NO331783B1 - Transkobalamin-metning testmetode samt sett for a utfore slik testing - Google Patents

Abstract

Det beskrives en testmetode for påvisning av transkobalamin-metning, hvor en transkobalamin-holdig flytende prøve kontaktes med et porøst substrat som på dette har immobilisert en transkobalamin-immobiliserende ligand, og med en rappportørmerket transkobalamin bindingspartner, og hvor signaler fra rapportør- merkingene som immobiliseres på nevnte substrat, påvises, og som kjennetegnes ved at en av nevnte ligand eller nevnte bindingspartner omfatter en første ligand eller bindingspartner som er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, og en andre ligand eller bindingspartner som er i stand til binding til apo-transkobalamin eller til holo- og apo-transkobalamin.

Description

Oppfinnelsen vedrører forbedringer ved, og med relasjon til diagnostiske testmetoder, særlig tester for transkobalamin.

Kobalamin eller vitamin B12er et vannløselig vitamin som utgjør en del av det vitamin B-kompleks som finnes i næringsmidler. Kjernemolekylet består av en korrin-ring av fire pyrrolenheter som omgir det essensielle koboltatom. Kobalamin er det eneste vitamin som ikke kan syntetiseres av dyr eller planter og som må absorberes fra næringsmidler i tarmen. Det kan imidlertid lagres i leveren. Det syntetiseres av mikroorganismer, særlig av anaerobe bakterier og gjær.

Kobalamin virker in vivo som et koenzym, og kobalaminenzymer katalyserer tre reaksjonstyper: (i) intramolekylære omleiringer, for eksempel dannelsen av succinyl-CoA fra L-metylmalonyl CoA; (ii) metyleringer, for eksempel dannelsen av metionin ved metylering av homocystein; og (iii) reduksjon av ribonukleotider til deoksyribonukleotider i enkelte mikroorganismer. Hos pattedyr er bare to enzym-reaksjoner, nemlig de som er nevnt under (i) og (ii) ovenfor, kjent å fordre kobalamin som et koenzym.

Under fordøyelsesprosessen binder et salivprotein betegnet haptokorrin, heretter omtalt som HC (som på dette området også kollektivt omtales som R-binder eller transkobalamin I og III), kobalamin i den øvre gastrointestinaltrakt under dannelse av et kompleks som passerer gjennom mavesekken. Pankreasenzymer oppslutter kobalamin-haptokorrin- (holo-HC) komplekset i ileum under frigjøring av kobalamin som så bindes til et protein kalt intrinsisk faktor, som utskilles av mave-slimhinnen under dannelse av et ytterligere kompleks. Kobalamin-intrinsiskfaktor-komplekset binder til en spesifikk reseptor i kledningen av den terminale ileum, hvoretter det dissosieres med en frigjørende faktor og kobalaminet transporteres aktivt gjennom ileum-membranen inn i blodstrømmen.

Kobalamin sirkulerer ikke i kroppen i fri form i noen vesentlig grad. Antagelig er omkring 99% av kobalaminet bundet av haptokorrin, transkobalamin eller albumin.

Det protein som antas å være ansvarlig for transporten av kobalamin til mål-vev, er transkobalamin II (heretter ganske enkelt omtalt som transkobalamin eller TC), et avgjørende sporprotein uten hvilket kobalamin ikke kan krysse cellemembraner. På tross av denne viktige metabolske funksjon er bare ca. 6-25% av kobalaminet i serum bundet til TC, og det meste fraktes av HC. TC er et enkeltkjedet polypeptid på 45 kDa som primært finnes i serum, sædvæske og cerebrospinal-væske. Kobalamin bundet til TC eller holo-TC, fester seg til spesifikke reseptorer på cellemembraner, og holo-TC-komplekset tas når det er bundet, inn i celler ved pinocytose.

TC syntetiseres av leveren, vaskulært endotel, enterocytter, makrofager og fibroblaster, og sirkulerer hovedsakelig som apo-TC, dvs. mangler bundet kobalamin. Det har en kort halveringstid på ca. 90 minutter.

Mindre enn fjerdedelen av det totale plasmakobalamin er assosiert med TC. Resten er bundet til HC eller albumin som nevnt ovenfor.

Siden kobalamin må absorberes fra maten, kan enhver tilstand som resulterer i nedsatt gastrisk funksjon, for eksempel gastroenteritt eller tilstander som resulterer i gastrisk atrofi, eller manglende evne til å produsere funksjonelt haptokorrin, intrinsisk faktor, frigjøringsfaktor, TC eller TC-reseptorer, resultere i nedsatt opptak av

kobalamin og resulterende mangel.

Enkelte populasjons-undergrupper, for eksempel de eldre, gravide kvinner, pasienter med kroniske eller akutte gastrointestinale sykdommer, de som lider av visse autoimmunsykdommer, de med en pernisiøs anemi i familien, samt AlDS-offere, er særlig utsatt for kobalaminmangel.

De kliniske manifestasjonene av kobalaminmangel er forskjellige og tallrike, men involverer primært anemi, megaloblastisk hematopoese og funksjonelle og strukturelle forstyrrelser av nervesystemet. Rundt 60% av de individer som diagnostiseres som kobalamin-manglende er anemiske, men hos mange er neurologiske symptomer det eneste kliniske tegn som observeres. Rundt 10% av pasientene oppviser psykiatriske symptomer og rundt 40% oppviser både neurologiske og psykiatriske symptomer.

Tidlig diagnose av kobalaminmangel er avgjørende for å sikre pasienten en god prognose, siden enkelte av manifestasjonene ved kobalaminmangel, særlig de neuropsykiatriske virkningene, er irreversible om de ikke påvises og lindres hurtig med kobalaminbehandling.

Det er derfor ønskelig å nøyaktig bestemme kobalaminnivået i et individ på en rask og effektiv måte, med henblikk på å fastslå hvorvidt vedkommende lider av kobalaminmangel eller ikke.

Måling av totalt plasmakobalamin, dvs. kobalamin (og kobalamin-lignende substanser) bundet til HC eller TC, har vært benyttet i forsøk på å bestemme kobalaminmangel. Denne teknikk resulterer i en bred konsentrasjonsfordeling innen en populasjon som ansees å være normal og fører således til et bredt referanse område. Blant individer er imidlertid det området av tilgjengelig kobalamin som ansees normalt for vedkommende, meget snevert. Det har vært registrert at selv om et individs metabolsk aktive kobalaminkonsentrasjon har beveget seg utenfor deres eget referanseområde, har deres totale plasmakobalamininnhold forblitt innenfor det området som ansees normalt for populasjonen. Under slike omstendigheter kan kobalaminmangel unnslippe påvisning. En slik upålitelig metode er selvsagt uønsket, og det er velkjent at slike serum- eller plasma-kobalaminmålinger har lav diagnostisk sensitivitet og spesifisitet.

