에서, 알파상(phase)은 재분배와 연관되고 베타상(phase)은 제거율과 연관된 것으로 정의된다. 그러나, 대체로, 혈류에 국한된 단백질 약물을 사용하면, 적어도 2개의 제거율(clearance) 반감기가 존재할 수 있다. 페길레이션(PEGylation)의 알파상(phase) 반감기 및 베타상(phase) 반감기에 대한 정밀한 영향은 크기 및 당업계에 잘 알려진 다른 파라미터에 의존하여 달라질 것이다. 또한 "반감기"에 대한 설명은 Pharmaceutical Biotechnology(1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101 120)에 제시되어 있다.
환자에게 펩티드 약물을 투여하는 것과 관련하여 본 발명에서 사용된 용어 "체류 시간(residence time)"은, 약물 투여 후에 환자의 몸 속에서 약물이 체류하는 평균 시간으로 정의된다.
실질적으로 FIXa가 없는 FIX 접합체를 포함하는 조성물은 안정성이 개선된 것으로 확인된다. 게다가 실질적으로 FIXa가 없는 FIX 접합체를 포함하는 조성물은 혈전증을 거의 일으키지 않는 것 같다. 일 실시예에서, 순수한 FIX 접합체를 포함하는 조성물은 정맥 혈전증을 거의 유발하지 않는 것 같다. 또다른 실시예에서, 순수한 FIX 접합체를 포함하는 조성물은 동맥 혈전증을 거의 유발하지 않는 것 같다.
본 발명의 FIX 접합체는 혈우병 B를 치료하는데 유용하다. 본 발명에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료", "~의 치료"는 개체의 상태의 심각성이 감소되거나, 적어도 부분적으로 개선되거나 완화되는 것을 의미하거나, 및/또는 적어도 하나의 임상적 증상의 어느 정도의 경감, 완화 또는 감소가 이루어지는 것을 의미하거나, 및/또는 질환(disease) 또는 병(illness)의 상태의 진행을 억제 또는 지연시키거나, 및/또는 질환(disease) 또는 병(illness)의 발생의 진행을 지연시키는 것을 의미한다. 또한 용어 "치료하다", "치료", "~의 치료"는 질환(disease)의 상태, 예를 들면 혈우병 B를 관리하는 것을 의미한다.
본 발명의 FIX 접합체는, 본 발명에서 설명된 치료적으로 유효한 양의 FIX 접합체 및 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 혈우병 B에 걸린 환자에게 FIX를 제공함으로써 혈우병 B에 걸린 환자를 치료하는데 유용하다.
본 발명에서 사용되는 "치료적으로 유효한" 양은 개체에 어떠한 개선이나 이익을 제공하는 양을 의미한다. 달리 표현하면 "치료적으로 유효한" 양은 적어도 하나의 임상적 증상의 어느 정도의 경감, 완화 및/또는 감소를 제공하는 양이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 장애(disorder)와 관련된 임상적 증상은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한 당업자는 어느 정도의 이익이 개체에 제공되는 한, 치료 효과는 완벽하거나 치유적일 필요가 없는 것으로 평가할 것이다.
일 실시예에서, FIXa가 없는 FIX 접합체를 포함하는 조성물은 평균 혈전 수치의 감소로 보여지는, 혈전증의 위험성이 감소된 혈우병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "평균 혈전 수치(mean thrombus score)"는 다음과 같이 정의된다. 혈액응고(thrombi)는 0 내지 4의 수치에서 측정될 수 있다. 수치 0은 완전하게 혈액(fluid blood)을 나타내며; 작은 피브린 반점의 존재는 수치 1로 표시되며, 여러 개의 더 큰 응혈(clot) 조각은 수치 2로 표시되며; 부분적으로 폐색된 응혈(clot)은 수치 3으로 표시되며, 수치 4는 조각(segment)의 고체 형태를 나타낸다. 평균 혈전 수치는 3개 이상의 독립적 실험으로부터 측정되어야 하며 Wessler et al ., J. Appl. Physiol. 14:943-946 (1959)의 프로토콜에 따라야 한다.
다른 일 실시예에서, FIX 접합체의 개선된 물성은 혈우병 B의 예방적 치료 방법을 제공한다. 또다른 일 실시예에서, FIX 접합체를 포함하는 조성물은 수술 과정을 겪고 있거나, 수술 과정으로부터 회복되고 있는, 혈우병 B에 걸린 환자에 투여될 수 있다.
혈우병 B의 치료를 위하여 환자에 대한 FIX 접합체의 투여는 트라넥사민산, 아미노카프론산, 제 II 인자(프로트롬빈) 및/또는 제 X 인자(스튜와트 프로워 인자(Stuart Prower Factor))와 같은, 다른 치료제와 결합될 수 있다.
본 발명에서 설명된 FIX 접합체는 약학적으로 허용되는 담체(carrier)와 함께 제형화될 수 있다. 본 발명의 제형과 관련하여 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은, 제형이 어떠한 투여 요법에 의해 투여된 개체에서, 허용되지 않는 정도의 자극을 유발하지 않는 것을 의미한다. 자극의 예는 FIX에 대한 과민 반응을 포함한다.
FIX 접합체의 증가된 반감기로 인해, 약학 조성물은 혈우병을 효과적으로 치료하기 위하여 전형적으로 투여되는 것보다 적은 투여량의 FIX를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 제제는, 그러나 이에 제한되지 않는, 진피내 주사(injection), 피하 주사(injection), 근육내 주사(injection), 정맥내 주입(infusion) 또는 뼈속내 주입(intraosseous infusion)을 포함하는 장관외(parenteral) 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 제제는 FIX-PEG와 같은 FIX 접합체, 및 투여 경로에 의존하는 약학적으로 허용되는 희석제(diluent), 애쥬번트(adjuvant) 또는 담체(carrier)를 포함하는 용액, 현탁액, 에멀젼의 형태일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 FIX 접합체의 치료적 투여량을 전달하기 위하여 제형화된다. FIX 접합체의 투여량은 국제단위(IU)로 표현될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "국제단위" 또는 "IU"는 세계 보건 기구 국제 표준에 따른 효능 측정을 의미한다. 상기 측정에 따라서, 체중 kg당 제 IX 인자(Factor IX) 활성의 1 IU는 인간의 정상 혼주 혈장(pooled normal human plasma) 1 mL에서의 제 IX 인자(Factor IX) 활성과 대략 동일하며, 1%씩 제 IX 인자(Factor IX)의 혈장 농도를 상승시킨다.
약학 제제에 포함된 FIX 접합체의 투여량은 1 IU부터 10,000 IU까지일 수 있다. 일 실시예에서, FIX 접합체의 투여량은 100 IU부터 5000 IU까지이거나, 또는 200 IU부터 2500 IU까지일 수 있다. 일 실시예에서, FIX 접합체의 투여량은 약 250 IU, 약 500 IU, 약 1000 IU 또는 약 2000 IU일 수 있다.
FIX 접합체는 혈우병 B을 치료하기에 충분한 양으로 투여된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "충분한 양" 또는 특정한 결과를 얻기에 "충분한 양"은 선택적으로 치료적 효과(예를 들어, 치료적으로 유효한 양의 투여에 의해)인, 원하는 효과를 발생시키는데 효과적인 FIX 접합체의 양을 의미한다. 예를 들어, "충분한 양" 또는 "~을 하기에 충분한 양"은 출혈성 관절증(hemarthrosis), 출혈(hemorrhage), 위장관 출혈(bleeding) 및 월경과다(menorrhagia)의 위험을 감소시키기에 효과적인 양이 될 수 있다.
