ES2288952T3 - Composiciones y metodos para producir celulas presentadoras de antigenos. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir células dendríticas inmaduras a partir de precursores de células dendríticas de monocitos in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto dichos precursores con una composición que comprende interleucina-15 y factor estimulador de colonia granulocito-macrófago durante aproximadamente entre 24 horas y 15 días.
Description
Composiciones y métodos para producir células
presentadoras de antígenos.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº 60/203.571, presentada
el 11 de mayo de 2000, que es una solicitud provisional utilizada
como base para la presentación de la US 2004/0022761 A1.
La presente invención se refiere a composiciones
y métodos para producir células presentadoras de antígenos, in
vitro, ex vivo o in vivo. Más particularmente, la
invención se refiere a métodos y composiciones para la producción
de células presentadoras de antígenos usando
interleucina-15 (IL-15), en
combinación con un Factor Estimulador de Colonia
Granulocito-Macrófago (GM-CSF, del
inglés "Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating
Factor"). Esta invención está dirigida particularmente a la
producción de células dendríticas procedentes de precursores de
monocitos in vitro o ex vivo. La invención también se
refiere a composiciones para implementar dichos métodos, así como a
composiciones que comprenden células presentadoras de antígenos, y a
usos de las mismas.
El sistema inmune comprende varias poblaciones
celulares, incluyendo células presentadoras de antígenos, que están
implicadas en la presentación de antígenos a células efectoras o
reguladoras, tales como macrófagos, linfocitos B y células
dendríticas. Las células dendríticas son potentes células
presentadoras de antígenos, implicadas en la inmunidad innata, y
capaces de inducir respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL)
específicas de antígeno. Por esta razón, las células dendríticas
han sido propuestas para su uso en la inmunoterapia de diversas
patologías, incluyendo tumores o enfermedades inmunes, a través de
la producción de dichas células in vitro, de la
sensibilización frente a un antígeno, y de la reinfusión en un
paciente. Asimismo, se han descubierto y aislado vesículas de
membrana derivadas de células dendríticas, que exhiben una actividad
inmunogénica muy potente (Solicitud Internacional Nº WO99/03499).
Los métodos actuales de producción de células dendríticas se basan
esencialmente en la diferenciación a partir de células precursoras
(esencialmente monocitos sanguíneos periféricos) mediante cultivo
en presencia de una combinación de una citoquina y un factor de
crecimiento, más específicamente interleucina-4 o
interleucina-13 en combinación con Factor
Estimulador de Colonia Granulocito-Macrófago
(GM-CSF). En la técnica existe la necesidad de
desarrollar métodos alternativos de producción, que produzcan
células dendríticas funcionales o células presentadoras de antígenos
funcionales para su uso en cualquier área terapéutica, diagnóstica,
profiláctica o de investigación.
En un aspecto, la presente invención es un
método para producir células dendríticas inmaduras a partir de
precursores de células dendríticas de monocitos in vitro o
ex vivo, que comprende poner en contacto dichos precursores
con una composición que comprende interleucina-15 y
factor estimulador de colonia granulocito-macrófago
durante aproximadamente de 24 horas a 15 días. Dichas células
dendríticas inmaduras se pueden sensibilizar frente a un antígeno.
Estas células dendríticas inmaduras se pueden administrar a un
paciente para modular una respuesta inmune en el paciente. La
invención también incluye una composición que comprende células
dendríticas inmaduras producidas de acuerdo con este método.
En otro aspecto, la invención es un método para
producir células dendríticas maduras a partir de precursores
celulares in vitro o ex vivo, que comprende poner en
contacto los precursores de células dendríticas con una composición
que comprende interleucina-15 y factor estimulador
de colonia granulocito-macrófago durante
aproximadamente de 24 horas a 15 días, para formar células
dendríticas inmaduras y cultivar las células dendríticas inmaduras
en presencia de un agente de maduración y en las condiciones
necesarias para promover la maduración de las células dendríticas
inmaduras y que formen células dendríticas maduras. En una
realización, las células dendríticas inmaduras son sensibilizadas
frente a un antígeno antes, durante o después de la maduración. Los
ejemplos de agentes de maduración para su uso in vitro
incluyen lipopolisacáridos, CD40L, y poli(I):(C). Estas
células dendríticas maduras se pueden administrar a un paciente
para modular una respuesta inmune en el paciente. La invención
también incluye una composición que comprende células dendríticas
maduras producidas de acuerdo con este método.
En otro aspecto, la invención es un método para
producir vesículas de membrana aisladas in vitro o ex
vivo que comprende poner en contacto precursores de células
dendríticas de monocitos con una composición que comprende
interleucina-15 y factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago durante aproximadamente de 24
horas a 15 días para formar células dendríticas inmaduras, cultivar
las células dendríticas inmaduras en presencia de al menos un
factor de estimulación para promover la liberación de vesículas de
membrana; y aislar las vesículas de membrana. En una realización,
las células dendríticas inmaduras son sensibilizadas frente a un
antígeno antes o después de la liberación de la vesícula de
membrana. Los ejemplos de factores de estimulación incluyen una
citoquina adecuada, irradiación y pH bajo. Estas vesículas de
membrana se pueden administrar a un paciente para modular una
respuesta inmune en el paciente. La invención también incluye una
composición que comprende vesículas de membrana producidas de
acuerdo con este método.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso
de células o vesículas que pueden obtenerse mediante dicho método
para la preparación de una composición farmacéutica para modular una
respuesta inmune en un paciente.
En otro aspecto, la invención es un método para
producir linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno in
vitro o ex vivo, que comprende proporcionar células
dendríticas sensibilizadas a un antígeno preparadas poniendo en
contacto precursores de las mismas con
interleucina-15 y factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago durante aproximadamente de 24
horas a 15 días, y sensibilizando posteriormente las células
dendríticas frente a un antígeno, y poniendo en contacto las
células dendríticas sensibilizadas a un antígeno con una población
de células que comprende linfocitos T para formar linfocitos T
citotóxicos específicos de antígeno activados. Dichos linfocitos T
citotóxicos específicos de antígeno se pueden administrar a un
paciente para modular una respuesta inmune en el pacien-
te.
te.
En otro aspecto, la invención es un método para
producir linfocitos T CD4+ específicos de antígeno in vitro
o ex vivo, que comprende proporcionar células dendríticas
sensibilizadas a un antígeno preparadas poniendo en contacto
precursores de las mismas con interleucina-15 y
factor estimulador de colonia granulocito-macrófago
durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, y sensibilizando
posteriormente las células dendríticas frente a un antígeno y
poniendo en contacto las células dendríticas sensibilizadas a un
antígeno con una población de células que comprende linfocitos T
para formar linfocitos T CD4+ específicos de antígeno activados.
Dichos linfocitos T CD4+ específicos de antígeno se pueden
administrar a un paciente para modular una respuesta inmune en el
paciente.
La interleucina-15 útil en los
métodos y composiciones de la presente invención se selecciona
preferiblemente a partir del grupo que consiste en
interleucina-15 aislada, un polipéptido de
interleucina-15 recombinante, un ácido nucleico, ya
sea natural o diseñado artificialmente codificando
interleucina-15 en un vector de expresión adecuado,
y una población de células que expresa un ácido nucleico que
codifica interleucina-15. El factor de crecimiento
útil en los métodos y composiciones de la presente invención es
factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago. El factor de maduración útil
en la presente invención se selecciona preferiblemente a partir del
grupo que consiste en lipopolisacáridos, CD40L y
poli(I):(C).
Las Figuras 1A y 1B muestran el desarrollo de
células dendríticas (DCs) en presencia de GM-CSF y
de IL-15
(GM-CSF+IL-15). Se cultivó células
CD14+ enriquecidas en presencia de GM-CSF y de
IL-15 durante más de seis días. La Figura 1A
muestra células no adherentes recogidas y analizadas para determinar
la presencia de CD1a, CD14, y HLA-DR mediante FACS
Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.). La Figura 1 B
muestra monocitos cultivados en GM-CSF y en
IL-15 analizados con una metodología cinética
respecto del tiempo mediante FACS Calibur.
