ES2231200T3 - Composiciones farmaceuticas y cosmeticas que comprenden serin-proteinasas de bacalao y su uso farmaceutico y cosmetico. - Google Patents
Composiciones farmaceuticas y cosmeticas que comprenden serin-proteinasas de bacalao y su uso farmaceutico y cosmetico.Info
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Abstract
1. Una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de bacalao para usarse como un medicamento. La presente invención proporciona el uso de tripsinas derivadas de bacalao u otras tripsinas o serín-proteinasas relacionadas tales como quimotripsinas derivadas de animales, en particular animales acuáticos tales como pescados, incluyendo bacalao, en una variedad de contextos médicos y cosméticos. Como se usa aquí, el término ¿enzima¿ es usado para indicar una enzima activa si no es especificada de otro modo. También, como se usa aquí, el término ¿tripsina u otra peptidasa relacionada¿, indica peptidasas del tipo tripsina y todas las peptidasas que tienen 90% o más homología de secuencia con las tripsinas de bacalao del Atlántico. Como se usa aquí, el término ¿quimotripsina u otras peptidasas relacionadas¿, significa todas las peptidasas del tipo quimotripsina y todas las peptidasas que tienen 90% o más de homología de secuencia con las quimotripsinas A y B de bacalao del Atlántico. En particular, las enzimas de conformidad con la invención, son empleadas para tratar dolor, inflamación aguda o crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoatritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematosos sistémico, flebitis, eczema, sarampión, psoriasis, acné, heridas y candidiasis.
Description
Composiciones farmacéuticas y cosméticas que
comprenden serín-proteinasas de bacalao y su uso
farmacéutico y cosmético.
La presente invención se refiere en su aspecto
más amplio, al campo del tratamiento de prevención y enfermedades y
al campo cosmético, en particular al uso farmacéutico y cosmético
de las serín-proteinasas derivadas del pescado.
Específicamente se proporcionan composiciones farmacéuticamente o
cosméticamente activas que comprenden como un componente activo,
tripsina y/o quimotripsina aisladas de bacalao del Atlántico y
serín-proteinasas relacionadas con tales
enzimas.
Las Patentes Estadounidenses Nos. 4,801,451 y
4,963,491, describen una mezcla de exo y endopeptidasas aisladas de
krill del Antártico (Euphasia superba) y el uso de esta
mezcla como una solución limpiadora. La Patente Estadounidense No.
4,801,451 describe el uso de tales enzimas para remover la materia
extraña y tejido muerto de heridas. La soelicitud de patente
internacional WO 85/04809 describe el uso de enzimas krill como un
agente que promueve la digestión. La
EP-A-01-0170115
describe el uso de enzimas krill para disolver coágulos de
sangre.
Sin embargo, todas estas referencias describen
materiales impuros o escasamente caracterizados. Una peptidasa
purificada o mezcla de peptidasa purificada es deseable para
proporcionar un producto farmacéuticamente útil. Además, no se
encuentra descripción en donde una peptidasa purificada o mezcla de
pepetidasas purificadas sean empleadas para tratar por ejemplo,
artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis
reumatoide, artritis séptica, flebitis, eczema, salpullido,
psoriasis o enfermedades infecciosas.
La solicitud de patente internacional WO 96/24371
describe el uso de una enzima proteolítica multifuncional derivada
del krill y una familia de enzimas proteolíticas derivadas de
crustáceos y pescados que tienen similitud estructural substancial
a la enzima multifuncional derivada de krill del Antártico. Esta
solicitud también se refiere a métodos de purificación de la enzima
multifuncional y a usos farmacéuticos, cosméticos y otros de la
enzima multifuncional. La similitud estructural substancial a la
enzima multifuncional derivada del krill del Antártico, es definida
en tal solicitud como al menos 70% de homología con la hidrolasa
multifuncional derivada de krill. La tripsina y la quimotripsina
derivadas de bacalao como se describe aquí tienen menos de 70% de
homología con la enzima multifuncional derivada del krill.
Adicionalmente, las tripsinas y quimotripsinas derivadas de
bacalao, no son enzimas multifuncionales. Su actividad principal
conocida es que aquella de proteasas tripsinas y proteasas
quimotripsinas, respectiva-
mente.
mente.
Un objetivo principal de la presente invención es
proporcionar el uso de las tripsinas y quimotripsinas derivadas de
bacalao, en composiciones farmacéuticas o medicamentos para la
aplicación local y tópica para tratar padecimientos internos y
alteraciones y uso cosmético de tales enzimas. El uso tópico para
tratar alteraciones internas, locales, sin la enzima que tiene que
penetrar a través de las heridas abiertas o tejido mucoso, se
encontró sorprendentemente efectivo como se describe en los
ejemplos acompañantes. Esto es contrario a las enseñanzas de la
técnica anterior de uso relacionado de otras enzimas, en donde por
ejemplo, la enzima hidrolasa multifuncional de krill es inyectada
para el tratamiento de varios dolores locales. Otro objetivo de la
presente invención es el uso de tripsinas y quimotripsinas
derivadas de bacalao para uso en las composiciones farmacéuticas o
medicamentos para el transporte de otros compuestos proteináceos o
no proteináceos activos a través de la piel para aplicación local y
tópica para tratar padecimientos y alteraciones internas. Se ha
encontrado que tales serín-proteinasas son
farmacéuticamente altamente activas contra una variedad de
padecimientos.
En consecuencia, la presente invención pertenece
en un primer aspecto a una serín-proteinasa de
pescado para uso como un medicamento. En este contexto, las
proteinasas particularmente útiles incluyen tripsinas y
quimotripsinas derivadas de bacalao, tal como el bacalao del
Atlántico.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
al uso de una serín-proteinasa en la fabricación de
un medicamento para tratar y/o prevenir un padecimiento en un
humano o un animal. Los padecimientos y alteraciones los cuales
pueden ser tratados o prevenidos incluyen dolor, inflamación agua,
inflamación crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis,
osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil,
artritis séptica, fibromialgia, lupus eritematoso sistémico,
flebitis, tendinitis, salpullido, psoriasis, acné, eczema, eczema
seborréico facial, eczema de las manos, cara o cuello, infecciones
del prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras
tópicas infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos,
arrugas, cicatrices, queloides, exacerbación, verrugas y comezón
alérgica, hemorroides, heridas, infecciones de heridas, heridas y
quemaduras, una infección fúngica y una alteración inmunológica
incluyendo un padecimiento auto inmune.
En todavía aspectos adicionales, la presente
invención proporciona el uso de una
serín-proteinasa de pescado en la fabricación de un
medicamento para remover la piel muerta o desprendida de otro modo
de piel saludable y el uso de una serína-proteinasa
de pescado en la fabricación de un medicamento para tratar o
prevenir un padecimiento en cuya patogénesis está involucrado un
enlace mediado por el receptor.
En aún aspectos adicionales, la invención se
refiere a composiciones farmacéuticas y cosméticas que comprenden
una serín-proteinasa de pescado y a un método para
tratar y/o prevenir un padecimiento en un humano o animal, el método
comprende administrar a dicho humano o animal, una cantidad
farmacéuticamente efectiva de una serín-proteinasa
de pescado.
De conformidad con la invención, también se
proporciona un método para preparar en una escala comercial, una
preparación purificada de isoenzimas de tripsina de bacalao, el
método comprende los pasos de (i) preparar un extracto acuoso de
vísceras de bacalao, (ii) someter el extracto acuso uno o más pasos
cromatográficos, incluyendo un paso de cromatografía de afinidad
usando un ligando de afinidad p-aminobenzamidina, y
(iii) desorber y eluir el enlace tripsina al ligando de afinidad
p-aminobenzamidina y una preparación purificada en
una escala comercial de tripsina de bacalao.
La presente invención proporciona el uso de
tripsinas derivadas de bacalao u otras tripsinas o
serín-proteinasas relacionadas tales como
quimotripsinas derivadas de animales, en particular animales
acuáticos tales como pescados, incluyendo bacalao, en una variedad
de contextos médicos y cosméticos.
Como se usa aquí, el término "enzima" es
usado para indicar una enzima activa si no es especificada de otro
modo. También, como se usa aquí, el término "tripsina u otra
peptidasa relacionada", indica peptidasas del tipo tripsina (EC
3.4.21.4) y todas las peptidasas que tienen 90% o más homología de
secuencia con las tripsinas de bacalao del Atlántico (Ásgeirsson
et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94,
1989: Gudmundsdottir et al., Eur. J. Bíochem.
