KR20080106193A - 막 귀소 폴리펩티드로 일시적 형질이입된 가지 세포 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 막 귀소 펩티드 및 임의로 적어도 하나의 추가의 항원을 일시적으로 발현하는 가지 세포("DC")를 생성하는 개선된 방법을 제공한다. 이러한 DC는 생체내에서 림프절로 귀소하는 능력을 갖고 있다. 일부 구현양태에서, DC는 환자에게 정맥내 투여될 수 있고, 이어서 림프절에 귀소하여 면역 반응을 자극할 수 있다. 본 발명의 방법 및 DC는 다양한 질병 및 질환의 치료를 위해 유용하다.

막 귀소 폴리펩티드, 일시적 형질이입, 가지 세포, 면역 반응.

Description

막 귀소 폴리펩티드로 일시적 형질이입된 가지 세포 및 그의 용도 {DENDRITIC CELLS TRANSIENTLY TRANSFECTED WITH A MEMBRANE HOMING POLYPEPTIDE AND THEIR USE}

본 발명은 가지 세포를 형질이입(transfect)시키는 개선된 방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 막 귀소(homing) 폴리펩티드로 일시적 형질이입된 가지 세포의 생성 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 가지 세포는 정맥내 투여 후에 림프절에 항원을 전달할 수 있다.

매년 오 십만 명 이상의 미국인이 암으로 사망하고, 즉 하루에 1,500 명 이상이 사망한다. 미국에서 사망하는 사람의 4명 중 한 명이 암으로 사망한다. 매년 2백만 건 이상의 새로운 암의 사례가 진단된다 (문헌 [American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2004] 참조). 암 환자를 위한 효과적인 치료는 중요한 과제이다. 전형적인 치료 요법은 외과 절제술, 외부 방사선 요법, 및/또는 전신 화학요법을 포함한다. 이러한 요법은 일부 종류의 악성종양을 치료하는데 부분적으로 성공하였으나, 다른 암에서는 만족스러운 결과를 가져오지 못하였고, 환자에서 급격한 바람직하지 못한 부작용을 일으킬 수 있다.

일부 경우에, 가지 세포에 기초한 백신접종이 암 치료에 대해 상당한 성공을 나타내는 비교적 새로운 접근법이다. 가지 세포(DC)는 면역 체계의 전문적인 항원-제시 세포이고, 면역 반응을 상당히 자극하는 잠재력을 갖는다. 이들은 말초 혈액을 포함한 사실상 모든 조직에서 보초 세포로서 역할을 하고, 이 경우에 이들은 자신이 노출된 항원을 연속적으로 섭취하고 처리한다. DC는 계속해서 배수 림프절로 이동하고, 이곳에서 이들은 림프구에 항원을 제시한다. 미성숙 DC는 항원 섭취 및 처리에서 특히 양호하지만, 생산 T-세포 반응은 성숙되고 충분히 활성화된 DC를 필요로 한다. 바이러스, 기타 병원체 및 내인성 암에 대한 면역 반응을 일으킴에 있어서 매우 작은 수의 활성화 DC로도 매우 효과적이다.

가지 세포의 면역-조절 능력의 이용은 암 치료를 위해 상당히 유망하다. 따라서, 다양한 질병 및 질환을 치료하기 위하여 DC "백신"을 개발하기 위해 상당한 양의 작업을 수행하여 왔다. DC 백신은 종양-관련 항원과 같은 항원으로 부하(load)된 DC를 포함한다. 환자에게 투여 시에, DC 백신은 부하된 항원을 포함한 세포에 대하여 면역 반응, 예컨대, 그 항원을 포함한 암 세포에 대해 항원-특이적 T-세포 반응을 유도하는 것으로 생각된다.

그러나, 초기의 결과가 유망하긴 하지만, 지금까지 질병 또는 질환의 치료를 위하여 어떠한 DC 백신도 승인되지 않았다. 임상 시험 결과를 적절히 평가하고, 관리 승인을 위해 엄격한 요건을 만족할 수 있는 표준화된 치료법을 제공하기 위하여, 표준화된 임상 및 면역학적 기준의 주의깊은 연구 설계 및 사용이 요구된다 (예를 들어, [Figdor et al. (2004) Nat.Med.10: 475] 참조). 임상 시험에서 DC-기초 요법을 위해 다수의 중요한 매개변수들이 평가되어야 하며, 이러한 매개변수 들이 개별적 및 집합적으로 최적화된다면 DC 백신의 효능을 개선할 가능성이 존재한다. 따라서, 특징화되고 표준화된 DC 백신을 개발하고 사용하는 것이 요구되고 있다 (예를 들어, 문헌 [Figdor et al. (2004) Nat.Med. 10: 475] 참조).

혈액-유래 단핵구로부터 DC가 다량으로 발생될 수 있고 (이하, "단핵구-유래 DC" 또는 "moDC"라 일컬어짐), 많은 임상 단계 I 및 단계 II 시험에서 사용되어 왔다. 대부분의 시험에서, 피내 또는 피하 주사를 통하여 DC를 환자에게 투여하였다 (예를 들어, 문헌 [Markiewicz et al. (2004), Cancer Invest. 22: 417-434]; [Gilbora and Vieweg (2004) Immunol.Rev. 199: 251-263]; [Paczesny et al. (2003) Semin.Cancer Biol. 13: 439-447]; [Banchereau et al. (2001) Cell 106: 271-274]; [Figdor et al., (2004) Nat.Med. 10: 475-480] 참조). 그러나, 항원-특이적 T-세포 자극이 발생하는 말초 림프 조직에 이르르기 위하여, DC는 주사 부위로부터 배수 림프절로 이동해야 한다. 유감스럽게도, DC가 피내 또는 피하 주사를 통해 투여될 때, 국소 림프절(LN)로의 이동이 매우 비효율적이어서, 기껏해야 DC의 약 1 % 내지 2% 만이 국소 림프절에 이르른다 (예를 들어 [Ridolfi et al. (2004) J.Transl.Med. 2:27]; [de Vries et al. (2003) Cancer Res. 63: 12-17]; [Morse et al. (1999) Cancer Res. 59: 56-58] 참조). 이러한 비효율적 이동은 효과적인 DC 예방접종을 위해 주된 장애물이다 (예를 들어 [Rosenberg et al. (2004) Nat.Med.10: 909-915] 참조).

피내 또는 피하 주사를 통한 투여의 다른 가능한 단점은, T 세포에 미치는 주위 조직의 효과와 관련된다. 상이한 기관의 림프절에 있는 T 세포는, 신체 전체 에 걸쳐 더욱 일반적인 분포를 가능하게 하기보다는, DC와의 접촉 후에 이 기관에 T 세포를 표적화하는 귀소 패턴을 얻는다는 증거가 점점 증가하고 있다 (예를 들어, 문헌 [von Andrian et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1020-1034]; [Robert et al. (1999) New Engl. J.Med. 341: 1817-1828]; [Campbell et al. (2002) J.Exp.Med. 195: 135-141]; [Dudda et al. (2004) J.Immunol. 172: 857-863]; [Dudda et al., (2005) Eur.J.Immunol. 35: 1056-1065] 참조). 사실상, DC를 피내 또는 림프관내 주사하는 DC 예방접종 전략에 의하여 대부분의 피부 전이가 효과적으로 제거됨이 보고되었다 (예를 들어 문헌 [Nestle et al. (1998) Nat.Med. 4: 328-332]; [Thurner et al. (1999) J.Exp.Med. 190: 1669-1678]; [Banchereau et al. (2001) Cancer Res. 61: 6451-6458] 참조).

피험자에게 DC의 대안적인 전달 시스템은 림프절에 직접적으로 주사하는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 접근법은 상당한 위험 및 단점을 갖고 있다. 림프절에 주사될 수 있는 백신의 부피는 제한되고, 효과를 내는 데는 특별한 장치 및 경험이 요구된다. 절차가 적절히 수행되지 않는다면, DC가 림프절로 전달될 수 없거나, 또는 심지어 림프절의 구조가 파괴될 수도 있다. 이 방법이 매우 가변적인 결과를 가져온다는 것은 놀라운 일이 아니다 (예를 들어, 문헌 [de Vries et al. (2003) Cancer Res. 63: 12-17]).

지금까지, 다른 전달 방법들은 비효율적인 것으로 입증되었다. 예를 들어, DC의 정맥내 주사는 다른 전달 방법과 관련된 많은 문제들을 극복할 수도 있지만, 정맥내 주사된 DC는 혈액으로부터 림프절로 직접적으로 이동할 수 없고, 그 대신에 먼저 폐에서 축적되고 그 후에 간, 비장 및 골수에서 축적된다 (예를 들어, [Morse et al. (1999) Cancer Res. 59: 56-58] 참조). 이러한 분포가 Th2-양극화 면역 반응을 선호하긴 하지만, 이러한 유형의 면역 반응은 암 치료에서 유리하지 않다 (예를 들어, [Fong et al. (2001) J.Immunol. 166: 4254-4259] 참조).

특정한 면역 세포 (예컨대 T 세포 및 가지 세포의 일부 소집단)가 고 내피 세정맥 (HEV)으로부터 림프절에 들어갈 수 있다는 것이 알려져 있다 (예를 들어 [Yoneyama et al. (2005) Int.J.Hematol. 3: 204-207] 참조). 이러한 이동은 E-셀렉틴, L-셀렉틴, CCR7 및 LFA-1을 포함하는 다양한 세포 표면 단백질에 의해 가능해진다. CCR7 및 LFA-1 단백질은 단핵구로부터 유래된 성숙한 DC ("moDC") 상에서 발현되지만 L-셀렉틴은 그렇지 않다. 셀렉틴은 특정한 조직으로의 백혈구 귀소를 위해 중요한 세포 표면 분자이다 (예를 들어 [Janeway,Jr. et al. eds. (2001) Immunobiology (제5판, Garland Publishing, New York]).

몇 가지 유형의 셀렉틴이 존재하고, 이들 모두는 일반적인 코어 구조를 공유하지만 세포외 부분에서 상이한 렉틴유사 도메인을 갖는다. L-셀렉틴은 항원에 노출된 적이 없는(naive) T 세포에서 발현되고, 혈액으로부터 말초 림프양 조직으로의 이동을 유도하는 반면, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴은 효과기 세포를 주변 조직으로 보충하기 위해 감염 부위에서 혈관 내피세포 상에서 발현된다. L-셀렉틴은, 혈관 내피 세포의 표면 위에서 발현되는 혈관 어드레신(addressin)이라 불리우는 뮤신유사 분자의 탄수화물 잔기인, 설페이트화 시알릴-루이스^x에 결합한다. 또한, L-셀 렉틴은 림프 절에서 고 내피 세정맥(HEV) 상에서 고 발현되는 말초 절 어드레신(PNAd)에 결합되는 것으로 알려져 있다.

L-셀렉틴 (예를 들어, 수탁 번호 CAB55488 또는 AAH56281)은 때때로 CD62L이라 불리우고; E-셀렉틴 (예를 들어, 수탁 번호 AAQ67702)는 때때로 CD62E라 불리우고; P-셀렉틴 (예를 들어, 수탁 번호 AAQ67703)은 때때로 CD62P라 불리운다.

문헌 [Robert et al. (2003) Gene Ther. 10: 1479-1486]은, DC가 세포 표면 위에서 키메라 E/L 셀렉틴 단백질을 발현하도록 쥐 DC가 레트로바이러스 형질도입에 의해 유전적으로 변형될 수 있음을 밝혀내었다 (미국 특허 6,929,792호 참조). 키메라 E/L-셀렉틴 단백질은, L-셀렉틴의 결합 특이성을 유지하면서, 프로테아제-풍부 DC 세포 표면으로부터의 박리를 피하기 위하여 E-셀렉틴의 프로테아제-내성 세포외 부분을 L-셀렉틴의 세포내 도메인과 조합하였다. 키메라 셀렉틴을 발현하는 DC가 피험자에게 정맥내 주사될 때, 이들은 말초 절 어드레신에 결합할 수 있고 HEV를 통해 림프절로 이동할 수 있다.

그러나, 이러한 방법은 인간의 치료를 위한 그들의 사용을 막는 몇 가지 중요한 단점을 갖고 있다. 먼저, 레트로바이러스 형질도입에 의해 변형된 세포는, 특히 관리 관점에서 볼 때, 인간에서의 치료법을 위해 적절하지 않다 (예를 들어, [Haviernik and Bunting (2004) Curr.Gene.Ther. 4: 263-276] 참조). 레트로바이러스 형질도입을 사용하는 가장 큰 단점은, 프로바이러스가 형질도입된 세포의 게놈 내로 무작위로 통합될 수 있어서, 세포 주기 제어에 관여된 것과 같은 중요한 유전자의 발현을 붕괴시킬 가능성이 있다는 것이다. 이러한 불행한 사건의 알려진 예가 중증 조합 면역결핍(SCID)를 위한 유전자 요법 임상 시험에서 발생하였다. 이러한 시험에서, 자가 조혈 줄기 세포를, SCID 환자에서 결여된 일반적인 γ 사슬을 코드화하는 유전자를 함유한 레트로바이러스 벡터로 형질도입하였으며; 적어도 2가지 경우에, 프로바이러스가 LMO-2 종양유전자에 통합되고 환자에서 백혈병-유사 증상을 일으켰다 (예를 들어 [Buckley (2002) Lancet 360: 1185-1186]; [Hacein-Bey-Abina et al (2002) New Engl. J.Med. 346: 1185-1193]; [Marshall (2002) Science 298: 34-35] 참조).

DC를 생성하기 위해 레트로바이러스 형질도입을 사용하는 다른 단점은, 형질이입의 효율이 가변적이고 레트로바이러스 형질도입이 단지 분할 세포, 예컨대 증식하는 CD34⁺ 세포로부터 유래된 DC에서만 사용되고 비-증식 단핵구로부터 유래되는 DC에서는 사용될 수 없다는 것이다 (예를 들어 [Ardeshna et al, (2000) Br.J.Haematol. 108: 817-824] 참조). 그러나, CD34⁺ 줄기 세포의 단리는 시간-소모적이고 복잡한 절차이며, 또한 환자를 위해 부담이 되고, 따라서 다른 대안이 종종 바람직하다.

비-분할 가지 세포를 형질도입하기 위해 사용될 수도 있는 대안은 렌티바이러스 형질도입 또는 아데노바이러스 형질도입을 포함한다. 그러나, 렌티바이러스 형질도입은 도입된 분자의 이종 발현을 가져온다 (예를 들어 문헌 [Dullaer et al (2004) Mol.Ther.10: 768-779]; [Breckpot et al. (2003) J.Gene Med. 5: 654-667]; [Sumimoto et al., (2002) J.Immunol. Meth. 271: 153-165] 참조). 또한, 아데노바이러스 형질도입 (예를 들어, [Korokhov et al., (2005) Cancer Biol.Ther.4: 289-294]; [Ophorst et al. (2004) Vaccine 22: 3035-3044]; [Rea et al. (2001) J.Immunol. 166: 5236-5244] 참조)이 도입된 분자의 이종 발현을 가져오고 (예를 들어 문헌 [Cho et al. (2003) Vaccine 22: 224-236] 참조), 심지어 효율적인 항암 반응 대신에 조절 T 세포의 유도를 이끌어낼 수도 있다 (예를 들어 문헌 [Lundqvist et al. (2005) J.Immunother. 28: 229-235] 참조).

세포를 형질도입하기 위해 사용된 다른 방법은 RNA 일렉트로포레이션이다. 이 방법은, 염색체 통합이 불가능하기 때문에 단지 일시적 단백질 발현 만이 발생하도록 보장하고; 따라서 방법은 세포의 성질을 단지 일시적으로 변화시킨다. RNA 일렉트로포레이션은 특정한 분자의 일시적 발현만이 필요한 적용, 예컨대 혈액으로부터 DC를 림프절로 표적화하고 DC에 의해 항원을 제시하는 적용에 적합하다. 결과가 대체로 섞여 있긴 하지만, RNA 일렉트로포레이션이 DC와 함께 사용되었다 (예를 들어, [Van Tendeloo et al. (1998) Gene Ther. 5. 700-707] 참조). 그러나, 최적화된 일렉트로포레이션 방법이 사용된다면, 약 95%의 고 형질이입 비율이 수득될 수 있다 (예를 들어, [Schaft et al. (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097] 참조).

지금까지, 예컨대 DC에 항원(Ag)을 전달하거나 또는 DC의 자극 능력을 증가시키기 위하여 제한된 상황에서 RNA 일렉트로포레이션 만이 사용되어 왔다 (예를 들어 [Abdel-Wahab et al. (2005) J.Surg.Res. 124: 264-273]; [Dannull et al. (2005) Blood 105: 3206-3213]; [Grunebach et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12: 749-756]; [Cisco et al. (2004) J.Immunol. 172: 7162-7168] 참조). 이러한 연구에서 발현된 단백질이 특정한 신호화 캐스캐이드에 연관된 신호화 수용체 또는 단백질로서 작용하는 것으로 밝혀졌으나, 매우 낮은 발현 수준이 기록되었다. 그러나, 혈액으로부터 말초 림프절로 이동할 수 있는 DC를 수득하기 위하여, 세포 표면 위에서 훨씬 높은 발현 수준이 필요하고, RNA 형질이입을 사용하여 이러한 높은 발현 수준이 달성하는 것이 불가능하거나 어려운 것으로 생각되었다.

따라서, 정맥내 투여 후에 림프절로 귀소될 수 있고 다양한 질병 및 질환의 치료를 위하여 백신으로서 사용될 수 있는 DC의 생성 방법이 여전히 요구되고 있다.

발명의 요약

본 발명은 막 귀소 펩티드 및 임의로 적어도 하나의 추가의 항원을 일시적으로 발현하는 가지 세포("DC")의 개선된 생성 방법을 제공한다. 이러한 DC는 생체내에서 림프절에 귀소되는 능력을 갖고 있다. 일부 구현양태에서, 이러한 DC는 환자에게 정맥내 투여될 수 있고, 이어서 관심 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. 본 발명의 방법 및 DC는 다양한 질병 및 질환의 치료를 위해 유용하다.

도 1은 E/L-셀렉틴 RNA의 일렉트로포레이션 후에 DC 세포에서 E/L-셀렉틴의 발현이 높다는 것을 증명한다. 성숙한 DC를 E/L-셀렉틴(ELS) RNA와 함께 또는 RNA 없이 일렉트로포레이트하고 4시간 동안 냉동보존하였으며; 이어서 세포를 해동하고 해동 후 0시간, 24시간 및 48시간에 FACS에 의하여 ELS 발현에 대해 분석하였다. 패널(a)는 ELS RNA로 일렉트로포레이트된 DC (검은색 히스토그램) 및 모의-일렉트로포레이트된 대조 DC (회색 히스토그램)의 ELS 발현을 나타낸다. 각각의 시점에 대하여, 패널(a)는 ELS-포지티브 세포의 퍼센트 및 평균 형광 강도(MFI)를 제공한다. 나타낸 데이터는 3개의 독립적으로 표준화된 실험의 전형이다. 패널(b)는 ELS RNA으로 일렉트로포레이트된 DC (백색 사각형) 및 모의-일렉트로포레이트된 DC (검은색 원)로부터의 DC 수율을 나타낸다. "수율"은 일렉트로포레이션 이전의 세포의 수에 비교하여 일렉트로포레이션 및 냉동보존 후 살아있는 세포의 퍼센트이고; 세포의 생육성은 트립판-블루 염색에 의해 결정되었다. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 표준화 실험의 평균 +/- 표준 평균 오차(SEM)를 나타낸다.