Las Figuras 2A y 2B muestran la maduración de
DCs derivadas de GM-CSF+IL-15 con
lipopolisacáridos (LPS). La Figura 2A muestra los resultados
obtenidos al 5º día cuando se activó una parte de las DCs derivadas
de GM-CSF+IL-15 con LPS (100 ng/mL)
y se analizaron para determinar la presencia de
HLA-ABC, CD40, CD80, CD83 y CD86. La Figura 2B
muestra los resultados de estudios de captación de
FITC-Dextrano. Se incubaron DCs activadas (línea
punteada) y no activadas (línea continua) con 100 \mug/mL de
FITC-Dextrano durante 30 minutos a 37ºC. Del mismo
modo, se incubaron DCs de control en hielo durante 30 minutos.
Seguidamente, las DCs fueron lavadas tres veces con PBS y se
analizó la captación de FITC-Dextrano mediante FACS
Calibur.
La Figura 3A muestra la expresión parcial de
Langerina (marcador de células de Langerhans, un tipo especial de
células dendríticas) y de CCR6 (receptor de quemocina 6) en DCs
derivadas de GM-CSF+IL-15. La Figura
3B muestra DCs inducidas por
GM-CSF+IL-15 que expresan niveles
superiores de Langerina cuando se comparan con DCs inducidas por
GM-CFS+IL-4/TGF\beta. Como
representante de tres experimentos, la Figura 3C muestra el hecho
de que la generación de DCs de tipo célula de Langerhans con
GM-CSF y con IL-15 es independiente
de TGF\beta-1. Se cultivaron monocitos durante 6
días con las citoquinas mostradas encima de los histogramas con 300
ng/mL diarios o sin anticuerpo
anti-TGF\beta-1, y se tiñeron como
se indica. La Figura 3D muestra el hecho de que las células
inducidas por GM-CSF+IL-15, pero no
así las células inducidas por
GM-CSF+IL-4, presentan el fenotipo
de las células de Langerhans.
Las Figuras 4A, 4B y 4C muestran la capacidad
aloestimuladora de las DCs derivadas de
GM-CSF+IL-15. Las DCs activadas con
poli (I):(C) o las DCs no activadas fueron cultivadas como se
describe en la presente memoria, y fueron cultivadas conjuntamente
con células T (1 x 10^{5}) alogénicas CD4^{+} (Figura 4A) o
CD8^{+} durante 5 días (Figura 4B). Se añadieron pulsos de
timidina a los cultivos durante 16 horas. La Figura 4C muestra una
comparación de DCs cultivadas en
GM-CSF+IL-15, en
GM-CSF+IL-4, en
GM-CSF+IL-4+TGF\beta-1,
o sólo en GM-CSF en un MLR alogénico.
Las Figuras 5A y 5B muestran la presentación de
TT (toxoide del tétanos) o de cuerpos celulares moribundas mediante
DCs derivadas de GM-CSF+IL-15. Las
DCs se cultivaron como se describe en la presente memoria. Las DCs
derivadas de GM-CSF+IL-15 y las DCs
derivadas de GM-CSF+IL-4 fueron
tratadas con TT (Figura 5A) o con cuerpos celulares moribundos de
Me 275 (Figura 5B) a 37ºC durante 2 horas. Las DCs fueron lavadas y
cultivadas con 1 x 10^{5} células T CD4^{+} naïve durante 5
días. Los cultivos celulares fueron sometidos a pulsos de timidina
durante las últimas 16 horas y se midió la incorporación de
radionucleótidos mediante espectroscopía de centelleo \beta.
La Figura 6 muestra DCs de
GM-CSF+IL-15 que inducen un modelo
de citoquina distintivo en células T CD4+ alogénicas "naive".
Se cultivaron DCs derivadas de
GM-CSF+IL-15 (5 x 10^{3}) junto
con células T CD4^{+} (1 x 10^{5}) durante 5 días. Se
recogieron los sobrenadantes y las células fueron estimuladas con
fitohemaglutinina (PHA) durante 24 horas. Se recogieron los
sobrenadantes y se determinó la presencia de citoquinas usando kits
ELISA. Cada punto representa un experimento independiente. Los
histogramas representan las medias de todos los experimentos.
Las Figuras 7A y 7B muestran el hecho de que las
DCs derivadas de GM-CSF+IL-15
inducen respuestas inmunes de recuerdo frente a antígenos víricos.
Se activaron HLA-A201+DCs con una mezcla de
citoquinas de macrófago
(GM-CSF/IL-1/TNF-\alpha/IL-6)
o con CD40L y se sometieron a pulsos durante 16 horas con péptido de
matriz de gripe (Flu-MP). A continuación fueron
recogidas y usadas como células estimuladoras de células T CD8^{+}
autólogas. Las células T CD8^{+} efectoras específicas de
antígeno Flu-MP fueron expandidas durante 14 días
con re-estimulación con DCs cargadas de péptidos
después de la primera semana de cultivo. Se recogieron las células
efectoras y se determinó su capacidad para matar células T2
(HLA-A201+hibridoma deficiente en TAP), sin pulsos
(control negativo) o con pulsos de péptido Flu-MP en
un ensayo de liberación de cromo estándar. La lisis específica se
determinó para las relaciones E:T 1:1; 1:2,5; 1:5; 1:1,75 y 1:30
(Figura 7A). Se recogieron las células efectoras y se determinó el
número de células secretoras de IFN-\gamma por
100.000 efectores. Los datos representan el número de células
IFN\gamma^{+} que responden a células T2 sometidas a pulsos de
péptido Flu-MP (Figura 7B).
La Figura 8 muestra la falta de proliferación de
células obtenidas mediante el cultivo de monocitos purificados
mediante el protocolo de agotamiento negativo en presencia
únicamente de IL-15 y únicamente de
IL-4, y la proliferación de células obtenidas
cultivando células obtenidas mediante el protocolo adherente en
presencia únicamente de IL-15 y únicamente de
IL-4. Posteriormente, las células fueron cultivadas
en una placa de 96 pocillos durante otras 10 horas en presencia de
^{3}H-timidina. Entonces se midió la captación de
timidina mediante un contador beta.
Las Figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E y 9F muestran
estudios cinéticos con respecto al tiempo que indican que las
células obtenidas mediante el cultivo de monocitos purificados en
presencia de IL-15 no son células dendríticas
inmaduras. Los monocitos purificados mediante agotamiento negativo
se cultivaron en placas de 6 pocillos en presencia de
IL-15. Al segundo día (Figuras 9A y 9B), al cuarto
día (Figuras 9C y 9D) y al sexto día (Figuras 9E y 9F), se extrajo
una alícuota de células y se tiñeron con
anti-HLA-DR,
anti-CD1a, anti-CD14,
anti-CD80, anti-CD83 y
anti-CD86, y se analizaron mediante citometría de
flujo.
Las Figuras 10A y 10B muestran que la
IL-15 en combinación con GM-CSF
puede inducir monocitos a partir de sangre de pacientes con
melanoma en estadio IV para diferenciarse en células dendríticas en
las condiciones aprobadas para uso clínico de células generadas, es
decir, en un medio X-VIVO complementado con suero
autólogo al 10%. Las células dendríticas inducidas se pueden
activar/inducir hasta madurez mediante una mezcla de citoquinas de
macrófago
(GM-CSF/IL-1/TNF-\alpha/IL-6),
las cuales están todas aprobadas para la generación de células
destinadas a ser inyectadas a pacientes.