217:1091-1097, 1993). Como se usa aquí, el término
"quimotripsina u otras peptidasas relacionadas", significa
todas las peptidasas del tipo quimotripsina (E:C 3.4.21.1) y todas
las peptidasas que tienen 90% o más de homología de secuencia con
las quimotripsinas A y B de bacalao del Atlántico (Ásgeirsson y
Bjarnason, Comp. Bíochem. Physíol.
99B:327-335-94, 1991;
Gudmundsfdottir et al., Biochem et Biophys. Acta
1219:211214, 1994).
En particular, las enzimas de conformidad con la
invención, son empleadas para tratar dolor, inflamación aguda o
crónica, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis, osteoatritis,
artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica,
fibromialgia, lupus eritematosos sistémico, flebitis, eczema,
sarampión, psoriasis, acné, heridas y candidiasis. En modalidades
empleadas, la tripsina de bacalao o quimotripsina de bacalao o una
mezcla de estas enzimas son administradas localmente y tópicamente
en el sitio infectado en una composición farmacéutica que comprende
la peptidasa purificada o mezcla de peptidasas purificadas y un
diluyente o portador farmacéuticamente aceptable, en particular
pero no limitado a un hidrogel. Además, las enzimas son empleadas
para tratar infecciones virales tales como erupción de herpes,
infecciones fúngicas, bacterianas o parasíticas, incluyendo
colitis, ulceras, hemorroides, cicatrización de córneas, placa
dental y alteraciones autoinmunes incluyendo padecimientos
autoinmunes.
Las enzimas que son substancialmente
estructuralmente similares a las enzimas tripsina y quimotripsinas
derivadas de bacalao, tienen la misma utilidad como las enzimas de
bacalao.
En particular, estas enzimas de tripsina y
quimotripsina son empleadas para tratar artritis, coyunturas
inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis
reumatoide juvenil, artritis séptica y flebitis. En tales
tratamientos, la tripsina o quimotripsina o una mezcla de ambas
enzimas son administradas localmente y tópicamente en el sitio de
la artritis o inflamación en una composición farmacéutica que
comprende las tripsinas o quimotripsinas o ambas enzimas y un
portador o diluyente farmacéuticamente aceptable en particular,
pero no limitado a hidrogel. Además, las enzimas tripsina y
quimotripsina de conformidad con la invención, son empleadas para
tratar infecciones virales tales como erupciones de herpes,
infecciones fúngicas, bacterianas o parasíticas, incluyendo
colitis, ulceras, hemorroides, cicatrización de córneas, placa
dental, acné, heridas, candidiasis y alteraciones autoinmunes
incluyendo padecimientos autoinmunes.
En particular, la invención se refiere a usos
médicos, farmacéuticos y cosméticos de las tripsinas derivadas de
bacalao del Atlántico u otros animales. Hay tres isoenzimas
principales de tripsina en el bacalao del Atlántico que han sido
purificadas y caracterizadas. Han sido llamadas Tripsina I, II y III
(Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem.
180:85-94, 1989). Las tripsinas de bacalao tienen
la secuencia amino terminal
I-V-G-G-Y-Q/E-C-E-/T-K/R-H-S-Q-A-H-QV-S-L-N-S,
mientras las tripsinas de mamíferos como la tripsina de bovino
tienen la secuencia amino terminal
I-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S.
Todas las tres isoformas de la tripsina de bacalao tienen una masa
molecular similar de aproximadamente 24 kDa.
La invención también se refiere a usos médicos,
farmacéuticos y cosméticos de las quimotripsinas derivadas de
bacalao del Atlántico u otros animales. Hay dos tipos principales
de isoenzimas de quimotripsina en bacalao del Atlántico que se han
purificado y caracterizado. Han sido designadas Quimotripsinas A y B
-(Ásgeirsson y Bjarnason, Com. Biochem. Physiol.
99B:327-335-94, 1991). Las
quimotripsinas de bacalao tienen las secuencias amino terminales
duales de una de sus formas activas
C-G-R/S-P-A-I-S/Q-P-V/Q-I/V-T-G-Y
(cadena A), y
I-V-N-G-E-E-A-V-P-H-S/T-W-S/P/Y-W-Q-V-S-LQ-D/Q
(cadena B), mientras la quimotripsina de mamífero tal como
quimotripsina A de bovino tiene la secuencia aminoterminal
C-G-V-P-A-I-Q-P-V-L-S-G-L
(cadena A), y
I-V-N-G-E-E-A-V-P-G-S-W-P-W-Q-V-S-L-Q-D
(cadena B). Ambas isoformas de quimotripsina de bacalao tienen masa
molecular similar de aproximadamente 26 kDa.
Las tripsinas y quimotripsinas de bacalao son
aisladas y purificadas de vísceras de bacalao, excepto el hígado,
bazos y hueva. Los inventores han encontrado los métodos descritos
abajo útiles para una producción de escala comercial de tripsinas y
quimotripsinas de bacalao. Las enzimas son extraídas de la víscera
completa o desmenuzada por extracción acuosa con agitación uniforme
a cualquier relación de víscera a agua, preferiblemente una
relación (p/p) desde 1:1 hasta 1:10 de vísceras o asadura a agua.
Después de la separación de la solución de extracto crudo y
vísceras o asadura residual, el extracto es clarificado por
sedimentación o filtración. La solución clarificada es concentrada
preferiblemente por ultrafiltración y/o opcionalmente intercambio de
iones y después preferiblemente microfiltrado para alcanzar una
solución real de biolímites bajos adecuados para la cromatografía
en columna empacada que puede incluir varios pasos.
Subsecuentemente, la tripsina de bacalao es purificada por
cromatografía de afinidad, preferiblemente por cromatografía de
afinidad aminobenzamidina y quimotripsina por cromatografía de
interacción hidrofóbica preferiblemente por cromatografía de Fenil
Sefarosa.
Como se usa aquí, la producción a escala
comercial de las tripsinas y quimotripsinas de bacalao se refieren
a métodos que son confiables y fuertes y permiten la producción de
lotes en el orden de 1 a 10 g o más, tal como 10 o 100 g o más.
El método preferido de aplicación de las enzimas
purificadas o mezcla de enzimas purificadas, está en una
preparación de hidrogel y agua que contiene 0 hasta 85% (vol/vol)
de un alcohol polivalente (poliol) tal como glicerol. Una
concentración adecuada de actividad de tripsina es de 0.1 hasta
10,000 unidades de enzima por actividad de
CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA
(carbobenzoxi-Gly-Pro-Arg-para
nitroanalido), por 100 mililitros de la preparación de hidrogel
final y la concentración apropiada de actividad de quimotripsina es
0.1 hasta 10,000 unidades de enzima por actividad de
Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA
por 100 mililitros de la preparación de hidrogel final.
La invención también proporciona una composición
farmacéutica que comprende las tripsinas de bacalao y las
peptidasas relacionadas y un diluyente o portador farmacéuticamente
aceptable.