도 2는 ELS RNA로 형질이입된 DC가 성숙한 표현형을 유지함을 증명한다. 성숙한 DC를 E/L-셀렉틴(ELS) RNA와 일렉트로포레이트하거나 (회색 히스토그램) 또는 ELS RNA없이 일렉트로포레이트하고 (검은색 선), 4시간 동안 휴지시키고, 냉동보존하고, 해동하고 특징적인 성숙화-표면 마커 CD25, CD80, CD83, CD86, HLA 부류 I 및 HLA-DR에 대해 염색하였다. 점선은 각각의 마커에 대한 동형 대조를 나타낸다. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 표준화 실험의 전형이다.

도 3은 E/L-셀렉틴으로 형질이입된 DC가 그들의 CCR7-매개 이동 능력을 보유함을 증명한다. DC를 E/L 셀렉틴 RNA으로 일렉트로포레이트하거나 ("ELS RNA"), 또는 RNA없이 모의-일렉트로포레이트하고("비 RNA"), 이어서 표준 트랜스웰 이동 분석에서 CCL19를 함유하는 배지 쪽으로의 그들의 CCR7-매개 이동 능력에 대해 시험하였다 (검은색 막대: "towards") (실시예 2 참조). 윗쪽 또는 아래쪽 구획에서 CCL1 없이 세포를 트랜스웰에서 배양함으로써 자발적인 이동이 측정되었으며 (백색 막대; "neg"), 다른 대조는 윗쪽 구획에서 CCL19를 포함하였다 (회색 막대: "anti"). 3개의 표준화 실험의 평균 (+/- SEM)을 나타낸다.

도 4는 E/L-셀렉틴으로 형질이입된 DC가 항원에 노출된 적이 없는 CD8+ T 세포를 자극하기 위한 그들의 능력을 보유함을 증명한다. DC를 RNA 없이 (백색 원: "No RNA"), E/L-셀렉틴 RNA 단독으로 (검은색 원: "ELS"), 멜란A RNA 단독으로 (백색 사각형: "MelA RNA"), 또는 E/L-셀렉틴 RNA와 조합된 멜란 A (검은색 사각형: "ELS+MelA RNA")와 일렉트로포레이트하였으며, 이것들을 항원에 노출된 적이 없는 자가 CD8+ 세포를 자극하기 위해 사용하였다. 또한, 모의-일렉트로포레이트되거나 E/L-셀렉틴 RNA 단독으로 일렉트로포레이트된 일부 DC를 멜란A-유래 유사체 펩티드 (MelA pep)로 부하하고, 항원에 노출된 적이 없는 CD8+ T 세포의 자극을 위해 사용하였다. 1주일의 자극 후에, 멜란 A/A2-테트라머-결합 CD8+ T 세포를 표현형 (패널(a)) 및 세포용해 능력 (패널(b))에 대해 평가하였다. 기능성 T 세포 표현형을 다음과 같이 지정하였다: 용균 효과기 ("LE"; CD45RA⁺/CCR7^-); 효과기 기억 ("EM"; CD45RA^-/CCR7^-); 중추 기억 ("CM"; CD45RA^-/CCR7⁺); 항원에 노출된 적이 없는 T 세포 ("N"; CD45RA⁺/CCR7⁺). 멜란A 유사체 펩티드 또는 부적절한 gp100 펩티드로 부하된 T2 세포의 표적을 사용하여 세포용해 능력(b)을 표준 Cr⁵¹-방출 분석에서 결정하였다. 패널(b)에 나타낸 데이터는 멜란A 유사체 펩티드로 부하된 T2 표적 세포의 퍼 센트 용균이고; 시험된 모든 T 세포 집단에 대하여, gp 100 펩티드로 부하된 T2 세포의 용균은 10% 미만이었다. 표적:효과기 비율 (T:E)을 수평 축에 나타낸다. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 표준화 실험의 1개의 대표적인 실험으로부터 얻어진다.

도 5는 E/L-셀렉틴 RNA로 형질이입된 DC가 시알릴-루이스^x-도포된 슬라이드 위에서 회전하는 능력을 얻는다는 것을 증명한다. 3명의 인간 기증자로부터의 DC를 E/L-셀렉틴 RNA로 일렉트로포레이트하거나 ("ELS RNA"), 또는 RNA 없이 일렉트로포레이트하고 ("No RNA"), 냉동보존하였다. 이어서, 이것을 해동하고 시알릴-루이스^x로 도포된 슬라이드를 사용하여 평행 판 유동 챔버에서 회전하는 능력에 대해 평가하였다 (실시예 4 참조). 무-펄스 펌프를 사용하여 1.04 dyne/s²의 전단 속도에서 20 ℃에서 관류를 수행하였다. 관류 동안에, 현미경 상-대조 영상을 실제 시간에 기록하였다 (하나의 대표적 영상을 표시한다 (10 × 대물렌즈)). 관류 10분 후에, 4개의 상이한 현미경 구역을 기록하고, 각각의 구역에 대해 회전하는 (즉, 부착성) 세포의 수를 세었다. 나타낸 값은 각각의 기증자에 대해 4개 구역의 세포 수의 평균(+/- SEM)이다. P-값이 제공되고, 이것은 데이타의 통계적 유의성을 나타낸다 (학생의 T-시험).

도 6은 E/L-셀렉틴으로 형질이입된 DC가 생체내에서 말초 림프절로 이주할 수 있음을 증명한다. 쥐 가지 세포 (C57/B6, 암컷)를 E/L-셀렉틴 RNA로 일렉트로포레이트하거나 ("ELS RNA") 또는 RNA없이 일렉트로포레이트하고 ("No RNA"), 5-클 로로메틸플루오레세인 디아세테이트 (CMFDA)로 염색하고, C57/B6 암컷 쥐의 꼬리 정맥에 주사하였다. 주사 후 16시간에, 쥐를 희생시키고 냉동단편을 비장 및 말초 림프절로 만들었다. T-세포 구역을 CD90.2 (Thy1.2)/alexa555로 염색하고 냉동단편을 형광 현미경으로 분석하였다. 나타낸 사진은 4개 실험 중 하나의 실험으로부터의 기관의 대표적인 구역이다 (100 × 대물렌즈).

본 발명은 막 귀소 펩티드를 일시적으로 발현하고 생체내에서 림프절로 귀소하는 능력을 가진 가지 세포("DC")의 개선된 생성 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 본 발명은 DC의 집단을 생성할 수 있고 예를 들어 환자에게 정맥내 주사 후에 림프절로 귀소될 수 있는 DC의 집단을 생성할 수 있는 RNA 일렉트로포레이션의 개선된 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 DC가 또한 제공된다; 이러한 DC는 레트로바이러스를 함유하지 않으며 DC에 의한 막 귀소 펩티드의 발현은 다른 세포 표면 단백질의 발현 또는 기능을 방해하지 않는다. 따라서, 본 발명의 DC는 다양한 질병 및 질환의 치료를 위한 백신으로서 사용될 수 있고 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 DC로 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 구현양태에서, DC는 막 귀소 폴리펩티드 및 적어도 하나의 다른 항원 (여기에서, 때때로 "관심 항원"이라 일컬어짐)을 일시적으로 발현하도록 형질이입된다. 이러한 가지 세포는 정맥내 투여 후에 림프절에 귀소될 수 있고, 이에 의해 림프절에 적어도 하나의 다른 항원을 전달할 수 있다. 여기에서, DC는 T 세포에 항원을 제시할 수 있고 면역 반응을 자극할 수 있다.

본 발명의 개선된 형질이입 방법은 심지어 냉동 보존 후에도 높은 형질이입 효율 및 DC의 수율을 가져오고, 또한 형질이입된 핵산(들)으로부터 매우 높은 발현 수준을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 막 귀소 펩티드의 리간드로 도포된 표면위에서 "속박" (즉, 고정)되고/되거나 "회전"되는 DC의 능력에 의해 증명되는 바와 같이, 본 발명은 막 귀소 펩티드를 기능적으로 발현하는 DC를 처음으로 제공한다 (예를 들어, 실시예 4 참조). 따라서, 일부 구현양태에서, 본 발명은 막 귀소 폴리펩티드를 코드화하는 RNA로 일시적 형질이입된 단리된 가지 세포를 제공하고, 여기에서 가지 세포는 막 귀소 폴리펩티드의 리간드로 도포된 표면 위에서 회전할 수 있다. 따라서, 일부 구현양태에서, 단리된 DC가 또한 제공된다.

시험관내에서 특정한 표면에 "속박", "고정" 및/또는 "회전"되는 DC의 능력은 생체내에서 정맥내 투여 후에 혈액으로부터 림프절로 이동하는 DC의 능력과 상관관계를 갖는다. 셀렉틴을 발현하는 DC에 대하여, 이러한 속박, 고정 및 회전 거동은, 실시예 4에서 증명되는 바와 같이 시알릴-루이스^x로 도포된 표면을 사용하여 평행 판 유동 챔버 분석에서 평가될 수 있다 ([Robert et al. (2003) Gene Therapy 10: 1479-1486] 참조). 따라서, 본 발명의 방법은, 시험관내이든지 생체내이든지 간에, 적절한 대조 세포에 비하여 적절한 리간드로 도포된 표면 위에서 증가된 속박, 고정 및 회전을 나타내는 DC를 생성한다.

구체적으로, "속박" 또는 "고정" 및 "회전"이란, 막 귀소 펩티드를 코드화하는 RNA로 형질이입되고 적절한 시험 표면 위를 유동하는 배지에 현탁된 상태의 DC가, 표면에 종종 결합하고, 배지의 유동 속도의 20% 이하인 속도로 회전하는 것을 가리킨다. 적절한 시험 표면은, 도입된 막 귀소 펩티드가 결합할 수 있고 시험관내 또는 생체내일 수도 있는 물질 또는 리간드로 도포된 표면이다. 적절한 세포 표면은 도입된 막 귀소 펩티드가 결합할 수 있는 물질 또는 리간드로 도포된 표면이고, 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 세포 집단은, 유사한 조건 하에서 회전하는 것으로 관찰된 대조 세포의 수에 비하여 10배 이상의 세포가 시험 표면의 한정된 부위에 결합하고 그 위에서 회전하는 것으로 관찰된다면, "속박" 또는 "고정" 및 "회전" 거동을 나타내는 것으로 생각된다. 따라서, 예를 들어, 동일한 상황하에서 적절한 대조 세포에 비하여 10배 이상의 DC가 1 내지 5 dyn/cm²의 전단 력 하에서 시알릴-루이스^x로 도포된 표면에 결합하고 20% 미만의 유동 속도로 그를 따라 이동한다면, DC의 집단은 속박 및 회전 거동을 나타낸다.

여기에 기재된 상기 및 기타 분석을 위하여, 적절한 대조 세포는 막 귀소 펩티드를 코드화하는 RNA로 형질이입되지 않은 것이다. 즉, 예를 들어, 적절한 대조 세포는 모의-일렉트로포레이트된 DC일 수도 있거나, 또는 막 귀소 펩티드를 코드화하지 않는 RNA로 일렉트로포레이트된 DC일 수도 있다. 당업자라면 특정한 분석을 위해 적절한 대조를 선택하고 준비하는데 익숙할 것이다.

본 발명의 개선된 방법은 바람직한 거동 (다시 말해서, DC가 막 귀소 펩티드로 형질이입되고 막 귀소 펩티드의 리간드로 도포된 표면을 사용하여 평행 판 유동 챔버 분석에서 분석할 때 속박, 고정, 및/또는 회전 거동)을 나타내는 많은 DC를 제공한다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 형질이입된 DC의 집단 (예를 들어, 셀렉틴을 코드화하는 RNA로 일렉트로포레이트됨)에서, 대조 집단 (예를 들어 모의-형질이입된 DC 또는 EGFP를 코드화하는 것으로서 부적절한 RNA로 형질이입된 DC)에서에 비하여, 적어도 10배 이상의 세포가 적절한 시험 표면 (예를 들어, 시알릴-루이스^x로 도포된 슬라이드 또는 고 내피 세정맥 위)에서 속박, 고정 및 회전될 것이다.

본 발명의 DC는 림프절에 "귀소"할 수 있고, 다시 말해서 정맥내 주사 후에 혈액으로부터 적어도 하나의 림프절 내로 이동할 수 있다. 따라서, 본 발명의 DC가 정맥내 주사될 때, 이후의 시점, 예컨대 주사 후 적어도 1 시간, 2 시간, 4 시간, 8 시간, 18 시간, 24 시간, 48 시간 또는 그 이상 후에 적어도 하나의 림프절에서 본 발명의 DC를 검출하는 것이 가능하다. 본 발명의 DC는 고 내피 세정맥("HEV")에서 혈액을 밖으로 이동시킬 수도 있다.

본 발명의 방법은, 발현이 세포의 영구적 유전자 변형보다는 오히려 일시적 형질이입의 결과인 표면 수용체의 발현의 결과로서 변경된 이동 거동을 나타내는 DC 집단을 처음으로 제공한다. 다시 말해서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 DC 집단은 게놈의 유전성 유전자 변형의 필요성을 피하면서 새로운 바람직한 속성을 획득한다. 이러한 방식으로, 본 발명은 다양한 용도를 위해 새롭고 개선된 DC 백신을 가능하게 만든다.

본 발명의 방법은 앞서 공지된 방법에 의해 제조된 것에 비하여 정량적으로 그리고 정성적으로 뛰어난 DC를 제공하기 때문에, 예를 들어, 전이성 흑색종과 같이 DC로의 치료에 미리 저항력이 있는 질병 및 질환을 치료할 수 있다. 본 발명은 기존의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있지만, 암을 예방하기 위해서도 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본 발명에 의해 제공된 다른 장점은, 본 발명의 DC가 단지 하나의 림프절만을 표적화하는 것이 아니라 다수의 림프절에 귀소된다는 것이고, 이것은 DC와 T 세포 간의 접촉을 증가시키고 따라서 항원-특이적 T 세포의 더욱 효율적인 자극을 일으킬 것으로 기대된다.

본 발명에 의해 제공된 다른 장점은, 본 발명의 DC가 정맥내 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다는 것이다. 피내 또는 피하 주사에 의한 DC의 투여는 DC가 단지 피부-배수 림프절에만 들어가도록 하고, 따라서 더 많은 일반적 면역 반응을 가능하게 하기보다는, 피부 및 피부-관련 질병 및 질환에 대해 면역 반응을 지정하는 귀소 패턴을 부여할 수도 있다. 반대로, 정맥내 투여는 DC가 넓은 스펙트럼의 조직 및 기관에 배수하는 림프절로 들어가서, 피부 이외에도 그 주변 기관에서 면역 반응을 유도하는데 더욱 효율적일 수 있도록 한다.

또한, 본 발명의 방법은 DC 백신을 위해 중요한 DC의 3가지 특징을 보유하는 DC를 제공한다: 성숙한 DC 표현형 (즉, 실시예 1에 증명된 바와 같이 CD80, CD83, CD86, CD25, HLA-부류 I의 높은 발현; 및 HLA-DR 발현); 정상 CCR7-매개 이동 능력의 지속 (실시예 2에서 증명됨); 및 항원-특이적 T 세포 자극 능력의 지속 (실시예 3에서 증명됨).

용어 "가지 세포" (DC)란 각종 림프구 및 비-림프구 조직에서 발견되는 형태적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단을 가리킨다 (예를 들어 [Steinman (1991) Ann.Rev.Immunol. 9:271-296] 참조). 가지 세포는 가장 강력하고 바람직한 항원 제시 세포(APC)이다. 가지 세포는 단핵구 또는 기타 전구체 세포로부터 분화될 수 있고, 이러한 전구체와는 구별되는 표현형을 갖는다. 예를 들어, 단핵구는 CD14 항원을 발현하는 반면, 성숙한 가지 세포는 그렇지 못하다. 또한, 성숙한 가지 세포는 식작용이 아닌 반면, 단핵구는 강력한 식작용 세포이다.

가지 세포의 상이한 가지 세포 성숙 단계의 일부 세포 표면 마커 특징을 하기 표 I에 요약한다. 그러나 표면 마커는 성숙화 과정에 의존하여 다양할 수 있다. 따라서, 여기에 사용된 바와 같이, "가지 세포"는 성숙한 가지 세포의 특징인 적어도 하나의 마커를 발현하고 미성숙 가지 세포 또는 단핵구의 특징인 적어도 하나의 마커를 발현하지 않는 세포를 가리킨다. 예를 들어, 성숙한 가지 세포는 CD83을 높은 수준으로 발현하지만 CD14를 발현하지 않는다.

세포 유형	표면 마커
조혈 줄기 세포	CD34+
단핵구	CD14++, DR+, CD86+, CD16+/-, CD54+, CD40+
미성숙 가지 세포	CD14+/-, CD16-, CD80+/-, CD83-, CD86+, CD1a+, CD54+, DQ+, DR++
성숙 가지 세포	CD14-, CD83++, CD86++, CD80++, DR+++, DQ++, CD40++, CD54++, CD1a+/-

성숙한 DC는 면역요법을 위해 미성숙 DC보다 현재 바람직하다. 단지 충분히 성숙한 DC만이 GM-CSF 수용체를 결여하고 (GM-CSF-R), GM-CSF의 제거 (즉, 부재) 시에 안정하게 성숙한 상태를 유지한다. 성숙한 DC는 시험관내 및 생체내에서 T 세포 반응을 유도하는데 있어서 미성숙 DC에 비하여 뛰어나고, T 세포 활성화 및 증식을 위해 필요한 모든 신호를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 반대로, 미성숙 DC는 조절 T 세포를 유도하는 것으로 보고되었고, 이에 의해 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서 내성을 유도한다 (예를 들어 [Jonuleit et al. (2000) Exp.Med.192: 1213]; [Dhodapkar et al. (2001) Exp.Med. 193: 233] 참조). 성숙한 가지 세포는 시험관내 또는 생체내에서 T-림프구에 대해 항원을 섭취하고 제시한다. 본 발명의 항원-제시 DC 및/또는 이러한 DC에 의해 교육받은(educated) T 세포 (즉, 이러한 DC가 항원을 제시하고 그 결과 항원을 인식하는 T 세포)는 연구, 진단 및 치료를 포함한 많은 용도를 갖는다.

성숙한 DC는 조직으로부터 추출하기 곤란하고, 백혈구의 1% 미만이 이러한 범주에 속하기 때문에 말초 혈액으로부터 성숙한 가지 세포를 단리하는 것이 곤란하다. 따라서, 다른 근원으로부터 성숙한 가지 세포를 생성하는 방법에 관해 많은 연구가 수행되어 왔다. 성숙한 DC를 생성하기 위하여 DC 전구체 세포를 함유하고 시험관내에서 분화된 적절한 조직 근원으로부터 미성숙 DC를 단리하거나 제조할 수 있는 방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, 적절한 조직 근원은 골수 세포, 말초 혈액 기원 세포(PBPC), 말초 혈액 줄기 세포(PBSC) 및 제대 혈구를 포함한다. 바람직하게는, 조직 근원은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 조직 근원은 신선한 것이거나 동결될 수 있다. 일부 방법에서, 세포 또는 조직 근원을 비-줄기 또는 기원 세포의 성장 및 분화를 촉진하는 유효 량의 성장 인자로 전-처리한 다음, 이어서 주요 세포로부터 더욱 쉽게 분리한다. 이러한 방법은 당 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Romani et al. (1994) J.Exp.Med. 180: 83 및 Caux et al. (1996) J.Exp.Med. 184: 695-706]에 기재되어 있다.

