ES2235034T3 - Metodo de dosificado de la transcobalamina ii. - Google Patents

Abstract

Un método de ensayo para determinar la saturación de transcobalamina en el que se pone en contacto una muestra líquida que contiene transcobalamina con un sustrato poroso que lleva inmovilizado un ligando inmovilizador de transcobalamina y con un socio de unión de transcobalamina etiquetado con indicador, y en el que se detectan las señales de las etiquetas de indicador que pasan a estar inmovilizadas sobre el sustrato, caracterizado porque uno de dichos ligandos o dichos socios de unión incluye un primer ligando o socio de unión capaz de unirse específicamente a la holo- transcobalamina y un segundo ligando o socio de unión capaz de unirse a apo-transcobalamina o a holo y apo transcobalamina.

Description

Método de dosificado de transcobalamina II.

La presente invención se refiere a mejoras en métodos de ensayo de diagnóstico, y relacionadas con ellos, en particular, ensayos para transcobalamina.

La cobalamina o vitamina B_{12} es una vitamina hidrosoluble que forma parte del complejo vitamina B que se encuentra en los alimentos. La molécula de núcleo consiste en un anillo de corrina de cuatro unidades pirol que rodean el átomo de cobalto esencial. La cobalamina es la única vitamina que no pueden sintetizar los animales o las plantas y que debe ser absorbida desde el alimento en el intestino. Sin embargo, se puede almacenar en el hígado. Es sintetizada por micro-organismos, en particular bacterias anaerobias y levaduras.

la cobalamina funciona in vivo, como una co-enzima y las enzimas de cobalamina catalizan tres tipos de reacciones: (i) reordenamientos intra-moleculares, como por ejemplo, la formación de succinil CoA a partir de L-metilmalonil CoA; (ii) metilaciones, como por ejemplo, la formación de metionina por metilación de homocisteína, y (iii) reducción de ribonucleótidos en desoxiribonucleótidos en algunos microorganismos. En los mamíferos, sólo se conocen dos reacciones enzimáticas que requieren cobalamina como co-enzima, la (i) y (ii) que se han mencionado antes específicamente.

En el proceso de la digestión, una proteína salivar denominada haptocorrina, en adelante nombrada como HC (que también se denomina en la técnica anterior como proteína de unión R o transcobalaminas I y III colectivamente), se une a cobalamina en la parte superior del tracto gastrointestinal formando un complejo que pasa a través del estómago. Las enzimas pancreáticas digieren el complejo cobalamina-haptocorrina (holo-HC) en el íleo, liberando cobalamina que se une entonces a una proteína llamada factor intrínseco, que es secretado por la mucosa gástrica, para formar otro complejo. El complejo de cobalamina-factor íntrínseco se une a un receptor específico en la mucosa del íleo terminal, en virtud de lo cual se disocia mediante un factor de liberación y la cobalamina se transporta activamente a través de la membrana del íleo hacia la corriente sanguínea.

La cobalamina no circula por el cuerpo en forma libre en una cantidad apreciable. Probablemente un 99% aproximadamente de la cobalamina se une mediante haptocorrina, trasncobalamina o albúmina.

La proteína que, según se cree, es responsable del transporte de cobalamina a los tejidos diana es transcobalamina II (en adelante nombrada simplemente transcobalamina o TC), una proteína traza crítica sin la cual la cobalamina no puede atravesar las membranas celulares. A pesar de esta importante función metabólica, tan sólo aproximadamente un 6-25% de la cobalamina en el suero está unido a TC y la mayor parte es transportada por HC. TC es un polipéptido de cadena simple de 45 kDa que se encuentra principalmente en el suero, el fluido seminal y el fluido cerebroespinal. La cobalamina unida a TC u holo-TC, se une específicamente a receptores específicos en las membranas celulares, y una vez unida, el complejo holo-TC es ingerido por las células por pinocitosis.

TC es sintetizado por el hígado, el endotelio vascular, los enterocitos, los macrofagos y los fibroblastos y circula predominantemente como apo-TC, es decir, cobalamina sin unir. Tiene una vida media corta de aproximadamente 90 minutos.

Menos de una cuarta parte de la cobalamina en plasma total está asociada con TC. El resto está unida a HC o albúmina, tal como se ha mencionado antes.

Dado que la cobalamina debe ser absorbida desde el alimento, cualquier estado patológico que tenga como resultado un daño en la función gástrica, por ejemplo, gastroenteritis o estados patológicos que son consecuencia de atrofia gástrica, o la incapacidad de producir haptocorrina funcional, factor intrínseco, factor de liberación, TC o receptores TC, puede resultar en un defecto en la absorción de cobalamina y una deficiencia en correspondencia.

Determinados subgrupos de población, como por ejemplo los ancianos, las mujeres embarazadas, los pacientes con enfermedad gastrointestinal crónica o aguda, los que sufren de determinadas enfermedades autoinmunes, los que tienen una historia familiar de anemia perniciosa y los enfermos de SIDA, son particularmente propensos a una deficiencia de cobalamina.

Las manifestaciones clínicas de deficiencia de cobalamina son variadas y numerosas, pero implican principalmente anemia, hematopoyesis megaloblástica y trastornos funcionales y estructurales del sistema nervioso. En torno a un 60% de los individuos con un diagnóstico de deficiencia de cobalamina son anémicos, si bien en muchos de ellos, los síntomas neurológicos son los únicos signos clínicos observados. En torno a un 10% de los pacientes presentan síntomas psiquiátricos y en torno a un 40% presentan síntomas tanto neurológicos como psiquiátri-
cos.

Un diagnóstico a tiempo de deficiencia de cobalamina es crucial para asegurar una buena prognosis para los pacientes, ya que algunas de las manifestaciones de la deficiencia de cobalamina, en particular, los efectos neuropsiquiátricos, son irreversibles si no se detectan y se alivian a través de una rápida terapia de cobalamina.

Es deseable por consiguiente valorar con precisión el nivel de cobalamina de un individuo en un expediente y de manera eficaz, con vistas a establecer si el individuo padece o no deficiencia de cobalamina.

La medida del total de cobalamina en el plasma, es decir, cobalamina (y sustancias de tipo cobalamina) unida a HC o TC, ha sido empleada en un intento de valorar la deficiencia de cobalamina. Esta técnica se basa de manera muy amplia en la concentración de una distribución de una población que se considera como normal y por tanto produce un intervalo de referencia muy aproximado. Dentro de cada individuo, sin embargo, el intervalo de cobalamina disponible considerado como normal para ese individuo es muy preciso. Se ha observado que aunque la concentración de cobalamina metabólicamente activa del individuo se haya desplazado fuera de su propio intervalo de referencia, su contenido en cobalamina en plasma total sigue estando dentro del intervalo considerado como normal para la población. En tales circunstancias, puede no detectarse la deficiencia de cobalamina. Este método poco fiable es claramente no deseable y se ha reconocido plenamente que dichas medidas de cobalamina en suero o plasma tienen una baja sensibilidad y especificidad de diagnóstico.