일 실시예에서, FIX 접합체의 투여량은 순환하는(circulating) 제 IX 인자(Factor IX) 활성이 1 IU/kg 내지 150 IU/kg의 농도가 되기에 충분하다. 다른 일 실시예에서, 조성물은 순환하는(circulating) 제 IX 인자(Factor IX) 활성이 10 IU/kg 내지 120 IU/kg의 농도가 되게 하는 투여량으로 투여된다. 또다른 일 실시예에서, 조성물은 순환하는(circulating) 제 IX 인자(Factor IX) 활성이 20 IU/kg 내지 100 IU/kg의 농도가 되게 하는 투여량으로 투여된다.
본 발명의 접합체는 변형되지 않은 FIX와 같은 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, FIX 접합체의 개선된 물성 때문에, 본 발명의 약학 제제는 결합되지 않은 FIX보다 더 긴 주기로 투여될 수 있다. 예를 들어, 변형되지 않은 재조합 FIX가 매일 한번씩 투여되는 것과 달리 FIX 접합체는 일주일마다 한번씩 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 투여 요법을 수반하며, 상기 요법에서 FIX 유도체는 혈우병 B를 효과적으로 치료하기 위하여 하루에 두번씩, 하루에 한번씩, 이틀에 한번씩, 3일에 한번씩, 4일에 한번씩 또는 일주일에 한번씩 투여될 수 있다. 감소된 투여 빈도는 개선된 치료 효과뿐만 아니라 환자의 개선된 삶의 질을 유발하는 개선된 환자의 순응도(patient compliance)를 일으킬 것으로 예상된다.
2. 발명의 상세한 설명
본 발명은 실질적으로 FIXa가 없는 FIX 접합체를 제공하기 위하여 하나 이상의 생체적합성 폴리머에 결합된 FIX를 제시한다. 본 발명에서 설명된 FIX 접합체는 또한, 그러나 이에 제한되지 않는, 변형되지 않은 FIX에 비해 증가된 순환 반감기 또는 증가된 혈장 체류 시간(residence time)을 포함하는 개선된 생물학적 및 약물동력학적 물성을 갖는다. 게다가, 본 발명에 설명된 접합체는 항체 반응에 덜 민감하다. 또한 본 발명은 그러한 접합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 일 실시예에서, FIX 접합체는 FIX-PEG 접합체이다. 또한 본 발명은 혈우병 B 치료용 FIX 접합체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 생체적합성 폴리머가 하나 이상의 시스테인 잔기에 결합된 FIX 접합체에 관한 것이다. 일 실시예에서, FIX 접합체는 FIX-PEG 접합체이며, 여기에서 하나 이상의 PEG기(PEG group)는 하나 이상의 시스테인 잔기를 통하여 FIX에 결합된다. 일 실시예에서, FIX-PEG 접합체는 PEG에 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기에 동시에 결합된 하나 이상의 PEG기를 포함한다. 이러한 접합체는 이황화 결합의 환원성 절단 후에 PEG 모이어티가 2개의 티오기(thio group)에 결합되는 반응을 통하여 제조될 수 있다. 결과물인 FIX 접합체는 이황화 결합을 형성한 2개의 황을 연결하는 PEG 모이어티를 포함한다.
본 발명의 조성물은 실질적으로 FIXa가 없는 FIX-PEG 접합체를 포함한다. 본 발명의 조성물은 미량의 오염원 FIXa를 포함하는 FIX 조성물과 비교할 때 감소된 혈전 수치를 가지므로, 그러나 이에 제한되지 않는, 정맥 혈전증 및/또는 동맥 혈전증을 포함하는, 혈전용해(thrombolytic) 이벤트의 위험을 감소시킨다.
본 발명은 또한 생체적합성 폴리머 모이어티와의 결합 반응(conjugation reaction)에서 FIX 접합체와 FIXa 접합체의 형성 속도가 서로 다르다는 유리한 점을 이용하여 FIXa로부터 FIX를 정제하는 방법에 관한 것이다. 이것은 FIX와 FIXa의 동역학적 분리를 일으킨다. 일 실시예에서 생체적합성 폴리머는 PEG이다.
본 발명의 FIX 접합체는 변형되지 않은 FIX에 비해 개선된 약물동력학적 프로파일을 갖는다.
본 발명의 또다른 관점은 FIX 접합체와 약학적으로 허용되는 희석제(diluent), 애쥬번트(adjuvant) 또는 담체(carrier)를 포함하는 약학 조성물을 혈우병 B의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 혈우병 B의 치료 방법이다. 본 발명의 FIX 접합체의 투여와 관련하여, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료가 필요한 환자"는 혈우병 B를 가진 것으로 진단된 환자 및/또는 제 IX 인자(Factor IX)가 결핍된 환자를 의미한다.
2.1 재조합 제 IX 인자(Factor IX)
당업계에 알려진 방법에 의해 제조된 재조합 제 IX 인자(Factor IX)는 본 발명에 따르는 유도(derivatizing) 및 결합을 위하여 고려된다. 바람직한 FIX는, 각각 인용에 의하여 그 전체로서 본 발명에 통합되는, 하나 이상의 하기의 특허등록 및 특허공개에 제시된 방법을 이용하여 제조될 수 있다: 미국 특허등록 제5,268,275호, 제5,171,569호, 제5,888,809호, 제6,531,298호; 국제 출원공개 WO 2005/030039, WO 2006/101474, WO 2006/089613; 미국 출원공개 제2003/0220247호, 제2005/0271644호, 제2006/0121574호 및 제2006/0194284호.
몇몇 실시예에서, FIX를 동결건조 또는 냉동건조시켰다. 바람직한 일 실시예에서, FIX를 동결건조 또는 냉동건조시키지 않았다. 몇몇 실시예에서, FIX를 동결보호제, 예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스에 노출시켰다. 바람직한 일 실시예에서, FIX를 동결보호제, 예를 들어, 수크로오스 또는 트레할로오스에 노출시키지 않았다.
2.2 제
IX
인자(
Factor
IX
) 접합체
변형되지 않은 FIX와 비교할 때, 본 발명의 FIX 접합체는 AUC, Cmax, 제거율 (CL), 반감기, 혈장 체류 시간(residence time) 및 생체이용률을 포함하는 약물동력학적 프로파일의 하나 이상의 파라미터에서의 개선을 보여줄 수 있다. FIX 접합체는 변형되지 않은 FIX와 비교할 때 생체내에서 상승된 임상적 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 접합체는 개선된 효능 및 안정성을 가질 수 있다.
본 발명에서 설명된, FIX 접합체는 당업계에 알려진 크로마토그래피를 통하여 정제되고 FIXa로부터 분리될 수 있다. 상기 방법은, 그러나 이에 제한되지 않는, 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 포함한다. 본 발명의 FIX 접합체는 변형되지 않은 FIX의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. FIX의 접합체는 제 IXa 인자(Factor IXa)를 생산하기 위하여, 제 XIa 인자(Factor XIa) 또는 제 VIIa 인자(Factor VIIa) 및 조직 인자(tissue factor)에 의해 생체내에서 활성화될 수 있다. FIX 접합체의 생물학적 활성은 본 발명에서 설명된 분석법을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따라 변형되는 FIX는 인간의 혈장과 같은 천연 원료로부터 수득되어 분리될 수 있다. 본 발명에 따라 변형되는 FIX는 재조합형으로 나타날 수 있다.
