ES2206448T3 - Heregulinas (hrgs), proteinas de union de p185?erb2. - Google Patents

Abstract

UNA NUEVA POLIPEPTIDA CON AFINIDAD DE LIGAZON PARA EL RECEPTOR P185HER2, DESIGNADA COMO HEREGULINA-(ALFA), HA SIDO IDENTIFICADA Y PURIFICADA A PARTIR DE CELULAS HUMANAS CULTIVADAS. SECUENCIAS DE DNA CODIFICANDO POLIPEPTIDAS HEREGULINA ADICIONALES, DESIGNADAS COMO HEREGULINA-(ALFA), HEREGULINA-(BETA)1, HEREGULINA-(BETA)2, SIMILARES A HEREGULINA-(BETA)2, Y HEREGULINA-(BETA)3, HAN SIDO AISLADAS, ORDENADAS Y EXPRESADAS. SE PROVEEN AQUI SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO CODIFICANDO LAS SECUENCIAS AMINO ACIDO DE HEREGULINAS USADAS EN LA PRODUCCION DE HEREGULINAS POR MEDIOS DE RECOMBINACION. ADEMAS SE PROVEEN LAS SECUENCIAS AMINO ACIDO DE HEREGULINAS Y METODOS DE PURIFICACION PARA ELLAS. LAS HEREGULINAS Y SUS ANTI-CUERPOS SE USAN COMO AGENTES TERAPEUTICOS Y EN METODOS DE DIAGNOSTICO.

Description

Heregulinas (HRGs), proteínas de unión de p185^{HER2}.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención hace referencia a ligandos polipeptídicos que se unen a receptores implicados en el crecimiento celular. En particular, hace referencia a ligandos polipeptídicos que se unen al receptor p185^{HER2}.

Descripción de los antecedentes y estado de la técnica

Los proto-oncogenes celulares codifican proteínas que se cree regulan la proliferación y la diferenciación celular normal. Las alteraciones en su estructura o la amplificación de su expresión, conducen al crecimiento celular anormal y se han asociado con la carcinogénesis (Bishop JM, Science 235:305-311 [1987]); (Rhims JS, Cancer Detection and Prevention 11:139-149 [1988]); (Nowell PC, Cancer Res 46:2203-2207 [1986]); (Nicolson GL, Cancer Res. 47:1473-1487 [1987]). Los proto-oncogenes se identificaron por primera vez mediante dos aproximaciones. En primer lugar, la caracterización molecular de los genomas de los retrovirus transformantes mostraron que los genes responsables de la capacidad de transformación de lo virus eran en muchos casos versiones alteradas de los genes que se hallan en los genomas de las células normales. La versión normal es el proto-oncogén, que se altera mediante mutación convirtiéndose en el oncogén. Un ejemplo de una de estas parejas génicas está representado por el receptor del EGF y el producto del gen v-erb-B. El producto del gen v-erb-B codificado por el virus se ha truncado y ha sufrido otras alteraciones que lo vuelven activo constitutivamente y le dotan de la capacidad para inducir la transformación celular (Yarden y col., Ann. Rev. Biochem. 57:443-478, 1988).

El segundo procedimiento para detectar genes de transformación celular que funcionen de forma dominante implica la transfección de DNA celular de las células tumorales de diversas especies en células diana no transformadas de una especie heteróloga. A menudo, esto se lleva a cabo mediante la transfección de DNAs humanos, aviares o de rata en la línea celular NIH 3T3 (Bishop JM, Science 235:305-311 [1987]); (Rhims JS, Cancer Detection and Prevention 11:139-149 [1988]); (Nowell PC, Cancer Res. 46:2203-2207 [1986]); (Nicolson GL, Cancer Res. 47:1473-1487 [1987]; (Yarden y col., Ann Rev. Biochem. 57:443-478 [1988]). Después de varios ciclos de aislamiento y retransfección del DNA genómico, se clonaron molecularmente los DNAs humanos o de otras especies diferenciándose del DNA del fondo murino y caracterizándose a continuación. En algunos casos, después de la transfección y el clonaje, se aislaron los mismos genes que los identificados mediante caracterización directa de los virus transformantes. En otros casos, se identificaron nuevos oncogenes. Un ejemplo de un nuevo oncogen identificado mediante este ensayo de transfección es el oncogen neu. Éste se descubrió por Weinberg y colaboradores en un experimentó de transfección, en donde el DNA inicial se derivaba de un neuroblastoma de rata inducido por carcinógenos (Padhy y col., Cell 28:865-871 [1982]); (Schecheter y col., Nature 312:573-516 [1984]). La caracterización del oncogen neu de rata demostró que presentaba la estructura de un receptor tirosina quinasa del factor de crecimiento, tenía homología con el receptor de EGF y difería de su homólogo normal, el proto-oncogén neu, por una mutación activadora en su dominio transmembrana (Bargmann y col., Cell 45:649-657 [1986]). El homólogo humano de neu es el proto-oncogén HER2, también denominado c-erb-B2 (Coussens y col., Science 230:1137-1139 [1985]), WO89/06692).

La asociación del proto-oncogén HER2 con el cáncer se estableció mediante una tercera aproximación, es decir, su asociación con el cáncer de mama humano. En primer lugar, el proto-oncogén HER2 se descubrió en las librerías de cDNAs por su homología con el receptor de EGF, con el que comparte similitudes estructurales (Yarden y col., Ann. Rev. Biochem., 57:443-478 [1988]). Cuando se utilizaron las sondas radioactivas derivadas de la secuencia del cDNA que codifica para p185^{HER2} para cribar muestras de DNA de pacientes con cáncer de mama, se observó una amplificación del proto-oncogen HER2 en aproximadamente el 30% de las muestras de los pacientes (Slamon y col., Science 235:177-182 [1987]). Posteriores estudios confirmaron esta observación original, sugiriendo una correlación importante entre la amplificación del proto-oncogén HER2 y/o la sobreexpresión y un peor diagnóstico en el cáncer de ovario y en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (Slamon y col., Science 244:707-712 [1989]); (Wright y col., Cancer Res 49:2087-2090, 1989); (Paik y col., J Clin Oncology 8:103-112 [1990]); (Berchuck y col., Cancer Res 50:4087-4091, 1990); (Kern y col., Cancer Res. 50:5184-5191, 1990).

La asociación de la amplificación/sobreexpresión de HER2 con una malignidad agresiva, tal como se describió anteriormente, implica que puede tener un papel importante en la progresión del cáncer humano; sin embargo, ya antes se habían descrito muchos antígenos de superficie celular relacionados con tumores y sólo unos pocos cuales parecen tener una función directa con la generación o progresión de la enfermedad (Schlom y col., Cancer Res. 50:820-827, 1990); (Szala y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 98:3542-3546).

Entre los proto-oncogenes se hallan aquellos que codifican para factores de crecimiento celular que actúan mediante la fosforilación de quinasas endoplásmicas de las proteínas citoplasmáticas. El gen HER1 (o erb-Bl) codifica para el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF). La cadena \beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas está codificada por el gen c-sis. El factor estimulador de la formación de colonias de granulocitos-macrófagos está codificado por el gen c-fms. El proto-oncogén neu se ha identificado en neuroblastomas de rata inducidos por etilnitrosourea. El gen HER2 codifica para la glicoproteína p185^{HER2} similiar al receptor tirosina quinasa de 1.255 aminoácidos que presenta una homología con el receptor del factor de crecimiento epitelial humano.

Los receptores tirosina quinasa tienen todos los mismos motivos estructurales: un dominio extracelular que se une al ligando y un dominio intracelular de tirosina quinasa necesario para la transducción de señal y la transformación. Estos dos dominios están conectados por una secuencia corta de aproximadamente 20 aminoácidos mayoritariamente hidrofóbicos, denominada secuencia transmembrana. Se cree que esta secuencia transmembrana juega un papel importante en la transferencia de señal generada por la unión al ligando desde el exterior al interior de la célula. De acuerdo con esta estructura, la glicoproteína humana p185^{HER2}, localizada en la superficie celular, puede dividirse en tres porciones principales: un dominio extracelular, o ECD (también conocido como XCD); una secuencia transmembrana; y un dominio intracelular de tirosina quinasa citoplasmático. Aunque se supone que el dominio extracelular es un receptor del ligando, el ligando de p185^{HER2} todavía no se ha identificado positivamente.

No se ha identificado un ligando específico de unión a p185^{HER2}, aunque Lupu y col., (Science, 249:1552-1555, 1989) describen una glicoproteína inhibidora de 30 KD secretada por las células de cáncer de mama humano que se supone es un ligando putativo de p185^{HER2}. Lupu y col., Science, 249:1552-1555 (1990); Proceedings of the American Assoc. for Cancer Research, vol 32, Abs 297, Marzo 1991) publicaron la purificación de un factor de 30 KD a partir de células MDA-MB-231 y de un factor de 75 KD de las células SK-BR-3 que estimulaban la p185^{HER2}. El factor publicado de 75 KD indujo la fosforilación de p185^{HER2} y moduló la proliferación celular y la formación dé colonias de las células SK-BR-3 que sobreexpresaban el receptor p185^{HER2}. El factor de 30 KD compite con el muMab 4D5 por la unión a p185^{HER2} y su efecto sobre el crecimiento en las células SK-BR-3, fue dependiente de su concentración (estimulador a baja concentración e inhibidor a concentraciones mayores). Además, estimuló el crecimiento de las células MDA-MB-468 (EGF-R positivo, p185^{HER2} negativo), estimuló la fosforilación del receptor de EGF y pudo obtenerse a partir de células SK-BR-3. En el sistema neu de rata, Yarden y col., (Biochemistry, 30:3543-3550, 1991) describen una glicoproteína de 35 KD, ligando candidato para el receptor codificado neu secretado por fibroblastos transformados por ras. Dobashi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8582-8586 (1991); Biochem. Biophys. Res. Commum.; 179:1536-1542 (1991), describieron un factor de activación proteico específico de la proteína neu (NAF), secretado por la línea celular T ATL-2 humana y que tiene un peso molecular en el intervalo de 8-24 KD. También se describió un ligando de 25 KD de macrófagos activados (Tarakjovsky y col., J. Cancer Res, 2188-2196 (1991).

En la patente internacional WO89/06692, se describen los procedimientos para el ensayo in vivo de tumores utilizando anticuerpos monoclonales específicos para HER2 y los procedimientos de tratamiento de células tumorales utilizando anticuerpos monoclonales específicos para HER2.

Actualmente, existe una necesidad continuada en la materia para la identificación del ligando o ligandos reales que activen la p185^{HER2} y para identificar su(s) función biológica, incluyendo las funciones implicadas en el crecimiento y diferenciación celular, la transformación celular y la creación de neoplasmas malignos.

Según ello, es un objetivo de la presente invención identificar y purificar uno o más polipéptidos ligandos de p185^{HER2} nuevos que se unan y estimulen la p185^{HER2}.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar los ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos ligandos nuevos que se unen a la p185^{HER2} y utilizar dicho ácido nucleico para producir un polipéptido ligando de unión a la p185^{HER2} en el cultivo de células recombinantes para su utilización diagnóstica o terapéutica y para la producción de antagonistas terapéuticos para el tratamiento de algunas enfermedades metabólicas, incluyendo pero sin restringirse necesariamente a la eliminación, la inhibición y/o el diagnóstico por la imagen de tumores y células tumorigénicas.

Es otro objetivo proporcionar derivados y formas modificadas de ligandos glicoproteicos nuevos, incluyendo variantes de secuencia aminoacídica, polipéptidos de fusión que combinan un ligando de unión a p185^{HER2} y una proteína heteróloga y derivados covalentes de un ligando de unión a p185^{HER2}.

Otro objetivo más es preparar inmunógenos para generar anticuerpos contra los ligandos de unión a p185^{HER2}, así como también obtener anticuerpos capaces de unirse a dichos ligandos y anticuerpos que se unan a un ligando de unión a p185^{HER2}, evitando así la activación de pl85^{HER2} por el ligando. Otro objetivo más es preparar inmunógenos que comprendan un ligando de unión a p185^{HER2} fusionado con un polipéptido heterólogo inmunogénico.

Estos y otros objetivos de la presente invención serán evidentes al experto en la materia tras considerar la especificación en su conjunto.

Resumen de la invención

De acuerdo con los objetivos de la presente invención, se han identificado y aislado nuevas familias de ligandos que se unen a p185^{HER2}. Estos ligandos se denominan polipéptidos de heregulina (HRG) e incluyen la HRG-\alpha, la HRG-\beta1, la HRG-\beta2, la HRG-\beta3 y otros polipéptidos HRG que reaccionan de forma cruzada con los anticuerpos dirigidos contra los miembros de esta familia y/o son esencialmente homólogos a los definidos más adelante. Una HRG preferida es el ligando descrito en la Fig. 4 y sus fragmentos, denominada posteriormente HRG-\alpha. Otras HRGs preferidas son los ligandos y sus fragmentos descritas en la Figura 8 y denominados HRG-\beta1, HRG-\beta2 descrito en la Figura 12 y la HRG-\beta3 descrita en la Figura 13.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una HRG que se ha aislado de su fuente original, en particular la HRG que está exento de polipéptidos humanos contaminantes. La HRG se purifica mediante absorción a sepharose-heparina, resinas de intercambio catiónico (p.ej., poliaspártico) y HPLC de fase inversa.

La HRG o fragmentos de HRG (que también pueden sintetizarse mediante procedimientos in vitro) se fusionan (mediante expresión recombinante o por un enlace peptidil in vitro) a un polipéptido inmunogénico y este polipéptido de fusión, a su vez, se utiliza para generar anticuerpos contra un epítopo de HRG. Los anticuerpos anti-HRG se recuperan del suero de animales inmunizados. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células in vitro o de animales inmunizados in vivo de manera convencional. Los anticuerpos preferidos identificados mediante cribaje de rutina se unirán a la HRG pero no reaccionarán esencialmente de forma cruzada con ningún otro ligando conocido como el EGF y evitarán así que la HRG active a la p185^{HER2}. Además, los anticuerpos anti-HRG se seleccionan para ser capaces de unirse específicamente a miembros individuales de la familia de HRG, p.ej., HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRG-\beta2, HRG-\beta3 y por lo tanto pueden actuar como antagonistas específicos de ésta.

La HRG también se modifica in vitro para preparar HRG inmovilizada y HRG marcada, en particular con propósitos de diagnóstico de HRG o de sus anticuerpos, o mediante purificación por afinidad de anticuerpos de HRG. Los anticuerpos anti-HRG inmovilizados son de utilidad en el diagnóstico (in vitro o in vivo) o para la purificación de HRG. En una realización preferida, una mezcla de HRG y de otros péptidos se pasa por una columna en donde se han unido los anticuerpos anti-HRG.

Las variantes sustitucionales, delecionales o insercionales de HRG se preparan mediante procedimientos in vitro o recombinantes, seleccionándose a continuación, por ejemplo, por su inmuno-reactividad cruzada con las formas nativas de HRG o por su actividad antagonista o agonista de HRG.

En otra realización preferida, se utiliza la HRG para estimular la actividad de p185^{HER2} en las células normales. En otra realización preferida, se utiliza una variante de HRG como un antagonista para inhibir la estimulación de p185^{HER2}.

La HRG, sus derivados o sus anticuerpos se formulan en vehículos aceptables fisiológicamente, especialmente para la utilización terapéutica. Dichos vehículos incluyen formulaciones de liberación prolongada de HRG o de variantes de HRG. También se proporciona una composición que comprende la HRG y un vehículo aceptable farmacéuticamente y un polipéptido aislado que comprende la HRG fusionada a un polipéptido heterólogo.

En otros aspectos, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para una HRG, pudiendo estar dicho ácido nucleico marcado o no con una molécula detectable y una secuencia de ácido nucleico que es complementaria o que hibrida en condiciones astringentes a, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una HRG.

La secuencia de ácido nucleico también es de utilidad en los ensayos de hibridación del ácido nucleico de HRG y en un procedimiento para determinar la presencia de una HRG. Dichos procedimientos comprenden la hibridación del DNA (o RNA) que codifica para (o es complementario a) una HRG con un ácido nucleico de la muestra a analizar y la determinación de la presencia de una HRG. La invención proporciona también un procedimiento de amplificación de un ácido nucleico de la muestra a analizar, que comprende una reacción (en cadena) de la polimerasa de ácidos nucleicos con el ácido nucleico (DNA o RNA) que codifica (o es complementario de) una HRG.

En otros aspectos, el ácido nucleico es DNA y comprende además un vector replicable que comprende el ácido nucleico que codifica para una HRG unida i operativamente a secuencias control que son reconocidas por un huésped transformado por el vector; las células huésped transformadas con el vector; y un procedimiento de utilización de un ácido nucleico que codifica para una HRG para realizar la producción de la HRG, que comprende la expresión de un ácido nucleico de HRG en un cultivo de células huésped transformadas y la recuperación de una HRG del cultivo de células huésped.

En otras realizaciones, la invención proporciona un procedimiento para la producción de una HRG que comprende: la inserción en el DNA de una célula, que contiene el ácido nucleico que codifica para una HRG, de un elemento modulador de la transcripción en la suficiente proximidad suficiente y orientación con un ácido nucleico como para influenciar (suprimir o estimular) la transcripción, con una etapa adicional opcional que comprende el cultivo de células que contienen el elemento modulador de la transcripción y un ácido nucleico de HRG.

En otras realizaciones, la invención proporciona una célula que comprende el ácido nucleico que codifica para una HRG y un elemento exógeno modulador de la transcripción en la suficiente proximidad y orientación con un ácido nucleico de HRG como para influenciar la transcripción; y una célula huésped que contiene el ácido nucleico que codifica para una HRG unida operativamente a las secuencias control exógenas que son reconocidas por la célula huésped.

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Descripción resumida de las figuras

Figura 1

Purificación de la Heregulina con una columna de ácido poli-aspártico

Se llevó a cabo una cromográfía en columna de ácido aspártico de la heregulina-\alpha y se cuantificó el perfil de elución de proteínas a A_{214}. El eluido con NaCl 0,6 M de la etapa de purificación con Sepharose-heparina se diluyó hasta NaCl 0,2M con agua y se cargó en una columna de ácido poliaspártico equilibrada con fosfato 17 mM, pH 6,8 y etanol al 30%. Se inició un gradiente lineal de NaCl desde 0,3 a 0,6 M en el tiempo 0 y se completó a los 30 minutos. Se analizaron las fracciones en un ensayo de autofosforilación de tirosinas. Las fracciones correspondientes al pico C se agruparon para una purificación posterior con una HPLC de fase inversa C4.

Figura 2

Purificación de fase inversa C4 de la Heregulina-2

Panel A

El agrupado C de la columna de ácido poliaspártico se aplicó a una columna HPLC C4 (SynChropak RP-4) equilibrada con TFA al 0,1% y se eluyeron las proteínas con un gradiente lineal de acetonitrilo a 0,25%/minuto. Se muestra el gráfico de absorbancias para la migración numerada C4-17. Se recogieron fracciones de 1 mililitro para el ensayo.

Panel B

Se analizaron alícuotas de 10 microlitros de las fracciones analizadas en el ensayo de autofosforilación de tirosinas de HRG. Los niveles de fosforilación en la proteína p185^{HER2} fueron cuantificados por un anticuerpo antifosfotirosina específico y expresados como unidades arbitrarias en las abcisas.

Panel C

Se obtuvieron fracciones de 10 microlitros y se sometieron a electroforesis en geles de SDS de gradiente de acrilamida del 4-20% de acuerdo con el procedimiento de Laemmli (Nature, 227:680-685, 1970). Los pesos moleculares de las proteínas estándares están indicados a la izquierda del carril que contiene los estándares. El pico mayor de actividad de fosforilación de tirosina, hallado en la fracción 17 se asoció con una banda importante de 45.000 D (HRH-\alpha).

Figura 3

Gel de poliacrilamida y SDS que muestra la purificación de la Heregulina-\alpha

En el carril 1, se muestran los marcadores de peso molecular. Las alícuotas del medio condicionado MDA-MB-231 (Carril 2), el agrupado con NaCl 0,6 M de la columna de Sepharose-heparina (Carril 3), el agrupado C de la columna de ácido poliaspártico (Carril 4) y la Fracción 17 de la columna de HPLC (C4-17) (Carril 5) se migraron en electroforesis en gel de gradiente al 4-20% y se tiñeron con plata. Los carriles 6 y 7 contenían únicamente tampón y mostraron la presencia de artefactos del gel en la región de peso molecular de 50-65 KD.

Figuras 4a-4d

Se muestra la secuencia aminoacídica deducida del cDNA contenido en \lambdat_{10}herl6 (SEC ID N°:12 y SEC ID N°:13). Los nucleótidos están numerados en el extremo superior izquierdo de cada línea y los aminoácidos escritos según el código de tres letras están numerados en el extremo inferior izquierdo de cada línea. La secuencia nucleotídica correspondiente con la sonda es la de los nucleótidos 681-720. El dominio transmembrana probable contiene los aminoácidos 287-309. Las seis cisteínas del motivo EGF son la 226, 234, 240, 254, 256 y 265. Los 5 sitios potenciales de N-glicosilación de tres aminoácidos corresponden a los aminoácidos 164-166, 170-172, 208-210, 437-439 y 609-611. Las dianas de O-glicosilación potenciales de serina-treonina son 209-221. Los sitios de adición de glicosaminoglicanos potenciales en los dipéptidos serina-glicina son los aminoácidos 42-43, 64-65 y 151-152. La metionina iniciadora (MET) se halla en la posición #45 de la figura 4, aunque el residuo N-terminal procesado es el S46.