Mikrobielle tester som involverer mikroorganismer avhengig av kobalamin for vekst, er blitt utviklet og benyttet til måling av plasmakobalaminkonsentrasjon, men i tillegg til vanskeligheten ved å anslå det riktige referanseområdet, fordrer disse metodene ekstraksjon og omdannelse av kobalaminene, noe som er meget tidkrevende, brysomt og fullstendig uegnet for hurtig laboratorie-screening.

Alternative metoder for bestemmelse av kobalaminmangel involverer måling av akkumuleringen av metabolitter i plasmaet, som fordrer kobalamin for omdannelse. Plasma-metylmalonat- og plasma-homocystein-nivåer øker hos individer med kobalaminmangel og er gode kandidatmolekyler for korrelasjon med vitamin Bi2-mangel. Metoder basert på homocysteinbestemmelse har imidlertid vist seg å være kompliserte, upraktiske og med liten spesifisitet og sensitivitet. Selv om metoder basert på metylmalonatmåling er nøyaktige og pålitelige, er de tungvinte og fordrer analyse ved kombinert gasskromatografi/massespektrometri og er følgelig kostbare og igjen uegnet for klinsk rutinemessig screening.

Det har også vært antydet at målingen av TC-bundet kobalamin i stedet for total plasmakobalamin, kan utgjøre en pålitelig klinisk indikator på sannsynligheten for kobalaminmangel (Herbert et al., (1990) Am. J. Hematol. 34:132-139; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46:537-539; US-patent 4680273). Slike bestrebelser på å bestemme holo-TC-konsentrasjon har for det meste vært indirekte, med bestemmelse av holo-TC-konsentrasjon som differansen mellom totalt plasmakobalamin og kobalaminkonsentrasjonen av TC-utarmet plasma.

Slik TC-utarming kan oppnås ved adsorpsjon til ammoniumsulfat (Carmel

(1974) Am. J. Clin. Pathol. 62:367-372), mikrosilika (Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58:332-337; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46:537-539, mikrofint glass (Vu et al. (1993) Am. J. Hematol. 42:202-211) eller immobiliserte anti-TC polyklonale antistoffer (Lindemans et al. (1983) Clin. Chim. Acta. 132:53-61). Konsentrasjonen av kobalamin i totalplasma og den utarmede fraksjon bestemmes etter velkjente metoder, så som radio- eller enzym-immunoassay-teknikker. Disse metodene er uegnet for rutine-screening enten de er automatiserte eller ikke, fordi de er komplekse og tidkrevende og fordi den lave spesifisitetsgrad av de adsorberende materialene som benyttes, resulterer i utilstrekkelig separasjon av holo-TC og holo-HC, som resulterer i en overestimering av holo-TC. Lot-til-lot-variasjon av det adsorberende materialet introdusrer ytterligere feil, og hva som er enda viktigere, resulterer subtraksjonen av et stort volum fra et annet stort volum i uakseptable unøyaktigheter og upålitelighet.

Andre forsøk på å bestemme TC har involvert separering av TC fra andre serumkomponenter, inklusivt HC, ved å benytte dets lipofilitet. Kapel et al., (1988) Clin. Chim. Acta 172:297-310, Benhayoun et al., (1993) Acta Haematol. 89:195-199 og Toft et al., (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54:62, angir således metoder for separering av TC fra HC ved å benytte henholdsvis heparin-sepharose, silikagel eller cellulose. Disse metodene lider imidlertid av den samme svakhet som de indirekte metodene, siden de baseres på de samme adsorberende materialene. Den lave plasmakonsentrasjon av holo-TC gjør dessuten at disse metodene er uegnet for kombinasjon med eksisterende metoder for kobalamin-kvantifisering. Normalområdet for holo-TC er 35-160 pM og verdier under 35 pM vil i alminnelighet bli ansett som indikasjon på kobalaminmangel. Den rapporterte analyttiske følsomhet av de fleste rutinemetoder for plasmakobalamin er ca. 40 pM, men er i praksis ofte meget høyere, typisk omkring 90 pM. Normale plasmanivåer av holo-TC er således under eller nær sensitivitetsgrensen for rutinemetodene for kobalamin-kvantifisering.

Den kanskje mest nøyaktige metode som for tiden kjennes for bestemmelse av TC-bundet kobalamin involverer adsorbering av TC til silika og påfølgende bestemmelse av den bundne fraksjon med henblikk på kobalamininnhold ved å benytte enten en immunoassay som beskrevet for eksempel av Kuemmerle et al.,

(1992) Clin. Chem. 38/10:2073-2077, eller en mikrobiologisk bestemmelse, hvor sistnevnte tilsynelatende gir de beste resultater. Denne metode fordrer en hel arbeidsdag for å foreta kun 20 bestemmelser. Den er meget kostbar og upraktisk og lite egnet for rutinemessige kliniske diagnostiske laboratorieundersøkelser.

I WO 00/17659, en alternativ metode for bestemmelse av holo-TC-konsentrasjon, bringes for eksempel en cellefri prøve i kontakt med et antistoff som er spesifikt for TC, immobilisert på magnetiserbare partikler, og med et ikke overlappende, ikke immobilisert radiomerket antistoff spesifikt for holo-TC. Partiklene skilles ut ved å benytte et magnetfelt, hvorpå de vaskes og deres radioaktivitet måles for å gi et mål på holo-TC-innholdet i prøven. Denne metoden fordrer imidlertid kalibrering og er mer egnet for utførelse i et klinisk laboratorium enn av en lege eller legesekretær på pasientens behandlingssted.

Det eksisterer således fortsatt et behov for en test for holo-TC som er enkel og kan utføres på behandlingsstedet.

Vi har sett at en slik enkel test kan oppnås ved ikke å måle holo-TC-innhold, men TC-metning, dvs. den andel av TC som er i holo-formen, ved å benytte to merkede spesifikke bindingspartnere, én for holo-TC og den andre for apo-TC, eller for både holo- og apo-TC, og ved å bestemme forholdet mellom signalene fra de to merkinger. En slik test er dessuten uavhengig av volum, dvs. mengden av anvendt flytende prøve (f.eks. kroppsvæske) trenger ikke bestemmes nøyaktig. Dette er en vesentlig fordel for bruk ved behandlingsstedet.

I henhold til ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen således en testmetode for bestemmelse av transkobalamin-metning, hvor en transkobalamin-holdig flytende prøve kontaktes med et porøst substrat, på hvilket det er immobilisert en transkobalamin-immobiliserende ligand, og med en rapportør-merket transkobalamin-bindende partner, og hvor signaler fra rapportørmerkinger som immobiliseres på nevnte substrat, påvises, som kjennetegnes ved at én av nevnte ligander eller nevnte bindingspartner, omfatter en første ligand eller bindingspartner som er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, og en andre ligand eller bindingspartner som kan binde til apo-transkobalamin eller til holo- og apo-transkobalamin.

