ES2234928T3 - Generacion y uso de celulas dendriticas. - Google Patents
Generacion y uso de celulas dendriticas.Info
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Abstract
Un procedimiento in vitro para la diferenciación y maduración de monocitos en células dendríticas mieloides 5 IL3-R+ CD11c+, que comprende incubar dichos monocitos con una combinación de interferón de tipo I e IL-3.
Description
Generación y uso de células dendríticas.
La presente invención se refiere a la mejora de
la terapia celular para tratar o prevenir el cáncer, infecciones y
enfermedades autoinmunes, en particular al desarrollo de nuevas
células dendríticas que tienen características superiores para
eliminar o prevenir la aparición de células invasivas.
Las células dendríticas (CD) son componentes
clave en el inicio de respuestas inmunitarias. Este tipo de célula
constituye la célula presentadora de antígeno más potente, dotada
de una capacidad única para agrupar linfocitos T naive. Por
consiguiente, se ha propuesto como un adyuvante natural, dirigido a
desencadenar las respuestas de los linfocitos T contra inmunógenos
pobres, tales como los Ag asociados a tumores (AAT). Durante mucho
tiempo la realización de ensayos clínicos se ha visto dificultada
por la baja frecuencia de las CD en la circulación disponibles en
la sangre. Recientemente, el desarrollo de procedimientos para
generar grandes cantidades de CD a partir de precursores
hematopoyéticos, ha permitido el inicio de ensayos clínicos
pioneros. Estos ensayos han dado resultados prometedores para la
terapia del cáncer.
Las células dendríticas (CD) representan una
clase principal de células presentadoras de antígeno caracterizadas
por su capacidad única de inducir células T naive^{1}. Trabajos
recientes demostraron la existencia de varios subconjuntos de CD
que se diferencian por los progenitores de la médula ósea linfoides
o mieloides^{2;3}. Un factor crítico para el desarrollo de las CD
mieloides es el factor estimulador de colonia de granulocitos y
macrófagos (GM-CSF)^{4;5}, mientras que
las CD linfoides dependen de la interleuquina
(IL)-3 para su superviciencia^{6;7}. Basándose en
la expresión de marcadores mieloides (es decir, CD11c) o la
expresión de la cadena \alpha (CD123) del receptor de
IL-3\alpha (IL-3R\alpha), se han
aislado dos tipos de precursores de CD de sangre periférica
humana^{7}. Un subtipo presenta marcadores de superficie mieloide
y niveles bajos de IL-3R\alpha, mientras que otro
subtipo de origen linfoide putativo, expresa
IL-3R\alpha, y depende en gran medida de la
IL-3 para su supervivencia y es un gran productor de
interferones de tipo I
(IFN).
(IFN).
Las CD mieloides humanas se pueden generar
fácilmente in vitro mediante cultivo de monocitos en
presencia de GM-CSF e
IL-4^{4:5},mientras que las llamadas CD linfoides
se han obtenido por aislamiento de precursores de la sangre o
nódulos linfáticos^{6;7}.
Las CD GM-CSF/IL4 se han usado en
ensayos clínicos en terapia celular^{44}. Sin embargo, usando
estas condiciones, sólo el 67% de los pacientes inmunizados mostró
un aumento de la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, es
importante mejorar el procedimiento, condiciones o sustancias para
mejorar la eficacia del tratamiento.
La presente invención se dirige a proporcionar un
procedimiento para producir células dendríticas superiores, que se
pueden usar en terapia celular para eliminar o prevenir más
eficazmente los efectos perjudiciales de las células invasivas en
pacientes. Los autores de la invención encontraron
sorprendentemente, que cuando se incubaban monocitos en condiciones
específicas en presencia de IL3 e IFN-\beta, se
podía producir un tipo de CD superiores.
Los IFN de tipo I son producidos por varios tipos
de células como respuesta a infecciones víricas, bacterianas y
protozoarias^{8-13}. Mediante sus múltiples
efectos en las células asesinas naturales y linfocitos T, los IFN de
tipo I representan un enlace crítico entre la inmunidad innata y la
adquirida^{14}. Estudios recientes indican que los IFN de tipo I
también pueden influir en la diferenciación y maduración de
CD^{15;16}. De hecho, se mostró que el
IFN-\beta promovía la diferenciación de monocitos
en CD de vida corta que sufrían apoptosis rápidamente^{16}. Los
presentes autores de la invención investigaron si se podía parar la
apoptosis usando IL-3. Para estudiar esto, los
autores de la invención determinaron el efecto del
IFN-\beta en la expresión de
IL-3R\alpha en los monocitos y caracterizaron el
fenotipo y la capacidad estimuladora de linfocitos T, de las
células derivadas de monocitos cultivados en presencia de
IL-3 e IFN-\beta.
Sorprendentemente, los presentes autores de la invención
encontraron que, de hecho, la IL-3 podía rescatar
células tratadas con IFN-\beta. Además, estas
células parecían superiores en la inducción del sistema
inmunitario.
Un objetivo particular de la presente invención
se dirige a un nuevo tipo de célula dendrítica (CD) estable, que es
más madura y más potente en la activación del sistema inmunitario,
comparada con otras CD estables conocidas. Los monocitos cultivados
en IL3 e IFN-\beta se diferencian en células
dendríticas con potentes actividades estimuladoras de linfocitos T.
Esta invención deriva del descubrimiento original e inesperado de
que el IFN-\beta mantiene la expresión de IL3R en
los monocitos. La IL3 permite la supervivencia de CD que tienen
vida corta cuando son generadas sólo en IFN-\beta
y por lo tanto no son adecuadas para la terapia celular. Estas
células inducen tanto respuestas de tipo TH1
(IFN-\gamma) como de tipo TH2
(IL-5), lo cual puede ser especialmente ventajoso
en la inmunoterapia del cáncer. Estas células inducen directamente
la apoptosis de ciertas células tumorales. Los presentes autores de
la invención proponen usar esas células para inmunoterapia del
cáncer y vacunación contra patógenos infecciosos mediante carga de
las CD ex vivo con proteínas tumorales, péptidos, transferencia
génica (ARN, ADN), fusión con células tumorales (híbridos), seguido
de la inyección in vivo, o inyección de la célula
directamente en el tumor donde podría inducir la liberación de
antígenos tumorales a través de su actividad asesina.
Estos objetivos se han cumplido en las siguientes
realizaciones.
La presente invención se refiere a un
procedimiento in vitro para la diferenciación y maduración
de monocitos en células dendríticas mieloides IL3-R+
CD11c+, que comprende incubar dichos monocitos con una combinación
de interferón de tipo I y IL-3 (o IL3). También se
pueden usar moléculas peptidomiméticas para este propósito. Los
autores de la invención probaron que el IFN-\alpha
ejerce un efecto similar al IFN-\beta, de modo
que la combinación IL-3+IFN-\alpha
también daba como resultado la generación de una CD
IL-3R\alpha mieloide positiva comparable (fig.
5). Cuando los monocitos se cultivaron en IL-3 sola,
los autores de la invención encontraron que expresaban niveles
menores de CD80 y CD86 y niveles mayores de CD14 que las CD
IL-3/IFN-\beta (fig. 4), lo cual
sugiere que están más cerca de los macrófagos.
El tipo de célula CD
IL-3/IFN-\beta (o CD
IFN-\beta/IL-3) que resulta de
este procedimiento, es nuevo y difiere significativamente de las CD
IL-4/GM-CSF obtenidas previamente.
Los monocitos purificados de CMSP (células mononucleares de sangre
periférica), que son las células precursoras de la CD, expresan
IL-3R\alpha (CD123), pero pierden esta expresión
después de cultivo en medio solo. Los presentes resultados muestran
que se evitaba la pérdida de la expresión de
IL-3R\alpha cuando se añadía
IFN-\beta durante el cultivo. Sin embargo, se
encontró que más del 90% de los monocitos cultivados en el medio
solo o en presencia de IFN-\beta sufrían
apoptosis. Sorprendentemente, los autores de la invención
encontraron que la adición de IL-3 en presencia de
IFN-\beta potenciaba notablemente la supervivencia
celular. De hecho, más del 65% de las células todavía estaban vivas
usando estas condiciones de cultivo. Sorprendentemente, los
presentes autores de la invención encontraron que la
IL-3 rescata de la apoptosis a los monocitos
cultivados en presencia de IFN-\beta, y les
permite la diferenciación adicional. Estas observaciones demuestran
un efecto de cooperación de la IL-3 y el
IFN-\beta en la supervivencia y diferenciación
celular. Este efecto de los IFN de tipo I en la expresión de
IL-3R\alpha no se había evaluado hasta ahora.
Para caracterizar las células obtenidas por
cultivo de monocitos en IL-3 y
IFN-\beta, los presentes autores de la invención
primero miraron su morfología ultraestructural y encontraron que
los monocitos cultivados en estas condiciones, adquirían
expansiones citoplasmáticas de tipo dendrítico. Por lo tanto, las
células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 y
IFN-\beta se pueden denominar en lo sucesivo CD
IL-3/IFN-\beta o CD
IFN-\beta/IL-3.
Los presentes autores de la invención
caracterizaron además que las CD
IL-3/IFN-\beta expresaban
marcadores de linaje mieloide (CD11c, CD14, y CD33). También
expresaban niveles altos de moléculas HLA de clase I y clase II,
CD40, CD54, CD80 y CD86, e IL-3R\alpha (CD123).
Al contrario que las CD IL-4/GM-CSF,
las CD IL-3/IFN-\beta mostraron
niveles mucho mayores de IL-3R\alpha. Al
contrario, CD1a era expresado en CD
IL-4/GM-CSF, pero no en células
derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e
IFN-\beta. Por lo tanto, los presentes resultados
indican que las CD IL-3/IFN-\beta
también son mieloides pero fenotípicamente completamente diferentes
comparado con las CD IL-4/GM-CSF
conocidas. Basándose en sus marcadores las CD
IL-3/IFN-\beta también se pueden
denominar células dendríticas (CD) IL3-R+ CD11c+ o
células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+.
Ventajosamente, la IL-3 y el
IFN-\beta se pueden añadir a los monocitos
simultáneamente, secuencialmente o por separado.
De acuerdo con la invención, el
IFN-\beta está presente con una concentración
entre 10 y 20000 U/ml.