La presente invención describe composiciones y
métodos de producción de células dendríticas inmaduras y de células
dendríticas maduras, más preferiblemente células dendríticas
presentadoras de antígenos, incluso más preferiblemente de origen
humano, usando interleucina-15
(IL-15) en combinación con GM-CSF
durante aproximadamente de 24 horas a 15 días, para provocar o
estimular la diferenciación o la producción de células dendríticas
completamente funcionales o de células dendríticas inmaduras, a
partir de precursores de las mismas in vitro o ex
vivo.
Tal como se demuestra en la presente memoria, la
combinación de IL-15 y GM-CSF es
capaz de provocar, inducir o estimular la diferenciación de
monocitos y de transformar precursores de DC en células dendríticas
("DCs"). Células CD14^{+} sanguíneas adherentes enriquecidas
cultivadas durante seis días con GM-CSF y con
IL-15 se diferenciaron en DCs
CD1a^{+}HLA-DR^{+}CD14^{-} típicamente
inmaduras. Al contrario que los cultivos hechos con
GM-CSF+IL-4, del 5 al 10% de las DCs
derivadas de GM-CSF+IL-15 (DCs
IL-15) expresan marcadores específicos de células
de Langerhans (por ejemplo, LAG-Langerina y CCR6).
Las células de Langerhans (LCs) de la piel y de otros epitelios
mucosales representan una subcategoría de DCs inmaduras que migran
al nodo linfático drenante tras la captura de antígenos procedentes
de patógenos invasores. Si se desea, dicha subcategoría de LCs
puede eliminarse de la composición mediante agotamiento.
Los resultados presentados en la presente
memoria describen también que las DCs inmaduras obtenidas usando
IL-15 en combinación con GM-CSF
capturan de forma eficaz antígenos solubles y en partículas, tal
como se demuestra usando FITC-Dextrano y cuerpos
celulares moribundos. Además, agentes tales como LPS,
TNF-\alpha y CD40L disminuyen la capacidad de
captura de antígenos de las DCs IL-15, y promueven
su maduración (CD83^{+} DC-LAMP^{+}). Estas DCs
también son capaces de inducir la proliferación de células T
CD4^{+} y CD8^{+} alogénicas y son capaces de procesar o de
presentar antígenos solubles (TT) y en partícula (cuerpos celulares
moribundos) a linfocitos T autólogos. Adicionalmente, las DCs
maduras, cargadas con péptido Flu-MP, son capaces de
inducir la expresión de células T CD8^{+} productoras de
INF\gamma y de CTLs específicas de péptido. Las células T CD4+
cultivadas en presencia de estas DCs producen niveles elevados de
IFN\gamma, bajos de IL-10 y nada de
IL-4, lo que indica una desactivación de tipo
Th_{1}. Considerados en conjunto, estos resultados demuestran por
tanto un nuevo papel para la IL-15 en la generación
de DCs, particularmente de LCs.
La interleucina-15
(IL-15) es una citoquina conocida, cuyo aislamiento,
clonación y secuencia fueron publicados por Grabstein y col.
(Patente de EE.UU. Nº 5.747.024; y Grabstein y col., 1994,
Science 246: 965-968) y se presenta en la
SEQ ID NO: 1 (la secuencia de aminoácidos se presenta en la SEQ ID
NO: 2). La IL-15 usa la cadena
IL-2R\gamma común a IL-2,
IL-4, IL-7, IL-9 e
IL-13, y en la técnica se han descrito varias
propiedades de la IL-15, tales como un potente
efecto adyuvante cuando se administra en combinación con un antígeno
de vacuna tal como se describe en la Patente de EE.UU. Nº
5.747.024. En el contexto de la presente invención, la
IL-15 se refiere al polipéptido, o al
correspondiente ácido nucleico, tal como se describe en la SEQ ID
NO: 1, así como a cualquier variante del mismo, incluyendo cualquier
derivado u homólogo natural aislado a partir de diversas especies
de mamíferos. De forma más general, las variantes abarcan cualquier
polipéptido que tenga una o varias modificaciones de aminoácidos en
comparación con la SEQ ID NO: 1, incluyendo mutación(es),
eliminación(es), inserción(es),
sustitución(es), solas o en diversas combinaciones. Más
particularmente, las variantes usadas en la presente memoria son
cualquier polipéptido que tenga la propiedad de estimular o de
inducir la producción de células dendríticas a partir de monocitos
tal como se describe en la presente memoria, codificado por una
secuencia de ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones
convencionales de severidad moderada, con la secuencia de ácido
nucleico descrita en la SEQ ID NO: 1. También preferiblemente, la
IL-15 tiene una identidad de al menos el 80% con la
secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2.
Más preferiblemente, la IL-15 es
una IL-15 recombinante, es decir, producida mediante
expresión, en cualquier célula hospedante adecuada, de una molécula
de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. Las células
hospedantes adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mamífero,
células procarióticas o células de levadura. A este respecto, la
IL-15 humana recombinante se encuentra disponible
comercialmente a partir de diferentes suministradores, que incluyen
R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, EE.UU.). Una
IL-15 preferida para su uso en la presente
invención es una IL-15 humana, incluso más
preferiblemente una IL-15 humana recombinante. Para
su uso en la presente invención, aunque se prefieren las
preparaciones de IL-15 esencialmente puras, debe
entenderse que puede usarse cualquier preparación de
IL-15, en combinación con otros factores,
diluyentes, adyuvantes, fluidos biológicos, etc. Además, aunque el
proceso utiliza preferiblemente un polipéptido de
IL-15, la invención también incluye el uso de
cualquier molécula de ácido nucleico que codifique
IL-15. En concreto, las células precursoras pueden
ponerse en contacto directamente con un ácido nucleico que codifica
IL-15 incorporado en un vector de expresión
adecuado, o con una población de células que contiene una molécula
de ácido nucleico que codifica IL-15 y que expresa
IL-15. Dichas células pueden producir adicionalmente
un factor de crecimiento tal como el GM-CSF.
Para llevar a cabo la presente invención, los
precursores de DC se ponen en contacto o se tratan con
IL-15 y con GM-CSF, in vitro
o ex vivo. Los precursores de DC incluyen cualquier célula o
población de células que es capaz de diferenciarse en células
dendríticas in vitro o ex vivo, cuando son tratadas de
acuerdo con la presente invención. Los precursores de DC típicos
incluyen monocitos y precursores de DC en circulación. Para los
usos in vitro o ex vivo, los precursores de DC pueden
obtenerse a partir de varios materiales biológicos, incluyendo
sangre y médula ósea, preferiblemente sangre. Normalmente los
precursores de DC comprenden células mononucleares sanguíneas
periféricas (PBMC) o monocitos sanguíneos periféricos aislados a
partir de ellas. Las PBMC se pueden preparar mediante aféresis
convencional, y los monocitos se pueden aislar mediante gradiente
de Ficoll, opcionalmente acoplado a agotamiento de las células T,
las células B y/o las células NK. Los ejemplos de métodos de
aislamiento de precursores de DC útiles en la presente invención han
sido publicados por Inaba y col. (Inaba y col., 1992, J Exp
Med 175: 1157) y por Romani y col. (Romani y col., 1994, J
Exp Med 180: 83).