본 발명의 일부 구현양태에서, 미성숙 DC를 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 그의 소집단으로부터 단리한다. PBMC를 백혈구성분채집술 생성물로부터 또는 밀도 원심분리에 의하여 건강한 기증자의 전혈액으로부터 제조할 수 있다. 인터류킨 4 (IL-4) 및/또는 IL-13의 존재 또는 부재하에서 PBMC를 유효 량의 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)로 처리하여, PBMC가 미성숙 DC로 분화되도록 한다. 일부 구현양태에서, PBMC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재하에서 약 4 내지 7일 동안, 바람직하게는 약 5 내지 6 일 동안 배양하여 미성숙 DC를 생성한다. 4, 5, 6 또는 7일, 가장 바람직하게는 5 또는 6일에 첫 번째 성숙 신호가 제공될 수 있다. 또한, 첫 번째 및/또는 두 번째 신호화 시에 GM-CSF 뿐만 아니라 IL-4 및/또는 IL-13이 배지에 존재할 수도 있다. 이러한 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다.

GM-CSF 및 IL-4 또는 GM-CSF 및 IL-13을 함유하는 배지에서 배양에 의하여 말초 혈액에서 빈번하지만 비-증식성 CD14+ 전구체 (단핵구)로부터 DC가 생성될 수 있다 (예를 들어, WO 97/29182; 문헌 [Sallusto and Lanzavecchia (1994) J.Exp.Med. 179: 1109]; [Romani et al. (1994) J.Exp.Med. 180: 83]; [Berger et al. (2002) J.Immunol.Meth. 268: 131-140] 참조). 다른 문헌들은, 이러한 접근법에 의해 발생된 DC가 다소 동종성인 것으로 보이고 미성숙 상태 또는 성숙 상태 (즉, 완전 분화된 상태)로 생성될 수 있음을 보고하고 있다. 성숙화를 자극하기 위해 자가 단핵구 상태조절 배지를 사용하여, 완전히 성숙되고 불가역적으로 안정한 DC가 수득될 수 있거나 (예를 들어, 문헌 [Romani et al. (1996) J.Immunol.Meth. 196: 137-151]; [Bender et al. (1996) J.Immunol.Meth. 196: 121] 참조), 또는 한정된 성숙 혼합물을 사용하여 수득될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jonuleit et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27: 3135]; [Schaft et al. (2005) J.Immunol.174: 3087-3097] 참조).

본 발명의 DC는 전형적으로 PBMC 또는 단핵구로부터 제조되지만, 가지 세포는 예를 들어 CD34+ 줄기 세포와 같은 다른 세포로부터 제조될 수도 있다. CD34+ 줄기 세포의 단리 및 팽창을 위하여 그리고 가지 세포로의 분화를 위하여 많은 방법들이 당 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,199,942호 참조).

CD34+ 줄기 세포는 골수 세포로부터, 또는 골수 세포 또는 기타 근원을 원하지 않은 세포, 예를 들어 CD4+ 및CD8+ 세포 (T 세포) 및 CD45+ 세포 (panB세포)에 결합하는 항체로 공격함으로써 단리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Inaba et al. (1992) J.Exp.Med. 176: 1693-1702] 참조). 인간 CD34+ 세포는 제대혈, 골수 외식체 및 동원된 말초 혈액을 포함한 다양한 근원으로부터 수득될 수 있다. CD34+ 세포의 정제는 항체 친화성 절차에 의해 달성될 수 있다 (예를 들어, [Paczesny et al. (2004) J.Exp.Med. 199: 1503-11]; [Ho et al. (1995) Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105]; [Brenner (1993) J.Hematother.2: 7-17]; 및 [Yu et al. (1995) Proc.Nat'l.Acad. Sci. 92: 699-703] 참조).

CD34+ 줄기 세포는 세포를 적절한 사이토카인과 배양함으로써 가지 세포로 분화될 수 있다. 이러한 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Inaba et al. (1992) J.Exp.Med. 176: 1693-1702]는, 줄기 세포를 쥐 GM-CSF와 배양함으로써, 쥐 줄기 세포를 가지 세포로 시험관내 분화하는 것을 기재하였다. 간략하게, 단리된 줄기 세포를, 격일 마다 한번 새로운 배지로 교체되는 표준 RPMI 성장 배지에서, 1 내지 200 ng/ml 쥐 CM-CSF, 바람직하게는 약 20 ng/ml GM-CSF와 함께 배양한다. IL-4가 유사한 범위로 임의로 첨가된다. 배양액 중에서 대략 5 내지 7일 후에, 표면 마커의 발현 및 세포 형태에 의해 평가 시에 많은 세포들이 가지 세포이다. 가지 세포들은 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해, 또는 당 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 단리될 수 있다.

세포를 인간 GM-CSF 및 TNF-α와 배양함으로써 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포가 시험관내에서 분화될 수 있다 (예를 들어 [Szabolcs et al. (1995) J.Immunol.154: 5851-5861] 참조). 인간 GM-CSF가 유사한 범위로 사용되고, 분화를 촉진하기 위하여 TNF-α가 동일한 범위로 첨가된다. 임의로, DC를 분화시키기 위하여 SCF 또는 다른 증식 리간드 (예, F1t3)가 유사한 투여량 범위로 첨가된다. WO 95/28479는 말초 혈액 세포를 단리하고, CD34+ 혈액 전구 세포를 풍부하게 한 다음 조혈 성장 인자 및 사이토카인의 조합으로 확장시킴으로써 가지 세포를 제조하는 방법을 개시하고 있다.

유럽 특허 공개 EP-A-0 922 758은 대식세포 또는 가지 세포 특징을 발현할 잠재력을 가진 다능성 세포로부터 유래된 미성숙 가지 세포로부터 성숙한 가지 세포의 생성을 개시하고 있다. 방법은 미성숙 가지 세포를 IFN-γ를 함유한 가지 세포 성숙화 인자와 접촉시키는 것을 필요로 한다. 유럽 특허공고 EP-B-0 633 930호는, CD1a+ 조혈 세포의 형성을 유도하기 위하여 인간 CD34+ 조혈 세포를 (i) GM-CSF, (ii) TNF-α 및 IL-3, 또는 (iii) GM-CSF 및 TNF-α와 먼저 배양시킴으로써 인간 가지 세포의 생성을 교시하고 있다. 미국 특허 2004/0152191호는 가지 세포를 RU 41740과 접촉시킴으로써 가지 세포의 성숙화를 개시하고 있다. 미국 특허 공고 2004/0146492 호는 조혈 줄기 세포를 형질전환한 다음, GM-CSF를 함유하는 배지 중에서 배양에 의해 줄기 세포를 가지 세포로 분화시킴으로써 재조합체 가지 세포의 생성 방법을 교시하고 있다. 미국 특허 공고 2004/0038398호는 포유동물의 말초 혈액으로부터 DC 및 단핵구의 실질적으로 정제된 집단의 제조 방법을 개시하고 있다. 흑색종 세포는 포유동물로부터 단리되고, 그의 집단으로부터 DC를 분리하여 단핵구의 단리된 소집단을 얻는다. 이어서, T 세포를 제거하기 위한 항-CD2 항체와의 네가티브 선택에 의하여 DC를 풍부하게 한다. PCT/US05/036304호 (그의 내용은 여기에서 참고문헌으로 포함됨)는 CD40L, 인터페론, PGE2 및 임의로 TNF-α를 사용하여 가지 세포를 성숙화하기 위한 방법을 개시하고 있다.

당 기술분야에 공지된 바와 같이, 줄기 세포 및 단핵구를 가지 세포로 분화하기 위한 투여량 범위는 대략적이다. 상이한 공급업자로부터, 그리고 심지어 동일한 공급업자의 상이한 로트로부터의 사이토카인이라도 그들의 활성이 다양하다. 당업자라면 특정한 사이토카인을 위한 최적의 투여량을 결정하기 위해 사용되는 각각의 사이토카인을 쉽게 적정할 수 있다.

본 발명의 DC는 인간 기증자로부터 수득된 세포로부터 유래될 수도 있거나, 또는 동물 기증자, 예를 들어 쥐 또는 개로부터의 세포로부터 수득될 수도 있다. 인간을 포함한 동물에서 가지 전구체 세포의 수를 증가시키기 위하여, 피험자를 조혈을 자극하는 물질(다시 말해서, 조혈 인자)로 전-처리할 수 있다. 이러한 물질은 이에 한정되지 않지만 G-CSF 및 GM-CSF를 포함한다. 투여되어지는 조혈 인자의 유효 량은 인자가 투여되는 개체의 세포 차이를 검출함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, G-CSF 및 GM-CSF와 같은 인자의 투여량은 세포독성 제로의 처리로부터 회복된 개체를 치료하기 위해 사용되는 투여량과 유사할 것이다. 일례로서, 가지 세포 전구체의 비율을 증가시키기 위해 근원 조직의 제거에 앞서서 GM-CSF 또는 G-CSF를 표준 투여량으로 4 내지 7일 동안 투여할 수 있다. 미국 특허 6,475,483호는, 5 내지 13일 동안 매일 300 마이크로그램의 G-CSF 투여 및 4 내지 19일 동안 매일 400 마이크로그램의 GM-CSF가 상당한 수율의 가지 세포를 생성한다는 것을 교시하고 있다.

달리 표시되지 않는 한, 본 발명의 실행은 재조합 기술, 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학을 포함한 종래의 분자 생물학 기술을 사용하며, 이들 모두는 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 실행에서 유용한 다양한 기술은 하기 문헌에 기재되어 있다: [Sambrook et al (1998) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제2판 (1989)]; [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al.eds. (1987))]; [the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); [PCR: A PRACTICAL APPROACH (M.MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991)); [PCR2: A PRACTICAL APPROACH (MacPherson, Hames and Taylor eds.) (1995)]; [ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1999))]; [USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lande eds (1999)]; 및 [ANIMAL CELL CULTURE (Freshney ed. (1987)].

여기에서 사용된 바와 같이, "형질이입하기 위하여" 또는 "형질이입"은 하나 이상의 외인성 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입하는 것을 가리킨다. 형질이입은 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화된 단백질이 발현될 수 있는 방식으로의 도입을 포함한다. 형질이입 방법이 당 기술분야에 공지되어 있고, 다양한 기술, 예컨대 일렉트로포레이션, 단백질-기초 방법, 지질-기초 및 양이온 기초 비드 핵산 전달 복합체, 바이러스 벡터, "유전자 건" 전달 및 다양한 기타 기술을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현양태에서, DC 내로 도입되는 폴리뉴클레오티드는 DC를 유전적으로 변형시키지 않고, 안정하게 유지되지 않는다. 용어 "유전적으로 변형"이란, 외래 유전자 또는 핵산 서열을 함유하고 및/또는 발현하고, 이것이 다시 세포 또는 그의 자손의 유전자형을 변형시키고, 가능하다면 세포의 표현형을 변경시키는 것을 의미한다. 다시 말해서, 이것은 세포의 내인성 뉴클레오티드에 대한 첨가, 결실 또는 붕괴를 가리킨다. 도입된 폴리뉴클레오티드의 안정한 유지는 전형적으로, 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포와 친화성인 복제 기원을 함유하거나 또는 염색체외 레플리콘 (예, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체와 같은 숙주 세포의 레플리콘 내로 통합되는 것을 필요로 한다.

여기에서 사용된 "일시적으로 형질이입된"이란, 형질전환된 세포의 자손이 형질전환된 유전 물질 (예, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드)을 물려받지 않도록 형질전환된 세포를 가리킨다. 유전 물질은 RNA로 전사될 수도 있고, 유전 물질에 의해 코드화된 단백질이 발현될 수도 있다. 이러한 발현은 일시적 발현이라 일컬어진다. 보통, 일시적 발현은 형질이입된 유전 물질을 염색체 내로 혼입하지 않음으로써 달성된다.

본 발명의 일부 구현양태에서, 가지 세포는 RNA 일렉트로포레이션을 사용하여 일시적으로 형질이입된다. 일반적으로, mRNA는 세포의 염색체 또는 염색체외 게놈의 영구적 부분이 되지 않는다. 원하는 단백질을 일시적으로 발현하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 방법은 게놈의 영구적 변경을 포함하지 않고 (다시말해서 세포에 유전가능한 유전자 변화가 일어나지 않고), 따라서 예를들어 레트로바이러스 및 아데노바이러스와 같은 바이러스를 사용한 형질이입과 관련된 단점을 피할 수 있다.

RNA 일렉트로포레이션이 당 기술분야에 공지되어 있지만, 이전에 알려진 방법으로 수득될 수 있는 발현 수준은 기능적 수준의 표면 수용체 발현을 가진 DC 집단을 생성하기에는 충분히 높지 않았다. 본 발명의 방법은, 방법에 의해 생성된 DC에서의 발현 수준이 바이러스 형질이입에 의해 수득된 수준과 유사하도록 최적화된 RNA 일렉트로포레이션 방법을 포함하며, 이에 의해 바이러스 형질이입의 단점이 회피된다. 다시말해서, 본 발명의 방법은 방법에 따라 처리된 세포의 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상이 형질이입을 위해 사용되는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 함유하도록 높은 형질이입 효율을 제공한다. 본 발명의 방법은 냉동보존 (예를 들어, 실시예 1 참조) 전 또는 후에 생육가능하고 형질이입된 가지 세포의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 높은 수율을 제공한다. 따라서, 여기에 기재된 어느 방법에 의해 제조된 성숙한 DC의 풍부한 집단이 본 발명에 의해 제공된다. 일부 구현양태에서, 가지 세포는 형질이입 및/또는 냉동보존 이전에 성숙한 상태이다. 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 풍부한 가지 세포 집단을 적절한 조건 하에서 적절한 냉동보존제와 접촉시키는 것을 포함하는, 성숙한 DC의 풍부한 집단을 저장하는 방법을 제공한다.

개선된 일렉트로포레이션 방법을 개발하기 위한 노력에서, 다수의 매개변수들이 변경되고 평가되었다. 이러한 실험을 위하여, 일렉트로포레이션을 위해 사용된 RNA는 시험 단백질 (증진된 GFP, 또는 "EGFP")을 코드화하였다. 일반적으로, 평가된 조건 하에서, 단백질 발현은 사용된 RNA의 농도에 비례하지만, 60×10⁶ DC/ml의 농도까지는 세포의 농도와 무관하였다. 인간 및 쥐 DC 양쪽 모두에 대하여, RNA를 밀리리터 당 약 150 마이크로그램, 예를 들어 밀리리터 당 약 100, 125, 150, 175 또는 200 마이크로그램의 최종 농도로 사용하였다. 인간 DC를 위하여, 일렉트로포레이션 이전에 약 1, 2 또는 3분 동안 큐벳에서 RNA를 세포와 함께 배양하였다. 쥐 DC를 위하여, 예비배양 단계가 임의로 포함될 수 있긴 하지만, RNA를 일반적으로 일렉트로포레이션 이전에 큐벳에서 세포와 미리 배양하지 않았다.

전형적으로, 다른 세포 농도가 사용될 수 있긴 하지만, 세포를 페놀-레드를 갖지 않은 옵티멤(OptiMEM) (기브코-BRL, 미국 롱아일랜드)에 약 4-6×10⁷ 세포/ml (인간) 또는 4-10×10⁷ 세포/ml (쥐)의 농도로 재현탁시켰다. 단백질 발현은 0.5 ms 내지 2 ms의 펄스 시간에 비례하지만, 2 ms 이상에서 더 높은 퍼센트의 인간 세포가 사멸하였다. 쥐 DC는 2 ms의 펄스 시간을 잘 견디었지만 5 ms에서 사멸하였다. 발현된 EGFP의 양에 비례하는 평균 형광 강도 (MFI)가 전압 증가에 따라 증가하기 때문에 더 높은 전압이 일반적으로 양호하지만, 더 높은 전압은 세포 사멸을 증가시키고, 사용된 전압은 다른 매개변수에 비하여 성공에 덜 중요하였다.

본 발명의 개선된 RNA 일렉트로포레이션 방법은 너무 많은 DC를 죽이지 않으면서 높은 발현 수준을 가져오는 값까지 펄스 시간의 최적화를 포함한다. 특히, 인간 DC를 위해 개선된 일렉트로포레이션 조건은, 옵티멤 배지에서 실온에서 400V 내지 600V의 전하 및 0.8 ms 내지 2 ms의 네모파 펄스를 가진 4 mm 큐벳의 사용을 포함하였다.

전하를 큐벳의 간격 폭으로 나눔으로써 자계 강도를 측정하고; 예를 들어 4 mm 큐벳을 가진 500 V 전하의 사용은 125 V/mm의 자계 강도를 가져오고, 전하 및 큐벳 폭의 상이한 조합을 사용하여 자계 강도가 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해서, 100 V/mm 내지 150 V/mm의 자계 강도가 얻어지는 전하 및 큐벳 폭의 다른 조합, 예를 들어 100, 120, 125, 130, 140 또는 150 V/mm의 자계 강도가 얻어지는 조합이 제공된다. 예를 들어 4 mm 큐벳을 사용할 때, 개선된 일렉트로포레이션 조건은 약 400 V, 450 V, 500 V, 550V 또는 600 V의 전하 및 약 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 또는 2ms 길이의 네모파 펄스를 포함한다.

쥐 DC를 위한 최적의 일렉트로포레이션 조건은 옵티멤 배지에서 실온에서 4 mm 큐벳을 가진 500 V 전하 (즉, 125 V/mm의 자계 강도) 및 2 밀리초 네모파 펄스의 사용을 포함하였다. 따라서, 본 발명에 의해서, 쥐 DC의 일렉트로포레이션을 위하여, 100 V/mm 내지 150 V/mm의 자계 강도를 가져오는 전하 및 큐벳의 다른 조합, 예를 들어 100, 120, 125, 130, 140 또는 150 V/mm의 자계 강도가 얻어지는 조합이 제공된다. 따라서, 예를 들어, 4 mm 큐벳을 사용할 때, 개선된 일렉트로포레이션 조건은 약 400 V, 450 V, 500 V, 550V 또는 600 V의 전하 및 약 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8 또는 5 ms 길이의 네모파 펄스를 포함한다.

일렉트로포레이션을 위해 사용된 네모파 펄스는 지수형 붕괴 펄스와 구별되고 본 발명의 방법에서 뛰어난 결과를 제공한다. 지수형 붕괴 펄스를 위하여, 일반적으로, 축전기를 샘플로 방전시키고 전극을 가로지르는 전압이 피크 전압으로 빠르게 상승한 다음 시간에 걸쳐 지수형 붕괴 파형으로 강하된다 (예를 들어 [Bio-Rad Instruction Manual for the Gene Pulser Xcell^TM Electroporation System, Bio-Rad, Munich Germany] 참조). 지수형 붕괴 펄스는 하기 식에 의해 설명될 수 있다:

V_t = V_o [e^{-(t/ RC )}]

상기 식에서, V_t는 펄스 후에 시간 = t 밀리초에서의 전압이고, V_o는 축전기에서 초기 전압이고, e는 자연 로그의 밑이고, R은 회로의 저항 (ohms으로 표현됨)이고 C는 용량 (마이크로패라드로 표현됨)이다.

네모파 펄스를 위하여, 펄스 길이 (즉, 세포가 전기장에 노출되는 시간 길이)는 세포가 전기장에 노출되는 시간을 설정함으로써 직접적으로 조절된다. 네모파 펄스는 펄스가 샘플로 방전된 후에 축전기로부터의 펄스를 끊어버림으로써 발생될 수 있다. 일부 구현양태에서, 네모파 펄스는 펄스의 시작에서에 비하여 펄스의 끝에서 낮은 전압을 갖는다. 네모파 펄스는 하기 식에 의해 설명될 수 있다.

ln (V_o/V_t) = t/(RC)

상기 식에서, 변수는 상기 나타낸 것과 같다. 네모파 펄스를 투여할 수 있는 일렉트로포레이션 장치는 통상적으로 입수가능하다. 예를 들어, 진펄서(Genepulser) Xcell (바이오래드, 독일 무니흐)가 사용될 수 있다.