Se han desarrollado y empleado ensayos microbianos que implican microorganismos que dependen de la cobalamina para su crecimiento, para medir la concentración de cobalamina en plasma, sin embargo, aparte de la dificultad que supone estimar el intervalo de referencia apropiado, estos métodos requieren extracción y conversión de las cobalaminas y eso supone consumo de tiempo, complicaciones, siendo totalmente inadecuado para una detección selectiva de laboratorio rápida.

Los métodos alternativos para valorar la deficiencia de cobalamina implican la medida de la acumulación en el plasma de metabolitos que requieren cobalamina para su conversión. Los niveles de metilmalona en plasma y homocisteína en plasma aumentan en los individuos con deficiencia de cobalamina y constituyen moléculas candidato buenas para la correlación con deficiencia de vitamina B_{12}. Los métodos que se basan en la valoración de homocisteína, sin embargo, han demostrado ser complicados, poco prácticos y se ha visto que tienen escasa especificidad y sensibilidad. Por su parte, los métodos que se basan en la medida de metilmalonato, aunque son precisos y fiables, son molestos y requieren el análisis combinado por cromatografía de gases/ espectrometría de masas, de manera que resultan caros y también son inadecuados para la detección selectiva clínica de rutina.

Se ha sugerido que la medida de cobalamina unida a TC en contraste con el total de cobalamina en plasma puede proporcionar un indicador clínico fiable de la probabilidad de una deficiencia de cobalamina (Herbert y cols., (1990) Am. J. Hematol. 34: 132-139; Wickramasinghe and Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537-539; Patente EE.UU. 4680273). Este intento de determinar la concentración de holo-TC fue sobretodo indirecto, pues estima la concentración de holo-TC como la diferencia entre el total de cobalamina en plasma y la concentración de cobalamina del plasma desprovisto de TC.

Dicha falta de TC puede llevarse a cabo por adsorción de sulfato amónico (Carmel (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62: 367-372), microsilicio (Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58: 332-337; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537-539), vidrio microfino (Vu y cols., (1993) Am. J. Hematol. 42: 202-211) o anticuerpos policlonales anti-TC inmovilizados (Lindemans y cols., (1983) Clin. Chim. Acta 132: 53-61). La concentración de cobalamina en el plasma total y la fracción desprovista se lleva a cabo a través de métodos conocidos en la técnica, tales como técnicas de radio inmunoensayo o inmunoensayo con enzima. Dichos métodos son inadecuados para una detección selectiva de rutina, ya sean automáticos o no automáticos, pues son complejos y requieren tiempo, aparte de que el bajo grado de especificidad de los materiales de adsorción utilizados tiene como resultado una separación insuficiente de holo-TC y holo-HC con el resultado de una superestimación de holo-TC. La variación de lote a lote del material de adsorción introduce más errores y, lo que es importante sobre todo, la substracción de un gran volumen de otro gran volumen tiene como resultado imprecisiones inaceptables y poco fiables.

Otras tentativas para valorar TC han implicado la separación de TC de otros componentes de suero, incluyendo HC, aprovechando su lipofilicidad. Así, Kapel y cols. (1988) Clin. Chim. Acta. 172: 297-310, Benhayoun y cols., (1993) Acta Haematol. 89: 195-199 y Toft y cols., (1994) Scand J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 describen métodos para separar TC de HC utilizando heparina sefarosa, gel de sílice o celulosa, respectivamente. Dichos métodos, sin embargo, presentan las mismas desventajas que los métodos indirectos ya que se basan en los mismos materiales de adsorción. Asimismo, la baja concentración en plasma de holo-TC hace que estos métodos sean inadecuados para su combinación con los métodos existentes para determinar cuantitativamente la cobalamina. El intervalo normal de holo-TC es 35 a 160 pM y los valores por debajo de 35 pM se considerarían por lo general como indicativos de deficiencia de cobalamina. La sensibilidad analítica que se ha descrito de la mayoría de los métodos de rutina para determinar la cobalamina en plasma es aproximadamente 40 pM, pero en la práctica frecuentemente es mucho más alta, típicamente en torno a 90 pM. Así pues, los niveles en plasma normales de holo-TC están por debajo o cerca del límite de sensibilidad de los métodos de rutina para la determinación cuantitativa de cobalamina.

Posiblemente el método más preciso actualmente reconocido para determinar cobalamina unida a TC implica la absorción de TC con sílice y, después, el ensayo de la fracción unida para determinar el contenido en cobalamina empleando o bien un inmunoensayo, tal como describe por ejemplo Kuemmerle y cols., (1992) Clin. Chem. 38/10: 2073-2077, o un ensayo microbiológico, consiguiéndose, según parece, mejores resultados con el segundo. Este método requiere una jornada entera para realizar solamente veinte ensayos. Es muy caro y poco práctico y, además se adapta escasamente a las investigaciones de laboratorio de diagnóstico clínico de rutina.

En WO 00/17659 se describe un método alternativo para determinar la concentración de holo-TC en el que, por ejemplo, se pone en contacto una muestra sin célula con un anticuerpo específico para TC inmovilizado sobre partículas magnetizables y con un anticuerpo radioetiquetado, no inmovilizado, no solapante específico para holo-TC. Se separan las partículas utilizando un campo magnético y se lavan y se mide su radioactividad proporcionando así una medida del contenido de holo-TC de la muestra. Este método requiere sin embargo calibrado y es más bien adecuado para en un laboratorio clínico que para que lo emplee un médico o colaborador médico en el punto de atención sanitaria.

Así pues, existe aún la necesidad de contar con un ensayo para determinar holo-TC que sea simple y operativo en el punto de atención sanitaria.

Los autores de la invención han reconocido que dicho ensayo simple se puede conseguir midiendo no el contenido de holo-TC sino la saturación de TC, es decir, la porción de TC que está en la forma holo, utilizando dos socios de unión específica etiquetados, uno para holo-TC y otro para apo-TC o tanto holo como apo-TC y determinando la relación de las señales a partir de las dos etiquetas. Por otra parte, dicho ensayo no depende del volumen, es decir, no ha de ser determinada con precisión la cantidad de la muestra líquida (v.g. el fluido corporal) utilizado. Esta es la principal ventaja para su uso en el punto de atención sanitaria.

Así pues, contemplada desde uno de sus aspectos, la presente invención proporciona un método de ensayo para determinar saturación de transcobalamina en el que se pone en contacto una muestra líquida que contiene transcobalamina con un sustrato poroso que lleva inmovilizado un ligando inmovilizador de transcobalamina y con un socio de unión de transcobalamina etiquetado con indicador (reporter), y en el que se detectan las señales de las etiquetas de indicador que se quedan inmovilizadas sobre dicho sustrato, caracterizado porque uno de dichos ligandos o dichos socios de unión comprende un primer ligando o un socio de unión capaz de unirse específicamente a la holo transcobalamina y un segundo ligando o socio de unión capaz de unirse a apo trasncobalamina o a holo y apo transcobalamina.

