PL202532B1

PL202532B1 - Proteinaza serynowa uzyskana z dorsza, zastosowanie proteinazy serynowej uzyskanej z dorsza oraz kompozycja farmaceutyczna i kompozycja kosmetyczna zawierające proteinazę serynową uzyskaną z dorsza

Info

Publication number: PL202532B1
Application number: PL352318A
Authority: PL
Inventors: Jon Bragi Bjarnason
Original assignee: Jon Bragi Bjarnason
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2009-07-31
Also published as: ATE278417T1; KR20020025082A; NO20016159L; CN1356907A; DK1202743T3; CN1197617C; EP1202743A2; PT1202743E; JP2003502071A; NO327283B1; IS2782B; RU2264824C2; NZ516632A; US20020141987A1; CA2377357C; MXPA01013246A; CA2377357A1; EP1202743B1; WO2000078332A3; NO20016159D0

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest proteinaza serynowa uzyskana z dorsza, zastosowanie proteinazy serynowej uzyskanej z dorsza oraz kompozycja farmaceutyczna i kompozycja kosmetyczna zawierające proteinazę serynową uzyskaną z dorsza. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy wyodrębnionych z dorsza atlantyckiego trypsyny i/lub chymotrypsyny lub homologicznych proteinaz serynowych oraz ich zastosowania w kompozycjach farmaceutycznych lub kosmetycznych.

Dziedzina wynalazku i stan techniki

W patentach US Nr 4,801,451 i 4,963,491 opisano mieszaninę egzo- i endopeptydaz wyodrę bnionych z kryla antarktycznego (Euphasia superba) i zastosowanie tej mieszaniny jako roztworu czyszczącego. Ponadto w patencie US Nr 4,801,451 przedstawiono zastosowanie podobnych enzymów do usuwania z ran materiału obcego i martwej tkanki. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 85/04809 ujawniono zastosowanie enzymów z kryla jako środka na poprawienie trawienia. W EP-A1-0170115 przedstawiono zastosowanie enzymów kryla do upł ynniania skrzepów.

Jednakże opisany we wszystkich tych dokumentach materiał biologiczny jest materiałem oczyszczonym jedynie w niewielkim stopniu lub niedostatecznie scharakteryzowanym. Natomiast produkt odpowiedni do zastosowania w farmacji, powinien zawierać oczyszczone peptydazy lub mieszaninę oczyszczonych peptydaz. Ponadto, żaden z dokumentów ze stanu techniki nie obejmuje zastosowania oczyszczonych peptydaz lub mieszaniny oczyszczonych peptydaz do leczenia np. artretyzmu, stanów zapalnych ścięgien, zapalenia kaletki, zapalenia kości, reumatoidalnego zapalenia kości, posocznicowego zapalenia stawów, zapalenia żył, egzemy, wyprysków, łuszczycy czy chorób zakaźnych.

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 96/24371 ujawniono zastosowanie wielofunkcyjnego enzymu proteolitycznego pochodzącego z kryla i, pochodzących ze skorupiaków i ryb, enzymów proteolitycznych strukturalnie podobnych do wielofunkcyjnego enzymu pochodzącego z kryla antarktycznego. Zg ł oszenie to dotyczy również sposobów oczyszczania wielofunkcyjnego enzymu z kryla oraz farmaceutycznych, kosmetycznych, i innych zastosowań tego enzymu. Zgodnie ze wspomnianym zgłoszeniem, strukturalne podobieństwo wielofunkcyjnego enzymu pochodzącego z kryla antarktycznego jest okreś lone jako przynajmniej 70% homologia z wielofunkcyjną hydrolazą pochodzącą z kryla. Natomiast niniejszy wynalazek dotyczy enzymów, takich jak pochodzących z dorsza, trypsyny i chymotrypsyny, które wykazują mniejszą niż 70% homologię z wielofunkcyjnym enzymem pochodzącym z kryla. Ponadto, pochodzące z dorsza, trypsyna i chymotrypsyna nie są enzymami wielofunkcyjnymi. Ich aktywność zasadniczo obejmuje aktywność odpowiednio proteazy trypsynowej i proteazy chymotrypsynowej.

Głównym celem obecnego wynalazku jest przedstawienie zastosowania trypsyny i chymotrypsyny z dorsza w kompozycjach farmaceutycznych lub lekach do miejscowego podawania, do leczenia chorób i zaburzeń oraz w kosmetyce.

Zastosowanie miejscowe trypsyny i chymotrypsyny z dorsza w leczeniu chorób wewnętrznych, nie uwzględniając działania enzymu, który dostał się do organizmu przez otwarte rany lub tkankę śluzówki, okazało się zaskakująco skuteczne, jak opisano w załączonych przykładach. Przeciwnie do wiedzy dostępnej w stanie techniki, zgodnie z którą znane jest podobne zastosowanie innych enzymów, np. wielofunkcyjnej hydrolazy z kryla, którą w terapii bólu miejscowego podaje się przez iniekcję. Niniejszy wynalazek obejmuje ponadto zastosowanie pochodzącej z dorsza trypsyny i chymotrypsyny w kompozycjach farmaceutycznych lub lekach, w których następuje transport przez skórę innych białkowych lub nie białkowych związków aktywnych, zapewniając miejscowe dostarczanie enzymu w terapii chorób i zaburzeń wewnętrznych. Stwierdzono, ż e proteinazy serynowe według wynalazku są bardzo skuteczne w zwalczaniu różnych chorób.

Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest proteinaza serynowa uzyskana z dorsza do zastosowania jako lek. Korzystnie proteinaza jest wybrana z grupy obejmującej trypsynę, chymotrypsynę lub jakąkolwiek ich mieszaninę. Korzystnie proteinaza jest enzymem jednofunkcyjnym. W korzystnym rozwiązaniu proteinaza pochodzi z dorsza atlantyckiego. W innym korzystnym rozwiązaniu proteinaza jest trypsyną pochodzącą z dorsza atlantyckiego, korzystniej proteinaza jest wybrana z grupy obejmującej trypsynę I, trypsynę II, trypsynę III, trypsynę IVa, trypsynę IVb, trypsynę IVc i trypsynę IVd albo z grupy obejmującej chymotrypsynę A i chymotrypsynę B.

PL 202 532 B1

W innym korzystnym rozwią zaniu proteinaza trypsyną o przynajmniej 90% homologii sekwencji aminokwasowej z którąkolwiek z pochodzących z dorsza atlantyckiego trypsyną I, trypsyną II, trypsyną III i trypsyną IV.

Korzystnie proteinaza jest chymotrypsyną o przynajmniej 90% homologii sekwencji aminokwasowej z pochodzącymi z dorsza atlantyckiego chymotrypsyną A i chymotrypsyną B.

Proteinaza w korzystnym rozwiązaniu jest zastosowana do wytwarzania preparatu do usuwania martwej lub złuszczającej się skóry ze zdrowej, pod innym względem, skóry.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie proteinazy serynowej uzyskanej z dorsza do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie u człowieka lub zwierzęcia wybranej z grupy obejmują cej ból, ostre stany zapalne, przewlekł e stany zapalne, zapalenie stawów, zapalenie ścięgien, zapalenie kaletki, zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, posocznicowe zapalenie stawów, ból włókien mięśniowych, ogólny toczeń rumieniowaty, zapalenie żył, zapalenie ścięgna, wyprysk, łuszczycę, trądzik, egzemę, egzemę twarzy z łojotokiem, egzemę rąk, twarzy lub szyi, infekcje napletka, grzybicę między palcową u sportowców, infekcje przetokowe, infekcje z miejscowym owrzodzeniem, infekcje pępka u noworodków, zmarszczki, blizny, rany, czyraki, brodawki i swędzenie uczuleniowe, hemoroidy, rany, infekcje ran, stany zapalne ran, rany po oparzeniowe, infekcje grzybicze i choroby immunologiczne włącznie z chorobami autoimmunologicznymi.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie proteinazy serynowej uzyskanej z dorsza do wytwarzania leku do usuwania martwej lub złuszczającej się skóry ze skóry zdrowej pod innym względem.

W innej odmianie, przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera proteinazę serynową uzyskaną z dorsza. Korzystnie proteinaza serynowa jest proteinazą według wynalazku, określoną powyżej. W korzystnym rozwiązaniu kompozycja jest do zastosowania miejscowego. Korzystnie kompozycja ma postać hydrożelu, korzystniej zawiera ponadto alkohol wielowodorotlenowy włącznie z glicerolem. W innym korzystnym rozwiązaniu kompozycja zawiera ponadto związek farmaceutycznie czynny.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja kosmetyczna, która zawiera proteinazę serynową z dorsza. Korzystnie proteinaza serynowa jest proteinazą według wynalazku, określoną powyżej. Korzystnie kompozycja kosmetyczna ma postać hydrożelu, korzystniej zawiera ponadto alkohol wielowodorotlenowy włącznie z glicerolem. W innym korzystnym rozwiązaniu kompozycja kosmetyczna zawiera ponadto związek aktywny kosmetycznie.

Wynalazek w jednym z rozwiązań obejmuje również mieszaninę proteinaz według wynalazku określonych powyżej. Korzystnie proteinaza jest wybrana z grupy obejmującej trypsynę IVa, trypsynę IVb, trypsynę IVc i trypsynę IVd.

Szczegółowy opis wynalazku

Użyty w zgłoszeniu termin „enzym określa enzym aktywny, jeśli nie jest podane inaczej. Ponadto stosowany tu termin „trypsyną lub inne pokrewne peptydazy oznacza peptydazy typu trypsyny (EC 3.4.21.4) i wszystkie peptydazy o 90% lub większej homologii sekwencji z trypsyną z atlantyckiego dorsza (Asgeirsson i wsp., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989; Gudmundsdottir i wsp., Eur. J. Biochem. 217:1091-1097, 1993). Użyty tu termin „chymotrypsyna lub inne pokrewne peptydazy oznacza wszystkie peptydazy typu chymotrypsyny (EC 3.4.21.1) i wszystkie peptydazy o 90% lub większej homologii sekwencji z chymotrypsynami A i B z dorsza atlantyckiego (Asgeirsson i Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991; Gudmundsdottir i wsp., Biochim et Biophys. Acta 1219:211-214, 1994).