I én utførelsesform omfatter testmetoden ifølge oppfinnelsen:

(i) kontakting av en transkobalamin-holdig flytende prøve med et porøst substrat som på dette har immobilisert en transkobalamin-immobiliserende ligand; (ii) før, under eller etter trinn (i) ovenfor, kontakting av transkobalamin i nevnte prøve med en første og en andre rapportør-merket bindingspartner for transkobalamin, hvor nevnte første bindingspartner er i stand til å binde både holo-og apo-transkobalamin, eller er en spesifikk bindingspartner for apo-transkobalamin, og hvor nevnte andre bindingspartner er en spesifikk bindingspartner for holo-transkobalamin; og (iii) påvisning av signaler fra rapportør-merkingene av nevnte bindingspartnere, immobilisert på nevnte substrat, og ut fra dette bestemme en indikasjon på transkobalamin-metning i nevnte prøve.

Alternativt kan substratet ha en første region som immobilisert på denne har en ligand som er en spesifikk bindingspartner for holo-transkobalamin, og en andre region som immobilisert på denne har en ligand som er en spesifikk bindingspartner for apo-transkobalamin eller er i stand til immobilisering av både holo- og apo-transkobalamin, og hvor trinn (iii) kan omfatte påvisning av signaler fra nevnte første og andre region.

Med en spesifikk bindingspartner eller ligand menes en som binder til TC (dvs. apo-TC og/eller holo-TC, etter behov) ved hjelp av dens spesifikke kjemiske struktur eller konformasjon og ikke bare ved hjelp av en total fysikalsk-kjemisk egenskap (som f.eks. lipofilitet) som kan være felles for mange komponenter av en prøve av kroppsvæske.

Den spesifikke bindingspartner eller ligand vil i alminnelighet enten være et antistoff, et antistoff-fragment, et enkeltkjedet antistoff, en antistoff-fragment-dimer, -trimer eller -tetramer, eller en forbindelse med affinitet for apo-TC og/eller holo-TC, så som en celleoverflatereseptor, et polypeptid, et oligopeptid, et oligonukleotid, en mindre organisk-kjemisk forbindelse, etc. Andre spesifikke bindingspartnere eller ligander kan velges fra et kombinatorisk kjemi- eller fag-displaybibliotek eller spesifikke bindingssekvenser av DNA eller RNA.

Dersom den spesifikke bindingspartner eller ligand er et antistoff, kan det være polyklonalt, men vil fortrinnsvis være monoklonalt. Monoklonale antistoffer kan frembringes med meget større spesifisitet og uniformitet enn polyklonale antistoffer, og dette reduserer kryssreaktivitet med andre komponenter i kroppsvæsken, særlig HC, og om relevant, den alternative konformasjon, f.eks. apo-formen av mål-analytten. Den uniformitet og reproduserbarhet som monoklonale antistoffer byr på i forhold til polyklonale antistoffer, sikrer en større nøyaktighet, noe som er vitalt for en test hvor analytten er i så lav konsentrasjon. Alternativt kan det være et antistoff-fragment, for eksempel F(ab), F(ab')2eller F(v) fragment. Antistoffene eller antistoff-fragmentene kan være monovalente eller divalente og kan fremstilles ved hybridom-teknikk eller være av syntetisk opprinnelse, og utviklet ved rekombinant DNA-teknologi eller kjemisk syntese. Enkeltkjedede antistoffer eller andre antistoff-derivater eller mimetika, kan for eksempel benyttes. Antistoffet kan være rettet eller utviklet mot en hvilken som helst epitop, komponent eller struktur av apo- og/eller holo-TC-proteinet, alt etter forholdene.

Den spesifikke bindingspartner eller ligand (sbp) for holo-TC benyttet i testmetoden ifølge oppfinnelsen, bør ha en spesifisitet for holo-TC (og ikke for apo-TC) som er minst 10 ganger, fortrinnsvis minst 50 ganger, mer foretrukket minst 100 ganger, dvs. i et overskudd av apo bør minst 10 ganger så meget av holo-TC-bindingspartneren binde til holo-TC enn til apo-TC. Generelt foretrekkes det derfor å velge holo-TC sbp ved å benytte in vitro metoder, fremfor å utvikle antistoff i et vertsdyr. Screening med henblikk på holo-TC sbp-kandidater vil derfor fortrinnsvis bli foretatt ved å benytte in vitro bibliotek, f.eks. fag-display antistoff-bibliotek (spesielt enkeltkjedet antistoff) eller oligonukleotid- eller kjemiske bibliotek. Affiniteten av holo-TC sbp for holo-TC bør dessuten fortrinnsvis være slik at det kan påvises nanomolare konsentrasjoner av holo-TC.

Holo-TC sbp-kandidater kan for eksempel velges ved å immobilisere holo-TC på et substrat (f.eks. kuler eller ark), f.eks. ved amidkobling, og «panning» av biblioteket i nærvær av et overskudd av ikke-immobilisert apo-TC. Substratet må deretter vaskes grundig og holo-TC-bindingskandidatene deretter frigjøres og identifiseres på vanlige måter for bibliotektypen.

Kandidater kan deretter testes på kryssreaktivitet for apo-TC, og kandidater som har tilstrekkelig preferanse for holo-TC fremfor for apo-TC, kan deretter velges. Hensiktsmessig vil holo-TC sbp-kandidater også bli underkastet screening for å velge bort sbp som er kryssreaktive for HC.

Mest foretrukket må de bindende regioner av holo-TC sbp ikke være peptidiske, f.eks. de kan være små organiske molekyler eller oligonukleotider (f.eks. 20- til 50-merer). Kandidater for apo-TC sbp kan velges på samme måte; men i alminnelighet foretrekkes det å benytte en holo-TC sbp og en ikke overlappende TC sbp (dvs. en som binder både til apo- og holo-TC), og TC sbp er velkjent fra litteraturen (se for eksempel Quadros et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:149-154 (1996) og McLean et al., Blood 89:235-242 (1997)).

Etter at kandidater for holo-TC sbp og TC eller apo-TC sbp er valgt, kan de rapportørmerkes på konvensjonell måte.

Rapportørgruppene kan være like dersom forskjellige ligander er immobilisert på ulike regioner av substratet, men rapprotørgruppene bør ellers være forskjellige, dvs. deres signaler bør kunne skjelnes fra hverandre.

Rapportørdelene i slike sbp kan være hvilken som helst av de konvensjonelle rapportørgrupper, f.eks. strålingsemittere eller -absorbenter, særlig elektro-magnetiske strålingsemittere eller-absobenter, enzymer, eller, mindre foretrukket, radioaktive merkinger, etc. Når det gjelder enzymatiske rapportørdeler vil de signaler som påvises være signaler, f.eks. emittert lys, fra den reaksjon som katalyseres av enzymet. De påviste signalene kan således frembringes direkte eller indirekte av rapportørdelene.

