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Die
Erfindung betrifft Verbesserungen bei und in Bezug auf diagnostische
Testverfahren, insbesondere Transcobalamin-Tests.
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Cobalamin
oder Vitamin B12 ist ein wasserlösliches
Vitamin, welches Teil des in Lebensmitteln zu findenden Vitamin
B-Komplexes ist. Das Kernmolekül
besteht aus einem Corrinring mit 4 Pyrroleinheiten, die das essentielle
Cobaltatom umgeben. Cobalamin ist das einzige Vitamin, das von Tieren
oder Pflanzen nicht synthetisiert werden kann und aus der Nahrung über den
Darm absorbiert werden muss. Es kann allerdings in der Leber gespeichert
werden. Es wird von Mikroorganismen, insbesondere von anaeroben
Bakterien und Hefen, synthetisiert.
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In
vivo wirkt Cobalamin als Coenzym, und Cobalaminenzyme katalysieren
drei Arten von Reaktionen: (i) intramolekulare Umlagerungen, z.
B. die Bildung von Succinyl-CoA
auf L-Methylmalonyl-CoA; (ii) Methylierungen, z. B. die Bildung
von Methionin durch Methylierung von Homocystein; und (iii) Reduktionen
von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden in einigen Mikroorganismen.
Von Säugern
ist bekannt, dass lediglich zwei enzymatische Reaktionen, nämlich die
oben unter (i) und (ii) speziell erwähnten, Cobalamin als Coenzym
benötigen.
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Ein
Haptocorrin genanntes Speichelprotein, das im Folgenden als HC bezeichnet
wird (und von der Fachwelt auch als R-Binder oder kollektiv als Transcobalamine
I und III bezeichnet wird) bindet während des Verdauungsprozesses
im oberen Verdauungstrakt Cobalamin, wobei sich ein magengängiger Komplex
bildet. Enzyme aus der Bauchspeicheldrüse verdauen den Cobalamin-Haptocorrin
(Holo-HC)-Komplex
im Ileum, wodurch Cobalamin freigesetzt wird, das dann an ein intrinsischer
Faktor genanntes Protein gebunden wird, welches von der Magenschleimhaut
sekretiert wird, wobei sich ein weiterer Komplex bildet. Der Komplex
aus Cobalamin und dem intrinsischen Faktor bindet an einen speziellen Rezeptor
auf der Auskleidung des terminalen Ileums, wonach der Komplex durch
einen Freisetzungsfaktor dissoziiert wird und das Cobalamin über die
Membran des Ileums aktiv in den Blutstrom transportiert wird.
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In
freier Form zirkuliert Cobalamin im Körper nicht in nennenswerter
Menge. Wahr scheinlich sind etwa 99% des Cobalamins von Haptocorrin,
Transcobalamin oder Albumin gebunden.
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Man
glaubt, dass das für
den Transport von Cobalamin in Zielgewebe verantwortliche Protein Transcobalamin
II (im Folgenden der Einfachheit halber als Transcobalamin oder
TC bezeichnet) ist, ein kritisches Spurenprotein, ohne das Cobalamin
Zellmembranen nicht überwinden
kann. Trotz dieser wichtigen metabolischen Funktion sind lediglich
etwa 6–25%
Cobalamin im Serum an TC gebunden und wird der überwiegende Teil von HC getragen.
TC ist ein einzelkettiges Polypeptid mit 45 kDa, das vornehmlich
in Serum, Samenflüssigkeit
und Cerebrospinalflüssigkeit
zu finden ist. Cobalamin gebundenes TC oder Holo-TC bindet an spezielle
Rezeptoren auf Zellmembranen und, einmal gebunden, wird der Holo-TC-Komplex
durch Pinocytose in Zellen aufgenommen.
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TC
wird von der Leber, dem Gefäßendothel, Enterocyten,
Macrophagen und Fibroblasten synthetisiert und zirkuliert vornehmlich
als Apo-TC, d. h. ohne gebundenes Cobalamin. Es besitzt eine kurze Halbwertzeit
von annähernd
90 Minuten.
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Weniger
als ein Viertel des gesamten Plasma-Cobalamins ist mit TC assoziiert.
Der Rest ist an HC oder Albumin, wie oben erwähnt, gebunden.
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Da
Cobalamin aus der Nahrung absorbiert werden muss, kann jeder zu
einer gestörten
Magenfunktion führender
Zustand, beispielsweise eine Gastroenteritis oder zu einer Magenatrophie
führende Zustände, oder
kann ein Unvermögen,
funktionelles Haptocorrin, funktionellen intrinsischen Faktor, funktionellen
Freisetzungsfaktor, funktionelles TC oder funktionelle TC-Rezeptoren
hervorzubringen, zu einer gestörten
Aufnahme von Cobalamin und einer damit einhergehenden Defizienz
führen.
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Bestimmte
Bevölkerungsuntergruppen,
beispielsweise Alte, schwangere Frauen, Patienten mit chronischen
oder akuten gastrointestinalen Erkrankungen, diejenigen, die an
bestimmten Autoimmunerkrankungen leiden, diejenigen mit einer familiären Vorgeschichte
für perniziöse Anämie und
AIDS-Kranke, sind für
eine Cobalamin-Defizienz
besonders anfällig.
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Die
klinischen Anzeichen für
eine Cobalamin-Defizienz sind vielfältig und zahlreich; in erster Linie
gehören
hierzu jedoch die Anämie,
megaloblastische Hämatopoese
sowie funktionelle und strukturelle Erkrankungen des Nervensystems.
Etwa 60% der Individuen, bei denen eine Cobalamin-Defizienz diagnostiziert
wird, sind anämisch,
doch bei vielen sind neurologische Symptome die einzigen beobachteten
klinischen Anzeichen. Etwa 10% der Patienten zeigen psychiatrische
Symptome und etwa 40% zeigen sowohl neurologische als auch psychiatrische Symptome.
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Um
eine gute Prognose für
Patienten sicherzustellen, ist es entscheidend, eine Cobalamin-Defizienz
früh zu
diagnostizieren, da einige der Erscheinungsformen einer Cobalamin-Defizienz,
insbesondere die neuropsychiatrischen Effekte, irreversibel sind,
wenn sie nicht rasch erkannt und durch eine Cobalamin-Therapie gelindert
werden.
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Es
ist daher wünschenswert,
den Cobalaminspiegel eines Individuums auf zweckmäßige und effiziente
Weise akkurat zu bestimmen, um festzustellen, ob das Individuum
an einer Cobalamin-Defizienz leidet.
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Die
Messung des gesamten Plasma-Cobalamins, d. h. des an HC oder TC
gebundenen Cobalamins (und Cobalamin-artiger Substanzen), wurde
bereits versuchsweise zur Beurteilung einer Cobalamin-Defizienz
verwendet. Diese Technik führt
innerhalb einer Population zu einer Konzentrationsverteilung mit
breiter Basis, die als normal angesehen wird und daher einen weiten
Referenzbereich ergibt. Individuell ist der als normal für ein bestimmtes
Individuum angesehene Bereich von zur Verfügung stehendem Cobalamin allerdings
sehr eng. Man hat beobachtet, dass selbst dann, wenn die metabolisch
aktive Cobalaminkonzentration eines Individuums den eigenen Referenzbereich
verlassen hat, der gesamte Plasma-Cobalamingehalt nichtsdestotrotz
innerhalb des als normal für
die Population angesehenen Bereichs bleibt. Unter solchen Umständen kann
eine Cobalamin-Defizienz unentdeckt bleiben. Ein derart unzuverlässiges Verfahren
ist klar unerwünscht,
und es ist hinlänglich
anerkannt, dass solche Serum- oder Plasma-Cobalaminmessungen eine
geringe diagnostische Sensitivität
und Spezifität
besitzen.