W szczególności enzymy według wynalazku są stosowane do leczenia bólu, stanów zapalnych, ostrego lub przewlekłego stanu zapalnego, zapalenia stawów, zapalenia ścięgien, zapalenia kaletki, zapalenia kości i stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, posocznicowego zapalenia stawów, bólu włókien mięśniowych, ogólnego tocznia rumieniowatego, zapalenia żył, zapalenia ścięgna, wyprysku, łuszczycy, trądziku, ran i grzybic. W użytecznych postaciach trypsyna dorsza lub chymotrypsyna dorsza lub mieszanina tych enzymów są podane lokalnie lub miejscowo na porażone miejsce w kompozycji farmaceutycznej obejmującej oczyszczoną peptydazę lub mieszaninę oczyszczonych peptydaz i farmaceutycznie akceptowalnego rozcieńczalnika lub nośnika szczególnie, lecz nie ograniczonego do hydrożelu. Ponadto, enzymy są użyteczne w leczeniu infekcji wirusowych takich jak wyrzut wirusa żółtaczki, infekcje grzybicza, bakteryjna lub pasożytami włącznie z zapaleniem okrężnicy, wrzodów, hemoroidów, urazów rogówki, płytek nazębnych i chorób immunologicznych włącznie z chorobą autoimmunologiczną.

PL 202 532 B1

Wynalazek obejmuje enzymy, które są zasadniczo strukturalnie podobne do pochodzącej z dorsza trypsyny i chymotrypsyny i mają te same zastosowania co enzymy z dorsza.

W szczególnoś ci enzymy te, trypsyna i chymotrypsyna są uż yteczne w leczeniu zapalenia stawów, zapalenia ścięgien, zapalenia kaletki, zapalenia kości i stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, posocznicowego zapalenia stawów i zapalenia żyły. Terapia obejmuje podanie trypsyny lub chymotrypsyny lub mieszaniny obu enzymów miejscowo w okolicę zapalenia stawów lub stanu zapalnego jako kompozycji farmaceutycznej zawierającej trypsynę lub chymotrypsynę lub oba enzymy i farmaceutycznie akceptowalny rozpuszczalnik lub nośnik, na przykład jako hydrożel. Dodatkowo enzymy, trypsyna i chymotrypsyna według wynalazku, mają zastosowanie w leczeniu infekcji wirusowych takich jak infekcja wirusem żółtaczki, infekcję grzybiczą, bakteryjną lub pasożytami włącznie z zapaleniem okrężnicy, wrzodów, hemoroidów, urazów rogówki, płytek nazębnych i chorób immunologicznych włącznie z chorobą autoimmunologiczną.

W szczególności wynalazek dotyczy zastosowań medycznych, farmaceutycznych i kosmetycznych trypsyn pochodzących z dorsza atlantyckiego lub innych zwierząt. Oczyszczono i scharakteryzowano trzy główne izoenzymy trypsyny z dorsza atlantyckiego. Zostały one określone jako trypsyna I, II i III (Asgeirsson i wsp., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Trypsyny z dorsza mają następującą sekwencję końca N: I-V-G-G-Y-Q/E-C-E/T-K/R-H-S-Q-A-H-QV-S-L-S, podczas gdy ssacze trypsyny, takie jak trypsyna bydlęca mają sekwencję końca N: I-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S. Wszystkie trzy izoformy trypsyny z dorsza mają podobną masę cząsteczkową około 24 kDa.

Wynalazek dotyczy również medycznych, farmaceutycznych i kosmetycznych zastosowań chymotrypsyn pochodzących z dorsza atlantyckiego i innych zwierząt. Oczyszczono i scharakteryzowano dwa główne izoenzymy chymotrypsyny z dorsza atlantyckiego. Zostały one oznaczone jako chymotrypsyna A i B (Asgeirsson i Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991). Chymotrypsyny z dorsza w swoich aktywnych postaciach mogą mieć dwie sekwencje końca N: C-G-R/S-P-A-I-S/Q-P-V/Q-I-V-T-G-Y (łańcuch A) i I-V-N-G-E-E-A-V-P-H-S/T-W-S/P/Y-W-Q-V-S-LQ-D/Q (łańcuch B), podczas gdy ssacze chymotrypsyny takie jak bydlęca chymotrypsyną A mają sekwencje końca N: C-G-V-P-A-I-Q-P-V-L-S-G-L (łańcuch A) i I-V-N-G-E-E-A-V-P-G-S-W-P-W-Q-V-S-L-Q-D (łańcuch B). Obie izoformy chymotrypsyny z dorsza mają podobną masę cząsteczkową około 26 kDa.

Enzymy będące przedmiotem wynalazku mogą być otrzymywane, na skalę komercyjną, w postaci oczyszczonych preparatów izoenzymów trypsyny dorsza, w etapach, w których (i) sporządza się wodny wyciąg z wnętrzności dorsza, (ii) poddaje się wodny ekstrakt co najmniej jednemu etapowi chromatografii, w tym etapowi chromatografii powinowactwa stosując jako ligand powinowactwa p-aminobenzoamidynę i (iii) odcina się trypsynę od ligandu powinowactwa p-aminobenzamidyny, po czym wymywa trypsynę i oczyszcza preparat trypsyny z dorsza na skalę przemysłową.

Bardziej szczegółowo trypsyny i chymotrypsyny z dorsza wyodrębnia się i oczyszcza z wodnych ekstraktów z wnętrzności dorsza z wyłączeniem wątroby, śledziony i ikry. Opisane sposoby mogą być wykorzystane od wytwarzania trypsyn i chymotrypsyn z dorsza na skalę komercyjną. Enzymy są ekstrahowane z całych lub poddanych obróbce mechanicznej wnętrzności przez ekstrakcję wodną z delikatnym mieszaniem przy proporcji wnętrzności do wody korzystnie (wag./wag.) od 1:1 do 1:10. Po rozdzieleniu od pozostałości roztworu będącego nieoczyszczonym ekstraktem, ekstrakt klaruje się przez osadzanie lub filtrowanie. Sklarowany roztwór zatęża się korzystnie przez ultrafiltrowanie i/lub warunkowo wymianę jonową a następnie korzystnie mikrofiltruje, aby uzyskać właściwy roztwór o niskiej zawartości substancji biologicznych, który nanosi się na kolumnę chromatograficzną, oczyszczanie chromatograficzne może obejmować szereg etapów. Następnie trypsynę z dorsza oczyszcza się stosując chromatografię powinowactwa, korzystnie chromatografię powinowactwa z aminobenzamidyną, a chymotrypsynę stosując chromatografię oddziaływania hydrofobowego, korzystnie przez chromatografię na Sefarozie Fenylowej. Zgodnie z opisem, dobór sposobu oczyszczania zależy od skali produkcji trypsyn i chymotrypsyn z dorsza na skalę komercyjną, tak aby uzyskać wytwarzanie serii w ilościach od 1 do 10 g lub większych, np. 10 do 100 g lub większych.

Korzystnie oczyszczone enzymy lub ich mieszaniny stosuje się w postaci preparatu hydrożelu z wodą, zawierającą od 0 do 85% (obj./obj.) alkoholu poliwartościwego (poliol) takiego jak glicerol. Stosowane stężenie zapewniające odpowiednią aktywność trypsyny wynosi 0,1 do 10,000 jednostek aktywności enzymu dla CBZ-Gly-Pro-Arg-pNA (karbobenzoksy Gly-Pro-Arg-paranitroanilidu) na 100 ml końcowego preparatu hydrożelu, a stężenie chymotrypsyny zapewniające odpowiednią aktywność wynosi od 0,1 do 10,000 jednostek aktywności enzymu dla bursztynylo-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA na 100 ml końcowego preparatu hydrożelu.

PL 202 532 B1

Zgodnie z wynalazkiem, lek może być stosowany do leczenia lub zapobiegania stanu chorobowego wybranego z grupy obejmującej ból, ostre stany zapalne, przewlekłe stany zapalne, zapalenie stawów, zapalenie ścięgien, zapalenie kaletki, zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, posocznicowe zapalenie stawów, ból włókien mięśniowych, ogólny toczeń rumieniowaty i zapalenie żył;

stany dermatologiczne takie jak trądzik, wyprysk, łuszczyca lub egzema włącznie z egzemą z łojotokiem twarzy lub egzemą rąk, twarzy, głowy lub szyi, hemoroidami i im podobnymi;

infekcje rany i oczyszczanie ran (przez naniesienie na ranę skutecznej ilości enzymu zapobiegającej zarażeniu mikroorganizmami lub przez wspomożenie gojenia się rany przez podanie skutecznej ilości enzymu hamującej mikroorganizm), gdzie leczona rana może być zasadniczo wolna od obumarłej tkanki;

usuwanie martwej lub złuszczanie skóry ze zdrowej pod innym względem skóry, dla poprawy wyglądu skóry, gdzie korzystnie ilość podanego enzymu jest skuteczna dla usunięcia martwej skóry;

zwłóknienie rozsiane, nowotwory, np. przez podanie ilości skutecznej dla leczenia nowotworu lub zapobiegania przerzutowi nowotworu lub ilość enzymu hamująca miażdżycę tętnicy, astmę, wstrząs posocznicowy, zespół szoku toksycznego, adhezji tkanki takiej jak ścięgno-pochewka, pooperacyjne przyleganie brzuszne lub ścięgien, reperfuzję pourazową malarię, chorobę immunologiczną taką jak choroba autoimmunologiczna, apoptozę, zapalenie okrężnicy, zapalenie jelita takie jak choroba Crohna, gdzie korzystnie podane ilości trypsyn z dorsza i pokrewnych peptydaz są skuteczne w leczeniu i zapobieganiu;