Enkelte egnede eksempler på farvede eller fluorescerende forbindelser som kan benyttes til påvisbart å merke sbp ifølge foreliggende oppfinnelse, antrakinoner, azo-farvestoffer, azin-farvestoffer, som f.eks. oksaziner og tiaziner, triaziner, naturlig forekommende pigmenter som porfyriner, fykobiliproteiner, inklusivt fykoerytriner og fykoguaniner, klorofyller og deres analoger og derivater, karotenoider, akridiner, xantener, inklusivt fluoresceiner og rhodaminer, indigo-farvestoffer, tioxantener, kumariner, polymetiner, inklusivt di- og tri-arylmetiner og derivater derav av ftalocyaniner og metall-ftalocyaniner.

Tilsvarende kan et stort utvalg radioaktive forbindelser benyttes som den signaldannende merking, herunder<125>l-merkede forbindelser.

Alternativt kan sbp være konjugert til naturlige eller syntetiske forbindelser som kan frembringe et kjemiluminescenssignal som kan bestemmes på kjent måte (Cormier, M.J. et al. ; Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York, 1973). Egnede kjemiluminescensforbindelser er luciferin, oksalsyreestere, 1,2-dioksetan, luminol eller derivater derav. Om relevant, kan hydrogenperoksyd, enzymer, f.eks. luciferase, alkalisk fosfatase eller andre kjemikalier, benyttes til å frembringe kjemiluminescenssignalet fra de anvendte signalproduserende molekyler.

Fortrinnsvis konjugeres sbp til et polymert «stativ» som bærer en rekke rapportørdeler, f.eks. enzymer, kromoforer, fluoroforer, etc. På denne måte kan signalet forstørres, f.eks. flere hundre ganger. Typiske polymerstativer er dekstran (f.eks. Amdex), polyetylenglykol og dendrimerer (f.eks. starburts-dendrimerer).

Sterkt anioniske signalgivende molekyler er ikke å foretrekke for bruk for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, siden de har tendens til å binde til serum-proteiner, som f.eks. humant serumalbumin (HSA) som kan forekomme i prøven. Særlig egnede eksempler er fluorescein-isotiocyanat, rhodamin B eller N-(resorufin-4-karbonyl)piperidin-4-karboksylsyre-N-hydroksysuccinimid-ester) (resos).

Når rapportørdelen er en lysemitter eller -absorbent, er det særlig foretrukket (spesielt for den merkede holo-TC sbp) at rapportørdelen omfatter flere kromoforer eller fluoroforer, slik at signalet forsterkes. En særlig foretrukket gruppe av rapportør-deler er den gruppen av rapportørdeler som kan tidsforsinke fluorescens, en annen er den gruppe som kan frembringe luminescens. Spesifikke eksempler på rapportør-deler er (3-galaktosidase og alkalisk fosfatase fra høns.

Det er velkjent å immobilisere affinitetsmolekyler, f.eks. antistoffer og antistoff-fragmenter for separasjonsformål, for eksempel ved binding eller kobling av ligandene, eventuelt ved hjelp av en linker, til hvilken som helst av de velkjente faste bærere eller matrikser som for tiden er utstrakt anvendt eller foreslått for separasjon eller immobilisering, og enhver metode som er kjent på området skulle kunne benyttes. Slike faste faser kan være i form av partikler, ark, gel, filtere, membraner, fibre eller kapillærer. Teknikker for binding av liganden til det porøse substrat er således meget godt kjent og ofte beskrevet i litteraturen.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er substratet fortrinnsvis et porøst ark eller en strimmel (f.eks. av et cellulosemateriale, fortrinnsvis nitrocellulose), spesielt foretrukket anbragt på en ikke-porøs bærer, eventuelt med en absorberende bakside som tjener til å fremme absorpsjon av den flytende prøve inn substratet gjennom kapillærvirkning. I én foretrukket utførelsesform er substratlaget, fortrinnsvis med bakside av et absorberende lag, anbragt på en teststrimmel. I en annen foretrukket utførelsesform holdes substratlaget, fortrinnsvis med en bakside av et absorberende lag, i et plasthylster forsynt med en åpning for påføring av den flytende prøve på den eksponerte overflate av substratlaget og for avlesning av signalene fra substratlaget.

Signalutvikling kan, dersom det fordres, være etter en hvilken som helst måte egnet for de valgte merkinger, f.eks. ved eksponering for lys eller for et substrat for en enzymatisk merking, og signalpåvisning kan skje med en hvilken som helst detektor egnet for påvisning av de emitterte signaler, f.eks. radioaktivitets- eller lys-detektorer. Spesielt foretrekkes det når signalene er lyssignaler, å benytte et digitalkamera som detektor, om nødvendig forsynt med et filter, prisme eller andre anordninger for å sikre at det ønskede bølgelengdebånd kan nå detektoren.

Påvisning av signalene fra de to merkede sbp, kan skje simultant eller suksessivt. Simultan påvisning er å foretrekke.

Manipulering av påvist signal for å frembringe en kvantitativ, halv-kvantitativ eller kvalitativ indikasjon på TC-metning foretas hensiktsmessig med datamaskin, fortrinnsvis innebygget i apparatet benyttet for å utføre testen og innrettet på å kontrollere ytelsen av testen. Når de signaldannende merkinger er forskjellige i sbp, vil testen fordre kalibrering på konvensjonell måte for å overføre signalforholdet (Sa/Sb eller Sa/(Sa+Sb) hvor Sa er holo-TC sbp-signalet og Sb er henholdsvis TC eller apo-TC sbp-signalet) til en TC-metningsverdi. Testen kan derfor eventuelt være forsynt med kalibreringsstandarder som inneholder kjente forhold mellom apo- og holo-TC.

I en alternativ utførelsesform kan en hvilken som helst metode ifølge foreliggende oppfinnelse foretas på overflaten av et substrat av chip-type i en SPR (surface plasmon resonance) detektor. Ved en slik metode unngås behovet for aktiv merking av de spesifikke ligandene eller substratene, og binding påvises direkte gjennom den ytterligere masse av de spesifikke bindingsligandene eller spesifikke bindingspartnere som binder til overflaten. I et foretrukket eksempel på dette alternativ immobiliseres en TCII-binder på overflaten av en SPR-«chip» (f.eks. ved gullbelegging av chip, etterfulgt av absorpsjon av en tiol-konjugert TCII-binder eller ved amidkobling av binderen til en dekstran-belagt chip). Denne chip anbringes deretter i SPR-detektoren, og en løsning som inneholder prøven får strømme over denne chip, slik at binding av holo-TC og apo-TC fra prøven til den immobiliserte ligand oppnås. En løsning som inneholder en første spesifikk binder med spesifisitet for apo-TC eller for både apo-TC og holo-TC får deretter strømme over denne chip og bindingen målt ved SPR for å gi et første signal. Denne første spesifikke binder vaskes deretter eventuelt av, hvorpå en andre spesifikk binder med kun spesifisitet for holo-TC, sendes over denne chip. Et andre signal som representerer bindingen til holo-TC påvises deretter ved SPR. Denne differanse mellom den første og andre SPR benyttes deretter for å beregne TCII-metningen. Ved å benytte SPR kan enhver ligand eller spesifikk bindingspartner beskrevet som «merket» eller «rapportør-merket» påvises ved hjelp av masse uten noen ytterligere eller aktiv merking. I dette tilfelle er «merking» simpelthen massen av den spesifikke bindingspartner eller ligand.