일 실시예에서, 접합체의 FIX 성분은 도 1에 나타난 바와 같은 인간 FIX로 식별되는 서열을 갖는다. 선택적으로, FIX의 서열은, 그러나 이에 제한되지 않는 삽입, 삭제 또는 치환을 포함하는, 아미노산 서열의 하나 이상의 변이(change)를 포함하기 위하여 변형되거나 유도(derivatizing) 될 수 있다.
FIX-PEG 접합체는 증가된 순환 반감기, 증가된 혈장 체류 시간(residence time), 감소된 제거율 및 생체내에서 증가된 임상적 활성을 유발할 수 있다. FIX는, 그러나 이에 제한되지 않는, 리신, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 시스테인뿐만 아니라 단백질의 N-말단 α-아미노기 및 C-말단 카르복시기를 포함하는, 하나 이상의 아미노산 잔기를 통하여 폴리에틸렌 글리콜 폴리머를 공유결합시킴으로써 변형될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 폴리머 단량체는 선형이거나 분지될(branched) 수 있다.
FIX-PEG 접합체는 주사(injection)를 통하여 정맥으로 전달되거나 피하로 전달될 수 있다. FIX-PEG 접합체는 또한 태블릿, 캡슐, 용액 또는 현탁액 형태로 경구 투여용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 하나의 관점은 PEG가 FIX의 하나 이상의 아민기에 결합된, FIX-PEG 접합체이다. 본 발명의 또다른 관점은 폴리에틸렌 글리콜 폴리머가 FIX의 하나 이상의 카르복실기에 결합된, FIX-PEG 접합체이다. 본 발명의 또다른 관점은 폴리에틸렌 글리콜 폴리머가 FIX의 하나 이상의 알코올기에 결합된 FIX-PEG 접합체이다. 일 실시예에서, 모이어티를 포함하는 PEG는 시스테인 티올 곁사슬에 결합될 수 있다. 또다른 일 실시예에서, 모이어티를 포함하는 PEG는 원래의 FIX에 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인 티올기를 연결할 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 폴리에틸렌 글리콜 폴리머가 리신 잔기에 결합된 FIX-PEG 접합체이다. FIX에서 리신의 ε-아미노기는, 그러나 이에 제한되지 않는 알킬레이션 및 아실레이션을 포함하는, 다양한 방법에 의해 용이하게 페길레이션(PEGylation) 될 수 있다.
본 발명의 또다른 관점은 폴리에틸렌 글리콜 폴리머가 N-말단 α-아미노기에 결합된 FIX 접합체이다. FIX의 N-말단 α-아미노 잔기는, 그러나 이에 제한되지 않는, N-말단 α-아미노기의 알킬레이션 또는 아실레이션을 포함하는 다양한 방법에 의한 PEG 접합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 또다른 관점은 시스테인 잔기에 결합된 하나 이상의 PEG를 포함하는 FIX 접합체이다. 시스테인 잔기에 대한 PEG 단위체의 결합은 이황화(-S-S-) 결합의 절단을 요구할 수 있다.
일 실시예에서, 하나 이상의 생체적합성 폴리머는 하나 이상의 시스테인 잔기를 통하여 FIX에 붙을 수 있다. 일 실시예에서, FIX 접합체의 생체적합성 폴리머 모이어티는 FIX에 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기에 결합된다. 또다른 일 실시예에서, PEG 폴리머는 하기의 화학식과 같이 FIX에 결합된다.
: 여기에서 Q는 직접 결합, 알킬렌기(바람직하게 C1 -10 알킬렌기), 또는 선택적으로-치환된 아릴기 또는 헤테로아릴기인 연결기(linking group)이며; 여기에서 아릴기는 페닐기 및 나프틸기를 포함하며; 여기에서 적당한 헤테로아릴기는 피리딘, 피롤, 퓨란, 피란, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린을 포함하며; 여기에서 폴리머와의 연결은 가수분해적으로 분리될 수 있는(labile) 결합에 의하거나, 가수분해적으로 분리되지 않는(non-labile) 결합에 의할 수 있다.
선택적으로 치환된 아릴기 또는 헤테로아릴기에 존재할 수 있는 치환기는 예를 들어, -CN, -NO2, -CO2R, -COH, -CH2OH, -COR, -OR, -OCOR, -OCO2R, -SR, -SOR, -SO2R, -NHCOR, -NRCOR, -NHCO2R, --NR'CO2R, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N--NR'COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, 할로겐(예를 들어 불소 또는 염소), -C≡CR, -C=CR2 및 13C=CHR로부터 선택된 같거나 서로 다른 하나 이상의 치환체를 포함하며, 여기에서 R 또는 R'는 각각 독립적으로 수소 원자, 알킬기(바람직하게 C1 -6) 또는 아릴기(바람직하게 페닐기)를 나타낸다. 특히 전자를 끌어당기는 치환체의 존재가 바람직하다.
또다른 일 실시예에서, PEG는 하기의 화학식과 같이 FIX에 결합된다.
FIX를 갖는 접합체를 형성하는 폴리에틸렌 글리콜 폴리머에는 수많은 다양한 형태가 존재한다. 단일의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하는 선형 PEG 폴리머가 존재하며, 분지되거나(branched) 여러개의 사슬을 갖는(multi-arm) PEG 폴리머가 존재한다. 분지된(branched) 폴리에틸렌 글리콜은 단일화기(unifying group)를 통하여 함께 결합된 2개 이상의 분리된 선형 사슬을 포함한다. 예를 들어, 2개의 PEG 폴리머는 리신 잔기에 의해 함께 결합될 수 있다. 하나의 선형 PEG 사슬은 α-아미노기에 결합되는 반면, 다른 PEG 사슬은 ε-아미노기에 결합된다. 리신 코어(core)에 남아있는 카르복실기는 단백질에 공유적으로 부착하기 쉽게 존재한다. 선형 및 분지된(branched) 폴리에틸렌 글리콜 폴리머는 분자량의 범위에서 상업적으로 유용하다.
본 발명의 하나의 관점에서, FIX-PEG 접합체는 FIX에 결합된 하나 이상의 선형 폴리에틸렌 글리콜 폴리머를 포함하며, 여기에서 각각의 PEG는 약 2kDa 내지 약 100kDa 사이의 분자량을 갖는다. 본 발명의 또다른 관점에서, FIX-PEG 접합체는 FIX에 결합된 하나 이상의 선형 폴리에틸렌 글리콜 폴리머를 포함하며, 여기에서 각각의 선형 PEG는 약 5kDa 내지 약 40kDa 사이의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 각각의 선형 PEG는 약 5kDa 내지 약 20 kDa 사이의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 각각의 선형 PEG는 약 10 kDa의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 각각의 선형 PEG는 약 10 kDa 미만의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, FIX-PEG 접합체는 FIX에 결합된, 하나를 초과하는 선형 PEG 폴리머, 예를 들어 FIX에 결합된 2개, 3개, 또는 4개의 선형 PEG 폴리머를 포함한다. 일 실시예에서, FIX-PEG 접합체는 2개의 선형 PEG 폴리머를 포함하며, 여기에서 각각의 선형 PEG는 약 10 kDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 FIX-PEG 접합체는 FIX에 결합된 하나 이상의 분지된(branched) PEG 폴리머를 포함할 수 있으며, 여기에서 각각의 분지된(branched) PEG는 약 2kDa 내지 약 100kDa 사이의 분자량을 갖는다. 본 발명의 또다른 관점에서, FIX-PEG 접합체는 FIX에 결합된 하나 이상의 분지된(branched) 폴리에틸렌 글리콜 폴리머를 포함하며, 여기에서 각각의 분지된(branched) FIX는 약 5kDa 내지 약 40kDa 사이의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 각각의 분지된(branched) PEG는 약 5kDa 내지 약 20 kDa 사이의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 각각의 분지된(branched) PEG는 약 10 kDa의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, 각각의 분지된(branched) PEG는 약 10 kDa 미만의 분자량을 갖는다. 일 실시예에서, FIX-PEG 접합체는 FIX에 결합된 하나를 초과하는, 분지된(branched) PEG 폴리머, 예를 들어, FIX에 결합된 2개, 3개, 또는 4개의 분지된(branched) PEG 폴리머를 포함한다. 일 실시예에서, FIX-PEG 접합체는 2개의 분지된(branched) PEG 폴리머를 포함하며, 여기에서 각각의 분지된(branched) PEG는 약 10 kDa의 분자량을 갖는다.