Los presentes resultados demuestran que se
evitaba la pérdida de la expresión de IL-3R\alpha
añadiendo 1000 U/ml de IFN-\beta al medio de
cultivo. Sin embargo también son posibles concentraciones de 10,
15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,
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1950, 2000, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500,
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18250, 18300, 18350, 18400, 18450, 18500, 18550, 18600, 18650,
18700, 18750, 18800, 18850, 18900, 18950, 19000, 19050, 19100,
19150, 19200, 19250, 19300, 19350, 19400, 19450, 19500, 19550,
19600, 19650, 19700, 19750, 19800, 19850, 19900, 19950 y 20000
U/ml.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, el IFN-\beta se da con una
concentración de 1000 U/ml.
De acuerdo con la invención, la
IL-3 está presente en una concentración entre 1 y
1000 U/ml. En relación con esto, son posibles concentraciones de 1,
2, 5, 10, 15, 20, 25, 30,35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80,
85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150,
155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215,
220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280,
285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345,
350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410,
415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475,
480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540,
545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 705,
710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770,
775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835,
840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900,
905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965,
970, 975, 980, 985, 990, 995 y 1000 U/ml.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la IL-3 está presente con una
concentración de 50 U/ml.
De acuerdo con la presente invención, el
procedimiento in vitro para obtener una población de células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ comprende la
incubación de: monocitos aislados de un paciente, en presencia de
interferón de tipo I e IL-3.
Hay dos fuentes principales de precursores de CD:
las células madre CD34+ y monocitos de sangre periférica (SP). La
mayor restricción de la generación de CD a partir de células madre,
es que el tiempo de cultivo es largo, y la obtención de células
CD34+ requiere la movilización del paciente. Por lo tanto, una
realización preferida de la presente invención, es usar monocitos
como un precursor de CD. Normalmente, estas células, cuando están
presentes en la sangre, se diferencian en CD en presencia de
GM-CSF, o como han mostrado los presentes autores
de la invención, en presencia de
IL-3/IFN-\beta. Se pueden usar
diferentes técnicas para aislar monocitos de la sangre como conocen
los expertos en la técnica. Un procedimiento preferido es como se
describe en el ejemplo 1. Con el término "población" se
entiende células dendríticas mieloides IL3-R+
CD11c+ como tales, un grupo de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ que pueden ser diferentes en otras
características, o un grupo de células que comprenden células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+. Además, una
célula, no está excluida de esta definición. Es importante
mencionar que los autores de la invención no excluyen el hecho de
que además los monocitos se pueden diferenciar y pueden madurar
in vivo, por inyección de IL-3 y
IFN-\beta como tales, en un paciente.
De acuerdo con la presente invención, las células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ se pueden
tratar además para producir células dendríticas presentadoras de
antígeno. Por consiguiente, el procedimiento in vitro, como
se describe en la presente invención, comprende al menos las
siguiente etapas:
(a) incubar monocitos aislados de un paciente, en
presencia de IFN-\beta e IL-3 que
producen una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+, y
(b) presentar un antígeno en la superficie de
dichas células dendríticas.
Dependiendo del tratamiento específico como se
describe a continuación, los antígenos son moléculas específicas
presentes en las células, seleccionadas del grupo que consiste en
una célula cancerosa, una bacteria, una célula infectada por
parásito y una célula infectada por virus. Estos antígenos pueden
ser moléculas grandes que son procesadas por las CD para cargar
moléculas MHC, o pueden ser moléculas más pequeñas (péptidos) que
son cargadas inmediatamente en las moléculas MHC. Se han usado
varios enfoques para armar la CD con un antígeno diana para usar en
ensayos clínicos. Los procedimientos usados para enfocar esta etapa
de carga del antígeno son revisados por Fong y Engleman^{44}. Los
autores de la invención también señalan, que las células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+ se puede producir in
vivo, inyectando en un paciente IL-3 e
IFN-\beta o IL-3 e
IFN-\beta combinados con un antígeno. De acuerdo
con la invención, la capacidad de presentación de un péptido en la
superficie de dichas células dendríticas de acuerdo, se puede
lograr por ejemplo, poniendo en contacto dicha célula dendrítica
con al menos parte del antígeno expresado de forma diferencial en
la célula. Esta célula puede ser una célula seleccionada del grupo
que consiste en una célula de cáncer, una célula bacteriana, una
célula infectada por parásito y una célula infectada por virus. Los
antígenos son liberados de esta CD dando como resultado la
activación de las CD.
Alternativamente, la capacidad de presentación de
un péptido en la superficie de dichas células dendríticas, se puede
lograr tratando con pulsos dichas células dendríticas con proteínas
antígenas, cargando dichas células dendríticas con péptidos
antígenos, o se puede lograr por transformación/transducción de
dichas células dendríticas por moléculas de ácido nucleico que
codifican al menos para parte de dicho antígeno. Con "tratamiento
con pulsos" se entiende que las CD son activadas por estos
antígenos y entran en las rutas de procesamiento del MHC de clase
II y/o MHC de clase I. La transformación de las CD se puede lograr
usando pulsos eléctricos, liposomas u otras técnicas conocidas por
los expertos en la técnica. Los vectores víricos permiten la
transducción de células. Por vectores víricos también se entiende
vectores retrovíricos, adenovíricos y adenoasociados.
La transformación/transducción de las células
permite introducir el ADN que codifica el antígeno, y cuando están
presentes las señales de expresión adecuadas, se forma dicho
antígeno en la célula y mediante los mecanismos endógenos es
transportado a la superficie de la célula dendrítica
tranformada/transducida. Como resultado de esto, se preparan células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras
de antígeno.
Alternativamente, la capacidad de presentación de
un péptido en la superficie de dichas células dendríticas se logra
mediante fusión de dichas células dendríticas con células que
llevan antígenos específicos. La producción de híbridos e
hibridomas de célula de tipo dendrítico/célula tumoral para inducir
respuesta antitumoral, ha sido descrita en el documento WO 96/30030.
Este documento proporciona hibridomas de célula de tipo
dendrítico/célula tumoral y pluralidades de híbridos de célula de
tipo dendrítico/célula tumoral, que confieren resistencia al tumor
in vivo. Estos híbridos e hibridomas son generados por la
fusión de células tumorales con células de tipo dendrítico. Por
ejemplo, se pueden fusionar células tumorales inmortales de una
línea celular tumoral autóloga con células de tipo dendrítico
alogénicas emparejadas con HLA autólogas. Las líneas de células
tumorales autólogas se pueden obtener de tumores primarios y de sus
metástasis. Alternativamente, se pueden fusionar células de tipo
dendrítico inmortales de una línea celular de tipo dendrítico
emparejada con HLA alogénica o autóloga con células tumorales
autólogas. Las líneas celulares de tipo dendrítico autólogas, se
pueden preparar a partir de diferentes fuentes tales como sangre
periférica y médula ósea. Los hibridomas y la pluralidad de
híbridos de célula de tipo dendrítico/célula tumoral, se pueden
infundir directamente para la inmunización activa de pacientes con
cáncer contra sus células tumorales residuales. Los hibridomas e
híbridos también se pueden usar para la activación in vitro
de células inmunitarias autólogas antes de su reinfusión en el
paciente para la inmunización pasiva contra las células
tumorales.
La presente invención también propone un
procedimiento in vitro para proporcionar una población
activada de linfocitos T usando células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, que se
pueden obtener por un procedimiento como se ha descrito antes, que
comprende al menos las etapas de:
(a) incubar monocitos aislados de un paciente, en
presencia de IFN-\beta e IL-3,
para proporcionar una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+,
(b) presentar un antígeno (por ejemplo péptido o
proteína) en la superficie de dichas células dendríticas,
proporcionando así una población de células dendríticas
presentadoras de antígeno; y,
(c) activar una población de linfocitos T con
dicha población de células dendríticas presentadoras de
antígeno.
Un linfocito T activado es un linfocito T que
prolifera (célula CD3+) y/o que segrega citoquinas
(IL-2, IL-4, IL-5,
IFN-\gamma, etc.) y/o que expresa marcadores de
activación (CD25, CD69, HLA-DR, CD40L, etc.). De
hecho, los presentes autores de la invención indicaron que los
niveles bajos de IL-12 segregados por las CD
IL-3/IFN-\beta contribuyen a su
capacidad para provocar la producción de
IFN-\gamma por los linfocitos T. Además, los
autores de la invención probaron que, las CD
IL-3/IFN-\beta también inducían la
producción de IL-5 en cultivo de leucocitos mixtos,
y también eran mucho más eficaces que las CD
IL-4/GM-CSF en este respecto. Si es
necesario, un linfocito T activado siempre se puede separar de la
célula dendrítica presentadora de antígeno mediante separación de
células.
En procedimientos preferidos de acuerdo con la
invención, dicho linfocito T es un linfocito T colaborador.
La presente invención también proporciona una
población de células dendríticas mieloides IL3-R+
CD11c+, una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o una
población de linfocitos T activados, que pueden inducir respuestas
tanto de tipo TH1 (IFN-\beta) como de tipo TH2
(IL-5), que se pueden obtener por un procedimiento
in vitro como se ha descrito antes, o una de sus
combinaciones.
Los presentes autores de la invención mostraron
que, aunque las CD IL-3/IFN-\beta
presentan varias características que sugieren un mayor grado de
maduración, no se deben considerar completamente maduras. De hecho,
los autores de la invención, probaron que las células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+ de acuerdo con la presente
invención, se pueden estimular más, usando un estimulador. La
presente invención también se refiere a un procedimiento para
estimular más a una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+, por el cual dichas células
dendríticas son incubadas adicionalmente con dicho estimulador.
Esta incubación se puede llevar a cabo simultáneamente,
secuencialmente o por separado del tratamiento con citoquina. Por
estimulación también se entiende maduración, inducción y/o
activación. De acuerdo con la presente invención, dicho estimulador
se puede elegir de un grupo que comprende virus, bacterias, LPS
(lipopolisacáridos), ácido nucleico, derivados funcionales o una de
sus combinaciones. La expresión "ácido nucleico" se refiere a
una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario,
pudiendo consistir dicho ácido nucleico en desoxirribonucleótidos
(ADN) o ribonucleótidos (ARN), o puede ser ADNc amplificado o ADN
genómico amplificado. Por consiguiente, la presente invención
también se refiere a una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ estimuladas, que se pueden obtener por
un procedimiento de acuerdo con la presente invención. En los
ejemplos, los autores de la invención mostraron que cuando se
analiza la producción de IFN-\alpha por las CD
IL-3/IFN-\beta, la estimulación
tal como por LPS y virus influenza inactivado con formaldehído,
inducía dichas CD sólo en un grado menor (tabla 2). Al contrario,
el Poli(I:C), que mimetiza el RNA bicatenario vírico, podía
inducir la producción de IFN-\alpha por las CD
IL-3/IFN-\beta en mayor grado.