infekcje spowodowane przez mikroorganizmy, np. infekcje wirusowe, takie jak infekcja wirusem żółtaczki, grypy, koronawirusem, cytomegalowirusem, rinovirusem lub infekcje wirusem brodawczaka; infekcje powodujące choroby jelitowo-żołądkowe takie jak owrzodzenie lub biegunka;

infekcje grzybowe, takie jak ogólne infekcje grzybowe skóry, ust, pochwy lub przełyku, np. infekcje drożdżowe, włącznie z grzybowymi infekcjami paznokci i infekcjami wywołanymi Candida sp.; wywołanych przez mikroorganizmy infekcji oka, korzystnie przez podanie do oka; infekcje wywołane przez bakterie włącznie z infekcjami Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Klebsiella sp., Pseudomonas sp., Neisseria gonorrheae, Haemophilus sp., Chlamydia sp., syfilis i E. coli i infekcjami bakteryjnymi powodującymi wrzód miękki; oportunistyczne infekcje wywołane przez mikroorganizmy u pacjentów o obniżonej odporności, gdzie korzystnie podana ilość trypsyn z dorsza jest ilością skuteczną dla leczenia lub zapobiegania zarażeniu lub ma aktywność hamującą w stosunku do adhezji komórka-komórka lub komórka-wirus;

usuwanie płytki nazębnej, gdzie korzystnie ilość podanego enzymu jest ilością skuteczną dla usunięcia płytki nazębnej i upłynnianie skrzepów, gdzie korzystnie ilość podanego enzymu jest ilością skuteczną dla rozpuszczenia skrzepu.

Kompozycja według wynalazku korzystnie jest również stosowana do usuwania martwych lub zmienionych komórek.

Wynalazek obejmuje kompozycję kosmetyczną i farmaceutyczną do podawania miejscowego, zawierającą trypsynę i chymotrypsynę z dorsza lub inne opisane powyżej pokrewne peptydazy oraz preparaty w postaci żelu, kremu albo czopku.

Ponadto wynalazek obejmuje (a) zastosowanie proteaz do leczenia lub profilaktyki zespołów związanych z adhezją komórki do komórki lub wirusa do komórki, obejmujący podanie skutecznej ilości trypsyn lub chymotrypsyn lub pokrewnych peptydaz skutecznie usuwających lub inaktywujących komórkowe lub wirusowe akceptorowe lub receptorowe składniki adhezji, uczestniczące w adhezji komórki do komórki lub wirusa do komórki, (b) kompozycje lub substancje zastosowane jak opisano wyżej, (c) kompozycje farmaceutyczne zawierające skuteczną ilość enzymu zastosowane jak opisano wyżej i (d) zastosowanie kompozycji zawierającej enzym do otrzymania leku zastosowanego jak opisano wyżej. Zasadniczo zespoły obejmują stany zapalne, zapalenia stawów, zapalenie ścięgien, zapalenie kaletki, zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, posocznicowe zapalenie stawów, zapalenie żył, egzemę, wysypkę, łuszczycę, trądzik, rany, infekcje Candida sp. oraz choroby immunologiczne, w tym choroby autoimmunologiczne, szok, przerzuty nowotworowe, reakcja odrzutu przeszczepu i infekcje spowodowane przez mikroorganizmy.

Korzystnie, (a) zespół jest wybrany z grupy obejmującej infekcje spowodowane przez mikroorganizmy, chorobę immunologiczną zwłóknienie torbielowate, miażdżycę, nowotwór, astmę, szok posocznicowy, zespół szoku toksycznego, zapalenie spojówek, uszkodzenie reperfuzyjne, i ból oraz

PL 202 532 B1 (b) powierzchniowy receptor komórkowy, związany z zespołem adhezji komórki do komórki lub wirusa do komórki, jest wybrany z następującej grupy, do której zaliczono receptory, które jak dowiedziono, są cięte przez trypsynę, CD4, CD8, CD54 (ICAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11a/CD18, jest usuwany lub inaktywowany przez podanie enzymu. Korzystnie, wynalazek obejmuje zastosowanie peptydaz do wytwarzania leku do leczenia infekcji, w tym infekcji spowodowanych przez mikroorganizm, np. infekcji wirusem żółtaczki, HIV, wirusem opryszczki lub brodawczaka; infekcji powodujących zapalenie okrężnicy lub biegunkę; infekcji przez Candida, np. infekcji jamy ustnej, pochwy lub przełyku spowodowanej przez Candida, przeziębienia, infekcji grypowej, infekcji spowodowanych przez Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, Pseudomonas, Haemophilus lub E. coli; pierwotnej lub wtórnej infekcji trądem lub infekcji powodująca zapalenie spojówek lub gruźlicę.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie peptydaz do hamowania lub profilaktyki przekazywania mikroorganizmów patogennych, przez podanie enzymów trypsyny lub chymotrypsyny z dorsza. Korzystnie, enzymy trypsyna i/lub chymotrypsyna z dorsza są podawane w obszarze ciała obejmującym miejsce pierwotnego wniknięcia danego mikroorganizmu. W korzystnym rozwiązaniu na część ciała uczestniczącą w aktywności płciowej nanosi się preparat w postaci sprayu, maści lub kąpieli, przykładowo celem zapobieżenia przekazywania HIV lub żółtaczki. W kolejnej korzystnej postaci trypsyna z dorsza lub peptydazy pokrewne wprowadza się do górnych dróg oddechowych, przykładowo za pośrednictwem aerozolu, hamując lub zapobiegając przekazywaniu typowych wirusów powodujących przeziębienie, takich jak wirus nieżytu nosa lub koronawirus.

W pewnej realizacji wynalazku, zastosowanie obejmuje pozaukł adowe dział ania na tkankę , pł yn ciała lub kompozycję komórek, umożliwiające usunięcie składników związanych z adhezją komórki i w konsekwencji zmniejszenie ryzyka odrzucenia przez ukł ad immunologiczny przeszczepionej od innej osoby, tkanki, płynu ciała lub kompozycji komórek. W kolejnej postaci wynalazku zastosowanie prowadzi do usunięcia lub inaktywacji składników adhezji komórkowej występujące w poddanej działaniu tkance, płynie ciała lub kompozycji komórek, które uczestniczą w wywołanej przez mikroorganizm infekcji.

W zastosowaniu trypsyn z dorsza lub pokrewnych peptydaz wedł ug wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki szoku posocznicowego lub szoku toksynowego odpowiednią drogą podania jest podanie ogólnoustrojowe. W przypadku infekcji pochwy związanych z szokiem, odpowiednie sposoby podawania obejmują płukanki dopochwowe, żele lub czopki. W zastosowaniu trypsyn z dorsza lub pokrewnych peptydaz według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki bólu, stanów zapalnych, ostrego lub przewlekłego stanu zapalnego, zapalenia stawów, zapalenia ścięgien, zapalenia kaletki, zapalenia kości i stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, posocznicowego zapalenia stawów, bólu włókien mięśniowych, ustrojowego tocznia rumieniowatego, zapalenia, odpowiednie drogi podawania obejmują między innymi: kremy, żele lub czopki, w szczególności, hydrożele zawierające glicerol lub inne poliole.

W zastosowaniu trypsyn z dorsza lub pokrewnych peptydaz wedł ug wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki wyprysków, łuszczycy, trądziku, egzemy, egzemy na twarzy z łojotokiem, egzemy na rękach, twarzy lub szyi, infekcji napletka, grzybicy między palcami u sportowców, infekcji przetokowej, infekcji z miejscowym owrzodzeniem, infekcji pępka u noworodków, zmarszczek, blizn, ran, czyraków, brodawek i swędzenia uczuleniowego, hemoroidów, infekcji ran, stanu zapalnego rany, usuwaniu martwej lub złuszczającej się skóry ze skóry zdrowej pod innymi względami celem poprawy wyglądu skóry, infekcji grzybiczej takiej jak ogólna infekcja jamy ustnej, pochwy lub przełyku, włącznie z przykładowo infekcją przez drożdże, włącznie z grzybową infekcją paznokci, infekcjami spowodowanymi przez Candida i chorobami immunologicznymi włącznie z chorobami autoimmunologicznymi, odpowiednie drogi podawania obejmują między innymi: hydrożele zawierające glicerol lub inne poliole.

Zgodnie z powyższym, wynalazek obejmuje kompozycje stosowane w leczeniu bólu, ostrych stanów zapalnych, przewlekłych stanów zapalnych, zapalenia stawów, zapalenia ścięgien, zapalenia kaletki, zapalenia kości i stawów, reumatoidalnego zapalenia stawów, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, posocznicowego zapalenia stawów, bólu włókien mięśniowych, ogólnego tocznia rumieniowatego, zapalenia żył, zapalenia ścięgna, wyprysku, łuszczycy, trądziku, egzemy, egzemy twarzy z łojotokiem, egzemy rąk, twarzy lub szyi, infekcji napletka, grzybicy między palcowej u sportowców, infekcji przetokowej, infekcji z miejscowym owrzodzeniem, infekcji pępka u noworodków, zmarszczek, blizny i bliznowca, czyraka, brodawek i swędzenia uczuleniowego, hemoroidów i im poPL 202 532 B1 dobnych, infekcji rany, stanu zapalnego rany, w usuwaniu martwej lub złuszczającej się skóry, pod innym względem zdrowej, aby uzyskać lepszy wygląd skóry, w leczeniu infekcji grzybiczej np. infekcji drożdżowej, infekcji paznokci wywołanej przez Candida sp. i chorób immunologicznych, włącznie z chorobami autoimmunologicznymi. Wynalazek dostarcza również sposobu sporzą dzania kompozycji do leczenia wspomnianych chorób. Ponadto wynalazek dostarcza tryb podawania kompozycji według wynalazku do leczenia określonych powyżej chorób, obejmujący wielkość dawek do zewnętrznego podania miejscowego. Podsumowując, wynalazek obejmuje kompozycje zawierające enzymy i ich zastosowanie, tam gdzie nie były wcześniej wykorzystywane lub bardziej odpowiednie enzymy, jeśli enzymy w takich kompozycjach były obecne.