Figura 5

Análisis de transferencia de Northern de los RNAs de MDA-MB-231 y SKBR3

Dichos RNAs, señalados de izquierda a derecha, son los siguientes: 1) RNA minus poliA- de MDA-MB-231 (RNA restante después de eliminar el RNA poliA); 2) mRNA plus poliA de MDA-MB-231 (RNA que contiene poliA); 3) RNA minus poliA de SKBR3; y 4) mRNA plus poliA de SKBR3. La sonda utilizada para este análisis fue un fragmento de DNA digerido por la endonucleasa de restricción XhoI y marcado internamente con P^{32}, procedente de la porción de cDNA de \lambdagt10her16.

Figura 6

Comparaciones de secuencia aminoacídica en la familia de proteínas de EGF

Las secuencias de algunas proteínas semejantes a EGF (SEC ID. Nº 14, 15, 16, 17, 18 y 19) alrededor del dominio de cisteína están alineadas con la secuencia de la HRG-\alpha. La localización en la figura 6 de las cisteínas y de los residuos invariables de glicina y arginina en las posiciones 238 y 264 muestran claramente que HRG-\alpha es un miembro de la familia de EGF. En la Figura 6, La región de mayor identidad aminoacídica de los miembros de la familia en relación con la HRG-\alpha (30-40%) se halla entre la Cys 234 y la Cys 265. La mayor identidad (40%) se halla en las especies de EGF de unión a heparina (HB-EGF).La HRG-\alpha tiene un único inserto de 3 aminoácidos entre la Cys 240 y la Cys 254. Los dominios transmembrana potenciales están enmarcados (287-309). Las líneas discontinuas indican los sitios carboxi-terminales del EGF y del TGF-alfa en donde el corte proteolítico separa los factores de crecimiento maduros de sus preformas asociadas transmembrana. El HB-EGF es el factor de crecimiento epitelial de unión a heparina; el EGF es el factor de crecimiento epitelial; el TGF-alfa es el factor alfa de crecimiento transformador y schawnnoma es el factor de crecimiento derivado de schawnnomas. Los números de los residuos en la Fig. 6 corresponden con los convenidos en la Fig. 4.

Figura 7

Estimulación del crecimiento celular por la HRG-\alpha

Se analizaron tres líneas celulares distintas para conocer las respuestas de crecimiento a HRG-\alpha 1 nM. La proteína celular se cuantificó mediante tinción con cristal violeta y las respuestas se normalizaron para controlar las células no tratadas.

Las Figuras 8a-8d (SEC ID Nº:7) muestran la secuencia completa nucleotídica del DNA codificante potencial de la heregulina-\beta1 y la secuencia aminoacídica deducida del cDNA contenido en \lambdaher, 11.1dbl (SEC ID Nº:9). Los nucleótidos se numeran en la parte superior izquierda de cada línea y los aminoácidos escritos con el código de tres letras se numeran en la parte inferior izquierda de cada línea. El dominio aminoacídico transmembrana probable comprende los aminoácidos 278-300. Las seis cisteínas del motivo de EGF son la 212, 220, 226, 240, 242 y 251. Los cinco sitios potenciales de N-glicosilación de tres aminoácidos son 150-152, 156-158, 196-198, 428-430 y 600-612. Los sitios potenciales de O-glicosilación de serina-treonina son 195-207. Las dianas de adición potencial del glicosamino-glicano en el dipéptido serina-glicina son los aminoácidos 28-29, 50-51 137-138. La metionina de iniciación (MET) se halla en posición #31. La HRG-\beta1 se procesa en el residuo S32 del extremo N-terminal.

La Figura 9 muestra una comparación de secuencias aminoacídicas de heregulina-\alpha y \beta-1. Una línea (-) indica la ausencia de aminoácidos en esa posición. (SEC ID Nº:8 y SEC ID Nº:9). Esta Fig. utiliza la numeración convencional de las Figs. 4 y 6.

La Figura 10 muestra la estimulación de la autofosforilación de HER2 utilizando HRG-\alpha recombinante cuantificada mediante la fosforilación de tirosinas de HER2.

La Figura 11 muestra la secuencia nucleotídica y aminoacídica de \lambda15'her13 (SEC ID Nº:22); el tipo de numeración de los residuos aminoacídicos es único para esta figura.

Las Figuras 12a-12e muestran la secuencia nucleotídica de \lambdaher76, que codifica para la heregulina-\beta2 (SEC ID N°:23). Esta figura inicia la numeración de residuos aminoacídicos con la MET N-terminal expresada; el aminoácido del extremo N-terminal es S2.

Las Figuras 13a-13c muestran la secuencia nucleotídica de \lambdaher78, que codifica para la heregulina-\beta3 (SEC ID Nº:24). Esta figura utiliza el acuerdo de numeración de la Fig. 12; S2 es el aminoácido N-terminal procesado.

Las Figuras 14a-14d muestran la secuencia nucleotídica de \lambdaher84, que codifica para un polipéptido similar a la heregulina-R2 (SEC ID Nº:25). Esta figura utiliza el acuerdo de numeración de la Fig. 12; S2 es el aminoácido
N-terminal procesado.

Las Figuras 15a-15c muestran las identidades de secuencia aminoacídica entre las heregulinas conocidas (\alpha, \beta1, \beta2, similar a \beta2 y \beta3 en orden descendente) y muestra las inserciones, las deleciones o sustituciones aminoacídicas que diferencian las distintas formas (SEC ID Nº:26-30). Esta figura utiliza el acuerdo de numeración aminoacídico de las Figs. 12-14.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

En general, las siguientes palabras tienen la definición indicada cuando se utilizan en la descripción, ejemplos y reivindicaciones.

Heregulina ("HRG") se define aquí como cualquier secuencia polipeptídica aislada que posee una actividad biológica de un polipéptido descrito en las Figs. 4, 8, 12, 13 ó 15 y como fragmentos, alelos o análogos de animales de lo mismo. La HRG excluye cualquier polipéptido identificado anteriormente, incluyendo cualquier polipéptido conocido, ya mencionado en el Código normativo de los Estados Unidos 35 U.S.C. 102, así como los polipéptidos mencionados en el código 35 U.S.C. 103, incluyendo en particular el EGF, TGF-\alpha, la antiregulina (Plowman y col., Mol. Cell Biol., 10:1969 (1990), HB-EGF (Higashimaya y col., Science 251:396 [1991]), factor de schwannoma o polipéptidos de lo mismo.

La "actividad biológica", para los propósitos aquí expresados, hace referencia a una función efectora o a una función antigénica in vivo realizada directamente por un polipéptido HRG (bien en su conformación nativa o desnaturalizada), o por cualquier subsecuencia de lo mismo. Las funciones efectoras incluyen la unión del receptor o la activación, la inducción o la diferenciación, la actividad mitogénica o de promoción del crecimiento, la modulación inmune, las funciones reguladoras del DNA y similares, ya sean poco conocidas o inherentes. Las funciones antigénicas incluyen la posesión de un sitio epitópico o antigénico capaz de reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos generados contra un polipéptido de HRG de origen natural, o un polipéptido de HRG desnaturalizado o un fragmento de lo mismo.

La HRG activa biológicamente incluye los polipéptidos que tienen una función efectora y antigénica, o únicamente una de dichas funciones. La HRG incluye los polipéptidos antagonistas de HRG, siempre que los antagonistas incluyan un epítopo de una HRG nativa. Una función efectora conocida y principal de HRG es la capacidad de unirse a p185^{HER2} y de activar el receptor tirosina quinasa.

La HRG incluye la secuencia aminoacídica traducida de las HRGs humanas de tamaño completo (proHRG) que se muestran en las figuras; los derivados desglicosilados o no glicosilados; las variantes de secuencia aminoacídica; y los derivados covalentes de HRG, siempre que posean actividad biológica. Mientras que la preforma nativa de HRG es probablemente un polipéptido unido a membrana, las formas solubles, como las formas que carecen de un dominio transmembrana funcional (proHRG o sus fragmentos), también se incluyen dentro de esta definición.

Los fragmentos de HRG intactos se incluyen dentro de la definición de HRG. Dentro de los fragmentos se incluyen dos dominios principales. Uno de ellos es el dominio del factor de crecimiento ("GFD"), homólogo a la familia del EGF y localizado en aproximadamente los residuos S216-A227 a N268-R286 (Fig. 9, HRG-\alpha; los dominios GFD para otras HRGs (Fig. 15) son las secuencias homólogas). Preferentemente, los GFDs para HRG-\alpha, \beta1, \beta2, similar a \beta2 y \beta3 son, respectivamente, G175-K241, G175-K246, G175-K238, G175-K238 y G175-E241 (Fig. 15).

El otro fragmento de interés es el dominio N-terminal ("NTD"). El NTD se extiende desde el extremo N-terminal del residuo de HRG procesado (S2) al residuo adyacente al N-terminal de GFD, es decir, aproximadamente T172-C182 (Fig. 15) y preferentemente T174. Un grupo adicional de fragmentos son los dominios NTD-GFD, equivalentes a los dominios extraacelulares de HFG-\alpha y \beta1-\beta2. Otro fragmento es el péptido C-terminal ("CTP") localizado a aproximadamente 20 residuos N-terminal del primer residuo del dominio transmembrana, bien solo o en combinación con los residuos restantes C-terminal de la HRG.

En realizaciones preferidas, la HRG activa antigénicamente es un polipéptido que se une con una afinidad de por lo menos 10^{7} l/ml a un anticuerpo generado contra una secuencia HRG de origen natural. Generalmente, el polipéptido se une con una afinidad de por lo menos 10^{8} l/mol. Más preferentemente, la HRG activa antigénicamente es un polipéptido que se une a un anticuerpo generado contra una de las HRGs en su conformación nativa. La HRG en su conformación nativa es generalmente igual que una HRG de origen natural que no ha sido desnaturalizada por agentes caotrópicos, calor u otros tratamientos que modifican esencialmente la estructura tridimensional de la HRG, determinada, por ejemplo, mediante migración en geles de calibración del tamaño no-reductores y no-desnaturalizantes. El anticuerpo utilizado en esta determinación es el anticuerpo póliclonal de conejo generado mediante formulación de una HRG nativa de una especie de conejo en adyuvante completo de Freund, inyección subcutánea de la formulación en los conejos y estimulación de la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta lograr un título en la meseta de anticuerpo anti-HRG.

Generalmente, la HRG activa biológicamente tendrá una secuencia aminoacídica con por lo menos una identidad de secuencia aminoacídica del 75% con una secuencia de HRG, más preferentemente de por lo menos el 80%, aún más preferentemente de por lo menos el 90% y todavía más preferentemente de por lo menos el 95%. La identidad o la homología respecto a una secuencia HRG se define aquí como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos HRG en las Figs. 15., después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad, sin considerar las sustituciones conservadoras como residuos idénticos. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N-terminales o C-terminales en la secuencia HRG deberían interpretarse que afectan la identidad de secuencia.

Así, los polipéptidos HRG activos biológicamente, objeto de la presente invención, incluyen cada una de las secuencias HRG expresadas o procesadas; los fragmentos de lo mismo con una secuencia consecutiva de por lo menos 15, 20, 25, 30 ó 40 residuos aminoacídicos; las variantes de secuencia aminoacídica de HRG en donde un residuo aminoacídico se ha insertado- en el extremo N- o C-terminal, o dentro de la secuencia HRG o de sus fragmentos, tal como se definió anteriormente; las variantes de secuencia aminoacídica de la secuencia HRG o de sus fragmentos, tal como se definió anteriormente en donde un residuo se ha sustituido por otro residuo. Los polipéptidos HRG incluyen los que contienen mutaciones predeterminadas mediante, p.ej., mutagénesis dirigida o por PCR. La HRG incluye las HRG de especies como el conejo, la rata, el cerdo, primates no-humanos, equinos, murinos y ovinas y las variantes alélicas u otras variantes de lo mismo; los derivados de HRG o sus fragmentos tal como se definieron anteriormente, en donde la HRG o sus fragmentos se han modificado covalentemente mediante sustitución, métodos químicos, enzimáticos u otros medios adecuados con una porción aminoacídica distinta a la de origen natural (por ejemplo, una porción detectable como una enzima o un radioisótopo); las variantes de glicosilación de HRG (inserción de un sitio de glicosilación o deleción de cualquier sitio de glicosilación mediante deleción, inserción o sustitución de un residuo aminoacídico adecuado); y las formas solubles de HRG, como HRG-GFD o las que carecen de un dominio transmembrana funcional.

De especial interés son las proteínas de fusión que contienen HRG-NTD pero están exentas de GFD, comúnmente asociado con HRG-NTD en cuestión. Los primeros 23 aminoácidos del NTD están dominados por residuos de carga negativa y contienen una secuencia (GKKKER; residuos 13-18, Fig. 15) que se asemeja fuertemente al motivo de secuencia consenso para el direccionamiento nuclear (Roberts, Biochem. Biophys. Acta. 1008:263 [1989]). Según ello, la HRG incluye fusiones en las que el NTD o por lo menos un polipéptido que comprende los primeros 23 residuos, se fusiona por un extremo con un polipéptido no-HRG, o con un GFD de otro miembro de la familia HRG. En esta realización, el polipéptido no-HRG es una proteína reguladora, un factor de crecimiento como el EGF o el TGF-\alpha, o un ligando polipeptídico que se une a un receptor celular, en particular un receptor de superficie celular que se halla en la superficie de una célula cuya regulación se desea, p.ej., una célula cancerosa.

En otra realización, se varían de forma independiente uno o más residuos de los residuos 13-18 para producir una secuencia incapaz de dirigirse al núcleo. Por ejemplo, se muta el G13 a cualquier residuo de origen natural incluyendo P, L, I, V, A, M, F, K, D o S; se muta uno o más de un residuo de K-14-K16 a cualquier otro residuo de origen natural incluyendo R, H, D, E, N o Q; se muta E17 a cualquier otro residuo de origen natural incluyendo D, R, K, H, N o Q; y se muta R18 a cualquier otro residuo de origen natural incluyendo K, H, D, E, N o Q. También, se delecionan todos o alguno de los residuos 13-18, o se insertan residuos foráneos adyacentes a estos residuos; por ejemplo, se insertan residuos adyacentes a los residuos 13-18, que son los mismos que las sustituciones sugeridas anteriormente para dichos residuos.

En otra realización, se fusionan enzimas o una proteína reguladora nuclear, por ejemplo un factor regulador de la transcripción, con HRG-NTD, HRG-NTD-GFD, o HRG-GFD. La enzima o factor se fusiona con el extremo N- o C-terminal, o se inserta entre los dominios NTD y GFD, o se sustituye por la región de NTD entre los 23 primeros residuos y el GFD.

La HRG "aislada" hace referencia a que la HRG se ha identificado y está exenta de componentes de su entorno original. Los componentes contaminantes de su entorno original incluyen materiales que podrían interferir con utilizaciones diagnósticas o terapéuticas de HRG y pueden incluir proteínas, hormonas y otras sustancias. En realizaciones preferidas, la HRG se purificará (1) por encima del 95% en peso de proteína, tal como se determina por el procedimiento de Lowry u otro procedimiento de determinación de proteínas validado y más preferentemente por encima del 99% en peso, (2) a una grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna utilizando el mejor secuenciador de aminoácidos disponible comercialmente hasta la fecha, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE con azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. La HRG aislada incluye la HRG in situ dentro de las células recombinantes heterólogas, ya que por lo menos un componente del entorno original de HRG no estará presente. La HRG aislada incluye la HRG de una especie en un cultivo de células recombinantes de otra especie, estando la HRG en este caso desprovista de polipéptidos de la fuente original. Aunque, generalmente, la HRG aislada se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

De acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico añadido de HRG es RNA o DNA que contiene más de 10 bases que codifican para una HRG activa biológica o antigénicamente, dicho ácido nucleico es complementario a una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha HRG, o hibrida con la dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha HRG, permaneciendo unido de forma estable con dicha secuencia en condiciones astringentes.

Preferentemente, el ácido nucleico de HRG codifica para un polipéptido que comparte por lo menos un 75% de identidad de secuencia, más preferentemente un 80% por lo menos, todavía más preferentemente un 85% por lo menos y aún más preferentemente un 90% y mejor si es un 95% de identidad de secuencia con una secuencia HRG, tal como se muestra en las Figuras 4, 8, 12, 13 ó 15. Preferentemente, el ácido nucleico de HRG añadido que hibrida comprende por lo menos 20 bases, más preferentemente 40 y todavía más preferentemente 90 bases. Dicho ácido nucleico que hibrida o es complementario excluye, sin embargo, el ácido nucleico que codifica para EGF, TGF-\alpha, la amfiregulina, HB-EGF, el factor de schwannoma o los fragmentos o variantes de lo mismo, que serían evidentes al igual que los citados anteriormente.

El ácido nucleico de HRG aislado incluye un ácido nucleico que está exento de por lo menos un ácido nucleico contaminante que está generalmente asociado en la forma natural del ácido nucleico de HRG. El ácido nucleico de HRG aislado está, en consecuencia, presente en otra forma distinta a la hallada en la naturaleza. Sin embargo, el ácido nucleico que codifica para HRG incluye el ácido nucleico de HRG de las células que expresan ordinariamente la HRG en una localización cromosómica distinta a la de las células naturales, es decir flanqueado por una secuencia de DNA distinta de la hallada en la naturaleza. El ácido nucleico que codifica para la HRG puede utilizarse en ensayos de hibridación específica, en particular aquellas porciones de HRG que codifican para la secuencia que no hibrida con otras secuencias de DNA conocidas, por ejemplo, aquellas que codifican para moléculas similares al EGF de la Figura 6.

El término "condiciones astringentes" hace referencia a que (1) se emplea una fuerza iónica baja y elevadas temperaturas para el lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M /citrato sódico 0,0015 M/NaDodSO4 al 0,1% a 50ºC; (2) se utiliza durante la hibridación un agente desnaturalizante como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina sérica bovina al 0,1%, Ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) se utiliza formamida al 50%, 5XSSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de 5x Denhardts, DNA de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2XSSC y SDS al 0,1%.

En particular, los ácidos nucleicos de HRG-\alpha son ácidos nucleicos u oligonucléotidos que consisten de, o comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre las secuencias de las Figs. 4a-4d y que contienen más de 17 bases (excluyendo las secuencias del DNA humano, pequeño, circular y polidisperso (HUMPC 125), el homólogo del proto-oncogen c-mos de pollo (CHKMOS), el proteoglicano heparin-sulfato de membrana basal (HUMBMHSP) y el pseudogén lipocortin 2 humano (región semejante a la codificante completa, HUMLIP2B), generalmente más de 20 bases y preferentemente más de 25 bases, junto con las secuencias complementarias de lo mismo.

En particular, los ácidos nucleicos de HRG-\beta1, \beta2 o \beta3 son ácidos nucleicos u oligonucleótidos que consisten de, o comprenden una secuencia nucleotidica seleccionada de entre las Figs. 8a-8d, 12a-12e o 13a-13c y contiene más de 20 bases, pero no incluye la secuencia poli-A hallada en el extremo 3' de cada gen, tal como se indica en las figuras, junto con los complementos a dichas secuencias. Preferentemente, la secuencia contiene más de 25 bases. Las secuencias de HGRG-\beta también excluyen la secuencia del DNA humano circular, polidisperso y pequeño (HUMP-C125).

En otras realizaciones, la secuencia nucleotídica de HRG contiene unas 15 o más bases de secuencia HRG y se selecciona a partir de la secuencia codificante para el dominio HRG que se extiende desde el extremo N-terminal del GFD al extremo N-terminal de la secuencia transmembrana (o el complemento de dicha secuencia de ácidos nucleicos). Por ejemplo, en relación con la HRG-\alpha, la secuencia nucleotídica se selecciona de entre la secuencia 678-869 (Fig. 4b) y contiene una secuencia de 15 o más bases de esta sección del ácido nucleico de HRG.

En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de HRG es superior a 14 bases y se selecciona a partir de una secuencia nucleotídica única para cada subtipo, por ejemplo una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia aminoacídica única para cada uno de los subtipos HRG (o el complemento de dicha secuencia de ácido nucleico). Estas secuencias son útiles en los ensayos diagnósticos para la expresión de varios subtipos, así como para la amplificación específica del DNA del subtipo. Por ejemplo, la secuencia de HRG-\alpha de interés se seleccionaría a partir de la secuencia que codifica para la secuencia única N-terminal o de unión a GFD-transmembrana, p.ej., aproximadamente en las bases 771-860. De modo similar, una única secuencia HRG-\beta1 es aquella que codifica para los 15 últimos residuos de aminoácidos C-terminal; esta secuencia no se halla en HRG-\alpha.

En general, la longitud de la secuencia HRG-\alpha o \beta superior al número de bases indicado anteriormente es irrelevante, ya que todos estos ácidos nucleicos son útiles como sondas o cebadores de amplificación. La secuencia HRG seleccionada puede contener secuencia HRG adicional, bien la secuencia normal flanqueante u otras regiones del ácido nucleico de HRG, así como también otras secuencias de ácido nucleico. Para los propósitos de hibridación, únicamente importa la secuencia HRG.