En uno de los modos de realización, el método de ensayo de la invención consiste en:

(i) contacto de una muestra líquida que contiene transcobalamina con un sustrato poroso que lleva inmovilizado un ligando inmovilizador de transcobalamina;

(ii) antes, durante o después de la etapa (i) anterior, contacto de transcobalamina de dicha muestra con un primer y un segundo socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina, siendo capaz dicho primer socio de unión de unirse tanto a holo como apo transcobalamina o siendo un socio de unión específica para apo transcobalamina y siendo dicho segundo socio de unión un socio de unión específica para holo transcobalamina; y

(iii) detección de señales de las etiquetas de indicador de dichos socios de unión inmovilizados sobre dicho sustrato y determinación a partir de ellas como indicación de la saturación de transcobalamina en dicha muestra.

Alternativamente, el sustrato puede tener una primera región que lleva inmovilizado un ligando que es un socio de unión específica para holo transcobalamina y una segunda región que lleva inmovilizado un ligando que es un socio de unión específica para apo transcobalamina o que es capaz de inmovilizar tanto holo como apo transcobalamina, y la etapa (iii) puede consistir en la detección de señales desde dichas primera y segunda regiones.

Se entiende por ligando o socio de unión específica aquel que se une a TC (es decir apo-TC y/o holo-TC, según se requiera) en virtud de su conformación o estructura química específica y no solamente en virtud de una propiedad físico-química global (como la lipofilicidad) que puede ser común a muchos componentes de la muestra de fluido corporal.

El ligando o socio de unión específica será generalmente un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena simple, un dímero, trímero o tetrámero de fragmento de anticuerpo, o un compuesto con afinidad para apo-TC y/o holo-TC, como por ejemplo un receptor de superficie celular, un polipéptido, un oligopéptido, un oligonucleótido, una sustancia química pequeña, etc. Otros ligandos o socios de unión específica se pueden seleccionar a partir de una química combinatoria o biblioteca de exposición de fagos o secuencias de unión específicas de ADN o ARN.

Si el ligando o socio de unión específica es un anticuerpo, puede ser policlonal, si bien es preferiblemente monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar con mucha mayor especificidad y uniformidad que los anticuerpos policlonales y esto reduce la reactividad cruzada con otros componentes del fluido corporal, en particular HC y, cuando sea apropiado, la conformación alternativa, v.g., la forma apo del analito diana. La uniformidad y reproductividad que ofrecen los anticuerpos monoclonales en relación con los anticuerpos policlonales asegura una mayor precisión que es vital para un ensayo en el que el analito se encuentra en tal baja concentración. Alternativamente, puede ser un fragmento de anticuerpo como, por ejemplo, un fragmento F(ab), F(ab')_{2} ó F(v). Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser monovalentes o divalentes y pueden producirse por tecnología de hibridoma o pueden tener un origen sintético, y generarse por tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Se podrían utilizar por ejemplo anticuerpos de cadena simple u otros derivados de anticuerpo o sucedáneos. El anticuerpo se puede dirigir o desarrollar contra un epitopo, componente o estructura de la proteína apo y/o holo-TC según sea
apropiado.

El ligando o socio de unión específica (sbp) para holo-TC utilizado en el método de ensayo de la presente invención deberá tener una especificidad para holo-TC (en contraposición con apo-TC) que sea al menos 10 veces mayor, preferiblemente, al menos 50 veces mayor, más preferiblemente, al menos 100 veces mayor, es decir, que exceda a la de apo y al menos 10 veces más del sbp de holo-TC se una a holo-TC en relación con apo-TC. En general, por lo tanto, será preferible seleccionar el sbp holo-TC utilizando métodos in vitro, más que por generación de anticuerpos en un animal huésped. Según esto, la detección selectiva para determinar sbps de holo-TC candidatos se realizará preferiblemente utilizando bibliotecas in vitro, v.g., bibliotecas de anticuerpo de exposición de fago (sobre todo anticuerpo de cadena simple) u oligonucleótido o bibliotecas químicas. La afinidad del sbp de holo-TC para holo-TC será además preferiblemente la necesaria para que las concentraciones nanomolares de holo-TC se puedan
detectar.

Los sbps de holo-TC candidatos pueden seleccionarse por ejemplo por inmovilización de holo-TC sobre un sustrato (v.g., perlas o láminas), v.g., por copulación con amida, y panning (reconocimiento y selección) de la biblioteca en presencia de un exceso de apo-TC no inmovilizado. El sustrato deberá lavarse después a fondo y, a continuación, se deberán liberar los candidatos de unión a holo-TC e identificarlos según los medios convencionales para el tipo de biblioteca.

A continuación, se pueden someter a ensayo los cadidatos para determinar su reactividad cruzada para apo-TC y se pueden seleccionar entonces los candidatos que tienen preferencia suficiente para holo-TC en lugar de para apo-TC. Deseablemente, los sbps de holo-TC candidato también se detectarán selectivamente para deseleccionar los spbps que son reactivos para HC.

Es sobre todo preferible que las regiones de unión de los sbps de holo-TC sean no peptídicos, por ejemplo, pueden consistir en pequeñas moléculas orgánicas u oligonucleótidos (v.g., de 20 a 50 monómeros).

Los sbps de apo-TC candidatos se pueden seleccionar de manera equivalente; sin embargo, por lo general será preferible utilizar un sbp holo-TC y un sbp de TC que no solapante (es decir, uno que se una tanto a apo como holo TC); los sbps de TC son muy conocidos dentro de la bibliografía (véase por ejemplo Quadros y cols., Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 149-154 (1996) y McLena y cols., Blood 89: 235-242 (1997)).

Una vez los sbp de holo TC candidatos y los sbps de TC o apo-TC han sido seleccionados, se pueden etiquetar con indicador (reporter) a través de un medio convencional.

Los indicadores pueden ser los mismos si se inmovilizan diferentes ligandos en diferentes regiones del sustrato; no siendo así, sin embargo, los indicadores usados deberán ser diferentes, es decir, sus señales deberán ser interdistinguibles.

Las fracciones de indicador en los sbps pueden consistir en cualquiera de los indicadores convencionales, v.g., emisores o absorbentes de radiación, en particular emisores o absorbentes de radiación electromagnética, enzimas o, menos preferiblemente, radioetiquetas, etc. En el caso de fracciones de indicador enzimático, las señales detectadas serán señales, v.g., luz emitida, de la reacción catalizada por la enzima. Así pues, las señales detectadas pueden ser generadas directamente o indirectamente por las fracciones de indicador.