Wynalazek jest realizowany przez zastosowanie kompozycji zawierającej skuteczną ilość trypsyn i/lub chymotrypsyn z dorsza, zdolnych do zmniejszenia bólu, stanu zapalnego, zapalenia stawów, swędzenia, obrzęku, łuszczycy, egzemy, stanu zapalnego skóry, wysypki i/lub innych objawów chorób wspomnianych powyżej. Enzymy z dorsza mogą być uzyskane z wysoką wydajnością i we względnie prosty sposób z wnętrzności dorsza. Stwierdzono, że enzymy z dorsza mogą być oczyszczane na skalę przemysłową, z odpowiednio wysoką wydajnością, w stosunkowo prosty sposób. Oczyszczona trypsyna z dorsza obejmuje trzy główne izozymy tego enzymu, a chymotrypsyna z dorsza zawiera dwa główne izozymy. Zgodnie z wynalazkiem mogą być stosowane jeden lub wszystkie izozymy.

Obecnie stwierdzono, że enzymy takie jak, trypsyna i chymotrypsyna z dorsza, będące przedmiotem wynalazku, skutecznie usuwają lub dezaktywują pewne cząsteczki obecne na powierzchni komórek, biorące dział w adhezji, enterotoksyny bakteryjne, cytokiny, związki pośredniczące w stanie zapalnym i metaloproteiny macierzy (MMP) takie jak CD4, CD8, CD54 (ICAM-1), CD31, CD62L, CD102 (ICAM-2), CD11a/CD18, TNF-alfa, IL-1 i MMP-9, nie wpływając niekorzystnie na żywotność komórki. Uważa się, że cięcie miejsca odpowiedzialnego za adhezję lub zjawisko inaktywacji cytokin, czynników pośredniczących w stanie zapalnym i metaloprotein macierzy częściowo wyjaśnia skuteczność trypsyn i chymotrypsyn z dorsza w terapii wielu, choć prawdopodobnie nie wszystkich, stanów w których skuteczne są trypsyny i chymotrypsyny z dorsza. Zgodnie z powyż szym, TNF-alfa jest zwią zany zarówno z zapaleniem stawów, łuszczycą, nowotworem, jak i stanami zapalnymi (patrz Cytokiny, wyd. Mire-Slui i Thrope, Academic Press, 1998, str. 350).

Pochodzące z dorsza trypsyny i chymotrypsyny pod wieloma względami są bardziej skuteczne niż inne tradycyjne proteinazy. Porównano aktywności trzynastu najbardziej aktywnych proteinaz pod względem ich oddziaływania z szesnastoma wyżej wymienionymi: obecnymi na powierzchni komórek cząsteczkami uczestniczącymi w adhezji, enterotoksynami bakteryjnymi, cytokinami, substancjami pośredniczącymi w stanach zapalnych i MMP. Badano również wrażliwość tych proteinaz na hamowanie ich aktywności przez surowicę. Wyniki wykazały, że trypsyna i chymotrypsyna z dorsza atlantyckiego są znacznie bardziej aktywne niż inne proteinazy. Proteinazom przyznawano dwa punkty za wysoką i bardzo wysoką aktywność, jeden punkt za niską lub średnią aktywność i zero punktów za bardzo niską lub brak aktywności (odwrotnie punktowano hamowanie aktywności proteinazy przez inhibitory z surowicy). Stosując taki schemat punktacji, dla trypsyny z dorsza atlantyckiego uzyskano 30 punktów, a dla chymotrypsyny z dorsza atlantyckiego 29 punktów, podczas gdy znana wielofunkcyjna proteaza z kryla uzyskała jedynie szesnaście punktów. Wyniki dla bydlęcej trypsyny i chymotrypsyny wskazują na ich znacząco niższą aktywność. Ponadto, pochodzące z dorsza trypsyny i chymotrypsyny są 2 do 20 razy bardziej aktywne niż ich bydlęce odpowiedniki, gdy do porównania tych aktywności użyto tradycyjnych, niskocząsteczkowych substratów chromogenicznych (Asgeirsson i wsp., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989; Asgeirsson i Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991).

Wnętrzności dorsza są dogodnym źródłem enzymów według wynalazku, trypsyny i chymotrypsyny z dorsza. Przykładowo, enzymy mogą być ekstrahowane, jak to opisano powyżej, na skalę przemysłową z zamrożonych wnętrzności dorsza. Klarowany i zatężony roztwór ekstrakcyjny może być ewentualnie frakcjonowany na skalę przemysłową z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej, korzystnie po pierwszym etapie kationowej chromatografii jonowymiennej, stosuje się anionową chromatografię jonowymienną pozwalającą na związanie, a co za tym idzie usunięcie pokrewnych proteaz serynowych takich jak elastaza i kolagenaza serynowa. W kolejnym, ostatnim etapie, oczyszcza się trypsynę z dorsza stosując na komercyjną skalę chromatografię powinowactwa, korzystnie wykorzystując kolumnę chromatograficzną powinowactwa z p-aminobenzamidyną i chymotrypsynę

PL 202 532 B1 stosując kolumnę chromatograficzną wykorzystującą oddziaływania hydrofobowe, korzystnie stosując Sefarozę fenylową.

Trypsynę z dorsza według wynalazku, odzyskuje się ze złoża w chromatografii powinowactwa stosując warunki, w których następuje destabilizacja oddziaływania pomiędzy enzymem a ligandem. Warunki takie obejmują wysokie stężenie soli wraz z niskim pH, korzystnie, w 30% lub bardziej stężonym glicerolu. Wyciek z kolumny spływa do zobojętniającego buforu, co ma na celu stabilizację trypsyny z dorsza po etapie wymycia kwaśnym roztworem (Asgeirsson i wsp., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Chymotrypsynę z dorsza odmywa się z kolumny z Sefarozą fenylową stosując warunki, w których następuje destabilizacja oddziaływania pomiędzy enzymem a hydrofobowym ligandem. Warunki takie obejmują dużą zawartość glicerolu w wodzie lub buforze, korzystnie 50% lub więcej, glicerolu w wodzie lub buforze (Asgeirsson i Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991). Opisane tutaj sposoby umożliwiają otrzymanie pochodzących z dorsza enzymów, takich jak trypsyna i chymotrypsyna, które mogą być wyodrębnione w postaci preparatu, którego czystość przekracza około 90%. Otrzymana w ten sposób frakcja trypsyny zawiera trzy główne postaci lub izozymy trypsyny dorszowej, co wykazano w elektroforezie SDS, w której uzyskano jedno pasmo, które w izoelektroogniskowaniu ujawniło trzy pasma oraz w chromatoogniskowaniu chromatograficznym dało trzy maksima związane z trzema izoformami trypsyny (fig. 1). Jeśli nie zastosowano anionowej chromatografii jonowymiennej, we frakcji trypsyny występowały dodatkowo przynajmniej cztery izozymy trypsyny IV. Izozymy te można oddzielić jako podfrakcje w przeprowadzonej następnie anionowej chromatografii jonowymiennej na mono-Q lub DEAE.

Proteazy serynowe pochodzące z innych organizmów niż dorsz atlantycki mogą być porównane z enzymami tj. trypsyny wyizolowanymi z dorsza atlantyckiego pod względem ich masy cząsteczkowej, punktu izoelektrycznego, sekwencji aminokwasowej, stabilności w zależności od temperatury lub pH, optymalnej temperatury lub pH działania, specyficzności proteolitycznej i parametrów kinetycznych lub innych właściwości enzymów trypsyny z dorsza atlantyckeiego, które przykładowo podano w przykładach (Asgeirsson i wsp., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Aktywność trypsyny z dorsza może być zmierzona z wykorzystaniem jako substratu estru metylowego tryozynoargininy (TAME). Wyodrębniona i oczyszczona chromatografią powinowactwa trypsyną z dorsza (90-100% czystości) korzystnie będzie wykazywała aktywność specyficzną przynajmniej 140 U/mg w 25°C i przy pH 8,1 w porównaniu z 60 U/mg wielofunkcyjnej hydrolazy z kryla. Stosując jako substrat Cbz-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilid (Cbz-GPR-pNa), możliwy jest pomiar aktywności tryptyczna co daje aktywność specyficzną korzystnie około 100 U/mg. Ponadto, gdy jako substrat użyty jest Bz-Arg-pNa dla pochodzącej z dorsza trypsyny I, II i III ustalone mogą być stałe wydajności katalitycznej (kcat/km) odpowiednio 50, 20 i 7 s^-1mM^-1 w porównaniu z wartością 3 s^-1mM^-1 dla trypsyny bydlęcej (Asgeirsson i wsp., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989). Podobne różnice pokazano dla chymotrypsyn z dorsza i chymotrypsyny bydlęcej (Asgeirsson i Bjarnason, Comp. Biochem. Physiol. 99B:327-335-94, 1991).