FIX-PEG 접합체는, 그러나 이에 제한되지 않는, 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 포함하는, 당업계에 알려진 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
2.3 제
IX
인자(
Factor
IX
) 유도체의 제조 방법
2.3.1 시스테인
잔기의
페길레이션
(
PEGylation
) 방법
폴리에틸렌 글리콜이 결합된 시스테인 잔기 또는, 페길레이션된(PEGylated) 시스테인 잔기를 형성하는 수많은 방법이 당업계에 존재한다. 이러한 방법의 유리한 점은 시스테인에 선택적이라는 것이며, 다른 곁사슬은 이러한 방법에 의해 영향을 받지 않고 남아 있다는 것을 의미한다. 하기의 도식 1a에서, 활성화된 이황화물, PEG ortho-피리딜-이황화물은 더욱 안정한 대칭성 이황화물을 형성하기 위하여 티올과 반응한다. 하기의 도식 1b에서, 시스테인 잔기는 마이클 첨가 반응에서 티올의 활성화된 이중 결합에 첨가를 통하여, PEG-말레아마이드(maleamide)와 반응한다. 하기의 도식 1c에서, PEG-비닐술폰의 활성화된 말단 비닐기에 대한 티올의 컨쥬게이트 공격(conjugate attack)은 페길레이션된(PEGylated) 시스테인 잔기를 형성한다. 하기의 도식 1d에서 시스테인 티올은 친핵성 공격(nucleophilic attack)을 통하여 요오드를 치환하여 PEG 결합된 시스테인 잔기를 형성한다.
[도식 1]
또한, 함께 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인기는 하기의 도식 2에 나타낸 방법을 사용하여 선택적으로 페길레이션될(PEGylated) 수 있다. 원래의 이황화 결합이 먼저 환원된다. 이러한 결합으로부터 형성된 티올 중 하나는, 에논(enone)에 대한 1,4-첨가 반응과 같이, 친전자성 그룹(electrophilic group)을 친핵적으로 공격한다. 그 후 이탈기(leaving group), 예를 들어, 술폰(sulfone)이 이탈한다. 연달아서 두번째 에논(enone)에 대해 제거 반응이 일어나고, 남아있는 티올에 의한 1,4-첨가 반응이 일어나서 PEG기가 부착된, 연결된 이황화물을 형성한다.
[도식 2]
상기 도식 2에서 보여준 방법은 2개 이상의 독립적인 PEG 모이어티 접합체가 결합된 FIX 접합체를 제조하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 원래의 첫번째 이황화 결합이 당업계에 잘 알려진 제어된 조건(controlled condition)에서 환원된다. 그 후 첫번째 PEG 모이어티가 상기 도식 2에 따라 부착된다. 연달아, 두번째 이황화 결합이, 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 더욱 완전한 환원 조건에서 환원된다. 그후 두번째 PEG 모이어티가, 상기 도식 2에 따라 다시 부착된다. 이러한 복합적 단계의 과정은 필요에 따라 반복될 수 있다.
2.3.2. 고도로 정제된
FIX
를 제조하는 방법
본 발명은 고도로 정제된 FIX 접합체를 제조하기 위하여 생체적합성 폴리머에 대한 FIX의 결합을 사용하는 방법을 제공한다. 특히, FIXa의 존재하에서 FIXa 접합체를 형성하지 않으면서 FIX 접합체를 형성하는 방법이 특히 유리하다. FIX의 접합체는 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법에 의해 FIXa로부터 용이하게 분리될 수 있다.
일 실시예에서, FIX-PEG의 형성 속도는 FIXa-PEG의 형성 속도보다 더 빠르게 일어난다. FIX의 선택적 결합을 위한 반응은 하기의 도식 3에 나타냈다.
[도식 3]
미량의 FIXa의 존재하에서, FIX의 반응 혼합물에 화학양론적 양의 PEG 성분이 첨가된다. 일 실시예에서, 반응 혼합물에 존재하는 PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 0.1부터 약 1.5까지다. 또다른 실시예에서, PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 0.1부터 약 1.0까지다. 또다른 실시예에서, PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 1.0부터 약 1.5까지다. 또다른 실시예에서, PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 0.1부터 약 0.5까지다. 또다른 실시예에서, PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 0.5부터 약 0.7까지다. 또다른 실시예에서, PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 0.7부터 약 1.0까지다.
일 실시예에서, PEG-성분은 한번에(one charge) 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 또다른 실시예에서, PEG-성분은 시간의 흐름에 따라 천천히 첨가된다. PEG-성분은 최대 약 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간 또는 24 시간의 기간에 걸쳐 첨가될 수 있다. 반응의 진행은, 그러나 이에 제한되지 않는, 질량 분석기, 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 또는 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 포함하는 방법에 의해 모니터될 수 있다. FIXa가 FIXa-PEG 접합체로 전환되지 않는다는 것을 확인하는 것이 중요하다. 일 실시예에서, FIX는 양적으로 FIX-PEG로 거의 전환되지 않는다. 또다른 실시예에서, FIX는 대략 80% 내지 90% 전환율로, 70% 내지 80% 전환율로, 60% 내지 70% 전환율로, 50% 내지 60% 전환율로, 40% 내지 50% 전환율로, 30% 내지 40% 전환율로, 30% 내지 40% 전환율로, 20% 내지 30% 전환율로 또는 10% 내지 20% 전환율로 FIX-PEG로 전환된다. 반응하지 않은 FIX는 재활용되어 추가적인 결합 반응을 할 수 있다.
FIX-PEG 접합체는 이온 친화성(ion affinity) 크로마토그래피 또는 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 통하여 반응 혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있다. 상기 분리 단계 후, 결과물 FIX-PEG 접합체에 실질적으로 FIXa가 없는지 확인하는 것이 중요하다. 이러한 내용은 Gray et al. Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9에 설명된 방법 또는 하기의 섹션 3.3의 방법에 의해 확인될 수 있다.
또다른 실시예에서 FIXa-PEG 접합체의 형성 속도는 FIX-PEG의 형성 속도보다 더 빠르다. 그 후 반응하지 않은 FIX는 본 발명에서 설명된 크로마토그래피에 의해 FIXa-PEG 접합체로부터 분리된다. 순수한 FIX-PEG를 제조하기 위하여, 남아있는 정제된 FIX에 대해 추가적 페길레이션(PEGylation) 반응이 진행될 수 있다. 하기의 도식 4는 이러한 환경에서 어떻게 정제된 FIX-PEG가 합성될 수 있는지를 보여준다.