A modo de ejemplo únicamente, algunos ejemplos adecuados de compuestos con color o fluorescentes que se pueden usar para etiquetar un sbp detectablemente en la presente invención son antaquinonas, colorantes azo, colorantes azina como oxazinas y tiazinas, triazinas, pigmentos naturales como porfirinas, ficobiliproteínas, incluyendo ficoeritrinas y ficocuaninas, clorofilas y sus análogos y derivados, carotenoides, acrinidinas, xantenos incluyendo fluoresceínas y rodaminas, colorantes de índigo, tioxantenos, cumarinas, polimetinas incluyendo di y tri arilmetinas y derivados de las mismas de ftalocianinas y ftalaocianinas metálicas.

De manera similar, se puede usar una amplia gama de compuestos radioactivos como etiqueta de formación de señal, entre ellos compuestos etiquetados con iodo 125.

Alternativamente, el sbp puede conjugarse con compuestos naturales o sintéticos que pueden producir una señal quimoluminiscente que se puede ensayar según el modo conocido (Cormier, M.J. y cols., Chemiluminiscence and Bioluminescence, Plenum Press, Nueva York 1973). Entre los compuestos quimioluminiscentes se incluyen luciferina, ésteres oxálicos, 1,2-dioxetano, luminiol o derivados de los mismos, si bien no se limitan a ellos sólo. Si es apropiado, se puede utilizar peróxido de hidrógeno, enzimas, por ejemplo luciferasa, fosfatasa alcalina y otras sustancias químicas para producir la señal quimioluminiscente a partir de las moléculas que producen señal utilizadas.

Preferiblemente, el sbp se conjuga con un "andamio" polimérico que transporta una pluralidad de fracciones de indicador, v.g., enzimas, cromoforos, fluoroforos, etc. De esta forma, se puede aumentar la señal, v.g., varios cientos de veces. Los andamios de polímero típicos incluyen dextrano (v.g. Amdex), polietilen glicol y dendrímeros (v.g., dendrímeros starburst)

Las moléculas que forman señal fuertemente aniónica pueden no ser preferibles para su uso en el método de la invención, ya que tienen tendencia a unirse a las proteínas de suero, como por ejemplo albúmina de suero humano (HSA) que pueden estar presentes en la muestra. Entre los ejemplos particularmente adecuados que se pueden utilizar se incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina B o ácido -N-hidroxisuccinimida-éster) N-(resorufin-4-carbonil)piperidina-4-carboxílico (resos).

Cuando el indicador es un emisor o absorbente de luz, es particularmente preferible (sobre todo para el sbp de holo-TC etiquetado) que el indicador comprenda una pluralidad de cromoforos o fluoroforos de manera que se aumente la señal. Un grupo particularmente preferible de indicadores es el grupo de indicadores capaces de producir fluorescencia de tiempo retardado, otro grupo es el grupo capaz de provocar luminiscencia. Entre los ejemplos específicos de indicadores se incluyen \beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina de pollo.

Se conoce bien en la especialidad la inmovilización de moléculas de afinidad, v.g., anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con fines de separación, por ejemplo por unión o copulación de los ligandos, opcionalmente por medio de un agente de unión, con cualquiera de los soportes sólidos o matrices conocidos cuyo uso está muy extendido actualmente o se ha propuesto para la separación o inmovilización, pudiéndose emplear cualquiera de los métodos conocidos en la especialidad. Dichas fases sólidas pueden adoptar la forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas, fibras o capilares. Las técnicas para la unión del ligando al sustrato poroso son por lo tanto enormemente conocidas y se han descrito ampliamente en la bibliografía.

En el método de la invención, el sustrato es preferiblemente una lámina o tira porosa (v.g., un material celulósico, preferiblemente nitrocelulosa), siendo especialmente preferible que esté montado sobre un soporte no poroso, opcionalmente con una protección absorbente que sirve para promover la absorción de la muestra liquida en el sustrato por acción capilar. Así pues, en uno de los modos de realización preferibles, la capa de sustrato, preferiblemente protegida con una capa absorbente, se monta sobre una varilla de nivel. En otro modo de realización preferible, la capa de sustrato preferiblemente protegida con una capa absorbente, se mantiene en un estuche plástico provisto de una apertura para la aplicación de la muestra líquida en la superficie expuesta de la capa de sustrato y para la lectura de las señales desde la capa de sustrato.

La generación de señal, si se requiere, se puede obtener a través de cualquier medio que sea adecuado para las etiquetas seleccionadas, por ejemplo, por exposición a la luz o para un sustrato para una etiqueta enzimática, y la detección de señal puede obtenerse a través de cualquier detector adecuado para detectar las señales emitidas, v.g., detectores de luz o radioactividad. Es especialmente preferible, cuando las señales son señales de luz, utilizar una cámara digital como detector, si es necesario, provista de un filtro, un prisma u otro medio para asegurar que se permite que la banda de longitud de onda deseada alcance el detector.

La detección de las señales a partir de los dos sbps etiquetados puede ser simultánea o secuencial. Es preferible la detección simultánea.

La manipulación de señal detectada para generar una indicación cuantitativa, semi-cuantitativa o cualitativa de la saturación TC se lleva a cabo convenientemente a través de un ordenador, preferiblemente un ordenador incorporado en el aparato utilizado para realizar el ensayo y colocado para controlar el rendimiento del ensayo. Cuando las etiquetas que forman la señal son diferentes en los sbps, el ensayo requerirá calibración según el modo convencional para transformar la relación de señales (Sa/Sb o Sa/(Sa+Sb), siendo Sa la señal de sbp de holo-TC y Sb la señal de sbp de TC o apo-TC, respectivamente) en un valor de saturación de TC. En correspondencia, se puede proveer el ensayo, si así se desea, de patrones de calibración que contengan apo y holo-TC en relaciones conocidas.

En un modo de realización alternativo, se puede llevar a cabo cualquiera de los métodos de la presente invención sobre la superficie de un sustrato de tipo chip dentro de un detector de resonancia de plasmones superficial (SPR). En dicho método, se evita la necesidad de etiquetado activo de los ligandos o sustratos específicos y se detecta la unión directamente a través de la masa adicional de los ligandos de unión específica o socios de unión específica que se unen a la superficie. En un ejemplo preferible de esta alternativa, se inmoviliza una proteína de unión TCII sobre la superficie de un "chip" SPR (v.g., por recubrimiento con oro del chip, seguido de la absorción de una proteína de unión TCII conjugado con tiol o por copulación con amida de la proteína de unión con un chip revestido con dextrano). A continuación, se coloca el chip en el detector de resonancia de plasmones superficial y se hace que la solución que contiene la muestra fluya sobre el chip, uniendo así holo-TC y apo-TC desde la muestra al ligando inmovilizado. A continuación, se hace que una solución que contiene una primera proteína de unión específica con especificidad para apo-TC o tanto para apo-TC como para holo-TC fluya sobre el chip y que se mide la unión según la resonancia de plasmones superficial para dar una primera señal. A continuación, se elimina por lavado esta primera proteína de unión específica opcionalmente y se pasa otra segunda proteína de unión específica con especificidad para holo-TC solamente sobre el chip. Se detecta una segunda señal, que representa la unión con holo-TC por resonancia de plasmones superficial. Esta diferencia entre la primera y segunda SRP se utiliza después para calcular la saturación TCII. Al utilizar SPR, se puede detectar cualquier ligando o socio de unión específica descrito como "etiquetado" o "etiquetado con indicador" según la masa sin ninguna etiqueta adicional o activa. En este caso la "etiqueta" es simplemente la masa de ligando o socio de unión específica.