본 발명의 개선된 RNA 일렉트로포레이션 방법은 RNA로 일시적 형질이입된 DC 집단을 제공할 수 있다. 이러한 집단은 많은 세포, 예를 들어 적어도 1 × 10⁶ 세포, 또는 적어도 2 × 10⁶, 3 × 10⁶, 4 × 10⁶, 5 × 10⁶, 6 × 10⁶, 7 × 10⁶, 8 × 10⁶, 또는 9 × 10⁶ 세포 또는 적어도 1 × 10⁷, 2 × 10⁷, 3 × 10⁷, 4 × 10⁷, 5 × 10⁷, 6 × 10⁷, 7 × 10⁷, 8 × 10⁷, 또는 9 × 10⁷ 세포, 또는 적어도 1 × 10⁸, 2 × 10⁸, 3 × 10⁸ 또는 4 × 10⁸ 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현양태에서, 집단에서의 대부분의 세포 (즉, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상)가 세포 집단에서의 표현형 변화, 예를 들어 생체내에서 림프절에 귀소되거나 RNA가 셀렉틴을 코드화하는 경우에 시험관내에서 시알릴-루이스^x로 도포된 표면 위에서 회전하는 능력을 일으키기에 충분히 높은 수준에서 RNA에 의해 코드화된 적어도 하나의 펩티드를 발현할 것이다. 본 발명의 DC 및 DC 집단은 형질이입된 RNA에 의해 코드화되는 하나 이상의 펩티드를 발현할 수도 있고; 예를 들어 이들은 막 귀소 펩티드뿐만 아니라 T 세포에 제시될 수 있는 관심 항원을 발현할 수도 있다. 또한, 이들은 하나 이상의 관심 항원 또는 다수의 관심 항원을 발현할 수도 있다.

여기에서 사용된 바와 같이, "막 귀소 폴리펩티드"는 다른 표면, 예컨대 세포의 표면 또는 세포외 기질의 표면 위에 존재하는 리간드와 상호작용하거나 결합할 수 있는 세포 표면 마커이다. 일부 구현양태에서, 막 귀소 폴리펩티드는 고 내피 세정맥의 표면 위에 존재하는 리간드에 결합한다. 적절한 막 귀소 폴리펩티드는 다른 유형의 혈관, 예를 들어 저 등급 림프절 세정맥에 존재하는 리간드에 결합할 수도 있다. 막 귀소 폴리펩티드는, 그들의 발현이 그것을 발현하는 DC의 림프절에 이동하는데 기여하는 이상, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수도 있다. 막 귀소 폴리펩티드는 형질이입된 RNA로부터 번역된 후에 더욱 처리되거나 변형될 수도 있다는 것을 이해해야 한다.

일부 구현양태에서, 막 귀소 폴리펩티드는 셀렉틴이다. 여기에서 사용된 바와 같이, "셀렉틴"은 이에 한정되지 않지만 말초 절 어드레신("PNAd")을 포함한 특정한 당단백질 위의 당 잔기에 결합하는 폴리펩티드이다. PNAd는 림프절 세정맥 내피의 표면에 존재하는 당단백질 및/또는 당접합체의 군을 가리킨다 (예를 들어, 미국 특허 5,538,724호 참조). 일부 구현양태에서, 말초 절 어드레신은 단클론성 항체 MECA-79에 의해 한정되고, 이것은 시알로뮤신에 의해 전달되는 설페이트화 올리고당을 인식하고; 이 에피토프는 6-술포-시알릴-루이스^x와 중복된다 (예를 들어, [Rosen et al. (2005) Am.J.Pathol. 166: 935-944]; [Streeter et al. (1988) J.Cell.Biol. 107: 1853] 참조). MECA-79 항체는 BD 바이오사이언스 파르밍겐 (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 통상적으로 입수가능하다. 대안적으로, PNAd는 L-셀렉틴이 결합하는 리간드인 것으로 정의된다. L-셀렉틴은, 선택적 결합에 의해, 이에 한정되지 않지만 GlyCAM-1 (Sgp50), CD34 (Sgp-90), Sgp200, MAdCAM-1, PSGL-1, PCLP 및 PCLP-2를 포함하여 말초 림프절의 고 내피 세정맥에 존재하는 몇몇 당단백질 리간드를 인지한다 (미국 특허 6,929,792호 및 6,395,882호 참조).

"선택적 결합"이란 분자 (예를 들어, L-셀렉틴)가 ELISA 분석에 의해 평가될 때 대조 리간드, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA)에 대한 결합에 비해 5, 7, 9, 10, 20배 또는 그 이상으로 특정한 리간드에 결합함을 의미한다. 대안적으로, 예를 들어 미국 특허 5,484,891호에 기재된 바와 같이, L-셀렉틴에 의한 선택적 결합은 기관 배양물에서 ³⁵S-설페이트로 표지화된 림프절로부터 무기 설페이트-표지화 물질을 침전시키기 위하여 L-셀렉틴-IgG 키메라를 사용하여 분석될 수도 있다. 여기에서 사용된 "결합"이란 분자들이 서로 공유 또는 비-공유 결합될 수 있음을 의미한다.

따라서, 용어 "셀렉틴"은 L-셀렉틴, E-셀렉틴 및 P-셀렉틴과 같은 천연 셀렉틴뿐만 아니라 천연 셀렉틴에 존재하는 프로테아제 절단 부위를 변경시키거나 절단하기 위해 처리되어진 것을 포함하여 셀렉틴의 변형된 형태의 다양한 형태를 포함한다. 용어 "셀렉틴"은 미국 특허 6,929,792호에 기재된 E/L 셀렉틴 키메라와 같은 기능성 키메라 단백질을 포함하고, 또한 예를 들어 천연 인간 E-셀렉틴의 세포외 도메인을 포함한 키메라 분자와 같은 상이한 천연 셀렉틴으로부터의 일부 또는 도메인을 천연 인간 L-셀렉틴의 경피 및 세포내 도메인과 조합한 키메라 단백질 ("E/L-셀렉틴")을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Robert et al. (2003) Gene Ther. 10: 1479-1486] 참조). 천연 셀렉틴의 다른 도메인이 당 기술분야에 공지되어 있고, 키메라 단백질 내에 조합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Smalley and Ley (2005) J.Cell.Mol.Med. 9: 255-266] 참조). 여기에서 사용된 바와 같이, "키메라또는 "키메라 단백질"은 하나의 단백질로부터의 적어도 하나의 도메인을 다른 단백질로부터의 적어도 하나의 도메인과 조합한다. 단백질은 천연일 수도 있거나 변형될 수도 있다.

여기에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 명백하게 달리 나타내지 않는 한 다수의 언급을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이들의 혼합물을 포함하여 다수의 세포를 포함한다. 모든 수치 명칭, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량 범위는 달리 명백하게 언급되지 않는 한 0.1의 증분씩 (+) 또는 (-)로 변하는 근사값이다.

여기에서 사용된 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소들을 포함하지만 다른 것을 배제하지 않음을 의미하기 위한 것이다. 조성물 및 방법을 한정하기 위해 사용될 때 "-로 필수적으로 구성된"은 필수로 중요한 것 이외의 다른 요소들이 조합에 배제됨을 나타낸다. 따라서, 여기에 한정된 요소들로 필수적으로 구성된 조성물은 미량의 오염물을 단리 및 정제 방법으로부터 배제하지 않을 것이며, 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 다른 통상적으로 사용되는 첨가제, 예컨대 포스페이트 완충 염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "로 구성된"은 다른 성분들의 미량 이상의 요소들의 배제 또는, 방법에 대하여 명백하게 언급된 것 이외의 실질적인 단계의 배제를 나타낸다. 이러한 전환 용어에 의해 한정되는 구현양태들은 본 발명의 범위 내에 속한다.

여기에서 사용된 "단리된"이란 자연 환경으로부터 분리되고 세포의 동정 및 사용을 가능하게 하기에 충분한 양으로 존재하는 세포를 가리킨다. 가지 세포에 관해 여기에서 사용된 바와 같이, 이것은 DC의 근원, 다시 말해서 유기체에서 발견되는 해부학적 부위, 예를 들어 혈액으로부터 제거됨을 의미한다. DC 세포 배양물은 필수적으로 순수할 수 있지만, 여기에서의 용도, 예를 들어 백신으로 사용하기 위해 반드시 순수할 것이 요구되지 않는다.

"면역 반응"은 넓은 의미에서 어떠한 물질에 대한 림프구의 항원-특이적 반응을 가리킨다. 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 물질은 "면역원성"인 것으로 언급되고 "면역원"이라 일컬어진다. 모든 면역원은 항원이지만, 모든 항원이 면역원성은 아니다. 본 발명의 면역 반응은 체액성 (항체 활성을 통해)일 수 있거나 세포-매개될 수 있다 (T-세포 활성화를 통해).

용어 "주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC"란, T 세포에 대한 항원 제시를 위해 그리고 빠른 이식 거부를 위해 필요한 세포-표면 분자를 코드화하는 유전자의 복합체를 가리킨다. 인간에서, MHC는 "인간 백혈구 항원" 또는 "HLA" 복합체로서 알려져 있다. MHC에 의해 코드화된 단백질은 "MHC 분자"로 알려져 있고, 부류 I 및 부류 II MHC 분자로 분류된다. 부류 I MHC 분자는 β₂-마이크로글로블린과 비-공유 결합된 MHC에서 코드화된 α 사슬로 이루어진 막 헤테로이량체 단백질을 포함한다. 부류 I MHC 분자는 거의 모든 핵형성 세포에 의해 발현되고, CD8+ T 세포에 대한 항원 제시에서 기능을 하는 것으로 밝혀졌다. 부류 I 분자는 인간에서의 HLA-A, B 및 C를 포함한다. 부류 II MHC 분자는 비공유 결합된 α 및 β 사슬로 이루어진 막 헤테로이량체 단백질을 포함한다. 부류 II MHC 분자는 CD4+ T 세포에 대한 항원-제시에서 기능을 하는 것으로 알려져 있고, 인간에서 HLA-DP, -DQ 및 -DR을 포함한다.

용어 "항원 제시 세포"(APC)란 면역 체계의 특정한 효과기 세포에 의해 인지될 수 있는 펩티드-MHC 복합체의 형태로 하나 이상의 항원을 제시할 수 있고 이에 의해 제시되는 항원(들)에 대해 효과적인 세포 면역 반응을 유도하는 세포의 부류를 가리킨다. APC는 대식세포, B-세포, 내피 세포, 활성화 T-세포 및 가지 세포와 같은 원상태 전 세포; 자연 발생 또는 합성 기타 분자, 예컨대 β₂-마이크로글로블린에 복합된 정제된 MHC 부류 I 분자일 수 있다. 많은 유형의 세포가 T-세포 인식을 위해 그들의 세포 표면 위에서 항원을 제시할 수 있지만, 예를 들어 적절한 공동-자극 분자와의 조합 시에 세포독성 T-림프구(CTL) 반응을 위해 항원에 노출된 적이 없는 T-세포를 활성화하기에 적절한 상황에서 단지 가지 세포만이 항원을 제시할 능력을 갖는다.

용어 "면역 효과기 세포"란 항원을 결합할 수 있고 면역 반응을 매개하는 세포를 가리킨다. 이러한 세포는 이에 한정되지 않지만 T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 세포독성 T 림프구(CTLs), 예를 들어 CTL 라인, CTL 클론 및 종양, 염증 또는 기타 침윤물로부터의 CTL을 포함한다. "항원에 노출된 적이 없는" 면역 효과기 세포는 그 세포를 활성화할 수 있는 항원에 결코 노출되지 않은 면역 효과기 세포이다. 항원에 노출된 적이 없는 면역 효과기 세포의 활성화는, 항원-특이적, 보강된 효과기 T 세포로 증식되고 분화되기 위하여, 펩티드:MHC 복합체의 인지 및 전문 APC에 의한 공동자극 신호의 동시 전달을 모두 필요로 한다.

여기에서 사용된 용어 "교육받은" 항원-특이적 면역 효과기 세포는 이전에 항원을 만난 적이 있는 면역 효과기 세포이다. 항원에 노출된 적이 없는 상대물과는 반대로, 교육받은 항원-특이적 면역 효과기 세포의 활성화는 공동자극 신호를 필요로 하지 않는다. 펩티드:MHC 복합체의 인지가 충분하다. T 세포에 관련하여 사용될 때 용어 "활성화"는, 세포가 더 이상 G0 단계에 있지 않고 세포 유형 (예, CD8+ 또는 CD4+)의 하나 이상의 세포독소, 사이토카인 및 기타 관련된 막-결합 단백질 특징을 생성하기 시작하며, 그의 표면 위에서 특정한 펩티드/MHC 복합체를 표시하는 표적 세포를 인지하고 결합할 수 있으며 그의 효과기 분자를 방출할 수 있음을 암시한다.

"공동-자극 분자"는 항원 제시 세포와 T 세포의 표면 위에서 발현된 수용체-리간드 쌍 사이의 상호작용에 관여된다. 지난 수년간에 걸쳐 축적된 연구결과는, 휴지 T 세포가 사이토카인 유전자 발현 및 증식의 유도를 위해 적어도 2개의 신호를 필요로 함을 설득력있게 증명하였다 (예를 들어, 문헌 [Schwartz (1990) Science 248: 1349-1356 및 Jenkins (1992) Immunol.Today 13: 69-73] 참조). 특이성을 부여하는 하나의 신호는 TCR/CD3 복합체와 적절한 MHC/펩티드 복합체와의 상호작용에 의해 생성될 수 있다. 두 번째 신호는 항원 특이성이 아니고 "공동-자극" 신호로 명명된다. 이러한 신호는 골수-유래 부속 세포, 예컨대 대식세포 및 가지 세포에 의해 제공되는 활성으로서 본래 정의되었으며, 따라서 "전문적" APC로 명명된다.

공동-자극 활성을 제공하고/하거나 증진시키기 위해 몇 가지 분자들이 밝혀졌다. 이들은 열 안정성 항원(HSA) [Liu et al. (1992) J.Exp.Med. 175: 437-445], 콘드로이틴 설페이트-변형 MHC 불변 사슬 (1i-CS) [Naujokas et al. (1993) Cell 74: 257-268], 세포내 부착 분자 1 (ICAM-1) (Van Seventer (1990) J.Immunol. 144: 4579-4586], B7.1/CD80 및 B7.2/B70/CD86 [Schwartz (1992) Cell 71: 1065-1068]을 포함한다. 이러한 분자들은 T 세포 상에서 그들의 동족 리간드와 상호작용함으로써 공동-자극을 제공하고/하거나 보조하는 것으로 보인다. 공동-자극 분자는 공동-자극 신호(들)을 매개하고, 이것은 정상적인 생리학적 조건 하에서 항원에 노출된 적이 없는 T 세포의 완전 활성화를 달성하기 위해 필요하다. 일례의 수용체-리간드 쌍은 APC의 표면 상에서 공동-자극 분자의 B7 계통 및 T 세포 상에서 그의 상대물-수용체 CD28 또는 CTLA-4이다 ([Freeman et al. (1993) Science 262: 909-911]; [Young et al. (1992) J.Clin.Invest. 90: 229] 및 [Nabavi et al. (1992) Nature 360: 266-268]). 다른 중요한 공동-자극 분자는 CD40 및 CD54이다.

용어 "공동-자극 분자"는, T 세포의 표면 위에서 TCR에 의해 결합된 MHC/펩티드 복합체와 함께 작용할 때, 펩티드를 결합하는 T 세포의 활성화를 달성하는 공동-자극 효과를 제공하는 하나의 분자 또는 분자들의 조합을 포함한다. 따라서, 용어는 APC, 그의 단편 (단독, 다른 분자(들)과의 복합 또는 융합 단백질의 일부)와 같은 항원-제시 기질 위에서 B7 또는 기타 공동-자극 분자(들)을 포함하며, 이것은 MHC 복합체와 함께 동족 리간드에 결합하여 T 세포의 표면 위의 TCR이 펩티드에 특이적으로 결합할 때 T 세포를 활성화시킨다. 용어 "공동-자극 분자"란 야생형 또는 정제된 공동-자극 분자로서 유사한 생물학적 활성을 가진 분자를 가리킨다 (예, 재조합으로 생성된 분자 또는 그의 뮤테인).

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "사이토카인"은 세포 위에서 예를 들어 성장 또는 증식을 유도하는 다양한 효과를 발휘하는 다수의 가용성 인자를 가리킨다. 본 발명의 실행에서 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있는 사이토카인의 비-제한적 예는 인터류킨-2 (IL-2), 줄기 세포 인자 (SCF), 인터류킨-3 (IL-3), 인터류킨-6 (IL-6), 인터류킨-12 (IL-12), G-CSF, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-1 알파 (IL-1α), 인터류킨-1L (IL-11), MIP-11, 인터류킨 억제 인자(LIF), c-키트 리간드, 트롬보포이에틴(TPO) 및 flt3 리간드를 포함한다. 사이토카인은 여러 판매인, 예를 들어 겐자임 (Genzyme) (미국 매사츄세츠주 프라밍검), 진앤테크(Genentech) (미국 캘리포니아주 사우스샌프란시스코), 암겐 (미국 캘리포니아주 사우전드 오크), R&D 시스템스 (미국 미네소타주 미네아폴리스) 및 이뮤넥스 (미국 워싱턴주 시애틀)으로부터 통상적으로 입수가능하다. 용어 "사이토카인"은 야생형 또는 정제된 사이토카인 (예, 재조합으로 생성된 것 또는 그의 뮤테인)과 유사한 생물학적 활성을 가진 분자를 포함한다.

용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 어떠한 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 가리키기 위해 서로 바꾸어 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 그들의 유사체를 함유할 수도 있다. 뉴클레오티드는 3-차원 구조를 가질 수도 있고, 알려지거나 알려지지 않은 어떠한 기능을 수행할 수도 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 예를 들어 단일-가닥, 이중-가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지쇄 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 어떠한 서열의 단리된 DNA, 어떠한 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 천연 핵산 분자에 추가로, 본 발명의 핵산 분자는 변형된 핵산 분자를 포함할 수도 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, mRNA란 가지 세포에서 번역될 수 있는 RNA를 가리킨다. 이러한 mRNA는 전형적으로 캡형성되고 리보좀 결합 부위 (코작(Kozak) 서열) 및 선택된 펩티드 또는 단백질을 코드화하는 개방 판독 프레임 앞에 있는 번역 개시 코돈을 가지며, 보통 폴리 A-꼬리를 함유한다.

용어 "펩티드"는 가장 넓은 의미로 2 이상의 소단위 아미노산의 화합물, 아미노산 유사체 또는 펩티도모방체를 가리키기 위해 사용된다. 소단위는 펩티드 결합에 의해 연결될 수도 있다. 다른 구현양태에서, 소단위는 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수도 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"이란 글리신 및 양쪽 모두의 D- 및 L-광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티도모방체를 포함하여 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 가리킨다. 펩티드 사슬이 짧다면 3개 이상의 아미노산의 펩티드는 보통 올리고펩티드라고 불리운다. 펩티드 사슬이 길다면, 펩티드는 보통 폴리펩티드 또는 단백질이라 불리운다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 폴리펩티드 및 단백질은, 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드 (모델 430A 또는 431A, 미국 캘리포니아주 포스터시티)에 의해 제조되는 것과 같은 통상적으로 입수가능한 자동화 펩티드 합성장치를 사용하여 화학 합성에 의해 수득될 수 있다. 합성된 단백질 또는 폴리펩티드는 예를 들어 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의하여 침전되고 더욱 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질 및 폴리펩티드는 공지된 재조합 방법을 사용하여 수득될 수 있다.