[도식 4]
이러한 조건에서, FIXa에 비해 과도한 화학양론적 양의 PEG-성분이 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 일 실시예에서, 반응 혼합물에 존재하는 PEG-성분/FIXa 비(ratio)는 약 100부터 약 1000까지다. 또다른 실시예에서, PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 10부터 약 100까지다. 또다른 실시예에서, PEG-성분/FIX 비(ratio)는 약 1.1부터 약 10까지다.
모든 FIXa가 FIXa-PEG의 형성에 소비되는지 확인하는 것이 중요하다. 분자량 및 극성과 같은, FIXa-PEG 접합체의 물성은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 결합되지 않은 FIX로부터 FIXa-PEG 접합체를 용이하게 분리될 수 있게 한다. 일 실시예에서, 결합되지 않은 FIX는 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피 또는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제된다.
2.4 생물학적 활성을 분석하는 방법
본 발명의 FIX 접합체는 변형되지 않은 FIX의 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 FIX 접합체의 활성을 측정하는 방법은 예를 들어, Biggs(1972, Human Blood Coagulation Haemostasis and Thrombosis(Ed. 1), Oxford, Blackwell, Scientific, pg. 614)에 설명된 바와 같은 일 단계(one stage) 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 분석(one stage activated partial thromboplastin time assay)과 같은, 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 간단하게, 본 발명의 방법에 따라 개발된 FIX 접합체의 생물학적 활성을 분석하기 위하여, 상기 분석은 동일한 부피의 활성화된 부분 트롬보플라스틴 성분, 당업계에 잘 알려진 무균 정맥절개술을 사용하여 혈우병 B를 가진 환자로부터 분리한 FIX 결핍 혈장, 및 표준품으로서의 정상 혼주 혈장 또는 시료를 사용하여 실행될 수 있다. 이러한 분석에서, 활성의 1 단위는 정상 혼주 혈장 1 미리리터에 존재하는 활성의 양으로 정의된다. 또한, FIX-결핍 환자부터 정상인까지의 혈장의 응고 시간을 줄이기 위한 FIX의 능력에 기초한 생물학적 활성에 대한 분석은, 예를 들어, Proctor and Rapaport(1961, Amer. J. Clin. Path. 36: 212)에 설명된 바와 같이 실행될 수 있다. 어떠한 오염원 FIXa도 없는 것으로 확인된 FIX 접합체의 생물학적 활성은 또한 하기의 섹션 3.3에서 설명되는 분석법을 이용하여 측정될 수 있다.
2.4.1. 약학 조성물
본 발명은 활성 성분으로서 FIX 접합체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. FIX 접합체는 약학적으로 허용되는 담체(carrier)와 함께 제형화될 수 있다. FIX 접합체의 연장된 반감기로 인해, 약학 조성물은 혈우병 B를 효과적으로 치료하기 위하여 통상적으로 투여되는 것보다 더 적은 투여량의 FIX를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은, 그러나 이에 제한되지 않는, 진피내 주사(injection), 피하 주사(injection), 근육내 주사(injection), 정맥내 주입(infusion) 또는 뼈속내 주입(intraosseous infusion)을 포함하는 장관외 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 폴리에틸렌 글리콜로 화학적으로 변형된 FIX와 같은 FIX 접합체, 및 투여의 경로에 의존하는 약학적으로 허용되는 희석제(diluent), 애쥬번트(adjuvant) 또는 담체(carrier)를 포함하는 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 FIX 접합체의 치료적 투여량을 전달하기 위하여 제형화된다. FIX 접합체의 투여량은 국제단위(IU)로 나타낼 수 있다. 약학 조성물에 포함된 FIX 접합체의 투여량은 약 1 IU부터 10,000 IU까지일 수 있다. 일 실시예에서, FIX 접합체의 투여량은 약 100 IU부터 5000 IU까지, 또는 200 IU부터 2500 IU까지일 수 있다. 일 실시예에서, FIX 접합체의 투여량은 약 250 IU, 약 500 IU, 약 1000 IU 또는 약 2000 IU일 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본 발명의 약학 조성물은 예를 들어, 결합되지 않은 FIX의 유사 약학 조성물에 비교하여 유리한 면역원성(immunogenicity) 프로파일을 나타낸다. 일 실시예에서, 본 발명의 약학 조성물은 결합되지 않은 FIX의 유사 약학 조성물 또는 실질적으로 비-면역원성 약학 조성물보다 실질적으로 면역원성이 더 작다. 관련된 일 실시예에서, 유리한 면역원성 프로파일을 갖는 약학 조성물과 같은 것은, 예를 들어 혈우병 B를 치료하는 방법에서, 환자의 피하로 투여될 수 있다.
2.5 혈우병 B의 치료 방법
본 발명에서 설명된 FIX 접합체는 혈우병 B의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 FIX 접합체의 치료적 투여량을 전달하기 위하여 제형화된다. 일 실시예에서, FIX 접합체의 투여량은 개체에서 순환하는(circulating) FIX 활성이 1 IU/dL 내지 150 IU/dL의 농도가 될 정도면 충분하다. 또다른 실시예에서, 조성물은 개체에서 순환하는(circulating) FIX 활성이 10 IU/dL 내지 120 IU/dL의 농도가 되게 하는 투여량으로 투여된다. 또다른 실시예에서, 조성물은 개체에서 순환하는(circulating) FIX 활성이 20 IU/dL 내지 100 IU/dL의 농도가 되게 하는 투여량으로 투여된다.
몇몇 실시예에서, FIX 접합체의 활성은 결합되지 않은 유사한 FIX의 활성의 약 100%이다. 몇몇 실시예에서, FIX 접합체의 활성은 결합되지 않은 유사한 FIX의 활성의 약 80%, 60%, 또는 40%보다 더 크다. 바람직한 일 실시예에서, FIX 접합체의 활성은 결합되지 않은 유사한 FIX의 활성의 약 20%보다 더 크다. 바람직하지는 않지만, 상기 활성은 20%보다 더 낮을 수 있으며, 예를 들어 10%, 5% 또는 심지어 1%가 될 수 있고, 결합되지 않은 FIX와 비교할 때 상기 활성은 여전히 유리하게 사용될 수 있다.
FIX 접합체를 수용하는 환자에 대해, 환자의 FIX 활성은 의학 전문가에 의해 모니터될 필요가 있을 수 있다. 본 발명에서 설명된 FIX 접합체는 또한 수술 과정을 겪고 있거나 수술 과정으로부터 회복된 혈우병 B에 걸린 환자에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에서 설명된 FIX 접합체는 유해한 혈전용해를 유발할 수 있는, FIXa로부터의 오염이 없다. 따라서, 본 발명에서 설명된 FIX 접합체 및 FIX 접합체의 제조방법은 평균 혈전 수치에 의해 측정되는 유해한 혈전증을 일으킬 가능성이 적은 순수한 FIX 접합체를 제조한다. 일 실시예에서, FIX 접합체 조성물의 평균 혈전 수치는 3번 이상의 독립적 측정 후에 1 미만이다. 또다른 실시예에서, 평균 혈전 수치는 3번 이상의 독립적 측정 후에 0.5 미만이다. 또다른 실시예에서, 3번 이상의 독립적 측정 후에, 평균 혈전 수치가 0.3 미만이다. 또다른 실시예에서, 3번 이상의 독립적 측정 후에, 평균 혈전 수치는 0.1 미만이다. 또다른 일 실시예에서, 3번 이상의 독립적 측정 후에, 평균 혈전 수치는 0이다.