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Mikrobiologische
Tests mit Mikroorganismen, deren Wachstum von Cobalamin abhängt, sind entwickelt
und verwendet worden, um Plasma-Cobalaminkonzentrationen zu messen;
doch zusätzlich
zu der Schwierigkeit, den geeigneten Referenz bereich abzuschätzen, ist
es bei diesen Verfahren erforderlich, die Cobalamine zu extrahieren
und umzuwandeln, was sehr zeitaufwendig, störanfällig und für ein rasches Screening im
Labor vollkommen ungeeignet ist.
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Bei
alternativen Verfahren zur Beurteilung eines Cobalaminmangels misst
man die Akkumulation von Metaboliten im Plasma, die für ihre Umsetzung Cobalamin
benötigen.
Methylmalonat- und Homocystein-Plasmaspiegel nehmen in Individuen
mit Cobalaminmangel zu und stellen gute Kandidaten für Moleküle dar,
die mit einem Vitamin B12-Mangel korrelieren.
Auf der Beurteilung von Homocystein basierende Verfahren stellten
sich allerdings als kompliziert, impraktikabel und wenig spezifisch
und sensitiv heraus. Während
auf der Messung von Methylmalonat basierende Verfahren exakt und
verlässlich
sind, erfordern diese viel Aufwand und benötigen eine Analyse durch kombinierte
Gaschromatographie/Massenspektrometrie und sind daher kostspielig
und wiederum für
das routinemäßige klinische
Screening ungeeignet.
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Man
hat auch vorgeschlagen, dass die Messung von TC-gebundenem Cobalamin
im Gegensatz zum gesamten Plasmacobalamin ein verlässlicher klinischer
Indikator für
die Wahrscheinlichkeit einer Cobalamin-Defizienz sein kann (Herbert
et al. (1990) Am. J. Hematol. 34: 132–139; Wickramasinghe und Fida
(1993) J. Clin. Pathol. 46: 537–539;
US-Patent 4,680,273). Solche Anstrengungen, Holo-TC-Konzentrationen zu
bestimmen, waren meist indirekt, wobei die Holo-TC-Konzentration als
Differenz zwischen dem gesamten Plasma-Cobalamin und der Cobalaminkonzentration
von TC-abgereichertem Plasma bestimmt wurde.
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Eine
solche TC-Abreicherung kann man mittels Adsorption an Ammoniumsulfat
(Carmel (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62: 367–372), Mikrosiliciumdioxid (Herzlich & Hubert (1988)
Lab. Invest. 58: 332–337; Wickramasinghe & Fida (1993) J.
Clin. Pathol. 46: 537–539),
mikrofeines Glas (Vu et al. (1993) Am J. Hematol. 42: 202–211) oder
immobilisierte polyklonale Antikörper
(Lindemans et al. (1983) Clin. Chim Acta 132: 53–61) erreichen. Die Konzentration
von Cobalamin im Gesamtplasma und der abgereicherten Fraktion führt man
mit Verfahren durch, die in der Fachwelt hinlänglich bekannt sind, wie Radio-
oder Enzymimmunoassay-Techniken. Für ein routinemäßiges Screening,
ob automatisiert oder nicht automatisiert, sind diese Verfahren
ungeeignet, da sie komplex und zeitaufwendig sind und da der geringe
Spezifitätsgrad
der verwendeten Adsorptionsmaterialien zu einer ungenügenden zifitätsgrad der
verwendeten Adsorptionsmaterialien zu einer ungenügenden Auftrennung
von Holo-TC und Holo-HC führt,
was wiederum zu einer Überbewertung
des Holo-TC führt. Unterschiede
zwischen einzelnen Chargen des Adsorptionsmaterials sind weitere
Fehlerquellen; größte Bedeutung
ist der Tatsache beizumessen, dass die Subtraktion eines großen Volumens
von einem weiteren großen
Volumen zu unannehmbaren Ungenauigkeiten und Unzuverlässigkeiten
führt.
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Bei
weiteren Versuchen TC zu beurteilen, hat man TC von anderen Serumkomponenten,
HC eingeschlossen, unter Verwendung seiner Lipophilie abgetrennt.
In diesem Sinne beschreiben Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta
172: 297–310,
Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89: 195–199 und Toft et al. (1994)
Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 Verfahren, um TC von HC abzutrennen,
wobei man Heparinsepharose, Silicagel bzw. Cellulose verwendet.
Diese Verfahren haben allerdings denselben Nachteil wie die indirekten
Verfahren, da sie auf denselben Adsorptionsmaterialien aufbauen.
Auch die geringe Plasmakonzentration von Holo-TC macht diese Verfahren
für eine
Kombination mit bestehenden Verfahren zur Cobalaminquantifizierung
ungeeignet. Der normale Bereich von Holo-TC liegt bei 35–160 pM und
Werte unterhalb von 35 pM werden im Allgemeinen als ein Hinweis
auf eine Cobalamin-Defizienz angesehen. Die berichtete analytische
Sensivität
der meisten Routineverfahren für
Plasmacobalamin liegt bei etwa 40 pM, ist in der Praxis aber oftmals
viel höher,
typischerweise bei etwa 90 pM. Normale Plasmaspiegel von Holo-TC
liegen daher unterhalb von oder nahe an der Sensitivitätsgrenze
der Routineverfahren zur Cobalaminquantifizierung.
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Bei
dem möglicherweise
genauesten, derzeit für
die Bestimmung von TC-gebundenem Cobalamin anerkannten Verfahren
adsorbiert man TC an Siliciumdioxid und untersucht dann die gebundene
Fraktion auf den Cobalamingehalt, wobei man entweder einen Immunoassay,
wie beispielsweise von Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10:
2073–2077
beschrieben, oder einen mikrobiologischen Test verwendet, wobei
letzterer scheinbar die besten Resultate hervorbringt. Bei diesem
Verfahren benötigt
man einen gesamten Arbeitstag, um lediglich 20 Tests durchzuführen. Er
ist sehr kostspielig und impraktikabel und für routinemäßige, klinische, diagnostische Laboruntersuchungen
wenig geeignet.
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In
WO 00/17659 ist ein alternatives Verfahren zur Bestimmung von Holo-TC-Konzentrationen beschrieben,
bei dem man beispielsweise eine zellfreie Probe mit einem TC-spezifischen,
an magnetisierbaren Partikeln immobilisierten Antikörper und mit
einem nicht überlappenden,
nicht immobilisierten, radiomarkierten, holo-TCspezifischen Antikörper in Kontakt
bringt. Man trennt die Partikel unter Verwendung eines magnetischen
Feldes ab, wäscht
und bestimmt ihre Radioaktivität,
und stellt so eine Messung des Holo-TC-Gehalts der Probe zur Verfügung. Dieses
Verfahren benötigt
aber eine Eichung und ist geeigneter, in einem klinischen Laboratorium
durchgeführt
zu werden als von einem Mediziner oder einer medizinischen Assistentin
im Bereich der Krankenpflege.
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Es
gibt somit nach wie vor einen Bedarf für einen Test für Holo-TC,
der einfach ist und im Pflegebereich eingesetzt werden kann.