La invención además proporciona (a) medios que se
relacionan a ciertas condiciones usando cantidades efectivas de las
enzimas purificadas descritas anteriormente, (b) composiciones o
substancias para uso en tales métodos, (c) composiciones
farmacéuticas que contienen cantidades efectivas de enzimas para
usarse en tales métodos, y (d) usos de la enzima o composición de la
enzima para la fabricación de un medicamento para el uso en tales
métodos. Los medios son para:
tratar o prevenir profilácticamente una
indicación seleccionada del grupo que consiste de dolor,
inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis, coyunturas
inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis
reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus
eritematoso sistémico y flebitis, en donde preferiblemente la
cantidad es una cantidad efectiva para tratar o prevenir; tratar o
prevenir profilácticamente condiciones dermatológicas tales como
por ejemplo acné, salpullido, psoriasis o eczema, incluyendo eczema
seborréico facial o eczema de las manos, cara, cuero cabelludo o
cuello, hemorroides y similares, en donde preferiblemente la
cantidad de las tripsinas de bacalao y peptidasas relacionadas
administradas es una cantidad efectiva para tratar o prevenir una
condición dermatológica;
tratar o prevenir profilácticamente la infección
de heridas y curación de desbridamientos (aplicando a la herida una
cantidad efectiva de la enzima para prevenir la infección
microbiana, o incrementar la sanación de heridas administrando una
cantidad efectiva de la enzima inhibitoria del microbio), cuando se
trata la herida puede estar substancialmente libre de tejido
necrótico; remover piel muerta o desprendida de otro modo piel
saludable para mejorar la apariencia de la piel, en donde
preferiblemente la cantidad de la enzima administrada es una
cantidad efectiva que remueve la piel muerta;
tratar o prevenir profilácticamente fibrosis
cística, cáncer, por ejemplo, administrando una cantidad efectiva
para tratar un tumor o una cantidad de enzima que inhibe o previene
la metástasis del tumor, aterosclerosis, asma, apoplejías sépticas,
síndrome de apoplejía tóxica, adhesión de tejidos tales como
envoltura de tendones, adhesiones de coyunturas o
post-quirúrgicas abdominales, lesión por
reperfusión, malaria, alteraciones inmunes tales como padecimientos
autoinmunes, apoptosis, colitis y enteritis, tales como
padecimiento de Crohn, en donde preferiblemente la cantidad de
tripsinas de bacalao y peptidasas administradas relacionadas son
efectivas para el tratamiento o prevención; tratar o prevenir
profilácticamente una infección microbiana, por ejemplo, una
infección viral tal como una infección del virus del herpes (por
ejemplo HSV-1, HSV-2, herpes zoster
o infección de herpes genital), VIH, hepatitis, influenza,
coronavirus, citomegalovirus, rinovirus, o infección del virus del
papiloma; una infección que causa un padecimiento gastrointestinal
tal como úlcera o diarrea; una infección fúngica tal como una
infección fúngica sistémica de la piel, oral, vaginal o esofageal,
incluyendo por ejemplo infección de levadura, incluyendo una
infección fúngica de uña e infecciones por cándida; infecciones
microbianas del ojo, preferiblemente tratado con administraciones
oculares; infecciones bacterianas que incluyen infección por
Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp.,
Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp., Chlamydia
spp., syphilis infecciones por E. coli, e infecciones
bacterianas que causan cancroides; infecciones oportunísticas en
pacientes inmunocomprometidos, en donde la cantidad administrada de
las tripsinas de bacalao es una cantidad efectiva para prevenir o
tratar la infección microbiana o tiene actividad inhibitoria contra
la adhesión célula-célula o
célula-virus;
remoción de la placa dental, en donde
preferiblemente la cantidad de enzima administrada es un cantidad
efectiva que remueve la placa dental;
y someter a lisis coágulos sanguíneos, en donde
preferiblemente la cantidad de enzima es una cantidad efectiva para
someter a lisis el coágulo.
El método comprende administrar una composición
que comprende las tripsinas y/o quimotripsinas de bacalao, como se
describe anteriormente. La composición de la invención puede
también ser usada para remover las células muertas o
divergentes.
La invención proporciona composiciones cosméticas
y médicas tópicas que comprenden la tripsina, quimotripsina de
bacalao u otras peptidasas relacionadas descritas anteriormente; y
gel, crema o composición de supositorios.
La invención también proporciona (a) medios para
tratar o prevenir profilácticamente un síndrome relacionado con la
adhesión célula-célula o
célula-virus, que comprende administrar una cantidad
efectiva anti-adhesión de las tripsinas o
quimotripsinas de bacalao o peptidasas relacionadas efectivas para
remover o inactivar un componente de adhesión receptor o aceptor
viral o celular, que está involucrado en la adhesión
célula-célula o célula-virus, (b)
composiciones o substancias para usarse en tales métodos, (c)
composiciones farmacéuticas que contienen cantidades efectivas de
la enzima para usarse en tales métodos, y (d) usos de la
composición de enzima para la fabricación de un medicamento para
uso en tales métodos. De manera general, el síndrome involucra la
inflamación, artritis, coyunturas inflamadas, bursitis,
osteoartritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil,
artritis séptica, flebitis, eczema, sarampión, psoriasis, acné,
heridas, candidiasis y alteraciones inmunes, incluyendo
padecimientos autoinmunes, apoplejías, metástasis del tumor,
reacciones al rechazo del transplante o infecciones microbianas.
Preferiblemente, (a) el síndrome se selecciona del grupo que
consiste de infección microbiana, alteración inmune, fibrosis
cística, ateroesclerosis, cáncer, asma, apoplejía séptica, síndrome
de apoplejía tóxica, conjuntivitis, lesión por reperfusión y dolor,
y (b) un receptor de la superficie celular, asociado con el
síndrome de adhesión célula-célula o
célula-virus, seleccionado a partir de los
siguientes, en los cuales la tripsina de bacalao se ha mostrado
desdoblar, que consiste de CD4, CD8, CD54 (ICAM-1),
CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11 a/CD18, se
remueve o inactiva por la enzima administrada. Preferiblemente, una
infección microbiana se trata o previene y la infección microbiana
es herpes, VIH, hepatitis o infección de papiloma; una infección
que causa colitis o diarrea; una infección por Cándida, tal como
infección por Candida oral, vaginal o esofageal; una infección de
influenza o frío; una infección por Staphylococcus,
Streptococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Haemophilus, o E. coli;
una infección primaria o secundaria de leprosia; o una infección que
causa conjuntivitis o tuberculosis.
En una modalidad, la invención proporciona medios
para inhibir o prevenir profilácticamente la transmisión de un
microbio patogénico administrando las enzimas tripsina o
quimotripsina de bacalao. Preferiblemente, la enzima tripsina y/o
quimotripsina de bacalao es aplicada a la porción del cuerpo que
comprende la vía de entrada de transmisión primaria para el
microbio en cuestión. En una modalidad preferida, un atomizador, o
ungüento o lavado es aplicado a un orificio del cuerpo involucrado
en la actividad sexual, por ejemplo, para prevenir el VIH o
transmisión de hepatitis. En otra modalidad preferida, la peptidasa
tripsina de bacalao o relacionada, se aplica a las vías
respiratorias superiores, por ejemplo, vía un aerosol, para inhibir
o prevenir la transmisión de un virus de resfriado común, tal como
un rinovirus o coronavirus.
En un aspecto, el método de tratamiento
extra-corporalmente de un tejido, fluido corporal o
composición de células, remueve los componentes de adhesión celular,
reduce el rechazo inmune del tejido, fluido corporal o composición
de células que son transplantadas de un individuo a otro. En otro
aspecto, tales tratamientos remueven o inactivan los componentes de
adhesión celular encontrados en el tejido tratado, fluido corporal
o composición de células involucradas en una infección
microbiana.
En el tratamiento o prevención profilácticamente
de apoplejía séptica o síndrome de apoplejía tóxica, administrando
las peptidasas de tripsina de bacalao o relacionadas, las vías
apropiadas de administración incluyen administración sistémica.
Para infecciones vaginales asociadas con apoplejías, los flujos
vaginales, cremas o geles o supositorios, pueden ser usados como un
método de administración.
En el tratamiento o prevención profilácticamente
del dolor, inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis,
coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis
reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica,
fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis administrando
las tripsinas de bacalao o peptidasas relacionadas, las rutas de
administración apropiadas podrían incluir sin limitación, geles o
supositorios, en particular pero no limitado a hidrogeles que
contienen glicerol u otros polioles.
En el tratamiento o prevención de sarampión,
psoriasis, acné, eczema, incluyendo eczema seborréico facial o
eczema de las manos, cara, cuero cabelludo o cuello, infecciones
del prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras
tópicas infectadas, infecciones del ombligo de recién nacidos,
arrugas, cicatrices y queloides, exacerbación, verrugas y comezón
alérgica, hemorroides y similares, heridas, infecciones de heridas,
heridas y quemaduras, remoción de la piel muerta o desprendida a
partir de otro modo piel saludable para mejorar la apariencia de la
piel, una infección fúngica tal como sistémica, de piel, oral,
vaginal o esofageal fúngica, incluyendo por ejemplo, infección de
levadura, incluyendo una infección en uña fúngica e infecciones por
cándida y alteraciones inmunes que incluyen padecimientos
autoinmunes administrando las tripsinas, quimotripsinas de bacalao
o peptidasas relacionada a estas enzimas, las rutas apropiadas de
administración podrían incluir cremas, geles, o supositorios en
particular pero no limitado a hidrogeles que contienen glicerol u
otros polioles.
En consecuencia, es un objetivo de la presente
invención proporcionar una composición para el tratamiento del
dolor, inflamación, inflamación aguda o crónica, artritis,
coyunturas inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis
reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis séptica,
fibromialgia, lupus eritematoso sistémico, flebitis, sarampión,
psoriasis, acné, eczema, incluyendo eczema seborreico facial o
eczema de manos, cara, cuero cabelludo o cuello, infecciones del
prepucio, pie de atleta, infecciones de la fístula, úlceras tópicas
infectadas, infecciones del ombligo en recién nacidos, arrugas,
cicatrices, queloides, exacerbación, verrugas y comezón alérgica,
hemorroides y los similares, heridas, infecciones de heridas,
heridas y quemaduras, remoción de la piel muerta o desprendida de
otro modo piel saludable para mejorar la apariencia de la piel, una
infección fúngica tal como infección sistémica, de piel, oral,
vaginal o esofageal que incluye la infección de levadura, incluyendo
una infección fúngica de uña e infecciones por Cándida spp,
y alteraciones inmunes que incluyen padecimientos autoinmunes. Otro
objeto es proporcionar un método para le preparación de una
composición para ser usada para el tratamiento de dichos
padecimientos. Un tercer objeto es proporcionar un método para la
aplicación de dicha composición para el tratamiento de dichos
padecimientos, incluyendo niveles de dosis para aplicaciones
externas y tópicas. La invención por lo tanto, está basada en
composiciones que comprenden enzimas en donde no se han usado
previamente enzimas o una enzima mejor en donde las enzimas se han
usado.