Hay que entender que todas las aplicaciones (tales como
procedimientos, composiciones, kits, usos) sugeridos en la presente
invención para las CD
IL-3/IFN-\beta no estimuladas, se
pueden aplicar a CD IL-3/IFN-\beta
estimuladas.
La presente invención se refiere a una
composición para usar como medicamento o producto basado en células
dirigido al uso clínico, que comprende al menos una de las
siguientes combinaciones de componentes:
- IL-3 e interferón de tipo I
- IL-3 e interferón de tipo I
mezclado con antígeno y/o estimulador, que puede inducir la
producción de IFN-\alpha en células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+
- una población de monocitos mezclada con
IL-3 e IFN-\beta o sus análogos
funcionales
- una población de monocitos mezclada con
IL-3, interferón de tipo I y antígeno y/o
estimulante, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ mezclada con antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o,
- una población de linfocitos T activados que
inducen tanto respuestas de tipo TH1 (IFN-\beta)
como de tipo TH2 (IL-5), que se puede obtener usando
células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+
presentadoras de antígeno,
en la que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o
en la que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus
combinacio-
nes.
nes.
Los productos basados en células todavía no se
consideran medicamentos, y en el futuro se podrían considerar
productos de transfusión.
De acuerdo con la presente invención, el
interferón de tipo I se puede elegir del grupo que consiste en
IFN-\beta, IFN-\alpha o sus
moléculas peptidomiméticas.
Los presentes resultados también mostraron que
las CD IL-3/IFN-\beta tienen
capacidad de endocitosis. Las CD
IL-3/IFN-\beta segregan
espontáneamente IL-6, IL-8,
IL-12 (p40) y TNF\alpha.
Los autores de la invención también estudiaron la
producción de citoquinas de las CD
IL-4/GM-CSF frente a las CD
IL-3/IFN-\beta. Comparado con las
CD GM-CSF/IL-4, las
IL-3/IFN-\beta producían menos
IL-12 (p40), mientras que su secreción de
IL-8 era ligeramente mayor. Como ocurre con las CD
GM-CSF/IL-4, la unión tanto de LPS
como de CD40 inducida por transfectantes CD40L regulaba
positivamente la síntesis de citoquinas por las CD
IL-3/IFN-\beta. Comparado con las
CD GM-CSF/IL-4, las CD
IL-3/IFN-\beta producían niveles
similares de TNF\alpha e IL-6 en ambas
condiciones de estimulación, mayores niveles de IL-8
como respuesta a CD40L pero no a LPS, y niveles mucho menores de
IL-12 (p40) e IL-12 (p70)
cualquiera que fuera el estímulo considerado.
Con todas las proporciones de
estimulador/respondedor, la CD
IL-3/IFN-\beta eran tan eficaces
como las CD GM-CSF/IL-4 para inducir
la proliferación de linfocitos T CD4+ naive. Sin embargo, si los
autores de la invención consideraban el perfil de las citoquinas
segregadas por los linfocitos T tras exposición a CD alogénicas,
las CD IL-3/IFN-\beta inducían la
producción de cantidades sustanciales de
IFN-\gamma, a pesar de su baja síntesis de
IL-12. Además, las CD
IL-3/IFN-\beta provocaban la
producción de IL-5 y a este respecto eran
significativamente más eficaces que las CD
IL-4/GM-CSF.
A pesar de su bajo nivel de producción de
IL-12, las CD
IL-3/IFN-\beta estimulan altos
niveles de producción de IFN-\gamma a partir de
linfocitos T CD4+ de adultos, sugiriendo que usan otros factores o
moléculas de membrana para provocar la síntesis de citoquinas Th1.
De hecho, recientemente se han descrito las rutas independientes de
IL-12 del
IFN-\gamma^{13;14;28;29}. Considerados juntos,
los datos indican que las CD
IL-3/IFN-\beta difieren de las
células plasmacitoides CD4^{+} CD3^{-} CD11c^{-}
IL-3R\alpha^{+} aisladas de sangre periférica,
descrita por Grouard y col.^{6}, ya que se mostró que estas
últimas células eran malos inductores de
IFN-\gamma en MLR.
Los presentes autores de la invención concluyen
que tras usar los procedimientos antes descritos, se pueden formar
nuevos tipos de CD que son más maduras que las CD mieloides
previamente descritas, y que tienen un carácter superior en la
inducción de la expresión de linfocitos T. El aumento de la
expresión de citoquinas da como resultado una estimulación más
rápida y eficaz del sistema inmunitario, y por lo tanto, será más
eficaz para eliminar material infeccioso extraño en un
paciente.
Las CD derivadas de monocitos inducidas con
antígenos tumorales, ahora se usan clínicamente en varios
protocolos para inducir inmunidad antitumoral
específica^{30-32}. Se ha mostrado que los
mecanismos efectores tanto Th1 como Th2 colaboran entre sí para
dirigir una actividad antitumoral eficaz^{33}. Debido a su
capacidad para inducir respuestas tanto de tipo Th1 como Th2, los
autores de la invención sugieren que las CD
IL-3/IFN-\beta (inducidas o no
inducidas) deben ser adecuadas para inducir una eficaz inmunidad
tumoral.
Preferiblemente, una composición o un producto
basado en células de acuerdo con la invención, se complementa con
al menos una citoquina adicional. De acuerdo con la presente
invención, dicha citoquina se elige preferiblemente de un grupo que
comprende IFN-\alpha, IFN-\beta,
IL-3 e IL-12. La
IL-12 y el IFN-\alpha son
citoquinas fundamentales para la diferenciación de Th1 y generación
de linfocitos T citotóxicos dotados de potentes efectos
antitumorales.
La invención implica la preparación de un
medicamento para tratar el cáncer, infecciones y enfermedades
autoinmunes, que comprende una composición o un producto basado en
células como se ha descrito antes. Las investigaciones mostraron
que los efectos inmunológicos y clínicos de las células dendríticas
cargadas con antígeno administradas como una vacuna terapéutica a
pacientes con cáncer^{44}. Aunque los procedimientos de
vacunación basados en CD son incómodos, los resultados prometedores
de los ensayos clínicos en pacientes con linfoma maligno, melanoma
y cáncer de próstata, sugieren que las estrategias
inmunoterapéuticas que se aprovechan de las propiedades
presentadoras de antígeno de las células dendríticas, finalmente
pueden ser tanto eficaces como ampliamente aplicables a tumores
humanos. También está bien establecido el papel de las CD en el
inicio o inducción de respuestas inmunes frente a antígenos víricos
y bacteriano in vivo. Se ha demostrado que las CD humanas,
pero no los monocitos o células B, pueden sensibilizar linfocitos
T naive a los antígenos proteicos solubles, permitiendo la
generación de líneas LCT CD4+ colaboradoras y CD8+ in
vitro^{44}. Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos
(LTC) CD8+ reconocen y matan células cancerosas en diferentes
modelos de tumor. Se ha demostrado en diferentes modelos animales
la capacidad de las CD para inducir linfocitos T capaces de
reconocer y matar células tumorales de una forma específica del
antígeno. Además, la inmunización basada en CD puede conducir a
memoria inmunológica con protección frente a posteriores desafíos de
tumores. Fong y col. (1997^{45}) ilustraron que la inmunización
con proteínas propias podía proteger a los animales frente a
reacciones autoinmunes.
La presente invención también se refiere a la
composición farmacológica que comprende la composición o un
producto basado en células de acuerdo con la invención, y
opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente
aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen
cualquier vehículo que no induzca la producción de anticuerpos
dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos
adecuados típicamente son macromoléculas grandes que metabolizan
lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos
lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos polímeros,
copolímeros de aminoácido; y partículas víricas inactivas. Dichos
vehículos son conocidos por los expertos en la técnica. Una
"vacuna" es una composición inmunógena capaz de provocar
protección contra infecciones, sea parcial o completa. Una vacuna
también puede ser útil para tratar a un individuo, en cuyo caso se
llama una vacuna terapéutica. Dichas composiciones de vacuna pueden
incluir composiciones de vacuna profilácticas así como
terapéuticas. El término "terapéutico" se refiere a la
capacidad de eliminar o prevenir células invasivas.
La presente invención también se refiere al uso
de una población o una composición de acuerdo con la presente
invención, para preparar un medicamento para matar una célula
diana.
Preferiblemente, dicha célula diana se selecciona
del grupo que consiste en una célula cancerosa, una célula
bacteriana, una célula infectada por parásito o una célula
infectada por virus.
La presente invención también proporciona un
procedimiento de cribado in vitro, que usa una población de
células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+, una
población de células dendríticas mieloides IL3-R+
CD11c+ presentadoras de antígeno, una población de células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas,
una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno estimuladas
o una población de linfocitos T activados, que inducen respuestas
tanto de tipo TH1 (IFN-\beta) como de tipo TH2
(DL-5), que se pueden obtener por un procedimiento
como se describe en la presente invención.
Por sus potentes propiedades inmunoestimuldoras,
las CD cargadas con Ag tumoral o bacteriano se pueden usar para
activar linfocitos T contra Agv poco inmunógenos desconocidos, y
así ayudar a descubrirlos.
De acuerdo con la presente invención, una
población de células dendríticas mieloides IL3-R+
CD11c+, una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, una
población de células dendríticas mieloides IL3-R+
CD11c+ estimuladas, una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno estimuladas
o una población de linfocitos T activados que inducen respuestas
tanto de tipo TH1 (IFN-\beta) como de tipo TH2
(IL-5), que usan células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígenos que se
pueden obtener por un procedimiento de acuerdo con la invención, se
pueden usar para preparar ensayos de cribado in vitro.
De acuerdo con la presente invención, un
procedimiento in vitro para detectar la actividad mediada
por linfocitos T de un péptido antigénico diana, comprende al
menos, las siguientes etapas:
(a) poner en contacto un linfocito T aislado de
un paciente, con una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno,
proporcionando así un linfocito T activado,
(b) poner en contacto una célula diana con dicho
linfocito T activado, y
(c) controlar el efecto de dicho linfocito T en
dicha célula diana, detectando así la actividad antidiana,
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus
combinaciones.