La muestra aplicada sobre el sustrato es preferiblemente un fluido corporal o líquido derivado de tejido, preferiblemente un líquido sin células, especialmente plasma o suero de un mamífero, sobre todo un ser humano.

Según otro aspecto más, la presente invención proporciona un equipo de ensayo que comprende:

un sustrato poroso que lleva inmovilizado sobre él un ligando de inmovilización de TC;

un primer y un segundo socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina, siendo capaz dicho primer socio de unión de unirse tanto a holo como apo transcobalamina o siendo un socio de unión específica para apo transcobalamina y siendo dicho segundo socio de unión un socio de unión específica para holo transcobalamina;

opcionalmente, un agente de lavado;

opcionalmente, un sustrato para una etiqueta de indicador enzimática;

opcionalmente, al menos un patrón de calibración que contiene apo y holo-TC en una relación conocida; y

opcionalmente, un detector capaz de detectar señales de dichas etiquetas de indicador.

En un formato alternativo, la saturación de transcobalamina se puede determinar a través de la unión a regiones diferentes del los dos ligandos de sustratos, uno primero que inmoviliza holo-TC y uno segundo que inmoviliza apo-TC (o apo y holo-TC), y poniendo en contacto el sustrato con la muestra que contiene TC y un sbp etiquetado con indicador para TC. De esta forma, lo que constituye otro aspecto más de la invención, se leen las señales de las diferentes regiones del sustrato y la relación de señal Sa/(Sa+Sb) o Sa/Sb (siendo Sa la señal para la región de ligando de holo-Tc y Sb la señal para la región de ligando de apo-TC o holo y apo-TC) indicativa del nivel de saturación de TC. Las "regiones" del sustrato en este y otros aspectos de la invención pueden ser por ejemplo diferentes áreas de la superficie de una membrana, diferentes superficies de membrana en una varilla de nivel, diferentes membranas en un estuche, o diferentes conjuntos de perlas separables (v.g. siendo un conjunto magnetizable y el otro
no).

En este formato, el método de ensayo de la invención comprende típicamente:

(i) contacto de una muestra de ensayo que contiene transcobalamina con un sustrato poroso que lleva inmovilizado encima en diferentes regiones del mismo un primer y un segundo ligando imobilizador de transcobalamina, siendo capaz dicho primer ligando de unirse específicamente a holo transcobalamina y siendo capaz dicho segundo ligando de inmovilizar apo o apo y holo transcobalamina;

(ii) antes, durante y después de la etapa (i), contacto de transcobalamina de dicha muestra con un socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina; y

(iii) detección de señales desde las etiquetas de indicador de dicho socio de unión inmovilizado sobre las diferentes regiones de dicho sustrato y determinación a partir de ello de una indicación de saturación de transcobalamina en dicha muestra.

Contemplada desde otro aspecto más, la invención proporciona así un equipo de ensayo que comprende:

un sustrato poroso que lleva inmovilizado encima en diferentes regiones del mismo un primer y un segundo ligando de inomovilización de transcobalamina, siendo capaz dicho primer ligando de unirse específicamente a holo transcobalamina y siendo capaz dicho segundo ligando de inmobilizar apo o apo y holo transcobalamina;

un socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina,

opcionalmente, un agente de lavado;

opcionalmente, un sustrato para una etiqueta de indicador enzimática;

opcionalmente, al menos un patrón de calibración que contiene apo y holo-TC en una relación conocida, y

opcionalmente, un detector capaz de detectar señales para dichas etiquetas de indicador.

La invención quedará descrita a continuación haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos y a los gráficos en los que:

la figura 1 representa un sustrato sobre el que se han inmobilizado ligandos TC;

la figura 2 representa un sustrato que tiene dos regiones, una que contiene ligandos inmovilizados específicos para holo-TCII y otro segundo que tiene ligandos inmovilizados específicos para apo-TCII; y

la figura 3 representa un chip dentro de un detector de resonancia de plasmones superficial que tiene anticuerpos para TC inmobilizado en la superficie.

En la figura 1, "etiqueta-spb1" representa un primer socio de unión específica que tiene una primera etiqueta unida y "spb-etiqueta2" representa un segundo socio de unión específica que tiene una segunda etiqueta unida. Se puede observar que la señal de la etiqueta 1 corresponde al nivel holo-TC y la señal de etiqueta 2 corresponde a los niveles totales de apo- y holo-TC.

En la figura 2, se puede observar que holo-TCII se ha unido a la primera región (a mano izquierda) y apo-TCII a la segunda región (a mano derecha). La "etiqueta-spb" representa un socio de unión específica para TC que tiene una etiqueta unida. De esta forma, las señales de las dos regiones representan el contenido de holoTC y apoTC, respectivamente.

En la figura 3, se ha modificado una superficie de chip por unión de un primer anticuerpo monoclonal (mAb1). Este se une a apoTC y a holoTC desde una muestra. También se une el segundo anticuerpo (mAb2) o bien a holo-TC o bien a apo-TC, dando así una señal SPR para el contenido total de TC cuando se añade. El tercer anticuerpo (mAb3) se une solamente a holo-TC y da así una señal SPR que representa el contenido de holo-TC.

Ejemplo 1 Generación de spb holo-TC A) Inmovilización de holo-TC sobre perlas

Se mezcla un mililitro de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida 0,2 M (EDAC) en ácido 2-(N-morfolin)-etanosulfónico 0,1 M (MES), pH 5,0, con 1,0 mL de perlas modificadas con carboxilato al 2% (p/v) (1 \mum de diámetro Merck-Estapor) en MES 0,1 M, pH 5,0. Se trata la mezcla con un baño de sonicación para dispersar los reactivos y después se hace girar continuamente durante 1 hora a temperatura ambiente. Se centrifuga la mezcla a 300 g y se lava el pelet con MES 0,1,pH 7,0, se centrifuga y se vuelve a suspender en 1,0 mL de agua desionizada. Se mezclan las perlas activdas con EDAC en un vial de plástico pequeño con el mismo volumen de 1 mg/mL de holo-TC en ácido 3-[N-morfolino]-propano sulfónico 0,1 M (MOPS), pH 7,5 y se hace rotar toda la noche a temperatura ambiente. A continuación, se lava la mezcla dos veces con Tween 20 al 0,05% (acuoso) y dos veces con tampón Tris 50 mM, pH 7,4, que contiene 5 mg/mL de BSA. Se almacenan las perlas revestidas que tienen una monocapa de holo-TC de aproximadamente 10 \mug/mg a 0,1% en Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, y 1 mg/mL de BSA.