몇몇 실시예에서, FIX 접합체의 투여되는 투여량은, 결합되지 않은 유사한 FIX에 요구되는 투여량과 대략 같다. 몇몇 실시예에서, FIX 접합체의 투여되는 투여량은 결합되지 않은 유사한 FIX에 요구되는 투여량의 약 2배, 약 3배, 약 4배 또는 약 5배이다.
본 발명은 또한 FIX 접합체 및 추가적 치료 성분을 혈우병 B의 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 혈우병 B를 치료하는 방법에 관한 것이다. 추가적 치료 성분은 트라넥사민산, 아미노카프론산, 제 II 인자(프로트롬빈) 및/또는 제 X 인자(스튜와트 프로워 인자(Stuart Prower Factor))의 하나 이상일 수 있다.
FIX 접합체 및 추가적 치료 성분은 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 만약 순차적으로 투여된다면, 투여의 순서는 유연하다. 예를 들어, FIX 접합체는 추가적 치료 성분을 투여하기 전에 투여될 수 있다. 또는, 추가적 치료 성분의 투여는 FIX 접합체를 투여하기 전에 투여될 수 있다.
각각의 조성물이 별개의 조성물로 투여되거나 하나의 조성물로 투여되는지에 상관없이, 각각의 조성물은 바람직하게 약학적으로 투여에 적합하다. 또한, FIX 접합체 및 치료적 성분이, 만약 별개로 투여된다면, 동일한 투여 방법에 의하거나 서로 다른 투여 방법에 의해 투여될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 FIX 접합체는 결합되지 않은 유사한 FIX와 동일한 약학적 효과를 실질적으로 발휘한다. 예를 들어, 몇몇 실시예에서, 본 발명의 FIX 접합체의 투여는, 응고(coagulation)를 나타내는, 정상적인 피브린-유도성 응고(clotting)를 유발한다.
2.5.1 투여 요법
투여 요법은 매일 두번씩, 하루에 한번씩, 이틀에 한번씩, 일주일마다 두번씩, 일주일마다 한번씩, 이주일마다 한번씩 또는 한달에 한번씩 혈우병 B에 걸린 환자에게 본 발명의 접합체를 투여하는 것을 포함한다.
의학 전문가는 FIX 접합체를 수용하는 개체에서의 FIX 활성을 모니터할 수 있으며, 그에 따라 투여 요법을 변경할 수 있다. 일 실시예에서, 개체에서의 FIX 활성은 FIX 접합체를 투여한 후 즉시 측정된다. 또다른 실시예에서, 개체에서의 FIX 활성은 FIX 접합체를 투여한 후 0.5 시간째, 1 시간째, 6 시간째, 12 시간째, 또는 24 시간째에 측정된다. 또다른 실시예에서, 개체에서의 FIX 활성은 FIX 접합체를 투여한 후 2 일째, 4 일째, 1 주째, 2 주째 또는 3 주째에 측정된다.
3.
실시예
3.1
FIX
접합체의 합성
본 발명의 FIX 접합체는 당업계에 알려진 합성 방법을 사용하여 용이하게 합성될 수 있다. 하기의 합성 실시예는 FIX-PEG 접합체의 합성을 설명한다.
3.1.1.
실시예
1:
이황화
결합의 연결을 통한
FIX
의 페길레이션(
PEGylation
)
우레아 수용액 2-메르캅토에탄올을 제 IX 인자(Factor IX)에 첨가한다. 결과물 용액의 pH는 메틸아민의 10% 수용액을 이용하여 pH 8.5로 조정한다. 그 후 대략 30 분 동안 질소를 사용하여 반응 용액에 거품이 일어나게 한다. 질소가 제거될 때까지 튜브를 37 ℃에서 가열한다. 그 후 반응 혼합물은 함수-수빙(ice-salt water) 배쓰(bath)에서 냉각되고 상기 반응 용액에 1N HCl:무수 에탄올의 아르곤이 제거된 냉각된 용액 10 mL가 첨가된다. 침전물이 발생하면 원심분리에 의해 침전물을 분리한 후 추가적 분량의 HCl:무수 에탄올 혼합물을 사용하여 3회 수세하고 질소가 제거된 냉각된 디에틸 에테르로 2회 수세한다. 수세된 후 침전물은 원심분리에 의해 분리된다. 그 후 수세된 침전물은 질소가 제거된 탈염수에 용해된 후 냉동건조되어 건식 고체를 형성한다. FIX의 부분적 환원은, 단백질 분자 당 유리(free) 티올의 갯수를 제공하는, 엘만 시험(Ellman's Test)을 사용하여 확인되고 정량화될 수 있다.
에펜도르프에서, 부분적으로 환원된 FIX는 아르곤이 제거된 pH 8의 암모니아 용액에 용해된다. 별개의 에펜도르프에서, 폴리머 결합 시약인, 폴리(에틸렌)글리콜로부터 유래된 α-메톡시-ω-4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤즈아마이드가 또한 암모니아 용액에 용해되고, 결과물 용액은 제 IX 인자(Factor IX) 용액에 첨가된다. PEG 에펜도르프는 깨끗한 암모니아 용액으로 수세되고, 그 후 주요 반응 에펜도르프에 첨가된다. 반응 에펜도르프는 그 후 아르곤 하에서 밀폐된 후 대략 24시간 동안 37 ℃에서 가열된 후, 상온까지 냉각되도록 한다. 냉각된 반응 용액은 그 후 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석된다.
3.1.2.
실시예
2: 오염원
FIXa
의 존재 하에서
FIX
-
PEG
의 선택적 형성 및 정제
우레아 수용액 2-메르캅토에탄올이 FIXa로 오염된 FIX를 포함하는 반응 혼합물에 첨가된다. 결과물 용액의 pH는 메틸아민의 10% 수용액을 사용하여 pH 8.5로 조정된다. 그 후 대략 30 분 동안 질소를 사용하여 반응 용액에 거품이 일어나게 한다. 질소가 제거될 때까지 튜브를 37 ℃에서 가열한다. 그 후 반응 혼합물은 함수-수빙(ice-salt water) 배쓰(bath)에서 냉각되고 상기 반응 용액에 1N HCl:무수 에탄올의 아르곤이 제거된 냉각된 용액 10 mL가 첨가된다. 침전물이 발생하면 원심분리에 의해 침전물을 분리한 후 추가적 분량의 HCl:무수 에탄올 혼합물을 사용하여 3회 수세하고 질소가 제거된 냉각된 디에틸 에테르로 2회 수세한다. 수세된 후 침전물은 원심분리에 의해 분리된다. 수세된 침전물은 질소가 제거된 탈염수에 용해된 후 냉동건조되어 건식 고체를 형성한다. FIX의 부분적 환원은, 단백질 분자 당 유리(free) 티올의 갯수를 제공하는, 엘만 시험(Ellman's Test)을 사용하여 확인되고 정량화될 수 있다.
에펜도르프에서, 부분적으로 환원된 FIX는 아르곤이 제거된 pH 8의 암모니아 용액에 용해된다. 별개의 에펜도르프에서, 1당량 미만의 폴리머 결합 시약인, 폴리(에틸렌)글리콜로부터 유래된 α-메톡시-ω-4-[2,2-비스[(p-톨릴설포닐)-메틸]아세틸]벤즈아마이드가 또한 암모니아 용액에 용해되고, 결과물 용액은 FIX 용액에 첨가된다. PEG 에펜도르프는 깨끗한 암모니아 용액으로 수세되고, 그 후 주요 반응 에펜도르프에 첨가된다. 반응 에펜도르프는 그 후 아르곤 하에서 밀폐된 후 대략 24시간 동안 37 ℃에서 가열된 후, 상온까지 냉각되도록 한다. 냉각된 반응 용액은 그 후 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석된다. 그 후 FIX-PEG는 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 통하여 반응 혼합물로부터 정제된다.