Los objetivos anteriores son logrados usando una
composición que contiene una cantidad efectiva de tripsina y/o
quimotripsina de bacalao, la cual es capaz de mitigar el dolor,
inflamación, artritis, hinchazón, edema, eczema psoriasis,
dermatitis, sarampión y/o otros síntomas de los padecimientos
mencionados en la parte introductoria. Las enzimas de bacalao
pueden ser obtenidas a un rendimiento alto y en una manera
relativamente simple a partir de vísceras de bacalao. Se ha
encontrado que las enzimas de bacalao pueden ser purificadas en una
escala comercial en una manera relativamente directa con
rendimientos razonables. La tripsina de bacalao purificada contiene
tres isoenzimas principales de la enzima y la quimotripsina de
bacalao contiene dos isoenzimas principales. Una o todas las
isozimas pueden ser usadas para los propósitos de la invención.
Se ha establecido ahora que las enzimas tripsina
y quimotripsinas de bacalao de la invención, efectivamente remueven
o inactivan ciertas moléculas de adhesión a la superficie celular,
enterotoxinas bacterianas, citosina, mediadores de la inflamación y
metaloproteinasas de matriz (MMPs) tal como CD4, CD8, CD54
(ICAM-1), CD31, CD62L, CD102
(ICAM-2), CDlla/CD18, TNF-alfa,
IL-1 y MMP-9 sin afectar la
biodisponibilidad de la célula. Este fenómeno de inactivación o
desdoblamiento del sitio de adhesión de citosina, mediadores
inflamatorios, y metaloproteinasas de matriz, se cree proporciona
al menos una explicación parcial para la efectividad de las
tripsinas y quimotripsinas de bacalao contra muchas, aunque
probablemente no todas, las indicaciones contra las cuales las
tripsinas y quimotripsinas de bacalao son efectivas. Así, el
TNF-alfa está implicado en tanto artritis,
psoriasis, cáncer e inflamación (Véase Citosinas, Eds.,
Mire-Slui y Thrope, Academic Press, 1998, p
350).
Las tripsinas y quimotripsinas de bacalao parecen
ser más efectivas que otra proteasas convencionales en muchos
aspectos. Cuando un panel de 13 de las proteasas más activas en
este sentido se compara por su actividad hacia 16 de ciertas
moléculas de adhesión de la superficie celular mencionadas
anteriormente, enterotoxinas bacterianas, citosinas, mediadores
inflamatorios y MMPs, así como también su sensibilidad a la
inhibición del suero, la tripsina y quimotripsina de bacalao se
encuentran por ser casi las más activas. Las proteasas se
registraron 2 puntos por arriba de la actividad muy alta, 1 punto
por abajo de la actividad moderada y 0 puntos por muy bajo sin
actividad (registros inversos para la actividad inhibitoria del
suero para las proteasas). En base a este esquema de registro la
tripsina de bacalao del Atlántico registró 30 punto y la
quimotripsina de bacalao del Atlántico registró 29 puntos, mientras
la proteasa multifuncional de krill conocida registró 16 puntos. Las
proteasas de tripsina y quimotripsina de bovino se encontraron
carentes en este sentido. Además, las tripsinas y quimotripsinas de
bacalao son 2 a 20 veces más activas en sus contrapartes de bovino
cuando se usan los substratos cromogénicos pequeños para comparar
sus actividades (Ásgeirsson et al., Eur. J. Biochem.
180:85-94, 1989; Ásgeirsson y Bjarnason, Comp.
Biochem. Physiol. 99B:327-335- 94, 1991).
Las vísceras de bacalao son fuentes útiles para
las enzimas tripsina y quimotripsinas de bacalao de la invención.
Por ejemplo, las enzimas pueden ser extraídas en una escala
comercial a partir de vísceras de bacalao congeladas como se
describe anteriormente. La solución de extracto concentrado y
clarificado puede ser fraccionada opcionalmente por cromatografía de
intercambio fónico en escala comercial, preferiblemente un primer
paso de cromatografía de intercambio de cationes, seguido por un
paso de cromatografía de intercambio de aniones para enlazarse y
con ello, remover las serín-proteasas tales como
elastasa y colagenasa de serina. En un paso final y subsiguiente, la
tripsina de bacalao es purificada por cromatografía de afinidad de
escala comercial preferiblemente usando cromatografía en columna de
afinidad de p-aminobenzamidina, y quimotripsina por
cromatografía en columna de interacción hidrófoba preferiblemente
usando Fenil Sefarosa.
La tripsina de bacalao usada en la invención
puede ser desorbida de la matriz de afinidad aplicando condiciones
que desestabilizarán la interacción entre la enzima y el ligando de
afinidad.
Tales condiciones incluyen sales altas seguidas
por pH bajo, preferiblemente en 30% o más glicerol. El eluente de
la columna se deja fluir en una solución amortiguadora de
neutralización para estabilizar la tripsina de bacalao después del
paso de elución del ácido (Ásgeirsson et al., Eur. J.
Biochem. 180:85-94, 1989). La quimotripsina de
bacalao usada en la invención puede ser liberada por la columna de
Fenil Sefarosa aplicando condiciones que desestabilizarán la
interacción entre la enzima y la interacción ligando hidrófobo.
Tales condiciones incluyen contenido de glicerol alto en agua o
solución amortiguadora, preferiblemente 50% o más glicerol en agua o
solución amortiguadora (Ásgeirsson y Bjarnason, Com. Biochem.
Physiol. 99B:327-335-94, 1991). Por
estos métodos las enzimas tripsina y quimotripsina de bacalao con
una pureza en exceso de aproximadamente 90% se puede aislar. La
fracción de tripsina de bacalao así obtenida contiene 3 formas
principales de isoenzimas de tripsina de bacalao como se manifiesta
por electroforesis SDS, la cual proporciona un enfoque
isoeléctrico, de una banda, que muestra tres bandas y cromatografía
de cromatoenfoque la cual da tres picos asociados con las tres
isoformas de tripsina (Fig. 1). Al menos cuatro isozimas de
tripsina IV están adicionalmente incluidas en la fracción de
tripsina si la cromatografía de intercambio de aniones no se
emplea. Estas pueden ser separadas como subfracciones con
cromatografía de intercambio de aniones mono-Q o
DEAE.
Las serín-proteasas a partir de
otras fuentes diferentes del bacalao del Atlántico pueden ser
comparados con las enzimas de tripsina de bacalao del Atlántico
aislados para masa molecular, punto isoeléctrico, secuencia de
aminoácido, temperatura, estabilidad de pH, temperatura o pH máximo,
especificidad proteolítica y parámetros cinéticos, o para otras
propiedades de las enzimas de tripsina de bacalao del Atlántico
ejemplificadas en los ejemplos (Ásgeirsson et al., Eur.
J. Biochem. 180:85-94, 1989). La actividad de
la tripsina de bacalao puede ser medida usando el éster metílico de
arginina tirosina (TAME) como substrato. La tripsina de bacalao
aislada de la purificación de columna de afinidad
(90-100% de pureza) preferiblemente tendrá
actividad específica de al menos 140 U/mg a 25ºC y pH
8.1, comparado con 60 U/mg para la hidrolasa multifuncional
de krill. También la actividad tríptica puede ser medida usando
Cbz-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilida
(Cbz-GPR-pNA) como substrato,
proporcionando una actividad específica preferiblemente al menos
aproximadamente 100 U/mg. Además, cuando el
Bz-Arg-pNA se usa como substrato,
se obtienen constantes de eficiencia catalítica
(k_{cat}/K_{m})de 52, 20, y 7 4 s^{-1}mM^{-1} para la
tripsina de bacalao I, II, y III respectivamente, en comparación
con 3 s^{-1} mM^{-1} para la tripsina bovina (Ásgeirsson et
al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Las
diferencias similares se observan para la quimotripsina de bacalao y
quimotripsina bovina (Ásgeirsson y Bjarnason, Comp. Biochem.
Physíol. 99B:327-335, 1991).