Para las aplicaciones in vitro y ex
vivo, los precursores de DC se pueden poner en contacto con
IL-15 y con GM-CSF, en cualquier
dispositivo apropiado, tal como una placa, un pocillo, un matraz, un
tubo, etc., y preferiblemente en condiciones estériles. Normalmente
se usan entre 1 x 10^{4} y 1 x 10^{8} células, más
preferiblemente entre 1 x 10^{5} y 1 x 10^{7} células,
dependiendo de la cantidad de precursores de DC disponibles o
recogidos. La cantidad de citoquina y/o de GM-CSF
puede ser ajustada por el especialista en la técnica. Normalmente,
la IL-15 se usa en una concentración entre
aproximadamente 50 ng/mL y aproximadamente 500 ng/mL, y más
preferiblemente entre aproximadamente 100 ng/mL y aproximadamente
300 ng/mL. El GM-CSF se puede emplear en una
concentración entre aproximadamente 10 ng/mL y aproximadamente 300
ng/mL, y más preferiblemente entre aproximadamente 50 ng/mL y
aproximadamente 200 ng/mL. Las células se ponen en contacto in
vitro con los anteriores reactivos durante aproximadamente de
24 horas a 15 días. Habitualmente, se producen DCs inmaduras y son
recogidas entre el tercer y el séptimo Día tras la estimulación de
los precursores de DC, preferiblemente entre el cuarto y sexto Día
después del tratamiento. Normalmente, 1 x 10^{6} células
precursoras de DC (por ejemplo, monocitos) dan lugar a
aproximadamente 1 x 10^{3} DCs inmaduras. Las DCs inmaduras
obtenidas se caracterizan particularmente por la expresión de CD1a
y HLA-DR, por la ausencia de CD14, y por niveles
mínimos o nulos de expresión de DC-LAMP
(glicoproteína de membrana asociada a lisosoma de DC), de CD40, de
CD80 y de CD83.
Las DCs inmaduras pueden recolectarse y
mantenerse en cualquier medio de cultivo adecuado, tal como RPMI
(GIBCO BRL, Grand Island, NY, EE.UU.), X-VIVO 15
(Bio Whittaker, Inc., Walkersville, MD, EE.UU.), AIMV (GIBCO BRL,
Grand Island, NY, EE.UU.) y DMEM (GIBCO BRL, Grand Island, NY,
EE.UU.), etc. Las células se pueden almacenar o congelar en
condiciones convencionales. Se puede determinar la calidad, la
pureza y la ausencia de contaminación usando métodos convencionales
conocidos en la técnica, tal como el marcado con anticuerpos, el
marcado con colorante, etc.
Un aspecto preferido de esta invención reside en
la inducción o estimulación de la diferenciación de células
dendríticas a partir de precursores de monocitos de las mismas, que
comprende poner en contacto los precursores con una combinación de
IL-15 y GM-CSF, in vitro o
ex vivo. En una realización específica de esta invención, se
producen células dendríticas inmaduras o células dendríticas
activadas a partir de precursores de células dendríticas de
monocitos poniendo en contacto los precursores con una combinación
de IL-15 y GM-CSF, in vitro
o ex vivo.
Las DCs inmaduras tienen utilidad en muchas
aplicaciones, incluyendo diagnosis, terapia, vacunación,
investigación, escrutinio, administración de genes, etc. En
concreto, debido a sus potentes propiedades inmunogénicas, las DCs
pueden sensibilizarse frente a un antígeno y usarse para modular una
reacción o respuesta inmune in vivo, por ejemplo para
inducir tolerancia específica de antígeno. Tal como se usa en la
presente memoria, la modulación de la respuesta inmune mediante DCs
incluye incrementos, disminuciones o cambios de otros tipos de
respuestas inmunes.
Las DCs activadas tienen utilidad en muchas
aplicaciones, incluyendo diagnosis, terapia, vacunación,
investigación, escrutinio, administración de genes, etc. En
concreto, debido a sus potentes propiedades inmunogénicas, las DCs
pueden sensibilizarse frente a un antígeno y usarse para provocar,
inducir o estimular una reacción o respuesta inmune in vivo.
También pueden usarse para producir, escrutar o expandir, in
vitro o ex vivo, linfocitos T citotóxicos (CTL)
específicos de antígeno.
A este respecto, las DCs pueden sensibilizarse
frente a uno o varios antígenos de acuerdo con los diversos
procedimientos conocidos en la técnica, tal como poniendo las DCs en
contacto con un antígeno ("pulso de antígeno"), con un péptido
de antígeno ("pulso de péptido"), con un complejo proteico
antigénico, con células o con membranas celulares que expresan
antígenos o péptidos antigénicos, con texosomas, con liposomas que
contienen antígenos o péptidos de antígenos, con ácidos nucleicos
que codifican antígenos o péptidos antigénicos (posiblemente
incorporados en vectores de plásmidos o víricos), o con ARNs totales
de células tumorales. Estos métodos se han descrito, por ejemplo,
en la Solicitud Internacional Nº WO99/03499. Los antígenos pueden
ser antígenos tumorales, antígenos víricos, antígenos bacterianos,
etc., de forma más general, cualquier péptido o polipéptido contra
el que se busca una reapuesta o reacción inmune. El término
"sensibilizado" indica que el antígeno, o una porción del
mismo, es expuesto a la superficie de las DCs, preferiblemente
formando un complejo con moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC, del inglés "major histocompatibility
complex").
También se pueden usar células dendríticas
inmaduras para producir vesículas de membrana (también denominadas
dexosomas), tal como se describe en el documento WO99/03499, antes o
después de la sensibilización a antígeno. A este respecto, un
objetivo concreto de esta invención se refiere a un método para
producir vesículas de membrana, que comprende (1) proporcionar
células dendríticas inmaduras poniendo en contacto precursores de
monocito de las mismas con IL-15 y
GM-CSF, (2) cultivar las células dendríticas en
condiciones que permitan la liberación de vesículas de membrana, y
(3) aislar las vesículas de membrana. Incluso más preferiblemente,
el método comprende, antes de la Etapa (2), una sensibilización de
las DCs frente a uno o varios antígenos. En la Etapa (1), los
precursores de DC se ponen en contacto con una combinación de
IL-15 y GM-CSF, tal como se
describe en la presente memoria. En la Etapa (2), las DCs se pueden
cultivar en cualquier medio convencional, preferiblemente en
presencia de un compuesto y/o tratamiento y/o entorno estimulante,
para aumentar la liberación de vesículas de membrana. Las
condiciones estimulantes preferidas incluyen el cultivo en presencia
de citoquina(s), más preferiblemente IL-10,
interferón gamma (IFN-\gamma) o
IL-12, irradiación y/o pH bajo (por ejemplo, pH =
5), tal como se describe en WO99/03499. Las vesículas de membrana (o
dexosomas) se pueden recuperar, por ejemplo, mediante
centrifugación y/o métodos
cromatográficos.
cromatográficos.
Tal como se ha indicado antes, estas vesículas
de membrana o células dendríticas se pueden usar para la preparación
de una composición farmacéutica para modular una respuesta inmune
en un paciente, en particular en un mamífero, más preferiblemente
en un humano. A este respecto, la composición farmacéutica se
destina para la administración al paciente de una cantidad eficaz
de células dendríticas preparadas en presencia de
IL-15 y de GM-CSF, o de vesículas
de membrana derivadas de las mismas. Incluso más preferiblemente,
las células dendríticas y/o las vesículas de membrana son
sensibilizadas frente a uno o a varios antígenos. En una realización
específica, las DCs se han preparado a partir de precursores
sanguíneos, se han cultivado en presencia de IL-15 y
de GM-CSF.
Las DCs preparadas de acuerdo con los anteriores
métodos pueden además ser activadas o cultivadas in vitro o
ex vivo en condiciones que permitan su maduración. A este
respecto, un objetivo de la presente invención reside en un método
para producir DCs maduras, que comprende (1) preparar células
dendríticas inmaduras poniendo en contacto precursores de monocitos
de las mismas con IL-15 en presencia de
GM-CSF durante aproximadamente de 24 horas a 15
días, y (2) cultivar las células dendríticas en las condiciones que
permitan su maduración, preferiblemente en presencia de
lipopolisacáridos (LPS), CD40L o poli (I):(C). Las DCs maduras
muestran una elevada expresión de CD80, CD83 y CD86. Las DCs
maduras pueden sensibilizarse frente a antígenos, tanto antes como
durante o después de la maduración.
