JPS62235564A - エリスロポエチンの免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［ａ業上の利用分野］ 本発明は、エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略称するこ
ともある）の免疫学的測定法に関するものである。［従
来の技術］ ＥＰＯは主として腎臓で産生され、赤血球の分化をコ゛
ントロールしている分子量的４万のホルモンである。種
々の貧血症や赤血球増過症では体液中ＥＰＯ量が増加又
は減少していることが知られており、体液中ＥＰＯ量を
正確に測定することはこれら血液疾患の診断に極めて重
要である。

従来ＥＰＯの測定法としてはマウスやラット等の小動物
を用いるバイオアッセイ法（臨床検査ｖｏ１．２２．　
Ｎｏ、２．１９８７年）、マウス骨髄細胞への８９　Ｆ
ｅの取り込みで測定する方法（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ。

Ｍｅｄ、、Ｖｏｌ、　９７．Ｎｏ、２．１５８〜１６９
頁、１９８１年）、マウス胎児細胞を利用する方法（日
本血液学会誌、Ｖｏｌ、４４．Ｎｏ、６．１９８１年）
などが知られている。これらの中ではバイオアッセイ法
が最も信頼性が高いと言われているが、この方法は検出
感度が低く、測定に長い日数を要し、多数の動物を使用
するためコストも高いという欠点を有している。

［発明が解決しようとする問題点コ 近年、体液中の微量物質の定量法としての免疫測定法、
取り分は酵素免疫測定法の進展は目覚ましいものがある
が、放射免疫測定法に比べて検出感度が低いという理由
によりその用途拡大が制限されている。特にＥＰＯは正
常血中濃度が１０〜２０　ｍｌｌ／ｍｊ！　（０，１〜
０．３ｎｇ／　ｍｆｔ　）と極めて微量であるため公知
の酵素免疫測定法では検出が難しいと考えられていた。

このため本発明者らは、ＥＰＯと特異的に反応する抗体
を不溶性支持体に結合させた抗体結合不溶性支持体、Ｅ
ＰＯを含む被検液及び　ＥＰＯと特異的に反応する抗体
を酵素で標識した標識物を反応せしめて、前記抗体結合
不溶性支持体上に抗体−ＥＰＯ−標識複合体を形成させ
た後、前記抗体結合不溶性支持体上に結合した標識物の
量を測定することによりなるＥＰＯの酵素免疫測定法に
ついて既に特許出願した（特願昭６Ｏ−３９６８７）。

しかしながら、この方法ではＥＰＯと特異的に反応する
抗体の力価が低い為、必ずしも前記の正常血中濃度のＥ
ＰＯを高精度に測定できるとは限らなかった。ＥＰＯと
特異的に反応する抗体の力価が低い理由としては、ＥＰ
Ｏをヒト以外の動物に免疫した場合、ＥＰＯの代謝が速
いこと、投与したＥＰＯに対して動物が生理的に反応し
て極度の貧血症状に陥ることなどが考えられている。

本発明者らは、このような現状に鑑み、通常の検査室で
実施でき、かつ極めて短時間に低コストで実施でき、検
出感度の極めて高いＥＰＯの測定法を鋭意研究し、本発
明を完成した。

［問題点を解決する為の手段］ 本発明は、エリスロポエチンと特異的に反応する第１抗
体を不溶性支持体に結合させた抗体結合不溶性支持体に
、エリスロポエチンを含む被検液、及びエリスロポエチ
ンと特異的に反応し且つ前記第１抗体とは異なる動物種
に免疫して得られた第２抗体を反応させた後、前記第２
抗体を作成した動物種の免疫グロブリンと特異的に反応
する第３抗体に標識物質を結合させた標識抗体を反応さ
せ、前記抗体結合不溶性支持体上に結合した前記標識抗
体の量を測定するか、若しくは結合しなかった標識抗体
の量を測定することにより前記被検液中のエリスロポエ
チンの量を測定する点に要旨を有するＥＰＯの免疫学的
測定法である。

［作用］ 本発明は上述の如く構成されるが、要はＥＰＯと特異的
に反応する前記第２抗体の力価が低い場合でも、該第２
抗体を作成した動物種の免疫グロブリンと特異的に反応
する第３抗体に標識物質を結合させた標識抗体を用いた
ことにより、感度を増幅させることができ、良好なＥＰ
Ｏの免疫学的測定方法が提供される。即ち第３抗体は前
記第２抗体を作成した動物種の免疫グロブリンをその動
物種以外の動物に免疫することにより容易に得られるが
、得られた第３抗体の力価は前記第２抗体の力価と比べ
て遥かに大きなものである。