El término "secuencias control" hace referencia a las secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped determinado. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente otras secuencias todavía no identificadas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y secuencias incrementadoras de la transcripción.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se halla en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA de una presecuencia o de un líder secretor está unido operativamente al DNA para un polipéptido que se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o una secuencia incrementadora de la transcripción están unidos operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está posicionado para facilitar la traducción. En general, el término "unido operativamente" hace referencia a que las secuencias que se han unido al DNA son contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas en una misma fase de lectura. Sin embargo, las secuencias incrementadoras de la transcripción no tienen porque ser contiguas. La unión se logra mediante la ligación en las dianas de restricción adecuadas. Si dichas dianas no existieran, entonces se utilizan adaptadores oligonucleotídicos sintéticos, o engarces de acuerdo con la práctica convencional.

Un elemento "exógeno" se define aquí como una secuencia de ácido nucleico que es extraña a la célula, u homóloga para la célula pero en una posición en el ácido nucleico del huésped que no es la habitual para dicho elemento.

\newpage

Tal como se utilizan aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" son intercambiables y dichas designaciones incluyen la progenie. Así, las palabras, "transformantes" y "células transformadas" incluyen el cultivo primario de las células en cuestión y los cultivos derivados sin tener en cuenta el número de pasajes. También se sobreentiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye así mismo la progenie mutante que tiene la misma función, o actividad biológica que la analizada en la célula transformada originalmente. Será evidente por el contexto el contenido de las distintas designaciones utilizadas.

Los "plásmidos" se designan por una letra minúscula "p" precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de la presente invención están comercialmente disponibles, son de disponibilidad pública de acuerdo con unas bases restringidas, o pueden construirse a partir de los plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Además, son conocidos en la materia otros plásmidos equivalentes y serán evidentes para un experto en la materia.

La "digestión por enzimas de restricción" del DNA hace referencia al corte catalítico del DNA con una enzima que actúa únicamente en ciertas localizaciones en el DNA. Dichas enzimas son denominadas endonucleasas de restricción y las dianas para las que son especificas se denominan dianas de restricción. Las diversas enzimas de restricción utilizadas aquí están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se utilizan tal como se establece por el fabricante. Las enzimas de restricción utilizadas comúnmente se denominan mediante abreviaciones compuestas por una letra mayúscula seguida por otras letras que representan el microorganismo de donde se obtuvieron y a continuación de un número que hace referencia a la enzima determinada. En general, se utiliza aproximadamente 1 \mug de plásmido o de un fragmento de DNA con aproximadamente 1-2 unidades de enzima en unos 20 \mul de solución tamponada. Los tampones y las cantidades de sustrato adecuadas para las determinadas enzimas de restricción se especifican por el fabricante. Generalmente, la incubación es de aproximadamente 1 h a 37ºC, pero puede variar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación, se elimina la proteína o el polipéptido mediante extracción con fenol y cloroformo y se recupera el DNA así digerido de la fracción acuosa mediante precipitación con etanol. La digestión con una enzima de restricción puede continuarse con la hidrólisis con fosfatasa alcalina bacteriana de los fosfatos 5', con el fin de evitar la "recircularización" de un fragmento de DNA por los 2 extremos cortados por digestión con enzimas de restricción, o evitar la "formación" de un bucle cerrado que impida la inserción de otro fragmento de DNA en la diana de restricción. Salvo que se indique lo contrario, la digestión de los plásmidos no se prosigue por la desfosforilación en el extremo 5'. Los procedimientos y reactivos para la desfosforilación son convencionales tal como se describe en las secciones 1.56-1.61 de Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

La "ligación" hace referencia al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico. Para ligar los fragmentos de DNA, los extremos de los fragmentos de DNA deben ser compatibles uno con otro. En algunos casos, los extremos serán compatibles directamente después de la digestión con endonucleasas. Sin embargo, puede ser necesario convertir en primer lugar los extremos protuberantes comúnmente producidos después de la digestión con endonucleasas en extremos romos para hacerlos compatibles para su ligación. Para los extremos romos, el DNA se trata con un tampón adecuado durante por lo menos 15 minutos a 15ºC con aproximadamente 10 unidades del fragmento Klenow de la DNA polimerasa I o de la DNA polimerasa T4 en presencia de 4 desoxirribonucleótidos trifosfatos. A continuación, el DNA se purifica mediante extracción fenol-cloroformo y se precipita con etanol. Los fragmentos de DNA que se han de ligar juntos se ponen en solución en cantidades equimolares. La solución también contendrá ATP, tampón de ligasa y una ligasa como la T4 DNA ligasa a aproximadamente 10 unidades por cada 0,5 \mug de DNA. Si el DNA se ha de ligar en un vector, éste se lineariza en primer lugar mediante digestión con la endoncleasa(s) de restricción adecuada. A continuación, el fragmento linearizado se trata con la fosfatasa alcalina bacteriana, o con fosfatasa intestinal vacuna para evitar la propia ligación durante la etapa de ligación.

La técnica de la "reacción en cadena de la polimerasa" o PCR, utilizada aquí, hace referencia a un procedimiento en donde se amplifican al momento cantidades de una porción de ácido nucleico específico, RNA y/o DNA, tal como se describe en la patente americana U.S. 4.683.195, publicada el 28 de julio de 1987. En general, se necesita disponer de la información de la secuencia de los extremos de la región de interés, o de alrededor de ésta, con el fin de diseñar los cebadores oligonucleotídicos; estos cebadores serán idénticos o similares en su secuencia a las cadenas opuestas del molde a amplificar. Los nucleótidos terminales 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede utilizarse para amplificar de forma específica las secuencias de RNA, las secuencias de DNA a partir del DNA genómico y del cDNA transcrito a partir del RNA total de la célula, de las secuencias bacteriófagas o plasmídicas, etc. Ver en general, Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Tal como se utiliza aquí, la PCR se considera un ejemplo, pero no el único, de un procedimiento de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ácido nucleico, que comprende la utilización de un ácido nucleico (DNA o RNA) como un cebador y utiliza una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un fragmento específico de ácido nucleico, o para amplificar o generar un fragmento de ácido nucleico que sea complementario a un ácido nucleico en particular.

El "ensayo de autofosforilación de tirosinas de HRG" para detectar la presencia de ligandos de HRG se utilizó para controlar la purificación de un ligando para el receptor p185^{HER2}. Este ensayo está basado en la asunción de que un ligando específico para el receptor p185^{HER2} estimulará la autofosforilación del receptor, en analogía con el EGF y su estimulación de la autofosforilación del receptor de EGF. Las células MDA-MB-453 o las NMCF7 que contienen niveles elevados de receptores de p185^{HER2} pero niveles negligibles de receptores de EGF, se obtuvieron del American Type Culture Collection, Rockville Md. (ATCC Nº HTB-131) y se mantuvieron en el cultivo de tejidos con suero de ternera fetal al 10% en medio DMEM/Ham F12(1:1). Para el ensayo, las células se tripsinizaron y se plaquearon a aproximadamente 150.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos (Costar). Después de la incubación durante toda la noche con el medio con suero, las células se colocaron en medio sin suero durante 12-18 horas antes del ensayo. Se añadieron a cada pocillo alícuotas de 100 \mul de las muestras test. Las células se incubaron durante
5-30 minutos (típicamente durante 30 min) a 37ºC y se retiró el medio. Las células en cada pocillo se trataron con 100 \mul de tampón de gel desnaturalizante con SDS (Seprosol, Enpotech, Inc.) y se calentaron las placas a 100°C durante 5 minutos para disolver y desnaturalizar las proteínas. Alícuotas de cada pocillo se migraron en una electroforesis en geles de SDS con gradiente del 5-20% (Novex, Encinitas, Ca), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de que el colorante alcanzase la parte inferior del gel, se finalizó la electroforesis y se colocó una hoja de membrana PVDF (ProBlott, AB) sobre el gel y se transfirieron las proteínas desde el gel a la membrana en una cámara de transferencia (BioRad) a 200 mAmps durante 30-60 minutos. Después de la transferencia, se incubaron las membranas con tampón salino tamponado con Tris y detergente Tween 20 al 0,1% con BSA al 5% durante 2-18 h para bloquear la unión inespecífica y tratar a continuación con un anticuerpo anti-fosfotirosina de ratón (Upstate Biological Inc., N.Y.). A continuación, las membranas de transferencia se trataron con un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina. Los geles se revelaron utilizando el ProtoBlot System de Promega. Después de secar las membranas, se cuantificó la densidad de las bandas correspondientes a p185^{HER2} en cada carril de las muestras con un escáner Hewlett Packard ScanJet Plus Scanner asociado a un ordenador Macintosh. El número de receptores por célula en las células MDA-MB-453 o MCF-7 es tal que en estas condiciones experimentales, la proteína receptor p185^{HER2} es la proteína mayoritaria que está marcada.

La "microsecuenciación de proteínas" se logró de acuerdo con los procedimientos siguientes. Las proteínas de la etapa final de HPLC se secuenciaron bien directamente mediante degradación automatizada de Edman con un modelo de secuenciador de fase de gas 470A Applied Biosystems equipado con un analizador de aminoácidos 120APTH, o se secuenciaron después de la digestión con diversas moléculas químicas o enzimáticas. Los aminoácidos PTH se integraron utilizando el sistema de datos ChromPerfect (Justice Innovations, Palo Alto, CA). La interpretación de la secuencia se realizó con un ordenador VAX 11/785 Digital Equipment Corporation tal como se describe por Henzel y col., J. Chromatography 404:41-52 (1987)). En algunos casos, las alícuotas de las fracciones de HPLC se migraron en electroforesis de geles de poliacrilamida-SDS al 5-20%, se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (ProBlott, ABI, Foster City, CA) y se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987). La proteína específica se extrajo de la transferencia para su secuenciación N-terminal. Para determinar las secuencias proteicas internas, las fracciones HPLC se secaron al vacío (Speed Vac), se resuspendieron en tampones adecuados y se digirieron con bromuro de cianógeno, la enzima específica de lisinas Lys-C (wako Chemicals, Richmond, VA), o la de Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Ind.). Después de la digestión, los péptidos resultantes se secuenciaron como una mezcla o se resolvieron por HPLC en una columna C4 desarrollada con un gradiente de TFA al 0,1% antes de su secuenciación, tal como se describió anteriormente.

II. Utilización y preparación de polipéptidos HRG 1.Preparación de polipéptidos HRG incluyendo las variantes

El sistema utilizado en la preparación de polipéptidos HRG dependerá de la secuencia HRG determinada y seleccionada. Si la secuencia HRG es suficientemente pequeña, se prepara mediante procedimientos sintéticos polipeptídicos in vitro. Sin embargo, la HRG se prepara más comúnmente en cultivo de células recombinantes utilizando los sistemas de huésped-vector descritos más adelante.

En general, se utilizarán células huésped de mamífero, pudiendo contener o no dichos huéspedes sistemas post-traduccionales para el procesamiento de las prosecuencias de HRG de manera normal. Si las células huésped contienen estos sistemas, entonces es posible recuperar los fragmentos del subdominio natural como HRG-GFD o HRG-NTD-GFD de los cultivos. Sino, se puede lograr un procesado correcto transformando los huéspedes con la enzima(s) requerida o mediante corte del precursor in vitro. Sin embargo, no es necesario transformar las células con el DNA que codifica la prosecuencia completa para una HRG seleccionada si únicamente se desea producir fragmentos de secuencias HRG como una HRG-GFD. Por ejemplo, para preparar una HRG-GFD, se liga un codón de inicio al extremo 5' del DNA que codifica para una HRG-GFD, este DNA se utiliza para transformar las células huésped y el producto se expresa directamente como la forma Met N-terminal (si se desea, dicha Met extraña se puede eliminar in vitro o mediante demetionilasas N-terminales endógenas). Alternativamente, la HRG-GFD se expresa como una fusión con una secuencia señal reconocida por la célula huésped, que procesará y secretará la HRG-GFD madura, tal como se describe más adelante. Las variantes de secuencia aminoacídica de secuencias HRG-GFD variantes o nativas se producen de la misma manera.

La HRG-NTD se produce de la misma manera que la molécula de tamaño completo, pero a partir de la expresión del DNA que codifica únicamente para la HRG-NTD con el codón de parada después de uno de los residuos aminoacídicos S172-C182 (Fig. 15).

Además, las variantes de HRG se expresan a partir del DNA que codifica para la proteína en donde ambos dominios GFD y NTD se hallan en la orientación correcta, pero que contienen una inserción aminoacídica, deleción o sustitución en el sitio de unión NTD-GFD (por ejemplo localizado dentro de la secuencia S172-C182. En otra realización, se coloca un codón de parada en el extremo 3' de la secuencia codificante NTD-GFD (después de cualquiera de los residuos T/Q222-T245 de la Fig. 15). El resultado es una forma soluble de HRG-\alpha, o \beta1, o \beta2 que carece de la secuencia transmembrana (esta secuencia también puede ser una secuencia señal interna, pero se hará referencia a ella como a una secuencia transmembrana). En otras variaciones de esta realización, una secuencia señal interna de otro polipéptido sustituye al dominio transmembrana HRG nativo; o un dominio citoplasmático de otro polipéptido de membrana celular p.ej., el receptor quinasa sustituye al péptido citoplasmático HRG-\alpha o HRG-\beta1-\beta2.

En otra realización, los dominios NTD, GFD y el dominio transmembrana de HRG y otros miembros de la familia EGF se sustituyen unos por otros, p.ej., la región equivalente NTD del EGF sustituye a la NTD de HRG, o la GFD de HRG sustituye al EGF en la proforma soluble y procesada de EGF. Alternativamente, un dominio transmembrana de un miembro de la familia de HRG o EGF se fusiona con el residuo E236 en el extremo C-terminal de HRG-\beta3.

En otra variante, la secuencia HRG que se expande desde el residuo K24 hasta el extremo C-terminal se fusiona por su extremo N-terminal con el C-terminal de un polipéptido no-HRG.

Otra realización comprende la deleción funcional o estructural del sitio de procesamiento proteolítico en CTP, el dominio de expansión transmembrana-GFD. Por ejemplo, la lisina C-terminal putativa (K241) de la HRG-\alpha o \beta1-\beta2 se deleciona, se sustituye por otro residuo, un residuo distinto a los residuos K o R insertados entre K241 y R242, o se realiza otra mutación en la prosecuencia, que inutilice dicho sitio de procesamiento.

En otra realización, el dominio de cualquier miembro de la familia de EGF, que se extiende desde (a) su cisteína correspondiente al (b) residuo C221 C-terminal del miembro de la familia sustituye al dominio análogo de HRG-\alpha o \beta1 o \beta2 (o se fusiona con el extremo C-terminal de HRG-\beta3). Dichas variantes se procesarán exentas de células huésped de la misma manera que un miembro de la familia en lugar de una HRG parental. En realizaciones más elegantes, se sustituyen otras dianas de corte específico (p.ej., dianas de proteasas) en el CTP o dominio de expansión transmembrana-GFD (aproximadamente los residuos T/Q222-T245, Fig. 15). Por ejemplo, la secuencia E84-K99 de amfiregulina o la secuencia E44-K58 de TGFa sustituyen a los residuos E223-K241de HRG-\alpha.

En otra realización, se prepara una variante (denominada HRG-NTDxGFD) en donde (1) el residuo lisina hallado en la secuencia VKC de unión NTD-GFD (residuos 180-182, Figura 15), se deleciona o (preferentemente) se sustituye por otro residuo distinto a R como H, A, T, o S y (2) se introduce un codón de parada en la secuencia RCT o RCQ (residuos 220-222, Figura 15) en lugar de C, o T (para HRG-\alpha) o Q (para HRG-beta).

Un ligando HRG-\alpha preferido con afinidad de unión por p185^{HER2} comprende los aminoácidos 226-265 de la Figura 4. Este ligando HRG-\alpha puede comprender además hasta 1-20 aminoácidos adicionales antes del aminoácido 2'26 de la Figura 4 y de 1-20 aminoácidos después del aminoácido 265 de la Figura 4. Un ligando HRG-\beta preferido con afinidad de unión por p185^{HER2} comprende los aminoácidos 226-265 de la Figura 8. Este ligando HRG-\beta puede comprender hasta 1-20 aminoácidos adicionales antes del aminoácido 226 de la Figura 8 y de 1-20 aminoácidos después del aminoácido 265 de la Figura 8.

Las secuencias GFD incluyen aquellas en las que uno o más residuos correspondientes a otro miembro de la familia de EGF se delecionan o sustituyen, o tienen un residuo insertado adyacente a éste. Por ejemplo, el F216 de HRG se sustituye por Y, L202 por E, F189 por Y, o se deleciona la secuencia S203-P205.

La HRG también incluye el NTD-GFD con su extremo C-terminal en uno de los primeros de aproximadamente 1-3 residuos del dominio extracelular (QKR, residuos 240-243, HER-\alpha, Figura 15), o de los primeros de aproximadamente 1-,2 residuos de la región transmembrana. Además, en algunas variantes de HRG-GFD, los codones se modifican en el sitio proteolitico transmembrana-GFD mediante sustitución, inserción o deleción. El sitio proteolitico de GFD es el dominio que contiene el residuo C-terminal de GFD y aproximadamente 5 residuos N-terminal y 5 residuos
C-terminal a este residuo. En este momento, no se ha identificado la naturaleza del residuo C-terminal para

\hbox{HRG- \alpha }

ni para HRG-\beta, aunque se conoce que la HRG-\alpha-GFD con la Met-227 terminal y la HRG-\alpha-GFD con la Val-229 terminal son activas biológicamente. El C-terminal nativo de HRG-\alpha-GFD es probablemente Met-227, Lys-228, Val-229, Gln-230, Asn-231 o Gln-232 y para HRG-\beta1-\beta2-GFD es probablemente Met-226, Ala-227, Ser-228, Phe-229, Trp-230, Lys-231, o (para HRG-\beta1) K240, o (para HRG-\beta2)K246. El C-terminal nativo se determina fácilmente mediante secuenciación C-terminal y aunque no es necesario que la HRG-GFD tenga el extremo terminal nativo tan largo como el de la secuencia GFD, sí que posee la actividad deseada. En algunas realizaciones de variantes de HRG-GFD, los cambios aminoacídicos en el CTP se rastrearon por su capacidad para resistir la proteolisis in vitro e inhibir la proteasa responsable de la generación de HRG-GFD.

Si se desea preparar los polipéptidos HRG de tamaño completo y los extremos 5' o 3' de la HRG proporcionada no están descritos aquí, seria necesario preparar los ácidos nucleicos en donde los dominios ausentes estén reemplazados por regiones homólogas de un ácidos nucleicos de HRG más completos. Alternativamente, los dominios ausentes se pueden obtener mediante hibridación de librerías utilizando los DNAs descritos en las Figuras, o fragmentos de lo mismo.

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A. Aislamiento del DNA que codifica para la Heregulina

El DNA que codifica para la HRG puede obtenerse a partir de cualquier librería de cDNA preparada de tejidos que se cree poseen mRNA de HRG y que lo expresan a un nivel detectable. El DNA de HRG también se obtiene a partir de una librería genómica.

Las librerías se rastrean con sondas o herramientas analíticas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Para las librerías de expresión de cDNAs, se incluyen como sondas adecuadas los anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen y se unen específicamente a HRG; los oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases de longitud que codifican porciones conocidas o putativas del cDNA de HRG de la misma o de diferentes especies; y/o cDNAs complementarios u homólogos, o fragmentos de lo mismo, que codifican para el mismo gen o para un gen que hibrida. Las sondas adecuadas para el rastreo genómico de librerías incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos; cDNAs o fragmentos de lo mismo que codifican para el mismo DNA o para uno que hibrida; y/o DNAs genómicos homólogos o fragmentos de lo mismo. El rastreo de librerías de cDNAs o genómicas con sondas seleccionadas puede realizarse utilizando procedimientos estándares tal como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook y col., supra.

Un medio alternativo para aislar el gen que codifica para HRG es utilizar la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se describe en la sección 14 de Sambrook y col., supra. Este procedimiento requiere la utilización de sondas oligonucleotídicas que hibridarán con HRG. Las estrategias para la selección de oligonucleótidos se describen más adelante.

Otro procedimiento alternativo para obtener el gen de interés es sintetizarlo químicamente utilizando uno de los procedimientos descritos en Engels y col., (Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734, 1989), Estos procedimientos incluyen los procedimientos del triéster, del fosfito, de la fosforamidita y del H-fosfonato, de la PCR y la ayuda de programas AutoPrimer, realizándose la síntesis de oligonucleótidos sobre soporte sólido. Estos procedimientos pueden utilizarse si se conoce la secuencia completa de ácidos nucleicos del gen, o si la secuencia del ácido nucleico complementario a la cadena codificante está disponible, o alternativamente, si se conoce la secuencia aminoacídica diana, se puede entonces deducir las secuencias de ácido nucleico utilizando los residuos conocidos y los codificantes preferidos para cada residuo aminoacídico.

Un procedimiento preferido para la práctica de esta invención es la utilización de secuencias oligonucleotídicas seleccionadas cuidadosamente para rastrear las librerías de cDNA de diversos tejidos, preferentemente de cáncer de mama, colon, glándulas salivales, placenta, tejido fetal, cerebro y líneas celulares de carcinoma. Otras fuentes biológicas de DNA que codifican para un ligando similar a la heregulina incluyen otros mamíferos y aves. De entre los mamíferos preferidos se hallan los miembros de los siguientes órdenes: bovino, ovino, equino, murino y roedores.

Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficientemente inequívocas para poder minimizar los falsos positivos. La secuencia(s) de nucleótidos real está basada generalmente en secuencias nucleotídicas conservadas o altamente homólogas, o en regiones de HRG-\alpha. Los oligonucleótidos pueden ser degenerados en una o más posiciones. La utilización de oligonucleótidos degenerados puede ser de importancia especial si una librería se rastrea a partir de una especie en la que no se conoce la utilización preferencial de codones. El oligonucleótido debe estar marcado de modo que pueda detectarse tras hibridación con el DNA en la librería a rastrear. El procedimiento de marcaje es utilizar el ATP marcado con P-^{32} mediante la polinucleótido quinasa, tal como se conoce en la materia, para marcar isotópicamente el oligonucleótido. Sin embargo, se pueden utilizar otros procedimientos para marcar el oligonucleótido, incluyendo, pero sin limitarse a, el marcaje por biotinilización o el enzimático.

De particular interés es el ácido nucleico de HRG que codifica para el polipéptido de longitud completa. En algunas realizaciones preferidas, la secuencia de ácido nucleico incluye la secuencia señal transmembrana de la HRG nativa. El ácido nucleico que posee toda la secuencia codificante de la proteína se obtiene mediante rastreo de librerías seleccionadas de cDNAs o genómicas, y, si es necesario, utilizando procedimientos de extensión por cebador, tal como se describe en la sección 7.79 de Sambrook y col., supra, para detectar los precursores y los intermediarios del procesamiento del mRNA, que pueden no haberse transcrito de forma inversa a cDNA.

El DNA que codifica para la HRG se utiliza para aislar el DNA que codifica para el ligando análogo de otra especie animal mediante hibridación, utilizando procedimientos descritos anteriormente. Los animales preferidos son los mamíferos, en particular los bovinos, ovinos, equinos, felinos, caninos y roedores y más especialmente las ratas, ratones y conejos.

B. Variantes de secuencia aminoacídica de la Heregulina

Las variantes de secuencia aminoacídica de la Heregulina se preparan introduciendo los cambios nucleotídicos adecuados en el DNA de la HRG, o mediante síntesis in vitro del polipéptido HRG deseado. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, las deleciones de, o las inserciones o sustituciones de los residuos dentro de la secuencia aminoacídica mostrada para las secuencias de HRG humanas. Puede realizarse cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para lograr la construcción final, siempre que la construcción posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos post-traduccionales de la HRG-\alpha, como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación, alterando las características de anclaje a membrana, alterando la localización intra-celular de la HRG mediante inserción, deleción, o afectando la secuencia transmembrana de la HRG nativa, o modificando su susceptibilidad para el corte proteolítico.

En el diseño de las variantes de secuencia aminoacídica de la HRG, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la característica(s) de la HRG a modificar. Los sitios a mutar se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo: (1) sustituyendo en primer lugar con aminoácidos conservados y a continuación con selecciones más radicales dependiendo de los resultados logrados, (2) delecionando el residuo diana, o (3) insertando residuos de otros ligandos adyacentes al sitio localizado.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos HRG o de regiones para mutagénesis se denomina "mutagénesis por selección de alaninas" tal como se describió por Cunningham y Wells (Science, 244:1081-1085, 1989). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (p.ej., residuos cargados como la arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyeron por un aminoácido cargado negativamente (más preferentemente la alanina o la polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso envolvente en o fuera de la célula. Posteriormente, se perfeccionarán los dominios que demuestren una sensibilidad funcional a las sustituciones, introduciendo más sustituciones u otras variantes en los sitios de sustitución. Así, mientras que el sitio de introducción de una variación de secuencia aminoacídica está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para optimizar la realización de una mutación en un sitio determinado, la selección por alaninas o la mutagénesis aleatoria puede realizarse en el codón o región diana y se rastrean las variantes HRG expresadas por su combinación óptima de actividad deseada.

Existen dos variables principales en la construcción de variantes de secuencia aminoacídica: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Estas son variantes de la secuencia de HRG y pueden representar los alelos de origen natural (que no requerirán la manipulación del DNA de HRG), o las formas de mutantes predeterminados generadas mediante mutación del DNA, bien para lograr un alelo o bien una variante no hallada en la naturaleza. En general, la localización y naturaleza de la mutación elegida dependerá de la característica de la HRG a modificar. Obviamente, dichas variaciones que, por ejemplo, convierten la HRG en un ligando de receptor conocido, no están incluidas dentro del ámbito de la presente invención, ni tampoco ninguna de las otras variantes de HRG o secuencias polipeptídicas que no son nuevas o se hallan descrito en los antecedentes de la materia.

Las deleciones de secuencia aminoacídica varían generalmente desde aproximadamente 1 a 30 residuos, más preferentemente de aproximadamente 1 a 10 residuos y típicamente de 1 a 5 residuos contiguos aproximadamente. Las deleciones se pueden introducir en las regiones de baja homología con precursores de otras familias de EGF para modificar la actividad de la HRG. Las deleciones de la HRG en áreas de homología esencial con otras secuencias de la familia de EGF servirán más probablemente para modificar la actividad biológica de la HRG de forma más significativa. El número de deleciones consecutivas se seleccionará para conservar la estructura terciaria de la HRG en el domino afectado, p.ej., unión con cisteínas, hoja plegada beta o hélice-alfa.

Las inserciones de secuencia aminoacídica incluyen las fusiones amino- y/o carboxi-terminal en un intervalo de longitud que abarca desde un residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más de residuos, así como también las inserciones intrasecuencia de residuos aminoacídicos sencillos o múltiples. Las inserciones intrasecuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia de HRG) pueden variar generalmente desde aproximadamente 1 a 10 residuos, más preferentemente de 1 a 5 y todavía más preferentemente de 1 a 3. Ejemplos de inserciones terminales incluyen la HRG con un residuo metionil N-terminal (un artefacto de la expresión directa de HRG en el cultivo de células recombinantes bacterianas) y la fusión de una secuencia señal N-terminal heteróloga en el extremo n-terminal de HRG para facilitar la secreción de la HRG madura de células huésped recombinantes. Dichas secuencias señal se obtendrán generalmente de, y por lo tanto tendrán una identidad de secuencia con, las especies de células huésped destinadas. Las secuencias adecuadas incluyen la STII o Ipp para E. coli, el factor alfa para levaduras y las señales virales como gD de herpes para las células de mamífero.

Otras variantes insercionales de HRG incluyen la fusión del extremo N- o C-terminal de HRG con un polipéptido inmunogénico, p.ej., los polipéptidos bacterianos como la beta-lactamasa o una enzima codificada por el locus trp de E. coli, o una proteína de levaduras, la albúmina sérica bovina y pólipéptidos quimiotácticos. También se incluyen las fusiones C-terminales de HRG-NTD-GFD con proteínas que tienen una vida media larga, como por ejemplo las regiones constantes de inmunoglobulinas (u otras regiones de inmunoglobulinas), la albúmina, o la ferritina, tal como se describe en la patente internacional WO 89/02922, publicada el 6 de abril de 1989.

Otro grupo de variantes son las variantes de sustitución aminoacídica. Estas variantes tienen por lo menos un residuo aminoacídico eliminado en la molécula HRG y un residuo distinto insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen los sitios identificados como el sitio(s) activo de HRG y los sitios en donde los aminoácidos hallados en los ligandos HRG de varias especies son esencialmente distintos en términos de volumen de la cadena lateral y/o de hidrofobicidad.

El extremo amino-terminal de la región citoplasmática de HRG puede fusionarse con el extremo carboxi-terminal de los dominios transmembrana heterólogos y los receptores para formar un polipéptido de fusión útil para la señalización intracelular de un ligando de unión de con el receptor heterólogo.

Otros sitios de interés son aquellos en los que residuos determinados de ligandos similares a HRG obtenidos de diversas especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica de HRG. Estos sitios, especialmente los que se hallan dentro de una secuencia de por lo menos tres de otros sitios conservados de forma idéntica, se sustituyen de forma relativamente conservada. Dichas sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones resultan en un cambio de la actividad biológica, entonces se introducen más cambios importantes, denominados "ejemplos de sustituciones" en la Tabla 1, o como se describen más adelante en relación con las clases de aminoácidos, y a continuación se analizan y seleccionan los productos.

TABLA 1

1

Las modificaciones esenciales en la función o en la identidad inmunológica de HRG se logran seleccionando las sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del armazón polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o en hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos según las características comunes de sus cadenas laterales:

1)

hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

2)

hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

3)

acídicos: asp, glu;

4)

básicos: asn, gin, his, lys, arg;

5)

residuos que modifican la orientación de la cadena: gly, pro; y

6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no-conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en las regiones HRG que son homólogas con otros ligandos del receptor, o, más preferentemente en las regiones no-homólogas de la molécula.

En una realización de la invención, es deseable inactivar uno o más sitios de corte por proteasas de los presentes en la molécula. Estos sitios se identifican mediante inspección de la secuencia aminoacídica codificada. Si se identifican los sitios potenciales de corte por proteasas, p.ej. en K241 R242, entonces éstos se inactivan para el corte prdteolítico sustituyendo el residuo diana por otro residuo, preferentemente un residuo básico como la glutamina o un residuo hidrofílico como la serina; delecionando el residuo; o insertando un residuo prolil inmediatamente después del residuo.

En otra realización, cualquier residuo metionil distinto al residuo metionil de inicio, o cualquier residuo localizado dentro de los tres residuos N- o C-terminal para cada residuo metionil, se sustituye por otro residuo (preferentemente de acuerdo con la Tabla 1), o se deleciona. Se halló que la oxidación de los 2 residuos M de GFD durante la expresión en E. coli reducían severamente su actividad de GFD. Así, estos residuos M se mutan de acuerdo con la Tabla 1. Alternativamente, se insertan aproximadamente de 1-3 residuos adyacentes a dichos sitios.

Cualquier residuo cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada también se puede sustituir, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar uniones aberrantes.

Los sitios especialmente adecuados para sustituciones, deleciones o inserciones, o para utilizar como fragmentos, incluyen los siguientes, numerados desde el extremo N-terminal de HRG-\alpha de la Figura 4:

1)

sitios potenciales de adición de glicosamino-glicano en los dipéptidos serina-glicina en 42-43, 64-65, 151-152;

2)

glicosilación potencial ligada a asparagina en las posiciones 164, 170, 208 y 437, sitios (NDS) 164-166, (NIT) 170-172, (NTS) 208-210 y NTS (609-611);

3)

O-glicosilación potencial en un grupo de serina y treonina en 209-218;

4)

cisteínas en 226, 234, 240, 254, 256 y 265;

5)

dominio transmembrana en 287-309;

6)

bucle 1 trazado por las cisteínas 226 y 240;

7)

bucle 2 trazado por las cisteínas 234 y 254;

8)

bucle 3 trazado por las cisteínas 256 y 265; y

9)

sitios potenciales de procesamiento por proteasas en 2-3, 8-9, 23-24, 33-34, 36-37, 45-46, 48-49, 62-63, 68-67, 86-87, 110-111, 123-124, 134-135, 142-143, 272-273, 278-279 y 285-286;

Las regiones análogas en HRG-\beta1 se pueden determinar consultando la Figura 9, que alinea los aminoácidos análogos de HRG-\alpha y HRG-\beta1. Los aminoácidos HRG-\beta1 análogos pueden mutarse o modificarse, tal como se discutió anteriormente para HRG-\alpha. Las regiones análogas en HRG-\beta2 se pueden determinar consultando la Figura 15, que alinea los aminoácidos análogos de HRG-\alpha, HRG-\beta1 y HRG-\beta2. Los aminoácidos análogos de HRG-\beta2 pueden mutarse o modificarse, tal como se discutió anteriormente para HRG-\alpha o HRG-\beta1. Las regiones análogas del HRG-\beta3 pueden determinarse considerando la Figura 15, que alinea los aminoácidos análogos en HRG-\alpha, HRG-\beta1 y HRG-\beta2. Los aminoácidos análogos de HRG-\beta3 pueden ser mutados o modificados tal como se discutió anteriormente para HRG-\alpha, HRG-\beta1 o HRG-\beta2.

El DNA que codifica para variantes de secuencia aminoacidica de HRG se prepara mediante diversos procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia aminoacidica de origen natural), o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (mutagénesis dirigida), mutagénesis por PCR y mutagénesis de "cajas" de una variante preparada con anterioridad o de una versión no-variante de HRG. Estas técnicas pueden utilizar el ácido nucleico de HRG (DNA o RNA), o el ácido nucleico complementario al ácido nucleico de HRG.

La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un procedimiento preferido paró preparar variantes de sustitución, deleción e inserción del DNA de HRG. Esta técnica es bien conocida en la materia tal como se describió por Adelman y col., DNA, 2:183 (1983).

Se utilizan en general oligonucleótidos de por lo menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos, complementarios con el molde por cada lado del nucleótido(s) codificante para la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido hibridará adecuadamente con la molécula molde del DNA de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en la materia como las descritas por Crea y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5 75:5765, 1978).

El molde de DNA de cadena sencilla también puede generarse desnaturalizando el DNA plasmídico (u otro) de cadena doble mediante técnicas estándares.

Para alterar la secuencia de DNA nativa (por ejemplo, para generar las variantes de secuencia aminoacídica), el oligonucleótido se hibrida con el molde de cadena sencilla en condiciones de hibridación adecuadas. A continuación, se añade una enzima de polimerización del DNA, generalmente el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I, para sintetizar la cadena complementaria del molde utilizando el oligonucleótido como un cebador para la síntesis. Así, se forma una molécula heterodúplex de modo que una cadena del DNA codifica para la forma mutada de la HRG y la otra cadena (el molde original) codifica para la cadena nativa, secuencia inalterable de HRG. Esta molécula heterodúplex se transforma a continuación en una célula huésped adecuada, generalmente un procariota como E. coli JM101. Después de que las células han crecido, se las plaquea en placas de agarosa y se criban utilizando el cebador oligonucleotídico marcado radioactivamente con fosfato-P^{32} para identificar las colonias bacterianas que contienen el DNA mutado. A continuación, se extrae la región mutada y se la coloca en un vector adecuado para la producción proteica, generalmente un vector de expresión del tipo utilizado comúnmente para la transformación de un huésped adecuado.

El procedimiento descrito anteriormente puede ser modificado de modo que se crea una molécula heterodúplex, en donde ambas cadenas del plásmido contienen la mutación o mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: se anilla el oligonucleótido de cadena sencilla a un molde de cadena sencilla, tal como se describió anteriormente. Se combina una mezcla de tres desoxirribonucleótidos: desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) y desoxirribotimidina (dTTP), con un tio-desoxirribocitosina denominado dCTP-(aS) (Amersham Corporation). Esta mezcla se añade al complejo de molde-oligonucleótido. Después de añadir a la mezcla la DNA polimerasa, se genera una cadena de DNA idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de DNA contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerla de la digestión con endonucleasas. Después de producir cortes en la cadena molde del heterodúplex de cadena doble con una enzima de restricción adecuada, la cadena molde se puede digerir con la nucleasa ExoIII u otra nucleasa adecuada más allá de la región que contiene el sitio(s) a mutagenizar. La reacción se para a continuación para dejar una molécula que es sólo parcialmente cadena sencilla. A continuación se forma un DNA homodúplex de doble cadena utilizando la DNA polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfatos, ATP y DNA ligasa. Esta molécula homodúplex se puede transformar en una célula huésped adecuada como E. coli JM101, tal como se describió anteriormente.

Ejemplos de sustituciones comunes a cualquier HRG incluyen S2T o D; E3D, o K; R4 K o E; K5R o E; E6D o K; G7P o Y; R8K o D; G9P o Y; K1OR o E; G11P o Y; K12R o E; G19P o Y; S20T o F; G21P o Y; K22 o E; K23R o E; Q38D; S107N; G108P; N120K; D121K; S122T; N126S; I126L; T127S; A163V; N164K; T165-174; cualquier residuo a I, L, V, M, F, D, E, R o K; G175V o P; T176S o V; S177K o T; H178K o S; L179F o I; V180L o S; K181R o E; A183N o V; E184K o D; K185R o E; E186D o Y; K187R o D; T188S o Q; F189Y o S; I V191L o D; N192Q o H; G193P o A; G194P o A; E195D o K; F197Y o I; M189V o Y; V199L o T; K200V o R; D201E o K; L202E o K; S203A o T; N204\Delta; N204Q; P205\Delta; P205G; S206T o R; R207K o A; Y208P o F; L209I o D; K211I o D; F216Y o I; T217H o S; G218A o P; A/D219K o R; R220K o A; A235/240/232V o F; E236/241/233D o K; E237/242/234D o K; L238/243/2351 o T; Y239/244/236F o T; Q240/245/237N o K; K241/246/238H o R; R242/247/238H o K; V243/248/239L o T; L244/249/2401 o S; 245/250/241S o I; 1246/251/242V o T y T247/252/243S o I. Específicamente en relación con HRG-\alpha, T222S, K o V; E223D, R o Q; N224Q, K o F; V225 A, R o D; P226G, I, K o F; M227V, T, Ro Y; K228R, H o D; V229L, K o D; Q230N, R o Y; N231Q, K o Y; Q232N, R o Y; E233D, K o T y K234R, H o D (en realizaciones alternativas, se asocian mutaciones K/R adyacentes para crear nuevos sitios de proteolisis). Específicamente, en relación con HRG-\beta (cualquier miembro), son variantes adecuadas Q222N, R o Y; N223Q, K o Y; Y224F, T o R; V225A, K o D; M226V, T o R; A227V, K, Y o D; S228T, Y o R; F229Y, I o K e Y230F, T o R. Específicamente, en relación con HRG-\beta1, son variantes adecuadas K231R o D, H232R o D; L2331, K, F o Y; G234P, R, A o S; I2351I, K, F o Y; E236D, R o A; F2371I, Y, K o A; M238V, T, R o A y E239D, R o A. Específicamente, en relación con HRG-\beta1 y HRG-\beta2, son variantes adecuadas K231R o D. Alternativamente, se puede delecionar cada uno de estos residuos, o se pueden insertar los sustituyentes adecuados adyacentes. Además, para producir combinaciones se combinan de 1-10 variantes. Estos cambios se realizan en la proHRG, NTD, GFD, NTD-GFD u otros fragmentos o fusiones. Los residuos Q213-G215, A219 y aproximadamente 11-21 residuos C-terminal al C221 difieren entre las diversas clases de HRG. Dichos residuos se intercambian entre las clases de HRG o entre los miembros de la familia de EGF, se delecionan, o se inserta un residuo adyacente.

El DNA que codifica para los mutantes de HRG-\alpha con más de un aminoácido a sustituir se puede generarse de diversas formas. Si los aminoácidos se hallan muy próximos en la cadena polipeptídica, se pueden mutar simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifique para todas las sustituciones aminoacídicas deseadas. Si, sin embargo, los aminoácidos se localizan a cierta distancia uno de otro (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un oligonucleótido que codifique para todos los cambios deseados. En su lugar, puede utilizarse uno de los dos procedimientos alternativos.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para generar variantes aminoacidicas de la HRG-\alpha. Mientras que la siguiente discusión hace referencia al DNA, se sobreentiende que la técnica también halla aplicación con el RNA. La técnica de la PCR hace referencia generalmente al procedimiento siguiente (ver Erlich, supra, el capítulo de R. Higuchi, p. 61-70). Cuando, en una PCR, se utilizan pequeñas cantidades de DNA molde como material de partida, se pueden utilizar cebadores que difieran ligeramente en la secuencia de la región correspondiente de un DNA molde, para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento específico de DNA que difiera de la secuencia molde únicamente en las posiciones en donde difieren los cebadores respecto al molde. Para introducir una mutación en un DNA plasmídico, se diseña uno de los cebadores para solapar la posición de la mutación y contener la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un fragmento de la secuencia de la cadena opuesta del plásmido, pudiendo estar localizada en cualquier sitio del DNA plasmídico. Es preferible, sin embargo, que la secuencia del segundo cebador se localice en los 200 nucleótidos cercanos al primer cebador, de modo que al final se pueda secuenciar fácilmente toda la región de DNA flanqueada por los dos cebadores. La amplificación por PCR utilizando una pareja de cebadores como la descrita anteriormente da como resultado una población de fragmentos de DNA que se diferencian en la posición de la mutación especificada por el cebador y posiblemente en otras posiciones, ya que el copiado del molde produce a menudo errores.

Si el cociente del material del molde respecto al del producto es extremadamente bajo, la gran mayoría de fragmentos de DNA incorporaron la mutación (o mutaciones) deseada. Este producto se utiliza para reemplazar la región correspondiente en el plásmido que sirvió como molde de la PCR, utilizando tecnología estándar del DNA. Las mutaciones en posiciones separadas se pueden introducir simultáneamente bien utilizando un segundo cebador mutante, o realizando una segunda PCR con cebadores mutantes distintos y ligando los dos fragmentos de PCR simultáneamente al fragmento del vector en una ligación de tres partes (o más).

Otro procedimiento para la preparación de variantes, mutagénesis en "caja", se basa en la técnica descrita por Wells y col., (Gene, 34:315, 1985). El material de inicio es el plásmido (u otro vector) que comprende el DNA de la HRG a mutar. Se identifica el codón o codones a mutar en el DNA de HRG. Debe haber una sola diana de endonucleasa de restricción a cada lado del sitio(s) de mutación identificado. Si no existiera tal diana(s) de restricción, se puede generar utilizando el procedimiento de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrito anteriormente para introducirlos en las localizaciones adecuadas en el DNA de HRG. Una vez introducidas las dianas de restricción en el plásmido, éste se corta por dichas dianas para linearizarse. Se sintetiza un oligonucleótido de doble cadena que codifica para la secuencia del DNA entre las dianas de restricción pero que contiene la mutación (o mutaciones) deseada utilizando procedimientos estándares. Las dos cadenas se sintetizan de forma separada y luego se hibridan utilizando técnicas estándares. Este oligonucleótido de cadena doble se denomina "caja". Esta "caja" se diseña para tener extremos 3' y 5' compatibles con los plásmidos linearizados, de modo que se pueda ligar directamente en el plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia del DNA de HRG.