Prøven som påføres substratet er fortrinnsvis en kroppsvæske eller en vevs-avledet væske, fortrinnsvis en cellefri væske, spesielt plasma eller serum fra et pattedyr, spesielt mennesket.

I henhold til et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et testsett som omfatter: et porøst substrat som immobilisert på dette har en TC-immobiliserende ligand;

en første og en andre rapportørmerket bindingspartner for transkobalamin, hvor nevnte første bindingspartner er i stand til å binde både holo- og apo-transkoblamin eller er en spesifikk bindingspartner for apo-transkobalamin, og hvor nevnte andre bindingspartner er en spesifikk bindingspartner for holo-transkobalamin;

eventuelt et vaskemiddel;

eventuelt et substrat for en enzymatisk rapportørmerking;

eventuelt minst én kalibreringsstandard inneholdende apo- og holo-TC i kjent forhold; og

eventuelt en detektor som er i stand til å påvise signaler fra nevnte rapportør-merkinger.

Etter et alternativt format kan transkobalamin-metningen bestemmes ved binding til forskjellige regioner av de to substratligandene, en første som immobiliserer holo-TC, og en andre som immobiliserer apo-TC (eller apo- og holo-TC), og kontakting av substratet med den TC-holdige prøve og en rapportør-merket sbp for TC. I denne form, som utgjør et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen, avleses signalene fra de forskjellige regioner av substratet, og signalforholdet Sa/(Sa+Sb) eller Sa/Sb (hvor Sa er signalet for holo-TC ligandregionen og Sb er signalet for apo-TC eller holo- og apo-TC ligandregionen) indikerer TC-metnings-nivået. «Regionene» av substratet i henhold til dette eller andre aspekter ved oppfinnelsen kan for eksempel være forskjellige områder av overflaten av en membran, forskjellige membranoverflater på en teststrimmel, forskjellige membraner i et hylster, eller forskjellige sett av separerbare kuler (f.eks. et sett som er magnetiserbart i motsetning til det andre).

I dette format omfatter testmetoden ifølge oppfinnelsen i alminnelighet:

(i) kontakting av en transkobalamin-holdig flytende prøve med et porøst substrat som immobilisert på dette, i forskjellige regioner på dette, har en første og en andre transkobalamin-immobiliserende ligand, hvor nevnte første ligand er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, og nevnte andre ligand er i stand til immobilisering av apo- eller apo- og holo-transkobalamin; og (ii) før, under eller etter trinn (i), kontakting av transkobalamin i nevnte prøve med en rapportørmerket bindingspartner for transkobalamin; og (iii) påvisning av signaler fra rapportørmerkingene i nevnte bindingspartner immobilisert på de ulike regioner av nevnte substrat, og ut fra dette bestemme en indikasjon på transkobalamin-metning i nevnte prøve.

I henhold til ytterligere et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen således et testsett som omfatter: et porøst substrat som immobilisert på dette, i forskjellige regioner på dette, har en første og en andre transkobalamin-immobiliserende ligand, hvor nevnte første ligand er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, og nevnte andre ligand er i stand til immobilisering av apo- eller apo- og holo-transkobalamin;

en rapportørmerket bindingspartner for transkobalamin;

eventuelt et vaskemiddel;

eventuelt et substrat for en enzymatisk rapportørmerking;

eventuelt minst én kalibreringsstandard som inneholder apo- og holo-TC i kjent forhold; og

eventuelt en detektor som er i stand til påvisning av signaler fra nevnte rapportørmerkinger.

Oppfinnelsen vil i det følgende bli ytterligere beskrevet under henvisning til de etterfølgende eksempler og til tegningene, hvor: Figur 1 representerer et substrat som TC-ligander er blitt immobilisert på; Figur 2 representerer et substrat som har to regioner, én inneholdende immobiliserteligander som er spesifikke for holo-TC II og en andre som har immobiliserte ligander som er spesifikke for apo-TC II; og Figur 3 representerer en chip i en SPR-detektor (surface plasmon resonance) som har antistoffer for TC immobilisert på overflaten.

I Figur 1 representerer «Iabel-spb1» en første spesifikk bindingspartner som har tilkoblet en første merking, og «sbp-label 2» representerer en andre spesifikk bindingspartner som har tilkoblet en andre merking. Det fremgår at signalet fra merking 1 tilsvarer holo-TC-nivået, og signalet fra merking 2 tilsvarer de totale apo-og holo-TC-nivåene.

Av Figur 2 fremgår det at holo-TC II har bundet seg til den første (venstre) region og apo-TC II til den andre (høyre) region. Merkingen «sbp-label» representerer en spesifikk bindingspartner for TC som har en tilkoblet merking. På denne måte representerer signalene fra de to regionene henholdsvis holoTC- og apoTC-innholdet.

I Figur 3 er en chip-overflate modifisert ved tilkobling av et første monoklonalt antistoff (mAbl). Dette binder til apoTC og til holoTC fra en prøve. Det andre antistoff (mAb2) binder også både holo-TC eller apo-TC og gir således et SPR-signal for totalt TC-innhold når dette tilsettes. Det tredje antistoff (mAb3) binder bare til holo-TC og gir således et SPR-signal som representerer holo-TC-innholdet.