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Wir
haben erkannt, dass solch ein einfacher Test möglich ist, indem man nicht
den Holo-TC-Gehalt, sondern die TC-Sättigung, d. h. den in der Holo-Form
vorliegenden TC-Anteil, bestimmt, wobei man zwei markierte spezifische
Bindungspartner verwendet, einen für Holo-TC und den anderen für Apo-TC
oder für
sowohl Holo- als auch für
Apo-TC, und das Verhältnis
der Signale von den beiden Markierungen bestimmt. Ein solcher Test
ist darüber
hinaus volumenunabhängig,
d. h. die verwendete Menge der Flüssigkeitsprobe (z. B. Körperflüssigkeit) muss
nicht exakt bestimmt werden. Dies ist ein großer Vorteil bei der Verwendung
im Pflegebereich.
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Einem
Aspekt zufolge stellt die vorliegend Erfindung somit ein Testverfahren
zur Bestimmung der Transcobalaminsättigung zur Verfügung, wobei man
eine Transcobalamin enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem porösen Substrat,
auf dem ein Transcobalamin immobilisierender Ligand immobilisiert
ist, und mit einem Reportermarkierten Transcobalamin-Bindungspartner
in Kontakt bringt und Signale von Reporter-Markierungen, die auf
dem Substrat immobilisiert werden, nachweist, wobei das Verfahren
dadurch gekennzeichnet ist, dass entweder der Ligand oder der Bindungspartner
einen ersten Liganden oder Bindungspartner, der an Holo-Transcobalamin
spezifisch zu binden vermag, und einen zweiten Liganden oder Bindungspartner,
der an Apo-Transcobalamin oder an Holo- und Apo-Transcobalamin zu
binden vermag, umfasst.
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Gemäß einer
Ausführungsform
beinhaltet das Testverfahren, dass man:
- (i)
eine Transcobalamin enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem porösen Substrat,
auf der ein Transcobalamin immobilisierender Ligand immobilisiert
ist, in Kontakt bringt;
- (ii) vor, während
oder nach obigem Schritt (i) Transcobalamin der Probe mit einem
ersten und einem zweiten Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin
in Kontakt bringt, wobei der erste Bindungspartner sowohl an Holo-
als auch Apo-Transcobalamin zu binden vermag oder ein für Apo-Transcobalamin spezifischer
Bindungspartner ist und der zweite Bindungspartner ein für Holo-Transcobalamin
spezifischer Bindungspartner ist; und
- (iii) Signale von den Reporter-Markierungen der auf dem Substrat
immobilisierten Bindungspartner nachweist und daraus einen Hinweis
auf die Transcobalaminsättigung
in der Probe entnimmt.
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Alternativ
kann das Substrat einen ersten Abschnitt mit einem darauf immobilisierten
Liganden, der ein für
Holo-Transcobalamin spezifischer Bindungspartner ist, und einen
zweiten mit einem darauf immobilisierten Liganden, der ein für Apo-Transcobalamin spezifischer
Bindungspartner ist oder der sowohl Holo- als auch Apo-Transcobalamin
zu immobilisieren vermag, aufweisen und kann der Schritt (iii) den
Nachweis von Signalen aus besagten ersten und zweiten Abschnitten
beinhalten.
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Mit
spezifischem Bindungspartner oder Ligand meint man einen, der aufgrund
seiner spezifischen chemischen Struktur oder Konformation und nicht
nur aufgrund einer allgemeinen physicochemischen Eigenschaft (wie
die Lipophilie), die vielen Komponenten einer Körperflüssigkeitsprobe gemein sein
kann, an TC (d. h. Apo-TC und/oder Holo-TC je nach Bedarf) bindet.
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Der
spezifische Bindungspartner oder Ligand wird im Allgemeinen entweder
ein Antikörper, ein
Antikörperfragment,
ein Einzelkettenantikörper, ein
Antikörperfragmentendimer,
-trimer oder -tetramer, oder eine Verbindung mit Affinität zu Apo-TC und/oder
Holo-TC, beispielsweise ein Zelloberflächenrezeptor, ein Polypeptid,
ein Oligopeptid, ein Oligonukleotid, eine kleine organische Substanz,
etc. sein. Weitere spezifische Bindungspartner oder Liganden können aus
einer kombinatorischen Chemie- oder Phage-Display-Bank oder aus
spezifischen DNA- oder RNA- Bindungssequenzen
ausgewählt werden.
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Ist
der spezifische Bindungspartner oder Ligand ein Antikörper, so
kann dieser polyklonal sein; monoklonale Antikörper sind allerdings bevorzugt. Monoklonale
Antikörper
können
mit sehr viel größerer Spezifität und Gleichförmigkeit
erzeugt werden als polyklonale Antikörper, und dies verringert die Kreuzreaktitivät mit anderen
Komponenten aus der Körperflüssigkeit,
insbesondere mit HC, und gegebenenfalls der alternativen Konformation,
z. B. der Apo-Form, des Zielanalyten. Die Gleichförmigkeit und
Reproduzierbarkeit, die monoklonale Antikörper im Vergleich zu polyklonalen
Antikörpern
bieten, sorgt für
eine höhere
Genauigkeit, was für
einen Test, bei dem der Analyt in solch geringer Konzentration vorliegt,
absolut notwendig ist. Eine Alternative sind Antikörperfragmente,
z. B. ein F(ab)-, F(ab')2- oder F(v)-Fragment. Die Antikörper oder
Antikörperfragmente
können
monovalent oder divalent sein und mittels Hybridomtechnologie produziert
werden, oder synthetischen Ursprungs sein und mittels rekombinanter
DNA-Technologie oder chemischer Synthese erzeugt werden. Einzelkettenantikörper oder
weitere Antikörperderivate
oder -mimetika können
beispielsweise verwendet werden. Die Antikörper können gegen ein beliebiges Epitop,
eine beliebige Komponente oder Struktur des Apo- und/oder Holo-TC-Proteins gerichtet
sein oder dadurch ausgelöst
werden, je nachdem was zweckmäßig ist.
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Der
in dem erfindungsgemäßen Testverfahren
verwendete, für
Holo-TC spezifische Bindungspartner oder Ligand (SBP) sollte für Holo-TC
(im Gegensatz zu Apo-TC) eine Spezifität aufweisen, die wenigstens
das 10-fache, vorzugsweise wenigstens das 50-fache und noch bevorzugter
wenigstens das 100-fache beträgt,
d. h. bei einem Überschuss
von wenigstens 10 × soviel
Apo-TC als Holo-TC soll der SBP eher an Holo-TC als an Apo-TC binden.
Im Allgemeinen ist es daher bevorzugt, den Holo-TC-SBP zu selektieren,
indem man eher in vitro-Verfahren verwendet als Antikörper in
einem Wirtstier erzeugt. Dementsprechend ist es bevorzugt, für das Screening
auf Holo-TC-SBP in vitro-Banken, z. B. Phage-Display-Antikörper-Banken
(vor allem Einzelkettenantikörper-Banken)
oder Oligonukleotid- oder chemische Banken zu verwenden. Die Affinität des Holo-TC-SBP
für Holo-TC
wird darüber
hinaus bevorzugt so sein, dass nanomolare Konzentrationen Holo-TC
nachgewiesen werden können.
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Holo-TC-SBP-Kandidaten
kann man beispielsweise selektieren, indem man Holo-TC auf einem
Substrat (z. B. Kügelchen
oder Blättchen)
z. B. mittels Amidkopplung immobilisiert und die Bank im Beisein
eines Überschusses
an nicht immobilisiertem Apo-TC austestet (panning). Das Substrat
sollte dann gründlich
gewaschen werden und Holo-TC-Bindungskandidaten sollten dann freigesetzt
und mit üblichen
Mitteln je nach Typ der Bank identifiziert werden.