Masa cząsteczkowa trypsyn z dorsza wynosi około 24 kDa, punkty izoelektryczne wynoszą odpowiednio 6,6, 6,2 i 5,5 dla trypsyn I, II i III i nawet niższy dla izozymów trypsyny IV. Sekwencje aminokwasowe izozymów trypsyny z dorsza mogą być wyrażone następującymi sekwencjami zawierającymi punktową zmienność zależnie od licznych izoform:

I-V-G-G-Y-E-C-T-K/R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y/F-C-G-G-S-L-IN-K/E-D/Q-W-V-V-S-A-A-H-C-Y-K-S-V-L-R-V-R-L-G-E-H-H-I-R-V-N-E-G-T-E-QY/F-I-S-S-S-S-V-I/X-R-H-P-N-Y-S-S-Y-N-I-N/D-N-D-I-M-L-I-H-L-T-K/E-P-A-T-LN-Q-Y-V-H-A-V-A-L-P-T-E-C-A-A-D-A-T-M-C-T-V-S-G-W-G-N-T-M-S-S-V-A/DD-G-D-K-L-Q-V/C-L-N/S-L-P-I-L-S-H-A-D-C-A-N-S-Y-G-P-G-M-I-T-Q-S-M-F-CA-G-Y-L-E-G-G-K-D-F-C-Q-G-D-S-G-G-P-V-V-C-N-G-V-L-Q-G-V-G-V-V-S-W-GY-G-C-A-E-R-D-H/N-P-G-V-Y-A-K-V-M/V/C-V-L-S-G-W-V-R-D-T-M-A-L/S-Y, gdzie X jest dowolną resztą aminokwasową lub ta reszta aminokwasowa nie występuje, i w trypsynie I z dorsza w pozycji 9 znajduje się reszta aminokwasowa K, podczas gdy w trypsynach II i III pochodzących z dorsza w pozycji 9, znajduje się R (Ggudmundsdottir i wsp., 1993 i dane nie publikowane).

Ogólnie, izozymy trypsyny z dorsza są dostatecznie stabilne gdy przynajmniej około 50% aktywności TAME ulega zachowaniu po inkubacji przez 18 godzin w temp. 5°C w pH 7,0 i zbuforowanym roztworze zawierającym 10 mM chlorek wapnia. Jednakże, po inkubacji przez 18 godzin w 5°C i w pH 2,0 pozostaje jedynie około 10% aktywności TAME (fig. 2).

PL 202 532 B1

Optymalna wartość pH dla trypsyn z dorsza i TAME jako substratu wynosi korzystnie od około 7,0 do 8,7, korzystniej około 8,0 (fig.3). Stosując jako substrat TAME, wartość Km w pH ok. 8,1 i temp. 25°C, w obecnoś ci 10 mM chlorku wapnia, wynosi korzystnie dla trypsyn I, II i III z dorsza odpowiednio ok. 0,029 mM, 0,021 mM i 0,049 mM. Korzystnie, maksymalna aktywność trypsyny z dorsza, względem TAME jako substratu, występuje w temperaturze od 50 do 60°C (Fig. 4).

Trypsyna i chymotrypsyna z dorsza według wynalazku mogą być podawane miejscowo, doustnie, doodbytniczo, dopochwowo, przez zakroplenie (przykładowo do dróg moczowych lub do przetok), do dróg oddechowych np. w postaci aerosolu, przez wkroplenie do oka lub układowo, np. pozajelitowo w tym przykładowo domięśniowo, podskórnie, dootrzewnowo, dotętniczo lub dożylnie. Enzymy z dorsza są podawane w postaci roztworu lub połączone z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem lub wypełniaczem zgodnym z klasyczną praktyka farmaceutyczną. Postacie enzymów z dorsza do podawania doustnego obejmują postać tabletek, kapsułek, pastylek, gumy do żucia, drażetek, proszków, syropów, eliksirów, roztworów wodnych i zawiesin i tym podobnych. Postacie enzymów z dorsza do podawania pozajelitowego zazwyczaj obejmują jałowe, buforowane, roztwory, o odpowiednich wartościach pH. W postaciach enzymów z dorsza do podawania dożylnego konieczne jest kontrolowanie całkowitego stężenia roztworów, tak aby izotoniczność preparatu była zachowana. Postacie enzymów z dorsza do podawania do oczu mogą obejmować maś ci lub pł yny do wkraplania, które mogą być podane przy pomocy znanych systemów do podawania do oczu, np. aplikatorów lub wkraplaczy do oczu. Postacie enzymów z dorsza do podawania do płuc zawierają odpowiednie rozcieńczalniki i/lub nośniki, umożliwiające utworzenie aerozolu. Postacie enzymów z dorsza do podawania miejscowego typowo obejmują hydrożel zawierający od 0 do 85% glicerolu, np. od ok. 20% do 30% do ewentualnie 85% glicerolu.

W podawaniu miejscowym odpowiednie jednorazowe dawki trypsyny z dorsza wynoszą od

0,01 μg/cm² do ok. 1 mg/cm², korzystnie od ok. 0,1 μg/cm² do ok. 0,01 mg/cm² (np. około 0,01 mg/ml enzymu w postaci żelu). W terapii układowej dawki zasadniczo dobiera się tak, aby utrzymywać poziom trypsyny z dorsza w surowicy od około 0,1 mg/100 ml do około 100 mg/100 ml, korzystnie od około 0,5 mg/100 ml do ok. 2,0 mg/100 ml. Stosując inne określenia ilości, w terapii układowej, wskazane są dawki od ok. 0,1 mg/kg do ok. 10 mg/kg, korzystnie ok. 1 mg/kg. W podawaniu dopochwowym i do dróg moczowych, odpowiednie roztwory trypsyny z dorsza do prowadzenia płukanek/wlewek będą zasadniczo miały stężenia od ok. 1 μg/ml do 15 mg/ml, korzystnie od ok. 100 μg/ml do ok. 3 mg/ml. We wszystkich trybach podawania kompozycja zawierająca enzym według wynalazku podawana jest od ok. 1 do 10 razy dziennie, korzystnie od ok. 2 do 5 razy dziennie. Oczywiście wiadomo, że podane wartości mogą być różne w zależności od wielu czynników, takich jak np. jaka choroba ma być leczona, ostrość przebiegu choroby, wieku, masy i stanu medycznego pacjenta. Uważa się, że zasadniczo wyższe dawki mogą być użyte bez wywoływania istotnych niepożądanych działań ubocznych.

W leczeniu ran enzymy trypsyny z dorsza są korzystnie podawane częściej niż raz, w momencie pierwszego opatrunku. Korzystnie trypsyna z dorsza jest podawana co najmniej za każdym razem wraz ze zmianą opatrunku. Enzymy trypsyny z dorsza mogą również być podawane prawie każdego dnia, korzystniej każdego dnia lub kilka razy dziennie. W stanach dermatologicznych takich jak egzema, łuszczyca i tym podobne korzystnie hydrożele z trypsynami i/lub chymotrypsynami z dorsza są podawane codziennie, korzystniej dwa razy dziennie. W przypadku przewlekłych stanów zapalnych, zapalenia stawów, zapalenia ścięgien, zapalenia kaletki, zapalenia stawów i kości i im podobnych, korzystnie trypsyny z dorsza są podawane codziennie, korzystnie dwa razy dziennie.

Jak zilustrowano poniżej dla wielu przykładów klinicznych, hydrożel z enzymem z dorsza według wynalazku jest skuteczny w leczeniu lub profilaktyce stanów zapalnych. Zwykle, w wyniku stosowania kompozycji według wynalazku stany zapalne ulegają ograniczeniu do akceptowanych poziomów w ciągu dwóch lub trzech dni od rozpoczęcia leczenia. W przykładach przedstawiono również, że enzymy według wynalazku skutecznie uśmierzają ból. Zmniejszenie bólu zwykle obserwuje się już od 20 minut do dwóch godzin od rozpoczęcia leczenia. Ulga w bólu nie jest związana z utratą czucia w leczonej tkance. Znaczniejsze zmniejszenie bólu, mianowicie pacjent odczuwa jedynie niewielki ból lub odczuwa podrażnienie, zazwyczaj osiąga się w ciągu jednego dnia od rozpoczęcia leczenia.

Ogólnie, enzymy z dorsza według wynalazku podaje się w skutecznej ilości. Skuteczna ilość oznacza ilość skuteczną zarówno w (1) ograniczeniu objawów leczonej choroby, (2) wywołaniu zmian farmakologicznych prowadzących do leczenia danej choroby, (3) hamowaniu lub zapobieganiu infekcji lub wtórnej infekcji przez czynnik infekcyjny lub (4) zapobieganiu wystąpienia innej choroby niż zaka10

PL 202 532 B1 żenie, (przykładowo choroby leczonej przez blokowanie adhezji do komórki). W leczeniu rany, w jednej realizacji, skuteczna ilość to ilość, która jeśli podawana regularnie, zapobiega wystąpieniu infekcji. W kolejnej realizacji zastosowania według wynalazku w leczeniu ran, skuteczna ilość to ilość skutecznie skracająca średni czasu potrzebny do wyleczenia rany.

W nauce znanych jest szereg sposobów procentowego okreś lenia homologii biał ek. W jednym ze sposobów korzysta się z komputerowego programu GPA, wersja 6.0, który porównuje sekwencje. Program jest dostępny z University of Wisconsin Genetics Computer Group i wykorzystuje sposób porównywania Needlemana i Wunscha, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970) jak przedstawili to Smith i Waterman, Adv. Appl. Math., 2, 482 (1981). Inny sposób obejmuje korzystanie z programu komputerowego FASTA.