La presente invención también describe un kit
para detectar la actividad mediada por linfocitos T de un péptido
antigénico diana, que comprende al menos una combinación de
componentes elegidos de la siguiente lista:
- IL-3 e interferón de tipo I
- IL-3 e interferón de tipo I
mezclado con antígeno y/o estimulador, que puede inducir la
producción de IFN-\alpha en células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+
- una población de monocitos mezclada con
IL-3 e interferón de tipo I
- una población de monocitos mezclada con
IL-3, interferón de tipo I y antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ mezclada con antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o,
- una población de linfocitos T activados que
inducen tanto respuestas de tipo TH1 (IFN-\beta)
como de tipo TH2 (IL-5), que se puede obtener usando
células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+
presentadoras de antígeno,
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus
combinaciones. Se ha mostrado que la congelación de la población de
dichas células no altera las propiedades funcionales de dichas
células. También se pueden usar otros procedimientos de
almacenamiento conocidos por los expertos en la técnica para
conservar estas células^{46}.
De acuerdo con la presente invención, en el kit
de la presente invención, dicho interferón de tipo I se puede
elegir del grupo que consiste en IFN-\beta,
IFN-\alpha o sus moléculas peptidomiméticas.
Todos los procedimientos, usos y kits descritos
en la presente invención para detectar la actividad mediada por
linfocitos T, también se refieren al uso de una población de CD
IL-3/IFN-\beta como reactivo, con
el propósito de seguir la respuesta inmune in vitro en
pacientes que recibieron vacunas de CD u otras vacunas. Se pueden
aislar y ensayar linfocitos T de pacientes usando CD
IL-3/IFN-\beta presentadoras de
antígeno, para analizar si se ha activado la respuesta inmunológica
en los pacientes. Para este propósito, se pueden usar CMSP (células
mononucleares de sangre periférica) o linfocitos T purificados.
Este sistema de ensayo permite evaluar cualquier terapia contra
infecciones, cáncer o enfermedades autoinmunes.
La presente invención sugiere el uso de una
composición de acuerdo con la invención, como un adyuvante de
vacuna para preparar un medicamento y el adyuvante de vacuna como
tal, que comprende una composición de acuerdo con la invención.
De acuerdo con la presente invención, una vacuna
que comprende la composición como se ha descrito en la invención,
se puede usar para producir un medicamento para inmunizar seres
humanos o animales frente a diferentes enfermedades. La vacunación
de pacientes ya se ha ilustrado y se ha encontrado que es eficaz
usando CD IL-4/GM-CSF tratadas con
pulsos con péptido, en pacientes con cáncer (Toungouz y col.
1999^{46}).
En particular, la presente invención describe el
uso del adyuvante de vacuna de la presente invención para preparar
un medicamento para inmunizar seres humanos o animales contra una
enfermedad.
La presente invención también se refiere al uso
de al menos una de las siguientes combinaciones de componentes,
para preparar un medicamento para tratar el cáncer, infecciones y
enfermedades autoinmunes,
- IL-3 e interferón de tipo I
- IL-3 e interferón de tipo I
mezclado con antígeno y/o estimulador, que puede inducir la
producción de IFN-\alpha en células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+
- una población de monocitos mezclada con
IL-3 e interferón de tipo I
- una población de monocitos mezclada con
IL-3, interferón de tipo I y antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ mezclada con antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o,
- una población de linfocitos T activados que
inducen tanto respuestas de tipo TH1 (IFN-\beta)
como de tipo TH2 (IL-5), que se puede obtener usando
células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+
presentadoras de antígeno,
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la presente invención, o una de sus
combinaciones. En el diseño y cuando se llevan a cabo las
aplicaciones antes descritas, las consideraciones importantes
incluyen procedimientos para introducir el antígeno en las rutas de
procesamiento de MHC de clase I y clase II, procedimientos para
aislar y activar células dendríticas, la ruta de administración y
selección del antígeno. Debido a que la terapia celular, tal como
se presenta en la presente invención, necesita un reconocimiento
específico de la célula diana, de hecho es importante que se
estudie bien la elección del antígeno. Por lo tanto, la presente
invención sugiere que el antígeno es un antígeno específico de
tumor, un antígeno específico infeccioso o una proteína, cuando se
aplica en el tratamiento del cáncer, infecciones (víricas,
bacterianas, parasitarias) o enfermedades autoinmunes. Además, es
importante que las composiciones se administren a una persona que
necesite tratamiento en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Ejemplos de antígenos que se pueden considerar antígenos tumorales
son los descritos por Fong y Engleman 2000^{44}.
De acuerdo con la presente invención, dicha
enfermedad vírica se selecciona del grupo que consiste, por
ejemplo, en VIH, virus del papiloma humano, virus
Ebstein-Barr y citomegalovirus.
De acuerdo con la presente invención, dicha
enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en
esclerosis múltiple, miastenia grave, artritis crónica juvenil,
artritis crónica, LED, dermatitis atópica y diabetes juvenil. Los
autores de la invención sugieren que probablemente todas las
enfermedades autoinmunes se pueden tratar o prevenir por un
procedimiento como se describe en la invención.
De acuerdo con la presente invención, dichas
composiciones se pueden inyectar en pacientes usando diferentes
rutas. Preferiblemente la inyección se lleva a cabo por vía
intravenosa, intralinfoide o intratumoral, sin embargo, se pueden
usar otras rutas tales como inyecciones subcutáneas. Es interesante
mencionar que además de expresar las moléculas MHC y
coestimuladoras para inducir linfocitos T, las células CD expresan
moléculas de adhesión y receptores de quimioquina adecuados, para
atraer a las CD a los órganos linfoides secundarios para la
inducción. En relación con esto, se puede evitar la inducción
ineficaz inyectando CD directamente a los órganos linfoides
secundarios mediante inyección intralinfática o intranodal. El
presente estudio prueba que, especialmente en el tratamiento del
cáncer, las inyecciones intratumorales darán como resultado la
eliminación más eficaz del tumor. La observación de que las CD
IL-3/IFN-\beta derivadas de
monocitos son capaces de desencadenar la apoptosis en células
tumorales, es importante para su uso terapéutico como vacunas
antitumorales. De hecho, recientes informes demuestran que las CD
IL-4/GM-CSF humanas pueden procesar
células apoptóticas y presentar cruzados los antígenos derivados de
una forma restringida para MHC de clase I, dando como resultado la
inducción de respuestas eficaces de los linfocitos T citotóxicos.
Por lo tanto las CD que se inyectan directamente en los tumores,
primero inducirán la apoptosis de células cancerosas, y finalmente
migrarán a los nodos linfáticos donde inducen las respuestas de los
linfocitos T específicas del tumor.
Estas composiciones se pueden administrar, por
ejemplo, por vía parenteral o intravenosa. Las composiciones de
acuerdo con la invención para administración parenteral pueden ser,
en particular, soluciones estériles, suspensiones o emulsiones
acuosas o no acuosas. Como una solución o vehículo farmacéuticamente
aceptable, se puede usar propilenglicol, polietilenglicol, ésteres
orgánicos inyectables, por ejemplo oleato de etilo, o
ciclodextrinas. Estas composiciones también pueden comprender
agentes humectantes, emulsionantes y/o de dispersión.
La esterilización se puede llevar a cabo de
varias formas, por ejemplo, usando filtro bacteriológico,
incorporando agentes de esterilización en la composición, o por
irradiación. También se pueden preparar en forma de composiciones
sólidas estériles, que se pueden disolver en el momento de uso en
agua estéril o en cualquier otro medio inyectable estéril.
La presente invención también puede comprender
adyuvantes que son conocidos para un experto en la técnica
(vitamina C, agentes antioxidantes, etc.), que se pueden usar de
forma sinérgica con los compuestos de acuerdo con la invención, con
el fin de mejorar y prolongar los tratamientos de los tumores
cancerosos.
La invención también se refiere a una composición
que comprende una composición de acuerdo con la presente invención,
y otro compuesto como una preparación combinada para el uso
simultáneo, separado o secuencial, para tratar el cáncer,
infecciones y enfermedades autoinmunes.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento in vitro para preparar una composición como se
describe en la presente invención, que comprende las siguientes
etapas:
(a) incubar dichos monocitos aislados de un
paciente, en un sistema cerrado en presencia de
IFN-\beta e IL-3 de grado clínico,
para proporcionar una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+,
(b) presentar un antígeno en la superficie de
dichas células dendríticas en estados de grado clínico,
proporcionando así una población de células dendríticas
presentadoras de antígeno; y,
(c) activar una población de linfocitos T con
dicha población de células dendríticas presentadoras de antígeno,
en la que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas, y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de la presente invención, o
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la invención, o una de sus
combinaciones.
Recientemente, se ha mejorado la producción de CD
en estados de grado clínico. Los presentes autores de la invención
describieron, en Toungouz y col. 1999^{46}, que es necesario el
desarrollo de sistemas cerrados, evitar proteínas exógenas y
respetar los procedimientos operativos estándar (POE) para poder
garantizar especificaciones predefinidas del producto celular. En
estos documentos se describe un procedimiento simplificado de las
buenas prácticas de fabricación (BPF) de la generación de CD
IL-4/GM-CSF a partir de productos de
leucoferesis en un sistema cerrado, usando medios de cultivo
sintéticos desprovistos de proteínas no humanas. Análogamente a
este procedimiento, se pueden preparar CD
IL-3/IFN-\beta de grado
clínico.
Salvo que se defina otra cosa, todos los términos
técnicos y científicos usados en esta invención, tienen los mismos
significados que entienden normalmente los expertos en la técnica a
la que pertenece esta invención. A continuación se describen
procedimientos de ejemplo y materiales, aunque se pueden usar
procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos
en esta invención, en la práctica o ensayo de la presente
invención. Todas las publicaciones y otras referencias mencionadas
en esta invención se incorporan como referencia en su totalidad. En
caso de conflicto, restringirá la presente especificación,
incluyendo las definiciones. Los materiales, procedimientos, y
ejemplos sólo son ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a
partir de los siguientes dibujos, tablas, descripción detallada, y
de las reivindicaciones.
Figura
1
Se analizó en monocitos incubados en medio solo o
con IFN-\beta (1000 U/ml) por citometría de
flujo, la expresión de IL-3R\alpha (CD123). Línea
gruesa: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos
anti-CD123 conjugados con PE. Líneas de puntos:
perfiles FACS después de tinción con IgG1 testigo de isotipo
correspondiente. Datos de un experimento representativo de 3 en
diferentes donantes de sangre.
Figura
2
Se cultivaron monocitos en medio sólo (\circ),
o en presencia de IL-3 50 U/ml (\triangledown), o
IFN-\beta 1000 U/ml (\bullet), o una combinación
de IFN-\beta 1000 U/ml e IL-3 50
U/ml (\blacktriangledown). Se cuantificaron las células
apoptóticas por citometría de flujo después de teñir para la
anexina V y el yoduro de propidio (PI). Los resultados se
expresaron como la media \pm ETM de los porcentajes de células
negativas para la expresión tanto de anexina V como de PI.