B) (i) Biopanning (reconocimiento y selección) de bibliotecas de aptámero con holo-TC como molécula diana

Se prepara una biblioteca de secuencias de ADN de doble hebra a través de una mezcla de etapas química y enzimática. Típicamente, se obtienen 10^{14}-10^{15} secuencias de ADN de hebra simple (ssADN) de 40 nucleótidos de longitud sintéticamente y después se convierten a la forma de doble hebra por medios enzimáticos antes de la amplificación por PCR. En segundo lugar, se transcribe el ADN de doble hebra para producir una biblioteca de ARN de hebra simple o ARN modificado. En tercer lugar, se estimula la biblioteca de ARN con la molécula diana en cuestión. Se transcriben inversamente las moléculas seleccionadas y después se amplifican por PCR (para bibliotecas de ADN PCR es suficiente). El subconjunto de secuencias que se unen a la diana pasa a ser la reserva para una segunda vuelta de biopanning. Normalmente, el proceso de selección tarda entre 7 y 15 vueltas.

Se amplifican cinco nmoles de ADN de plantilla sintética purificado con gel que contiene una secuencia contigua de 40 nucleótidos flanqueada por secuencias de hibridación de cebador definidas [5'-GGGAGGACGATGCGG-(N)_{40}-
CAGACGACTCGCCCGA-3'] mediante cuatro ciclos de PCR con cebadores 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAG
GAACGATGCGG-3' y 5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'. Aproximadamente 800 pmoles del ADN de plantilla derivado de PCR (aproximadamente 5 x 10^{14} moléculas) se transcriben in vitro mediante T7 ARN polimerasa (1000 U) en una reacción de transcripción de 3 mL que consiste en TrisHCl 40 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 12 mM, Spermidina 1 mM, ditiotreitol 5 mM (DTT), Triton X-100 al 0,002% (v/v), polietilen glicol al 4% (p/v) y 2 mM de cada uno de los sigiuentes ATP, guanidina-5'-trifosfato (GTP), 2'-NH_{2}CTP y 2'-NH_{2}UTP (CTP = citidina 5'-trifosfato y UTP = uridina 5'-trifosfato). Se purifican los productos de transcripción de longitud completa sobre geles de poliacrilamida al 8% en condiciones de desnaturalización, se suspenden en tampón de unión (TrisHCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, pH 6,8), se calienta a 70ºC y se enfría con hielo.

Se incuba la reserva de ARN a 37ºC durante 15 minutos con aproximadamente 10 \mug de holo-TC inmovilizado sobre perlas y 100 \mug de apo-TC libre en la solución como competidor. Se separan las perlas por centrifugado y se lavan inmediatamente con 5 mL de tampón de unión. Las moléculas de ARN unidas se eluyen de las perlas por reducción del pH, se recuperan por precipitación con etanol y se transcriben por transcripción inversa con virus de mieloblastosis avícola transcriptasa (Life Sciences) a 48ºC durante 45 minutos con la secuencia de ADN 5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3' como cebador. Después de la amplificación por PCR del cADN, se transcribe la plantilla de ADN duplex resultante in vitro para obtener ARN para la siguiente vuelta de selección. La cantidad de perlas recubiertas con holo-TC en la reacción de unión se reduce sucesivamente para aumentar progresivamente la presión de selección. Se repite el proceso de selección hasta que la afinidad de la reserva de ARN enriquecida para holo-TC aumenta sustancialmente. En este punto, se amplía cADN por PCR con cebadores 5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGGAC
GATGCGG-3' Y 5'-GCCGGATCCTCGGGCGAGTCGTCTG-3' que introduce sitios de restricción BamHi y HindIII (subrayados) en los extremos 5' y 3' de los productos de PCR, respectivamente. Se digieren los productos de PCR con BamHI y HindIII y se clonan en pUC18 que ha sido digerido con las mismas enzimas y se introduce en Escherichia coli SURE (Stratagene) por electroporación. Se aíslan los plasmidios de clones bacterianos simples y se detectan selectivamente y secuencian utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas por ejemplo en Sambrook y cols. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp Cl.

Para conferir resistencia a nucleasa ARN, se pueden modificar las moléculas de ARN en la posición 2' del azúcar, v.g., sustitución amino.

El protocolo de biopanning será esencialmente idéntico ya se base la biblioteca en aptámeros de ARN o en aptámeros de ssADN, o ya sea una biblioteca simple o vinculada. Básicamente, la diferencia será que las bibliotecas ssADN no requerirán transcripción.

(ii) Biopanning de péptido de exposición de fago o bibliotecas de anticuerpo con holo-TC

Se mezcla una pmol de biblioteca de exposición de fago con 10 \mug de holo-TC inmovilizado sobre perlas y 100 \mug de apo-TC en 100 \muL de PBS-Tween con 1 mg/mL de BSA o 3% de BLOTTO. (BLOTTO es leche en polvo sin grasa al 5% p/v en 100 mM de fosfato sódico, 150 mM de cloruro sódico, pH 7,4, 0,01% de Antiespumante A, 0,01% de trimerosal). Se incuba la mezcla a 4ºC durante toda la noche y se separan las perlas por centrifugado y se lavan 9 veces con 1 mL de PBS-Tween y una vez con solución salina normal para eliminar cualquier capacidad de tamponado. Se vuelven a suspender las perlas en 600 \muL de tampón glicina-HCl 0,1 M, pH 2,2 y al cabo de 15 minutos se separan las perlas por centrifugado a 3000 g durante 3 min. Se elimina el sobrenadante y se neutraliza con 36 \muL de Tris 2M, pH 9,0, y se mezcla con 400 \muL de Escherichia coli (v.g., K91-Kan). Se aíslan los plasmidios desde clones bacterianos simples y detectan selectivamente y se secuencian utilizando las técnicas convencionales tal como se describe por ejemplo en Sambrook J. y cols., antes mencionado. Se realizan las reacciones de unión y elución al menos tres veces. Se utilizan BSA y BLOTTO alternadamente en la reacción de unión para evitar el enriquecimiento de unión de fagos a estas proteínas.

Ejemplo 2 Inmovilización de agente de unión específica para TC sobre papel de celulosa

Se activa papel de celulosa (v.g., Whatman Nº 52) primero por hinchado en agua desionizada durante 3 minutos y después tratándolo con CNBr al 3% (acuoso). Se eleva el pH a 10,5 por adición de NaOH 1 mM. Al cabo de 30 minutos, se lava el papel con 12 x 500 mL de NaHCO_{3} 5 \muM, 2 x 500 mL de agua desionizada, 2 x 500 mL de cada uno de los siguientes, acetona al 25%, al 50% y al 75%. Finalmente, se lava con 4 x 500 mL de acetona y se seca al aire a temperatura ambiente.