EKSEMPEL 1 - Utvikling av holo-TC sbp

A) Immobilisering av holo-TC på kuler

En milliliter 0,2M 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (EDAC) i 0,1 M 2-(N-morfolin)-etansulfonsyre (MES), pH 5,0, blandes med 1,0 mL 2 % (vekt/vol) karboksylat-modifiserte kuler (1^m diameter, Merck-Estapor) i 0,1 M MES, pH 5,0. Blandingen behandles ved ultralydbehandling i et bad for å dispergere reagensene og roteres deretter ende-over-ende i 1 time ved romtemperatur. Blandingen sentrifugeres ved 300 g og pelleten vaskes med 0,1 M MES, pH 7,0, sentrifugeres og resuspenderes i 1,0 mL deionisert vann. De EDAC-aktiverte kulene blandes i et lite plastglass med det samme volum av 1 mg/mL holo-TC i 0,1M 3-[(N-morfolino]-propan-sulfonsyre (MOPS), pH 7,5, og roteres over natten ved romtemperatur. Deretter vaskes blandingen to ganger med 0,05% Tween 20 (aq) og to ganger med 50 mM Tris-buffer, pH 7,4, inneholdende 5 mg/mL BSA. De belagte kulene som har et monolag av holo-TC på ca. 10 ug/mg, oppbevares som 0,1% i 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15M NaCI og 1 mg/mL BSA. B) (i) Biopanning av aptamer-bibliotek med holo-TC som målmolekylet Et bibliotek av dobbeltkjedede DNA-sekvenser fremstilles gjennom en blanding av kjemiske og enzymatiske trinn. Det syntetiseres typisk 10<14->10<15>enkeltkjedede DNA (ssDNA) sekvenser med lengde på 40 nukleotider som deretter enzymatisk omdannes til den dobbeltkjedede form før PCR-amplifikasjon. Deretter transkriberes den dobbeltkjedede DNA for å gi et bibliotek av enkeltkjedet RNA eller modifisert RNA. I tredje omgang utsettes RNA-biblioteket for det tiltenkte målmolekyl. De selekterte molekylene revers-transkriberes og amplifiseres deretter ved PCR (for DNA-bibliotek er PCR tilstrekkelig). Subsettet av sekvenser som binder til målet utgjør forrådet for en andre runde med biopanning. Vanligvis tar seleksjonsprosessen fra 7 til 15 runder. Fem nmol gelrenset, syntetisk templat-DNA inneholdende en 40 nukleotider sammenhengende sekvens flankert med definerte primer-renatureringssekvenser [5'-GGGAGGACGATGCGG-(N)4o-CAGACGACTCGCCCGA-3'] amplifiseres ved fire PCR-sykluser med primerne 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' og 5-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'. Omkring 800 pmol av den PCR-oppnådde templat-DNA (ca. 5 x 10<14>molekyler) transkriberes in vitro ved T7 RNA-polymerase (1000 U) i en 3 mL transkripsjonsreaksjon bestående av 40 mM TrisHCI (pH 8,0), 12 mM MgCI2, 1 mM Spermidine, 5 mM ditiotreitol (DTT), 0,002% Triton X-100 (vol/vol), 4% polyetylenglykol (vekt/vol) og 2 mM hver av ATP, guanidin-5'-trifosfat (GTP), 2'-NH2CTP og 2'-NH2UTP (CTP=cytidin-5'-trifosfat og UTP = uridin 5'-trifosfat). Full-lengde transkripsjonsprodukter renses på en 8% polyakrylamidgel under denatureringsbetingelser, suspendert i bindingsbuffer (10 mM TrisHCI, 0,1 mM EDTA, 2,5 mM MgCI2, pH 6,8), oppvarmet til 70°C og avkjølt på is.

RNA-forrådet inkuberes ved 37°C i 15 min med ca. 10^g holo-TC immobilisert på kuler og 100^g apo-TC fritt i løsningen som konkurrent. Kulene separeres ved sentrifugering og vaskes umiddelbart med 5 mL bindingsbuffer. Bundne RNA-molekyler elueres fra kulene ved å senke pH, gjenvinnes ved utfelling med etanol og revers-transkriberes med AMVT (avian myeloblastosis virus transcriptase) (Life Sciences) ved 48°C i 45 min med DNA-sekvensen 5-TCGGGCGAGTCGTCTG-3' som primeren. Etter PCR-amplifikasjon avcDNA, transkriberes den resulterende dupleks DNA-templat in vitro for å oppnå RNA for neste selekteringsrunde. Mengden av holo-TC-belagte kuler i bindingsreaksjonen reduseres suksessivt for progressivt å øke seleksjonstrykket. Seleksjonsprosessen gjentas inntil affiniteten av det anrikede RNA-forråd for holo-TC er vesentlig øket. På dette tidspunkt amplifiseres cDNA ved PCR med primerne

5-CCG AAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' og

5-GCC GGATCCTCGGGCGAGTCGTCTG-3', som innfører BamHI-og Hindlll-restriksjonsseter (understreket) henholdvis i 5'- og 3'-endene av PCR-produktet. PCR-produktene oppsluttes med BamHI og Hindlll og klones inn i pUC18 som er blitt oppsluttet med de samme enzymene, og innføres i Escherichia coli SURE (Stratagene) ved elektroporering. Plasmider isoleres fra enkle bakteriekloner og underkastes screening og sekvensering ved å benytte standardteknikker, som

beskrevet i f.eks. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. C1.

For å gi RNA-nukleaseresistens kan RNA-molekylene modifiseres i sukkerets 2'-stilling, f.eks. aminosubstitusjon.

Biopanning-protokollen vil i det vesentlige være identisk enten biblioteket er basert på RNA-aptamerer eller ssDNA-aptamerer eller hvorvidt biblioteket er naivt eller forfordelt ("biased"). Forskjellen vil være at ssDNA-biblioteker ikke vil fordre transkripsjon.

(ii) Biopanning av fagdisplay-peptid- eller antistoff-bibliotek med

holo-TC

1 pmol fag-displaybibliotek blandes med 10 fag holo-TC immobilisert på kuler og 100 ug apo-TC i 100^L PBS-Tween med 1 mg/mL BSA eller 3% BLOTTO.

(BLOTTO er 5% vekt/vol skummetmelk-pulver i 100 mM natriumfosfat, 150 mM natriumklorid, pH 7,4, 0,01% Antifoam A, 0,01% timerosal). Blandingen inkuberes ved 4°C over natten, og kulene separeres ved sentrifugering og vaskes ni ganger med 1 mL PBS-Tween og én gang med normalt saltvann for å fjerne enhver buffer-evne. Kulene resuspenderes i 600 \ iL 0,1M glycin-HCI-buffer, pH 2,2, og etter 15 min separeres kulene ved sentrifugering ved 3000 g i 3 min. Supernatanten fjernes og nøytraliseres med 36 \ iL 2M Tris, pH 9,0, og blandes med 400 \ iL Escherichia coli (f.eks. K91-Kan). Plasmider isoleres fra enkle bakteriekloner og underkastes screening og sekvensering ved å benytte standardteknikker som beskrevet i f.eks. Sambrook J. et al., supra. Bindings- og elueringsreaksjonene foretas minst tre ganger. BSA og BLOTTO benyttes alternerende i bindingsreaksjonen for å forhindre anrikning av fag som binder til disse proteinene.

EKSEMPEL 2

Immobilisering av TC-spesifikk binder på cellulosepapir

Cellulosepapir (f.eks. Whatman Nr. 52) aktiveres ved først å la det svelle i deionisert vann i 3 min og deretter behandle det med 3% CNBr (aq). pH økes til 10,5 ved tilsetning av 1 mM NaOH. Etter 30 min vaskes papiret med 12 x 500 mL 5 \ M NaHC03, 2 x 500 mL deionisert vann, 2 x 500 mL hver av 25%, 50% og 75% aceton. Til slutt vaskes det med 4 x 500 mL aceton og lufttørkes ved romtemperatur.