Figura
3
La microscopía de transmisión electrónica de
monocitos después de cultivo durante 6 días con
GM-CSF e IL-4 o IL-3
e IFN-\beta (aumento inicial A; x900, B; x1950).
Tanto las CD IL-3/IFN-\beta como
las CD GM-CSF/IL-4, mostraron el
aspecto típico de células dendríticas que incluían un núcleo
lobulado, procesos citoplasmáticos largos y sistema
tubulovesicular. En presencia de IL-3 e
IFN-\beta, las células dendríticas aparecían como
células más pequeñas llenas de mitocondrias.
Figura
4
(A) Fenotipo de monocitos purificados, cultivados
durante 6 días con GM-CSF e IL-4 o
IL-3 e IFN-\beta. Línea gruesa:
perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos específicos.
Líneas de puntos: perfiles de FACS después de tinción con
anticuerpos testigo de isotipo correspondiente. Datos de un
experimento representativo de 6 en diferentes donantes.
(B) Fenotipo de monocitos purificados, cultivados
con GM-CSF e IL-4 o
IL-3 e IFN-\beta. Línea gruesa:
perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos específicos.
Líneas de puntos: perfiles de FACS después de tinción con
anticuerpos testigo de isotipo correspondiente. Datos de un
experimento representativo de 6 en diferentes donantes.
Figura
5
Fenotipo de monocitos cultivados con
IL-3 e IFN-\beta o con
IL-3 e IFN-\alpha. Líneas
gruesas: perfiles de FACS después de tinción con anticuerpos
específicos. Líneas finas: perfiles de FACS después de tinción con
anticuerpos testigo de isotipo correspondiente.
Figura
6
Se incubaron CD hechas crecer en
GM-CSF e IL-4 o IL-3
e IFN-\beta, en medio que contenía
FITC-dextrano 1 mg/ml durante los tiempos indicados,
y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados son de un
experimento representativo de 3 en diferentes donantes.
Figura
7
Se cultivaron monocitos con
GM-CSF e IL-4 o IL-3
e IFN-\beta. Después las CD se estimularon o no
con LPS (1 \mug/ml) durante 24 h. Líneas gruesas: perfiles FACS
después de tinción con anticuerpos específicos. Líneas finas:
perfiles FACS después de tinción con anticuerpos testigo de isotipo
correspondiente. Datos de un experimento representativo de 2 en
diferentes donantes de sangre.
Figura
8
(A) Las CD
IL-3/IFN-\beta inducen la
proliferación de linfocitos T CD4^{+} naive. Se cultivaron
linfocitos T CD4^{+} de sangre de cordón umbilical con CD
IL-3/IFN-\beta (\circ) o CD
GM-CSF/IL-4 (\bullet) alogénicas
preparadas a partir del mismo donante. Después de 5 días, se
cuantificó la proliferación de linfocitos T por incorporación con
[^{3}H]-timidina. Los datos se muestran como
medias \pm ETM de 6 experimentos independientes.
(B) Producción de citoquinas en cultivos de
leucocitos mixtos. Los linfocitos T CD4^{+} de sangre periférica
se cultivaron con CD
IL-3/IFN-\beta (columnas
sombreadas) o CD GM-CSF/IL-4
(columnas blancas) alogénicas con una relación CD/T de 1:10.
Después de 6 días, se ensayaron los líquidos sobrenadantes por ELISA
para determinar los niveles de citoquinas. Los datos se muestran
como media \pm ETM de 6 experimentos.
*p < 0,05 comparado con CD generadas en CD
GM-CSF e IL-4 (ensayo de
Wilcoxon).
Figura
9
Se cocultivaron CD derivadas de monocitos humanos
generadas a partir de monocitos cultivados en IL-3
e IFN-\beta, con líneas de células tumorales
marcadas con [^{3}H]-timidina. Después de 18 h, se
recogieron los núcleos intactos y se midió la radiactividad. Los
datos se expresan como porcentajes de la fragmentación de ADN con
una proporción de CD:célula diana 10:1.
Figura
10
Respuesta de IFN-\gamma
anti-E7 inducida por CD I3, comparado con CD GM. Las
barras blancas representan la respuesta obtenida con CD no
estimuladas, mientras que las barras oscuras representan respuestas
inducidas por CD estimuladas con LPS. Como sistemas de lectura se
usaron ELISPOT, ELISA y citometría. Los resultados representados
gráficamente son los obtenidos después de restar la base (CD no
cargadas + linfocitos T autólogos).
Tabla
1
Las CD se generaron en presencia de
GM-CSF e IL-4 o IL-3
e IFN-\beta, y se activaron con LPS (1 \mug/ml)
durante 24 h o con transfectantes 3T6-CD40L durante
3 días. Los niveles de citoquinas en los líquidos sobrenadantes se
midieron por ELISA, y los resultados se expresan como medias \pm
ETM de 6 experimentos independientes en diferentes donantes de
sangre.
Tabla
2
Se generaron CD en presencia de
IL-3 e IFN-\beta, y se activaron
con transfectantes 3T6-CD40L durante 3 días, o LPS
(1 \mug/ml) durante 24 h, o virus influenza durante 24 h, o
Poli(I:C) durante 48 h. Se midieron los niveles de
IFN-\alpha en los líquidos sobrenadantes por
ELISA, y los resultados se expresaron como medias \pm ETM de
experimentos independientes en diferentes donantes de sangre.
Se obtuvieron células mononucleares de sangre
periférica (CMSP) de sangre heparinizada de donantes normales
mediante centrifugación en gradiente de densidad con Lymphoprep
(Nycomed, Oslo, Noruega). Los monocitos se obtuvieron por adhesión
durante 2 h en matraces de 75 cm^{2} o por centrifugación en
gradiente de densidad con Nycoprep (Nycomed), seguido de separación
celular magnética usando un kit de aislamiento de monocitos
disponible en el comercio, que permite obtener suspensiones
celulares que contienen más de 95% de monocitos (Miltenyi Biotec,
Auburn, CA). Para generar CD usando IL-4 y
GM-CSF (CD
IL-4/GM-CSF), se cultivaron
monocitos purificados durante 4-6 días en RPMI 1640
(Bio Whittaker Europe, Verviers, Bélgica) complementado con
L-glutamina 2 mM (GIBCO, Paisley, Escocia),
gentamicina 20 \mug/ml, 2-mercaptoetanol 50
\muM (GIBCO), aminoácidos no esenciales al 1% (GIBCO) y suero
bovino fetal al 10% (Bio Whittaker Europe) en matraces de 75
cm^{2} o placas de 6 pocillos (7,5 10^{5} células/ml) en
presencia de GM-CSF (800 U/ml) e
IL-4 (500 U/ml) cedido por
Schering-Plough (Kenilworth, NJ), como describen
Romani y col.^{4}. En paralelo se cultivaron monocitos durante
4-6 días en presencia de IFN-\beta
(1000 U/ml) (Ares Serano Europe, Londres, GB) e
IL-3 (50 U/ml) (R&D Systems Europe, Oxon, GB),
solos o combinados.
Las células dendríticas se fijaron con
glutaraldehído al 2%, y tampón de fosfato de Millonig durante 2 h.
Los bloques de células obtenidos después de centrifugación a 1200g
durante 10 min, se fijaron con tetraóxido de osmio al 2% y se
embebieron en resina epoxi. Se tiñeron secciones ultrafinas con
acetato de uranilo y citrato de plomo. El estudio ultraestructural
se llevó a cabo usando el microscopio electrónico EMT400 (Philips,
Eindhoven, Holanda).
Para el inmunofenotipo, las células se lavaron en
solución tamponada con fosfato (PBS) complementada con albúmina se
suero bovino (BSA) al 0,5%, y se incubaron durante 15 min a 4ºC con
uno de los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con
fluroesceína (FITC-) o ficoeritrina (PE): IgG2a
FITC-anti-HLA-DR,
IgG1 PE-anti-CD4, IgG1
FITC-anti-CD8, IgG2a
PE-anti-CD11b, IgG2b
PE-anti-CD11c, IgG2b
PE-anti-CD14, IgG1
PE-anti-CD33, IgG1
FITC-anti-CD45RA, IgG2a
PE-anti-CD45RO, IgG2b
PE-anti-CD54, IgG1
PE-anti-CD80 (B7-1),
IgG1 PE-anti-CD123
(IL-3R\alpha) e IgG1
PE-anti-CD154 (CD40L), todos de
Becton Dickinson (Mountain View, CA), IgG2b
PE-anti-CD86 (B7-2)
de Pharmingen (San Diego, CA), IgG2a
FITC-anti-CD3, IgG1
FITC-anti-CD16, IgG1
FITC-anti-CD19 y IgG1
PE-anti-CD40 de Biosource
International (Camarillo, CA), IgG2a
FITC-anti-CD1a de Dako (Glostrup,
Dinamarca), y IgG2a clon B9.12.1
FITC-anti-HLA-Clase
I (A, B, C), IgG2a PE-anti-CD83 de
Immunotech (Marseille, Francia). Las células también se tiñeron con
los correspondientes anticuerpos monoclonales testigo de los
correspondientes isotipos, y después se analizaron usando un
citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).
La muerte celular apoptótica se midió por
citrometría de flujo usando anexina V conjugada con FITC (Becton
Dikinson) y yoduro de propidio (Sigma-Aldrich,
Bomem, Bélgica) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Se usó FITC-dextrano (Molecular
Probes, Eugen, OR) para evaluar la endocitosis celular como
describen Sallusto y col^{17}. Brevemente, las células se
incubaron con FITC-dextrano 1 mg/ml a 37ºC durante
5, 15 ó 30 min, y después se analizaron usando el citómetro de
flujo FACScan.
Se estimularon CD (4 x 10^{5}/ml) mediante
lipopolisacáridos bacterianos (LPS) (1 \mug/ml), virus influenza
inactivado con formaldehído de cepa de Nueva Caledonia (cedido por
N. Kuehm, Aventis, Pasteur Mérieux, Val de Reuil, Francia),
poli(ácido inosínico)-poli(ácido citidílico)
(Poli(I:C)) (20 \mug/ml) (Sigma), durante 24 h o 48 h
respectivamente, y después se ensayaron los niveles de citoquinas
en los líquidos sobrenadantes del cultivo. En paralelo, se
activaron CD (2 x 10^{5}/ml) por cocultivo con fibroblastos 3T6
irradiados transfectados con el gen CD40L humano (transfectados
CD40L) (5 x 10^{4}/ml), y los líquidos sobrenadantes se
recogieron después de 3 días, para determinar los niveles de
citoquina.