La masa molecular de las tripsinas de bacalao es
de aproximadamente 24 kDa, mientras que sus puntos isoeléctricos
son 6.6, 6.2 y 5.5 para tripsina I, II y III respectivamente, y aún
inferior para isozimas de tripsina IV. Las secuencias de
aminoácidos de las isoenzimas de la tripsina de bacalao se pueden
expresar con la siguiente secuencia la cual contiene punto de
variabilidad debido a las isoformas múltiples:
I-V-G-G-Y-E-C-T-K/R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y/F-C-G-G-S-L-I-N-K/E-D/Q-W-V-V-S-A-A-H-C-Y-K-S-V-L-R-V-R-L-G-E-H-H-I-R-V-N-E-G-T-E-Q-Y/F-I-S-S-S-S-V-I/X-R-H-P-N-Y-S-S-Y-N-I-N/D-N-D-I-M-L-I-K-L-T-K/E-P-A-T-L-N-Q-Y-V-H-A-V-A-L-P-T-E-C-A-A-D-A-T-M-C-T-V-S-G-W-G-N-T-M-S-S-V-A/D-D-G-D-K-L-Q-V/C-L-N/S-L-P-I-L-S-H-A-D-C-A-N-S-Y-G-P-G-M-I-T-Q-S-M-F-C-A-G-Y-L-E-G-G-K-D-S-C-Q-G-D-S-G-G-P-V-V-C-N-G-V-L-Q-G-V-G-V-V-S-W-G-Y-G-C-A-E-R-D-H/N-P-G-V-Y-A-K-V-M/I/C-V-L-S-G-W-V-R-D-T-M-A-N/S-Y,
en donde X es cualquier aminoácido o no
aminoácido, y la tripsina I de bacalao tiene residuo K de
aminoácidos en la posición 9, mientras que las tripsinas II y III
de bacalao contienen R en esta posición (Gudmundsdottir et
al. 1993 y datos no publicados).
Generalmente, las isoenzimas de tripsina de
bacalao serán suficientemente estables de modo que al menos
aproximadamente 50% de la actividad de TAME es retenida después de
la incubación a 5ºC por 18 horas a pH 7.0 en una solución
amortiguadora que contiene 10 mM de cloruro de calcio. Sin embargo,
sólo aproximadamente 10% de la actividad de TAME es retenida
después de la incubación a 5ºC por 18 horas a pH 2.0 (Figura
2).
El pH óptimo de las tripsinas de bacalao para
TAME como substrato está en forma preferible entre aproximadamente
7.0 y 8.7 en forma más preferida aproximadamente 8.0 (Figura 3). Al
usar TAME como el substrato, el Km a aproximadamente pH 8.1 y 25ºC
en la presencia de cloruro de calcio 10 mM es preferiblemente en
forma aproximada 0.029 mM, 0.021 mM y 0.049 mM para tripsinas I, II
y III de bacalao respectivamente. En forma preferida, la tripsina de
bacalao tiene una temperatura máxima de actividad para TAME como
substrato entre 50 y 60ºC (Figura 4).
La tripsina de bacalao y enzimas de
quimiotripsina de la invención se administran tópicamente, en forma
oral, rectal, vaginal, por instalación (por ejemplo en el tracto
urinario o en fístulas), por la vía pulmonar por ejemplo por el uso
de un aerosol, por la aplicación de gotas para el ojo, o
sistémicamente, tal como parenteralmente, incluyendo, por ejemplo,
vía intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraarterial o
intravenosa. Las enzimas de bacalao se administran en solución o
combinadas con un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente
de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar. Para el modo de
administración oral, las enzimas de bacalao se usan en la forma de
tabletas, cápsulas, pastillas, gomas masticables, trozos, polvos,
jarabes, elíxires, suspensiones y soluciones acuosas, y semejantes.
Para la administración parenteral, las soluciones estériles de las
enzimas de bacalao están usualmente preparadas, y los valores de pH
de las soluciones se ajustan convenientemente y se amortiguan. Para
el uso intravenoso, la concentración total de los solutos se
deberán controlar para volver la preparación isotónica. Para la
administración ocular, los ungüentos o líquidos para gotas se puede
suministrar por sistemas de suministro ocular conocidos en la
técnica tal como aplicadores o goteros para ojos. Para la
administración pulmonar, los diluyentes y/o portadores se
seleccionan que en forma apropiada permitan la formación de un
aerosol. Para las administraciones tópicas, las enzimas de tripsina
de bacalao típicamente se administran en un hidrogel, que contiene
0 a 85% de glicerol, tal como aproximadamente 20% a 30% de glicerol
y posiblemente hasta 85% de glicerol.
Para tratamientos tópicos, una dosis adecuada de
las enzimas de tripsina de bacalao por intervalos de aplicación
desde aproximadamente 0.01 \mug/cm^{2} a en forma aproximada 1
mg/cm^{2}, preferiblemente de en forma aproximada 0.1
\mug/cm^{2} a aproximadamente 0.01 mg/cm^{2} (que usa por
ejemplo, aproximadamente 0.01 mg/ml de gel de enzima). Para
tratamientos sistemáticos, las dosificaciones generalmente serán
seleccionadas para mantener un nivel de suero de las enzimas de
tripsina de bacalao entre aproximadamente 0.1 mg/100 ml y en forma
aproximada 100 mg/100m1, de manera preferida entre aproximadamente
0.5 mg/100 ml y en forma aproximada 2.0 mg/100 ml. En una medición
alternativa de las cantidades de administración sistemática
preferidas, preferiblemente se usarán desde aproximadamente 0.1
mg/kg a en forma aproximada 10 mg/kg, de manera más preferida
aproximadamente 1 mg/kg. Para los tratamientos de tracto vaginal y
urinario, las soluciones de limpieza/instilación adecuadas de las
enzimas de tripsina de bacalao generalmente tendrán concentraciones
desde aproximadamente 1 \mug/ml a en forma aproximada 15 mg/ml,
en forma preferible desde aproximadamente 100 \mug/ml a en forma
aproximada 3 mg/ml. Para todos los tratamientos, la composición de
enzima generalmente será aplicada desde aproximadamente 1 a en
forma aproximada 10 veces por día, de manera preferible desde
aproximadamente 2 a en forma aproximada 5 veces por día. Estos
valores, por supuesto, variará con un número de factores incluyendo
el tipo y severidad de la enfermedad, y la edad, peso y condición
médica del paciente, como se reconocerá por aquellos expertos en el
campo médico. Se cree que las dosis substancialmente superiores se
pueden usar sin efecto adverso substancial.
Para el sanado de heridas, las enzimas de
tripsina de bacalao se aplican preferiblemente de manera más
frecuente que simplemente en el periodo de tiempo en el cual el
sanado es primero vendado. Preferiblemente, la tripsina de bacalao
se aplica al menos aproximadamente cada vez que se cambie el vendado
de la herida. Las enzimas de tripsina de bacalao también se pueden
aplicar al menos aproximadamente un día si y un día no, en forma
más preferida, todos los días, o algunas veces por día. Para
situaciones dermatológicas tales como eczema, psoriasis y
semejante, la tripsina de bacalao y/o hidrogel de enzima de
quimiotripsina se aplica preferiblemente todos los días, en forma
más preferida dos veces por día. Para inflamación aguda o crónica,
artritis, articulaciones inflamadas, bursitis, osteoartritis, y
semejantes, las enzimas de tripsina de bacalao se aplican
preferiblemente todos los días en forma más preferida dos veces al
día.
Como se ilustra en muchos de los ejemplos
clínicos posteriormente, el hidrogel de enzima de bacalao de la
invención es efectivo para tratar o prevenir las condiciones
inflamatorias. Típicamente, las inflamaciones se reducen a niveles
aceptables dentro de 2 a 3 días a partir de la iniciación del
tratamiento. Los ejemplos también ilustran que la enzima es
efectiva para aliviar el dolor. El alivio del 5 dolor
frecuentemente se reporta dentro de 20 minutos a 2 horas del inicio
del tratamiento. El alivio del dolor no se acompaño por pérdida de
sensibilidad en el tejido tratado. El alivio del dolor más completo,
de modo que el paciente sólo sufre ligero dolor o una sensibilidad
de poco dolor, frecuentemente se experimenta dentro de 1 día del
inicio del tratamiento.