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Man
kann Kandidaten dann auf eine Kreuzreaktivität mit Apo-TC austesten und
Kandidaten mit einer ausreichenden Bevorzugung für Holo-TC versus Apo-TC auswählen. Es
ist erwünscht,
dass Holo-TC-SBP-Kandidaten auch gescreent werden, um SBP, die mit
HC kreuzreagieren, aus der Auswahl herauszunehmen.
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Am
bevorzugtesten sollten die bindenden Abschnitte des Holo-TC-SBP
nichtpeptidisch sein; sie können
beispielsweise kleine organische Moleküle oder Oligonukleotide (z.
B. 20- bis 50-mere) sein.
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Apo-TC-SBP-Kandidaten
können
in entsprechender Weise selektiert werden; allerdings ist es im Allgemeinen
bevorzugt, einen Holo-TC-SBP und einen nicht überlappenden TC-SBP (d. h.
einer der sowohl an Apo- als auch an Holo-TC bindet) zu verwenden,
und TC-SBP sind aus der Literatur gut bekannt (siehe beispielsweise
Quadros et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 149–154 (1996)
und McLean et al., Blood 89: 235–242 (1997)).
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Sobald
man Holo-TC-SBP-Kandidaten und TC- oder Apo-TC-SBP-Kandidaten selektiert
hat, können
diese mit konventionellen Mitteln mit Reporter-Markierungen versehen
werden.
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Die
Reporter können
gleich sein, falls verschiedene Liganden auf verschiedenen Abschnitten des
Substrats immobilisiert sind; ansonsten sollten die Reporter allerdings
unterschiedlich sein, d. h. ihre Signale sollten voneinander unterscheidbar
sein.
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Die
Reportereinheiten in den SBP können
irgendeine von den herkömmlichen
Reportern sein, z. B. Emitter oder Absorber von Strahlung, insbesondere
Emitter oder Absorber von elektromagnetischer Strahlung, Enzyme,
oder weniger bevorzugt Radiomarkierungen, etc. Im Fall von enzymatischen
Reportereinheiten werden die Nachweissignale Signale, z. B. emittiertes
Licht, aus der von dem Enzym katalysier ten Reaktion sein. Die Nachweissignale
können daher
direkt oder indirekt von den Reportereinheiten erzeugt werden.
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Einige
geeignete Beispiele farbiger oder fluoreszierender Verbindungen,
die man erfindungsgemäß verwenden
kann, um einen SBP nachweisbar zu markieren, sind Anthrachinone,
Azofarbstoffe, Azinfarbstoffe wie Oxazine und Thiazine, Triazine, natürlich vorkommende
Pigmente wie Porphyrine, Phycobiliproteine, Phycoerythrine und Phycoguanine eingeschlossen,
Chlorophylle sowie Analoga und Derivate davon, Carotenoide, Acrinidine,
Xanthene, Fluoreszeine und Rhodamine eingeschlossen, Indigofarbstoffe,
Thioxanthene, Coumarine, Polymethine, Di- und Triarylmethine sowie
Derivate davon mit Phthalocyaninen und Metallphthalocyaninen eingeschlossen,
nur um Beispiele zu nennen.
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In ähnlicher
Weise kann man ein breites Spektrum an radioaktiven Verbindungen
als signalgebende Markierungen verwenden, unter anderem Iod-125-markierte
Verbindungen.
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Alternativ
kann man den SBP an natürliche oder
synthetische Verbindungen konjugieren, die in bekannter Weise auszutestende
chemilumineszierende Signale hervorrufen (Cormier, M. J. et al.,
Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York 1973).
Zu geeigneten chemilumineszierenden Verbindungen gehören Luciferin,
Oxalsäureester,
1,2-Dioxethane, Luminol und Derivate davon, ohne jedoch auf diese
beschränkt
zu sein. Gegebenenfalls kann man Wasserstoffperoxid, Enzyme, z.
B. Luciferase, Alkalische Phosphatase oder andere Chemikalien verwenden,
um das chemilumineszierende Signal aus den verwendeten, signalhervorrufenden
Molekülen
hervorzurufen.
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Vorzugsweise
konjugiert man den SBP an ein polymeres „Gerüst", das eine Vielzahl von Reportereinheiten
trägt,
z. B. Enzyme, Chromophore, Fluorophore, etc. Auf diese Weise kann
das Signal verstärkt
werden, z. B. mehrere 100-fach. Zu typischen Polymergerüsten gehören Dextran
(z. B. Amdex), Polyethylenglykol und Dendrimere (z. B. Starburst-Dendrimere).
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Es
kann sein, dass stark anionische, signalgebende Moleküle im erfindungsgemäßen Verfahren nicht
bevorzugt zu verwenden sind, da diese dazu neigen, an Se rumproteine
wie Humanserumalbumin (HSA) zu binden, welche in der Probe zugegen
sein können.
Besonders geeignete, zu verwendende Beispiele sind Fluoreszeinisothiocyanat,
Rhodamin B oder N-(Resorufin-4-carbonyl)piperidin-4-carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester)(Resos).
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Ist
der Reporter ein Lichtemitter oder Lichtabsorber, so ist es besonders
bevorzugt (vor allem für
den markierten Holo-TC-SBP), dass der Reporter eine Vielzahl von
Chromophoren oder Fluorophoren umfasst, so dass das Signal verstärkt ist.
Eine besonders bevorzugte Gruppe von Reportern ist die Gruppe von
Reportern mit der Fähigkeit
zur zeitverzögerten
Fluoreszenz und eine andere ist die Gruppe mit der Fähigkeit,
Lumineszenz hervorzurufen. Zu speziellen Beispielen von Reportern
gehören β-Galactosidase
und Alkalische Phosphatase aus Huhn.
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Im
Fachgebiet ist es hinlänglich
bekannt, Affinitätsmoleküle, z. B.
Antikörper
und Antikörperfragmente
zu Trennzwecken, zu immobilisieren, beispielsweise durch Bindung
oder Kopplung der Liganden, gegebenenfalls mittels eines Linkers,
an irgendeinen oder irgendeine der hinlänglich bekannten festen Träger oder
Matrices, die derzeit für
Trennungen oder Immobilisierungen häufig verwendet oder vorgeschlagen
werden, und man kann irgendein im Fachgebiet bekanntes Verfahren
verwenden. Derartige feste Phasen können die Form von Partikeln, Blättchen,
Gelen, Filtern, Membranen, Fasern oder Kapillaren haben. Techniken
für die
Bindungen des Liganden an das poröse Substrat sind somit extrem gut
bekannt und häufig
in der Literatur beschrieben.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist das Substrat vorzugsweise ein poröses Blättchen oder poröser Streifen
(z. B. aus einem Material auf Cellulosebasis, vorzugsweise Nitrocellulose),
das besonders bevorzugt auf einem nichtporösen Träger angeordnet ist, gegebenenfalls
mit einem absorbierenden Material auf der Rückseite, welches dazu dient,
die Absorption der Flüssigkeitsprobe
in das Substrat durch Kapillarwirkung zu unterstützen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Substratschicht, auf der Rückseite vorzugsweise mit einer
absorbierenden Schicht versehen, auf einem Dipstick angeordnet.
Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird die auf der Rückseite vorzugsweise
mit einer absorbierenden Schicht versehene Substratschicht in einem
Plastikgehäuse
gehalten, das mit einer Öffnung
versehen ist, um die Flüssigkeitsprobe
auf die zugängliche
Oberfläche
der Substratschicht aufzutragen und um die Signale von der Substratschicht
abzulesen.