Se cocultivaron CD en placas de fondo plano de 96
pocillos con linfocitos T CD4^{+} naive alogénicos (2 x
10^{5}/ml) aislados de sangre de cordón umbilical de recién
nacido o CMSP de adulto. Los linfocitos T CD4^{+} se purificaron
por separación celular magnética usando un kit de aislamiento de
linfocitos T CD4 disponible en el comercio (pureza > 95%,
evaluada por análisis de FACS) (Miltenyi Biotec). En el caso de
linfocitos T CD4^{+} de adultos, se usa además un kit de
aislamiento CD45RA (Miltenyi Biotec) para el enriquecimiento en
células naive.
Después de 5 días, se evaluó la proliferación
celular mediante la captación de [^{3}H]-timidina
durante las últimas 16 h, y se recogieron los líquidos
sobrenadantes del cultivo para determinar los niveles de
citoquinas.
Se adquirieron kits para ELISA de Biosource
Europe (Fleurus, Bélgica) para determinar los niveles de
TNF\alpha, IL-6, IL-8 e
IL-12 (p40). La determinación de los niveles de
IL-12 (p70) se llevó a cabo usando un kit
disponible en el comercio (Endogen, Wobum, MA). Se midieron los
niveles de IFN-\gamma e IL-5
mediante ELISA en sándwich de dos sitios, usando anticuerpos de
Chromogenix (Mölndal, Suecia) y Pharmingen, respectivamente.
La significancia estadística se determinó usando
el ensayo de Wilcoxon apareado de dos colas.
Como se muestra en la figura 1, los monocitos
purificados de CMSP expresan IL-3R\alpha (CD123),
pero pierden esta expresión después de 6 días de cultivo en medio
solo. La pérdida de expresión de IL-3R\alpha se
evitó cuando se añadió IFN-\beta (1000 U/ml) el
primer día de cultivo (figura 1). Este análisis se llevó a cabo en
la fracción de células viables en el cultivo. De hecho, más del 90%
de los monocitos cultivados en medio solo o en presencia de
IFN-\beta 1000 U/ml, eran apoptóticas, cuando se
evaluó por citometría de flujo usando tinción doble con anexina V y
yoduro de propidio (fig. 2). La adición de IL-3 el
primer día de cultivo potenció notablemente la supervivencia de los
monocitos. De hecho, más del 65% de las células todavía estaban
vivas después de 6 días de cultivo en presencia de
IL-3 e IFN-\beta.
Para caracterizar las células obtenidos por
cultivo de monocitos en IL-3 e
IFN-\beta, los autores de la invención primero
miraron su morfología ultraestructural. Como se muestra en la
figura 3, los monocitos cultivados en estas condiciones adquieren
expansiones citoplasmáticas de tipo dendrítico. Por lo tanto, las
células derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e
IFN-\beta, se denominarán en lo sucesivo CD
IL-3/IFN-\beta.
Los análisis por citometría de flujo (fig. 4)
demostraron que estas células expresaban marcadores de linaje
mieloide (CD11c, CD14, y CD33) pero eran negativas para la
expresión de CD3, CD4, CD8, CD11b, CD16, CD19, CD45RA y CD154
(CD40L). También expresaban altos niveles de moléculas HLA de clase
I y clase II, CD40, CD54, CD80 y CD86, y
IL-3R\alpha (CD123). Como se esperaba^{7}, el
último marcador sólo era expresado con niveles bajos en las CD
derivadas de monocitos cultivados en IL4 y GM-CSF.
A la inversa, CD1a era expresado en CD
IL-4/GM-CSF pero no en células
derivadas de monocitos cultivados en IL-3 e
IFN-\beta.
Cuando los monocitos eran cultivados en
IL-3 sola, se adherían fuertemente al plástico, de
modo que sólo se podían recoger cantidades limitadas de dichas
células para el posterior análisis. Por citometría de flujo,
expresaban niveles menores de CD80 y CD86, y niveles mayores de
CD14 que las CD IL-3/IFN-\beta
(fig. 4), lo cual sugiere que están más cerca de los macrófagos. En
experimentos adicionales, los autores de la invención encontraron
que el IFN-\alpha ejerce un efecto similar al
IFN-\beta, de modo que la combinación
IL-3+INF-\alpha también daba como
resultado la generación de CD mieloides positivas para
IL-3R\alpha, que expresaban CD80 y CD86 (fig.
5).
La capacidad de endocitosis de las CD
IL-3/IFN-\beta se estudió por
absorción de fase fluida de FITC-dextrano. Como se
muestra en la figura 6, las CD
IL-3/IFN-\beta absorben
activamente dextrano, aunque eran menos potentes que las CD
IL-4/GM-CSF en esto.
Para estudiar más el estado de maduración de las
CD IL-3/IFN-\beta, los autores de
la invención analizaron su expresión de CD83 y
DC-LAMP, que son marcadores establecidos de CD
maduras. Como se muestra en la figura 6, ambos marcadores estaban
ausentes en las CD IL-3/IFN-\beta
en reposo, pero estaban claramente regulados positivamente tras
estimulación con LPS (fig. 7).
Las CD
IL-3/IFN-\beta segregaban
espontáneamente IL-6, IL-8,
IL-12 (p40) y TNF\alpha. Comparado con las CD
GM-CSF/ IL-4, las CD
IL-3/IFN-\beta producían menos
IL-12 (p40), mientras que su secreción de
IL-8 era ligeramente mayor (tabla 1). Al igual que
en el caso de las CD IL-4/GM-CSF, la
unión tanto de LPS como de CD40 inducida por transfectantes CD40L
regula positivamente la síntesis de citoquina por las CD
IL-3/IFN-\beta. Comparadas con las
CD GM-CSF/IL-4, las CD
IL-3/IFN-\beta producían niveles
menores de TNF-\alpha como respuesta a los LPS,
niveles mayores de IL-6 e IL-8 como
respuesta a CD40L, y niveles mucho menores de IL-12
(p40) e IL-12 (p70), independientemente del
estímulo considerado.
Para analizar la producción de
IFN-\alpha, los autores de la invención
incluyeron como estímulos adicionales el virus influenza inactivado
con formaldehído y Poli(I:C) que mimetiza ARN bicatenario
vírico. Como se muestra en la tabla 2, el Poli(I:C) era el
único estímulo que inducía la producción de
IFN-\alpha por las CD
IL-3/IFN-\beta. En estas
condiciones, los niveles de IFN-\alpha segregados
fuertemente por las CD
IL-3/IFN-\beta, eran más de diez
veces mayores que los producidos por las CD
IL-4/GM-CSF (128 \pm 24 pg/ml,
p<0,05) (figura 12).
Para evaluar la capacidad de las CD
IL-3/IFN-\beta para provocar las
respuestas de linfocitos T naive, se prepararon cultivos de
leucocitos mixtos de linfocitos T CD4^{+} de sangre de cordón
umbilical y CD IL-4/GM-CSF o
IL-3/IFN-\beta. En todas las
proporciones de estimulador/respondedor, las CD
IL-3/IFN-\beta eran tan eficaces
como las CD GM-CSF/IL-4 para inducir
la proliferación de linfocitos T CD4^{+} naive (fig. 8A). En
experimentos posteriores diseñados para analizar el perfil de las
citoquinas segregadas por los linfocitos T tras exposición a CD
alogénicas, se prepararon cultivos de linfocitos mixtos usando
linfocitos T CD4^{+} CD45RA^{+} de adulto como células
respondedoras. Como se muestra en la figura 8B, las CD
IL-3/IFN-\beta indujeron la
producción de grandes cantidades de IFN-\gamma,
mucho mayores que las provocadas por las CD
IL-4/GM-CSF. Para determinar si la
IL-12 estaba implicada en la inducción de la
producción de IFN-\gamma, los autores de la
invención añadieron un anticuerpo
anti-IL-12 neutralizante a los
cultivos de leucocitos mixtos. La neutralización de la
IL-12 inhibe más del 60% de la producción de
IFN-\gamma cualquiera que sea el tipo de CD
considerada (no se muestran los datos), indicando que los niveles
bajos de IL-12 segregada por las CD
IL-3/IFN-\beta contribuyen a su
capacidad para provocar la producción de
IFN-\gamma por los linfocitos T. Igualmente, las
CD IL-3/IFN-\beta también
indujeron la producción de IL-5 en cultivo de
leucocitos mixto, y respecto a esto también eran mucho más eficaces
que las CD IL-4/GM-CSF (fig.
8B).
Entre la población de CD, se definieron distintos
linajes de acuerdo con la expresión de moléculas de superficie. Las
CD CD11c^{+} CD123^{-} presentan características de linaje
mieloide y dependen de GM-CSF para su
supervivencia^{5;18}. Se cree que las CD CD11c^{-} CD123^{+}
dependientes de IL-3, pertenecen a linaje
linfoide^{7}, aunque Olweus y col., mostraron que en las zonas de
los órganos linfoides humanos dependientes de linfocitos T, un
subconjunto grande de CD que expresan niveles altos de
IL-3R\alpha pertenecen a un linaje
mieloide^{19}. Los experimentos descritos por los autores de la
invención, demuestran que los monocitos cultivados en
IL-3 e IFN-\beta dan lugar a un
tipo distinto de CD que expresan un nivel alto de moléculas de
superficie tanto CD11c como CD123. Además de su morfología, su
naturaleza de célula dendrítica se estableció además por su
capacidad para inducir la proliferación de linfocitos T CD4^{+}
naive en MLR. Es interesante, que se mostró previamente que la
IL-3 cooperaba con el factor de necrosis tumoral en
la generación de células dendríticas/Langerhans a partir de células
progenitoras hematopoyéticas CD34^{+, 20}. Puesto que la
población inicial en los experimentos llevados a cabo por los
autores de la invención, consiste en monocitos purificados, y las
CD IL-3/IFN-\beta difieren de las
células dendríticas/Langerhans en términos de la expresión de CD1a
y CD14, parece que IL-3 puede promover la
diferenciación de diferentes poblaciones de CD.