Se realiza la copulación covalente de anticuerpo anti-TC por dilución del anticuerpo a 10 \mug/mL en 100 mL de NaHCO_{3} 0,1 M y añadiendo 20 g de papel cortado. Se agita la mezcla suavemente durante 3 horas a 40ºC, después se lava a temperatura ambiente durante 10 minutos con 2 x 100 mL de NaHCO_{3} 0,5 mM, durante 3 horas con 100 mL de etanolamina 50 mM en NaHCO_{3} 0,1 mM, durante 10 minutos con 2 x 100 mL de NaHCO_{3} 0,5 mM, durante 30 minutos con 100 mL de acetato sódico 0,1 M, pH 4,0, y dos veces con tampón fosfato 50 mM, pH 7,5, que contiene Na 0,15 M, 0,1% de Tween 20 y 0,1% de gelatina. Se almacena el papel cargado con anticuerpo en un pequeño volumen de este tampón.

A continuación, se adhieren secciones del papel cargado con anticuerpo a una varilla de nivel de plástico flexible.

Ejemplo 3 Ensayo

Se aplican 50 \muL de suero humano a una almohadilla de membrana de una varilla de nivel preparada según el ejemplo 2. Al cabo de 5 minutos, se enjuaga la varilla de nivel con 100 \muL de solución salina tamponada con Tris (TBS - Tris 100 mM, pH 7,2, cloruro sódico 150 mM) y se añaden 50 \muL de una solución de detección y se incuba durante 5 minutos. la solución de detección contiene un anticuerpo monoclonal específico para TC anti-humano no solapante conjugado con \beta-galactosidasa y sbp de holo-TC con arreglo al ejemplo 1 (o un anticuerpo monoclonal holo-TC anti-humano no solapante) conjugado con fosfatasa alcalina de pollo. A continuación, se enjuaga la varilla de nivel con 100 \muL de TBS. Se añaden 50 \muL de un sustrato luminiscente a la fosfatasa alcalina en TBS (v.g CPD-Star 0,25 mM de Tropix). Se mide la varilla de nivel en un luminómetro durante 1 segundo a 15 minutos. A continuación, se enjuaga la varilla de nivel con 100 \muM de PBS (solución salina tamponada con fosfato) y se añaden 50 \muL de un sustrato luminiscente para \beta-galactosidasa en PBS (v.g., Galacton-Star 0,1 mM de Tropix) y un inhibidor de fosfatasa alcalina (v.g., 40 \muM de ciclohexano-trismetilensulfonato). A continuación, se lee la varilla de nivel una vez más en un luminómetro. Mientras que la primera lectura da el contenido de holo-TC en la varilla de nivel, la segunda lectura da el contenido de TC total. La relación de los dos da el valor independiente de volumen para la saturación de cobalamina de TC en la muestra.

Ejemplo 4 Desarrollo de anticuerpos monoclonales de ratón específicos para transcobalamina humana y holo-transcobalamina humana i) inmunización

Se inmunizaron ratones hembra BALB/c hembra i.p. con 20 \mug de holo-transcobalamina humana recombinante mezclada con Inmuno modulador AdjuPrime (Pierce, IL, EE.UU.), seguido de dos inyecciones de refuerzo de 20 \mug a intervalos de 4 semanas.

ii) Fusión

Cuatro días después del refuerzo final, se extirparon los bazos y se fundieron los esplenocistos para el plasmacitoma sensible a HAT (Hipoxantina, Aminopterina, Timidina; sigma) OUR1 (un sub-clon de X63-Ag8.653) utilizando PEG (Boehringer Mannheim, Alemania). Se colocaron en placa los productos de fusión sobre 5 bandejas x 96F (Nunc) en presencia de HAT en medio de cultivo (DMEM/Ham's F12 (Invitrogen) más 10% de CPSR3 (Sigma). Se alimentaron las fusiones al cabo de 1 semana con medio de cultivo que contenía HT (Sigma).

iii) Análisis de selección primario

Al cabo de dos semanas, se detectó selectivamente del medio de los hibridomas utilizando un ensayo de captura en fase sólida. Se mezcló el medio celular con 10 \muL de una suspensión al 1% (p/v) de 1 \mum de perlas magnetizables revestidas con anticuerpo IgG anti-ratón de oveja (Merck-Estapor, Francia) y se guardaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se aislaron las perlas magnetizables con anticuerpos monoclonales de ratón unidos utilizando un imán, y se lavaron cuatro veces con 1 mL de tampón fosfato, pH 7,2, NaCl 0,15 M y 1 mg/mL de albúmina de suero bovino. Se volvieron a suspender las perlas lavadas en 100 \muL de suero humano reservado (Scantibodies, EE.UU) que había sido tratado previamente con cobalamina etiquetada con 57Co (ICN, EE.UU.) para convertir la apo-transcobalamina en el suero en holoTC etiquetado con 57Co. Se guardaron las mezclas a temperatura ambiente durante 30 minutos y se aislaron las perlas utilizando un imán. Se hizo el recuento de la radioactividad asociada con las perlas en un contador gamma.

iv) Clonación

Se clonaron pocillos positivos para anticuerpos anti-transcobalamina limitando la dilución sobre bandejas de 96 pocillos F (Nunc), se pre-sembraron con células de alimentación peritoneal Balb/c (10.000 por pocillo). Se seleccionaron clones positivos, y se volvieron a clonar hasta que un 100% de los subclones producían un anticuerpo específico. Se congelaron las reservas ce células en nitrógeno líquido, en CPSR3 (Sigma) que contenía DMSO al 10% (Sigma).

Detección selectiva secundaria. Se aislaron anticuerpos de medio celular en perlas magnetizables tal como se ha descrito antes. Se mezclaron 10 \muL de las perlas revestidas con anticuerpo con suero preetiquetado con 57-Co, tal como se ha descrito antes, en presencia de concentraciones cada vez mayores de apo-transcobalamina humana o holo-transcobalamina humana, recombinante.

Se seleccionaron dos anticuerpos anti-transcobalamina (mAb1 y mAb2) basándose en su afinidad para apo- y holo-transcobalamina y se seleccionó un anticuerpo monoclonal (mAb3) basándose en la especificidad para holo-transcobalamina. Se expandieron los clones correspondientes in vitro en Tecnomouse, CL1000. Se purificaron los anticuerpos del medio celular por cromatografía de afinidad a proteína A. Brevemente, se diluyó el sobrenandante de cultivo que contenía anticuerpo 1:1 en Tris 0,1 M, pH 8,0, que contenía NaCl 1M (tampón de unión) y se aplicó a la columna de proteína A, que había sido pre-equiibrada con tampón de unión. A continuación, se lavó extensivamente la columna de proteína A con 15 volúmenes de columna de tampón de unión. Se eluyó el anticuerpo con tampón citrato 0,1 M, pH 4,0, se neutralizó hasta un pH 7,0 con tampón Tris 1M, pH 8, y se cambió el tampón sobre una columna G-25 Sephadex (Pharmacia)a fosfato 0,1 M, pH 7,2, que contenía NaCl 0,15 M.