Otro objetivo de la presente invención reside en
un método de producción de CTL específico de antígeno in
vivo o ex vivo, que comprende poner en contacto células
dendríticas sensibilizadas frente a antígeno tal como se ha
descrito antes con una población de células que comprenden
linfocitos T, y recuperar los CTLs activados que son específicos
del antígeno. La población que comprende linfocitos T puede estar
constituida por linfocitos T CD8+ aislados o por células
mononucleares sanguíneas periféricas. Los CTLs activados se pueden
recuperar y seleccionar midiendo la proliferación clonal, mediante
lisis celular dirigida y/o mediante liberación e citoquinas, tal
como se describe en los ejemplos proporcionados en la presente
memoria. Los CTLs específicos de antígeno pueden expandirse
mediante cultivo en presencia de DCs sensibilizadas a antígeno. Este
método también es aplicable a la producción de linfocitos T CD4+
activados. Además, el método también puede llevarse a cabo in
vivo, para activar o para aumentar una respuesta de CTL o una
respuesta de CD4+ frente a un antígeno in vivo.
La invención también incluye composiciones de
materia que comprenden células dendríticas inmaduras para la
preparación de una composición farmacéutica para modular vesículas
de membrana derivadas de las mismas, obtenibles como se ha descrito
anteriormente. En concreto, la invención se refiere a composiciones
que comprenden células dendríticas inmaduras obtenidas poniendo en
contacto in vitro o ex vivo precursores de monocitos
de las mismas en presencia de IL-15 y de
GM-CSF durante aproximadamente de 24 horas a 15
días, más particularmente células dendríticas inmaduras humanas.
Dichas células dendríticas pueden sensibilizarse frente a uno o a
varios antígenos, tal como se ha descrito antes.
La invención también se refiere a composiciones
que comprenden vesículas de membrana obtenidas a partir de células
dendríticas obtenidas poniendo en contacto in vitro o ex
vivo precursores de las mismas en presencia de
IL-15 y de GM-CSF. Las composiciones
pueden comprender cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable, por ejemplo, un tampón, una disolución salina y
adyuvantes. Se pueden usar para inducir o estimular una respuesta o
una reacción inmune in vivo, por ejemplo, para tratar a un
paciente con un tumor o una enfermedad inmune tal como alergia,
asma, y/o enfermedades autoinmunes. Son especialmente adecuadas para
tratar el cáncer en un paciente.
Otra realización específica de esta invención
reside en un método para producir células dendríticas maduras a
partir de precursores de monocitos de células dendríticas, que
comprende poner en contacto dichos precursores con
IL-15 y con GM-CSF como se describe
en la presente memoria in vitro o ex vivo, y cultivar
las células dendríticas inmaduras obtenidas de ese modo en
presencia de un agente de maduración y en las condiciones necesarias
para promover la maduración de dichas células dendríticas inmaduras
para formar células dendríticas maduras. La invención también
inclu-
ye composiciones de materia que comprenden células dendríticas maduras producidas de acuerdo con dicho método.
ye composiciones de materia que comprenden células dendríticas maduras producidas de acuerdo con dicho método.
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) usados en
este estudio fueron: CD14, HLA-DR (Becton Dickinson,
Franklin Lakes, NJ, EE.UU.); CD86, (PharMingen, San Diego, CA,
EE.UU.); CD40, HLA-AB, CCR6 (R&D Systems, Inc.,
Minneapolis, MN, EE.UU.), CD1a (Dako Corp., Carpinteria, CA,
EE.UU.), CD80 y CD83 (Coulter/Immunotech, Fullerton, CA,
EE.UU.).
Las citoquinas humanas recombinantes usadas en
este estudio fueron: rhGM-CSF (100 ng/mL, Leukine,
Immunex Corp., Seattle, WA, EE.UU.); rhIL-4 (20
ng/mL, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.);
rhIL-15 (200 ng/mL, R&D Systems, Inc.,
Minneapolis, MN, EE.UU.); TGF-\beta1 (10 ng/mL,
R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.); y huCD40L (Immunex
Corp., Seattle, WA, EE.UU.).
El medio RPMI completo consistió en RPMI 1640,
un 1% de L-Glutamina, un 1% de
penicilina/estreptomicina, 2-ME 50 mM, un 1% de
piruvato sódico, un 1% de aminoácidos esenciales y un 10% de suero
fetal de ternero desactivado por calor (todos de GIBCO BRL, Grand
Island, NY, EE.UU.). El poli (I):(C) se compró en Pharmacia
(Piscataway, NJ, EE.UU.), y el lipopolisacárido (LPS) se compró a
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE.UU.).
Se aislaron monocitos sanguíneos periféricos
mediante agotamiento inmunomagnético (Dynabeads; Dynal Biotech,
Lake Success, NY, EE.UU.) después de la separación de células
mononucleares sanguíneas seguida de un gradiente de
Ficoll-Paque^{TM}. Se recuperó la partícula para
realizar la purificación de células T, y se aislaron monocitos
negativamente mediante agotamiento magnético positivo de células T,
células B y células asesinas naturales (NK, del inglés "natural
killer") usando anticuerpos purificados anti-CD3,
anti-CD16, anti-CD19,
anti-CD56 y anti-glicoforina A.
Después de eso, se cultivaron monocitos CD14^{+} enriquecidos en
placas de 6 pocillos (1 x 10^{6} células/pocillo). Estas células
se cultivaron durante 6 días en presencia de 100 ng/mL de
GM-CSF y de 200 ng/mL de IL-15
(GM-CSF+IL-15), o de 100 ng/mL de
GM-CSF y de 20 ng/mL de IL-4
(GM-CSF+IL-4). Al sexto Día, se
recogieron las células y se tiñeron con
anti-CD14-PE,
anti-CD83-PE,
anti-HLA-DR-PerCP y
anti-CD1a-FITC. En algunos
experimentos, las DCs fueron activadas con LPS (300 ng/mL), y se
analizaron sus fenotipos. El análisis se llevó a cabo mediante FACS
Calibur.
La actividad endocitótica de DCs se determinó
como se indica a continuación. A los seis días se recogieron DCs
derivadas de GM-CSF+IL-15 activadas
con LPS (300 ng/mL) o no activadas, y se incubaron con 100 \mug/mL
de FITC-Dextrano durante 30 minutos a 37ºC. A modo
de control, parte de las DCs se incubó con la misma cantidad de
FITC-Dextrano en hielo. Las células fueron lavadas
con disolución salina tamponada de fosfato (PBS) fría con un 10% de
suero fetal de ternero, y se analizaron mediante FACS Calibur o
mediante microscopía confocal.
La tinción de inmunofluorescencia intracelular
se llevó a cabo como se ha descrito previamente (de Saint Vis, y
col., 1998, Immunity 9: 325-336; Valladeau y
col., 2000, Immunity 12: 71-81). Se fijó las
células en cubreobjetos recubiertos de polilisina durante 15
minutos con un 4% de paraformaldehído en PBS. Después de eso,
dichas células fueron lavadas dos veces en glicina 10 mM en PBS y
dos veces en PBS, y permeabilizadas con PBS que contenía un 0,5% de
saponina y un 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30
minutos. Los cubreobjetos fueron cultivados durante 30 minutos a
temperatura ambiente con 5 \mug/mL de
anti-DC-LAMP o de
anti-Langerina (donados por los Drs. Lebecque y
Saeland, Schering-Plough, Dardilly, Francia).
Después de tres lavados, las células fueron incubadas durante 30
minutos con anticuerpos secundarios anti-ratón de
asno marcados acoplados a rojo de Texas (Jackson Immuno Research
Laboratorios, Inc., West Grove, PA, EE.UU.), se lavaron, se
incubaron con suero preinmune de ratón durante 30 minutos, se
lavaron de nuevo, se incubaron durante 30 minutos con un segundo
anticuerpo primario anti-HLA-DR
acoplado directamente a fluoresceína (Becton Dickinson, Franklin
Lakes, NJ, EE.UU.). Los cubreobjetos se montaron sobre tiras de
vidrio con Fluoromount (Southern Biotechnology Associates,
Birmingham, AL, EE.UU.). La microscopía confocal se llevó a cabo
usando un microscopio TCS SP equipado con láseres de iones de argón
y de kriptón (Leica Microsystem, Heidelberg, Alemania).