Recientemente, se ha mostrado que el
IFN-\beta puede potenciar la maduración de CD
derivadas de monocitos^{21}. Comparadas con las CD clásicas
generadas en GM-CSF e IL-4, las CD
IL-3/IFN-\beta están en un estado
de maduración superior, como se indica por su mayor expresión de
superficie de moléculas coestimuladoras y HLA. La menor capacidad
endocítica de las CD
IL-3/IFN-\beta también puede
reflejar su mayor nivel de maduración^{22}. En lo que se refiere
a la producción de citoquinas, las CD
IL-3/IFN-\beta segregan niveles
mucho menores de IL-12 comparadas con las CD
GM-CSF/IL-4. Esto puede estar
relacionado con su mayor estado de maduración, ya que se mostró
previamente que la maduración de las CD daba como resultado una
menor producción de IL-12^{23}. Además, el
IFN-\beta puede inhibir directamente la síntesis
de IL-12 por las CD^{24}. El hecho de que las CD
IL-3/IFN-\beta presentaran menor
capacidad de endocitosis, también puede reflejar su mayor nivel de
maduración. Aunque presentan varias características que sugieren un
grado mayor de maduración de las CD
IL-4/GM-CSF, las CD
IL-3/IFN-\beta no se deben
considerar como completamente maduras, ya que no expresan CD83 ni
DC-LAMP. sin embargo, estos marcadores aparecen
claramente después de estimulación con LPS, como en el caso de las
CD IL-4/GM-CSF.
En un estudio previo se observó que las CD
diferenciadas de los cultivos de monocitos en presencia de
IFN-\beta y GM-CSF son de vida
corta^{16}. En este informe, los presentes autores de la
invención, demuestran que la IL-3 rescata de la
apoptosis a los monocitos cultivados en presencia de
IFN-\beta, y les permite diferenciarse en CD
maduras. Estas observaciones demuestran un efecto de cooperación de
la IL-3 e IFN-\beta en la
supervivencia y diferenciación celular. Se sabe poco sobre el
efecto de los IFN tanto de tipo I como de tipo II en la expresión
del receptor de IL-3. Nunca se ha evaluado el efecto
de los IFN de tipo I en la expresión de
IL-3R\alpha, pero se ha mostrado que el
IFN-\gamma regula positivamente la expresión de
IL-3R\alpha en células endoteliales
humanas^{25}. Además, se ha mostrado que el
IFN-\gamma tiene un efecto sinérgico con la
IL-3 en el crecimiento de progenitores
hematopoyéticos humanos inmaduros^{26}, aunque este efecto no se
correlacionó con la regulación positiva de la expresión de
IL-3R\alpha^{27}. Sin embargo, se sabe que la
IL-3 estimula la diferenciación de monocitos a
partir de progenitores mieloides y su
activación^{28-30}. Más recientemente, se ha
mostrado que la IL-3 es un factor de supervivencia
crítico para los precursores de CD
IL-3R\alpha^{+} aisladas de sangre humana, nódulos
linfáticos y médula osea^{6;7;19}.
A pesar de su bajo nivel de producción de
IL-12, las CD
IL-3/IFN-\beta estimulan un alto
nivel de producción de IFN-\gamma de linfocitos T
CD4^{+} de adulto, sugiriendo que usan otras moléculas de
membrana o factores para provocar la síntesis de citoquinas Th1. De
hecho, recientemente se describió la ruta de
IFN-\gamma independiente de
IL-12^{13;14;31-33}. Sin embargo,
los menores niveles de IFN-\gamma medidos tras
neutralización de la IL-12, indican que la
IL-12 contribuye a la función de las CD
IL-3/IFN-\beta. Considerados
juntos, los datos presentados en la presente invención, indican que
las CD IL-3/IFN-\beta difieren de
las células plasmacitoides CD4^{+} CD3^{-} CD11c^{-}
IL-3R\alpha^{+} aisladas de sangre periférica,
descritas por Grouard y col.^{6}, ya que éstas últimas células
mostraron ser malos inductores de IFN-\gamma en
MLR.
La capacidad de las CD
IL-3/IFN-\beta para producir
niveles altos de IFN-\alpha tras estimulación con
Poli(I:C) puede ser importante por sus efectos en el marco
de infecciones víricas^{34}. Esta respuesta a Poli(I:C)
está de acuerdo con su origen mieloide^{35}. Es interesante, que
las CD IL-3/IFN-\beta responden
poco al virus influenza en relación con la inducción de MxA por el
IFN-\beta^{36}. La diferentes sensibilidades al
virus influenza y Poli(I:C) está de acuerdo con el hecho de
que Poli(I:C) actúa en la proteína-quinasa R
expresada en el citoplasma, mientras que los receptores de
superficie están implicados en las respuestas a todos los
virus^{37}.
Las CD
IL-4/GM-CSF derivadas de monocitos,
ahora se usan clínicamente como herramientas para inducir inmunidad
antitumoral^{38-40}. En esta memoria, los autores
de la invención muestran que las CD
IL-3/IFN-\beta son más eficaces
que las IL-4/GM-CSF para provocar la
producción de IFN-\gamma e IL-5
por linfocitos T colaboradores. Esto puede ser importante para la
vacunación del cáncer, ya que se encontró que ambas citoquinas
tienen efecto sinérgico en el rechazo tumoral^{41}. Debido a su
capacidad para inducir la producción tanto de
IFN-\gamma como de IL-5, y a su
facilidad de generación a partir de monocitos de sangre periférica,
los autores de la invención sugieren que las CD
IL-3/IFN-\beta deben tener interés
en el desarrollo de nuevas terapias del cáncer basadas en CD.
Resumen del ejemplo
1
Los autores de la invención observaron que el
interferón \beta (IFN-\beta) prevenía la
regulación negativa de la cadena \alpha del receptor de
interleuquina 3 (IL-3R\alpha) que se produce
espontáneamente durante el cultivo de monocitos humanos. La
funcionalidad del IL-3R se demostró por el hecho de
que la IL-3 rescataba de la apoptosis a los
monocitos tratados con IFN-\beta. Mientras que
más del 90% de los monocitos morían después de 6 días de cultivo en
IFN-\beta solo, el 65% de las células todavía
estaban vivas en presencia de IL-3 e
IFN-\beta. Después, los autores de la invención
encontraron que los monocitos cultivados en presencia de
IFN-\beta e IL-3 adquieren una
morfología dendrítica y expresan niveles altos de moléculas HLA de
clase I y de clase II y coestimuladoras, tales como CD40, CD54, CD80
y CD86. Cuando eran estimuladas por lipopolisacáridos (LPS) o
fibroblastos que expresan el ligando CD40 (transfectados CD40L),
las CD generadas en IFN-\beta e
IL-3 (CD
IL-3/IFN-\beta) segregaban niveles
altos de IL-6, IL-8 y factor de
necrosis tumoral (TNF)-\alpha, pero sólo niveles
muy bajos de IL-12, comparado con las CD generadas
en IL-4 y factor estimulador de colonia de
granulocitos y macrófagos (CD
IL-4/GM-CSF). Los autores de la
invención encontraron que las CD
IL-3/IFN-\beta inducían una
respuesta proliferativa vigorosa de linfocitos T de cordón
umbilical alogénicos. En cultivo de leucocitos mixtos con linfocitos
T CD4^{+} de adulto, las CD
IL-3/IFN-\beta provocaban la
producción de niveles altos tanto de IFN-\gamma
como de IL-5. Finalmente, se encontró que las CD
IL-3/IFN-\beta producían niveles
mucho mayores de IFN-\alpha que las CD
IL-4/GM-CSF como respuesta al
Poli(I:C). Los autores de la invención concluyen que los
monocitos cultivados en presencia de IL-3 e
IFN-\beta se diferencian en CD con potente
capacidad estimuladora de linfocitos T colaboradores a pesar de su
baja expresión de IL-12.
Los autores de la invención probaron que las CD
derivadas de monocitos generadas a partir de células mononucleares
de sangre periférica por cultivo en interleuquina
(IL)-3 e interferón (IFN)-\beta
(CD IL-3/IFN-\beta) se pueden
usar en ensayos clínicos como herramientas para inducir respuestas
antitumorales in vivo^{38-40}. Con el fin
de determinar si las CD
IL-3/IFN-\beta pueden inducir la
muerte celular programada en células tumorales, esas células se
cocultivaron con un panel de líneas celulares tumorales (línea
celular Jurkat, la línea celular Molt-4 (obtenida
del Instituto Pasteur, Lille, Francia); línea celular Cem (obtenida
de Dr. T. Velu (ULB, Bruselas, Bélgica), líneas celulares 786.0,
A498 y Caki 2 proporcionadas por Dr. R. Kiss (ULB, Bruselas,
Bélgica); líneas celulares Daudi adquiridas en ATCC). Se midió el
porcentaje de fragmentación de ADN en células diana usando el
ensayo de interferencia. Brevemente, las células diana se marcaron
con [^{3}H]-timidina 5 \muCi/ml por incubación
toda la noche a 37ºC. Las células diana marcadas se recogieron, se
lavaron y se sembraron en placas con fondo en U de 96 pocillos con
una densidad de 10.000 células/pocillo. Las células efectoras se
lavaron y se añadieron a las células diana. Después de 18 h, se
recogieron los núcleos intactos (ADN de alto PM, no fragmentado),
usando un microcosechador 96, y se midió la radiactividad en un
contador beta de microplaca. Los datos se expresaron como el
porcentaje de fragmentación de ADN calculado por la siguiente
fórmula: [1-(cpm con efectoras / cpm sin efectoras)] x 100. Los
autores de la presente invención observaron que las CD
IL-3/IFN-\beta en una relación de
E:T = 10:1 presentaban actividad citotóxica significativa frente a
6 de 8 líneas tumorales ensayadas. Como se muestra en la figura 9,
las líneas celulares Molt-4, Jurkat, 786.0, A498 y
Caki2 eran susceptibles a la apoptosis mediada por las CD
IL-3/IFN-\beta, así como las
células Daudi, aunque en menor grado. Por otra parte, las células
Cem eran resistentes.
La observación de que las CD
IL-3/IFN-\beta derivadas de
monocitos pueden desencadenar la apoptosis en células tumorales es
importante para su uso terapéutico como vacunas antitumorales. De
hecho, informes recientes demostraron que las CD
IL-4/GM-CSF pueden procesar las
células apoptóticas y presentar de forma cruzada los antígenos
derivados de una forma restringida a MHC de clase I, dando como
resultado la inducción de respuestas eficaces de linfocitos T
citotóxicos^{42-43}. Por lo tanto, las CD que son
inyectadas directamente en tumores inducirán primero la apoptosis
en células cancerosas, y finalmente migran a los nódulos linfáticos
donde inducen las respuestas de los linfocitos T específicos del
tumor.