여기에서 사용된 "발현"이란 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정을 가리키고; mRNA는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 더욱 번역될 수도 있다. 따라서, 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 달리 표시되지 않는 한 전사 및 번역을 양쪽 모두 포함한다. mRNA 및 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 양쪽 모두의 발현을 위해 요구되는 조절 요소들이 당 기술분야에 공지되어 있다. "전사 제어 하"란, 당 기술분야에서 이해되는 용어이고, 폴리뉴클레오티드 서열, 보통 DNA 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 전사를 촉진하는 요소에 작동적으로 연결되었는지에 의존한다는 것을 나타낸다. "작동적으로 연결된"은, 요소들이 기능할 수 있고/있거나 다른 요소에 대한 효과를 발휘할 수 있는 배열로 존재함을 나타낸다. 예를 들어, 전사 인핸서는 양쪽 모두가 동일한 발현 벡터에 포함될 때 프로모터에 작동적으로 연결될 수도 있다.

변하기 쉬운 클론화 부위 및 발현을 위해 필요한 요소를 함유하는 벡터가 당 기술분야에 공지되어 있다. 상황에 따라 다양한 특징을 가진 벡터들이 사용될 수도 있고, 당업자라면 다양한 특징 및 이들이 적절한 상황에 친숙할 것이다. 벡터들은 예를 들어 하기 벡터의 일부 또는 전부를 함유할 수도 있다: 포유동물 세포에서 안정하거나 일시적인 형질전환체의 선택을 위해 선택가능한 마커 유전자 (예, 네오마이신 내성); (인간 CMV의 초기 유전자로부터) 높은 수준의 전사를 위한 인핸서 및/또는 프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 전사 종료 및 RNA 처리 신호 (예, SV40으로부터); 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제 기원 및 ColE1; 가변성 다중 클론화 부위; 및 센스 및/또는 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 프로모터 (예, T7 및/또는 SP6 프로모터). 상기 및 기타 유용한 요소들의 기타 예는 공지되어 있고 당 기술분야에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 유용한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있고, 스트라타진 (미국 캘리포니아주 라 졸라) 및 프로메가 바이오테크 (미국 위스콘신주 매디슨)와 같은 공급처로부터 통상적으로 입수가능하다. 일부 구현양태에서, RNA를 생성하고 이어서 세포 집단을 형질이입하기 위해 발현 벡터가 사용된다.

발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위하여, 당 기술분야에 공지된 특정한 변형이 필요하거나 도움이 될 수도 있다. 일부 구현양태에서, 번역의 안정성 및 효율을 위하여 시험관내 전사된 mRNA가 최적화된다. 예를 들어, mRNA에 3' UTR 및/또는 5' UTR을 포함시킴으로써 mRNA 안정성 및/또는 번역 효율이 증가될 수 있다. 3' UTR의 바람직한 예는 인간 CD40, β-액틴 및 로타바이러스 유전자 6으로부터의 것을 포함한다. 5' UTR의 바람직한 예는 CD40L로부터의 것, 및 Hsp70, VEGF, 비장 괴사 바이러스 RU5, 및 담배 식각 바이러스의 5'UTR에서의 번역 인핸서를 포함한다. 조절 요소의 다른 예는 이에 한정되지 않지만 다음을 포함한다.

베타-액틴은 인간 비-근육 세포에서 풍부하게 발현된 유전자이다. 포유동물 세포 주 및 유전자도입 쥐에서 유전자 발현을 유도하기 위하여 인간 β-액틴 프로모터가 널리 사용되었다. 이러한 프로모터를 함유하는 구조물에서, β-액틴 3' UTR + 인접 영역의 포함은 mRNA 축적 수준을 더욱 증가시키는 것으로 증명되었다 (예를 들어 문헌 [Qin and Gunning (1997) J.Biochem.Biophys.Meth. 36: 63-72] 참조).

시미안 로타바이러스 유전자 6 mRNA의 3'UTR은 캡형성된 비-폴리아데닐화 바이러스 전사물에서 번역의 인핸서로서 기능을 한다. 또한, 3'UTR은 토끼 그물적혈구 용해물에서 이종 리포터 mRNA의 번역을 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어 [Yang et al. (2004) Arch.Virol. 149: 303-321] 참조).

인간 hsp70 유전자의 5' UTR은 스트레스 유발의 부재 하에서 메시지 안정성에 극적으로 영향을 미치지 않으면서 리포터 mRNA의 번역을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 인핸서 기능은 다수의 인간 세포 주에서 증명되었다 (예를 들어, [Vivinus et al. (2001) Eur.J.Biochem. 268: 1908-1917] 참조).

쥐 VEGF 5' UTR은 단시스트론 리포터 RNA의 번역을 증진시키고, IRES (내부 리보솜 결합 부위) 활성을 갖고 있다. 그의 인핸서 활성이 쥐, 햄스터 및 인간 세포 주에서 증명되었다. 전체 길이 5'UTR은 1014 뉴클레오티드이지만, 163 뉴클레오티드 변이체 변형이 더욱 활성인 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, [Stein et al. (1998) Mol.Cell.Biol. 18: 3112-3119] 참조).

비장 괴사 바이러스(SNV)는 조류 레트로바이러스이다. 바이러스 5'LTR의 RU5 영역은 인간 293개 세포에서 비-바이러스 리포터 RNA의 번역 효율을 자극한다 (예를 들어, 문헌 [Roberts and Boris-Lawrie (2000) J.Virol. 74: 8111-8118]).

담배 식각 바이러스 RNA의 143-뉴클레오티드 5' 리더는 식물 및 동물 세포주에서 리포터 mRNA의 캡-독립적 번역을 촉진한다. 리더 서열이 캡형성 전사물의 번역을 더욱 증진시키지 않긴 하지만, 가지 세포에서 캡-독립적 CD40L 발현은 시험관내 캡형성에서 매우 매력적인 대안이다 (예를 들어, 문헌 [Gallie et al. (1995) Gene 165: 233-238]; [Niepel and Gallie (1999) J.Virol. 73: 9080-9088]; [Gallie (2001) J.Virol.75: 12141-12152] 참조).

여기에서 사용된 "유전자 전달" 또는 "유전자 운반"이란 도입을 위해 사용되는 방법과는 무관하게 숙주 세포로 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입을 가리킨다. 유전자 전달(또는 운반)이란 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수도 있거나, 또는 숙주 세포 게놈과 무관하게 복제될 수도 있는 핵산의 전달을 가리킨다. 유전자 전달은 mRNA가 세포 내로 도입되는 것을 가리키지 않는다. "유전자 전달 운반체"란 숙주 세포 내로 삽입된 폴리뉴클레오티드를 운반할 수 있는 분자이다. 유전자 전달 운반체의 예는 예를 들어 리포좀; 생체적합성 중합체 (천연 또는 합성); 지질단백질; 폴리펩티드; 다당류; 지질다당류; 인공 바이러스 외피; 및 금속 입자를 포함한다. 유전자 전달 운반체의 예는 세균 또는 바이러스 (예컨대, 바쿨로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스), 박테리오파지, 벡터 (예, 코스미드 및 플라스미드) 및 각종 진핵 및 원핵 숙주에서 발현을 위해 설명되어진 당 기술분야에 공지된 기타 재조합 운반체를 포함하며, 유전자 요법뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 생성을 위해 사용될 수도 있다.

다수의 벡터가 포유동물 세포로 유전자의 운반을 매개할 수 있고, 당 기술분야에 공지되어 있으며 여기에 설명되어 있다. "바이러스 벡터"는, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 숙주 세포 내로 전달되어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합에 의해 생성된 바이러스 또는 바이러스 입자로서 정의된다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-결합 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등을 포함한다. 알파바이러스 벡터, 예컨대 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스-기초 벡터 및 신드비스 바이러스(Sindbis virus)-기초 벡터는 유전자 요법 및 면역요법에서 사용하기 위해 개발되었다. 예를 들어 문헌 [Schlesinger and Dubensky (1999) Curr.Opin.Biotechnol. 5:434-439] 및 [Zaks et al. (1999) Nat.Med. 7: 823-827] 참조.

유전자 운반이 레트로바이러스 벡터에 의해 매개되는 측면에서, 벡터 구조물은 레트로바이러스 게놈 또는 그의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 치료 유전자를 가리킨다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "레트로바이러스 매개 유전자 운반" 및 "레트로바이러스 형질도입"은 동일한 의미를 갖고, 세포에 들어가고 그의 게놈을 숙주 세포 게놈에 통합하는 바이러스에 의하여 유전자 또는 핵산 서열이 숙주 세포 내에 안정하게 운반되는 과정을 가리킨다. 바이러스는 일반적인 감염 메카니즘을 통하여 숙주 세포에 들어갈 수 있거나, 또는 세포에 들어가기 위해 상이한 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하도록 변형될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이 "레트로바이러스 벡터"는 바이러스 또는 바이러스-유사 도입 메카니즘을 통해 세포 내에 외인성 핵산을 도입할 수 있는 바이러스 입자를 가리킨다. 레트로바이러스는 그들의 유전 정보를 RNA의 형태로 운반한다; 그러나, 바이러스가 일단 세포를 감염시키면, RNA가 DNA로 역-전사되고 이것이 감염된 세포의 게놈 DNA에 통합되고 프로바이러스라 일컬어진다.

2 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역 (또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은 특정한 퍼센트의 "서열 동일성"을 공유할 수도 있다. 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 의해 공유된 서열 동일성의 정렬 및 평가는, 디폴트 매개변수를 가진 BLAST 정렬 프로그램을 사용하여 결정된다. BLAST 프로그램은 문헌 [Karlin and Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 2264]의 알고리즘의 실행이고, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90: 5873-5877]에서와 같이 변형된다. 대안적인 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP가 있으며, 다음과 같은 디폴트 매개변수를 사용한다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음 (none); 스트랜드 = 양쪽 (both) ; 컷오프 = 60; 예상치 (expect) = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 분류 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, 진뱅크(GenBank) + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + 스위스프로테인(SwissProtein) + SP업데이트(SPupdate) + PIR. 또한, GAP 프로그램을 사용하여 서열을 비교할 수 있으며, 이 프로그램은 일치하는 수를 최대화하고 차이를 최소화하는 2개의 완전한 서열의 정렬을 찾기 위한 니들맨과 번치의 알고리즘 [Needleman and Wunsch (1970), J.Mol.Biol. 48: 443-453]을 사용한다. 이 프로그램의 세부사항은 URL ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST에서 찾아볼 수 있다. BLAST 및 GAP 프로그램을 포함한 서열 비교 소프트웨어는 액슬리(Accelrys) GCG 패키지 (버젼 11.0, 미국 샌디에고 액슬리)로서 통상적으로 입수가능하다.

서열은 다양한 퍼센트의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 공유할 수도 있다. 상기 나타낸 알고리즘 또는 다른 알고리즘을 사용하여 수동으로 정렬 및 서열 동일성 평가를 수행할 수도 있다.

아미노산 서열 또는 그것을 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 "보존적 변경"은, 유사한 전하 밀도, 친수성 또는 소수성, 크기, 및/또는 형태의 대안적 아미노산 서열을 가져오는 것이다 (예, Ile에 대해 Val). 이에 비교하여, "비보존적 변경"은 상당히 상이한 전하 밀도, 친수성 또는 소수성, 크기 및/또는 형태의 대안적인 아미노산 서열을 가져오는 것이다 (예를 들어, Phe에 대해 Val). 이러한 변형을 형성하는 수단이 당 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능한 키트 및 벡터에 의해 달성될 수 있다 (예를 들어, 미국 매사츄세츠주 베버리의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.); 미국 캘리포니아주 팔로 알토의 클론테크(Clontech)로부터 입수가능한 것).

"단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편은, 자연 환경에서 발견되는 핵산 분자 또는 단백질을 수반하거나 이와 상호작용하는 성분을 실질적 또는 필수적으로 갖지 않는다. 따라서, 단리되거나 정제된 핵산 분자 또는 단백질은 재조합 기술에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 갖지 않거나, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않는다. 예를 들어, 바람직하게는, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 폴리뉴클레오티드에 자연적으로 인접한 서열 (예컨대 단백질 코드화 서열) (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)을 갖지 않는다. 예를 들어, 다양한 구현양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA에서 폴리뉴클레오티드에 자연적으로 인접한 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 미만의 핵산 서열을 함유할 수 있다. 세포 물질을 실질적으로 갖지 않는 단백질은 오염 단백질의 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% (건조 중량) 미만을 가진 단백질의 제제를 포함한다. 본 발명의 단백질 또는 생물학적 활성 부분을 재조합에 의해 생성할 때, 바람직하게는 배양 배지가 주요 단백질 이외의 화학 전구체 또는 화학 물질을 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만 (건조 중량)으로 나타낸다.

폴리뉴클레오티드는 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 복제될 수 있다. PCR 기술은 DNA를 복제하기 위한 한가지 수단이고 미국 특허 4,683,195호; 4,800,159호; 4,754,065호; 및 4,683,202호에 기재되어 있으며, 또한 [PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION (Mullis et al.eds, Brikhauser Press, Boston (1994)] 및 그의 참고문헌에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위한 추가의 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다.

"농축된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편(들)은 부피 당 분자의 농도 또는 수가 자연 발생 상대물의 것보다 크다는 점에서, 자연 발생 상대물로부터 구별될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편(들)은 예를 들어 주요 서열에 의하여 또는 대안적으로 글리코실화 패턴과 같은 다른 특징에 의하여, 또는 다른 일부 특징에 의하여 그것을 자연 발생 상대물로부터 구별할 수 있기 때문에 자연 발생 상대물로부터 구별하기 위하여 "단리"를 필요로 하지 않는다.

용어 "숙주 세포", "표적 세포" 및 "수용체 세포"는 벡터 또는 외인성 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질의 혼입을 위한 수용체일 수 있거나 이미 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함하는 것으로 해석된다. 또한, 단일 세포의 자손을 포함하는 것으로 해석되고, 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이에 기인하여 자손이 반드시 원래 모 세포와 (형태학적 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체에 있어서) 완전히 동일할 필요는 없을 수도 있다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수도 있고, 이에 한정되지 않지만 세균 세포, 효모 세포, 동물 세포 및 포유동물 세포, 예를 들어 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 세포를 포함한다.

"피험자"는 예를 들어 포유동물 또는 인간과 같은 척추동물이다. 포유동물은 이에 한정되지 않지만 쥐, 원숭이, 인간, 농장 동물, 운동경기 동물, 및 애완 동물을 포함한다. "환자"는 특정한 질병 또는 질환, 예컨대 암을 위한 치료가 필요한 피험자이다. 그러나, 환자가 치료받도록 하기 위하여 실제 질병 또는 질환이 확인될 필요는 없다. "대조"는 비교를 위한 실험에서 사용되는 대안적인 피험자 또는 샘플이다. 대조는 포지티브 또는 네가티브일 수 있다. 예를 들어, 실험의 목적이 면역 반응과 특정한 배양 조건과의 상관관계를 결정하는 것인 경우에, 포지티브 대조 및 네가티브 대조를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 적절한 대조를 위한 기준 및 매개변수가 당 기술분야에 공지되어 있고 당업자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 상황 하에서 형질이입된 가지 세포를 위해 적절한 대조는, "모의 형질이입된", 예를 들어 RNA 없이 일렉토르포레이트된 동일하거나 유사한 계통의 가지 세포이다. 대안적으로, 일부 상황하에서 형질이입된 가지 세포를 위해 적절한 대조는, 주요 표현형에 영향을 미치는 것으로 예상되지 않는 상이한 단백질을 코드화하는 RNA로 형질이입된 가지 세포이다.

"암"이란 비교적 자가 성장을 나타내는 적어도 하나의 비정상 세포를 의미한다. 암 세포는 세포 증식 조절의 상당한 손실을 특징으로 하는 비정상적 성장 표현형을 나타낸다. 암종 세포는 양성 또는 악성일 수 있다. 암은 예를 들어, 방광, 혈액, 뇌, 유방, 결장, 소화관, 폐, 난소, 췌장, 전립선 또는 피부를 포함한 다양한 조직 또는 기관의 세포에 영향을 미칠 수 있다. 여기에서 사용된 암 세포의 정의는 주요 암 세포뿐만 아니라 암 세포 원종으로부터 유래된 어떠한 세포를 포함한다. 이것은 전이된 암 세포 및 암 세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포 주를 포함한다.

암은 이에 한정되지 않지만 고형 종양, 액체 종양, 혈액 악성종양, 신장 세포 암, 흑색종, 유방암, 전립선 암, 고환 암, 방광 암, 난소 암, 자궁경부암, 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 신경아세포종, 아교모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 골수종, 림프종, 간암, 샘종, 육종, 암종, 모세포종 등을 포함한다. 보통 고형 종양으로서 나타나는 암 유형을 언급할 때, "임상적으로 검출가능한" 종양은 예를 들어 CAT 스캔, 자기 공명 영상화(MRI), X-선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의하여 종양 덩어리를 기초로 하여 검출가능한 것이다. 생화학적 또는 면역학적 연구결과 만으로는 이러한 정의를 충족하기 위해 불충분할 수도 있다.

용어 "배양하는"이란 적절한 배지에서 세포의 시험관내 유지, 분화 및/또는 증식을 가리킨다. "풍부한"이란, 세포가 유기체에 존재할 때 전체 세포가 조직에서 발견되는 것보다 더욱 큰 퍼센트로 존재하는 세포를 포함하는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 만들어진 DC의 풍부한 배양물 및 제제는, 유기체에 존재하는 조직 (예, 혈액, 피부, 림프절 등)에서의 퍼센트에 비하여 더욱 높은 퍼센트의 전체 세포로 존재한다.

일부 구현양태에서, "조성물"은 불활성이거나 (예를 들어 검출가능한 시약 또는 표지) 또는 활성 (예를 들어, 아주반트)인 활성 시약 및 기타 화합물 또는 조성물의 조합을 포함하는 것으로 이해된다. "제약학적 조성물" 또는 약제는, 조성물이 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단 또는 치료 용도를 위해 적절하도록 불활성 또는 활성 담체와 활성 시약과의 조합을 포함하는 것으로 이해된다. 여기에서 사용된 용어 "제약학적으로 허용가능한 담체"는 포스페이트 완충 염용액, 물 및 유/수 또는 수/유 에멀젼과 같은 에멀젼 및 다양한 유형의 습윤제와 같은 표준 제약학적 담체를 포함한다. 조성물은 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아주반트의 예를 위하여, 문헌 [Martin REMINGTON'S PHARM.SCI. 18th Ed. (Mack Publ.Co., Easton (1990)]을 참조한다.

"유효 량"은 적어도 유리하거나 바람직한 결과, 예를 들어 증진된 면역 반응 또는 의학적 상태 (질병, 감염 등)의 개선를 얻기에 충분한 양이다. 유효 량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여 량은 체중, 연령, 건강, 치료되어질 질병 또는 상태 및 투여 경로에 의존하여 변할 것이다.

일부 구현양태에서, 방법의 단계들은 생체내 또는 생체외로 수행될 수 있다. 생체외에서 실행할 때, 방법은 개방 또는 밀폐 시스템에서 실행될 수 있다. 세포 집단을 배양하고 풍부하게 만들기 위한 방법 및 시스템이 당 기술분야에 알려져 있다. 미국 특허 공고 2004/0072347의 실시예 1 및 2 참조. 또한, 세포 확장을 위한 밀폐 시스탬을 설명하고 있는 미국 특허 공고 2003/0235908 참조.