C. Inserción del DNA en un vector de clonaje o de expresión

El cDNA o el DNA genómico que codifica para la HRG nativa o variante se inserta en un vector replicable para el posterior clonaje (amplificación del DNA) o para la expresión. Existen muchos vectores disponibles y su selección adecuada dependerá de 1) si se ha de utilizar para la amplificación del DNA o para la expresión del DNA, 2) del tamaño del DNA a insertar en el vector y 3) de la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación del DNA o expresión del DNA) y de la célula huésped para la cual es compatible. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más de un gen marcador, una secuencia incrementadora de la transcripción, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción.

(i) Componente de la secuencia señal

En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA de HRG que se inserta en el vector. El DNA de HRG nativo se cree que codifica para una secuencia señal en el extremo amino-terminal (extremo 5' del DNA codificante para HRG) del polipéptido que se corta durante el procesamiento post-traduccional del polipéptido para formar el ligando polipeptídico de HRG maduro que se une al receptor p185^{HER2}, aunque no sea evidente una estructura señal convencional. La proHRG nativa se secreta por la célula pero permanece localizada en la membrana porque contiene un dominio transmembrana y una región citoplasmática en la región carboxi-terminal del polipéptido. Así, en una versión de HRG secretada y soluble se deleciona generalmente el extremo carboxi-terminal de la molécula, incluyendo el dominio transmembrana. Esta HRG variante polipeptídica truncada puede secretarse por la célula, siempre que el DNA que codifica la variante truncada codifique para una secuencia señal reconocida por el huésped.

La HRG de la presente invención puede expresarse no sólo directamente, sino también como una fusión con un polipéptido heterólogo, preferentemente una secuencia señal de otro polipéptido que tiene una diana de corte específico en el extremo N- y/o C-terminal de la proteína madura o del polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA de HRG que se inserta en el vector. Dentro del ámbito de la presente invención, se incluyen las HRG con la secuencia señal nativa delecionada y reemplazada por una secuencia señal heteróloga. La secuencia señal heteróloga seleccionada debería ser una secuencia que sea reconocida y procesada, es decir, cortada por una peptidasa señal, por la célula huésped. Para las células procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal de HRG, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota, por ejemplo, una secuencia líder del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o la entorotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal de HRG nativa puede sustituirse por las secuencias líder de la invertasa de levaduras, el factor alfa, o de la fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamífero, la secuencia señal nativa es satisfactoria, aunque otras secuencias señal de mamíferos pueden ser también adecuadas.

(ii) Origen del componente de replicación

Tanto los vectores de clonaje como los de expresión contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonaje, esta secuencia es una que permita al vector replicarse independientemente del DNA cromosómico del huésped e incluya los orígenes de replicación o las secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas en una gran variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la gran mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para levaduras y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) se utilizan en vectores de clonaje en las células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (el origen de SV40 puede utilizarse de forma característica únicamente porque contiene el promotor temprano).

La mayoría de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse por lo menos en una clase de organismos, pero pueden transfectarse en otro organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli y luego el mismo vector se transfecta en células de levadura o de mamífero para su expresión, aún cuando no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El DNA puede también amplificarse mediante inserción en el genoma del huésped. Esto se logra fácilmente utilizando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA complementaria con una secuencia hallada en el DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da como resultado la recombinación homóloga con el genoma e inserción del DNA de HRG. Sin embargo, la recuperación del DNA genómico que codifica para HRG es más compleja que la de un vector replicado exógenamente ya que se requiere una digestión por enzimas de restricción para extraer el DNA de HRG. El DNA puede amplificarse mediante PCR y transferirse directamente a las células huésped sin ningún componente de replicación.

(iii) Componente de selección génica

Los vectores de expresión y clonaje deberían contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este gen codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas y crecidas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metrotexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles por el medio complejo, p.ej., el gen que codifica para la racemasa D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transformaron con éxito con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia al fármaco y por ello sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern y col., J. Molec. Appl. Genet. 1:327, 1982), ácido micofenólico (Mulligan y col., Science 209:1422, 1980) o la higromicina (Sugden y col., Mol. Cell Biol. 5:410-413, 1985). Los tres ejemplos proporcionados anteriormente utilizan genes bacterianos bajo control bacteriano para expresar la resistencia al fármaco adecuado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son los que permiten la identificación de las células competentes para incorporar el ácido nucleico, como la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo la presión de selección, en donde únicamente los transformantes adaptados sobreviven gracias al haber incorporado el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones tales que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, lo que conduce a la amplificación del gen de selección y del DNA que codifica para la HRG. La amplificación es el proceso por el cual los genes en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se hallan repetidos en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. De esta forma, se sintetizan cantidades incrementadas de HRG a partir del DNA amplificado.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (MTX), un antagonista competitivo de

\hbox{DHFR}

. Cuando se utiliza el DHFR de tipo salvaje, una célula huésped adecuada es una línea de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe por Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980. A continuación, se exponen las células transformadas a incrementos en el nivel de metrotexato. Ello conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR y en consecuencia a copias múltiples de otro DNA que comprende los vectores de expresión, como el DNA que codifica para HRG. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier otro huésped adecuado, p.ej., ATCC Nº. CCL61 CHO-K1, teniendo en cuenta la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, se utiliza un gen mutante de DHFR que es altamente resistente a Mtx (patente europea EP 117.060). Alternativamente, las células huésped (en particular los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformados o co-transformados con las secuencias de DNA que codifican para HRG, la proteína DHFR de tipo salvaje y otro marcador seleccionable como el aminoglicósido 3'fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse mediante crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable como un antibiótico aminoglicosídico, p.ej., la kanamicina, la neomicina, o el G418 (ver patente americana U.S. 4.965.199).

Un gen de selección adecuado para utilizar con levaduras es el gen trp presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39, 1979; Kingsman y col., Gene, 7:141, 1979; o Tschemper y col., Gene, 10:157, 1980). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad para crecer en medio con triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12, 1977). La presencia de la lesión trp 1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona un entorno eficaz para la detección de la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura Leu-2 deficientes (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos que contienen el gen Leu2.

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonaje contienen generalmente un promotor que es reconocido por los organismos huéspedes y está unido al ácido nucleico de HRG. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente en unas 100 a 1000 pb) que controla la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico determinada, como la HRG para la que está unida operativamente. Dichos promotores se hallan de forma característica en dos clases, los inducibles y los constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que promueven niveles elevados de transcripción a partir del DNA bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, p.ej., la presencia o la ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En la actualidad, se conocen un gran número de promotores que son reconocidos por una diversas células huésped potenciales bien conocidas. Estos promotores están unidos operativamente al DNA que codifica la HRG tras haber eliminado el promotor de la fuente de DNA mediante digestión con enzimas de restricción e insertado la secuencia promotora aislada en el vector. Para la amplificación y/o expresión directa del DNA de HRG, se pueden utilizar tanto la secuencia promotora de HRG nativa como cualquiera de los muchos promotores heterólogos. Sin embargo, son preferibles los promotores heterólogos, ya que permiten una transcripción mayor y rendimientos superiores de la HRG expresada en comparación con el promotor de la HRG nativa.

Los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotores de la

\hbox{ \beta -lactamasa}

y la lactosa (Chang y col., Nautre, 275:615, 1978; Goeddel y col., Nature 281:544, 1979), la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057, 1980 y la patente europea EP 36.776) y los promotores híbridos como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983). Sin embargo, también son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias nucleotídicas se han publicado, con lo que facilitan al experto en la materia el ligarlas con el DNA que codifica para la HRG (Siebenlist y col., Cell 20:269, 1980) utilizando engarces o adaptadores para suministrar cualquier diana de restricción requerida. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al DNA que codifica para HRG.

Las secuencias promotoras para utilizar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073, 1980) o de otras enzimas glicoliticas (Hess y col., J.Adv. Enzyme Reg 7:149, 1968; y Holland, Biochemistry 17:4900, 1978), como la enolasa, la giceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles con la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, la isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y la enzima responsable de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen por Hitzeman y col., patente europea EP 73.657A. Las secuencias incrementadoras de la transcripción también se utilizan de forma ventajosa con los promotores de levadura.

Las secuencias promotoras de eucariotas son conocidas. En general, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada a aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia a 70 a 80 bases cadena arriba del codón de inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT (SEC ID Nº:1), en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de muchos genes eucariotas se halla una secuencia AATAAA (SEC ID Nº:2) que puede ser la señal para la adición de una cola poliA en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en los vectores de expresión de mamíferos.

La transcripción del gen HRG a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla mediante promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente americana UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), los adenovirus (como el adenovirus 2), el virus del papiloma, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el Simian Virus 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, de los promotores de choque térmico y del promotor asociado normalmente con la secuencia HRG, siempre que los promotores sean compatibles con los sistemas de células huéspedes.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción que también contiene el origen viral de SV40 de replicación (Fiers y col., Nature 273:113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)). El promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus humano se obtiene de forma adecuada como un fragmento de restricción HindIII (Greenaway y col., Gene, 18:355-360 (1982)). Un sistema para la expresión del DNA en huéspedes mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la patente americana U.S. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente americana U.S. 4.601.978. Ver también Gray y col., Nature, 295:503-508 (1982) sobre la expresión del cDNA que codifica para el interferón inmune en células de mono; Reyes y col., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión del cDNA del \beta-interferon humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en células de ratón y conejo en cultivo; y Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos embrionales de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células de ratón NIH-3T3 utilizando como promotor la secuencia de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

(v) Componente del elemento incrementador

La transcripción de un DNA que codifica para HRG de la presente invención por eucariotas superiores se aumenta a menudo insertando una secuencia incrementadora de la transcripción en el vector. Estas secuencias son elementos de actuación en cis del DNA, generalmente a aproximadamente 10-300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Las secuencias incrementadoras de la transcripción tienen una posición y orientación relativamente independiente y se han hallado en 5' (Laimins y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993, 1981) y 3' (Lusky y col., Mol. Cell Biol., 3:1108, 1983) de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne y col., Mol. Cell. Bio., 4:1293, 1984). En la actualidad, se conocen muchas secuencias incrementadoras de la transcripción de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). De forma característica, sin embargo, se utilizará una 'secuencia incrementadora de la transcripción de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen la secuencia incrementadora de la transcripción de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), la secuencia incrementadora de la transcripción del promotor temprano del citomegalovirus, la secuencia incremantadora de la transcripción del polioma en el lado tardío del origen de replicación y las secuencias incrementadoras de la transcripción de adenovirus (ver también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)) sobre elementos incrementadores de la activación de promotores eucariotas. La secuencia incrementadora de la transcripción se puede ayustar cortar y empalmar en el vector en una posición 5' o 3' al DNA de HRG, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor.

(vi) Componente de finalización de transcripción

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias están disponibles comúnmente de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de los DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica para la HRG. Las regiones no 3' traducidas también incluyen los sitios de finalización de la transcripción.

Para la construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los anteriores componentes enunciados, las secuencias codificantes y control deseadas se utilizan técnicas de ligación estándar. Los plásmidos aislados, o los fragmentos de DNA se cortan, se recortan sus extremos y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

En el análisis para confirmar que las secuencias son correctas en los plásmidos construidos, se utilizan mezclas de ligación para transformar la cepa de E. coli K12 294 (ATCC 31.446) y los transformantes con éxito se seleccionan por su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según sea el caso. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian por el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o por el procedimiento de Maxam y Col., Methdos in Enzymology 65:499 (1980).

De especial interés en la práctica de la presente invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en las células de mamífero del DNA que codifica para la HRG. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que sea capaz de replicarse de forma eficaz, de modo que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez sintetice niveles elevados de un polipéptido deseado que codifique para el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitorios, comprenden un vector de expresión y una célula huésped adecuados, que permiten la identificación positiva conveniente de los polipéptidos codificados por el DNA clonado, así como el rastreo rápido de dichos polipéptidos para las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Así, los sistemas de expresión transitoria son de especial interés en la presente invención para los propósitos de identificar análogos y variantes de HRG que tengan una actividad similar a HRG. Dicho sistema de expresión transitoria se describe en la patente europea EP 309.237, publicad el 29 de marzo de 1989. Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de HRG en el cultivo de células de vertebrados se describen en Gething y col., Nature 293:620-625; Mantei y col., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson y col., patentes europeas EP 117.060 y EP 117.058. Un plásmido de expresión de utilidad para la expresión en el cultivo de células de mamífero de HRG es pRK5 (EP 307.247).

D. Selección de transformantes de células huésped

Las células huésped adecuadas para el clonaje o expresión de vectores de la presente invención son las procariotas, levaduras o eucariotas superiores, tal como se describió anteriormente. Las procariotas adecuadas incluyen las eubacterias, como los organismos Gram-negativos o los Gram-positivos, por ejemplo, E. coli, Bacilli como B. subtilis, Pseudomonas species como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium o Serratia marcescans. Un huésped de clonaje preferido de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.46), aunque también son adecuadas otras cepas como E. coliB, E. coli 1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Preferentemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Alternativamente, son adecuados los procedimientos in vitro de clonaje, p.ej., la PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes adecuados para los vectores que codifican la HRG. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura del pan, es el más utilizado de entre los huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, otros géneros, especies y cepas también están generalmente disponibles y son de utilidad en la presente invención, como Schizosaccharomyces pombe (Beach u Nurse, 249:140 (1981); patente europea EP 139.383, publicad el 2 de mayo de 1985), huéspedes de Kluyveromyces (patente americana U.S.S.N. 4.943.529) como por ejemplo K. Lactis (Louvencourt y col., J. Bacteriol, 737 (1983); K. fragilis, K. Bulgaricus, K. Thermorolerans y K. marxianus, yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070), Streekrishna y col., J. Basic Microbiol. 28:265-278 (1988); Candida, Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979) y hongos filamentosos como Neurospora, Penicillium, Tolypoctadium (patente internacional WO 91/00357, publicado el 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn y col., Gene 26:205-221 (1983); Yelton y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)).

Las células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido HRG glicosilado derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de realizar un procesado complejo y de actividades de glicosilación. En principio, cualquier eucariota superior es adecuada para trabajar, bien sea en cultivo de vertebrados o invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células huésped de 5 insectos permisivas de huéspedes como de Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori (ver por ejemplo, Luckow y col., Biol Technology, 6:47-55 (1988); Miller y col., in Genetic Engineering, Setlow, JK y col., eds., Vol 8 (Plenum Publishing, 1986), pág. 277-279; y Maeda y col., Nature, 315:592-594 (1985)). Varias de estas cepas víricas están disponibles públicamente, p.ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombix mori NPV, pudiéndose utilizar dichos virus tal como se describe en la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden utilizarse como huéspedes. En general, las células de plantas se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, previamente manipulada para contener el DNA de HRG. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el DNA que codifica para HRG se transfiere a la célula vegetal de modo que ésta se transfecta y en condiciones adecuadas expresará el DNA de HRG. Además, también están disponibles secuencias reguladoras y señal compatibles con las células vegetales, como el promotor y las secuencias de señalización de la sintasa nopalina (Depicker y col., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)). Además, los segmentos del DNA aislados de la región cadena arriba del gen T-DNA 780 son capaces de activar o aumentar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en el tejido vegetal que contiene el DNA recombinante (ver la patente europea EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989).

Sin embargo, el interés ha sido mayor en las células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, ed. (1973)). Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos son la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen virol., 36:59, 1977); células de riñón de bebé hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO 76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL75); células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped preferidas son las embrionarias humanas 293 y las células de ovario de hámster chino.

Las células huésped se transfectan y transforman preferentemente con los vectores de expresión o clonaje descritos anteriormente en la presente invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados de forma adecuada para la inducción de promotores, selección de transformantes o la amplificación de los genes codificantes para las secuencias deseadas.

La transfección hace referencia a la incorporación de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de que se exprese o no cualquier secuencia codificante. Se conocen numerosos procedimientos de transfección en la materia, por ejemplo, el procedimiento del CaPO_{4} y la electroporación. En general, se reconoce una transfección con éxito cuando se tiene cualquier indicación de operación de este vector dentro de la célula huésped.

La transformación significa la introducción del DNA en un organismo de modo que el DNA sea replicable, bien como elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándares adecuadas a dichas células. El tratamiento del calcio utiliza el cloruro cálcico, tal como se describió en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra, se utiliza generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras esenciales de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como se describió por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO 89/0589, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin dichas paredes celulares, es preferible el procedimiento del fosfato cálcico descrito en las secciones 16.30-16.37 de Sambrook y col., supra. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamíferos se han descrito en Axel en la patente americana U.S. 4.399.216, publicada el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo generalmente de acuerdo con el procedimiento de Van Sollingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para la introducción de DNA en las células como la inyección nuclear, la electroporación o la fusión de protoplastos.

E. Cultivo de células huésped

Las células procariotas utilizadas para producir el polipéptido HRG de la presente invención se cultivan en un medio adecuado tal como se describió en general por Sambrook y col., supra.

Las células huésped de mamíferos utilizadas para producir la HRG de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Medios disponibles comercialmente como el Ham F10 (Sigma), el Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), el jRPMI-1640 (Sigma) y el Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquier medio de los descritos por Ham y Wallace, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102:255 (1980), las patentes americanas U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; las patentes internacionales WO 90/03430; WO 87/00195 y la patente americana U:S. Re. 30.085, pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse si fuera necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina o el factor de crecimiento epitelial), sales como el cloruro sódico, el calcio, el magnesio y el fosfato), tampones (como el HEPES), nucleósidos (como la adenosina y la timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina™), oligoelementos (definidos como compuestos orgánicos generalmente presentes a concentraciones finales del orden micromolar) y glucosa o cualquier otra fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro suplemento a concentraciones adecuadas, que será conocido por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, pH y similar, son las previamente utilizadas por las células huésped seleccionadas para la expresión y serán evidentes a un experto en la materia.

Las células huésped referidas en esta descripción abarcan las células en un cultivo in vitro así como las células que se hallan dentro de un animal huésped.

Además, se prevé que la HRG de esta invención pueda producirse mediante recombinación homóloga, o mediante procedimientos de recombinantes utilizando elementos control introducidos en las células que contienen el DNA que codifica para la HRG actualmente en utilización. Por ejemplo, un elemento promotor/secuencia incrementadora de la transcripción potente, un supresor o un elemento modulador de la transcripción exógena se inserta en el genoma de la célula huésped deseada en el genoma de la célula huésped determinada a proximidad y orientación suficientes para modificar la transcripción del DNA que codifica para la HRG deseada. El elemento control no codifica la HRG de la presente invención, pero el DNA está presente en el genoma de la célula huésped. A continuación, se pueden rastrear las células que generan la HRG de la presente invención, o producen niveles aumentados o disminuidos de expresión, según se desee.

F. Detección de la amplificación/expresión génica

Se puede cuantificar la amplificación y/o expresión génicas en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia de mancha (análisis de DNA) o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuadamente basada en las secuencias proporcionadas aquí. Se pueden utilizar diversos marcajes, más comúnmente los radioisótopos, en particular el P^{32}. Sin embargo, también se pueden utilizar otras técnicas, como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina se utiliza a continuación como el sitio para la unión a avidina, o a los anticuerpos que pueden marcarse con una gran variedad de marcajes, como los radionúclidos, fluorescentes, enzimas o similares. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que reconozcan duplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo si el dúplex está unido a una superficie, de modo que después de la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

Alternativamente, la expresión génica se puede cuantificar mediante procedimientos inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y del ensayo del cultivo de células o de fluidos corporales, con el fin de cuantificar directamente la expresión del producto génico.

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse en cualquier mamífero. De forma adecuada, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido HRG o contra un péptido sintético basado en las secuencias del DNA proporcionadas aquí, tal como se describe posteriormente en la Sección 4.

G. Purificación del polipéptido heregulina

La HRG se recupera de una fracción de membrana celular. Alternativamente, un fragmento de HRG soluble, cortado proteolíticamente o expresado de forma truncada se recupera del medio de cultivo como polipéptidos solubles.

Cuando HRG se expresa en una célula recombinante distinta a la de origen humano, la HRG está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es deseable purificar la HRG procedente de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones esencialmente homogéneas como la HRG. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar los restos celulares. Las fracciones de membrana y proteínas solubles se separan a continuación. La HRG se purifica de la fracción soluble (que requiere la presencia de una proteasa) y de la fracción de membrana del lisado del cultivo, dependiendo si la HRG está unida o no a la membrana. Los procedimientos siguientes son ejemplos adecuados de procedimientos de purificación: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice, heparina-sepharose o una resina de intercambio catiónico como la DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

Las variantes HRG en donde los residuos se delecionan, insertan o sustituyen se recuperan de la misma manera que la HRG nativa, teniendo en cuenta cualquier cambio esencial en las propiedades ocasionadas por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión HRG con otra proteína o polipéptido, p.ej., un antígeno viral o bacteriano, facilita la purificación; puede utilizarse una columna de inmunoafinidad que contiene el anticuerpo contra el antígeno para adsorber la fusión. Se pueden utilizar columnas de inmunoafinidad, como una columna anti-HRG policlonal de conejo para adsorber la variante HRG uniéndola a por lo menos un epítopo inmune restante. Un inhibidor de proteasa como el fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación y pueden incluirse anticuerpos para evitar el crecimiento de contaminantes fortuitos. Un experto en la materia apreciará que los procedimientos de purificación adecuados para la HRG nativa pueden requerir una modificación para ajustar los cambios en el carácter de las variantes HRG, después de la expresión en un cultivo de células recombinantes.