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Die
Signalerzeugung kann, soweit erforderlich, mit jedem beliebigen
für die
gewählte
Markierung geeigneten Mittel geschehen, z. B. durch Einwirkung von
Licht oder eines Substrats für
eine enzymatische Markierung, und der Signalnachweis kann mit jedem
beliebigen, zum Nachweis des emittierten Signals geeigneten Detektor
erfolgen, z. B. mit Detektoren für
Radioaktivität
oder Licht. Falls die Signale Lichtsignale sind, ist es besonders
bevorzugt, eine Digitalkamera als Detektor zu verwenden, die, falls erforderlich,
mit einem Filter, Prisma oder anderen Mitteln versehen ist, um sicherzustellen,
dass man das gewünschte
Wellenlängenband
den Detektor erreichen lässt.
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Der
Nachweis der Signale aus den zwei markierten SBP kann simultan oder
sequenziell erfolgen. Der simultane Nachweis ist bevorzugt.
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Der
Umgang mit dem nachgewiesenen Signal zur Erzeugung eines quantitativen,
semiquantitativen oder qualitativen Hinweises auf die TC-Sättigung
erfolgt zweckmäßigennreise
durch einen Computer, der vorzugsweise Teil des Gerätes ist,
das man zur Durchführung
des Tests verwendet, und der zur Leistungskontrolle des Tests ausgelegt
ist. Sind diese signalgebenden Markierungen in den SBP unterschiedlich,
ist es erforderlich, den Test in herkömmlicher Weise zu kalibrieren,
um das Signalverhältnis (Sa/Sb
oder Sa/(Sa + Sb), worin Sa das Holo-TC-SBP-Signal bzw. Sb das TC-
oder Apo-TC-SBP-Signal ist) in einen TC-Sättigungswert umzusetzen. Dementsprechend
kann der Test gewünschtenfalls
mit Eichstandards versehen werden, die Apo- und Holo-TC in bekannten
Verhältnissen enthalten.
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Gemäß einer
alternativen Ausführungsform kann
jedes erfindungsgemäße Verfahren
auf der Oberfläche
eines Chip-artigen Substrats in einem Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Detektor durchgeführt werden.
Mit einem solchen Verfahren vermeidet man die Notwendigkeit, die
spezifischen Liganden oder Substrate aktiv zu markieren; man weist
die Bindung direkt durch die zusätzliche
Masse der an die Oberfläche
gebundenen spezifischen Bindungsliganden oder spezifischen Bindungspartner nach.
Bei einem bevorzugten Beispiel dieser Alternative ist ein TCII-Binder auf der Oberfläche eines SPR-„Chips" immobilisiert (z.
B. durch ein Beschich ten des Chips mit Gold und anschließender Absorption
eines Thiol-konjugierten TCII-Binders oder durch Amidkopplung des
Binders an einen Dextran-beschichteten Chip). Der Chip wird dann
in den Oberflächenplasmonresonanz-Detektor
gegeben und man lässt
eine die Probe enthaltende Lösung über den Chip
fließen,
so dass Holo-TC und Apo-TC aus der Probe an den immobilisierten
Liganden binden. Dann lässt
man eine einen ersten spezifischen Binder mit Spezifität für Apo-TC
oder mit Spezifität
sowohl für Apo-TC
als auch Holo-TC über
den Chip fließen
und bestimmt die Bindung mittels Oberflächenplasmonresonanz, was ein
erstes Signal ergibt. Diesen ersten spezifischen Binder wäscht man
dann gegebenenfalls ab und gibt einen zweiten spezifischen Binder mit
Spezifität
für Holo-TC über den
Chip. Ein zweites Signal, das für
die Bindung an Holo-TC steht, weist man mittels Oberflächenplasmonresonanz
nach. Dieser Unterschied zwischen dem ersten und dem zweiten SPR
verwendet man dann, um die TCII-Sättigung auszurechnen. Indem
man SPR verwendet, kann man beliebige als „markiert" oder „Reporter-markiert" bezeichnete, spezifische
Bindungspartner anhand von Masse ohne irgendeine zusätzliche oder
aktive Markierung nachweisen. In diesem Fall stellt einfach die
Masse des spezifischen Bindungspartners oder Liganden die „Markierung" dar.
-
Die
auf das Substrat aufgetragene Probe ist vorzugsweise eine Körperflüssigkeit
oder eine von Gewebe abstammende Flüssigkeit, vorzugsweise eine
zellfreie Flüssigkeit,
insbesondere Plasma oder Serum, eines Säugers, vor allem eines Menschen.
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Einem
weiteren Aspekt zufolge betrifft die Erfindung ein Testkit, umfassend:
ein
poröses
Substrat, auf dem ein TC-immobilisierender Ligand immobilisiert
ist;
einen ersten und einen zweiten Reporter-markierten Bindungspartner
für Transcobalamin,
wobei der erste Bindungspartner sowohl an Holo- als auch Apo-Transcobalamin
zu binden vermag oder ein spezifischer Bindungspartner für Apo-Transcobalamin
ist und der zweite Bindungspartner ein spezifischer Bindungspartner
für Holo-Transcobalamin
ist;
gegebenenfalls ein Waschagens;
gegebenenfalls ein
Substrat für
eine enzymatische Reporter-Markierung;
gegebenenfalls wenigstens
einen Apo- und Holo-TC in einem bekannten Verhältnis enthaltenden Eichstandard;
und
gegebenenfalls einen Detektor, der Signale von den Reporter-Markierungen
nachzuweisen vermag.
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Bei
einem alternativen Format kann man die Transcobalaminsättigung
bestimmen, indem man zwei Liganden an unterschiedliche Abschnitte
des Substrats bindet, wobei ein erster Ligand Holo-TC immobilisiert
und ein zweiter Ligand Apo-TC (oder Apo- und Holo-TC) immobilisiert,
und man das Substrat mit der TC enthaltenden Probe und einem Reporter-markierten
SBP für
TC in Kontakt bringt. In dieser Form, die einen weiteren Aspekt
der Erfindung bildet, liest man die Signale aus den verschiedenen Abschnitten
des Substrats ab, und das Signalverhältnis Sa/(Sa + Sb) oder Sa/Sb
(worin Sa das Signal für den
Holo-TC-Ligandenabschnitt und Sb das Signal für den Apo-TC- oder Holo- und
Apo-TC-Ligandenabschnitt ist) ist ein Hinweis auf den TC-Sättigungsspiegel.
Die „Abschnitte" des Substrats können diesem
oder weiteren Aspekten der Erfindung zufolge beispielsweise verschiedene
Flächen
auf der Oberfläche
einer Membran, verschiedene Membranoberflächen auf einem Dipstick, verschiedene
Membranen in einem Gehäuse,
oder verschiedene Sets voneinander trennbarer Kügelchen (wobei z. B. ein Set magnetisierbar
ist, das andere aber nicht) sein.
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Bei
diesem Format beinhaltet das erfindungsgemäße Testverfahren typischerweise,
dass man
- (i) eine Transcobalamin enthaltende
Flüssigkeitsprobe
mit einem porösen
Substrat, auf dem ein erster und ein zweiter Transcobalamin immobilisierender
Ligand in verschiedenen Abschnitten des Substrats immobilisiert
ist, in Kontakt bringt, wobei der erste Ligand an Holo-Transcobalamin spezifisch
zu binden vermag und der zweite Ligand Apo- oder Apo- und Holo-Transcobalamin zu
immobilisieren vermag;
- (ii) vor, während
oder nach Schritt (i) Transcobalamin der Probe mit einem Reporter-markierten
Bindungspartner für
Transcobalamin in Kontakt bringt; und
- (iii) Signale von den Reporter-Markierungen des in verschiedenen
Abschnitten auf dem Substrat immobilisierten Bindungspartners nachweist
und daraus einen Hinweis auf die Transcobalaminsättigung in der Probe entnimmt.