Generalmente, las enzimas de bacalao de acuerdo
con la invención se administrarán en una cantidad efectiva. Una
cantidad efectiva es una cantidad efectiva de ya sea (1) reducir
los síntomas de la enfermedad que se desee tratar, (2) inducir un
cambio farmacológico relevante para tratar la enfermedad que se
desee tratar, (3) inhibir o prevenir la infección o
re-infección por un agente infeccioso, o (4)
prevenir la aparición de una enfermedad no infecciosa (por ejemplo
una enfermedad tratable desbloqueando un fenómeno de adhesión de
células). Para el tratamiento de heridas, en un aspecto, una
cantidad efectiva incluye una cantidad la cual, si se aplica
regularmente, previene la ocurrencia de infección. En otro aspecto,
para el sanado de heridas, una cantidad efectiva incluye una
cantidad efectiva para reducir el tiempo promedio que toma para
sanar una herida.
Numerosos métodos para determinar el porcentaje
de homología de proteínas, son conocidos en la técnica. Un método
preferido es usar la versión 6.0 del programa de computadora GAP
para hacer comparaciones de secuencias. El programa está disponible
de la University of Wisconsin Genetics Computer Group y utiliza el
método de alineamiento de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48,
443 (1970) como se revisa por Smith and Waterman, Adv. Appl. Math.,
2, 482 (1981). Otro método conveniente usa el programa de
computadora FASTA.
La invención se ilustrará ahora en forma
adicional en los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos
en esta:
La Figura 1 muestra una cromatógrafo
cromatoenfocado de la fracción de tripsina de bacalao del Atlántico
fuera del paso de purificación de la columna de afinidad de
aminobenzamidina. La fracción eluida de la columna para
aminobenzamidina fue gel filtrado en una columna Sephadex
G-25 equilibrada en 25 mM de monoetanolamina/ácido
acético pH 9.4 que contiene cloruro de calcio 10 mM y
subsecuentemente se aplica a una columna de material de intercambio
iónico PBE-94 (Pharmacia) equilibrado en la misma
solución amortiguadora. La columna se eluyó entonces con Polybuffer
94 (ajustado a pH 5.5 con ácido acético) que contiene 10 mM de
cloruro de calcio. Se observó la actividad para el substrato TAME
(círculos rellenos), absorbencia a 280 nm (círculos abiertos) y pH
(diamantes abiertos). La primera fracción eluida se llamó tripsina
I, la segunda fracción tripsina II y la tercera fracción tripsina
III;
La Figura 2 ilustra el efecto de pH en la
estabilidad de tripsina de bacalao del Atlántico purificada por
para aminobenzamidina como se mide por la actividad de TAME
residual después de la incubación a varios valores de pH y dos
periodos de tiempo diferentes. Las muestras de tripsina de bacalao
del Atlántico se incubaron a 5ºC por 30 minutos (círculos abiertos)
y 18 horas (cuadros cerrados) a valores de pH variantes. La
actividad residual para el substrato de TAME se midió
subsecuentemente a pH 8.1 y 25ºC;
La Figura 3 muestra la dependencia de pH de la
actividad de tripsina de bacalao del Atlántico purificada por
para-aminobenzamidina como se midió usando el
substrato TAME. Las soluciones amortiguadoras usadas a una
concentración final 0.1 M fueron acetato (pH
3.0-5.9), hepes/HCl(pH
6.0-8.0) y glicinato (pH 8.3-9.0)
que contienen todos 10 mM de cloruro de calcio; y
La Figura 4 muestra la dependencia de temperatura
de la actividad de tripsina I de bacalao del Atlántico comparado
con la actividad de tripsina de bovino medida usando el substrato
TAME. Las enzimas se adicionaron a una cubeta con termostato
precalentada y después de un periodo de equilibrio corto la
velocidad promedio de hidrólisis se determinó durante los
siguientes 3 minutos.
Aproximadamente 100 kg de víscera de bacalao
congelada se descongelan y adicionan a un volumen de cuatro veces
de agua potable fría en un tanque de extracción y el pH se ajusta a
pH 8 a 9 con una solución de hidróxido de sodio. La mezcla se agitó
por aproximadamente 2-6 horas por 0 a 5ºC. Después
de un corto periodo de sedimentación cruda (aproximadamente 30
minutos) el extracto acuoso se extrajo de la víscera insoluble
remanente con una bomba y se colectó en un tanque de sedimentación.
El extracto acuoso se dejó permanecer en el tanque de sedimentación
enfriada para sedimentar por aproximadamente 24 a 60 horas. El
sobrenadante se decantó del tanque de sobrenadante a un tanque de
mantenimiento usando una bomba. El sobrenadante se concentró 10 a 20
veces por ultrafiltración y se diafiltró a un nivel aceptable de
resistencia iónica con conductividad por debajo de aproximadamente
3 mS/cm. Aproximadamente se obtuvieron 1015 litros de concentrado
de proteína ultrafiltrada y
diafiltrada.
diafiltrada.
Aproximadamente 10 litros de concentrado
ultrafiltrado y diafiltrado como se obtuvo en el Ejemplo 1, se
aplicó a una serie conectada continua de columnas para
cromatografía empacadas de aproximadamente 1 litro, la primera
contiene una resina de intercambio catiónico de flujo rápido de CM
(Pharmacia, Suecia), la segunda una resina de intercambio aniónico
de flujo rápido de DEAE (Pharmacia, Suecia) y la tercera un ligando
de afinidad de paminobenzamidina acoplado a una resina de sefarosa
(Pharmacia, Suecia). Las columnas se
pre-equilibraron con aproximadamente 10 volúmenes
de columna de 25 mM de solución amortiguadora de Tris de pH 7.8,
que contiene 2.5 mM de cloruro de calcio (solución amortiguadora
A). El producto concentrado se bombeó en las columnas a una
velocidad de flujo de aproximadamente 100 ml por minuto. Cuando la
aplicación de la solución concentrada en las columnas se completó,
el material residual se lavó fuera del sistema de columnas
continuas con aproximadamente 8 litros de solución amortiguadora
A.
Después de que este lavado se completó, la
columna de afinidad de p-aminobenzamidina se
desconectó de las otras columnas y se lavó con aproximadamente 5
volúmenes de columna de una solución alta en sal de 25 mM de
solución amortiguadora Tris pH 7.5 que contienen 0.5 M de NaCl y 2.5
mM de cloruro de calcio. Las tripsinas de bacalao se desorbieron
entonces a partir del ligando de afinidad y se eluyeron fuera de la
columna con una solución ácida de 25 mM de ácido acético pH 3.2 que
contiene 10 mM de cloruro de calcio y 30% de glicerol. La fracción
de tripsina de bacalao se colectó en una solución amortiguadora
neutralizante a 200 mM de Tris pH 8.5 que contiene 30% de
glicerol.
La preparación de tripsina de bacalao purificada
fue homogénea por electroforesis de SDS PAGE y cromatografía FPLC
Mono Q y mostró las tres bandas de isozima de tripsina en enfocado
isoeléctrico. La preparación de la enzima tuvo una actividad
específica de aproximadamente 100 U/mg usando a
Cbz-GPR-pNA como substrato como se
describió previamente. La preparación purificada fue esterilizada
por filtro a través de un filtro de 0.22 micras y se almacenó
congelada a aproximadamente -20ºC.
Aproximadamente 10 litros de concentrado
ultrafiltrado y diafiltrado como se obtuvieron en el Ejemplo 1, se
aplicaron a un ligando de afinidad de paminobenzamidina acoplada a
una resina de sefarosa (Pharmacia, Suecia). La columna se
pre-equilibró con aproximadamente 10 volúmenes de
columna de 25 mM de solución amortiguadora Tris de pH 7.8, que
contiene 2.5 mM de cloruro de calcio (solución amortiguadora A). El
concentrado se bombeó en la columna a una velocidad de flujo de
aproximadamente 100 ml por minuto. Cuando la aplicación de la
solución concentrada en la columna se completó, el material residual
se lavó fuera de la columna con aproximadamente 8 litros de
solución amortiguadora A.
La columna de afinidad se lavó subsecuentemente
con aproximadamente 5 volúmenes de columna de una solución
altamente salina de 25 mM de solución amortiguadora Tris pH 7.5 que
contiene 0.5 M de NaCl y 2.5 mM de cloruro de calcio. Las tripsinas
de bacalao se desorbieron entonces a partir del ligando de afinidad
y se eluyeron fuera de la columna con una solución ácida de 25 mM
de ácido acético pH 3.2 que contiene 10 mM de cloruro de calcio y
30% de glicerol. La fracción de tripsina de bacalao se colectó en
una solución amortiguadora neutralizante de 200 mM de Tris pH 8.5
que contiene 30% de glicerol, y contiene aproximadamente 5 a 6 g
de
tripsina.
tripsina.