Wynalazek został szczegółowo przedstawiony, nie ograniczając jego zakresu, na rysunku, na którym:

fig. 1 przedstawia wykres uzyskany metodą chromoogniskowania chromatograficznego frakcji trypsyny z dorsza atlantyckiego w etapie oczyszczania na kolumnie powinowactwa z aminobenzoamidyną jako ligandem. Frakcje wymyte z kolumny z para aminobezamidyną poddano filtrowaniu w żelu na kolumnie zawierającej Sephadex G-25, zrównoważonej 25 mM monoetanoloaminą / kwasem octowym, przy pH 9,4 zawierającym 10 mM chlorek wapnia, a następnie naniesiono na kolumnę PBE-94 zawierającą złoże do wymiany jonowej (Pharmacia) zrównoważone tym samym buforem. Kolumnę następnie wymywano roztworem Polybuffer 94 (o pH doprowadzonym kwasem octowym do pH 5,5), zawierającym 10 mM chlorek wapnia. Śledzono aktywność substratu TAME (wypełnione kółka), absorbancję przy 280 nm (otwarte kółka) i pH (otwarte romby). Pierwszą wymywaną frakcję zidentyfikowano jako trypsynę I, drugą jako trypsynę II i trzecią jako trypsynę III;

fig. 2 obrazuje wpływ pH na stabilność trypsyny z dorsza atlantyckiego oczyszczonej z użyciem para aminobenzoamidyny jako liganda, jak zmierzono na podstawie resztkowej aktywność TAME po inkubacji przy różnych wartościach pH i w dwóch różnych okresach inkubacji. Próbki trypsyny dorsza atlantyckiego inkubowano w różnych wartościach pH, w 5°C, przez 30 min (nie wypełnione kółka) i 18 godzin (wypełnione kwadraty). Następnie mierzono resztkową aktywność względem substratu TAME przy pH 8,1 w 25°C;

fig. 3 przedstawia zależność od pH aktywności trypsyny z dorsza atlantyckiego oczyszczonej przy pomocy para-aminobenzamidyny jak zmierzono z użyciem substratu TAME. Jako bufory użyto, w stężeniu końcowym 0,1 M, octan (pH 3,0-5,9), hepes/HCl (pH 6,0-8,0) i glicynian (pH 8,3-9,0), wszystkie zawierające 10 mM chlorek wapnia oraz fig. 4 przedstawia zależność od temperatury aktywności trypsyny I z dorsza atlantyckiego w porównaniu z aktywnością trypsyny bydlęcej, aktywności mierzono stosując substrat TAME. Enzymy dodano do wcześniej ogrzanej termostatyzowanej kuwety i po krótkim równoważeniu, określano w cią gu nastę pnych trzech minut ś redni poziom hydrolizy.

P r z y k ł a d 1

Przygotowanie mieszaniny proteaz z dorsza

Około 100 kg zamrożonych trzewi dorsza rozmrożono i wprowadzono do czterokrotnie większej objętości zimnej przegotowanej wody w zbiorniku ekstrakcyjnym i roztworem wodorotlenku sodu doprowadzono pH do wartości 8 do 9. Mieszaninę mieszano przez około 2-6 godzin w temp. 0 do 5°C. Po krótkim czasie osadzania (ok. 30 min.) ekstrakty wodne zebrano znad nierozpuszczalnych pozostałości trzewi, przy pomocy pompy i połączono w osadniku. Ekstrakty wodne pozostawiano na około 24 do 60 godzin w schłodzonym osadniku w celu osadzenia osadu. Nadsącz zdekantowano przy pomocy pompy do zbiornika do przechowywania. Następnie nadsącz zatężano 10 do 20-krotnie przez ultrafiltrowanie i diafiltrowanie do uzyskania odpowiedniego poziomu siły jonowej i wartości przewodnictwa poniżej ok. 3 mS/cm.

W wyniku ultrafiltrowania i diafiltrowania uzyskano okoł o 10-15 litrów koncentratu biał ka.

P r z y k ł a d 2

Oczyszczanie trypsyny z dorsza z zatężonego ekstraktu z wnętrzności dorsza

Około 10 litrów zatężonego ekstraktu, uzyskanego w wyniku ultrafiltrowania i diafiltrowania jak opisano w przykładzie 1, nanoszono na szereg połączonych kolumn chromatograficznych o pojemności 1 litra, z których pierwsza zawierała kationowymienną żywicę CM o szybkim przepływie (Pharmacia, Szwecja), druga była wypełniona anionowymienną żywicą DEAE o szybkim przepływie (Pharmacia, Szwecja), a jako trzecią stosowano chromatografię powinowactwa, w której jako ligand stosowano p-aminobenzamidynę sprzężoną z żywicą sefarozową (Pharmacia, Szwecja). Kolumny wstępnie zrównoważono dziesięcioma objętościami kolumn 25 mM buforu Tris, pH 7,8 zawierającego 2,5 mM chloPL 202 532 B1 rek wapnia (bufor A). Zatężony ekstrakt wprowadzono z użyciem pompy na kolumny z szybkością przepływu około 100 ml na minutę. Po zakończeniu nanoszenia zatężonego ekstraktu na kolumny, pozostały materiał wypłukano z ciągłego systemu kolumn 8 litrami buforu A.

Po zakończeniu płukań, kolumnę powinowactwa z p-aminobenzamidyną jako ligandem odłączano od innych kolumn i płukano pięcioma objętościami roztworu o wysokim stężeniu soli, mianowicie buforem 25 mM Tris pH 7,5 zawierającym 0,5 M NaCl i 2,5 mM chlorek wapnia. Trypsyny z dorsza następnie odcinano od złoża kolumny powinowactwa i wymywano z kolumny roztworem kwasu, mianowicie 25 mM kwasem octowym, o pH 3,2, zawierającym 10 mM chlorku wapnia i 30% glicerol. Frakcję trypsyny z dorsza zbierano do buforu zobojętniającego, tj. 200 mM Tris, pH 8,5, zawierającego 30% glicerol.

Homogenność oczyszczonego preparatu badano stosując elektroforezę SDS PAGE i chromatografię FPLC Mono Q, otrzymując trzy pasma izozymów trypsyny widoczne w izoelektroogniskowaniu. Preparat enzymu wykazywał aktywność specyficzną około 100 U/mg co stwierdzono, jak opisano wcześniej, stosując substrat Cbz-GPR-pNa. Oczyszczone preparaty sterylizowano sącząc przez filtr o porach 0,22 mikrona i przechowywano zamroż one w okoł o -20°C.

P r z y k ł a d 3

Inny sposób oczyszczania trypsyny z dorsza z zatężonego ekstraktu z wnętrzności z dorsza na skalę komercyjną

Około 10 litrów otrzymanego w przykładzie 1 zatężonego ekstraktu po ultrafiltrowaniu i diafiltrowaniu, nanoszono na kolumnę z żywicą sefaroza, sprzężoną z ligandem powinowactwa p-aminobenzamidyną (Pharmacia, Szwecja). Kolumnę wstępnie równoważono dziesięcioma objętościami kolumny, stosując bufor 25 mM Tris pH 7,8 zawierający 2,5 mM chlorku wapnia (bufor A). Koncentrat wprowadzono na kolumnę z użyciem pompy, przy przepływie ok. 100 ml na minutę. Po zakończeniu nanoszenia koncentratu na kolumnę pozostały materiał wypłukiwano z kolumny około 8 l buforu A.

Kolumnę powinowactwa następnie płukano około pięcioma objętościami kolumny roztworu o dużej zawartości soli, mianowicie buforem 25 mM Tris, o pH 7,5, zawierającym 0,5 M NaCl i 2,5 mM chlorek wapnia. Następnie trypsynę z dorsza odcinano od ligandu powinowactwa i wymywano z kolumny roztworem kwasu będącym 25 mM kwasem octowym, o pH 3,2 zawierającym 10 mM chlorek wapnia i 30% glicerol. Frakcję trypsyny z dorsza zbierano do buforu zobojętniającego, mianowicie 200 mM Tris, o pH 8,5, i zawierała ona ok. 5-6 gramów trypsyny.

Oczyszczony preparat trypsyny z dorsza badano pod względem homogenności stosując elektroforezę SDS PAGE i wykazano stosując izoelektroogniskowanie obecność trzech prążków dla izozymów trypsyny. Mniejsza frakcja (< 5%), która może być oddzielona przez kolejną chromatografię FPLC Mono Q, została zidentyfikowana jako co najmniej cztery dodatkowe izozymy: trypsyną IVa, IVb, IVc i IVd. Otrzymany preparat enzymu posiada aktywność specyficzną około 100 U/mg, którą wyznaczono zgodnie z wcześniejszym opisem, stosując substrat Cbz-GPR-pNA. Oczyszczony preparat sterylizowano przez filtrowanie przez filtr o porach 0,22 mikrona i przechowywano zamrożony w około -20°C.

P r z y k ł a d 4

Przygotowanie preparatu hydrożelu z trypsyną z dorsza

Preparat oczyszczonej trypsyny z dorsza z przykładu 2 mieszano z hydrokoloidalnym żelem obejmującym żel wodny zawierający 0,8% wag./obj. Carbomer 940, 30% glicerol i 0,08% paraoksybenzoesan. Preparat trypsyny z dorsza mieszano w stosunku 1:1 z hydrożelem, uzyskując końcowe stężenie jednej jednostki enzymu na mg (U/mg) w ostatecznej mieszaninie żelu i enzymu (hydrożelowa maść z enzymem). Jednostki enzymu określono, jak to wcześniej opisano, stosując jako substrat Cbz-GPR-pNA. Tak więc, uzyskana maść hydrożelowa z enzymem zawiera około 0,01 mg/ml lub 1 U/ml enzymów trypsyny z dorsza, 0,4% Carbomer 940, 20% glicerol i 0,04% paraoksybenzoesan. Poniżej hydrożelowa maść z enzymem określana jest jako Penzyme 100.