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Einem
weiteren Aspekt zufolge betrifft die Erfindung ein Testkit, umfassend:
ein
poröses
Substrat, auf dem ein erster und ein zweiter Transcobalamin immobilisierender
Ligand in verschiedenen Abschnitten des Substrats immobilisiert
ist, wobei der erste Ligand an Holo-Transcobalamin spezifisch zu
binden vermag und der zweite Ligand Apo- oder Apo- und Holo-Transcobalamin
zu immobilisieren vermag; und
einen Reporter-markierten Bindungspartner
für Transcobalamin;
gegebenenfalls
ein Waschagens;
gegebenenfalls ein Substrat für eine enzymatische Reporter-Markierung;
gegebenenfalls
wenigstens einen Apo- und Holo-TC in bekannten Verhältnissen
enthaltenden Eichstandard; und
gegebenenfalls einen Detektor,
der Signale von den Reporter-Markierungen nachzuweisen vermag.
-
Die
Erfindung wird nun anhand der folgenden, nicht beschränkenden
Beispiele und Zeichnungen genauer beschrieben, worin:
-
1 ein
Substrat darstellt, auf dem TC-Liganden immobilisiert sind;
-
2 ein
Substrat mit zwei Abschnitten darstellt, wobei einer immobilisierte
Liganden mit Spezifität
für Holo-TCII
enthält
und ein zweiter immobisierte Liganden mit Spezifität für Apo-TCII
aufweist; und
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3 einen
Chip in einem Oberflächenplasmonresonanz-Detektor
mit auf der Oberfläche
immobilisierten Antikörpern
für TC
darstellt.
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In 1 steht „Markierung-spb1" für einen ersten
spezifischen Bindungspartner mit einer ersten angehängten Markierung
und steht „SBP-Markierung2" für einen
zweiten spezifischen Bindungspartner mit einer zweiten angehängten Markierung.
Es ist ersichtlich, dass das Signal von Markierung1 dem Holo-TC-Spiegel
und das Signal von Markierung2 den gesamten Apo- und Holo-TC-Spiegeln
entspricht.
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In 2 ist
ersichtlich, dass Holo-TCII an den ersten (links gelegenen) Abschnitt
und Apo-TCII an den zweiten (rechts gelegenen) Abschnitt gebunden
ist. „SBP-Markierung" steht für einen
spezifischen Bindungspartner für
TC mit einer ange hängten Markierung.
Auf diese Weise stehen die Signale aus den beiden Abschnitten für den Holo-TC-
bzw. Apo-TC-Gehalt.
-
In 3 ist
eine Chipoberfläche
dadurch modifiziert, dass ein erster monoklonaler Antikörper (mAb1)
angehängt
ist. Dieser bindet an Apo-TC und an Holo-TC aus der Probe. Der zweite
Antikörper (mAb2)
bindet ebenfalls entweder an Holo-TC oder Apo-TC, womit sich ein
SPR-Signal für
den TC-Gesamtgehalt ergibt, wenn dies zugegeben wird. Der dritte
Antikörper
(mAb3) bindet lediglich an Holo-TC und ergibt somit ein SPR-Signal,
das für
den Holo-TC-Gehalt steht.
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BEISPIEL 1 – Erzeugung
eines Holo-TC-SBP
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A) Immobilisierung von
Holo-TC auf Kügelchen
-
Man
vermischt 1 ml von 0,2 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC)
in 0,1 M 2-(N-Morpholin)-ethansulfonsäure (MES), pH 5,0, mit 1,0
ml 2% (G/V) Carboxylat-modifizierten Kügelchen (1 μm Durchmesser; Merck-Estapor)
in 0,1 M MES, pH 5,0. Man behandelt das Gemisch in einem Bad mit
Schall, um die Reagenzien zu dispergieren und rotiert es dann 1
Stunde bei Raumtemperatur kopfüber.
Man zentrifugiert das Gemisch bei 300 g und wäscht das Pellet mit 0,1 M MES,
pH 7,0, zentrifugiert und suspendiert erneut in 1,0 ml entionisiertem
Wasser. Die EDAC-aktivierten Kügelchen
vermischt man in kleinen Plastikvials mit demselben Volumen von
1 mg/ml Holo-TC in 0,1 M 3-[N-Morpholino]-propansulfonsäure (MOPS),
pH 7,5, und rotiert über
Nacht bei Raumtemperatur. Danach wäscht man das Gemisch zweimal
mit 0,05% Tween 20 (aq) und zweimal mit 50 mM Tris-Puffer, pH 7,4,
der 5 mg/ml BSA enthält.
Die beschichteten Kügelchen
mit einer Holo-TC-Schicht
(Mono) von etwa 10 μg/mg
werden bei 0,1% in 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl und 1 mg/ml BSA
aufbewahrt.
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B) (i) Biopanning von
Aptamer-Banken mit Holo-TC als Zielmolekül
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Man
stellt eine Bank doppelsträngiger DNA-Sequenzen
mit teils chemischen, teils enzymatischen Verfahrensschritten her.
Typischerweise stellt man 1014–1015 einzelsträngige DNA (ssDNA)-Sequenzen
mit einer Länge
von 40 Nukleotiden synthetisch her und überführt diese dann mit enzymatischen Mitteln
in die doppelsträngige Form,
bevor man mittels PCR amplifiziert. Zweitens transkribiert man die doppelsträngige DNA,
was eine Bank einzelsträngiger
RNA oder modifizierter RNA ergibt. Drittens lässt man das beabsichtige Zielmolekül auf die
RNA-Bank einwirken. Man transkribiert die ausgewählten Moleküle zurück und amplifiziert dann mittels
PCR (für DNA-Banken
reicht die PCR aus). Die Untergruppe von Sequenzen, die an das Ziel
binden, stellen den Pool für
die zweite Runde des Biopanning dar. Gewöhnlicherweise benötigt der
Auswahlvorgang 7 bis 15 Runden.
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Man
amplifiziert 5 nmol einer gelgereinigten, synthetischen Templat-DNA,
die eine durch definierte Primeranlagerungssequenzen [5'-GGGAGGACGATGCGG-(N)40-CAGACGACTCGCCCGA-3'] flankierte fortlaufende
Sequenz von 40 Nukleotiden enthält,
mit Hilfe von 4 PCR-Zyklen mit den Primern 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' und 5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'. Man transkribiert etwa 800 pmol der
mittels PCR erhaltenen Templat-DNA (etwa 5 × 1014 Moleküle) in vitro mittels
T7-RNA-Polymerase (1000 U) in einem 3 ml-Transkriptionsreaktionsmedium,
das aus 40 mM TrisHCl (pH 8,0), 12 mM MgCl2,
1 mM Spermidin, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 0,002% Triton X-100 (V/V), 4% Polyethylenglycol
(G/V) und jeweils 2 mM ATP, Guanidin-5'-triphosphat
(GTP), 2'-NH2CTP und 2'-NH2UTP (CTP
= Cytidin-5'-Triphosphat
und UTP = Uridin-5'-triphosphat)
besteht. Man reinigt Transkriptionsprodukte von vollständiger Länge auf
8% Polyacrylamidgelen unter denaturierenden Bedingungen, suspendiert
in Bindungspuffer (10 mM TrisHCl, 0,1 mM EDTA, 2,5 mM MgCl2, pH 6,8), erwärmt auf 70°C und kühlt auf Eis ab.