本発明において使用する第１抗体及び第２抗体は、ＥＰ
Ｏを比較的多量に産生じている再生不良性貧血患者など
の尿より精製されたＥＰＯを、ヒト以外の哺乳動物１例
えばウサギ、ウシ、ヒツジ、モルモット等から選択され
る異なった動物種に免疫して得られる。また前記第１抗
体及び第２抗体はいずれか一方がモノクローナル抗体で
あっても良い。本発明のより好適な実施態様は、第１抗
体がウサギ、ウシなどの動物に免疫して得られた抗体で
あり、第２抗体がマウス由来のモノクローナル抗体であ
り、第３抗体がマウスの免疫グロブリンをマウス以外の
動物に免疫して得られた抗体である場合である。

ＥＰＯの精製はアフィニテイクロマトグラフ。

ゲル濾過等の公知の精製手段を組合せて実施できるが、
特異性の高い抗体を得るには、ＥＰＯをできるだけ純化
しておくのが好ましい。このようにして精製されたＥＰ
Ｏを、ウサギやウシ等の皮下に免疫して、前記第１抗体
或は第２抗体が作成される。また第２抗体を作成した動
物種の免疫グロブリンと特異的に反応する第３抗体は、
免疫グロブリンの精製品を前記第２抗体を作成した動物
種以外の動物に免疫して作成される。ＥＰＯと特異的に
反応するモノクローナル抗体は、例えば精製されたＥＰ
ＯをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスに免疫して牌細胞を得、
骨髄腫細胞とポリエチレングリコールにより融合させ、
ＨＡＴ培地によるクローニングをくり返すことにより得
られる。

次に、こうして得られた第１抗体を不溶性支持体に結合
させる。不溶性支持体としては、ポリスチレンチューブ
、ポリスチレン球、シリコーン片、マイクロプレートな
どが挙げられるが、特にポリスチレン球が好ましい。こ
れらの不溶性支持体に結合させる方法は公知の化学的方
法、物理的方法のいずれの方法でも良い。例えば物理的
方法としては、抗体を適当な緩衝液に溶解し、前記不溶
性支持体を添加して、０℃〜室温にて数時間乃至−夜、
好ましくは４〜２０℃にて４〜１６時間放置した後、生
食水などで、洗浄して抗体結合不溶性支持体（以下単に
抗体結合支持体と略す）を得る方法が例示される。抗体
結合支持体は、牛血清アルブミンなどの安定剤を加えて
保存すれば少なくとも１年は安定である。

次に、前記第３抗体に標識物質を結合させた標識抗体（
以下単に標識抗体と呼ぶ）を作成する。

第３抗体は前述したようにＥＰＯと特異的に反応する第
２抗体を作成した動物種の免疫グロブリンに対する抗体
である。例えば、第２抗体がマウス由来モノクローナル
抗体であれば、第３抗体はマウスの免疫グロブリンに対
する抗体であり、該第２抗体が、ウサギで作成された抗
体であれば、第３抗体はウサギの免疫グロブリンに対す
る抗体である。ここで標識物質としては、酵素、アイソ
トープ、蛍光物質、金属などが挙げられるが特に酵素が
好ましい。さらに酵素としては西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ。

β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ。

グルコースデヒドロゲナーゼなどが好適であるが、特に
西洋ワサビペルオキシダーゼが有利である。これらの酵
素を第３抗体に結合させる方法は、公知方法で実施でき
る。例えば、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成し
たアルデヒド基と第３抗体のアミノ基とを結合させる方
法、或は酵素にマレイミド基を導入し、第３抗体に存在
するチオール基とを結合させる方法等が例示される。

こうして得られた抗体結合支持体及び標識抗体を用いて
ＥＰＯを測定するには、次のようにして行なう。まず抗
体結合支持体に、ＥＰＯを含む被検液及びＥＰＯと特異
的に反応する第・２抗体を０℃〜５０℃にて１時間乃至
１夜好ましくは１５〜３７℃にて２〜４時間反応させる
。ここでＥＰＯを含む被検液とは血清、血漿、尿などを
示す。また抗体結合支持体に結合させである第１抗体と
前記第２抗体は、異なる動物種で作成された抗体でなけ
ればならない。即ち第１及び第２抗体を同種の動物で作
成すると、その動物の免疫グロブリンに対する第３抗体
に標識物質を標識した標識抗体が、ＥＰＯの存在量とは
無関係に結合してしまい事実上測定できなくなるからで
ある。