H. Modificaciones covalentes de HRG

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos de HRG se incluyen dentro del ámbito de la invención. Opcionalmente, se modifican covalentemente tanto la HRG nativa como sus variantes de secuencia aminoacídica. Un tipo de modificación covalente, incluida dentro del ámbito de esta invención, es un fragmento polipeptídico de HRG. Los fragmentos de HRG, como HRG-GDF, que tienen hasta 40 residuos aminoacídicos se preparan de forma conveniente mediante síntesis química, o mediante corte enzimático o químico del polipéptido HRG de longitud completa, o del polipéptido variante de HRG. En la molécula, se introducen otros tipos de modificaciones covalentes de HRG, o de sus fragmentos, haciendo reaccionar residuos aminoacídicos diana de HRG, o fragmentos de lo mismo con un agente derivatizante orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de los residuos N- o C-terminal.

Los residuos cisteinil reaccionan más frecuentemente con los \alpha-haloacetatos (y las correspondientes aminas), como el ácido cloroacético o la cloroacetamida para producir derivados de carboximetil o carboximidometil. Los residuos cisteinil también se derivan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta(5-imidozoil)propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, emtil 2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidil se derivan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0, porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral histidil. El para-bromofenacil bromuro también es útil; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinil y amino terminales se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinil. Otros agentes adecuados para la derivación de residuos con grupos \alpha-amino incluyen los imidoésteres como el metil picolimidato; piridoxal fosfato; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanediona; y la reacción de transaminasas se cataliza con glioxilato.

Los residuos arginil se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos se hallan el fenilglioxal, 2,3-butanediona, 1,2-ciclohexanedina y la nihidrina. La derivación de residuos arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo épsilon-amina de la arginina.

La modificación específica de residuos tirosil puede realizarse, al introducir marcajes espectrales en los residuos tirosil reaccionando con compuestos de diazonio aromático de tetranitrometano. Se utilizan más frecuentemente el
N-acetilimidizol y el tetrametano para formar especies O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosil se yodan con I^{125} o I^{131} para preparar proteínas marcadas para utilizar en el radioinmunoensayo, siendo el procedimiento de cloramina T descrito anteriormente el adecuado.

Los grupos laterales carboxilo(aspartil o glutamil) se modificaron selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), en donde R y R' son diferentes grupos alquil, como el 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o el 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilfenil) carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamil se convierten en asparaginil y glutamil reaccionándolos con iones amonio.

La derivación con agentes bifuncionales es útil para la unión de HRG a una matriz soporte insoluble en agua o a una superficie a utilizar en el procedimiento de purificación de anticuerpos anti-HRG y viceversa. Agentes de unión utilizados comúnmente incluyen, p.ej., la 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehido, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidil como el 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales como el bis-N-maleimida-1,8-octano. Los agentes de derivación como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes americanas U.S.3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización de proteínas.

Los residuos glutaminil y asparaginil se desaminan frecuentemente a los residuos correspondientes glutamil y aspartil. Alternativamente, estos residuos se desaminan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de grupos hidroxilos de residuos seril o treonil, la metilación de grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, WH. Freeman & Co., San Francisco, pág. 79-86 (1983), la acetilación del grupo amino N-terminal y la amidación del grupo carboxilo C-terminal.

La HRG se fusiona opcionalmente con un polipéptido heterólogo a HRG. El polipéptido heterólogo es opcionalmente una secuencia de anclaje como la hallada en el factor de aceleración de la desintegración (DAF); una toxina como la ricina, la exotoxina de pseudomonas, la gelonina u otros polipéptidos que darán como resultado la muerte de células diana. Estos polipéptidos heterólogos están unidos covalentemente a HRG a través de cadenas laterales o por los residuos terminales. De forma similar, la HRG se conjuga unto con otras moléculas tóxicas o inhibidoras de una célula de mamífero diana, p.ej., los tricotecenos o el DNA antisentido que bloquea la expresión de los genes diana.

La HRG se modifica covalentemente al alterar su patrón de glicosilación nativo. Uno o más sustituyentes de carbohidratos se modifican añadiendo, eliminando o variando los componentes monosacáridos en un sitio determinado, o mediante la modificación de residuos en la HRG de modo que se añaden o delecionan dichos sitios de glicosilación.

La glicosilación de polipéptidos, típicamente, está ligada a N- u O-. Ligada a N-, o N-glicosilación, hace referencia a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tri-peptídicas asparagina-X-serina y aspargina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido a excepción de la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de la asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La O-glicosilación hace referencia a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente la serína o la treonina, aunque también puede utilizarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

Los sitios de glicosilación se añaden a la HRG mediante alteración de su secuencia aminoacídica, a fin de contener uno o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para sitios de N-glicosilación). La alteración también se puede realizar mediante adición de, o sustitución por, uno o más residuos serína o treonina a la HRG (para sitios de O-glicosilación). Para mayor facilidad, la HRG se modifica preferentemente mediante cambios a nivel del DNA, en particular mutando el DNA que codifica para la HRG en bases preseleccionadas, de modo que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

El acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos a la HRG incrementa el número de sustituyentes de carbohidratos. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped capaz de N- u O-glicosilación. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar (o azúcares) puede unirse a (a) una arginina o histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfidrilos libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo como los de la serína, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente internacional WO 87/05330, publicada el 11 de septiembre y en Aplin y Wriston (CRC Crit. REv. Biochem., pág. 259-306 (1981)).

Las porciones de carbohidrato presentes en una HRG se eliminan química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto de ácido trifluorometansulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado el corte de la mayoría de azúcares, excepto del azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin y col. (Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)) y por Edge y col., (Anal. Biochem., 118:131 (1981)). Las porciones de carbohidrato se eliminan de la HRG mediante diversas endo- y exo-glicosidasas, tal como se describe por Thotakura y col., (Meth. Enzymol., 138:350 (1987)).

La glicosilación añadida durante la expresión en las células también se suprime por la tunicamicina, tal como se describe por Duskin y col., (J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)). La tunicamicina bloquea la formación de las uniones proteína-N-glicósido.

La HRG también se modifica mediante unión de la HRG a diversos polímeros no proteicos, p.ej., el polietilén glicol, el propilén glicol o los polioxialquilenos, de la forma descrita en las patentes americanas U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.471; 4.791.192 ó 4.179.337.

Un modo preferido para aumentar la vida media circulante in vivo de la HRG no unida a membrana es conjugarla a un polímero que le confiera una vida media prolongada, como el polietilén glicol (PEG). (Maxfield y col., Polymer 16, 505-509 (1975); Bailey, F.E. y col., en Nonionic Surfactants (Schick, MJ, ed.) pág. 794-821 (1967); Abuchowski A. y col., J. Biol. Chem., 252:3582-1 3586 (1977); Abuchowski A. y col., Cancer Biochem Biophys. 7:175-186 (1984); Katre, N.V. y col., también se ha descrito que el PEG reduce la inmunogenicidad y la toxicidad (Abuchowski A. y col., J. Biol. Chem., 252:3582-3586 (1977)).

La HRG se inmoviliza en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-[metilmetacilato], respectivamente), en sistemas de liberación del fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microsesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., Oslo, A., Ed. (1980).

La HRG se utiliza también en la generación de anticuerpos, como estándares en ensayos para HRG (p.ej., mediante marcaje de la HRG para utilizar como un estándar en un radioinmunoensayo, inmunoensayo ligado a enzima, o ensayo de radioreceptor), en técnicas de purificación por afinidad y en ensayos de unión de receptor de tipo competitivo en donde se marcan con yodo radioactivo, enzimas, fluoróforos, marcajes electrónicos, y similares.

Los expertos en la materia serán capaces de rastrear variantes con el fin de seleccionar la variante óptima para el propósito deseado. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de HRG, como un cambio en la afinidad para un antígeno dado o para el receptor HER2, se cuantifica mediante un inmunoensayo de tipo competitivo utilizando un estándar o control como una HRG nativa (en particular la HRG-GFD nativa). También se ensayan, mediante procedimientos bien conocidos en la materia, otras modificaciones potenciales de las propiedades de la proteína o del polipéptido, como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad, susceptibilidad a la degradación proteolítica, estabilidad del cultivo de células recombinantes, o la tendencia a agregarse con vehículos o en multímeros.

1.Utilización terapéutica de los ligandos de la heregulina

Aunque se desconoce el papel de la p185^{HER2} y de su ligando en el crecimiento y la diferenciación celular, es un objetivo de la presente invención desarrollar utilizaciones terapéuticas de los ligandos de p185^{HER2} de la presente invención para promover el crecimiento y desarrollo normal y para inhibir el crecimiento anormal, especialmente en tejidos malignos o neoplásicos.

2. Composiciones terapéuticas y administración de HRG

Las formulaciones terapéuticas de HRG o del anticuerpo contra HRG se preparan para su almacenamiento mezclando la proteína HRG, que tiene el grado de pureza deseado, con vehículos, excipientes, o estabilizantes opcionales aceptables fisiológicamente (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra), en la forma de una pasta liofilizada o soluciones acuosas. Los vehículos, exicipientes o estabilizantes no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) (para prevenir la formación de metóxido); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrof.ílicos como la polivinilpirrolidona: aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, manosa, o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; y /o los tensoactivos no-iónicos como el Tween, el Pluronics o el polietilén glicol (PEG).

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La HRG o el anticuerpo contra la HRG a utilizar para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se logra fácilmente filtrando a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución. La HRG o el anticuerpo contra la HRG se guardarán generalmente en una forma liofilizad o en solución.

Las composiciones terapéuticas de HRG o de anticuerpos específicos de HRG se colocan en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La HRG, su anticuerpo o la variante de HRG cuando se utiliza como un antagonista puede combinarse opcionalmente con o ser administrado junto con otros agentes para utilizar en el tratamiento de procesos malignos. Cuando la HRG se utiliza como un agonista para estimular el receptor del HER2, por ejemplo en el cultivo de tejidos, se puede combinar con o administrarse junto con otras composiciones que estimulen el crecimiento como el PDGF, FGF, EGF, la hormona de crecimiento u otros factores proteicos de crecimiento.

La vía de administración de la HRG o del anticuerpo de HRG está de acuerdo con los procedimientos conocidos, p.ej., inyección o infusión por vías intravenosas, intraperitoneales, intracerebrales, intramusculares, intraoculares, o intralesionales, o por sistemas de liberación sostenida tal como se indica más adelante. La HRG se administra de forma continua por infusión o por inyección del bolo. El anticuerpo de HRG se administra de la misma manera, o por administración en la circulación sanguínea o linfática.

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos que contienen la proteína, estando dichas matrices bajo la forma de artículos moldeados, p.ej., películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres [p.ej., poli(2-hidroximetil-metacrilato) tal como se describe por Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer,Chem. Tech., 12:98-105 (1982) o poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919, patente europea EP 58.481), los copolímeros del ácido L-glutámico y del gamma etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), etilen-vinil acetato no-degradable (Langer y col., supra), copolímeros degradables de ácido láctico -ácido glicólico como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-glicólico y de acetato de leuprolide) y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (patente española EP 133.988). Mientras que los polímeros como el acetato de etilen-vinilo y del ácido láctico-glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Si las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante períodos prolongados, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como resultado un pérdida de la actividad biológica y de cambios posibles en la inmunogenicidad. Se pueden elaborar estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación resulta ser la formación de un enlace S-S intermolecular gracias a un intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos sulfhidrilo, liofilización de soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicos.

Las composiciones de HRG o anticuerpos de liberación sostenida también incluyen la HRG o el anticuerpo atrapado en liposomas. Estos liposomas que contienen la HRG o el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); patente europea EP 52.322; patente europea EP 36.676; patente europea EP 143.949; patente europea EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patente americana U.S. 4.485.045 y 4.544.545; y patente europea EP 102.324. En general, los liposomas son de tipo unilamelar y pequeños (aproximadamente de 200-800 Angstroms), en donde el contenido lipídico es superior a aproximadamente el 30% de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada a la terapia óptima de HRG. Los liposomas con un tiempo de circulación aumentado se describen en la patente americana U.S. 5.013.556.

Otra utilización de la presente invención comprende la incorporación del polipéptido o anticuerpo de HRG en dichos artículos. Éstos artículos pueden utilizarse en la modulación y el desarrollo del crecimiento celular. Además, se puede modular el crecimiento y la división y la invasión del tumor con dichos artículos.

Una cantidad eficaz de HRG o de anticuerpo a utilizar terapéuticamente dependerá, por ejemplo, según los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y de la condición del paciente. Según ello, será necesario para el terapeuta titular la dosificación y modificar la vía de administración tal como se requiere para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede hallarse en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/Kg hasta 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. De forma característica, el médico administrará HRG o anticuerpo hasta alcanzar una dosificación que produzca el efecto deseado. El progreso de este terapia se controla fácilmente mediante ensayos convencionales.

3. Preparación del anticuerpo heregulina y de la utilización terapéutica

Los anticuerpos de esta invención se obtienen mediante rastreo rutinario. Los anticuerpos policlonales de HRG se producen generalmente mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de HRG y un adyuvante. Puede ser útil conjugar la HRG o un fragmento de HRG que contenga la secuencia aminoacídica diana a una proteína inmunogénica en las especies a inmunizar, p.ej., la hemocianina de la lapa californiana, la seroalalbúmina, la tiroglobulina, o el inhibidor de la tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación por sus residuos cisteína), la N-hidroxisuccinimida (por sus residuos lisina), el glutaraldehído, el anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, en donde R y R^{1} son grupos alquilo distintos.

La vía y el programa de inmunización de un animal, o del cultivo y extracción de las células productoras de anticuerpos se realizan generalmente de acuerdo con las técnicas convencionales y establecidas para la estimulación y producción de anticuerpos. Aunque, frecuentemente son los ratones los que se inmunizan, se contempla también que cualquier sujeto mamífero, incluyendo los humanos, o las células productoras de 1 anticuerpos obtenidas a partir de ellos, pueda ser inmunizado para generar las células productoras de anticuerpos.

Los individuos se inmunizan de forma característica contra HRG o sus conjugados inmunogénicos, o derivados, mediante la combinación de 1 \mug de HRG inmunógeno (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde, los individuos se estimulan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de inmunógeno en adyuvante completo de Freund (u otro adyuvante adecuado) mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. Al cabo de 7 a 14 días, se sangran los animales y se analiza el suero para conocer el título de anti-HRG. Los individuos se estimulan hasta alcanzar una titulación en la meseta de producción de anticuerpos. Preferentemente, el individuo se estimula con un conjugado de la misma HRG, pero conjugado a una proteína distinta y/o con un agente de unión distinto. Los conjugados también se pueden realizar en el cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. También, se utilizan agentes agregantes como el alumbre para incrementar la respuesta inmune.

Después de la inmunización, los anticuerpos monoclonales se preparan recuperando la respuesta inmune de las células linfoides (generalmente células del bazo o linfocitos del tejido de los nódulos linfáticos) de animales inmunizados e inmortalizando las células de forma convencional, p.ej., mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación con el virus Epstein-Barr (EB) y rastreo de los clones que expresan el anticuerpo deseado. La técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6:51 (1976) se ha utilizado ampliamente para producir líneas celulares híbridas que secreten niveles elevados de anticuerpos monoclonales contra muchos antígenos específicos.

Es posible fusionar las células de una especie con otra. Sin embargo, es preferible que la fuente de células inmunizadas productoras del anticuerpo y la del mieloma sean de la misma especie.

Las líneas celulares de hibridomas productoras de anti-HRG se identifican rastreando los sobrenadantes del cultivo para conocer la presencia del anticuerpo que se une a HRG. Esto se logra de forma rutinaria mediante inmunoensayos convencionales utilizando preparaciones de HRG, o mediante FACS utilizando la HRG unida a la célula y el anticuerpo candidato marcado.

Las líneas celulares híbridas se pueden mantener en cultivo in vitro en el medio de cultivo celular. Las líneas celulares de la presente invención se pueden seleccionar y/o mantener en una composición que comprende la línea celular continua en medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). De hecho, una vez se ha establecido la línea celular del hibridoma, se la puede mantener en diversos medios adecuados nurtritivos. Además, las líneas celulares híbridas se pueden almacenar y conservar en cualquiera de las formas convencionales, incluyendo la congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido. Las líneas celulares congeladas se pueden reavivar y volver a cultivar de forma indefinida, reanudándose la síntesis y secreción del anticuerpo monoclonal. El anticuerpo secretado se recupera del sobrenadante del cultivo celular mediante procedimientos convencionales como la precipitación, la cromatografía de intercambio fónico, la cromatografía de afinidad, o similares. Los anticuerpos descritos aquí también se recuperan de cultivos celulares de hibridomas mediante procedimientos convencionales para la purificación de IgG o IgM, como puede ser el caso utilizado aquí para purificar estas inmunoglobulinas de un plasma agrupado, p.ej., procedimientos de precipitación con etanol o polietilén glicol. Los anticuerpos purificados se filtran estérilmente y opcionalmente se conjugan con un marcador detectable como una enzima o un marcaje electrónico para utilizar en ensayos diagnósticos de la HRG en las muestras a analizar.

Aunque generalmente se utilicen los anticuerpos monoclonales de ratón, la invención no está limitada por ello; de hecho, los anticuerpos humanos se pueden utilizar e incluso demostrar que son preferibles. Dichos anticuerpos se pueden obtener utilizando hibridomas humanos (Cote y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Lis, p. 77 (1985)). Los anticuerpos quiméricos, Cabilly y col., (Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851 (984); Neuberger y col., Nature 312:604 (1984); Takeda y col., Nature 314:452 (1985)) que contiene una región variable anti-HRG murina y una región constante humana de actividad biológica adecuada (como la capacidad para activar el complemento humano y mediar la ADCC) se hallan dentro del ámbito de la presente invención, como los anticuerpos anti-HRG humanizados producidos mediante procedimientos convencionales de injerto-CRD.

Dentro de la práctica de la presente invención, se abarcan las técnicas para la creación de versiones del DNA de las regiones de unión al antígeno de moléculas de anticuerpo (conocidas como Fab o fragmentos de regiones variables) que no necesitan la generación de anticuerpos monoclonales. Una vez extraídas las moléculas de RNA mensajero específicas del anticuerpo de células del sistema inmune obtenidas de un individuo inmunizado, estas moléculas se transcriben a DNA complementario (cDNA) y estos cDNAs se clonan en un sistema de expresión bacteriano, seleccionándose según sus características de unión deseadas. El procedimiento de Scrips/Stratagene utiliza un sistema de vector del bacteriófago lambda que contiene una secuencia líder que causa que la proteína Fab expresada migre al espacio periplásmico (entre la membrana celular y la pared celular de la bacteria) o se secrete. A continuación, se puede generar y rastrear rápidamente un gran número de fragmentos Fab funcionales para identificar cuál se une a HRG con las características deseadas.

Los anticuerpos específicos para HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRGº-\beta2 y HRG-\beta3 pueden producirse y utilizarse de la forma descrita anteriormente. Los anticuerpos específicos de HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRGº-\beta2 y HRG-\beta3 de la presente invención no reaccionan, preferentemente, de forma cruzada con otros miembros de la familia EGF (Fig. 6) o entre ellos.

De especial interés son los anticuerpos capaces de unirse específicamente a HRG-NTD, HRG-GFD o HRG-CTP. También son interesantes los anticuerpos capaces de unirse específicamente a los sitios de procesamiento proteolítico entre GFD y los dominios transmembrana. Estos anticuerpos se identifican mediante procedimientos convencionales per se. Por ejemplo, un banco de anticuerpos candidatos capaces de unirse a HRG-ECD o pre-HRG se obtiene mediante los procedimientos anteriores utilizando la inmunización con la proHRG completa. Estos anticuerpos pueden así subdividirse por su capacidad de unirse a diversos dominios de HRG utilizando técnicas de mapeo convencional. Menos preferibles, son los anticuerpos específicos para un dominio predeterminado, generados mediante inmunización del individuo con un polipéptido que comprende esencialmente sólo el dominio en cuestión, p.ej., HRG-GFD libre de los polipéptidos NTD o CTP. Estos anticuerpos no necesitarán del mapeo excepto si se desea la unión con un epítopo determinado.

Los anticuerpos capaces de unirse a sitios de procesamiento proteolítico son de especial interés. Éstos se producen mediante inmunización con un fragmento de HRG que incluye el sitio de procesamiento de CTP, con HRG intacta, o con HRG-NTD-GFD, y luego se realiza el rastreo de su capacidad para bloquear o inhibir el procesamiento proteolítico de la HRG en el fragmento de NTD-GFD por las células huésped recombinantes, o las líneas celulares aisladas capaces de procesar la HRG en el fragmento. Estos anticuerpos son de utilidad para suprimir la liberación de NTD-GFD y en consecuencia son prometedores para utilizar en la prevención de la liberación de NTD-GFD y la estimulación del receptor de HER-2. También son útiles para el control del crecimiento celular y de la replicación. Los anticuerpos anti-GFD son útiles por las mismas razones, pero puede que no sean biológicamente eficaces como anticuerpos dirigidos contra un sitio de procesamiento.