La preparación de tripsina de bacalao purificada
fue homogénea por electroforesis de SDS PACE y mostró las tres
bandas de isozima de tripsina en enfoque isoeléctrico. Una fracción
menor (<5%) podría ser preparada por cromatografía FPLC Mono Q
subsecuente y se identificó como al menos cuatro isoenzimas
adicionales; tripsina IVa, IVb, IVc, y IVd. La preparación de
enzimas tuvo una actividad específica de aproximadamente 100 U/mg
que usa para Cbz-GPRpNA como substrato como se
describió previamente. La preparación purificada se esterilizó por
filtro a través de un filtro de 0.22 micras y se almacenó por
congelamiento a aproximadamente -20ºC.
La preparación de tripsina de bacalao purificada
del Ejemplo 2, se mezcló con gel hidrocoloide que comprende 0.8%
peso/volumen de Carbomero 940, 30% de glicerol y 0.08% de
paraoxibenzoato. La preparación de tripsina de bacalao se mezcló en
una proporción 1:1 con el hidrogel para dar una concentración final
de 1 unidad de enzima por mg (U/mg) de la mezcla de enzima de gel
final (el ungüento hidrogel de la enzima), la unidad de enzima es
determinada usando Cbz-GPR-pNA como
substratos como se describe previamente. Así, el ungüento hidrogel
de la enzima contiene aproximadamente 0.01 mg/ml, o 1 U/ml de las
enzimas de tripsina de bacalao, 0.4% de Carbomero 940, 20% de
glicerol y 0.04% de paraoxibenzoato. En lo siguiente, este ungüento
de hidrogel de enzima es referido como Penzyma 100.
Diecisiete individuos con osteoartritis, algunos
con síntomas agudos o muy severos, se trataron con el ungüento de
hidrogel de la enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de enzima
de aplicó unas ves a dos veces por día, siempre una vez en la noche
antes de retirarse en la cama y en muchos casos también en la
mañana. Aproximadamente 5 mililitros del gel de enzima se aplicó en
cada área afectada, tal como rodillas, cadera o ambas manos.
Cantidades más grandes pueden ser aplicadas en casos severos. El
gel se dejó secar por aproximadamente 10 a 30 minutos, dependiendo
de la cantidad aplicada, el tiempo disponible y las necesidades y
requerimientos del paciente. Este secado se puede acelerar por el
uso de un dispositivo de bombeo de aire tal como una secadora de
cabello. Todos estos pacientes experimentaron alivio de los
síntomas dentro de una semana, la mayoría de ellos dentro de 2 a 4
días. El paciente No. 71 fue incapaz de comenzar a subir escaleras
antes del tratamiento pero no tuvo problemas en el progreso después
del tratamiento. Estos resultados están resumidos en la siguiente
tabla
5:1.
5:1.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Unos cuantos de los pacientes (Nos. 19 y 21) han
sido capaz de discontinuar el tratamiento y así parecen haber
disfrutado el alivio de largo término o permanente de la
enfermedad, pero la mayoría de ellos mantienen los síntomas bajo
control con uso constante o intermitente de la Penzyma 100.
Ocho individuos con tendinitis, algunos con
síntomas muy severos que causan problemas con dormir en la noche,
se trataron con el ungüento de hidrogel de enzima (Penzyma 100) del
Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó tópicamente en el área
afectada una vez a dos veces por día, aproximadamente 5 a 10
mililitros en cada área afectada, dependiendo del tamaño del área.
El gel se dejó secar por aproximadamente 10 hasta 30 minutos,
dependiendo de la cantidad aplicada, tiempo disponible y las
necesidades y requerimientos del paciente. Todos estos pacientes
experimentaron alivio de los síntomas dentro de dos semanas, la
mayoría de ellos dentro de 2 a 4 días, pero otros, también más
largo, especialmente aquellos con tendinitis del codo (codo de
tenista o codo de golfista). Estos resultados se resumen en la
siguiente Tabla 6.1:
Todos estos pacientes han disfrutado el alivio
permanente de la condición y han descontinuado el tratamiento.
Dos pacientes que sufren de fibromialgia severa
se trataron con el ungüento hidrogel de enzima (Penzyma 100) del
Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó tópicamente en el área
afectada dos veces por día, aproximadamente 5 a 10 mililitros en
cada área afectada, dependiendo del tamaño del área. El gel se dejó
secar por aproximadamente 10 hasta 30 minutos, dependiendo de la
cantidad aplicada, tiempo disponible y las necesidades y
requerimientos del paciente. Ambos pacientes (No. 78,
F-50 y No. 92, F-53), experimentaron
alivio de los síntomas dentro de tres semanas. Ambos usan el
tratamiento del gel de enzima cuando reaparecen los dolores.
Cinco pacientes con artritis reumatoide, algunos
con síntomas muy severos, se trataron con el ungüento de hidrogel de
la enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó
tópicamente en el área afectada usualmente dos veces por día,
aproximadamente 3 a 5 mililitros en cada área afectada, dependiendo
del tamaño del área. El gel se dejó secar por aproximadamente 15
minutos, dependiendo del espesor del gel aplicado. Este periodo de
secado se puede acortar por el uso de dispositivo de bombeo de aire
tal como secadora de cabello. Todos los cinco pacientes
experimentaron alivio de los síntomas dentro de 5 días. Estos
resultados se resumen en la siguiente tabla 8.1:
La paciente No. 61 no pudo irse de la cama en la
mañana y dirigirse sin asistencia antes del tratamiento, pero fue
capaz de progresar en sí misma después del tratamiento. La paciente
No. 94 tiene dolor en el tórax cuando respira debido a una
complicación de la efusión pleural. Ella se alivió de estos síntomas
después de 3 días de tratamiento con la Penzyma 100. Todos estos
pacientes mantuvieron los síntomas bajo el control con uso constante
o intermitente del tratamiento del gel de enzima.
Cinco pacientes con varias formas de flebitis,
tales como tromboflebitis, flebotrombosis, síndrome
post-flebítico crónica y venas varicosas, en todos
los casos en las pantorrillas, algunos con síntomas muy severos que
causan dolor con dificultad para dormir, se trataron con el
ungüento hidrogel de la enzima (Penzyma 100) del Ejemplo 4. El gel
de la enzima se aplicó tópicamente en la pantorrilla al menos una
vez por día, es decir, en la tarde y en algunos casos en la mañana,
aproximadamente 5 mililitros en cada pantorrilla. El gel se dejó
secar por aproximadamente 15 minutos. Todos los cinco pacientes
experimentaron alivio de los síntomas dentro de unas cuantas
semanas. Estos resultados están resumidos en la siguiente tabla
9:1.
La paciente No.2 se diagnosticó con síndrome
postflebítico crónico. La paciente No. 68 no duerme adecuadamente
en la noche debido al dolor si ella no se aplica el gel antes de la
hora de dormir. Todos estos pacientes mantuvieron los síntomas bajo
control con uso constante o intermitente del tratamiento de gel de
enzima.
Seis pacientes con psoriasis, algunos casos
crónicos con síntomas muy severos, se trataron con el hidrogel de la
enzima del Ejemplo 4, pero en la mayoría de los casos de psoriasis,
se usó una composición de hidrogel designada Penzyma 200 con el
doble de la concentración de tripsina de bacalao o 2 U/mg, puesto
que la Penzyma 100 (1U/ml de tripsina de bacalao), proporciona
resultados preferentemente lentos y en algunos casos inciertos. Los
pacientes reivindicaron grandes mejoramientos en el tratamiento con
el gel que contiene el contenido de tripsina de bacalao superior
(Penzyma 200) comparado con el gel que contiene el contenido de
tripsina inferior (Penzyma 100). Una combinación de tripsina de
bacalao y quimotripsina de bacalao, con una concentración de 1 U/ml
de cada enzima, designada Penzyma 200-C, también se
sometió a prueba, y dio resultados positivos similares como la
Penzyma 200. El gel de enzima se aplicó una vez a dos veces por día,
siempre una vez en la tarde antes de irse a dormir, después de lo
cual el gel de enzima se dejo en la piel durante la noche y en
algunos casos en la mañana después del baño y antes de vestirse. El
gel se aplica como una capa o película delgada y toma
aproximadamente 5 minutos para secar. Todos los seis pacientes
experimentaron alivio de los síntomas dentro de dos semanas. El
tratamiento fue en algunos casos suplementado con métodos
auto-ayuda convencionales, tales como baños o
tratamientos con luz solar. Los resultados se resumen en la
siguiente Tabla 10.1:
La Paciente No. 3 ha sufrido de psoriasis crónica
y muy severa, desde la edad de 5 años. Ella probó todos los
tratamientos disponibles con resultados limitados. El tratamiento
con la Penzyma 200 ha proporcionado solamente al alivio de largo
término de los síntomas para ella. Ella reivindica que el alivio de
los síntomas es notable después de 4 días y el alivio total se
abarca dentro de 2 a 3 semanas de tratamiento con una aplicación por
día antes de irse a dormir.