Kovalent kobling av anti-TC antistoff foretas ved fortynning av antistoffet til

10 ng/mL i 100 mL 0,1 M NaHC03og tilsetning av 20 g oppklippet papir. Blandingen omrøres forsiktig i 3 timer ved 4°C og vaskes deretter ved romtemperatur i 10 min med 2 x 100 mL 0,5 mM NaHC03, 3 timer med 100 mL 50 mM etanolamin i 0,1M NaHC03, i 10 min med 2 x 100 mL 0,5 mM NaHC03, i 30 min med 100 mL 0,1 M natriumacetat, pH 4,0, og to ganger med 50 mM fosfatbuffer, pH 7,5, inneholdende 0.15M NaCI, 0,1% Tween 20 og 0,1% gelatin. Det antistoff-ladede papir oppbevares i et lite volum av denne buffer.

Snitt av det antistoff-ladede papir klebes deretter til en fleksibel teststrimmel av plast.

EKSEMPEL 3 -Test

50 \ A. humanserum avsettes på membranflaten av en teststrimmel fremstillet i henhold til Eksempel 2. Etter 5 min renses teststrimmelen med 100 \ iL Tris-buffret saltvann (TBS -100 mM Tris, pH 7,2, 150 mM natriumklorid), og det tilsettes 50^L av en påvisningsløsning som inkuberes i 5 minutter. Påvisningsløsningen inneholder et ikke overlappende anti-humant TC-spesifikt monoklonalt antistoff konjugert til p-galaktosidase og en holo-TC sbp i henhold til Eksempel 1 (eller et ikke overlappende anti-humant holo-TC monoklonalt antistoff) konjugert til alkalisk fosfatase fra høns. Teststrimmelen renses deretter med 100 \ iL TBS. Det tilsettes 50 \ iL av et luminescerende substrat til alkalisk fosfatase i TBS (f.eks. 0,25 mM CPD-Starfra Tropix). Teststrimmelen avleses i et luminometer i ett sekund opptil 15 minutter. Teststrimmelen renses deretter med 100 \ iL PBS (fosfatbuffret saltvann) og det tilsettes 50 jaL av et luminescerende substrat for (3-galaktosidase i PBS (f.eks.

0,1 mM Galacton-Star fra Tropix) og en alkalisk fosfatase-inhibitor (f.eks. 40 \ iM cykloheksan-trismetylensulfonat). Teststrimmelen avleses en gang til i lumino-meteret. Mens den første avlesningen gir holo-TC-innholdet på teststrimmelen, gir den andre avlesningen det totale TC-innhold. Forholdet mellom de to gir den volum-uavhengige verdi for kobalamin-metningen av TC i prøven.

EKSEMPEL 4

Utvikling av mus monoklonale antistoffer som er spesifikke for humant transkobalamin og humant holo-transkobalamin

i) Immunisering.

BALB/c hunnmus ble immunisert i.p. med 20 fag rekombinant humant holo-transkobalamin blandet med AdjuPrime Immune modulator (Pierce, IL, USA), etterfulgt av to booster-injeksjoner på 20 jag i fire ukers intervaller.

ii) Fusjon.

Fire dager etter den siste booster-dose, ble milten tatt ut og splenocytter fusjonert til det HAT- (hypoksantin, aminopterin, tymidin; Sigma) sensitive plasmacytom OURI (en sub-klon av X63-Ag8.653) ved å benytte PEG (Boehringer Mannheim, Tyskland). Fusjonsprodukter ble utplatet over 5 x 96F plater (Nunc) i nærvær av HAT i dyrkningsmedium (DMEM/Ham's F12 (Invitrogen) pluss 10% CPSR3 (Sigma). Fusjonene ble matet etter 1 uke med kulturmedium inneholdende HT (Sigma).

iii) Primær screening.

Etter 2 uker ble medium fra hybridomene underkastet screening ved å benytte en oppfangingstest på fast-fase. Cellemediet ble blandet med 10 jaL av 1% (vekt/vol) suspensjon av 1 faM magnetiserbare kuler belagt med et sau anti-mus IgG antistoff

(Merck-Estapor, Frankrike) og holdt ved romtemperatur i 1 time. De magnetiserbare kulene med bundet mus monoklonale antistoffer ble isolert ved å benytte en magnet, og vasket fire ganger med 1 mL fosfatbuffer, pH 7,2, 0,15M NaCI og 1 mg/mL bovint serumalbumin. Vaskede kuler ble resuspendert i 100 faL sammenslått humanserum (Scantibodies, USA) som var blitt forbehandlet med<57>Co-merket kobalamin (ICN, USA) for å omdanne apo-transkobalamin i serumet til<57>Co-merket holo-TC. Blandingene ble holdt ved romtemperatur i 30 min og kulene isolert med en magnet. Radioaktiviteten assosiert med kulene ble tellet i en gammateller.

iv) Kloning.

Brønner som var positive for anti-transkobalamin antistoffer ble klonet ved begrensende fortynning over 96-brønns F-plater (Nunc), på forhånd utsådd med

BALB/c peritoneale mateceller (10.000 per brønn). Positive kloner ble selektert og reklonet inntil 100% av subklonene produserte spesifikt antistoff. Celle-forråd ble nedfrosset i flytende nitrogen i CPSR3 (Sigma) inneholdende 10% DMSO (Sigma).

Sekundær screening.

Antistoffer fra cellemedier ble isolert på magnetiserbare kuler som beskrevet ovenfor. 10 jaL av de antistoff-belagte kulene ble blandet med serum på forhånd merket med<57>Co, som beskrevet ovenfor, i nærvær av økende konsentrasjoner av rekombinant, humant apo-transkobalamin eller rekombinant, humant holo-transkobalamin.

Anti-transkobalamin antistoffene (mAb1 og mAb2) ble valgt på grunnlag av deres affinitet for både apo- og holo-transkobalamin og ett monoklonalt antistoff (mAb3) ble valgt på grunnlag av spesifisitet for holo-transkobalamin. De respektive klonene ble ekspandert in vitro i Technomouse, CL1000. Antistoffer ble renset fra cellemedium ved protein A affinitetskromatografi. I korte trekk ble antistoff-holdig kultursupernatant fortynnet 1:1 i 0,1 M Tris, pH 8,0, inneholdende 1M NaCI (bindingsbuffer) og avsatt på protein A kolonnen, som på forhånd var ekvilibrert med bindingsbuffer. Protein A kolonnen ble deretter vasket grundig med 15 kolonnevolumer bindingsbuffer. Antistoffet ble eluert med 0,1 M citratbuffer, pH 4,0, nøytralisert til pH 7,0 med 1M Tris-buffer, pH 8, og buffer endret på en Sephadex G-25 kolonne (Pharmacia) til 0,1 M fosfat, pH 7,2, inneholdende 0,15M NaCI.