Las DCs cultivadas en
GM-CSF+IL-15,
GM-CSF+IL-4 ó
GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1
fueron recogidas, lavadas con RPMI completo y cultivadas con 1 x
10^{5} células T alogénicas CD4^{+} o CD8^{+} recién aisladas
derivadas de sangre periférica. En algunos experimentos, las DCs
fueron activadas con poli (I):(C) (6,5 \mug/mL) durante 16 horas.
Los cultivos de células T y DC se prepararon para 5 días en RPMI
completo más suero AB humano al 10%. Durante las últimas 16 horas
las células se sometieron a pulsos con 0,5 mCi de
[^{3}H]-timidina por pocillo, y se midió la
incorporación del radionucleótido mediante espectroscopía de
centelleo \beta. Para determinar la proliferación de células T
autólogas, se recogieron DCs
GM-CSF+IL-15 ó
GM-CSF+IL-4, se lavaron, y a
continuación fueron sometidas a pulsos de toxoide del tétanos (TT)
durante 48 horas. Después de eso, las DCs fueron lavadas tres veces
con PBS y a continuación fueron resuspendidas en RPMI completo más
suero AB humano al 10%. Las células se añadieron por triplicado en
diversas concentraciones a 1 x 10^{5} células T autólogas/pocillo
en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (Falcon, Oxnard, CA,
EE.UU.). Para evaluar la captura de cuerpos celulares moribundos
por las DCs, éstas fueron incubadas durante dos horas con cuerpos
de la línea celular Me275, que se prepararon mediante tratamiento
con ácido betulínico (10 \mug/mL, Aldrich, Milwaukee, WI, EE.UU.)
durante 48 horas. Después de eso, las DCs fueron clasificadas en
base a la dispersión hacia delante/lateral usando un FACS Vantage.
A continuación las DCs se cultivaron junto con células T CD4^{+}
autólogas. Las células T CD4^{+} ó CD8^{+} fueron aisladas
mediante el procedimiento estándar Ficoll-paque
seguido de agotamiento magnético de las células que no eran T
(Dynabeads; Dynal Biotech, Lake Success, NY, EE.UU.).
Para el análisis de citoquinas, se recogieron
los sobrenadantes 5 días después del cultivo conjunto de DCs
derivadas de GM-CSF+IL-15 y células
T CD4^{+}, y las células fueron re-estimuladas con
PHA (10 \mug/mL) en medio fresco durante 24 horas. Después de
eso, los sobrenadantes fueron recogidos y se determinó la liberación
de citoquinas utilizando kits ELISA de R&D Systems
(Minneapolis, MN, EE.UU.).
Se estimularon CDs derivadas de
GM-CSF+IL-15 ó CDs derivadas de
GM-CSF+IL-4 con CD40L o con una
mezcla de citoquinas de macrófago
(GM-CSF/TNF-\alpha/IL-1/IL-6).
A continuación las DCs fueron lavadas y sometidas a pulsos con 10
\mug/mL de Flu-MP^{58-66}
durante otras 18 horas. Las células T efectoras CD8^{+} (1 x
10^{6}) fueron aisladas mediante separación magnética de
partículas y se cultivaron conjuntamente con DCs no sometidas a
pulsos o con DCs sometidas a pulsos de Flu-MP en 1
mL de RPMI completo más suero AB humano al 10%. Todos los cultivos
de CTL recibieron IL-7 (10 ng/mL) en el momento de
formar el cultivo, e IL-2 (10 UI/mL) al séptimo Día
de cultivo. Los CTL se cultivaron durante 14 días antes del ensayo.
Los CTL se usaron para el ensayo de citotoxicidad al decimocuarto
Día. Se colocó células efectoras (30 x 10^{3}/pocillo) sobre
placas de fondo redondo de 96 pocillos con células diana T2 (1 x
10^{3}/pocillo) incubadas durante la noche con
Flu-MP^{58-66} y se marcaron con
^{51}Cr (Amersham Pharmacia, Biotech, Inc., Piscataway, NJ,
EE.UU.). Después de 4 horas, los sobrenadantes fueron recogidos
usando un marco de recogida y se midió la proteína marcada con
cromo usando un contador \gamma (Packard Instruments Co, Meriden,
CT, EE.UU.). A continuación se determinó el porcentaje de lisis
específica de antígeno.
Para determinar las células T efectoras
productoras de IFN-\gamma, específicas de
antígeno, se empleó un ensayo de inmunomancha ligado a enzima
(ELISPOT), tal como se describe en Dhodapkar, y col. (Dhodapkar, y
col., 1999, J Clin Invest 104: 173-180). Se
añadieron células T CD8^{+} (1 x 10^{5}/pocillo) por triplicado
a placas de 96 pocillos con nitrocelulosa en el fondo (MAHA S4510;
Millipore Corp., Bedford, MA, EE.UU.) cubiertas previamente con el
mAb anti-IFN-\gamma primario
(1-D1K; Mabtech AB, Nacía, Suecia) en 50 \muL de
RPMI completo por pocillo. Para la detección de células T reactivas
específicas, se añadieron 1 x 10^{4}/pocillo (volumen final de
100 \muL/pocillo) DCs derivadas de monocitos maduras autólogas
sometidas a pulsos con péptidos restringidos MHC de clase I
(Flu-MP). Después de incubar durante 20 horas, los
pocillos fueron lavados 6 veces, se incubaron con mAb secundario
biotinilado contra IFN-\gamma
(7B6-1; Mabtech AB) durante 2 horas, se lavaron y
se tiñeron con un kit Vectastain Elite (Vector Laboratories, Inc.,
Bulingame, CA, EE.UU.). Las respuestas se contabilizaron como
positivas si se detectaba un mínimo de 10 células formadoras de
manchas (SFC)/2 x 10^{5}, y si el número de manchas era al menos
el doble que el de los pocillos de control negativos.
Para determinar si la fuente de monocitos puede
afectar a los resultados obtenidos cuando los monocitos son
tratados únicamente con IL-15, los monocitos se
obtuvieron empleando los siguientes dos protocolos: (1) agotamiento
negativo mediante partículas magnéticas, y (2) un protocolo
adherente. En el protocolo de agotamiento negativo, se aislaron
monocitos sanguíneos periféricos mediante agotamiento
inmunomagnético (Dynabeads, Dynal Biotech, Lake Success, NY,
EE.UU.) después de la separación de células sanguíneas mononucleares
seguida de un gradiente de Ficoll-Paque^{TM}. Se
recuperó la partícula para purificación de células T y los monocitos
fueron aislados negativamente mediante agotamiento magnético
positivo de células T, células B y células NK usando anticuerpos
purificados anti-CD3, anti-CD16,
anti-CD19, anti-CD56 y
anti-glicoforina A. Después de eso, los monocitos
CD14^{+} enriquecidos fueron cultivados en placas de 6 pocillos (1
x 10^{6}/pocillo). Se cultivó una alícuota de dichas células
durante 6 días en presencia únicamente de IL-15 y
únicamente de IL-4, respectivamente. Al segundo
Día, al cuarto Día y al sexto Día, las células fueron recogidas,
teñidas con anti-CD14, anti-CD83,
anti-CD80,
anti-HLA-DR,
anti-CD1a, anti-CD40 y
anti-CD86, y se analizaron mediante FACS Calibur. En
el protocolo adherente, se cultivaron linfocitos crudos en placas
de 6 pocillos durante 2 horas, y las células fueron lavadas tres
veces con PBS que contenía un 2% de FSC para eliminar las células no
adherentes. A continuación las células adherentes fueron cultivadas
únicamente con IL-15 y únicamente con
IL-4. Se añadió timidina marcada a las células
obtenidas mediante el protocolo de agotamiento negativo
y mediante el protocolo adherente, y se midió la captación de timidina al sexto Día empleando un contador \beta.
y mediante el protocolo adherente, y se midió la captación de timidina al sexto Día empleando un contador \beta.