次に前述した様にして反応させた抗体結合支持体上には
、ＥＰＯの結合量に比例して第２抗体が結合しているの
で、更に標識抗体を０〜５０℃にて１時間〜１夜、好ま
しくは１５〜３７℃にて２〜４時間反応させると、前記
抗体結合支持体上にはＥＰＯの結合量に比例して標識抗
体が結合することになる。従ってこの標識抗体の標識物
質の量を測定し、予め作成した検量線より被検液中のＥ
ＰＯを測定することができる。ここで標識物質として酵
素を用いた場合は、その酵素活性を測定すれば良く、ア
イソトープであれば放射能量をカウントすれば良い。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例により限定されるものではない。

実施例１ （ａ）抗体結合支持体の調製 ポリクローナル抗体の作成−エリスボエチンに対するポ
リクローナル特異抗体の作成は、純化ＥＰＯ（貧血患者
尿由来）を抗原として使用し、ウサギに対し次のとおり
３回の免疫を行なうことにより抗血清を作成し、常法に
従ってＩｇＧ精製を行なうことにより行なった。

第１回免疫−ＰＢＳ中に純化ＥＰＯを４００μｇ／ｍｊ
Ｚとなる様に溶解し、これに等量のフロイント完全アジ
ュバントを混合して得たエマジョン１．５ｎｊ！をウサ
ギ（約２　ｋｇ）に対しを椎にそって１５〜２０カ所に
皮下注射を行なって投与した。

第２回免疫−２週間後に、第１回免疫と同様の方法でエ
マルジョンｔ　　ｍｉを１０〜１５カ所に投与した。

第３回免疫−さらに２週間後に、ＰＢＳに対し２００μ
ｇ　／ｍｊｌで溶解した抗原を用い、同様にして得たエ
マルジョン１　　ａｌｌを１０カ所に投与した。

第３回免疫の前日に少量の血液を試験採血し、その血清
中に含まれる抗ＥＰＯ活性を調べ、第３回免疫（最終免
疫）の１週間後に全採血を行ない、常法により血清分離
を行なって抗ＥＰＯ血清を得た。抗ＥＰＯ血清からの抗
ＥＰＯ−１ｇＧの調製は常法に従い、５０％硫安沈殿、
ＤＥＡＥ−セルロース未吸着画分を取得することにより
行なった。

次に、ポリスチレン球（直径６．４ｍｍ　）　１００個
に、０．１　Ｍ−ＮａＨＣＯｓに溶解した第１抗体を２
０ｎｌ添加し、４℃で１６時間放置後洗浄して抗体結合
ポリスチレン球を得た。

（ｂ）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧの調製 ペルオキシダーゼ（東洋紡製）５ｍｇに０．０８ＭのＮ
ａＩＯ４を０．２ｍＪｌ添加し、室温で２０分反応させ
、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）に対して一夜透析し
た。透析後ｐＨを９．５に調整し、抗マウスＩｇＧ（ウ
サギに免疫、ＤＡＫＯ社製）を５ｍｇ加えて室温を２時
間反応させ、水素化硼素ナトリウムを加えて還元し、全
反応液をセファデックスＧ−２００にてゲル濾過し、活
性画分を集めてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧを
得た。

（ｃ）ＥＰＯの測定 第２抗体としては、モノクローナル抗ＥＰＯ抗体（マウ
スに免疫、特開昭５９−１５５３９５号公報参照）を用
いた。

ポリスチレンチューブ（１２ｘ７５ｍｍ）に（ａ）で調
製した抗体結合ポリスチレン球１個、ＥＰＯを含む試料
５０　μ４２．０．０１Ｍ燐酸緩衡緩衝液０μｍを添加
して３７℃で２時間反応させ、生食水で洗浄した。次に
モノクローナル抗ＥＰＯ抗体（１，０００倍希釈）を２
５０μｍ添加し３７℃で２時間反応させて生食水で洗浄
した。