Las CD se generaron a partir de CMSP de donantes
de sangre sanos, mediante un cultivo de 5 días en presencia de
GM-CSF (800 UI/ml) e IL-4 (500
UI/ml) (CD GM o CD IL4/CSF) o IL-3 (50 UI/ml) e
IFN-\beta (1000 UI/ml) (CD I3 o IL3/CD IFN-
\beta). Después de recogerlas, estas células se trataron con
pulsos durante 2 horas con la proteína E7 (20 \mug/ml) a 37ºC en
atmósfera de CO_{2} al 5%, y se activaron o no con LPS (1
\mug/ml, estimulación toda la noche). Las CD tratadas con pulsos
con E7 se cocultivaron con linfocitos T CD4+ purificados autólogos
en una relación 1:10 durante 6 días. Como sistemas de lectura para
evaluar la producción de IFN-\gamma se usaron
ELISPOT ELISA y citometría de flujo (tinción intracelular).
Los datos de estos experimentos muestran que las
CD I3 no activadas son al menos iguales o incluso superiores a las
CD GM estimuladas con LPS, en la inducción de respuestas
anti-E7. Puesto que E7 es una proteína derivada de
HPV 16, un virus implicado en la patogénesis del cáncer de cuello
cervical, estos datos son importantes para el diseño de nuevas
vacunas para el cáncer/inmunoterapia.
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Claims (44)
1. Un procedimiento in vitro para la
diferenciación y maduración de monocitos en células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+, que comprende incubar
dichos monocitos con una combinación de interferón de tipo I e
IL-3.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la IL-3 y el interferón
de tipo I se añaden a los monocitos simultáneamente, secuencialmente
o por separado.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que el interferón de tipo I está
presente con una concentración entre 10 y 20000 U/ml.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que el interferón de tipo I está presente
con una concentración de 1000 U/ml.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el que la IL-3 está
presente con una concentración entre 1 y 1000 U/ml.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la IL-3 está presente
con una concentración de 50 U/ml.
7. Un procedimiento in vitro para obtener
una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende incubar los monocitos
aislados de un paciente, en presencia de interferón de tipo I e
IL-3.
8. Un procedimiento in vitro para producir
una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende al
menos las siguientes etapas:
(a) incubar monocitos aislados de un paciente en
presencia de interferón de tipo I e IL-3, dando
como resultado una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+, y
(b) presentar un péptido en la superficie de
dichas células dendríticas.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en
la superficie de dichas células dendríticas se consigue poniendo en
contacto dichas células dendríticas con al menos una parte de un
antígeno expresado de forma diferencial en una célula.
10. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en
la superficie de dichas células dendríticas se consigue mediante el
tratamiento con pulsos de dichas células dendríticas con proteínas
antigénicas.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en
la superficie de dichas células dendríticas se consigue cargando
dichas células dendríticas con péptidos antigénicos.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en
la superficie de dichas células dendríticas, se consigue por
transformación/transducción de dichas células dendríticas por
moléculas de ácido nucleico que codifican al menos parte de dicho
antígeno.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que dicho antígeno es expresado en la
superficie de dicha célula dendrítica transformada/transducida.
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la capacidad de presentar un péptido en
la superficie de dichas células dendríticas se consigue por fusión
de dichas células dendríticas con células que llevan antígenos
específicos.
15. Un procedimiento in vitro para activar
un linfocito T usando células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ que se pueden obtener por un
procedimiento como se describe en las reivindicaciones anteriores,
que comprende al menos las siguientes etapas:
(a) incubar monocitos aislados de un paciente, en
presencia de interferón de tipo I e IL-3 para
proporcionar una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+,
(b) presentar un péptido en la superficie de
dichas células dendríticas, proporcionando así una población de
células dendríticas presentadoras de antígeno; y,
(c) activar una población de linfocitos T con
dicha población de células dendríticas presentadoras de
antígeno.
16. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que dicho linfocito T es un linfocito T
colaborador.
17. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho interferón de tipo I
se elige de un grupo que consiste en IFN- \beta,
IFN-\alpha o sus moléculas peptidomiméticas.
18. Una población de células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de
antígeno o una población de linfocitos T activados que inducen
respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\gamma) como de
tipo TH2 (IL-5), que se pueden obtener por un
procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, o una de sus combinaciones.
19. Un procedimiento in vitro para
estimular más una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ que se pueden obtener por un
procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que dichas células dendríticas se
incuban adicionalmente con un estimulador que puede inducir la
producción de IFN-\alpha en dichas células
dendríticas.
20. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que dicho estimulador se elige de un grupo
que comprende virus, bacteria, LPS, ácido nucleico, derivados
funcionales o una de sus combinaciones.
21. Una población de células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+ estimuladas, que se pueden
obtener por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó
20.
22. Una composición para usar como medicamento, o
un producto basado en células dirigido al uso clínico, que
comprende al menos una de las siguientes combinaciones de
componentes:
- IL-3 e interferón de tipo I
- IL-3 e interferón de tipo I
mezclado con antígeno y/o estimulador, que puede inducir la
producción de IFN-\alpha en células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+
- una población de monocitos mezclada con
IL-3 e interferón de tipo I
- una población de monocitos mezclada con
IL-3, interferón de tipo I y antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ mezclada con antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o,
- una población de linfocitos T activados que
inducen tanto respuestas de tipo TH1 (IFN-\beta)
como de tipo TH2 (IL-5), que se puede obtener usando
células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+
presentadoras de antígeno,
en la que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, o en la que dichas células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, o una de
sus combinaciones.
23. Una composición o un producto basado en
células de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho
interferón de tipo I se elige de un grupo que consiste en
IFN-\beta, IFN-\alpha o sus
moléculas peptidomiméticas.
24. Una composición o un producto basado en
células de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23, complementada con
al menos una citoquina adicional.
25. Una composición o un producto basado en
células de acuerdo con la reivindicación 24, en la que dicha
citoquina se elige del grupo que comprende
IFN-\alpha, IFN-\beta,
IL-3 e IL-12.
26. Uso de una composición o un producto basado
en células, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a
25, para preparar un medicamento para tratar el cáncer, infecciones
y enfermedades autoinmunes.
27. Una composición farmacéutica que comprende un
vehículo farmacéuticamente aceptable y los componentes de una
composición como se describe en cualquiera de las reivindicaciones
22 a 25.
28. Uso de una población o una composición de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18, 21, 22 a 25 y
27, para preparar un medicamento para matar una célula diana.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en
el que dicha célula diana se selecciona del grupo que consiste en
una célula cancerosa, una célula bacteriana, una célula infectada
por parásito o una célula infectada por virus.
30. Un procedimiento de cribado in vitro,
que usa una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+, una población de células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno,
una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ estimuladas, una población de células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de
antígeno estimuladas, o una población de linfocitos T activados que
inducen respuestas tanto de tipo TH1 (IFN-\gamma)
como de tipo TH2 (IL-5), que se pueden obtener por
un procedimiento in vitro de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, y 19 a 20.
31. Uso de una población de células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+, una población de células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras de
antígeno, una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ estimuladas, una población de células
dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+ presentadoras
de antígeno estimuladas, o una población de linfocitos T activados
que inducen respuestas tanto de tipo TH1
(IFN-\gamma) como de tipo TH2
(IL-5), que se pueden obtener por un procedimiento
in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1 a 17, y 19 a 20, para preparar ensayos de cribado in vitro.
32. Un procedimiento in vitro para
detectar la actividad mediada por linfocitos T de un péptido
antigénico diana, que comprende al menos las siguientes etapas:
(a) poner en contacto un linfocito T aislado de
un paciente, con una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno,
proporcionando así un linfocito T activado,
(b) poner en contacto una célula diana con dicho
linfocito T activado, y
(c) controlar el efecto de dicho linfocito T
activado en dicha célula diana, detectando así la actividad
antidiana,
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, o en el que dichas células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, o una de
sus combinaciones.
33. Un kit para detectar la actividad mediada por
linfocito T de un péptido antigénico diana, que comprende al menos
una combinación de componentes elegidos de la siguiente lista:
- IL-3 e interferón de tipo I
- IL-3 e interferón de tipo I
mezclado con antígeno y/o estimulador, que puede inducir la
producción de IFN-\alpha en células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+
- una población de monocitos mezclada con
IL-3 e interferón de tipo I
- una población de monocitos mezclada con
IL-3, interferón de tipo I y antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ mezclada con antígeno y/o
estimulador, que puede inducir la producción de
IFN-\alpha en células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+
- una población de células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ presentadoras de antígeno, o,
- una población de linfocitos T activados que
inducen tanto respuestas de tipo TH1 (IFN-\beta)
como de tipo TH2 (IL-5), que se puede obtener usando
células dendríticas mieloides IL3-R+ CD11c+
presentadoras de antígeno,
en el que dichas células dendríticas mieloides
IL3-R+ CD11c+ no están estimuladas y se pueden
obtener de acuerdo con un procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, o en el que dichas células dendríticas
mieloides IL3-R+ CD11c+ son estimuladas usando un
procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, o una de
sus combinaciones.
34. Un kit de acuerdo con la reivindicación 33,
en el que el interferón de tipo I se elige de un grupo que consiste
en IFN-\beta, IFN-\alpha o sus
moléculas peptidomiméticas.
35. Uso de una composición de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27 como adyuvante de
vacuna para preparar un medicamento.
36. Adyuvante de vacuna que comprende una
composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a
25 y 27.
37. Uso del adyuvante de vacuna de la
reivindicación 36, para preparar un medicamento para inmunizar
seres humanos o animales frente a una enfermedad.
38. Uso de la composición de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 y 27, para preparar un
medicamento para el tratamiento del cáncer, infecciones y
enfermedades autoinmunes.
39. Uso de la composición de cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 25 y 27 para preparar un medicamento para el
tratamiento del cáncer, en el que el antígeno, como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, 22 y 33, es un antígeno
específico de tumor.
40. Uso de la composición de cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 25 y 27 para preparar un medicamento para el
tratamiento de infecciones, en el que el antígeno, como se define
en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, 22 y 33, es un
antígeno específico de infección.
41. Uso de la reivindicación 40, en el que dicha
infección se selecciona del grupo de VIH, virus de papiloma humano,
virus Ebstein-Barr y citomegalovirus.
42. Uso de la composición de cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 25 y 27 para preparar un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad autoinmune, en la que el antígeno,
como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, 22 y
33, es una proteína del organismo.
43. Uso de acuerdo con la reivindicación 42, en
el que dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que
consiste en esclerosis múltiple, miastenia grave, artritis crónica
juvenil, artritis crónica, LED, dermatitis atópica y diabetes
juvenil.
44. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 37 a
43, en el que el medicamento se formula para administrar al
paciente por vía intravenosa, intralinfoide o intratumoral.
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