Se llevó a cabo un estudio para determinar si la
IL-15 puede estar involucrada en la diferenciación
de DC inmaduras, y más particularmente de LCs. Los monocitos fueron
purificados intensamente mediante agotamiento negativo usando
partículas magnéticas negativas (98%) y se cultivaron con
IL-15 en combinación con GM-CSF.
Después de seis días de cultivo en un medio que contenía
GM-CSF+IL-15, la morfología de
contraste de fases características de las DCs de
IL-15 indicó una agregación celular extensiva. Se
observó una agregación celular similar en los cultivos que
contenían una combinación de
GM-CSF+IL-4. El contraste de fases
representativo y la tinción de Giemsa de las DCs de
IL-15 revelaron velos extendidos, una morfología que
sugiere la presencia de DCs. El análisis de citometría de flujo
mostró que todas las células habían adquirido CD1a, habían perdido
CD14 y habían expresado niveles relativamente altos de
HLA-DR (Figura 1A). Por tanto, los monocitos
cultivados con GM-CSF+IL-15 se
diferenciaron en células con un fenotipo de DCs inmaduras. Los
monocitos requirieron de 4 a 6 días de cultivo para diferenciarse
completamente en DCs inmaduras (Figura 1B) (de aquí en adelante
estas células se denominarán
IL-15-DCs). Después de seis días, 1
x 10^{6} monocitos dieron lugar a una media de 0,53 x 10^{6}
DCs inmaduras (media de 5 experimentos, SD = 176,86). La generación
de DCs derivadas de IL-15 fue independiente de la
producción de IL-4 endógena, determinado mediante
adiciones diarias de anti-IL4 neutralizante. Dicho
tratamiento impidió la diferenciación de monocitos en DCs como
respuesta a GM-CSF+IL-4, pero no
como respuesta a GM-CSF+IL-15,
mientras que la adicción de
anti-IL-15 o de cadena
anti-IL-2R\gamma bloqueó
significativamente la generación de DCs CD1a^{+} en respuesta a
GM-CSF+IL-15.
Tal como se muestra en la Figura 2A, las DCs
derivadas de IL-15 expresan HLA-ABC
de Clase I, niveles bajos de CD86 y niveles mínimos de CD40, CD80 y
CD83. Tras activación con LPS, las células muestran una expresión
incrementada de CD40, CD80, CD86 y CD83. Las secciones de
microscopía confocal revelaron la acumulación de
DC-LAMP intracelular en la condición
GM-CSF/IL-15, un marcador de DCs
maduras. La maduración de DCs derivadas de IL-15
podría inducirse igualmente con LPS y con CD40L. Al contrario que
las DCs generadas con IL-4, las DCs derivadas de
IL-15 siempre muestran algunas células activadas tal
como demuestra la expresión espontánea de DC-LAMP
en el 5-10% de las células. Como DCs inmaduras, las
DCs derivadas de IL-15 fueron capaces de capturar
antígenos de forma eficaz, por ejemplo,
FITC-Dextrano (Figura 2B). Sin embargo, perdieron
dicha capacidad después de la maduración, por ejemplo, con LPS
(Figura 2A).
Las células progenitoras hematopoyéticas
CD34^{+} cultivadas con
GM-CSF+TNF-\alpha dieron lugar
tanto a DCs como a LCs intersticiales. Los monocitos cultivados con
GM-CSF+IL-4 no se diferenciaron en
LCs a menos que se añadiera a los cultivos
TGF-\beta1. Hasta la fecha, dos marcadores
distinguen LCs: CCR6, el receptor de defensina
MIP-3 \alpha/\beta, y LAG/Langerina, una lectina
implicada en la formación de gránulos Birbeck. Tal como se muestra
en la Figura 3A, hasta el 10% de las DCs derivadas de
IL-15 expresaron CCR6, mientras que las DCs
generadas con GM-CSF+IL-4 no lo
hicieron. Se llevó a cabo la microscopía confocal de
inmunofluorescencia de HLA-DR/Langerina sobre DCs
derivadas de monocitos cultivadas in vitro durante 6 días con
GM-CSF+IL-4,
GM-CSF+IL-15 y
GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1.
Las secciones confocales revelaron la acumulación de Langerina
intracelular en DCs generadas cultivando monocitos con
GM-CSF+IL-15 y
GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1,
pero no con GM-CSF+IL-4.
Las DCs de IL-15 son células
presentadoras eficaces de antígenos que pueden inducir la
proliferación de células T CD4^{+} y CD8^{+} alogénicas
(Figuras 4A y 4B). Las DCs generadas mediante el cultivo de
monocitos con GM-CSF+IL-15,
GM-CSF+IL-4 o
GM-CSF+IL-4/TGF-\beta1
fueron comparables en cuanto a su capacidad para inducir reacción
de linfocitos mixtos alogénicos (MLR, del inglés "mixed lymphocyte
reaction") (Figura 4C). Fueron considerablemente más eficaces
que las células generadas únicamente con GM-CSF
(Figura 4C). Las DCs de IL-15 activadas durante 24
horas con poli (I):(C) (Figuras 4A, 4B), CD40L ó LPS mostraron una
capacidad de alo-estimulación incrementada. También
se determinó la capacidad para presentar antígenos a las células T
CD4^{+} autólogas. De este modo, las DCs de IL-15
cargadas con toxoide del tétanos soluble (TT) indujeron la
proliferación de células T CD4^{+} (Figura 5A). Adicionalmente,
las DCs de IL-15 que habían capturado cuerpos
celulares moribundos también indujeron la proliferación de
linfocitos T autólogos (Figura 5B).
La capacidad de las DCs de IL-15
para orientar la diferenciación de células T se determinó
cultivándolas con células T naive CD4^{+}CD45RA^{+}T durante
cinco días. Después de eso, las células fueron lavadas y estimuladas
con PHA, y se evaluó la producción de citoquinas de los
sobrenadantes. Las DCs de IL-15 no activadas
indujeron a las células T a producir grandes cantidades de
IFN-\gamma, pero no de IL-4 o de
IL-10 (Figura 6). Los cultivos conjuntos de células
T y de DCs de IL-15 estimuladas con Poli (I):(C)
contenían niveles superiores de IFN-\gamma
(Figura 6). A continuación se pudo observar IL-10 en
los sobrenadantes (Figura 6).
Se evaluó la capacidad de las DCs de
IL-15 para estimular respuestas de CTL restringidas
a MHC de clase I. Las DCs de IL-15 fueron sometidas
a pulsos con péptido Flu-MP y se usaron para
estimular células T CD8^{+} purificadas. Después de dos ciclos de
cultivos de siete días llevados a cabo en presencia de
IL-7 (ambos ciclos) y de IL-2 (sólo
el segundo ciclo), las células T excitadas fueron capaces de matar
eficazmente células T2 cargadas con péptido Flu-MP
(lisis específica al 55% con una relación E:T 2,5:1 y lisis
específica al 60% con una relación E:T de 5:1). Las líneas
celulares, generadas mediante cultivo conjunto con DCs de
IL-15 no cargadas (DCs de control) indujeron menos
de un 5% de lisis específica (Figura 7A). Sin embargo, tal como se
muestra en la Figura 7B, las DCs de IL-15 cargadas
con péptido de Flu-MP fueron comparables a las DCs
de GM-CSF+IL-4 en lo que se refiere
a la estimulación de la generación de precursores de CTL específicos
de péptido capaces de producir IFN-\gamma. Las
DCs no sometidas a pulsos no indujeron células específicas
productoras de IFN-\gamma (Figura 7B).