분리된 생성물은 오염원 FIXa의 농도를 측정하기 위하여, 추가적으로 Gray et al. Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9에 의해 제시된 방법 또는 하기의 섹션 3.3의 방법에 의해 분석된다.
3.2 재조합 제
IX
인자(
Factor
IX
)의 제조
3.2.1.
실시예
3: 제
IX
인자(
Factor
IX
) 유전자를
CHO
세포에 1차
삽입(
Primary
Transfection
)
96-웰 플레이트에서 CHO 세포에 야생형 제 IX 인자(Factor IX) 유전자를 한계 희석(limit dilution)으로 도입한다. 제 IX 인자(Factor IX) 유전자는 CHEF-1 프로모터의 조절 하에 둔다. 세포는 14일 동안 5% 혈청에서 성장되도록 한다. 세포 배양 배지가 수집된 후 제 IX 인자(Factor IX) 항원의 총 양(mL 당 마이크로그램)이 제 IX 인자(Factor IX) ELISA 방법에 의해 정량화된다. 150개를 초과하는 클론이 측정되고 클론 당 생산된 제 IX 인자(Factor IX)의 총 양이 측정된다.
제 IX 인자(Factor IX) 유전자가 도입된 CHO 세포는 제 IX 인자(Factor IX) ELISA에 의해 감지되는 제 IX 인자(Factor IX) 항원을 생산한다.
3.2.2.
실시예
4: 제
IX
인자(
Factor
IX
)-생산
CHO
세포에
VKGC
유전자와 VKOR 유전자의 과량 도입(
supertransfection
)
제 XI 인자-도입된 CHO 세포에서 생산된 활성 제 IX 인자(Factor IX)의 백분율을 상승시키기 위하여, 일차 도입물(primary transfectant)이 조직 배양(tissue culture)에 혼주되어(pooled) 증량된 후, 제 IX 인자(Factor IX)의 효율적 비타민 K-의존성 감마-카르복실화에 중요하다고 일반적으로 생각되는 효소에 대한 cDNA를 포함하는 벡터로 과량 도입(supertransfected)된다. 제 IX 인자(Factor IX) 생산 클론은 진탕 플라스크에 혼합된(pooled) 후 비타민 K 의존성 감마-카르복실라아제(VKGC)에 대한 cDNA 및 비타민 K-의존성 에폭사이드 리덕타아제(VKOR)에 대한 cDNA가 과량 도입(supertransfected)된다. 개별적으로 과량 도입된(supertransfected) 세포는 96-웰 플레이트에서 14일 동안 5% 혈청에서 한계 희석(limit dilution)에 의해 성장된다. mL 당 생산된 제 IX 인자(Factor IX) 항원의 총 양은 제 IX 인자(Factor IX) ELISA에 의해 측정된다. 활성 제 IX 인자(Factor IX)의 양은 기질로서의 제 IX 인자(Factor IX)-결핍 혈장과 표준품으로서의 혈장-유래 제 IX 인자(Factor IX)를 사용하는 APTT 응고 분석법(APTT clotting assay)에 의해 측정된다.
3.3
FIX
접합체의 생물학적 분석(
Bioassay
)
3.3.1.
실시예
5:
FIX
-
PEG
및
FIXa
의 분석
FIX-PEG 활성뿐만 아니라 어떠한 오염원 FIXa 또는 FIXa-PEG 활성을 측정하기 위하여 정제된 FIX-PEG 조성물이 분석된다. 분석은 오염원 FIXa에 대하여, Smith, K. J. et al., Blood, 72, 1269-1277 (1988), for FIX and Varadi, K. et al., Thromb. Haemos., 35, 576-585 (1976)에 설명된 프로토콜에 따라서 수행된다.
3.3.2.
실시예
6:
FIX
-
PEG
조성물의
생체내
혈전유발성
(thrombogenicity) 분석
본 실시예는 상기 실시예 2의 과정에 따라 정제된 FIX 접합체가,혈전유발성(thrombogenicity)에 대한 생체내 Wessler Rabbit Stasis Assay에 의해 측정된 오염원 FIXa에 기인한, 원치않는 응집(coagulation)을 일으키는지 판단하기 위한 것이다.
정체 혈전(stasis thrombi)의 형성을 평가하기 위하여 Wessler et al ., J. Appl. Physiol. 14:943-946 (1959)에 제시된 과정에 따라, FIX 제제는 분리된, 단단히 묶인(ligated) 토끼의 경정맥(jugular vein) 부분으로 생체내에 주사된다.
점수 측정(scoring)은 응혈(clot)의 크기에 따라 Wessler, et al.의 방법에 따라 수행되며, 여기에서 +4는 선택된 혈관의 크기 및 형태에서 일반적으로 혈전형성 물질로 형성될 수 있는 가장 큰 크기의 응혈(clot)을 나타내며 +1은 육안으로 감지될 수 있는 정도의 가장 작은 크기의 응혈(clot)을 나타낸다. 실험은 3번 반복되고 산술 평균이 측정된다.
3.3.3.
실시예
7: 정제된
FIX
-
PEG
조성물에서 미량의
FIXa
및
FIXa
-
PEG
의 감지
TBS/1% 인간 알부민으로 희석된 참고(Reference) FIXa(25 마이크로리터) 또는 TBS/1% 인간 알부민에 희석된 25 마이크로리터의 테스트 FIX 농축물 희석액을 37 ℃에서 96-웰 마이크로리터 플레이트에 둔다. 같은 부피의 인간 FX, 소의 뇌의(bovine brain) 인지질 및 재조합 데설파토히루딘(desulphatohirudin)을 포함하는 분석 시약은 37 ℃에서 5분 동안 데운다. 그 후 데워진 재조합 FVIII와 CaCl2는 같은 부피로 시약에 첨가된다. 이들을 혼합한 후 즉각적으로, 125 마이크로리터의 상기 시약이 FIX 또는 FIXa 시료를 포함하는 웰에 첨가된다. 37 ℃에서 FXa 형성된 후 20분 후에, 50 마이크로리터가 100 마이크로리터의 S-2765(Quadratech Epsom UK)에 도입된다. 2분 동안 배양한 후 50 마이크로리터의 50% 아세트산에 의해 반응이 정지된 후 흡광도가 측정된다. 그 후 테스트 기질에 대한 흡광 정도는 테스트 혼합물의 FIXa의 양을 측정하기 위한 파장에서 실행된다.
3.3.4.
실시예
8: 10
kDa
FIX
-
PEG
및 20
kDa
FIX
-
PEG
과
결합되지
않은
FIX
의 순환 반감기의 비교
10kDa FIX-PEG와 20 kDa FIX-PEG(여기에서, 각각의 PEG 모이어티는 선형임)는 상기 실시예 1 및 2의방법을 이용하여 제조되었다.