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Man
inkubiert den RNA-Pool 15 Minuten bei 37 °C mit etwa 10 μg von dem
auf Kügelchen
immobilisierten Holo-TC und 100 μg
von frei in der Lösung vorliegendem
Apo-TC als Kompetitor. Man trennt die Kügelchen mittels Zentrifugation
ab und wäscht
sie mit 5 ml Bindungspuffer. Man eluiert gebundene RNA-Moleküle von den
Kügelchen,
indem man den pH-Wert senkt, gewinnt sie mittels Ethanolfällung und transkribiert
sie mit Hilfe der Transkriptase des Vogel-Myoleblastosis-Virus (Life
Sciences) 45 Minuten bei 48°C
mit der DNA-Sequenz 5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3' als Primer zurück. Im Anschluss an die PCR-Amplifikation
der cDNA transkribiert man das resultierende Duplex-DNA-Templat
in vitro, um RNA für
die nächste
Auswahlrunde zu erhalten. Man verringert sukzessive die Menge an
Holo-TC-beschichteten
Kügelchen
in der Bindungsreaktion, um den Selektionsdruck zuneh mend zu erhöhen. Man wiederholt
den Selektionsvorgang, bis die Affinität des angereicherten RNA-Pools
für Holo-TC
wesentlich erhöht
ist. An dieser Stelle amplifiziert man die c-DNA mittels PCR mit
den Primern 5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' und 5'-GCCGGATCCTCGGGCGAGTCGTCTG-3', die BamHI- und
HindIII-Restriktionsschnittstellen
(unterstrichen) an den 5'-
bzw. 3'-Enden der
PCR-Produkte einführen.
Man verdaut die PCR-Produkte mit BamHI und HindIII und kloniert sie
in pUC18, das man mit denselben Enzymen verdaut hat, und führt sie
mittels Elektroporation in Escherichia coli SURE (Stratagene) ein.
Man isoliert Plasmide von einzelnen Bakterienklonen und screent und
sequenziert diese, wobei man Standardtechniken verwendet, wie beispielsweise
in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, S. C1 beschrieben.
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Um
für eine
Resistenz gegen RNA-Nukleasen zu sorgen, kann man die RNA-Moleküle an der 2'-Position des Zuckers
modifizieren, beispielsweise Aminosubstituieren.
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Das
Biopanning-Protokoll bleibt im Wesentlichen gleich, ob die Bank
auf RNA-Aptameren
oder ssDNA-Aptameren basiert, oder ob die Bank unvorbereitet oder
vorbereitet ist. Der Unterschied liegt hauptsächlich darin, dass ssDNA-Banken
keine Transkription benötigen.
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(ii) Biopanning von Phagen-Display-Peptiden
oder Antikörperbanken
mit Holo-TC
-
Man
vermischt 1 pmol einer Phagen-Display-Bank mit 10 μg auf Kügelchen
immobilisiertem Holo-TC und 100 μg
Apo-TC in 100 μl
PBS-Tween mit 1 mg/ml BSA oder 3% BLOTTO. (BLOTTO steht für 5% G/V
Magermilchpulver in 100 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid,
pH 7, 4, 0,01% Antifoam A, 0,01% Thimerosal). Man inkubiert das Gemisch über Nacht
bei 5°C
und trennt die Kügelchen
mittels Zentrifugation ab, wäscht
sie neunmal mit 1 ml PBS-Tween und einmal mit normaler Kochsalzlösung, um
jegliche Pufferkapazität
zu entfernen. Man suspendiert die Kügelchen erneut in 600 μl 0,1 M Glycin-HCl-Puffer,
pH 2,2, und trennt nach 15 Minuten die Kügelchen wieder mittels 3-minütiger Zentrifugation
bei 3000 g ab. Man ent fernt den Überstand und
neutralisiert mit 36 μl
2 M Tris, pH 9,0, und vermischt mit 400 μl Escherichia coli (z. B. K91-Kan). Man
isoliert Plasmide aus einzelnen Bakterienklonen und screent und
sequenziert sie, wobei man Standardtechniken verwendet, beispielsweise
wie in Sambrook J. et al., supra beschrieben. Die Bindungs- und
Elutionsreaktionen werden wenigstens dreimal durchgeführt. In
den Bindungsreaktionen verwendet man abwechselnd BSA und BLOTTO,
um eine Anreicherung von Phagen, die an diese Proteine binden, zu
vermeiden.
-
BEISPIEL 2
-
Immobilisierung
von TC-spezifischen Bindern auf Cellulosepapier
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Man
aktiviert Cellulosepapier (z. B. Whatman Nr. 52), indem man es zunächst in
deionisiertem Wasser 3 Minuten quellen lässt und dann mit 3% CNBr (aq)
behandelt. Man erhöht
den pH-Wert durch Zugabe von 1 mM NaOH auf 10,5. Nach 30 Minuten wäscht man
das Papier mit 12 × 500
ml 5 μM NaHCO3, 2 × 500
ml deionisiertem Wasser und jeweils 2 × 500 ml von 25%, 50% und 75%
Aceton. Schließlich
wäscht
man es mit 4 × 500
ml Aceton und trocknet an der Luft bei Raumtemperatur.
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Man
koppelt anti-TC-Antikörper
kovalent an, indem man den Antikörper
auf 10 μg/ml
in 100 ml 0,1 M NaHCO3 verdünnt und
20 g geschnittenes Papier dazugibt. Man rührt das Gemisch vorsichtig
bei 4°C
3 Stunden, wäscht
es dann bei Raumtemperatur 10 Minuten mit 2 × 100 ml 0,5 mM NaHCO3, drei Stunden mit 100 ml 50 mM Ethanolamin
in 0,1 M MaHCO3, 10 Minuten mit 2 × 100 ml
0,5 mM NaHCO3, 30 Minuten mit 100 ml 0,1
M Natriumacetat, pH 4,0, und zweimal mit 50 mM Phosphatpuffer, pH
7,5, der 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20 und 0,1% Gelatine enthält. Man
bewahrt das mit Antikörpern
beladene Papier in einem kleinen Volumen dieses Puffers auf.
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Dann
fügt man
Ausschnitte des mit Antikörper
beladenen Papiers an einen flexiblen Plastikdipstick an.
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BEISPIEL 3 – Test
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Man
trägt 50
ml Humanserum auf das Membrankissen eines gemäß Beispiel 2 her gestellten
Dipsticks auf. Nach 5 Minuten wäscht
man den Dipstick mit 100 μl
Trisgepufferter Kochsalzlösung
(TBS – 100 mM
Tris, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid) und man gibt 50 μl einer Nachweislösung dazu
und inkubiert 5 Minuten. Die Nachweislösung enthält einen an β-Galactosidase
konjugierten, nicht überlappenden,
spezifisch gegen humanes TC gerichteten monoklonalen Antikörper und
einen Holo-TC-SBP
aus Beispiel 1 (oder einen nicht überlappenden, gegen humanes Holo-TC
gerichteten monoklonalen Antikpörper),
an Alkalische Phosphatase aus Huhn konjugiert. Man wäscht den
Dipstick dann mit 100 μl
TBS. Man gibt 50 μl
eines lumineszierenden Substrats für die Alkalische Phosphatase
in TBS dazu (z. B. 0,25 mM CPD-Star von Tropix). Man vermisst den
Dipstick in einem Luminometer für
eine Dauer von 1 Sekunde bis 15 Minuten. Man spült den Dipstick dann mit 100 μl PBS (Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung)
und man gibt 50 μl
eines lumineszierenden Substrats für β-Galactosidase in PBS (z. B.