EKSEMPEL 5

Immobilisering av TC-spesifikt monoklonalt antistoff mAbl på dekstran-belagt overflate

Den karboksylerte overflate av den dekstran-belagte chip (Pharmacia, Sverige) ble aktivert med 0,05M N-hydroksysuccinimid (NHS)/0,2M N-etyl-N'-[3-(dimetylamino)propyl]karbodiimid-hydroklorid (EDC), renset med deionisert vann og belagt kovalent med mAbl (fra Eksempel 4) som 50 jag/mL i 0,01 HEPES-buffer, pH 7,4, inneholdende 0,15M NaCI, 0.003M EDTA, og 0,005% polysorbat (HBS). Uomsatt NHS ble blokkert med 1M etanolamin og denne chip vasket grundig med

HBS.

EKSEMPEL 6

Binding av holo-transkobalamin, mAb2 og mAb3 til immobilisert mAbl

Bindingshendelsene ble fulgt i sann tid ved å benytte SPR (surface plasmon resonance), og foretatt på et Biocore instrument (Biacore, Sverige). Mengden fri ligand-binding til denne chip ble målt som responsenheter (RU), som gjenspeiler både massen av ligandbinding og dens affinitet for det immobiliserte mål. Denne chip med immobilisert mAbl (Eksempel 5) ble ført inn i instrumentet, hvoretter det suksessivt ble injisert 5 jaL av 100 nM holo-transkobalamin, 5 jaL av 50^g/mL mAb2 og 5 jaL av 50 jag/mL mAb3 med vasketrinn mellom hver. Etter at holo-transkobalamin hadde strømmet gjennom instrumentet bandt 565 RU av mAb3 til det immobiliserte mAbl. I fravær av holo-transkobalamin bandt verken mAb2 eller mAb3 til denne chip med det immobiliserte mAbl.

Claims (20)

1. Testmetode for bestemmelse av transkobalamin-metning, hvor en transkobalamin-holdig flytende prøve kontaktes med et porøst substrat, på hvilket det er immobilisert en transkobalamin-immobiliserende ligand, og med en rapportør-merket transkobalamin-bindende partner, og hvor signaler fra rapportørmerkinger som immobiliseres på nevnte substrat, påvises, karakterisert vedat én av nevnte ligander eller nevnte bindingspartner, omfatter en første ligand eller bindingspartner som er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, og en andre ligand eller bindingspartner som kan binde til apo-transkobalamin eller til holo- og apo-transkobalamin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for bestemmelse av transkobalamin-metning i en transkobalamin-holdig flytende prøve,karakterisert vedat den omfatter: (i) kontakting av nevnte prøve med et porøst substrat som på dette har immobilisert en transkobalamin-immobiliserende ligand; (ii) før, under eller etter trinn (i) ovenfor, kontakting av transkobalamin i nevnte prøve med en første og en andre rapportørmerket bindingspartner for transkobalamin, hvor nevnte første bindingspartner er i stand til å binde både holo-og apo-transkobalamin, eller er en spesifikk bindingspartner for apo-transkobalamin, og hvor nevnte andre bindingspartner er en spesifikk bindingspartner for holo-transkobalamin; og (iii) påvisning av signaler fra rapportørmerkingene av nevnte bindingspartnere immobilisert på nevnte substrat, og ut fra dette bestemme en indikasjon på transkobalamin-metning i nevnte prøve.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat det på nevnte substrat er immobilisert en ligand som er i stand til immobilisering av både holo- og apo-transkobalamin, og hvor signalene fra den første og andre rapportørmerking kan skjelnes fra hverandre.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den omfatter: (i) kontakting av en transkobalamin-holdig flytende prøve med et porøst substrat som immobilisert på dette, i forskjellige regioner på dette, har en første og en andre transkobalamin-immobiliserende ligand, hvor nevnte første ligand er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, og nevnte andre ligand er i stand til immobilisering av apo- eller apo- og holo-transkobalamin; og (ii) før, under eller etter trinn (i), kontakting av transkobalamin i nevnte prøve med en rapportørmerket bindingspartner for transkobalamin; og (iii) påvisning av signaler fra rapportørmerkingene av nevnte bindingspartner immobilisert på de ulike regioner av nevnte substrat, og ut fra dette bestemme en indikasjon på transkobalamin-metning i nevnte prøve.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 4,karakterisert vedat nevnte spesifikke bindingspartner for holo-transkobalamin eller nevnte ligand som er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, omfatter en ikke-peptidisk holo-transkobalamin-bindende del.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 4,karakterisert vedat nevnte spesifikke bindingspartner for holo-transkobalamin eller nevnte ligand som er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, omfatter et monoklonalt antistoff.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 6,karakterisert vedat nevnte spesifikke bindingspartner for holo-transkobalamin eller nevnte ligand som er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin, har en spesifisitet for holo-transkobalamin versus apo-transkobalamin som er minst 10 ganger.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 7,karakterisert vedat nevnte signaler er elektromagnetisk stråling.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat nevnte signaler påvises med et digitalkamera.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 9,karakterisert vedat nevnte prøve er blod eller en blod-avledet væske.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 10,karakterisert vedat nevnte substrat er et celluloseark.

12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 11,karakterisert vedat nevnte substrat er anbragt på en teststrimmel.

13. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 12,karakterisert vedat nevnte prøve i trinn (i) påføres den ene flate av nevnte porøse substrat og trekkes inn i nevnte porøse substrat ved kapillærstrøm fremmet av et vann-absorberende materiale tett inntil den motstående side av nevnte porøse substrat.

14. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 7,karakterisert vedat nevnte rapportørmerkede spesifikke bindingspartner er merket kun ved dens egen masse og påvises ved SPR (surface plasmon resonance).

15. Testsett,karakterisert vedat det omfatter: et porøst substrat som på dette har immbolisert en TC-immobiliserende ligand, og en første og en andre rapportørmerket bindingspartner for transkobalamin, hvor nevnte første bindingspartner er i stand til å binde holo- og apo-transkobalamin eller er en spesifikk bindingspartner for apo-transkobalamin, og hvor nevnte bindingspartner er en spesifikk bindingspartner for holo-transkobalamin.

16. Testsett,karakterisert vedat det omfatter: et porøst substrat som i forskjellige regioner på dette har immobilisert en første og en andre transkobalamin-immobiliserende ligand, hvor nevnte første ligand er i stand til spesifikk binding til holo-transkobalamin og nevnte andre ligand er i stand til immobilisering av apo- eller apo- og holo-transkobalamin, og en rapportørmerket bindingspartner for transkobalamin.

17. Sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 eller 16, karakterisert vedat det ytterligere omfatter et vaskemiddel.

18. Sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 17, karakterisert vedat det ytterligere omfatter minst ett substrat for en enzymatisk rapportørmerking.

19. Sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 18, karakterisert vedat det ytterligere omfatter minst én kalibreringsstandard inneholdende apo- og holo-TC i kjent forhold.

20. Sett ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 19, karakterisert vedat det ytterligere omfatter en detektor som er i stand til å påvise signaler fra nevnte rapportørmerkinger.