결합되지 않은 FIX, 10kDa FIX-PEG 및 20kDa FIX-PEG는 FIX-결핍 마우스에 투여되었고, 투여된 후 15분부터 최대 48시간까지 각각에 대해 ELISA에 의해, 그리고 크로모제닉하게(chromogenically) 혈장 농도를 측정하였다. 평균 혈장 농도는 각각 도 2, 3 및 4에 나타냈다. 투여된 후 약 15분부터 약 4시간까지의 시간 동안 측정하였을 때, 10kDa FIX-PEG 및 20kDa FIX-PEG의 반감기는 결합되지 않은 FIX의 반감기보다 약 2 내지 2.5배 더 길었다. 투여된 후 약 15분부터 약 48시간까지의 시간 동안 측정하였을 때, 20kDa PEG-FIX의 반감기는 결합되지 않은 FIX의 반감기보다 대략 11배 더 길었고, 10kDa PEG-FIX의 반감기는 결합되지 않은 FIX의 반감기보다 대략 8배 더 길었다.
3.3.5.
실시예
9:
FIX
-결핍 마우스에서 10
kDa
FIX
-
PEG
및 20
kDa
FIX
-
PEG
의 활성
10kDa FIX-PEG와 20kDa FIX-PEG의 활성은 FIX-결핍 마우스를 사용하여 브리드-아웃 방법(bleed-out study)을 수행함으로써 측정되었다. 결합되지 않은 FIX의 45 마이크로그램/mL의 당량이 마우스에 투여되었다. 마우스 꼬리는 묶여졌고, 12 마리의 마우스에 10kDa FIX-PEG가 투여되고 16 마리의 마우스에 20kDa FIX-PEG가 투여되었다. 10kDa FIX-PEG 그룹의 12 마리 마우스 중 11 마리의 마우스의 죽음이 방지되었고, 20kDa FIX-PEG 그룹의 16 마리 마우스 중 12 마리의 마우스의 죽음이 방지되었다. 오로지 혈소판에 기인한 출혈 중지와 반대로, 피브린 응혈(clot)의 형성에 기인한 출혈 중지는 육안으로 관측되었다. 이러한 결과는 10kDa FIX-PEG와 20kDa FIX-PEG 모두 활성적이라는 것을 나타낸다.
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<110> Celtic Pharma Peg. Ltd.
<120> FACTOR IX CONJUGATES WITH EXTENDED HALF-LIVES
<130> 11662-072-228
<140> PCT/IB2009/005763
<141> 2009-04-24
<150> US 61/047,544
<151> 2008-04-24
<160> 1
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg
1 5 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe
20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly
35 40 45
Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp
50 55 60
Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys
65 70 75 80
Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu
85 90 95
Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr
100 105 110
Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val
115 120 125
Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr
130 135 140
Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn
165 170 175
Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe
180 185 190
Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly
195 200 205
Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu
210 215 220
Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu
225 230 235 240
Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His
245 250 255
His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile
275 280 285
Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala
305 310 315 320
Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys
325 330 335
Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly
340 345 350
Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
355 360 365
His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser
370 375 380
Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys
385 390 395 400
Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
405 410 415
Claims (30)
- 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜기가 시스테인 잔기를 통하여 제 IX 인자(Factor IX)에 결합된 것을 특징으로 하는 제 IX 인자(Factor IX)-폴리에틸렌 글리콜(FIX-PEG) 접합체(conjugate).
- 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜기가, 하나 이상의 환원된 시스테인 이황화 결합에 의해 제 IX 인자(Factor IX)에 결합된 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 2항에 있어서, 모이어티를 포함하는 하나 이상의 PEG는 하기의 화학식과 같이 하나 이상의 시스테인 이황화 결합과 연결된 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
: 여기에서 R1은 직접 결합, 알킬렌기(바람직하게 C1 -10 알킬렌기), 또는 선택적으로-치환된 아릴기 또는 헤테로아릴기인 연결기(linking group)이며; 여기에서 아릴기는 페닐기 및 나프틸기를 포함하며; 여기에서 적당한 헤테로아릴기는 피리딘, 피롤, 퓨란, 피란, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린을 포함하며; 여기에서 폴리머와의 연결은 가수분해적으로 분리될 수 있는(labile) 결합에 의하거나, 가수분해적으로 분리되지 않는(non-labile) 결합에 의할 수 있음. - 제 3항에 있어서, 모이어티를 포함하는 하나 이상의 PEG는 하기의 화학식과 같이 하나 이상의 시스테인 이황화 결합과 연결된 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 1항, 제 2항, 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 모이어티를 포함하는 하나 이상의 PEG는 약 10 kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 1항, 제 2항, 제 3항, 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 FIX-PEG 접합체(conjugate)는 모이어티를 포함하는 PEG가 하나인 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 1항, 제 2항, 제 3항, 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 FIX-PEG 접합체(conjugate)는 모이어티들을 포함하는 PEG가 2개인 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 접합체(conjugate)를 포함하고, 또한 약학적으로 허용되는 희석제(diluent), 애쥬번트(adjuvant) 또는 담체(carrier)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 조성물은 장관외(parenteral) 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 진피내 주사(injection), 피하 주사(injection), 근육내 주사(injection), 정맥내 주입(infusion) 또는 뼈속내 주입(intraosseous infusion)에 적합한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 접합체(conjugate)를 포함하고, 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FIX-PEG 접합체(conjugate)는 변형되지 않은 FIX에 비해 더 긴 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FIX-PEG 접합체(conjugate)는 변형되지 않은 FIX에 비해 더 큰 AUC를 갖는 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FIX-PEG 접합체(conjugate)는 변형되지 않은 FIX에 비해 더 큰 생체이용률을 갖는 것을 특징으로 하는 FIX-PEG 접합체(conjugate).
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 FIX-PEG 접합체(conjugate) 및 약학적으로 허용되는 희석제(diluent), 애쥬번트(adjuvant) 또는 담체(carrier)를 포함하는 약학 조성물을 혈우병 B의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 FIX-PEG 접합체(conjugate) 및 약학적으로 허용되는 희석제(diluent), 애쥬번트(adjuvant) 또는 담체(carrier)를 포함하고, 실질적으로 제 IXa 인자(Factor IXa)가 없는 약학 조성물을 혈우병 B의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈우병 B를 가진 포유동물의 출혈성 관절증(hemarthrosis), 출혈(hemorrhage), 위장관 출혈 및 월경과다(menorrhagia)의 위험을 감소시키는 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물의 평균 혈전 수치(mean thrombus score)는 3번의 독립적인 실험 후 1 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물의 평균 혈전 수치(mean thrombus score)는 3번의 독립적인 실험 후 0.5 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 조성물의 평균 혈전 수치(mean thrombus score)는 3번의 독립적인 실험 후 0인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 정맥으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 제 IXa 인자(Factor IXa)를 측정가능한 양으로 포함하는 재조합 제 IX 인자(Factor IX)의 조성물에 비해 혈전증의 발병률 감소를 유발하는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 하루에 한번씩 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 이틀에 한번씩 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 1 IU 내지 10,000 IU의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 200 IU 내지 2500 IU의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 약 250 IU, 약 500 IU, 약 1000 IU 또는 약 2000 IU의 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 순환하는(circulating) 제 IX 인자(Factor IX) 활성이 1 IU/dL 내지 150 IU/dL의 농도가 되게 하는 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 순환하는(circulating) 제 IX 인자(Factor IX) 활성이 10 IU/dL 내지 120 IU/dL의 농도가 되게 하는 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 조성물이 순환하는(circulating) 제 IX 인자(Factor IX) 순환 활성이 20 IU/dL 내지 100 IU/dL의 농도가 되게 하는 투여량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 혈우병 B의 치료 방법.
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