본 발명의 일부 구현양태에서, 가지 세포를 하나 이상의 관심 항원으로 추가로 부하할 수도 있고, 이어서 성숙한 DC에 의해 처리 및/또는 제시될 것이다. DC가 미성숙되거나 성숙될 때 DC를 부하할 수도 있거나, 또는 전구체 세포를 부하한 다음 성숙한 부하된 DC를 생성하기 위해 사용할 수도 있다. "부하된" 또는 "항원-부하된"이란, 항원이 가지 세포에 혼입되어 이것이 가지 세포에 의해 T-세포에 제시될 수 있음을 의미한다. 일부 구현양태에서, 가지 세포는 항원을 함유한 배지에서 배양함으로써 부하된다 (때때로, "펄스화(pulsing)" 또는 "펄스화된"이라 일컬어짐, 예를 들어 문헌 [Shaw et al. (2002) Infect.Immun. 70: 1097-1105] 참조). 이어서, DC는 MHC 분자와의 결합 시에 세포 표면 위에서 항원을 취하고 처리한다. 다른 구현양태에서, 항원을 코드화하는 핵산과의 형질이입에 의해 DC를 항원으로 부하하고, 예를 들어 항원을 코드화하는 RNA로 DC를 일렉트로포레이트한 다음 이들이 발현된다.

용어 "항원"은 당 기술분야에서 잘 이해되며, 면역원성인 물질, 즉 면역원을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위하여 항원의 사용이 계획되는 것을 이해해야 하며, 따라서 항원은 이에 한정되지 않지만 자기-항원 (정상 또는 질병-관련), 감염성 또는 병원체-특이성 항원 (예, 미생물 항원, 바이러스 항원 등) 또는 일부 기타 외래 항원 (예, 식품 성분, 꽃가루 등)을 포함한다. 예를 들어, 항원은 이에 한정되지 않지만 병원체, 병원체 용균물, 병원체 추출물, 병원체 폴리펩티드, 바이러스 입자, 세균, 단백질, 폴리펩티드, 암 세포, 암 세포 용균물, 암 세포 추출물 및 암-세포-특이적 폴리펩티드를 포함한다. 항원은 당 기술분야에 공지된 바와 같이 생존성 또는 면역원성을 증진시키는 역할을 할 수도 있다. "병원체-특이성" 항원은 특정한 병원체 또는 특정한 병원체 군에 의해 생성되지만 다른 병원체 또는 다른 병원체 군에 의해서는 생성되지 않는 항원이다. 병원체-특이성 항원의 예는 당 기술분야에 알려져 있으며, HIV-특이성 항원 (예를 들어 문헌 [Stratov et al. (2004) Curr.Drug.Targ. 5: 71-88]) 및 HCV-특이성 항원 (예를 들어 문헌 [Simon et al. (2003) Infect.Immun. 71: 6372-6380]; [Encke et al. (1998) J.Immunol. 161: 4917-4923])을 포함한다.

항원은 자연 발생적이거나 재조합에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항원"은 하나 이상의 항원의 집합에 적용되고, 따라서 다수의 항원에 대한 면역 반응이 동시에 조절될 수도 있다. 또한, 용어는 각종 상이한 항원의 제형을 포함한다. "에피토프"는 면역 반응을 이끌어내는 항원의 일부 (보통 표면 일부 또는 MHC-결합 펩티드)이고, 여기에서 사용된 용어 "항원"에 의해 일반적으로 포함된다.

항원은 폴리펩티드 또는 단백질로서 세포에 전달될 수 있거나, 또는 이들은 항원을 코드화하는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드로서 전달될 수 있고, 따라서 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 발현은 처리되어지는 개체 (생체내 전달될 때) 또는 세포 배양 시스템 (시험관내 전달될 때)에서 항원을 생성한다. 즉, 본 발명의 방법은, 적절한 방법 (예를 들어, 형질이입, 펄스화 등)에 의하여 항원-부하된 DC를 생성하기 위해, 미성숙 또는 성숙 DC에 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 항원을 코드화하는 폴리뉴클레오티드(들)을 도입하는 것을 더욱 포함한다. 일부 구현양태에서, 항원(들)을 코드화하는 mRNA가 일렉트로포레이션에 의해 세포 내에 도입된다. 일부 구현양태에서, 이러한 mRNA는 CD40 작용질을 코드화하는 mRNA와 함께 또는 실질적으로 CD40 작용질 신호화와 동시에 도입될 수 있다.

항원은 그의 "자연" 형태로 전달될 수도 있고, 다시 말해서 항원이 DC와 만나는 환경에 들어가기 위해 항원을 제조하거나 항원을 유도함에 있어서 인간의 개입이 관여되지 않는다. 대안적으로 또는 추가로, 항원은 예를 들어 통상적인 알레르기 샷으로 또는 종양 용균물로 투여되는 형태의 미가공 제제로 전달될 수도 있다. 대안적으로, 항원은 실질적으로 정제될 수도 있고, 예를 들어 적어도 약 90% 순수할 수도 있다. 일부 구현양태에서, 항원은 신생물 세포 또는 병원체 또는 병원체-감염된 세포로부터 단리되거나 유래된 RNA의 형태로, 다시 말해서 대량으로 항원 제시 세포에 전달된다. 어떠한 세포로부터 추출된 RNA의 RT-PCR 방법 및 시험관내 전사가 예를 들어 PCT/US05/053271에 개시되어 있다.

항원이 펩티드인 경우에, 이것은 예를 들어 단리된 단백질의 단백질분해 절단에 의해 생성될 수도 있다. 이에 한정되지 않지만 펩신, 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신 등을 포함한 각종 절단 시약이 사용될 수도 있다. 대안적으로, 펩티드는 바람직하게는 자동화 합성장치 위에서 화학적으로 합성될 수도 있다 (예를 들어, 문헌[Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis 2nd Ed. Pierce Chemical Co., 1984] 참조). 일부 구현양태에서, 주요 펩티드를 코드화하는 핵산을 생성하고, 원하는 조건 하에서 (예를 들어 숙주 세포에서, 또는 쉽게 정제될 수 있는 시험관내 발현 시스템에서) 펩티드를 발현하기 위하여 재조합 기술이 사용될 수도 있다.

일부 구현양태에서, 항원은 자연-발생 화합물과 구별되는 구조를 가질 수 있다. 본 발명의 특정한 구현양태에서, 항원은 자연-발생 항원과 실질적으로 유사한 구조를 갖지만 자연 발생 화합물의 정확한 구조로부터 하나 이상의 일탈을 가진 "변형된 항원"이다. 예를 들어, 자연-발생 항원이 단백질 또는 폴리펩티드 항원인 경우에, 단백질 또는 폴리펩티드 항원에 비해 변형된 항원은 하나 이상의 아미노산의 첨가, 치환 또는 결실에 의해 자연-발생 항원과 상이한 아미노산 서열을 가질 것이고, 및/또는 아미노산에 공유 결합된 하나 이상의 화학 잔기의 첨가, 치환 또는 결실에 의하여 자연-발생 항원에서 상응하는 아미노산과 상이한 하나 이상의 아미노산을 포함할 것이다. 하나의 측면에서, 자연-발생 및 변형된 항원은 적어도 대략 75% 동일한 5개 이상의 아미노산의 영역을 하나 이상 공유한다. 당업자라면, 그들의 동일성 정도를 결정하기 위해 2개의 아미노산 서열을 비교할 때, 동일한 아미노산의 연장부 (즉, 적어도 2개의 영역) 사이의 간격이 항상 정확하게 보존될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 자연-발생 및 변형된 단백질 또는 폴리펩티드 항원은 적어도 5개 아미노산의 적어도 하나의 영역에 대하여 아미노산 서열의 적어도 약 80% 동일성, 더욱 대안적으로 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 동일성을 나타낼 수 있다. 종종, 더욱 긴 아미노산 서열 영역 (예를 들어, 10, 20, 50 또는 100 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 영역)이 표시된 동일성 정도를 나타내는 것이 유용할 수도 있다.

일부 구현양태에서, DC는 암 세포 또는 병원체, 예를 들어 HIV 또는 HCV로부터 적어도 하나의 다른 항원을 발현한다. 용어 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"란 암과 관련된 항원을 가리킨다. 암종 세포에 대해 면역 반응을 유도하거나 향상시키기 위해 본 발명의 DC에 의해 발현될 수도 있는 특정한 종양-관련 항원의 예는 당 기술분야에 공지되어 있으며 예를 들어 MAGE 단백질, MART, LAGE, NY-ESO-1, 티로시나제, PRAME, 전립선 특이적 항원(PSA), 멜란-A 및 기타 등등을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Santin et al. (2005) Curr.Pharm.Des. 11: 3485-3500]; [Rimoldi et al. (2000) J.Immunol. 165: 7253-7261]; [Watari et al. (2000) FEBS Lett. 466: 367-371]; [Engelhard et al. (2000) Cancer J. 6 Suppl. 3: S272-S280]; [Chakraborty et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 497-502]; [Romero et al. (2002) Immunol.Rev. 188: 81-96] 참조). 종양-관련 항원인 관심 항원의 사용은 암의 치료를 위해 피험자의 면역 반응을 조절하기 위해 유용하다. 따라서, 일부 구현양태에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은, 예를 들어 (a) 막 귀소 폴리펩티드를 코드화하는 RNA로 일시적 형질이입되고 적어도 하나의 다른 항원으로 부하되어진 단리된 가지 세포를 제공하고; (b) 가지 세포를 환자에게 정맥내 투여하는 단계를 포함하는, 항원-부하 가지 세포를 환자에서 림프 조직에 전달하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현양태에서, 다른 항원이 한정되고 일부 구현양태에서는 한정되지 않는다. 항원은 항원의 각각의 펩티드 또는 단백질의 개성 및 길이가 미리 공지되어 있을 때 "한정"된다. 역으로, 항원의 적어도 하나의 펩티드 또는 단백질 성분의 개성 및/또는 길이가 미리 공지되어 있지 않을 때, 항원은 "비한정"되거나 "한정되지 않는다". 예를 들어, 전체 세포 단백질 (예, 전체 세포 mRNA로서 세포에 제공된 항원)을 포함하는 항원은 비한정 항원이다.

본 발명의 항원-부하 DC는 피험자에서 관심 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시키기 위해 유용하다. 따라서, 일부 구현양태에서, 본 발명은 본 발명의 항원-부하 DC의 유효 량을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법을 제공한다. DC는 피험자에게 동종이형 또는 자가유래일 수 있다. DC의 "유효 량"은 시간에 걸쳐 피험자에서 유리한 치료 반응을 달성하거나 암 세포의 성장을 억제하거나 감염을 억제하기에 충분하다.

여기에서 사용된 바와 같이 피험자에서 면역 반응을 "유도하는" 또는 "증진시키는"이라는 용어는 당 기술분야에 공지된 용어이고, 피험자에게 항원을 도입하기 전의 면역 반응(존재한다면)에 비하여, 피험자에게 항원을 도입한 후에 검출되거나 측정될 수 있는 항원에 대한 면역 반응에서 적어도 약 2배, 5배, 10배, 100배, 500배 또는 적어도 약 1000배 이상의 증가를 가리킨다. 항원에 대한 면역 반응은 이에 한정되지 않지만 항원-특이적 항체의 생성, 및 그의 표면상에서 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 발현하는 면역 세포의 생성을 포함한다.

주어진 항원에 대한 면역 반응이 유도 (또는 증진)되는지의 여부를 결정하는 방법이 당 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 이에 한정되지 않지만 고정화 항원에 대한 샘플 내 항체의 결합이 검출가능하게 표지화된 제2 항체 (예, 효소-표지화 쥐 항-인간 Ig 항체)와 함께 검출되어지는 ELISA를 포함하여, 당 기술분야에 공지된 다양한 면역분석의 어느 것을 사용하여 항원-특이적 항체가 검출될 수 있다.

본 발명의 가지 세포는 환자에게 투여하기 위해 적절한 제형, 예를 들어 정맥내 제형으로 제공될 수 있다. 환자에게 투여하기 위해 적절한 본 발명의 DC는 "백신" 또는 "DC 백신"으로서 여기에서 언급된다. 백신 또는 DC 백신은 면역 반응을 조절하는데 도움이 되도록 추가의 성분을 더`욱 포함할 수도 있거나, 또는 환자에게 투여하기 위해 적절하도록 더욱 처리될 수도 있다. 가지 세포의 정맥내 투여 방법이 당 기술분야에 공지되어 있고, 당업자라면 투여된 DC의 치료 효과를 최대화하기 위하여 정맥내 투여의 매개변수를 변화시킬 수 있을 것이다.

따라서, DC는 적어도 하나의 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께 어떠한 적절한 방식으로 피험자에게 투여된다. 제약학적으로 허용가능한 담체의 적합성은, 투여되어지는 특정한 조성물에 의해서 뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정한 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 가장 전형적으로, 품질 조절 시험 (예, 생물학적 분석, 클론원성 분석, 생육성 분석)을 수행하고, 세포를 피험자에게 재주입하고, 일부 경우에 디펜히드라민 및 히드로코르티존의 투여에 의해 선행된다. 예를 들어 문헌 [Korbling et al. (1986) Blood 67: 529-532] 및 [Haas et al. (1990) Exp.Hematol. 18: 94-98] 참조.

비경구 투여를 위해 적절한 제형, 예를 들어 정맥내 투여는 산화방지제, 완충제, 정균제 및 제제를 수용체의 혈액과 등장성인 제제로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 등장성 멸균 주사 용액, 뿐만 아니라 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.

일반적으로, 본 발명의 DC는 당업자에 의해 결정되는 바와 같이 피험자의 체중 및 전체 건강에 적절하도록 유효량, 세포 유형의 독성 (예, LD-50), 및 다양한 농도에서 세포 유형의 부작용에 의해 결정되는 비율로 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할 투여량으로 달성될 수 있다. 본 발명의 DC는 질병 또는 질환을 위해 예를 들어 통상적인 방사선 요법, 세포독성 시약, 뉴클레오티드 유사체 및 생물학적 반응 개질제를 포함하여 다른 치료를 보충할 수 있다.

단지 예증의 목적을 위하여, 본 발명의 DC를 다음과 같이 피험자에게 투여할 수 있다. 혈액 샘플은 주입 이전에 피험자로부터 수득되고, 이후의 분석 및 비교를 위하여 일부 분취량을 남겨둔다. 일반적으로 적어도 약 10⁴ 내지 10⁶, 전형적으로 1 × 10⁷ 내지 1 × 10⁹ 세포를 약 60 내지 120분에 걸쳐 70 kg 환자에게 정맥내 주입한다. 맥박 산소측정법에 의하여 환자를 활력 징후 및 산소 포화에 대해 가까이에서 감시한다. 간격을 두고 혈액 샘플을 수득할 수도 있고 분석을 위해 남겨둔다. 1년 기간에 총 10 내지 12회 치료를 위하여 대략 매달 세포 재-주입을 반복한다. 첫 번째 치료 후에, 임상학자의 판단 시에 외래환자에게 주입을 실행할 수 있다.

본 발명은 항원성 펩티드의 효과를 시험할 수 있는 방법을 더욱 제공한다. 각종 유사한 펩티드를 예방접종으로서 투여할 수 있고, 최적의 반응을 일으키는 아미노산 서열을 확인하기 위하여 각각의 펩티드에 대한 반응을 비교할 수 있다. 예를 들어 HLA 결합 친화성과 같은 공지된 매개변수를 기초로 하여 펩티드에 대한 변형을 행할 수 있거나, 또는 무작위로 변형이 발생될 수 있고 면역원성 잠재력에 대해 시험할 수 있다.

특정한 조성물 또는 적용에서 사용되어지는 항원의 양은, 당업자에 의해 쉽게 이해되듯이 특정한 항원의 성질 및 사용되는 용도에 의존할 것이다.

방법은 시험관내 또는 생체내에서 유효 량의 사이토카인 또는 공동-자극 분자와 세포를 접촉시킴으로써 더욱 변형될 수 있다. 이러한 시약은 폴리펩티드, 단백질로서 전달될 수 있거나, 또는 대안적으로 폴리뉴클레오티드 또는 이들을 코드화하는 유전자로서 전달될 수 있다. 사이토카인, 공동-자극 분자 및 케모카인이 불순한 제제 (예를 들어, 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 사이토카인 유전자를 발현하는 세포의 단리물)로서 또는 "정제된" 형태로 제공될 수도 있다. 정제된 제제는 바람직하게는 적어도 약 90%, 95% 또는 적어도 약 99% 순수하다.

사이토카인 및 항원 양쪽 모두가 개체에 전달되는 경우에, 이들은 함께 또는 별도로 제공될 수도 있다. 이들이 폴리펩티드 또는 단백질로서 전달될 때, 이들은 일반적인 캡슐화 장치로 전달될 수 있거나, 공유 결합, 수소 결합, 소수성 상호작용, 반 데르 바스 상호작용 등과 같은 물리적 조합에 의해 전달될 수도 있다. 대안적인 구현양태에서, 양쪽 모두를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다는 점에서 화합물들이 함께 제공된다. 일부 구현양태에서, 양쪽 요인들이 사이토카인 및 항원이 펩티드 결합을 통해 서로에 공유 결합된 융합 단백질로서 단일 연속 폴리뉴클레오티드로부터 발현된다. 대안적으로 또는 추가로, 유전자들이 동일하거나 동등한 제어 서열에 연결될 수도 있고, 그 결과 양쪽 유전자들이 동일한 자극에 대한 반응으로 개체 내에서 발현된다. 사이토카인 및/또는 항원의 투여는 기타 원하는 면역 체계 조절 인자, 예를 들어 아주반트 또는 기타 면역조절 화합물의 투여와 함게 임의로 조합될 수도 있다.

T 세포를 활성화시키기 위한 DC의 능력을 분석하기 위하여, 당 기술분야에 공지된 절차를 사용하여 T 세포가 수득될 수도 있다. 간략하게, 적혈구 및 호중구로부터 PBMC를 분리하기 위하여 밀도 구배 원심분리를 사용할 수 있다. T 세포는 컬럼 또는 자기 비드에 결합된 적절한 단클론성 항체와의 네가티브 또는 포지티브 선택에 의해 풍부하게 될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 성숙한 DC는 당 기술분야에 공지되고/되거나 여기에 기재된 적절한 분석에 의해 측정 시에 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상만큼 대조 DC에 비해서 생체 내에서 T 세포를 더욱 자극할 수 있다.

다양한 목적을 위해 특정한 세포 유형을 확인하고/하거나 단리하기 위하여 세포 표면 마커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 줄기 세포는 전형적으로 CD34 항원을 발현한다. 특정한 세포 유형을 확인하고 단리하는 방법은 예를 들어 FACS, 컬럼 크로마토그래피, 자기 비드와의 패닝(panning), 웨스턴 블롯, 방사선촬영술, 전기영동, 모세관 전기영동, 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 얇은 층 크로마토그래피(TLC), 고확산 크로마토그래피, 등, 및 유체 또는 겔 침전 반응, 면역확산 (단일 또는 이중), 면역전기영동, 방사선면역측정법(RIA), 효소-결합 면역흡수 분석 (ELISA), 면역형광 분석 등과 같은 다양한 면역학적 방법을 포함한다. 일반적으로 면역학적 및 면역분석 절차의 검토를 위하여 문헌 [Stites and Terr,eds. 1991 BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.)]; [Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL]; [Harlow and Lane, eds. (1999) USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL]을 참조한다.