P r z y k ł a d 5

Leczenie zapalenia kości i stawów przy pomocy Penzyme 100

Siedemnaście osób z zapaleniem kości i stawów, niektórzy z objawami ostrymi lub bardzo przewlekłymi, leczono maścią hydrożelową z enzymem (Penzyme 100) uzyskaną według przykładu 4. Żel zawierający enzym nanoszono raz do dwóch razy dziennie, zawsze wieczorem przed zaśnięciem i w większości przypadków również rano. Około 5 ml żelu z enzymem nanoszono na każdy porażony obszar, taki jak kolana lub uda, lub obie ręce. Większe ilości mogą być nanoszone w przypadkach przewlekłych. Żel pozostawiano na około 10 do 30 minut, w zależności od czasu potrzebnego do wyschnięcia, możliwości czasowych, potrzeb i wymagań pacjenta. Wysychanie można przyspieszać stosując dmuchawę, np. suszarkę do włosów. Wszyscy pacjenci odczuli zmniejszenie objawów, część

PL 202 532 B1 w ciągu jednego tygodnia, większość w ciągu dwóch do czterech dni. Pacjent nr 71 nie był w stanie wchodzić po schodach przed leczeniem, lecz po leczeniu nie miał z tym problemów. Wyniki podsumowano, poniżej w tabeli 5.1.

T a b e l a 5.1

Wyniki leczenia zapalenia stawów i kości przy pomocy Penzyme

Pacjent nr	Płeć-wiek	Dotknięty obszar	Liczba dawek na dzień	Ulga po
1	F-67	Kolana, ręce	1-2	2 dniach
4	M-74	Kolana	1-2	3 dniach
17	M-54	Kolana	1	4 dniach
19	M-55	Kolana	2	3 dniach
21	F-73	Biodra	2	2 dniach
30	F-77	Kolana	2	3 dniach
36	F-68	Kolana, biodra	2	3 dniach
51	F-63	Biodra	2	3 dniach
53	F-75	Kolana, biodra	1-2	3 dniach
54	F-73	Kolana	1-2	4 dniach
55	M-67	Uraz kolana	1	4 dniach
65	F-37	Kolana, ręce	2	3 dni
67	F-72	Kolana	1-2	4 dni
71	F-78	Kolana, plecy	2	3 dni
72	M-54	Ręce	1	2 dni
73	F-76	Ręce, biodra	1-2	3 dni
77	M-75	Biodra, stopy, plecy	1-2	3 dni

Kilku z pacjentów (nr 19 i 21) pomimo przerwania leczenia nadal odczuwało trwałą lub długotrwałą poprawę, lecz większość z nich kontrolowała wystąpienie objawów stosując Penzyme 100 stale lub okresowo.

P r z y k ł a d 6

Leczenie pacjentów dotkniętych zapaleniem ścięgna.

Hydrożelowa maścią z enzymem (Penzyme 100) z przykładu 4 leczono osiem osób z zapaleniem ścięgien, niektórzy z ostrymi objawami powodującymi problemy ze snem w nocy. Żel z enzymem nanoszono miejscowo na dotknięty chorobowo obszar, raz do dwóch razy dziennie, około 5 do 10 mililitrów, zależnie od wielkości obszaru, na każdy porażony obszar. Żel pozostawiano do wyschnięcia na około 10 do 30 minut, zależnie od naniesionej ilości, dostępnego czasu i potrzeb i wymagań pacjenta. Wszyscy leczeni pacjenci odczuwali ulgę w objawach w ciągu dwóch tygodni, większość z nich w ciągu dwóch do czterech dni, lecz u innych trwało to dłużej, szczególnie u cierpiących na stan zapalny barku (łokieć tenisisty lub łokieć golfisty). Uzyskane wyniki podsumowano w tabeli 6.1:

T a b e l a 6.1

Wyniki leczenia pacjentów dotkniętych zapaleniem ścięgien.

Pacjent nr	Płeć-wiek	Dotknięty obszar	Dawek na dzień	Ulga po
1	2	3	4	5
15	F-45	Barki	2	2 dniach
37	F-50	barki, ramię	2	2 dniach
57	F-55	Barki	1-2	4 dniach
79	F-43	Barki	2	2 dniach
47	M-63	Ramię	1	2 tygodniach

PL 202 532 B1 cd tabeli 6.1

1	2	3	4	5
49	M-34	łokieć tenisisty	1	1 tygodniu
84	F-33	łokieć tenisisty	2	2 dniach
20	M-24	kolano skoczka	2	3 dniach

Wszyscy pacjenci odczuli trwałą poprawę stanu zdrowia i zaprzestali leczenia.

P r z y k ł a d 7

Leczenie fibromyalgii (bólu włókien mięśniowych)

Dwóch pacjentów dotkniętych ostrym bólem włókien mięśniowych leczono hydrożelową maścią z enzymem (Penzyme 100) z przykładu 4. Żel zawierający enzym nanoszono 2 razy dziennie miejscowo na porażony obszar w ilości około 5 do 10 ml na każdy obszar, zależnie od jego wielkości. Żel pozostawiano do wyschnięcia na około 10 do 30 minut, zależnie od naniesionej ilości, dostępnego czasu i potrzeb oraz wymagań pacjenta. Obaj pacjenci (nr 78, F-50 i nr 92, F-53) odczuli zmniejszenie objawów w ciągu trzech tygodni. Obaj ponownie zastosowali żel z enzymem, gdy ból wystąpił ponownie.

P r z y k ł a d 8

Leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów

Hydrożelowa maścią z enzymem (Penzyme 100) z przykładu 4 leczono pięć osób z reumatoidalnym zapaleniem stawów. Żel z enzymem nanoszono miejscowo na porażony obszar zazwyczaj przynajmniej dwa razy dziennie, około 5 do 10 mililitrów na każdy obszar, zależnie od jego wielkości. Żel pozostawiano do wyschnięcia na około 15 minut, zależnie od grubości warstwy naniesionego żelu. Okres suszenia może być skrócony dzięki użyciu dmuchawy, np. suszarki do włosów. U wszystkich pięciu pacjentów złagodzenie objawów nastąpiło w ciągu pięciu dni. Uzyskane wyniki podsumowano w tabeli 8.1:

T a b e l a 8.1

Leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów

Pacjent nr	Płeć-wiek	Dotknięty obszar	Dawek na dzień	Ulga po
14	M-55	ręce	1	5 dniach
61	F-47	biodra, ręce	3	4 dniach
65	F-37	szyja, ręce	2	2 dniach
78	F-50	szyja, ręce	2	2 dniach
94	M-36	ręce, klatka piersiowa	1	3 dniach

Przed rozpoczęciem leczenia pacjentka nr 61 nie była w stanie rano wstać z łóżka i samodzielnie się ubrać, lecz po leczeniu mogła wykonywać wszystkie te czynności samodzielnie. Pacjent nr 94 cierpiał na ból w klatce piersiowej podczas oddychania spowodowany wysiękiem z opłucnej. Zanik tych objawów nastąpił po trzech dniach leczenia Penzyme 100. Wszyscy pacjenci kontrolowali wystąpienie objawów choroby dzięki ciągłemu lub okresowemu stosowaniu leczenia żelem z enzymem.

P r z y k ł a d 9

Leczenie zapalenia żył

Pięciu pacjentów z różnymi postaciami zapalenia żył, takimi jak zakrzepowe zapalenie żył, zakrzep żylny, przewlekły zespół po zakrzepie żyły i żylaki żylne, we wszystkich przypadkach zlokalizowanych w obrębie łydki, w niektórych przypadkach z bardzo ostrymi objawami, powodującymi ból i trudności w spaniu, leczono maścią hydrożelową z enzymem (Penzyme 100) z przykładu 4. Żel nanoszono miejscowo na łydkę przynajmniej raz dziennie, np. po południu i w niektórych przypadkach również rano, około 5 ml na każdą łydkę. Żel pozostawiano do wyschnięcia na około 15 minut. U wszystkich pięciu pacjentów stwierdzono zmniejszenie objawów w ciągu około 5 tygodni. Wyniki te podsumowano poniżej w tabeli 9.1:

PL 202 532 B1

T a b e l a 9.1 Leczenie zapalenia żyły

Pacjent nr	Płeć-wiek	Dotknięty obszar	Dawki na dzień	Ulga po
2	F-69	noga	1-2	3 tygodniach
28	M-54	łydka	1	2 tygodniach
56	M-71	łydka	1-2	2 tygodniach
59	F-59	łydka	1	2 tygodniach
68	F-72	łydka	1-2	4-5 dniach

U pacjentki nr 2 stwierdzono przewlekły zespół po zapaleniu żyły. Pacjentka nr 68 nie mogła spać w nocy z powodu bólu, jeśli nie zastosowała żelu przed snem.

Wszyscy pacjenci kontrolowali objawy dzięki ciągłemu lub okresowemu stosowaniu leczenia żelu z enzymem.

P r z y k ł a d 10

Leczenie łuszczycy

Sześciu pacjentów z łuszczycą, w niektórych przypadkach choroba była przewlekła, z bardzo ostrymi objawami, leczono hydrożelem z enzymem z przykładu 4. Jednakże większości przypadków łuszczycy stosowano kompozycję oznaczoną Penzyme 200 o podwójnym stężeniu trypsyny z dorsza lub o dwóch jednostkach enzymu na mililitr, bowiem preparat Penzyme 100 (1 jednostka trypsyny z dorsza na ml) dawał raczej nieznaczne i w pewnych przypadkach niepewne wyniki. Pacjenci stwierdzali ogromną poprawę po leczeniu przy pomocy żelu zawierającego większą dawkę trypsyny z dorsza (Penzyme 200) w porównaniu z żelem zawierającym niższe stężenie trypsyny (Penzyme 100). Połączenie trypsyny z dorsza i chymotrypsyny z dorsza w stężeniach każdego enzymu 1 U/ml, oznaczone jako Penzyme 200C, również badano i uzyskano równie pozytywne wyniki jak dla Penzyme 200. Żel z enzymem był nanoszony raz do dwóch razy dziennie zawsze przed snem, po czym żel z enzymem pozostawiano na noc na skórze, w pewnych przypadkach stosowano również rano po kąpieli, a przed ubraniem się. Żel nanoszono jako cienką warstwę lub błonkę, co trwało około 5 minut ze względu na konieczność wyschnięcia preparatu. U wszystkich sześciu pacjentów zaobserwowano zmniejszenie objawów w ciągu dwóch tygodni. W niektórych przypadkach leczenie było uzupełnione tradycyjnymi, domowymi sposobami takimi jak kąpiele słoneczne lub naświetlanie UV. Wyniki podsumowano poniżej w tabeli 10.1:

T a b e l a 10.1 Wyniki leczenia łuszczycy

Pacjent nr	Płeć-wiek	Rodzaj żelu	Dawki na dzień	Ulga po
3	F-45	Penzyme 200	1-2	4-5 dniach
7	M-63	Penzyme 100	1-2	2 tygodniach
18	M-55	Penzyme 100	1-2	1 tygodniu
69	M-29	Penzyme 200	1-2	1 tygodniu
86	F-30	Penzyme 200	1-2	1 tygodniu
88	M-21	Penzyme 200	1-2	1 tygodniu

Pacjentka nr 3 od wieku 5 lat była dotknięta przewlekłą i bardzo ostrą postacią łuszczycy. Pacjentka próbowała wszelkich dostępnych sposobów leczenia uzyskując ograniczone wyniki. Długotrwałe zmniejszenie objawów dało jej jedynie leczenie Penzyme 200. Stwierdziła, że ulga w objawach jest dostrzegalna po około 4 dniach, a całkowitą ulgę osiągnęła po 2 do 3 tygodniach leczenia przy jednokrotnym podawaniu leku przed snem.