一方（ｂ）で得たペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ
を、０，５％牛血清アルブミン過燐酸緩衝液で７００倍
に希釈して２５０μｍ添加し、３７℃で２時間反応させ
て生食水で洗浄した。次に、０−フェニレンジアミン３
　ｍｇ／ｍＪ２、Ｈ２Ｏ２０，０２％を含むくえん酸緩
衝液を５００μ℃添加し、室温で１時間反応させた。更
にｌＮ−Ｈ２ＳＯ４を２ｆｆｌｆｔ加えて反応を停止し
、反応液の４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。

第１図に得られたＥＰＯの標準曲線を示す。

第１図から求められるＥＰＯの検出感度は１０ｍ１Ｉ／
ｍｊ！でありた。

実施例２ （ａ）抗体結合支持体の調製 ポリスチレン球（直径６．４ｍｍ　）　１００個に、０
．１　Ｍ−ＮａＨＣＯ，に溶解したモノクローナル抗Ｅ
ＰＯ抗体（マウスに免疫、特開昭５９−１５５３９５号
公報参照）を２０ｎｌ添加し４℃で１６時間放置後洗浄
して抗体結合ポリスチレン球を得た。

（ｂ）ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧの調製 実施例１．（ｂ）テ抗マウスＩ　ｇＧ　（ＤＡＫＯ製）
の替りに、抗ウサギＩｇＧ（ヤギに免疫、Ｃａｐｐｅｊ
２社製）を用いて実施例１．（ｂ）　と同様に調製した
。

（ｃ）ＥＰＯの測定 第２抗体としては、実施例１．（ａ）で得たウサギ由来
の抗体を用いた。

ポリスチレンチューブ（１２ｘ７５ｍｍ）に、（ａ）で
得た抗体結合ポリスチレン球１個、ＥＰＯを含む試料５
０μｍ、０．ＯＩＭ燐酸緩衡緩衝液０μｍを添加して３
７℃で２時間反応させ、生食水で洗浄した。次に第２抗
体を０．０１Ｍ燐酸緩衝液にて５００倍に希釈し、２５
０μｆ１．添加して３７℃で２時間反応させて生食水で
洗浄した。更に（ｂ）で得たペルオキシダーゼ標識抗マ
ウスＩｇＧを０．５％牛血清アルブミン過燐酸緩衝液で
５００倍に希釈して２５０μＬ添加し、３７℃で２時間
反応させて生食水で洗浄した。次にＯ−フニーレンジア
ミン３ｍｇ／ｉｆＬ、　Ｈ２０２０，０２％含むくえん
酸緩衡液を５００μ℃添加し、室温で１時間反応させた
。次にｌＮ−Ｈ２ＳＯ４を２　ｍｆｔ加えて反応を停止
し、反応液の４９２ｒｖにおける吸光度を測定した。こ
の方法によりＥ　Ｐ　Ｏ２５ｍＵ／ｆｆ１ｆの検出が可
能であった。

実施例３ （ａ）グルコースオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧの調
製 グルコースオキシダーゼ（東洋紡製）１０ｍｇにＮ−（
４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ
−ヒドロキシサクシイミジルエステル２ｍｇを５分毎に
数回に分けて添加し、反応液をセファデックスＧ−２５
にてゲル濾過し、酵素画分を集めて濃縮した。これに抗
マウスＩｇＧ（ウサギに免疫、ＤＡＫＯ社製）を還元し
たＩｇＧ画分とし、１０ｍｇ相当量を添加して４℃で一
夜反応させ、セファデックスＧ−２００にてゲル濾過し
、活性画分を集めてグルコースオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＧを得た。

（ｂ）ＥＰＯの測定 ポリスチレンチューブ（１２ｘ７５ｍｍ）に、実施例１
．（ａ）で得た抗体結合ポリスチレン球１個。

ＥＰＯを含む試料５０μＪＺ、　０．０１Ｍ燐酸緩衡緩
衝液０μｍを添加し、３７℃で２時間反応させて生食水
で洗浄した０次に第２抗体としてモノクローナル抗ＥＰ
Ｏ抗体（特開昭５９−１５５３９５号公報参照）ヲ用イ
、０．０１Ｍ　ｍａｌ！ｉ液ニテｔ、ｏｏｏ　倍ニ希釈
して２５０μｍ添加し、３７℃で２時間反応させて生食
水で洗浄した０次に（ａ）で得たグルコースオキシダー
ゼ標識抗マウスＩｇＧを、０．５％牛血清アルブミン過
燐酸緩衝液で４００倍に希釈し、２５０μｌ添加して３
７℃で２時間反応させて生食水で洗浄した。次に、０．
１％ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、　０．００２％ペル
オキシダーゼ。