다양한 목적을 위해 사용된 항체는 어떠한 적절한 유형, 예를 들어 단클론성 또는 다클론성일 수 있고; 항체는 인간, 키메라 또는 인체화될 수 있다. 예를 들어 Fab, Fab', Fab2, Fab'2 및 단일 사슬 가변 영역을 포함하여 기능적 단편 또는 항체의 유도체가 사용될 수 있다. 세포 배양물, 파지 또는 기타 적절한 동물에서 항체가 생성될 수 있다. 주어진 일련의 조건 하에서 적절한 항원 (즉, 항체에 의해 인식되거나 인식될 수도 있는 항원)에 대한 항체의 결합을, 부적절한 항원 또는 항원 혼합물 (즉, 항체에 의해 인식될 것으로 예상되지 않거나 인식되지 않는 항원)에 대한 항체의 결합과 비교함으로써 결합 특이성에 대해 항체를 시험할 수 있다. 항체가 부적절한 항원 또는 항원 혼합물에 대해서 보다 적어도 2, 5, 7 또는 10배 이상 적절한 항원에 결합한다면 항체 결합은 특이적인 것으로 생각된다.

단백질 및/또는 폴리펩티드를 검출하고 정량하기 위하여 다양한 기술이 당 기술분야에 공지되어 있으며, 이에 한정되지 않지만 방사능면역분석, ELISA (효소 결합 면역흡수 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역방사능측정 및/또는 면역염색 분석, 원위치 면역분석 (예를 들어, 콜로이드 골드, 효소 또는 방사능동위원소 표지 사용), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전 분석, 면역형광 분석 및 PAGE-SDS를 포함한다. 다양한 세포-표면 마커의 존재 또는 부재에 대해 세포의 집단을 평가하기 위하여 유세포분석법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Givan (1992) Flow Cytometry: First Principles (John Wiley & Sons, New York, NY, USA)] 참조.

세포의 냉동보존 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Feuerstein et al. (2000) J.Immunol. Meth. 245: 15-29] 참조.

가지 세포의 면역원성 및 본 발명의 방법에 의해 유도되고 확장된 교육받은 T 세포의 품질 및 양은, 이에 한정되지 않지만 다음을 포함하는 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다:

⁵¹ Cr -방출 용균 분석: 펩티드-펄스화 또는 일부 다른 수단을 통해 항원을 제시하는 ⁵¹Cr-표지화 표적을 용균시키는 능력에 대하여 항원-특이적 T-세포를 비교할 수 있으며, "더욱 활성"인 조성물은 시간의 함수로서 더욱 큰 표적의 용균을 나타낸다. 특정한 기간, 예를 들어 4 시간 이내에 용균의 동역학뿐만 아니라 용균의 양에 의하여 성능을 평가할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ware et al. (1983) J.Immunol. 131: 1312] 참조.

사이토카인-방출 분석: 변형된 APC를 접촉할 때 세포에 의해 분비되는 사이토카인의 유형 및 양에 의하여 T 세포의 기능적 활성을 측정할 수 있다. 사이토카인 생성의 속도 및 전체 량을 결정하기 위하여 사이토카인을 ELISA 또는 ELISPOT 분석에 의해 측정할 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Fujihashi et al. (1993) J.Immunol.Meth. 160: 181]; [Tanquay and Killon (1994) Lymph.Cyt.Res. 13: 259] 참조).

T-세포의 시험관내 교육( education) : 정상 기증자 또는 환자로부터의 PBMC로부터 반응성 T 세포 집단을 이끌어내는 능력에 대하여 DC를 분석할 수 있다. 이끌어낸 T 세포를 용균 활성, 사이토카인 방출, 다클론성 및 항원에 대한 교차-반응성에 대해 시험할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Parkhurst et al. (1996) J.Immunol. 157: 2539-2548] 참조).

유전자도입 동물 모델: HLA 유전자도입 쥐를 본 발명의 조성물로 예방접종하고, 유도된 면역 반응의 성질 및 크기를 결정함으로써 생체내에서 면역원성을 평가할 수 있다. 대안적으로, hu-PBL-SCID 쥐 모델은 인간 PBL의 입양 전달에 의해 쥐에서 인간 면역 체계를 재구성할 수 있다. 이러한 동물을 조성물로 예방접종할 수도 있고, 문헌 [Shirai et al. (1995) J.Immunol. 154: 2733]; [Mosier et al. (1993) Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 2443]에 앞서 언급된 바와 같이 면역 반응에 대해 분석할 수 있다.

증식 분석: 반응성 조성물에 대한 반응에서 T 세포가 증식할 것이고, 예를 들어 ³H-티미딘 흡수를 측정함으로써 증식을 정량적으로 점검할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Caruso et al. (1997) Cytometry 27: 71] 참조).

영장류 모델: 침팬지는 인간 MHC 분자와의 중복된 MHC-리간드 특이성을 공유하고, 따라서 상대적 생체내 면역원성에 대해 HLA-제한 리간드를 시험하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bertoni et al. (1998) J.Immunol. 161: 4447] 참조).

TCR 신호 변환 사건의 점검: MHC-리간드 복합체에 의한 성공적인 TCR 개입(engagement)을 몇 가지 세포내 신호 변환 사건 (예, 포스포릴화)과 조합한다. 이러한 사건을 TCR 개입을 통해 효과기 세포를 활성화하기 위하여 정성적 및 정량적으로 조성물의 상대적 능력과 서로 관련되었다 (예를 들어, 문헌 [Salazar et al. (2000) Tnt.J.Cancer 85: 829]; [Isakov et al. (1995) J.Exp.Med. 181: 375] 참조).

상기 설명에 따르면, 하기 실시예들이 본 발명의 다양한 측면을 예증하지만 이것을 제한하지 않는 것으로 해석된다.

실험

하기 기재된 실시예에서 적용된다면 하기 물질 및 방법이 사용되었다. 집합적으로, 하기 실시예들은 키메라 E/L 셀렉틴을 DC 내에 도입하면, DC가 고 내피 세정맥(HEV)을 통해 혈류로부터 직접적으로 림프절에 들어갈 수 있게 한다는 것을 보여준다.

항체: DC의 표현형을 결정하기 위하여, 하기 항체(Abs)를 사용하였다: FITC-표지화 항-CD83, 항-CD86, 항-CD25, 및 항-CD80 (BD 파르밍겐, 독일 하이델베르그); FITC-표지화 항-HLA-DR (BD 바이오사이언스, 독일 하이델베르그); 및 FITC-표지화 항-HLA 부류 I (케미콘 인터내셔날, 영국 햄프셔). 동형 대조는 IgG1-FITC (BD 파르밍겐) 및 IgG2a-FITC (케미콘 인터내셔날)이었다. E/L-셀렉틴 발현을 결정하기 위하여, FITC-표지화 항-인간 E-셀렉틴/CD62E mAb (클론 BBIG-E5)를 사용하였다 (R&D 시스템스 GmbH, 독일 비에스바덴-노르덴스타트). T 세포 표현형을 결정하기 위하여, ECD-표지화 항-CD45RA, PC7-표지화 항-CD8 (벡맨 코울터 GmbH, 독일 크레펠트) 및 FITC-표지화 항-CCR7 (R&D 시스템스 GmbH)를 사용하였다.

백혈구성분채집술 및 전혈액으로부터 인간 DC 생성: 필수적으로 문헌 [Berger et al. (2002) J.Immunol.Meth. 268: 131-140]에 기재된 바와 같이, 단핵구-유래 DC ("moDC")가 생성되었다. 간략하게, 림포프레프(Lymphoprep) (노르웨이 오슬로, 아식스-쉴드(Axis-Shield))를 사용하여 밀도 원심분리에 의해 백혈구성분채집술 산물 또는 건강한 기증자의 전혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조하였다. 정보에 근거하고 임상시험 심사위원회에 의해 승인된 동의에 따라 혈액 산물을 수득하였다. 1%의 열-불활성화 인간 혈장, 2mM L-글루타민 (바이오-위타커) 및 20 mg/l 겐타마이신 (시그마-알드리치 케미 GmbH, 독일 타우프키르켄)을 함유하는 RPMI 1640 (벨기에 베르비어스 캄브렉스)로 구성된 자가 배지에 PBMC를 재현탁시켰다. PBMC를 세포-팩토리 당 1.2×10⁹ 세포로 세포-팩토리 (덴마크 로스킬드 눈크(Nunc))로 옮기거나, 또는 더욱 작은 규모로 DC의 생성을 위해 30×10⁶ 세포/접시로 조직 배양 접시 (프랑스, 르 퐁 드 클레이스 팔콘(Falcon)(BD))로 옮겼다. 부착을 위하여 세포를 37 ℃에서 1 내지 2시간 동안 배양하였다. 200 ml (세포 팩토리) 또는 10 ml (접시)의 자가 배지를 부착성 세포에 첨가하면서, 비-부착성 분획을 제거하고 냉동보존하였다. 배지 및 사이토카인 (GM-CSF (미국 뉴저지 몬트빌 버렉스 류킨) 및 IL-4 (독일 함부르그 스트라트만)으로 세포를 공급하면서, 필수적으로 문헌 [Schaft et al (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097]에 앞서 기재된 바와 같이 DC의 성숙화를 수행하였다. 24시간의 성숙화 후에, 일렉트로포레이션을 위해 세포를 사용하였다.

쥐 BM-유래 DC 생성: GM-CSF에 의한 골수(BM)-DC의 생성은 필수적으로 문헌 [Lutz et al. (1999) J.Immunol.Meth. 223: 77-92]에 기재된 바와 같다. 세포 배양물 배지(R 10)는 RPMI-1640 (GIBCO BRL, 독일 에겐스테인), 페니실린 (100 U/ml; 독일 데이센호펜 시그마), 스트렙토마이신 (100 ㎍/ml, 시그마), L-글루타민 (2mM 시그마), 2-메르캅토에탄올 (50 μM, 시그마), 및 10% 열-불활성화 및 여과된 FCS (PAA로부터 FCS, 독일 콜베; 독일 에쉬본 밀리포어로부터 0.22㎛ 필터로 여과됨)으로 구성되었다. 0일에, 쥐 뒷다리로부터 얻어진 BM 백혈구를, 쥐 GM-CSF 유전자로 형질이입된 세포 쥐로부터의 10% GM-CSF 상층액을 함유하는 10 ml R10 배지에서 2×10⁶ 세포/접시로 접종하였다 [Zal et al. (1994) J.Exp.Med. 180: 2089-2099]. 3일 째에, 10% GM-CSF 상층액을 함유하는 다른 10 ml R 10 배지를 플레이트에 첨가하였다. 6일 째에, 배양 배양물의 반을 수집하고 원심분리하였으며, 세포 펠릿을 10% GM-CSF 상층액을 함유하는 10 ml 새로운 R 10 배지에 재현탁하고, 원래의 접시로 되돌렸다. 8일 째에서, 일렉트로포레이션을 위해 세포를 수집하였다.

시험관내 전사된 RNA의 생성: RNA의 시험관내 생성을 위하여, 2개의 플라스미드를 사용하였다: pGEM4Z64A-멜란A 플라스미드 (Heiser et al. (2000) J.Immunol.164: 5508-5514; Dr.I.Tcherepanova에 의해 제공됨, 흑색종 항원 멜란-A의 전체 길이 개방 판독 프레임을 함유함) 및 PSP73 SphA64+EL 플라스미드 (개방 판독 프레임에서 인간 E-셀렉틴의 세포외 도메인 및 인간 L-셀렉틴의 막통과 및 세포내 도메인을 함유함, Dr.C.Robert에 의해 제공됨). 제조업자의 지시에 따라서, 암비온 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA 키트 (미국 텍사스 오스틴)를 사용하여, 양쪽 플라스미드를 앞서 기재된 바와 같이 (Schaft et al (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097) 전사하였다.

가지 세포의 일렉트로포레이션: 세포-팩토리 또는 접시로부터 인간 및 쥐 DC를 수집하고, 순수한 RPMI 1640으로 한번 세척하고 PBS로 한번 세척하였다 (모두 실온). 4-6 × 10⁷ 세포/ml (인간) 또는 4-10 × 10⁷ 세포/ml (쥐)의 농도에서 세포를 페놀-레드를 갖지 않은 옵티멤 (기브코-BRL, 미국 롱 아일랜드)에서 재현탁하였다. 필수적으로 앞서 기재된 바와 같이 [Schaft et al. (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097], 발현 수준을 증가시키기 위한 시간 상수 및 RNA 농도의 변형과 함께, RNA를 진펄서 Xcell (독일 무니흐 바이오래드) 기계에 의해 DC 내로 일렉트로포레이트하였다.

특히, 인간 DC를 위한 최적의 일렉트로포레이션 조건은 옵티멤 배지에서 실온에서 4mm 큐벳 및 1 밀리초 네모파 펄스와 함께 500V 전하의 사용을 포함하는 것으로 결정되었다. RNA를 150 마이크로그램/밀리리터의 최종 농도로 사용하고, 일렉트로포레이션 이전에 3 분 동안 큐벳에서 세포와 함께 배양하였다. 쥐 DC를 위한 최적의 일렉트로포레이션 조건은 옵티멤 배지에서 실온에서 4mm 큐벳 및 2 밀리초 네모파 펄스와 함께 500V 전하의 사용을 포함하였다. 150 마이크로그램/밀리리터의 최종 농도에서 RNA를 사용하였으나, 일렉트로포레이션 이전에 큐벳에서 세포와 함께 미리 배양하지 않았다.

일렉트로포레이션 직후에, 세포를 상기 나타낸 농도의 GM-CSF 및 IL-4로 보충된 자가 배지 (인간 세포를 위해), 또는 10% GM-CSF- 함유 상층액으로 보충된 R10 배지 (쥐 세포를 위해; "BM-유래 DC 생성"의 제목으로 기재된 항목에서 상기 설명됨)로 옮겼다.

세포의 냉동보존: 필수적으로 앞서 기재된 바와 같이 냉동보존을 수행하였다 (예를 들어, [Feuerstein et al. (2000) J.Immunol.Meth. 245: 15-29] 참조). 간략하게, 세포를 20% 인간 혈청 알부민 (HSA, 파르마시아 앤드 업존)에 5 - 10 × 10⁶ 세포/ml (DC) 또는 20 - 50 × 10⁶ 세포/ml (비-부착성 세포)의 농도로 취하고, 얼음 위에서 10분 동안 저장하였다. 동일 부피의 냉동보존 배지를 세포 현탁액 (즉, 55% HSA (20%), 20% 디메틸 술폭시드 (DMSO) (시그마-알드리치)) 및 25% 글루코스 (글루코스터릴 40^TM, 독일 배드 홈버그 프레세니우스)에 첨가하였다. 세포를 -1 ℃/분 내지 -80 ℃에서 냉동-동결 용기 (날진, 덴마크 로스킬드)에서 동결하였다. 세포의 이탈이 눈에 보일 때까지 37 ℃에서 수 욕조에서 냉동관을 유지시킴으로써 해동을 수행하였다. 세포를 10 ml의 RPMI 1640 배지에 쏟아 붓고, 세척하고, 250 IU IL-4/ml 내지 800 IU GM-CSF/ml를 가진 예열된 자가 배지를 함유하는 세포 배양 접시에 첨가하였다. 세포를 1 내지 2 시간 동안 37 ℃배양기에서 추가의 실험 전까지 휴지시켰다.

유세포 분석법: 표면 염색을 위하여, DC를 세척하고 그 후에 100 ㎕의 냉 FACS 용액 (DPBS (바이오 위타커, 미국 메릴랜드 워커스빌), 0.1% 소듐 아지드 (시그마-알드리치) 및 0.2% HSA (독일 랑겐펠트 옥타파르마)를 가짐) 중에서 1×10⁵ 세포로 현탁하고, 단클론성 항체 또는 적절한 동형 대조와 함께 30분 동안 배양하였다. 세포를 2번 세척하고 100 ㎕의 냉 FACS 용액에 재현탁하였다. 염색된 세포를 FACS 스타 세포 분석기(벡톤-딕킨슨)로 면역형광에 대해 분석하였다. 전방 및 측방 산란기 위에서 게이트를 사용하여 분석으로부터 세포 파편을 제거하였다. 표면 염색 세포의 각각의 샘플에 대해 최소 10⁴개 세포를 분석하였다. 셀퀘스트 소프트웨어 (벡톤-딕킨슨)를 사용하여 결과를 분석하였다.

트랜스웰 이동 분석: 필수적으로 문헌 [Schaft et al. (2005) J.Immunol.174: 3087-3097]에 기재된 바와 같이, 5 ㎛의 공극 크기를 가진 트랜스웰 삽입물 (영국 런던 코스타) 및 CCL19 (100 ng/ml, 독일 오펜바흐 테부-바이오 GmbH)를 사용하여 트랜스웰 이동 분석을 수행하였다.

세포독성 T 세포(CTL) 유도 분석: RNA없이, E/L-셀렉틴 RNA 단독과 함께, 멜란A RNA 단독과 함께, 또는 멜란A와 E/L-셀렉틴 RNA의 조합과 함께, DC를 일렉트로포레이트하였다. 또한, 모의-일렉트로포레이트되고 E/L-셀렉틴 RNA-일렉트로포레이트된 DC를, 비교를 위하여 10 ㎍/ml의 멜란A-유래 HLA-A2 결합 유사체 펩티드 ELAGIGILTV와 함께, 37 ℃에서 1 시간 동안 펄스하였다. 제조업자의 지시에 따라서 MACS (밀테니 바이오테크, 독일 베르기시-글래드바흐)를 사용하여, 동일한 건강한 기증자로부터의 비-부착성 세포 분획을 CD8+ T-세포의 생성을 위한 근원으로서 사용하였다. CD8+ 세포를 10% 모아진 혈청(캠브렉스), 10mM Hepes, 1mM 소듐 피브레이트, 1% MEM 비-필수 아미노산(100x), 2mM L-글루타민, 20 mg/l 겐타마이신 및 20 U/ml의 IL-7로 보충된 RPMI에서 각각 1 × 10⁶ /ml 내지 1 × 10⁵/ml의 최종 농도로 상기 기재되고 상이하게 전처리된 DC와 함께 공동-배양하였다. 2일 및 4일에, 20 IU/ml의 IL2 및 20 U/ml의 IL7을 첨가하였다. 7일에 세포를 수집하고 분석하였다.

항원-특이성 CD8+ T-세포의 테트라머 염색 및 표현형: 문헌 [Schaft et al. (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097]에 기재된 바와 같이, 항-CCR7, 항-CD45RA 및 항-CD8 항체를 사용하여 HLA-A2-멜란A 테트라머-염색 (벡맨 코울터 GmbH) 및 T 세포 표현형을 수행하였다. 벡맨 코울터로부터의 사이토믹스(CYTOMICS) FC500 위에서 세포를 분석하였다.

세포독성 분석: 문헌 [Schaft et al. (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097]에 기재된 바와 같이 필수적으로 표준 4-h ⁵¹Cr 방출 분석에서 세포독성을 시험하였다.