Pacjent nr 69, również z ostrą łuszczycą zaobserwował całkowity zanik niektórych plam. Wszyscy pacjenci kontrolowali objawy dzięki ciągłemu lub okresowemu leczeniu żelem z enzymem.

PL 202 532 B1

P r z y k ł a d 11

Leczenie trądziku i czyraków

Dwie osoby (pacjent nr 25, F-16 i nr 63, M-17) dotknięte trądzikiem i jedną z czyrakami (nr 64 M-22) leczono maścią hydrożelową z trypsyną dorsza (Penzyme 100) z przykładu 4. Żel nanoszono miejscowo na porażony obszar (twarz) raz dziennie w ilości ok. 5 ml za każdym razem. Żel pozostawiono do wyschnięcia przez ok. 15 min., po czym pozostawiano go na skórze. Wszystkie trzy osoby odczuły całkowite ustąpienie objawów w ciągu dwóch tygodni i używały enzymu jedynie jako okazyjnego leczenia, gdy objawy zaczynały powracać.

P r z y k ł a d 12

Leczenie egzemy, zapalenia skóry i innych stanów chorobowych skóry

Osiemnastu pacjentów dotkniętych egzemą, stanem zapalnym skóry i różnymi innymi stanami chorobowymi skóry leczono maścią hydrożelową z trypsyną dorsza (Penzyme 100) z przykładu 4. Żel zawierający enzym nanoszono raz dziennie (czasami dwukrotnie), zazwyczaj wieczorem przed snem. Żel nanoszono cienką warstwą lub jako błonkę. Wyschnięcie następowało po około 5-10 minutach. Większą ilość nanoszono w przypadkach o ostrzejszym przebiegu. Suszenie można przyspieszyć przez użycie dmuchawy, np. suszarki do włosów. Wszyscy pacjenci odczuli złagodzenie objawów w ciągu jednego tygodnia, częściej w ciągu 2 do 4 dni. Wyniki podsumowano poniżej w tabeli 12.1:

T a b e l a 12.1

Wyniki leczenia egzemy, zapalenia skóry i innych stanów skóry

Pacjent nr	Płeć-wiek	Stan, obszar	Dawek dziennie	Ulga po
32	M-24	Łojotok, włosy	1	2-3 dniach
45	M-23	Łojotok, włosy	1	3-4 dniach
23	F-26	Potnica, dłoń	2	7 dniach
40	F-21	Potnica, dłoń	1	4 dniach
41	F-45	Potnica, dłoń	2	3 dniach
48	F-33	Potnica, podeszwa	1	2 tygodniach
66	F-40	Pokrzywka, twarz	1	2 dniach
50	F-25	Zanokcica, paznokcie	2	5 dniach
20	M-2	Liszaj, usta	2	5 dniach
11	M-50	Podrażnienie skóry, twarz	2	2-3 dniach
98	F-52	Podrażnienie skóry, twarz	2	2-3 dniach
12	M-2	Egzema dziecięca	1	6 dniach
46	F-5	Egzema dziecięca	1	5 dniach
87	F-7	Egzema dziecięca	1	5 dniach
99	M-2	Egzema dziecięca	1	8 dniach
97	F-52	Trądzik różowaty, twarz	2	5-6 dniach
100	F-69	Półpasiec, twarz	2	2 dniach
101	F-47	Toczeń tarczowaty	2	7 dniach

U niektórych pacjentów (nr 40, 41, 48, 66, 50, 20, 46, 87, 97, 100) moż na był o stosować leczenie okresowe, lecz pomimo tego odczuwali oni trwałe lub długoterminowe ustąpienie choroby. Pozostali pacjenci kontrolowali objawy dzięki ciągłemu lub okresowemu używaniu Penzyme 100.

P r z y k ł a d 13

Leczenie ran

Dwie osoby (pacjent nr 44, M-4 i 85, M-9) z poparzeniami leczono hydrożelowa maścią z trypsyną dorsza (Penzyme 100) z przykł adu 4. U dwóch innych pacjentów (nr 62, F-47 i 96, M-70) leczono rany pooperacyjne, które nie chciały się goić. Żel zawierający enzym nanoszono miejscowo na rany przynajmniej dwa razy dziennie i pozostawiano na dotkniętym obszarze. U wszystkich czte16

PL 202 532 B1 rech osób zaobserwowano dobre, wolne od komplikacji, gojenie się ran w ciągu jednego do trzech tygodni.

P r z y k ł a d 14

Leczenie chymotrypsyną z dorsza.

Analogiczne badania jak w każdym z przykładów 5-13 dla hydrożelu z trypsyną z dorsza, przeprowadzono na hydrożelu z chymotrypsyną z dorsza lub hydrożelu zawierającym mieszaninę trypsyny z dorsza i chymotrypsyny z dorsza.

Claims

1. Proteinaza serynowa uzyskana z dorsza do zastosowania jako lek.

2. Proteinaza według zastrz. 1, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej trypsynę, chymotrypsynę lub jakąkolwiek ich mieszaninę.

3. Proteinaza według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jest jednofunkcyjna.

4. Proteinaza według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że pochodzi z dorsza atlantyckiego.

5. Proteinaza według zastrz. 1, znamienna tym, że jest trypsyną pochodzącą z dorsza atlantyckiego.

6. Proteinaza według zastrz. 5, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej trypsynę I, trypsynę II, trypsynę III, trypsynę IVa, trypsynę IVb, trypsynę IVc i trypsynę IVd.

7. Proteinaza według zastrz. 4, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej chymotrypsynę A i chymotrypsynę B.

8. Proteinaza według zastrz. 1, znamienna tym, że jest trypsyną o przynajmniej 90% homologii sekwencji aminokwasowej z którąkolwiek z pochodzących z dorsza atlantyckiego trypsyną I, trypsyną II, trypsyną III i trypsyną IV.

9. Proteinaza według zastrz. 1, znamienna tym, że jest chymotrypsyną o przynajmniej 90% homologii sekwencji aminokwasowej z pochodzącymi z dorsza atlantyckiego chymotrypsyną A i chymotrypsyną B.

10. Proteinaza według zastrz. 1 do wytwarzania preparatu do usuwania martwej lub złuszczającej się skóry ze zdrowej, pod innym względem, skóry.

11. Zastosowanie proteinazy serynowej uzyskanej z dorsza do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania chorobie u człowieka lub zwierzęcia wybranej z grupy obejmującej ból, ostre stany zapalne, przewlekle stany zapalne, zapalenie stawów, zapalenie ścięgien, zapalenie kaletki, zapalenie kości i stawów, reumatoidalne zapalenie stawów, młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów, posocznicowe zapalenie stawów, ból włókien mięśniowych, ogólny toczeń rumieniowaty, zapalenie żył, zapalenie ścięgna, wyprysk, łuszczycę, trądzik, egzemę, egzemę twarzy z łojotokiem, egzemę rąk, twarzy lub szyi, infekcje napletka, grzybicę między palcową u sportowców, infekcje przetokowe, infekcje z miejscowym owrzodzeniem, infekcje pępka u noworodków, zmarszczki, blizny, rany, czyraki, brodawki i swędzenie uczuleniowe, hemoroidy, rany, infekcje ran, stany zapalne ran, rany po oparzeniowe, infekcje grzybicze i choroby immunologiczne włącznie z chorobami autoimmunologicznymi.

12. Zastosowanie proteinazy serynowej uzyskanej z dorsza do wytwarzania leku do usuwania martwej lub złuszczającej się skóry ze skóry zdrowej pod innym względem.

13. Kompozycja farmaceutyczna znamienna tym, że zawiera proteinazę serynową uzyskaną z dorsza.

14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że proteinaza serynowa jest proteinazą określoną w zastrz. 2 albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9.

15. Kompozycja według zastrz. 13 albo 14, znamienna tym, że stanowi kompozycję do zastosowania miejscowego.

16. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że ma postać hydrożelu.

17. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że zawiera ponadto alkohol wielowodorotlenowy włącznie z glicerolem.

18. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera ponadto związek farmaceutycznie czynny.

19. Kompozycja kosmetyczna znamienna tym, że zawiera proteinazę serynową z dorsza.

20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że rybia proteinaza serynowa jest proteinazą określoną w zastrz. 2 albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9.

PL 202 532 B1

21. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że ma postać hydrożelu.

22. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że dodatkowo zawiera alkohol wielowodorotlenowy włącznie z glicerolem.

23. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że zawiera ponadto związek aktywny kosmetycznie.