２％グルコースを含む基質液２５０μ℃を加え、３０ｔ
で１時間反応させ、グリシン−Ｎ　ａ　ＯＨ１１１衡液
で反応を停止し、励起波長３２０　ｎｍ、蛍光波長４５
０ｎｍにて蛍光強度を測定した。この方法では、ＥＰＯ
の１２０　ｍｕ／ｍＩＬの検出が可能であった。

実施例４ （ａ）グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐ
ＤＨ）標識抗マウスＩｇＧの調製Ｇ６ＰＤＨ（東洋紡製
）５ｍｇにＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル
）マレイミドのＮ−ヒドロキシサクシイミジルエステル
２ＩＩＩｇを添加し、３０℃にて１時間反応させた。反
応液をセファデックスＧ−２５にてゲル濾過し、酵素画
分を集めて濃縮した。これに、抗マウスＩｇＧ（ウサギ
に免疫、ＤＡＫＯ社製）を還元して得られた還元ＩｇＧ
５ｍｇを添加して４℃で一夜反応させ、ウルトロゲルＡ
ｃＡ４４にてゲル濾過し、活性画分を集めてＧ６ＰＤＨ
ｍ識抗マウスＩｇＧを得た。

（ｂ）ＥＰＯの測定 ポリスチレン製マイクロプレート（コースタ−社）の各
ウェルに、実施例１（ａ）で得たＮ１抗体を５ｏｔ１ｘ
ｌ加し、４℃にて一夜反応させて洗浄した。次に各ウェ
ルにＥＰＯを含む試料５０μｍを添加し、３７℃で２時
間反応させて洗浄した。

さらに第２抗体としてモノクローナル抗ＥＰＯ抗体（マ
ウスに免疫、特開昭５９−１５５３９５号公報参照）を
用い、Ｏ，ＯＩＭ燐酸綴衡緩衝液１，０００倍に希釈し
て５０μｍ添加し、３７℃で２時間反応させて洗浄した
。次に（ａ）で得た０６ＰＤＨ標識抗マクスＩｇＧを０
．５％牛血清アルブミンを含む燐酸緩衝液で７５０倍に
希釈し、５０ｕｆ）、添加して３７℃で２時間反応させ
て洗浄した。次に３０ｍＭグルコース−６−燐酸及び２
ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
から成る基質溶液２００μ℃を各ウェルに添加し、３７
℃で３０分間反応させた後、ルシフェラーゼ（東洋紡製
）、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ（東洋紡製
）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）及びデカナー
ルから成る発光分析用基質に前記反応液を添加して、生
成する発光量からルミネッセンスメーターＴ　Ｄ　−４
０００（ラボナイエンス社製）で還元型ＮＡＤ　（ＮＡ
ＤＨ）の量を測定した。その結果、５　ｍｌＩ／ｎｕの
ＥＰＯ測定が可能であった。

［発明の効果コ ＥＰＯ量を測定する場合、一般的に抗体の力価が低く、
前述した様な従来法では必ずしも満足な測定感度が得ら
れなかったが、本願発明では第３抗体で結合量を増幅さ
せることにより高感度にＥＰＯを測定できるようになっ
た。即ち本発明によれば、ＥＰＯに対する第２抗体の力
価が低い場合でも、正常血中濃度が１０〜２０　ｍｕ／
ｍＪＺ（０，１〜０．３ｎｇ／　ｒａｆｔ　）と極めて
微量であるＥＰＯを高感度で測定することができる様に
なった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明におけるＥＰＯ標準曲線である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. エリスロポエチンと特異的に反応する第１抗体を不溶性
   支持体に結合させた抗体結合不溶性支持体に、エリスロ
   ポエチンを含む被検液、及びエリスロポエチンと特異的
   に反応し且つ前記第１抗体とは異なる動物種に免疫して
   得られた第２抗体を反応させた後、前記第２抗体を作成
   した動物種の免疫グロブリンと特異的に反応する第３抗
   体に標識物質を結合させた標識抗体を反応させ、前記抗
   体結合不溶性支持体上に結合した前記標識抗体の量を測
   定するか、若しくは結合しなかった標識抗体の量を測定
   することにより前記被検液中のエリスロポエチンの量を
   測定することを特徴とするエリスロポエチンの免疫学的
   測定法。