Los anticuerpos se seleccionan para ser capaces de unirse únicamente a uno de los miembros de la familia HRG, p.ej., alfa-HRG o cualquiera de las isoformas de la HRG-beta. Dado que cada uno de los miembros de la familia HRG tiene un sitio de corte del dominio transmembrana-GFD distinto, los anticuerpos dirigidos específicamente contra estas únicas secuencias permitirán la inhibición altamente específica de cada uno de los GFDs, o de los sitios de procesamiento y por lo tanto permitirán perfeccionar la respuesta biológica deseada. Por ejemplo, las células de carcinoma mamario dependientes de HER2 pueden, de hecho, activarse por un único isotipo GFD o, sino, el GFD activador puede originarse únicamente a partir de una secuencia de procesamiento determinada, bien en la propia célula portadora del HER-2 o en una célula generadora de GFD. La identificación de la diana activadora de GFD o del sitio,de procesamiento es una forma sencilla de analizar los carcinomas dependientes de HER2, p.ej., analizando los tejidos para la presencia de un miembro determinado de la familia GFD asociado con el receptor, o mediante el análisis de tejidos para la expresión de un miembro de la familia de HRG (que serviría como la diana terapéutica). Estos anticuerpos selectivos se producen de la misma manera que la descrita anteriormente, bien mediante inmunización con la secuencia o el dominio diana, o mediante selección a partir de un banco de anticuerpos con una amplia especificidad.

Tal como se describió anteriormente, los anticuerpos deberían tener una especificidad y afinidad elevadas para con la secuencia diana. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra las secuencias GFD deberían tener una mayor afinidad para el GFD que la afinidad del GFD por el receptor HER2. Dichos anticuerpos se seleccionan mediante procedimientos de rastreo rutinarios.

4.Utilizaciones no-terapéuticas de la Heregulina y sus anticuerpos

El ácido nucleico que codifica para HRG puede utilizarse como diagnóstico para el tipado específico de tejidos. Por ejemplo, los procedimientos como la hibridación in situ, la transferencia de Northern y Southern y el análisis por PCR pueden utilizarse para determinar si el DNA y/o el RNA que codifican para la HRG están presentes en el

\hbox{tipo(s)}

celular que se evalúa. En particular, el ácido nucleico puede ser útil como una sonda específica para ciertos tipos de células tumorales como por ejemplo, la glándula mamaria, los adenocarcinomas gástricos y de colon, las glándulas salivales y otros tejidos que contienen p185^{HER2}.

La HRG se puede utilizar aislada en ensayos diagnósticos cuantitativos, como un estándar o un control contra el que se pueden comparar muestras de cantidades desconocidas de HRG.

La HRG aislada se puede utilizar como un factor de crecimiento para el cultivo de células in vitro y para promover in vivo el crecimiento de células que contienen p185^{HER2} u otros receptores análogos.

Los anticuerpos de HRG son de utilidad en ensayos diagnósticos para la expresión de HRG en células o tejidos específicos. Los anticuerpos se marcan de la misma manera que la descrita anteriormente para HRG y/o se inmovilizan en una matriz insoluble.

Los anticuerpos de HRG son de utilidad para la purificación por afinidad de HRG a partir del cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales. Los anticuerpos de HRG que no reaccionan de forma detectable con otras HRG se pueden utilizarse para purificar la HRG libre de otros ligandos conocidos o de proteínas contaminantes.

Los ensayos diagnósticos adecuados para la HRG y sus anticuerpos son bien conocidos per se. Dichos ensayos incluyen ensayos competitivos y de sándwich y los ensayos de inhibición estérica. Los procedimientos competitivos y de sándwich utilizan una etapa de separación en fases como parte integral del procedimiento, mientras que los ensayos de inhibición estérica se llevan a cabo en una única mezcla de reacción. Fundamentalmente, se utilizan los mismos procedimientos para el ensayo de la HRG y para las sustancias que se unen a HRG, aunque algunos procedimientos tendrán mejor o peor acogida dependiendo del peso molecular de la sustancia a analizar. En consecuencia, la sustancia a analizar es referida aquí como un analito, irrespectivamente de su estado, un antígeno o un anticuerpo, y las proteínas que se unen al analito se denominan parejas de unión, bien sean anticuerpos, receptores de superficie celular o antígenos.

Los procedimientos analíticos para la HRG o sus anticuerpos utilizan uno o más de uno de los reactivos siguientes: análogo de analito marcado, análogo de analito inmovilizado, pareja de unión marcada, pareja de unión inmovilizada y conjugados estéricos. Los reactivos marcados también se conocen como "trazadores".

El marcaje utilizado (y ello es también útil para marcar el ácido nucleico codificante de la HRG para utilizar como sonda) es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del analito y su pareja de unión. Se conocen muchos marcajes para utilizar en inmunoensayos, como ejemplos se incluyen las porciones que pueden detectarse directamente, como los marcajes con fluorocromos, quimioluminiscentes y radiactivos, así como también las porciones, como las enzimas, que deben reaccionar o modificarse para ser detectadas. Ejemplos de dichos marcajes incluyen los radioisótopos P^{32}, C^{14}, I^{125}, H^{3} y I^{131}, los fluoróforos como los quelatos térreos raros o la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus derivados, el dansilo, la umbeliferona, las luciferasas, p.ej., la luciferasa da la luciérnaga (patente americana U.S. 4.737.456), la luciferina, las 2,3-dihidroftalazinedionas, la peroxidasa de rábano (HRP), la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la lisozima, las oxidasas de sacárido, p.ej., la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, las oxidasas heterocíclicas como la uricasa y la xantina oxidasa, conjugada con una enzima que utiliza el peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor del colorante como la HRP, la lactoperoxidasa, o la microperoxidasa, la biotina/avidina, los marcadores electrónicos, los marcadores de bacteriófagos, los radicales libres estables y similares.

Están disponibles los procedimientos convencionales para unirse covalentemente con estos marcajes a las proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, los agentes acoplantes como los aldehídos, las carbodiimidas, las maleimidas, los bis-imidatos, la benzidina bis-diazotizada y similares se pueden utilizar para poner una etiqueta a los anticuerpos con los fluorescentes, quimiluminiscentes y marcajes enzimáticos anteriormente descritos. Ver, por ejemplo, la patente americana U.S. 3.940.475 (fluorimetría) y 3.645.090 (enzimas); Hunter y col., Nature, 144:945 (1962); David y col., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain y col., J. Immunol. Methods, 40:219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982). Los marcajes preferidos aquí son la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina. La conjugación de dicho marcaje, incluyendo las enzimas, con el anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para un experto en las técnicas de inmunoensayo. Ver, por ejemplo, O'Sullivan y col., "Methods for the preparation of Enzyme-antibody conjugates for use in enzyme Iimmunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone y H. Vunakis, vol. 73 (Academic Press, New York, 1981), pp. 147-166. Dichos procedimientos de marcaje son adecuados para utilizar con la HRG o sus anticuerpos, todos ellos proteicos.

Para ciertos procedimientos de ensayo se necesita la inmovilización de los reactivos. Esta inmovilización comprende la separación de la pareja de unión de cualquier analito que permanezca libre en solución. Ello se logra insolubilizando la pareja de unión o el analito análogo cantes del procedimiento de ensayo, como la adsorción a una matriz o superficie insoluble al agua (Bennich y col., patente americana U.S. 3.720.760), mediante unión covalente (por ejemplo, entrecruzamiento con glutaraldehído), o insolubilizando inmediatamente después la pareja o el análogo, p.ej., mediante inmunoprecipitación.

Otros procedimientos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o de sándwich, están bien establecidos y se utilizan ampliamente en la industria para diagnósticos comerciales.

Los ensayos competitivos se basan en la capacidad de un análogo de trazador para competir con el analito de la muestra test por un número de sitios de unión en una pareja de unión común. Generalmente, la pareja de unión se insolubiliza antes o después de la competición y luego el trazador y el analito unidos a la pareja de unión se separan del trazador y del analito no-unidos. Esta separación se logra decantando (si la pareja de unión se ha presinsolubilizado) o mediante centrifugación (si la pareja de unión se precipitó después de la reacción de competición). La cantidad del analito de la muestra test es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unido. tal como se cuantifica por la cantidad de sustancia marcadora. Las curvas de dosis-respuesta con cantidades conocidas de analito se preparan y comparan con los resultados test para determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra test. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando las enzimas se utilizan como marcadores detectables.

Otras especies de ensayo competitivo, denominado "ensayo homogéneo", no requieren una fase de reparación. Aquí, se prepara y se utiliza un conjugado o una enzima con el analito, así cuando el anti-analito se una al analito la presencia del anti-analito modifique la actividad enzimática. En este caso, la HRG o sus fragmentos activos inmunológicamente se conjugan con un puente orgánico bifuncional como la peroxidas. Los conjugados se seleccionan para utilizar con el anti-HRG del anticuerpo anti-HRG a fin de que la unión del anticuerpo anti-HRG inhiba o potencia la actividad enzimática del marcaje. Este procedimiento per se se utiliza ampliamente bajo el nombre de EMI.

Los conjugados estéricos se utilizan en procedimientos para impedimentos estéricos en el ensayo homogéneo. Estos conjugados se sintetizan uniendo covalentemente un hapteno de bajo peso molecular con un analito pequeño, a fin de que el anticuerpo contra el hapteno sea incapaz esencialmente de unirse al conjugado al mismo tiempo que el anti-analito. En este procedimiento de ensayo, el analito presente en la muestra test se unirá al anti-analito, permitiendo así que el anti-hapteno se una al conjugado, dando como resultado un cambio en el carácter del hapteno conjugado, p.ej., un cambio en la fluorescencia si el hapteno es un fluoróforo.

Los ensayos sándwich, en particular, son de utilidad para la determinación de la HRG o de los anticuerpos de HRG. En los ensayos sándwich secuenciales, se utiliza una pareja de unión inmovilizada para adsorber el analito de una muestra test, la muestra test se elimina mediante lavados, el analito unido se usa para adsorber la pareja de unión marcada y a continuación el material unido se separa del trazador-residual. La cantidad de trazador unido es directamente proporcional al analito de la muestra test. En ensayos sándwich "simultáneos", la muestra test no se separa antes de la adición de la pareja de unión marcada. Y un ensayo sándwich secuencial, que utiliza un anticuerpo monoclonal anti-HRG como un anticuerpo y un anticuerpo anti-HRG policlonal como el otro anticuerpo, se utiliza para analizar la actividad HRG de las muestras.

Los ensayos citados anteriormente son únicamente ejemplos de ensayos diagnósticos para HRG y sus anticuerpos. Otros procedimientos desarrollados hasta ahora o más adelante en la presente invención para la determinación de estos análisis se incluyen dentro del ámbito de la misma, incluyendo los bioensayos descritos anteriormente.

Los polipéptidos de HRG se pueden utilizar para la purificación por afinidad de los receptores como la p185^{HER2} y otros receptores similares que tienen una afinidad de unión para HRG y más específicamente para HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRG-\beta2 y HRG-\beta3. Para formar polipéptidos de fusión, en donde la porción HRG es útil para la afinidad de unión de ácidos nucleicos y heparina, se pueden utilizar la HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRG-\beta2 y HRG-\beta3.

Los polipéptidos HRG se pueden utilizar para el rastreo competitivo de agonistas o antagonistas potenciales para la unión a p185^{HER2}. Las variantes de HRG son útiles como estándares o controles en los ensayos de HRG, siempre que sean reconocidos por el sistema analítico utilizado, p.ej., un anticuerpo anti-HRG. En ensayos en donde la HRG se desnaturaliza antes del ensayo, se utiliza un anticuerpo capaz de unirse a la HRG o a un fragmento de lo mimo desnaturalizados. Y en este ensayo, la HRG o el fragmento se utiliza como un estándar o control. Preferentemente, HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRG-\beta2 y HRG-\beta3 se marcan de forma detectable y se realiza un ensayo de competición para unir la p185^{HER2} utilizando procedimientos de ensayo estándares.

Los procedimientos y métodos descritos aquí con la HRG-\alpha pueden aplicarse de forma similar a HRG-\beta1,

\hbox{HRG- \beta 2}

y HRG-\beta3 y a otros nuevos ligandos de HRG y a sus variantes. Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación. Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de los sobrenadantes de células de cáncer de mama

La heregulina-\alpha se aisló del sobrenadante del carcinoma de mama humano MDA-MB-231. La HRG se liberó en el medio de cultivo celular y de allí se aisló.

a. Cultivo celular

Las células de carcinoma de mama humano, MDA-MB-231, obtenibles del American Type Culture Collection (ATCC HTB 26) se escalaron inicialmente desde frascos de cultivo de tejidos de 25 cm^{2} a botellas cilíndrica de plástico de 890 cm^{2} (Corning, Coming, NY) mediante pasajes seriados, manteniéndose la línea de sembrado a escala de las botellas cilíndricas. Para realizar los pasajes de las células y mantener la línea de sembrado, en primer lugar, se lavaron los frascos y las botellas cilíndricas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y a continuación se incubaron con tripsina/EDTA (Sigma, St. Louis, Mo) durante 1-3 minutos a 37ºC. Las células desenganchadas se pipetearon varias veces en medio de cultivo fresco con suero bovino fetal (FBS), (Gibco, Grand Island, NY) para romper los agregados celulares e inactivar la tripsina. Por último, las células se repartieron a una proporción de 1:10 en medio de cultivo fresco, se transfirieron a frascos o botellas nuevas, se incubaron a 37ºC, dejándolas crecer hasta la confluencia. El medio de crecimiento en donde se mantuvieron las células fue una formulación de medios combinados de DME/Ham's-F12 modificada en relación con las concentraciones de algunos aminoácidos, vitaminas, azúcares y sales y suplementado con FBS al 5%. El mismo medio basal se utilizó para la producción de ligando libre de suero y se suplemento con Primatone RL al 0,5% (Shefield, Norwich, NY).

b. Producción a gran escala

Se obtuvo un crecimiento a gran escala de MDA-MB-231 utilizando los microvehículos de Percell Biolytica (Hyclone Laboratories, Logan, UT) realizados de gelatina entrecruzada. En primer lugar, los microvehículos se hidrataron, se autoclavaron y se lavaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células procedentes de 10 botellas cilíndricas de se tripsinizaron y se añadieron un frasco centrifugador de inoculación que contenía tres litros de medio de crecimiento y 10-20 g de microvehículos hidratados. Se agitaron suavemente las células durante aproximadamente 1 hora y se transfirieron a un fermentador de 10 litros que contenía 7 litros de medio de cultivo. El cultivo se agitó a 65-75 rpm para mantener los microvehículos en suspensión. El fermentador se mantuvo a 37ºC y el pH a 7,0-7,2 añadiendo carbonato sódico y CO_{2}. Los gases del aire y oxígeno se introdujeron mediante aspersión para mantener el cultivo a aproximadamente el 40% de saturación de aire. La población celular se controló microscópicamente con un colorante vital fluorescente (diacetato de fluoresceína) y se comparó con la tinción con tripan-blue para valorar la viabilidad celular relativa y del grado de invasión de microvehículos por las células. Los cambios en el tamaño de los agregados célula-microvehículo se controlaron mediante fotografía microscópica.

Una vez alcanzada una confluencia del 90-100%, se lavó el cultivo con medio sin suero para eliminar el suero. Ello se logró parando la agitación y con otros controles para permitir que los microvehículos se depositaran en el fondo de los recipientes. Aproximadamente, se bombearon 9 litros del sobrenadante del cultivo fuera del recipiente y se reemplazaron con un volumen equivalente de medio sin suero (el mismo medio basal descrito anteriormente y suplementado con o sin Primatone RL). Los microvehículos se resuspendieron brevemente y se repitió el proceso hasta lograr una renovación de 1000 veces de FBS. A continuación, las células se incubaron en medio sin suero durante 3-5 días. La concentración de glucosa en el cultivo se controló diariamente y se suplementó con adiciones de glucosa necesarias para mantener la concentración en el fermentador a aproximadamente 1 g/l. En el momento de la cosecha, los microvehículos se depositaron, tal como se describió anteriormente, y el sobrenadante se recogió asépticamente y se almacenó a 2-8ºC para su purificación. A continuación, se añadió medio fresco sin suero en el fermentador, se resuspendieron los microvehículos y el cultivo se incubó y cosechó como antes, pudiéndose repetir este procedimiento cuatro veces.

Ejemplo 2 Purificación de la actividad del factor de crecimiento

El medio condicionado (10-20 l) de las células MDA-MB-231 se clarificó por centrifugación a 10.000 rpm en una centrífuga Sorvall, se filtró a través de un filtro de 0,22 \mu y luego se concentró 10-50 (aproximadamente 25) veces con una unidad de Minitan Tangential Flow Unit (Millipore Corp.) con una membrana de corte de 10 KDa de polisulfona a temperatura ambiente. Alternativamente, se concentró el medio con 2,5 L de Amicon Stirred Cell a 4ºC con una membrana YM3. Después de la concentración, se centrifugó de nuevo el medio a 10.000 rpm y se congeló el sobrenadante en alícuotas de 35-50 ml a -80ºC.

La Sepharose-Heparina se obtuvo de Pharmacia (Piscataway, NJ) y se preparó de acuerdo con las direcciones del fabricante. Se empaquetaron 5 ml de la resina en una columna y se lavaron extensamente (100 volúmenes de la columna) y se equilibraron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El medio condicionado se descongeló, se filtró con una filtro de 0,22 \mu para eliminar el material particulado y se cargó en una columna de Sepharose-heparina a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La carga normal consistió de 30-50 ml del medio concentrado 40 veces. Después de la carga, la columna se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm retornó a la línea de base antes de iniciar la elución de proteínas. La columna se eluyó a 1 ml/min con etapas sucesivas de sal de NaCl a 0,3 M, 0,6 M, 0,9 M y (opcionalmente) 2,0 M preparada en PBS. Cada etapa se continuó hasta que la absorbancia retornó a la línea de base, generalmente de 6-10 volúmenes de columna. Se recogieron fracciones de 1 ml de volumen. Todas las fracciones correspondientes con cada lavado o etapa salina se agruparon y se guardaron para el consiguiente ensayo en las células MDA-MDB-453.

La mayor actividad estimuladora de la fosforilación de tirosina se halló en el agrupado de NaCl 0,6M, que se utilizó para la próxima etapa de purificación. Se descongelaron fracciones activas de la cromatografía de Sepharose-heparina, se diluyeron tres veces con agua desionizada (MilliQ) para reducir la concentración de sal y se cargaron en una columna de ácido poliaspártico (PolyCAT A 4,6 x 100 mm, PolyLC, Columbia, MD) y se equilibró en fosfato N 17 mM, pH 6,8. Todos los tampones para esta etapa de purificación contenían etanol al 30% para mejorar la resolución de proteínas en esta columna. Después de la carga, la columna se lavó con tampón de equilibración y se eluyó con un gradiente lineal de sal de NaCl desde 0,3 M a 0,6 M en tampón de fosfato Na 17 mM, pH 6,8. La columna se cargó y se hizo pasar el flujo a 1ml/min, recogiéndose fracciones de 1 ml durante la elución del gradiente. Las fracciones se guardaron a 4ºC. Se prepararon múltiples columnas de Sepharose-heparina y de PolyCat A con el fin de obtener material suficiente para la próxima etapa de purificación. Un perfil de absorbancia típico de una columna de PolyCat A se muestra en la Figura 1. Se tomaron alícuotas de 10-25 \mul de cada fracción para el ensayo y el análisis del gel de SDS.

La actividad estimuladora de la fosforilación de tirosina hallada en las fracciones eluidas de la columna de PolyCat A, se concentró en la mayor parte en las fracciones correspondientes al pico C del cromatograma (concentración de sal de NaCl de aproximadamente 0,45 M). Estas fracciones se agruparon y ajustaron con ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) mediante adición de 0,1 volúmenes de TFA al 1%. Se añadieron dos volúmenes de agua desionizada para diluir el etanol y la salde la etapa anterior y la muestra se sometió a una purificación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna de fase inversa C4 (SynChropak RP-4, 4,6x100 mm) equilibrada con un tampón que consistía de TFA al 0,1% en agua con acetonitrilo al 15%. El procedimiento de HPLC se llevó a cabo a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después de cargar la muestra, la columna se re-equilibró con TFA 0,1%/acetonitrilo 15%. Se estableció un gradiente de acetonitrilo de modo que durante un periodo de 10 min se incrementó la concentración de acetonitrilo desde el 15 al 25% (1%/min). La columna continuó desarrollándose con un gradiente de 25 a 40% de acetonitrilo, durante 60 min (0,25%/min). Se recogieron fracciones de 1 ml, se taparon para evitar la evaporación y se guardaron a 4ºC. Se tomaron alícuotas de 10 a 50 \mul, se secaron completamente al vacío (SpeedVac) y se reconstituyeron con el tampón de ensayo (PBS con albúmina sérica bovina al 0,1%) para el ensayo de fosforilación de tirosina. Adicionalmente, se tomaron alícuotas de 10 a 50 \mul y se secaron como antes para analizar con una electroforesis en gel de SDS. Un perfil típico de HPLC se muestra en la Figura 2.