El paciente No. 69, también con psoriasis
crónica, ha experimentado la desaparición de algunas manchas. Todos
estos pacientes mantienen los síntomas bajo control con tratamiento
del gel de enzima constante o intermitente.
Dos individuos (paciente Nos. 25,
F-16 y No. 63, M17) que sufren de acné y uno que
sufre de exacerbación (No. 64, M-22), se trataron
con el ungüento de hidrogel de tripsina de bacalao (Penzyma 100) del
Ejemplo 4. El gel de enzima se aplicó tópicamente en el área
afectada (cara) una vez por día, aproximadamente 5 mililitros cada
vez. El gel se dejó secar por aproximadamente 15 minutos después de
lo cual se dejó en la piel. Todos los tres individuos experimentaron
alivio total de los síntomas dentro de dos semanas, y se usó
solamente el tratamiento de gel de enzima ocasionalmente cuando los
síntomas comenzaron a aparecer.
Dieciocho pacientes que sufren de eczema,
dermatitis y varias otras condiciones de la piel, se trataron con el
ungüento hidrogel de tripsina de bacalao (Penzyma 100) del Ejemplo
4. El gel de la enzima se aplicó una vez por día (ocasionalmente dos
veces), usualmente en el atardecer antes de retirarse a la cama. El
gel se aplicó como una capa o película delgada. El secado ocurre
después de aproximadamente 5-10 minutos. Una
cantidad superior puede aplicarse en casos severos. Este secado
puede ser acelerado por el uso de un dispositivo de bombeo de aire
tal como un secador de pelo. Todos estos pacientes experimentaron
alivio de los síntomas dentro de una semana, la mayoría de ellos en
2 a 4 días. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla
12.1:
Algunos de los pacientes (Nos. 40, 41, 48, 66,
50, 20, 46, 87, 97, 100) han sido capaces de discontinuar el
tratamiento y así parecen haber disfrutado alivio permanente o de
largo término del padecimiento, pero otros mantienen los síntomas
bajo el control con uso constante o intermitente de la Penzyma
100.
Dos individuos (pacientes Nos. 44,
M-4 y 85, M-9) con quemaduras, se
trataron con el ungüento de hidrogel de tripsina de bacalao (Penzyma
100) del Ejemplo 4. Otros dos pacientes (No. 62,
F-47 y 96, M-70), se trataron por
heridas post-operacionales que no podrían sanar. El
gel de enzima se aplicó tópicamente en las heridas al menos dos
veces por día y se dejaron en el área afectada. Todos los cuatro
individuos experimentaron sanación buena y libre de complicación de
sus heridas dentro de una a tres semanas.
Para cada uno de los ejemplos
5-13, el hidrogel de la enzima tripsina se
substituyó con un hidrogel de enzima quimotripsina de bacalao o un
hidrogel que contiene una mezcla de tripsina de bacalao y
quimotripsina de bacalao.
Claims (26)
1. Una serín-proteinasa de
pescado que puede obtenerse de bacalao para usarse como un
medicamento.
2. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona del
grupo que consiste en una tripsina, una quimotripsina y cualquier
mezcla de las mismas.
3. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 1 o 2, que no es multifuncional.
4. Una proteinasa de conformidad con cualquiera
de las reivindicaciones 1-3, que se deriva de
bacalao del Atlántico.
5. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 1, que es una tripsina derivada de bacalao del
Atlántico.
6. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 5, que se selecciona del grupo que consiste en
tripsina I, tripsina II, tripsina III, tripsina IV a, tripsina IV b,
tripsina IV c, y tripsina IV d.
7. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 4, que se selecciona del grupo que consiste en
quimotripsina A y quimotripsina B.
8. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 1, que es una tripsina que tiene al menos, 90% de
homología de secuencia de aminoácido con cualquiera de la tripsina
I, tripsina II, tripsina III, y tripsina IV aisladas a partir de
bacalao del Atlántico.
9. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 5, que es una quimotripsina que tiene al menos 90% de
homología de secuencia de aminoácido con cualquiera de quimotripsina
A y quimotripsina B aislada de bacalao del Atlántico.
10. Una proteinasa de conformidad con la
reivindicación 1, para usarse como un medicamento para tratar y/o
prevenir un padecimiento en un humano o un animal, dicho
padecimiento se selecciona del grupo que consiste de dolor,
inflamación agua, inflamación crónica, artritis, coyunturas
inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis
reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus
eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, sarpullido, psoriasis,
acné, eczema, eczema seborréico facial, eczema de las manos, cara o
cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones de la
fístula, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en
recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, exacerbación,
verrugas y comezón alérgica, hemorroides, heridas, infecciones de
heridas, heridas de quemaduras, una infección fúngica y una
alteración inmunológica incluyendo un padecimiento auto inmune.
11. Un método para la remoción de la piel muerta
o desprendida de piel de otro modo saludable mediante el uso de una
proteinasa de conformidad con la reivindicación 1.
12. Uso de una serín-proteinasa
de pescado que puede obtenerse de bacalao en la fabricación de un
medicamento para tratar y/o prevenir un padecimiento en un humano o
animal, dicho padecimiento se selecciona del grupo que consiste en
dolor, inflamación aguda, inflamación crónica, artritis, coyunturas
inflamadas, bursitis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis
reumatoide juvenil, artritis séptica, fibromialgia, lupus
eritematoso sistémico, flebitis, tendinitis, sarpullido, psoriasis,
acné, eczema, eczema seborréico facial, eczema de las manos, cara o
cuello, infecciones del prepucio, pie de atleta, infecciones de la
fístula, úlceras tópicas infectadas, infecciones del ombligo en
recién nacidos, arrugas, cicatrices, queloides, exacerbación,
verrugas y comezón alérgica, hemorroides, heridas, infecciones de
heridas, heridas de quemaduras, una infección fúngica y una
alteración inmunológica incluyendo un padecimiento auto inmune.
13. Uso de una serín-proteinasa
de pescado que puede obtenerse de bacalao para remover la piel
muerta o desprendida de piel de otro modo saludable.
14. Uso de una serín-proteinasa
de pescado que puede obtenerse de bacalao en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o prevención de un padecimiento
causado por un organismo patogénico seleccionado del grupo que
consiste en un virus, una bacteria, un hongo, un parásito y un
protozoario, estando la enfermedad seleccionada del grupo de una
infección del virus del herpes (por ejemplo HSV-1,
HSV-2, herpes zoster o infección de herpes genital),
VIH, hepatitis, influenza, coronavirus, citomegalovirus, rinovirus,
o infección del virus del papiloma; una infección que causa un
padecimiento gastrointestinal tal como úlcera o diarrea; una
infección fúngica tal como una infección fúngica sistémica de la
piel, oral, vaginal o esofageal, incluyendo por ejemplo infección de
levadura, incluyendo una infección fúngica de uña e infecciones por
cándida; infecciones microbianas del ojo, infección por
Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp.,
Pseudomonas spp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus spp, Chlamydia
spp., syphilis infecciones por E. coli, e infecciones
bacterianas que causan cancroides.
15. Uso de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, en donde la
serín-proteinasa de pescado es una proteinasa de
conformidad con cualquiera de las reivindicaciones
2-9.
\newpage
16. Una composición farmacéutica, que comprende
una serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse
de bacalao.
17. Una composición de conformidad con la
reivindicación 16, en la que la serín-proteinasa de
pescado es una proteinasa de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 2-11.
18. Una composición de conformidad con la
reivindicación 16 o 17, que es una composición para uso tópico.
19. Una composición de conformidad con la
reivindicación 18, que es un hidrogel.
20. Una composición de conformidad con la
reivindicación 19, que además comprende un alcohol polivalente que
incluye glicerol.
21. Una composición de conformidad con la
reivindicación 16, que además comprende un compuesto
farmacéuticamente activo.
22. Una composición cosmética, que comprende una
serín-proteinasa de pescado que puede obtenerse de
bacalao.
23. Una composición de conformidad con la
reivindicación 22, en la que la serín-proteinasa de
pescado es una proteinasa de conformidad con cualquiera de las
reivindicaciones 2-11.
24. Una composición de conformidad con la
reivindicación 22, que es un hidrogel.
25. Una composición de conformidad con la
reivindicación 22, que además comprende un alcohol polivalente que
incluye glicerol.
26. Una composición de conformidad con la
reivindicación 22, que comprende un compuesto adicional
cosméticamente activo.
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