E/L-셀렉틴-유도된 시험관내 이동 분석: 가지 세포를 E/L-셀렉틴 RNA와 함께 또는 RNA 없이 일렉트로포레이트하고, 1×10⁶ 세포/ml의 농도로 재현탁하였다. 직사각형 커버 슬립(24×60mm)을 시알릴-루이스^x 및 설페이트화 티로신 (렉티니티 홀딩스 인코포레이티드, 러시아 모스크바)에 결합된 5㎍ 비오티닐화 폴리아크릴아미드로 도포하고, 통풍 건조시켰다. 비-특이적 결합을 막기 위하여 모든 커버 슬립을 0.5% 소 혈청 알부민 (PBS 중)과 함께 적어도 30분 동안 배양하였다. 50 ㎛의 슬릿 깊이 및 500 ㎛의 슬릿 폭을 갖고 도포되거나 도포되지 않은 커버 슬립을 가진 투명한 유동 챔버를, 1ml 세포 현탁액을 함유하는 주사기에 연결하기 전에, 2mM CaCl₂로 보충된 행크스 균형 염 용액(HBSS)로 잠깐 헹구었다. 무-펄스 펌프를 사용하여 1.04 dyne/s²의 전단 속도에서 20 ℃에서 관류를 수행하였다. 관류 동안에, 현미경 상-대조 영상을 실제 시간에 기록하였다. 관류 10분 후에, 4개의 상이한 현미경 구역 (10 × 대물렌즈)을 기록하고, 각각의 구역에 대해 부착성 세포의 수를 세었다. 메타뷰 이미징 소프트웨어 (유니버셜 이미징 코포레이션, 미국 다우닝톤)를 사용하여 영상 분석을 오프-라인으로 수행하였다.

E/L-셀렉틴-유도된 생체내 이동: 쥐 DC를 E/L-셀렉텐 RNA와 함께 또는 RNA 없이 일렉트로포레이트하고, 제조업자의 지침에 따라서 5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트 (CMFDA) (몰리큘러 프로브, 미국 오레곤)로 염색하였다. 세포를 C57/B6 쥐의 꼬리 정맥에 주입하고; 16시간 후에 쥐를 희생시키고, 서혜부 림프절(LN), 비장 및 폐의 일부를 추출하고, 액체 질소에서 즉시 동결시켰다. 기관을 티슈-텍(Tissue-Tek) O.C.T. 화합물 (사쿠라, 미국 NL)에 끼워넣고 -80 ℃에서 저장하였다. 동결된 기관을 레이카 CM3050 S 초냉동박절기 (레이카, 독일 웨즐러)로 10 ㎛ 두께 단편으로 자르고, 슈퍼프로스트 플러스(SuperFrost Plus) 현미경 슬라이드 (독일 브라운쉬베이그 멘젤 GmbH)에서 -20 ℃에서 저장하였다.

면역형광 염색을 위하여, 동결된 단편을 해동하고 10분 동안 건조시켰다. 단편을 4% 파라포름알데히드 (머어크, 독일 다름스타트)로 20분 동안 고정시켰다. PBS로 세척하고 과다한 알데히드 기를 0.1M 글리신과 15분 동안 중화시킨 후에, 단편을 2% BSA (PAA, 독일 쿨베)의 차단 용액과 함께 15분 동안 배양하고, 2% BSA 용액에 1:200의 비율로 희석된 CD90.2 (Thy 1.2, BD 바이오사이언스, 독일 하이델베르그)에 대해 특이적인 항체로 염색하였다. 30분 후에, 세포를 2% BSA 중에서 1:1000으로 희석된 항-쥐 알렉사555-접합된 항체 (인비트로겐 GmbH, 독일 카알스루흐)와 함께 배양하였다. 30분의 배양 후에, 단편을 플루오로마운트 장착 배지에 묻어 두었다 (세르바 일렉트로포레시스 GmbH, 독일 하이델베르그). 레이카 DMRD 연구 현미경 (레이카, 독일 웨슬러)으로 형광 분석을 수행하였다.

실시예 1: 성숙한 인간 DC 내로 E/L- 셀렉틴 -코드화 RNA 의 일렉트로포레이션 은 높은 형질이입 효율 및 수율을 가져온다

상기 기재된 다양한 일렉트로포레이션 설정을 시험한 후에 달성된 최적화 일렉트로포레이션 프로토콜을 사용하여, 키메라 E/L-셀렉틴을 코드화하는 RNA를 DC 내로 일렉트로포레이트하였다. 일렉트로포레이션 후에 RNA-형질이입된 DC를 4시간동안 냉동보존하고, 해동하고 평가하였다. 도 1 (패널 a)에 나타낸 것과 같이, 이러한 DC는 E/L-셀렉틴의 높고 균질한 발현을 나타내었다. DC가 해동된 후 심지어 24시간 및 48시간 후에 고 발현이 관찰되었으며 (도 1a), 이것은 E/L-셀렉틴의 장기간 발현이 수득됨을 입증한다.

인간 환자에서 백신으로서 DC를 사용하기 위하여, DC가 제조 과정을 견디는 것이 중요하다. DC는 일렉트로포레이션 및 냉동보존 단계를 견디어야 하고, 주요 귀소 펩티드 및 항원을 발현하는 것으로부터 과도한 손상 (예, 독성 효과)을 나타내어서는 안된다. 따라서, 수율에 대해 DC를 평가하였다 (즉, 전체 과정에 이전의 세포의 수와 비교하여, 일렉트로포레이션 및 냉동보존 후에 생체 세포의 퍼센트). E/L-셀렉틴 RNA를 갖거나 RNA를 갖지 않고 일렉트로포레이트된 DC를 냉동보존한 다음 해동하였다. 트립판-블루에서 수를 셈으로써 수율을 결정하였다. 해동 후 0시 간에 세포를 평가하거나, 또는 37 ℃에서 IL-4 및 GM-CSF와 함께 자가 배지에서 배양하고, 해동 후 24시간 또는 48시간에서 평가하였다. 도 1 (패널 b)에 나타낸 것과 같이, 해동 직후의 DC의 생존은 약 80%였으며, 48 시간에 걸쳐 서서히 감소하였다. 대조 DC에서 유사한 결과가 수득되었으며, 이것은 E/L-셀렉틴 RNA의 도입이 DC에서 독성 효과를 갖지 않음을 나타내었다.

실시예 2: E/L- 셀렉틴 RNA 로 일렉트로포레이트 된 성숙한 인간 DC 는 정상 마커 표현형 및 CCR7 -매개 이동을 나타낸다.

최적의 성능을 위하여, DC 백신은 종양-관련 항원 ("TAA")을 제시할 수 있는 성숙한 DC의 가장 높은 빈도를 포함해야 한다. 따라서, 이들이 전체적 또는 부분적으로 성숙한 표현형을 보유하는지의 여부를 결정하기 위해 일렉트로포레이트된 DC를 평가하였다. CD80, CD83, CD86, CD25, HLA 부류 I 및 HLA-DR 분자의 표면 발현을 위하여, ELS RNA로 일렉트로포레이트되거나 모의-일렉트로포레이트된 DC를 평가하였다. 성숙한 표현형을 검출하였으며, 양쪽 DC 집단에서 차이점이 관찰되지 않았다; 결과를 도 2에 나타낸다.

최적의 성능을 위하여, DC는 CCR7-매개 이동 능력을 보유해야 하고, 이것은 피부로부터 림프절 내로 정상적인 DC 이동을 위해 중요하다. 또한, DC가 HEV 위에서 "회전" 되기 위해서는 기능적 CCR7 발현이 필요하다. 따라서, ELS RNA로 일렉트로포레이트되거나 모의-일렉트로포레이트된 DC를 비교하였다. 표준 트랜스웰 시험관내 이동 분석에서 표준 트랜스웰에서 이동 능력을 시험하였다 (예를 들어, 문헌 [Scandella et al. (2002) Blood 100: 1354-1361] 참조). 이러한 분석에서, DC 를 트랜스웰 시스템의 윗쪽 웰에 놓아 두고; 케모카인 CCL19를 윗쪽 웰 (즉, 세포에서와 동일한 웰) 또는 아래쪽 웰에 놓아두었다. 케모카인과 함께 윗쪽 웰에 놓여지지만 그 웰로부터 멀리 이동하는 세포는 케모카인에 "반대쪽으로" 이동된다고 언급되고, 그 반면에 케모카인과 상이한 웰에 놓여지지만 케모카인 쪽으로 이동하는 세포는 케모카인 "쪽으로" 이동한다고 언급된다. 세포를 2시간 동안 이동시킨 다음 평가하였다. CCL19 구배에 반대쪽으로 이동된 DC의 군, 가장 중요하게는 DC의 양쪽 집단의 어느 것도, CCL19 쪽으로 동일한 이동 능력을 나타내지 않았다 (도 3). 네가티브 대조로서, 세포를 CCL19 없이 트랜스웰에서 배양하였다.

상기 실험에 의해 예증된 바와 같이, DC의 몇몇 성질들은 성숙한 마커 표현형 및 CCR7-매개 이동 능력을 포함하여 DC의 표면 위에서 E/L-셀렉틴의 발현에 의해 영향을 받지 않는다.

실시예 3: E/L- 셀렉틴 RNA 로 일렉트로포레이트 된 DC 는 여전히 멜란 A-특이적 CTL 의 효율적인 유도인자이다 .

암에 대한 DC 백신의 최적의 성능을 위하여, DC는 TAA-특이적 CTL을 효율적으로 유도할 수 있어야 한다. 이를 시험하기 위하여, 흑색종-결합 항원(Ag) 멜란A를 선택하였다. 멜란A-특이적 T 세포가 비교적 빈번하고 지원자에서 항원에 노출된 적이 없는 표현형이기 때문에, 멜란A Ag는 이 분석을 위해 잘 작업한다. 이러한 T 세포는 강력한 DC가 사용된다면 심지어 한번의 자극 후에도 검출가능하게 확장될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Schaft et al. (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097]; [Pittet et al. (1999) J.Exp.Med. 190: 705-715]; [Romero et al. (2002) Immunol.Rev. 188: 81-96] 참조).

다양한 DC의 유도 능력을 분석하였다. 멜란 A 단독으로 부하된 DC의 유도 능력을 멜란A로 부하되고 E/L-셀렉틴 RNA로 일렉트로포레이트된 DC의 유도 능력과 비교하였다. 항원 부하는 천연 멜란A를 코드화하는 RNA의 공동-일렉트로포레이션에 의해 또는 멜란A 유래 HLA-A2 제한 유사체 펩티드로 펄스화함으로써 달성될 수 있고, 이것은 이러한 상황 하에서 천연 멜란A 펩티드에 비해 더 많은 자극을 제공한다 (예를 들어, 문헌 [Schaft et al. (2005) J.Immunol. 174: 3087-3097]; [Abdel-Wahab et al. (2003) Cell.Immunol. 224: 86-97] 참조).

자가 CD8+ T 세포와 함께 1주일 동안 일렉트로포레이트 DC를 공동-배양하고, HLA-A2/멜란A-테트라머 포지티브 T 세포의 퍼센트를 결정하였다. 테트라머-포지티브 T 세포를 그들의 CCR7 및 CD45RA 발현 (예를 들어, 문헌 [Sallusto et al. (1999) Nature 401: 708-712]: 항원에 노출된 적이 없는 T 세포, 중추 기억, 효과기 기억 및 용균 효과기에 의하여 4개 표현형의 하나로 분류하였다. 멜란A RNA 단독뿐만 아니라 멜란A RNA 및 E/L-셀렉틴 RNA의 조합으로 일렉트로포레이트된 DC는, 효과기 집단 쪽으로 강하게 편향되어 (도 4a) 멜란A-특이적 T 세포의 풀을 동일한 정도까지 확장시킬 수 있다. 모의-일렉트로포레이트되고 E/L-셀렉틴 RNA-일렉트로포레이트된 DC가 네가티브 대조로서 작용하였다. 멜란A 유사체 펩티드로 부하된 DC는 항원-특이적 T 세포를 더욱 강하게 자극하였으나, ELS RNA로 일렉트로포레이트된 DC와 모의-일렉트로포레이트된 DC 사이에서 자극 능력의 실질적인 차이는 관찰되지 않았다 (도 4a).

이러한 절차에 의해 발생된 T 세포를, 표적 세포로서 특정한 유사체 펩티드로 부하된 T2 세포를 사용하여 표준 Cr⁵¹-방출 분석에서 그들의 세포용해 능력에 대해 점검하였다. 멜란A 유사체 펩티드-부하된 DC로 자극된 T 세포는, DC가 ELS RNA로 일렉트로포레이트되든지 모의-일렉트로포레이트되든지 간에, 높은 세포용해를 나타내었다 (도 4, 패널 b). 또한, T 세포는 이들이 멜란A RNA 단독으로 일렉트로포레이트된 DC에 의해 자극되든지 또는 ELS RNA 및 멜란A RNA의 조합으로 일렉트로포레이트된 DC에 의해 자극되든지 간에, 유사한 용균 능력을 나타내었다 (도 4, 패널 b). T 세포는 ELS RNA로 일렉트로포레이트되거나 모의-일렉트로포레이트된 DC에 의해 자극될 때 세포용해를 나타내지 않았다 (도 4, 패널 b). 부적절한 펩티드로 부하된 T2 표적 세포의 배경 용해는 시험된 모든 T 세포 집단에 대해 10% 미만이었다 (데이타를 나타내지 않음).

요약하면, 이러한 데이터는, DC에 의한 E/L-셀렉틴의 공동 발현이 종양-관련 Ag를 제시함으로써 CTL을 유도하기 위한 DC의 기능 능력을 억제하지 않고, DC에 의한 멜란A의 공동발현이 E/L-셀렉틴의 막 발현을 억제하지 않음을 나타낸다.

실시예 4: E/L- 셀렉틴 RNA 로 일렉트로포레이트된 DC 는 시알릴 -루이스 ^X 에 결합함으로써 회전한다.

도입된 키메라 E/L-셀렉틴 단백질의 기능성은, 평행 판 유동 챔버에서 시알릴-루이스^X(SLX)로 도포된 슬라이드를 사용하여 시험관내 회전 분석으로 입증되었다. 분석에서의 전단력은 고 내피 세정맥 ("HEV")에서의 전단력과 비슷하였다 (예 를 들어, 1.04 dyne/s²). E/L-셀렉틴 RNA와 일렉트로포레이트된 DC는 낮은 회전 속도로 SLX-도포된 슬라이드 위에서 회전되는 반면, 모의-일렉트로포레이트된 DC는 SLK-도포된 슬라이드 상에서 회전되거나 고정되지 않았다. DC의 집단의 어느 것도 비도포 슬라이드에서 회전되거나 고정되지 않았다. 유동 10분 후에, 4개의 무작위 구역의 사진을 찍고, 세포의 수를 세었으며; 도 5에서 3명의 상이한 DC 기증자에 대해 이러한 데이터를 요약하고 p 값을 제공하며, 이것은 데이터의 통계적 유의성을 나타낸다 (학생의 T-시험). 모든 3명의 기증자로부터의 DC에 대해, RNA없이 일렉트로포레이트된 DC는 SLX-도포된 슬라이드 위에서 결코 고정되거나 회전하지 않았으며 (도 5 및 7), 그 반면 E/L-셀렉틴 RNA로 일렉트로포레이트된 DC는 고정되고 회전하는 것으로 관찰되었다 (도 5). E/L-셀렉틴이 쥐 DC 내에 도입되면 SLX-도포된 슬라이드 상에서 DC의 회전이 일어났다.

이러한 데이터들을 함께 취하면, 이러한 데이터는 E/L-셀렉틴 RNA로 형질이입된 DC가 시험관내 회전에 의해 증명되는 바와 같이 키메라 E/L-셀렉틴 단백질을서 기능적으로 발현한다는 것을 나타내었다.

실시예 5: E/L- 셀렉틴 RNA 로 일렉트로포레이트된 DC 는 혈액으로부터 효율적으로 분출되고 생체내에서 림프절에 이동된다.

도입된 E/L-셀렉틴의 생체내 기능성을 증명하기 위하여, 쥐 DC (C57/B6)을 E/L-셀렉틴 RNA로 일렉트로포레이트하고, CMFDA로 염색하고, C57/B6 쥐의 꼬리 정맥 내에 주입하였다. 14 내지 18시간 후에, 쥐를 희생시키고 비장 및 림프절의 냉 동단편을 만들었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, DC가 ELS RNA로 일렉트로포레이트되는지의 여부 또는 이들이 모의-일렉트로포레이트되는지의 여부에 따라 DC의 주사 후 비장에서 포지티브-염색 DC가 검출되었다. 그러나, 단지 ELS RNA로 일렉트로포레이트된 DC 만이 말초 림프절로 이동하고, 그 반면 모의-일렉트로포레이트된 DC는 그렇지 않았으며 (도 6), 이것은 E/L-셀렉틴을 발현하는 DC가 혈액으로부터 림프절로 이주하는 능력을 획득함을 입증한다.

전체로서, 이러한 데이터는, DC에 의한 E/L-셀렉틴의 기능 발현을 제공하기 위하여, 다시 말해서 정맥내 투여 후 혈액으로부터 림프절로 이동할 수 있는 DC를 제공하기 위하여, RNA 일렉트로포레이션이 사용될 수 있음을 나타낸다.

본 개시내용에 걸쳐서, 다양한 공보, 특허 및 공고된 특허 명세서들이 인용문헌으로서 여기에 언급된다. 본 발명의 속하는 기술분야의 상태를 더욱 충분히 설명하기 위하여, 각각의 언급된 공보, 특허 및 공고된 특허 명세서들이 본 개시내용에 대한 참고문헌으로 구체적으로 포함된다.

Claims (18)

1. 막 귀소 폴리펩티드를 코드화하는 RNA로 일시적 형질이입된 가지 세포를 포함하고, 상기 가지 세포가 상기 폴리펩티드에 대한 리간드로 도포된 표면 위에서 회전할 수 있는 것인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 막 귀소 폴리펩티드가 셀렉틴이고, 바람직하게는 상기 셀렉틴이 E-셀렉틴, L-셀렉틴, P-셀렉틴 또는 그의 키메라이고, 가장 바람직하게는 상기 셀렉틴이 E/L 셀렉틴 키메라인 조성물.
3. 제1항에 있어서,

   (i) 상기 가지 세포가 시알릴-루이스^x로 도포된 표면 위에서 회전하고/하거나;

   (ii) 상기 가지 세포가 성숙하고/하거나;

   (iii) 상기 가지 세포가 단핵구-유래 가지 세포이고/이거나;

   (iv) 상기 가지 세포가 인간 가지 세포이고/이거나;

   (v) 상기 가지 세포가 RNA 일렉트로포레이션에 의해 일시적 형질이입된 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 가지 세포가 관심 항원으로 추가로 부하된 것인 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 항원이 펄스화 및 형질이입으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의하여 가지 세포에 부하된 것인 조성물.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 항원이

   (i) 종양 관련 항원이거나; 또는

   (ii) 병원체-특이적 항원이고, 바람직하게는 상기 병원체가 HIV 또는 HCV인 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 백신.
8. 암의 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
9. 제8항에 있어서, 약제가 정맥내 투여에 적합한 것인 용도.
10. 100 볼트/mm 내지 15 볼트/mm의 자계 강도 및 0.8ms 내지 2ms의 네모파 펄스 길이에서, 성숙한 가지 세포를 RNA의 존재하에 일렉트로포레이트하는 것을 포함하 는, RNA로 가지 세포를 형질이입하는 방법.
11. a) 막 귀소 폴리펩티드를 코드화하는 RNA로 일시적 형질이입된 단리된 가지 세포를 제공하고;

    b) 가지 세포를 인간 피험자에게 정맥내 투여하는 단계를 포함하는,

    인간 피험자에서 림프절에 가지 세포를 전달하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 가지 세포가 항원-부하된 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 가지 세포가 원래 인간 피험자로부터 단리된 것인 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 막 귀소 폴리펩티드가 셀렉틴인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 셀렉틴이 E/L 셀렉틴 키메라인 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 단리된 가지 세포가 종양-관련 항원을 코드화하는 RNA로 일시적 형질이입된 것인 방법.
17. 제11항에 있어서, 상기 단리된 가지 세포가 병원체-특이적 항원을 코드화하 는 RNA로 일시적 형질이입된 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 병원체-특이적 항원이 HIV 또는 HCV로부터의 항원인 방법.

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