Cuando se cultivan monocitos purificados,
obtenidos mediante el protocolo de agotamiento negativo, en
presencia de IL-15 y de GM-CSF, las
DCs de GM-GSF+IL-15 resultantes
fueron CD1a^{+} y CD14^{-}, lo cual es indicativo de células
dendríticas inmaduras. Sin embargo, cuando estos monocitos se
cultivaron únicamente con IL-15, las células
resultantes fueron CD1a^{+} y CD14^{+}, indicativo de células
dendríticas precursoras y no de células dendríticas inmaduras. Tal
como se muestra en la Figura 8, los monocitos purificados obtenidos
mediante el protocolo de agotamiento negativo no proliferaron cuando
se cultivaron en presencia de IL-15 o de
IL-4. Los estudios cinéticos con el tiempo
presentados en las Figuras 9A-9F demuestran además
que las células obtenidas después de cultivar dichos monocitos
purificados únicamente en IL-15 no eran células
dendríticas inmaduras.
Tal como demuestran los estudios de captación de
timidina ilustrados en la Figura 8, cuando se cultivaron células
adherentes obtenidas mediante el protocolo adherente en presencia
únicamente de IL-15, el cultivo celular resultante
mostró evidencias de proliferación. Estos resultados indicaron que
las células adherentes no sólo incluyeron monocitos sino también
contaminaciones de células T, células B y células NK, que responden
a la IL-15 mediante proliferación.
Tal como se ha indicado antes, la
IL-15 en combinación con GM-CSF
induce la diferenciación de monocitos altamente purificados en DCs
inmaduros. Las células generadas en estas condiciones son
comparables en muchos sentidos a las DCs generadas con
GM-CSF+IL-4: 1) el mismo fenotipo;
2) la misma capacidad para capturar FITC-Dextrano y
cuerpos celulares moribundos; 3) la misma capacidad para madurar
como respuesta a diversos estímulos; 4) la misma capacidad para
procesar y presentar antígenos solubles y particulados; 5) la misma
capacidad para inducir la diferenciación de células T en el
mecanismo Th1; y 6) la misma capacidad para inducir la
diferenciación de células T CD8 en CTL específicas. Se observaron
dos diferencias entre las DCs generadas en presencia de
IL-4 y las DCs generadas en presencia de
IL-15: 1) los cultivos de IL-15
incluyeron algunas DCs maduras tal como demuestra la expresión de
DC-LAMP; y 2) los cultivos de IL-15
contenían células de Langerhans. Esta última observación es
relevante para la IL-15, que es un producto de KCs,
las células que rodean por completo las LCs dentro de la epidermis.
Por tanto, los monocitos que salen al exterior de los vasos se
diferenciarían en DCs intersticiales cuando se encontraran con el
GM-CSF y la IL-4 producidos por las
células mast dermales; pero se diferenciarían en células de
Langerhans cuando se encontraran con el GM-CSF y la
IL-15 producidos por KCs.
Tal como se muestra en la Figura 10, la fracción
adherente de las células mononucleares sanguíneas periféricas da
lugar, al cultivarla con IL-15 y
GM-CSF, a células con el fenotipo de las células
dendríticas que incluyen el componente celular de Langerhans
determinado mediante expresión superficial de Langerina. Dichas
células se obtiene en un cultivo llevado a cabo en las condiciones
aprobadas para uso clínico y para la re-inyección
de células cultivadas a un paciente. Las células se generan en un
medio de cultivo X-VIVO complementado con entre un
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\hskip1.05cmMohamadzadeh, Manssur
\hskip1.05cmPalucha, Anna
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<120> Composiciones y Métodos para
Producir Células Presentadoras de Antígenos
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<151>
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<160> 2
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<170> PatentIn versión 3.0
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<210> 1
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<211> 1202
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (317)..(805)
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<400> 1
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<400> 2
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Claims (15)
1. Un método para producir células dendríticas
inmaduras a partir de precursores de células dendríticas de
monocitos in vitro o ex vivo, que comprende poner en
contacto dichos precursores con una composición que comprende
interleucina-15 y factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago durante aproximadamente entre
24 horas y 15 días.
2. El método de la Reivindicación 1, en donde
dicha interleucina-15 se encuentra en una forma
seleccionada del grupo que consiste en
interleucina-15 aislada, un polipéptido recombinante
de interleucina-15, un ácido nucleico que codifica
interleucina-15, natural o diseñada artificialmente,
en un vector de expresión adecuado, y una población celular que
expresa un ácido nucleico que codifica
interleucina-15.
3. El método de la Reivindicación 1, en donde
dicho factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago se encuentra en una forma
seleccionada del grupo que consiste en factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago aislado, un polipéptido
recombinante de factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago, un ácido nucleico que
codifica factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago en un vector de expresión
adecuado, y una población celular que expresa un ácido nucleico que
codifica factor estimulador de colonia
granulocito-macrófago.
4. El método de las Reivindicaciones 1 a 3, que
además comprende la sensibilización de dichas células dendríticas
inmaduras frente a un antígeno.
5. Un método para la producción de células
dendríticas maduras, que comprende la producción de células
dendríticas inmaduras de acuerdo con el método de las
Reivindicaciones 1 a 3, y el cultivo de dichas células dendríticas
inmaduras en presencia de un agente de maduración y en las
condiciones necesarias para promover la maduración de dichas
células dendríticas inmaduras y formar células dendríticas
maduras.
6. El método de la Reivindicación 5, que además
comprende sensibilizar dichas células dendríticas frente a un
antígeno antes, durante o después de la maduración.
7. El método de la Reivindicación 5 ó 6, en
donde dicho agente de maduración se selecciona del grupo que
consiste en lipopolisacárido, CD40L, poli (I) : (C) y una mezcla de
citoquinas de macrófagos
(GM-CSF/TNF-\alpha/IL-1/IL-6).
8. Un método para producir vesículas de membrana
aisladas in vitro o ex vivo, que comprende producir
células dendríticas inmaduras de acuerdo con el método de las
Reivindicaciones 1 a 3, cultivar dichas células dendríticas
inmaduras en presencia de al menos un factor estimulador para
promover la liberación de vesículas de membrana; y aislar dichas
vesículas de membrana.
9. El método de la Reivindicación 8, que además
comprende sensibilizar dichas células dendríticas inmaduras frente
a un antígeno antes o después de la liberación de las vesículas de
membrana.
10. El método de las Reivindicaciones 8 ó 9, en
donde dicho factor estimulador se selecciona del grupo que consiste
en una citoquina adecuada, irradiación y pH bajo.
11. El uso de células dendríticas inmaduras
mediante el método de las reivindicaciones 1 a 4, o de las vesículas
de membrana que se pueden obtener mediante el método de la
reivindicación 8, 9 ó 10, para la preparación de una composición
farmacéutica para modular la respuesta inmune en un paciente.
12. Un método para producir linfocitos T
citotóxicos específicos de antígeno in vitro o ex
vivo, que comprende proporcionar células dendríticas
sensibilizadas a antígeno preparadas produciendo células dendríticas
inmaduras según el método de las reivindicaciones 1 a 3, y
posteriormente sensibilizar dichas células dendríticas frente a
dicho antígeno, y poner en contacto dichas células dendríticas
sensibilizadas a antígeno con una población de células que
comprende linfocitos T para formar linfocitos T citotóxicos
específicos de antígeno activados.
13. Un método para producir linfocitos T CD4+
específicos de antígeno in vitro o ex vivo, que
comprende proporcionar células dendríticas sensibilizadas a
antígeno preparadas produciendo células dendríticas inmaduras según
el método de las reivindicaciones 1 a 3, y posteriormente
sensibilizar dichas células dendríticas frente a dicho antígeno, y
poner en contacto dichas células dendríticas sensibilizadas a
antígeno con una población de células que comprende linfocitos T
para formar linfocitos T CD4+ específicos de antígeno activados.
14. Una composición que comprende células
dendríticas inmaduras que incluyen un componente celular de
Langerhans, determinado mediante la expresión de Langerina
producida de acuerdo con el método de la Reivindicación 1 a 4.
15. Una composición que comprende vesículas de
membrana producidas de acuerdo con el método de la Reivindicación
8, 9 ó 10.
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