0,1 mM Galacton-Star von Tropix) und einen Inhibitor der Alkalischen
Phosphatase (z. B. 40 μM
Cyclohexantrismethylensulfonat) dazu. Man liest den Dipstick dann
ein weiteres Mal in einem Luminometer ab. Während das erste Ablesen den
Holo-TC-Gehalt auf dem Dipstick ergibt, ergibt das zweite Ablesen
den TC-Gesamtgehalt. Das Verhältnis
dieser beiden Werte ergibt den nicht vom Volumen abhängenden
Wert für
die Cobalamin-Sättigung
von TC in der Probe.
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BEISPIEL 4
-
Entwicklung eines monoklonalen
Mausantikörpers mit
Spezifität
für humanes
Transcobalamin und humanes Holo-Transcobalamin
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i) Immunisierung
-
Man
immunisierte weibliche BALB/c-Mäuse i.
p. mit 20 μg
rekombinantem humanen Holo-Transcobalamin im Gemisch mit AdjuPrime
Immunmodulator (Pierce, IL, USA), gefolgt von zwei Booster-Injektionen
von 20 μg
in vierwöchigem
Abstand.
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ii) Fusion
-
Vier
Tage nach dem letzten Boost entnahm man die Milzen und fusionierte
die Milzzellen mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin; Sigma)-sensitiven
Plasmazytomen OUR1 (einem Unterklon von X63-Ag8.653), wobei man
dazu PEG (Boehrin ger Mannheim, Deutschland) verwendete. Man verteilte die
Fusionsprodukte auf 5 × 96
F-Platten (Nunc) in Gegenwart von HAT in Kulturmedium (DMEM/Ham's F12 (Invitrogen)
plus 10% CPSR3 (Sigma)). Nach einer Woche fütterte man die Fusionen mit
HT-haltigem Kulturmedium (Sigma).
-
iii) Primäres Screening
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Nach
zwei Wochen screente man das Medium von den Hybridomen, wobei man
einen Festphasen-Einfangtest verwendet. Man vermischte die Zellmedien
mit 10 μl
einer 1% (G/V) Suspension von 1 μm
magnetisierbaren Kügelchen,
die mit einem gegen Maus-IgG gerichteten Schaf-Antikörper (Merck-Estapor,
Frankreich) beschichtet waren und hielt die Zellmedien 1 Stunde
bei Raumtemperatur. Man isolierte die magnetisierbaren Kügelchen
mit gebundenem monoklonalen Maus-Antikörpern, indem
man einen Magneten verwendete, und man wusch sie viermal mit 1 ml
Phosphatpuffer, pH 7,2, 0,15 M NaCl und 1 mg/ml Rinderserumalbumin.
Man suspendierte gewaschene Kügelchen
erneut in 100 μl
gepooltem Humanserum (Scantibodies, USA), das man zuvor mit 57Co-markiertem Cobalamin (ICN, USA) behandelt
hatte, um Apo-Transcobalamin im Serum in 57Co-markiertes
Holo-TC zu überführen. Man
hielt die Gemische 30 Minuten bei Raumtemperatur und isolierte die
Kügelchen,
indem man einen Magneten verwendete. Die mit den Kügelchen
verbundene Radioaktivität
zählte
man in einem Gammazähler.
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iv) Klonierung
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Vertiefungen,
die hinsichtlich Anti-Transcobalamin-Antikörper-positiv waren, klonierte
man durch limitierende Verdünnung
auf Platten mit 96 Vertiefungen F(Nunc), die zuvor mit peritonealen
Fütter-Balb/c-Zellen
(10.000 pro Vertiefung) beimpft worden waren. Man wählte positive
Klone aus und klonierte erneut, bis 100% der Unterklone spezifische Antikörper produzierten.
Man fror die Zellbestände,
in 10% DMSO (Sigma) enthaltendem CPSR3 (Sigma) in flüssigem Stickstoff
ein.
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Sekundärscreening.
Man isolierte die Antikörper
aus den Zellmedien auf magnetisierbaren Kügelchen, wie zuvor beschrieben.
Man vermischte 10 μl
antikörperbeschichtete
Kügelchen
mit Serum, das zuvor mit 57Co, wie oben
beschrieben, im Beisein zunehmender Konzentrationen von rekombinantem
humanen Apo-Transcobalamin
oder rekombinantem humanen Holo-Transcobalamin.
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Man
selektierte zwei Anti-Transcobalamin-Antikörper (mAb1 und mAb2) anhand
ihrer Affinität
für sowohl
Apo- als auch Holo-Transcobalamin, und man selektierte einen monoklonalen
Antikörper (mAb3)
anhand der Spezifität
für Holo-Transcobalamin.
Die jeweiligen Klone expandierte man in vitro in Tecnomouse, CL1000.
Man reinigte die Antikörper aus
dem Zellmedium mittels Protein A-Affinitätschromatographie. Kurzum,
man verdünnte
den Antikörper-haltigen
Kulturüberstand
1 : 1 in 0,1 M Tris, pH 8,0, das 1 M NaCl (Bindungspuffer) enthielt,
und gab ihn auf eine Protein-A-Säule,
die zuvor mit Bindungspuffer äquilibriert
worden war. Dann wusch man die Protein-A-Säule ausgiebig mit 15 Säulenvolumina Bindungspuffer.
Man eluierte den Antikörper
mit 0,1 M Citratpuffer, pH 4,0, den man mit 1 M Tris-Puffer pH 8,
auf pH 7,0 neutralisierte und auf einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia)
auf 0,1 M Phosphat, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCl, umpufferte.
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BEISPIEL 5
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Immobilisierung des TC-spezifischen
monoklonalen Antikörpers
mAb1 auf Dextran-beschichteter
Oberfläche
-
Man
aktivierte die carboxylierte Oberfläche des Dextran-beschichteten
Chips (Pharmacia, Schweden) mit 0,05 M N-Hydroxysuccinimid (NHS)/0,2
M N-ethyl-N'-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimidhydrochlorid
(EDC), spülte
mit deionisiertem Wasser und beschichtete kovalent mit mAb1 (aus
Beispiel 4) bei 50 μg/ml
in 0,01 HEPES-Puffer, pH 7,4, der 0,15 M NaCl, 0,003 M EDTA und
0,005% Polysorbat (HBS) enthielt. Nicht umgesetztes NHS blockierte
man mit 1 M Ethanolamin, und man wusch den Chip ausgiebig mit HBS.
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BEISPIEL 6
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Bindung von Holo-Transcobalamin,
mAb2 und mAb3 an immobilisiertem mAb1
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Man
beobachtete die Bindungsereignisse in Realzeit, wobei man Oberflächenplasmonresonanz verwendete
und auf einem Biocore-Instrument (Biacore, Schweden) arbeitete.
Man maß die
Menge an freiem Liganden, der an den Chip band, als Antworteinheiten
(RU für „response
units"), was sowohl die
Masse des bindenden Liganden als auch seine Affinität für das immobilisierte
Ziel wiedergibt. Man führte
den Chip mit immobilisiertem mAb1 (Beispiel 5) in das Instrument
ein, wonach man 5 μl
100 nM Holo-Transcobalamin, 5 μl
50 μg/ml
mAb2 und 5 μl
50 μg/ml
mAb3 sukzessive injizierte, wobei man zwischen jedem Schritt wusch.
Nach dem Durchfluss von Holo-Transcobalamin durch das Instrument
banden 565 RU mAb3 an den immobilisierten mAb1. In Abwesenheit von
Holo-Transcobalamin, banden weder mAb2 noch mAb3 an den Chip mit
dem immobilisierten mAb1.