Ejemplo 5 Inmovilización de anticuerpo monoclonal específico para TC mAb1 sobre superficies revestidas con dextrano

Se activó la superficie carboxilada del chip revestido con dextrano (Pharmacia, Suecia) con hidrocloruro de N-hidroxisuccinimida 0,05 M (NHS)/ N-etil-N'-[3-(dimetilamino)proil]carbodiiida 0,2 M (EDC), se enjuagó con agua desionizada y se recubrió covalentemente con mAb1 (del ejemplo 4) a 50 \mug/mL en tampón HEPES 0,01, pH 7,4, que contenía NaCl 0,15 M, EDTA 0,003 M, y 0,005% de polisorbato (HBS). Se bloqueó NHS sin reaccionar con etanolamina 1M y se lavó el chip extensivamente con HBS.

Ejemplo 6 Unión de holo-trasncobalamina, mAb2 y mAb3 a mAb1 inmovilizado

Se siguieron los eventos de unión en tiempo real utilizando resonancia de plasmones superficial y llevada a cabo en un instrumento Biocore (Biacore, Suecia). Se midió la cantidad de ligando libre que se unía al chip en unidades de respuesta (RU) que reflejan tanto la masa de la unión de ligando como su afinidad para la diana inmovilizada. Se introdujo el chip con mAb1 inmovilizado (ejemplo 5) en el instrumento, tras lo cual se inyectaron 5 \muL de holo-transcobalamina 100 nM, 5 \muL de 50 \mug/mL mAb2, y 5 \muL de 50 \mug/mL mAb3 sucesivamente con etapas de lavado entre una y otra. Después del flujo de holo-transcobalamina a través del instrumento, se unieron 565 RU de mAb3 a mAb1 inmovilizado. En ausencia de holo-transcobalamina ni mAb2 ni mAb3 se unieron al chip con el mAb1 inmovilizado.

Claims (19)

1. Un método de ensayo para determinar la saturación de transcobalamina en el que se pone en contacto una muestra líquida que contiene transcobalamina con un sustrato poroso que lleva inmovilizado un ligando inmovilizador de transcobalamina y con un socio de unión de transcobalamina etiquetado con indicador, y en el que se detectan las señales de las etiquetas de indicador que pasan a estar inmovilizadas sobre el sustrato, caracterizado porque uno de dichos ligandos o dichos socios de unión incluye un primer ligando o socio de unión capaz de unirse específicamente a la holo-transcobalamina y un segundo ligando o socio de unión capaz de unirse a apo-transcobalamina o a holo y apo transcobalamina.

2. Un método según la reivindicación 1 para determinar saturación de transcobalamina en una muestra líquida que contiene transcobalamina, consistiendo dicho método en:

(i) contacto de dicha muestra con un sustrato poroso que lleva inmovilizado un ligando inmovilizador de transcobalamina;

(ii) antes, durante o después de la etapa (i) anterior, contacto de transcobalamina de dicha muestra con un primer y un segundo socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina, siendo capaz dicho primer socio de unión de unirse tanto a holo como a apo transcobalamina o siendo un socio de unión específica para apo- transcobalamina y siendo dicho segundo socio de unión un socio de unión especifico para holo transcobalamina; y

(iii) detección de las señales de las etiquetas de indicador de dichos socios de unión inmovilizados sobre dicho sustrato y determinación a partir de las mismas como indicación de la saturación de transcobalamina en dicha muestra.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que dicho sustrato lleva inmovilizado dicho ligando que es capaz de inmovilizar tanto holo como apo transcobalamina y en el que las señales tanto de las primeras como de las segundas etiquetas de indicador son interdistinguibles.

4. Un método según la reivindicaicón 1 que consiste en:

(i) contacto de una muestra líquida que contiene transcobalamina con un sustrato poroso que lleva inmovilizado encima en diferentes regiones del mismo un primer y un segundo ligando inmovilizador de transcobalamina, siendo capaz dicho primer ligando de unirse especificamente a holo transcobalamina y siendo capaz dicho segundo ligando de inmovilizar apo o apo y holo transcobalamina;

(ii) antes, durante o después de la etapa (i) contacto de transcobalamina de dicha muestra con un socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina; y

(iii) detección de señales de las etiquetas de indicador de dicho socio de unión inmovilizado en diferentes regiones de dicho sustrato y determinación a partir de las mismas de una indicación de saturación de transcobalamina en dicha muestra.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en el que dicho socio de unión específica para holo transcobalamina o dicho ligando capaz de unirse específicamente a holo transcobalamina comprende una fracción de unión a holo-transcobalamina no peptídica.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en el que dicho socio de unión específica para holo transcobalamina o dicho ligando capaz de una unión especifica a holo transcobalamina comprende un anticuerpo monoclonal.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que dicho socio de unión específica para holo transcobalamina o dicho ligando capaz de una unión específica a holo transcobalamina tiene una especificidad para holo transcobalamina frente a apo transcobalamina que es al menos 10 veces mayor.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 en el que dichas señales son radiación electromagnética.

9. Un método según la reivindicación 8 en el que dichas señales se detectan mediante una cámara digital.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 en el que dicha muestra es sangre o un líquido derivado de sangre.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 en el que dicho sustrato es una lámina de celulosa.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 en el que dicho sustrato se monta sobre una varilla de nivel.

13 Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12 en el que en la etapa (i) dicha muestra se aplica sobre una de las caras de dicho sustrato poroso y se extiende en dicho sustrato poroso por flujo capilar promovido por un material absorbente en agua adyacente a la cara opuesta de dicho sustrato poroso.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 en el que dicho socio de unión específica etiquetado con indicador se etiqueta únicamente con su propia masa y se detecta por resonancia de plasmones superficial.

15. Un equipo de ensayo que incluye:

a un sustrato poroso que lleva inmovilizado encima un ligando inmovilizador de TC y; y

un primer y un segundo socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina, siendo capaz dicho primer socio de unión de unirse tanto a holo como apo transcobalamina o siendo un socio de unión específica para apo transcobalamina y siendo dicho segundo socio de unión un socio de unión específica para halo transcobalamina;

16. Un equipo de ensayo que incluye:

un sustrato poroso que lleva inmovilziado encima en diferentes regiones un primer y un segundo ligando inmovilizador de transcobalamina, siendo capaz dicho primer ligando de una unión específica a holo-transcobaamina y siendo capaz dicho segundo ligando de inmovilizar apo o apo y holo transcobalamina y;

un socio de unión etiquetado con indicador para transcobalamina.

17. Un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 que incluye adicionalmente un agente de lavado.

18. Un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 que incluye adicionalmente al menos un sustrato para una etiqueta indicadora enzimática.

19. Un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 que incluye adicionalmente al menos un patrón de calibración que contiene apo y holo-TC en una relación conocida.

20. Un equipo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que incluye adicionalmente un detector capaz de detectar señales de dichas etiquetas indicadoras.