Un pico principal de actividad se halló en la fracción 17 (Figura 2B). Mediante el análisis del gel de SDS, se halló que la fracción 17 contenía una única especie de proteína principal que comigraba con el estándar de 45.000 D de peso molecular (Figs. 2C, 3). En otras preparaciones, la presencia de la proteína de 45.000 D que comigraba con la estimulación de la actividad de fosforilación de tirosinas en el ensayo de células MDA-MB-1 453. Las propiedades cromatográficas de la proteína de 45.000 D eran atípicas; al contrario que muchas proteínas en la preparación, la proteína de 45.000 D no se eluyó de la columna de fase inversa dentro de 2-3 fracciones. En su lugar, se eluyó en 5-10 fracciones. Ello es debido posiblemente a las extensas modificaciones post-traduccionales.

a. Determinación de la secuencia proteica

Las fracciones que contenían la proteína de 45.000 D se secaron al vacío para realizar su secencia aminoacídica. Las muestras se redisolvieron en ácido fórmico al 70% y se cargaron en un secuenciador de fase de vapor Applied Biosystems, Inc. Modelo 470 para la secuenciación N-terminal. No se obtuvo una secuencia N-terminal inteligible, lo que sugiere que el residuo N-terminal estaba bloqueado. Se obtuvieron resultados similares cuando la proteína se migró en primer lugar en un gel de SDS, se transfirió a una membrana ProBlott y se extrajo la banda de 45.000 D después de su localización con tinción rápida con Coomassie Brilliant Blue.

La secuencia aminoacídica interna se obtuvo sometiendo fracciones que contenían la proteína de 45.000 D a la digestión parcial utilizando bromuro de cianógeno, para cortar por los residuos metionina, Lysine-C para cortar por C-terminal de los residuos de lisina, o Asp-N para cortar por el N-terminal de los residuos de ácido aspártico. Después de la digestión, se secuenciaron las muestras directamente o se resolvieron en primer lugar por cromatografía de HPLC o en una columna Synchrom C4 (4000A, 2x100 mm) equilibrada con TFA al 0,1% y eluída con un gradiente de propanol-1 en TFA al 0.1%. Los picos de la migración cromatográfica se secaron al vacío antes de secuenciarlos.

Tras la secuenciación del péptido en el pico de número 15 (lisina C-15), se hallaron algunos aminoácidos en cada ciclo de la reacción. Después del análisis cuidadoso, fue evidente que la fracción contenía el mismo péptido básico con varios N-terminales distintos, lo que producía los múltiples aminoácidos en cada ciclo. Después de la circonvolución, se determinó la siguiente secuencia (SEC ID Nº:3) :

89

(Los residuos entre corchetes fueron inciertos, mientras que una X representa un ciclo en el que no fue posible identificar el aminoácido).

El rendimiento inicial fue de 8,5 pmol. Esta secuencia comprende 24 aminoácidos que no corresponden con ninguna proteína conocida previamente. Posteriormente, se halló que el residuo, 1 de la secuencia del cDNA correspondía a una Cys y el residuo 9 era correcto. Los aminoácidos desconocidos en las posiciones 15 y 22 fueron Cys y Cys, respectivamente.

La secuenciación de muestras después de las digestiones con bromuro de cianógeno y Asp-N, pero sin la separación por HPLC, se realizaron para corroborar la secuencia del cDNA. Las secuencias obtenidas se proporcionan en la Tabla 1 y se confirma la secuencia para la proteína de 45.000 D de la secuencia de cDNA. El extremo N-terminal de la proteína parece estar bloqueado con un grupo bloqueante desconocido. En una ocasión, la secuenciación directa de la banda de 45.000 D de una transferencia en PVDF puso de manifiesto esta secuencia con un rendimiento inicial muy pequeño (0,2 pmol)(SEC ID Nº:4):

XEXKE (G) (R) GK (G) K (G) KKKEXGXG (K )

(Los residuos que podrían no estar determinados se representan por una "X", mientras que los residuos provisionales están entre paréntesis). Esto corresponde a una secuencia de inicio en la serina en la posición 46 cerca del presente N-terminal de la secuencia del cDNA de HRG; lo que sugiere que el extremo N-terminal de la proteína de 45.000 D se halla en, o antes de este punto en la secuencia.

Ejemplo 3 Clonaje y secuenciación de la heregulina humana

El clonaje del DNA del ligando de p185^{HER2} se logró de la manera siguiente. Una porción de la secuencia aminoacídica del péptido de lisina C-15 se descodificó con el fin de diseñar una sonda para los cDNAs que codifican para el ligando de HRG-\alpha de 45KD. Los siguientes desoxioligonucleótidos ochos veces degenerados y de 39 residuos de largo correspondientes con la secuencia aminoacídica (SEC ID Nº:5) NH2-...AEKEKTFXVNGGE se sintetizó químicamene (SEC ID Nº:6):

3'GCT GAGAAGGAGAAGCCTTTCTGT/CGTGAAT/CGGA/CGAG 5'

El residuo aminoacídico desconocido designado X en la secuencia aminoacídica fue asignado como cisteína para el diseño de la sonda. Esta sonda fue fosforilada radioactivamente y utilizada para rastrear mediante hibridación a baja astringencia una librería de cDNA cebada con oligo dT y construida a partir del mRNA de las células MDA-MB-231 en \lambdagt10 (Huyng y col., 1984, En DNA cloning, Vol 1: A Practical Approach (D. Glover, ed) pap. 49-78. IRL Press, Oxford). Se identificaron dos clones positivos denominados \lambdagtl0her16 y \lambdagtl0her13. El análisis de secuencia del DNA demostró que ambos clones eran idénticos.

La secuencia del cDNA de 2010 pb de \lambdagt10her16 (Fig. 4) contiene un marco abierto de lectura de 669 aminoácidos que se inicia con alanina en las posiciones 3-5 y se finaliza con glutamina en las posiciones nucleotídicas 2007-2009. No se halló ningún codón de parada en la secuencia traducida; sin embargo, posteriores análisis de clones de \beta-heregulina indican que la metionina codificada en las posiciones 135-137 era la metionina iniciadora. La identidad de secuencia nucleotídica con la sonda se halla entre las bases 135-137, ambas inclusivas. La identidad entre aquellos aminoácidos que codifican la sonda y los flanqueantes de la misma con la secuencia aminoacídica determinada por el fragmento de lisina C-15 verifican que el clon aislado codifica por lo menos para el fragmento de lisina C-15 de la proteína de 45KD.

El análisis de hidropatía muestra que la existencia de una región aminoacídica fuertemente hidrofóbica incluyendo los residuos 237-309 (Fig. 4) indica que esta proteína contiene un dominio señal transmembrana o interno y por ello se ancla a la membrana de la célula.

La secuencia 669 aminoácidos codificada por la secuencia de DNA de 2010 pb contiene sitios potenciales para la glicosilación ligada a asparagina (Winzler, R., en Hormonal Proteins and Peptides, (Li, C.H. ed.) pp. 1-15, Academic Press, New York (1973)) en las posiciones de asparagina 164, 170, 208, 437 y 609. Un sitio de potencial de O-glicosilación (Marshall, R.D. (1974) Biochem. Soc. Symp, 40:17-26) se presenta en la región incluyendo una agrupación de residuos serina y treonina en las posiciones aminoacídicas 209-218. Tres sitios potenciales de adición de glicosaminación (Goldstein, L.A. y col., (1989) Cell 56:10E3-1072) se posicionan en los dipéptidos de serina-glicina en los aminoácidos 42-43, 64-65 y 151-152. La glicosilación se justifica probablemente las discrepancias entre el PM calculado de aproximadamente 26KD para la región extracelular NTD-GFD de la HRG y el PM observado de aproximadamente 45 KD para la HRG purificada.

Esta secuencia aminoacídica comparte varias características con la familia del factor de crecimiento epitelial (EGF) de factores de crecimiento unidos a transmembrana (Carpenter, G., y Cohens, S. (1979) Ann. Rev. Biochem. 48:193-216; Masenque, J. (1990) J. Biol. Chem. 265:21393-21396) incluyendo: 1) la existencia de una preforma de cada factor de crecimiento a partir de la cual se libera proteolíticamente la forma madura (Gray, A., Dull T.J., y ullrich, A. (1983) Nature 303, 722-725; Bell,G.I. y col., (1986) Nuc. Acid.Res., 14:8427-8446; Derynck,R. y col, (1984) Cell:287-297; 2) la conservación de 6 residuos de cisteína en posiciones características en una extensión de aproximadamente 40 aminoácidos (motivo estructural similar a EGF) (Savage, R.C., y col. (1973), J. biol. Chem., 248:7669-7672); las cisteínas 226, 234, 240, 254, 256 y 265 de la HRG-\alpha); y 3) la existencia de un dominio transmembrana próximo al extremo carboxi-terminal de la región homóloga de EGF (Fig. 4 y 6).

La alineación de las secuencias aminoacídicas en la región del motivo de EGF y del dominio transmembrana flanqueante de varias proteínas relacionadas con el EGF humano (Fig. 6) muestra que la región entre la primera y la sexta cisteína del motivo EGF de HRG es más similar (50%) al factor de crecimiento similar a EGF de unión a la heparian (HB-EGF) (Higashiyama, S. y col., (1991) Science 251:936-939). En esta misma región de HRG hay un 35% de identidad con la amfiregulina (AR) (Plowman, G.D. y col., (1990) Mol. Cell Biol. 10:1969-81), 32% de identidad con el factor \alpha de crecimiento transformante (TGF\alpha) (8), 27% de identidad con el EGF (Bell, G.I ycol., (1986) Nuc. Acid Res., 14:8427-8446); y 39% de identidad con el factor de crecimiento derivado de schwanomas (Kimura, H. y col., Nature, 348257-260, 1990). Las uniones disulfuro entre los residuos cisteína en el motivo EGF se han determinado para EGF (Savage, R.C. y col., (1973) J. Biol. Chem. 248:7669-7672). Estos disulfuros definen la estructura secundaria de esta región y delimitan tres bucles. Numerando las cisteínas empezando por 1 en el extremo N-terminal, el bucle 1 se define por las cisteínas 1 y 3; el bucle 2 por las cisteínas 2 y 4; y el bucle 3 por las cisteínas 5 y 6. Aunque la configuración exacta de disulfuros en la región para otros miembros de la familia no se ha determinado, la estricta conservación de las seis cisteínas, así como de otros residuos, p.ej., la glicina 238 y 262 y la arginina en la posición 264, indican que también deben tener la misma disposición. La HRG-\alpha y el EGF tienen ambos 13 aminoácidos en el bucle 1. La HB-EGF, la amfiregulina (AR) y el TGF-\alpha tienen 12 aminoácidos en el bucle 1. Cada miembro tiene 10 residuos en el bucle 2, excepto la HRG-\alpha que tiene 13. Los cinco, miembros tienen 8 residuos en el tercer bucle.

El EGF, la AR, el HB-EGF y el TGF-\alpha se sintetizan de nuevo como proteínas de anclaje a membrana gracias a sus dominios transmembrana. A continuación, se procesan las pre-proteínas para proporcionar moléculas activas maduras. En el caso del TGF-\alpha existen evidencias de que las preformas de las moléculas asociadas a membrana son también activas biológicamente (Brachmann, R., y col., (1989) Cell 56:691-700), una característica que también puede ser común para HRG-\alpha. El EGF se sintetiza como un pre-EGF unido a transmembrana de 1168 aminoácidos, que se corta por su extremo amino-terminal entre la arginina 970 y la asparagina 971 y un extremo carboxi-terminal entre la arginina 1023 y la histidina 1024 (Carpenter, G., y Cohen, S. (1g79) Ann. Rev. iochem. 48:193-216) para proporcionar la molécula madura de EGF de 53 aminoácidos, que contiene 3 bucles y una estructura con 3 enlaces disulfuro. El pre-AR de 252 aminoácidos se corta entre el ácido aspártico 100 y la serina 101 y entre la lisina 184 y la serina 185 para proporcionar una forma de AR madura de 84 aminoácidos y una forma de 78 aminoácidos que se genera por el corte NH_{2}-terminal entre la glutamina 106 y la valina 107 (Plowman, G.D. y co., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:1969-1981). El HB-EGF se procesa a partir de su producto de traducción primario de 208 aminoácidos para producir la forma de 84 aminoácidos propuesta mediante el corte entre la arginina 74 y un segundo sitio de aproximadamente 84 aminoácidos más allá en dirección carboxi-terminal (Higashiyama,S., y col., Klagsbum, M. (1991) Science 251:936-939). La pre-forma de 160 aminoácidos de TGF-\alpha se procesa una proteína madura de 50 aminoácidos mediante corte entre la alanina 39 y la valina 40 en un lado y corte cadena abajo entre la alanina 89 y la valina 90 (Derynck y col., (1984) Cell:38, 287-297). Para cada una de las moléculas anteriormente descritas, el procesado COOH-terminal tiene lugar en el área unida por la sexta cisteína del motivo EGF y el inicio del dominio transmembrana.

Los residuos entre la primera cisteína y la sexta de las HRGs son los más similares (45%) al factor de crecimiento similar al EGF de unión a la heparina (HB-EGF). En esta misma región existe un 35% de identidad de secuencia con la amfiregulina (AR), 32% con el TGF-\alpha y 27% con el EGF. Fuera del motivo del EGF, existe poca similitud entre las HRGs y otros miembros de la familia del EGF. El EGF, la AR, el HB-EGF y el TGF-\alpha se derivan todos de las pre-proteínas ancladas a membrana que se procesan por los dos extremos de la unidad estructural del EGF, produciendo proteínas maduras de 50-84 aminoácidos (16-19). Al igual que otros miembros de la familia de EGF, la HRG parece derivarse de una pre-forma unida a membrana, pero necesita únicamente de un único corte, C-terminal al agrupamiento de cisteínas, para producir la proteína madura.

La HRG puede ejercer su función biológica uniéndose a su receptor y provocando la transducción de una señal moduladora del crecimiento. Esto se puede lograr como una molécula soluble o quizás como su forma anclada a membrana, como a veces sucede con el TGF-\alpha (Brachmann, R. y col., (1989) Ce1156:691-700). A la inversa, o adicionalmente a la transducción de la señal de estimulación, la HRG puede internalizarse por una célula diana en donde puede a su vez interactuar con las regiones controladoras de otros genes reguladores y así liberar su mensaje al núcleo de la célula. La posibilidad de que la HRG medie parte de su efecto por un mecanismo, como el sugerido anteriormente, se basa en el hecho de que existe una señal potencial de localización nuclear (Roberts, Biochem-Biophys Acta (1989) 1008:263-280) en la región de alrededor de los tres residuos de lisina en las posiciones 58-60 (Fig. 4).

El aislamiento del cDNA de tamaño completo de la HRG-\alpha se logra utilizando la secuencia de DNA de la Fig. 4 para seleccionar las secuencias de cDNA adicionales de la librería de cDNAs construida a partir del mRNA de las células humanas MDA-MB-231. Los clones de cDNA de tamaño completo que codifican para HRG-\alpha se obtienen mediante identificación de los cDNAs que codifican para HRG-\alpha más largas en ambas direcciones de transcricpión 3' y 5' y luego se ayustan junto con un compuesto de cDNAs distintos. Para este propósito, se construyeron las librerías adicionales de cDNA requeridas. A continuación se describen los tres tipos de librerías de cDNA que se pueden construir: 1) Cebado con oligo-dT, se hibridan preferentemente los mRNAs con fragmentos de poliadenosinas; 2) cebado aleatorio utilizando desoxi-oligonucleótidos sintéticos cortos e inespecíficos para cualquier región del mRNA y 3) cebado específicamente utilizando desoxi-oligonucleótidos sintéticos cortos y específicos para una región deseada del mRNA. Los procedimientos para el aislamiento de dichas librerías de cDNA ya se han descrito con anterioridad.

Ejemplo 4 Detección de la expresión del mRNA de HRG-\alpha mediante análisis de Northern

Los análisis de transferencia de Northern del mRNA de las células MDA-MB-231 y SK-BR-3 en condiciones astringentes muestran por lo menos cinco bandas de hibridación en el mRNA de MDA-MB-231: una banda de 6,4 Kb predominante y otras bandas de 9, 4, 6, 9, 2, 8 y 1,8 Kb (Fig. 5). No se observó ninguna banda de hibridación con el mRNA de SK-BR-3 (esta línea celular reprime la p185^{HER2}). La existencia de estos mensajes múltiples en las células MDA-MB-231 indican el ayuste alternativo del gen, o diversos procesados del transcrito primario de los genes, o la existencia de un transcrito de otro mensajero homólogo. Uno de estos mensajeros puede codificar para una forma no unida a trans-membrana y soluble de la HRG-\alpha. Dichos mensajeros (Fig. 5) pueden utilizarse para producir el cDNA que codifica para las formas no unidas a trans-membrana y solubles de la HRG-\alpha.

Ejemplo 5 Estimulación del crecimiento celular por la heregulina-\alpha

Se analizaron diversas líneas de cáncer de mama distintas que expresaban el receptor de EGF o el receptor p185^{HER2} por su sensibilidad para inhibir el crecimiento mediante preparaciones de ligandos. Las líneas celulares analizadas fueron: SK-BR-3 (ATCC HTB 30), una línea celular que sobre-expresa p185^{HER2}; MDA-MB-468 (ATCC HTB 132), una línea que sobre-expresa el receptor EGF; y las células MCF-7 (ATCC HTB 22) que presentan un nivel moderado de expresión de p185^{HER2}. Estas células se mantuvieron en cultivo y se realizaron pasajes de acuerdo con las técnicas de cultivo celular establecidas. Las células crecieron en una mezcla 1:1 de medio DMEM y F-12 con suero bovino fetal al 10%. Para el ensayo, los cultivos madre se trataron con tripsina para desenganchar las células del frasco de cultivo y se repartieron a aproximadamente 20000 células/pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Durante el curso del ensayo de crecimiento, se mantuvieron en medio con suero bovino fetal al 1%. Las muestras test se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,22 \mu y luego se añadieron a pocillos por cuadruplicado y se incubaron durante 3-5 días a 37ºC. Al final del período de crecimiento, el medio se aspiró de cada pocillo y se trataron las células con Cristal violeta (Lewis, G. y col., Cancer Research, 347:5382-5385 [1987]). Se cuantificó la cantidad de absorbancia del cristal violeta que es proporcional al número de células en cada pocillo con un Lector de Placas. Se obtuvo la media de los valores de los pocillos replicados para cada muestra test. Los pocillos no tratados en cada placa sirvieron como controles. Los resultados se expresaron como porcentajes del crecimiento relativo a las células controles.

Se analizó la actividad del ligando HRG-\alpha purificado en el ensayo de crecimiento celular y los resultados se presentan en la Figura 7. A una concentración del ligando de aproximadamente 1 nM, ambas líneas celulares que expresan el receptor p185^{HER2} (SK-BR-3 y MCF-7) mostraron estimulación del crecimiento en relación con los controles, mientras que el tipo celular (MDA-M8-468), que expresa el receptor EGF, no mostró una respuesta apreciable. Estos resultados fueron consistentes con los obtenidos por los experimentos de I autofosforilación con diversas líneas celulares. Estos resultados establecen que el ligando HRG-\alpha es específico del receptor p185^{HER2} y no muestra una interacción apreciable con el receptor EGF a estas concentraciones.

La HRG no compite con los anticuerpos dirigidos contra el dominio extra-celular de p185^{HER2}, pero los anticuerpos monoclonales anti-p185^{HER2} 2C4 y 7F3 (anti-proliferativos) sí antagonizan la HRG.

Ejemplo 6 Clonaje y secuenciación de la Heregulina-\beta1

El cDNA de la HRG-\beta1 se aisló utilizando un fragmento de hibridación de la secuencia de DNA que codifica para la HRG-\alpha, para seleccionar secuencias adicionales de cDNA de la librería de cDNA construida a partir de células MDA-MB-231. Se identificó el clon \lambdaher.11.ldbl (heregulina-\beta1) en una librería de cDNA cebada con oligo-dT en \lambdagt10 y derivada de mRNAs poliA+ de MDA MB231. Las sondas de DNA sintéticas marcadas radioactivamente correspondientes con los extremos 3' y 5' de \lambdaher16 (HRG-\alpha), se utilizaron en una reacción de hibridación en condiciones de alta astringencia para aislar el clon \lambdaher11.1dbl. La secuencia nucleotídica del DNA de \lambdaher11.1dbl se muestra en la Figura 8 (SEC ID Nº:9). La secuencia aminoacídica de HRG-\beta1 es homóloga a HRG-\alpha desde su extremo amino-terminal en la posición Asp15 de la HRG-\alpha hasta el extremo 3' de HRG-\alpha, excepto en las posiciones descritas más adelante. Además, el DNA que codifica para la HRG-\beta1 se extiende 189 pb más allá que el \lambdaher16 en la dirección 3' y proporciona un codón de parada después de la Val675. En la posición nucleotídica 247 de \lambdaher11.1dbl, existe una G que sustituye a una A, dando como resultado la sustitución de Gln(Q) en lugar de Arg(R) en la HRG-\beta1, tal como se muestra en la segunda línea de la Figura 9 (SEC ID Nº:8 y SEC ID Nº:9).

En el área del motivo de EGF, existen diferencias adicionales entre la HRG-\alpha y la HRG-\beta1. Estas diferencias se muestran más adelante en una vista ampliada de la identidad se secuencia entre HRG-\alpha y HRG-\beta1 en la región del motivo de EGF o de GFD (dominio del factor de crecimiento). La secuencia específica mostrada corresponde con los aminoácidos 221-286 de la HRG-\alpha, que se muestran en la Figura 9. Los asteriscos indican residuos idénticos en la comparación siguiente (SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº:11).

90

Ejemplo 7 Expresión de la Heregulina en E. coli

La HRG-\alpha y la HRG-\beta1 se han expresado en E. coli utilizando las secuencias de DNA de las Figuras 4 y 8 que codifican para la heregulina bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina y la secuencia líder STII. En la caracterización inicial de la actividad de la heregulina, no se definieron con precisión la naturaleza de los extremos amino- y carboxi-terminal de la molécula de heregulina. Sin embargo, después de comparar las secuencias de la heregulina con las del EGF y TGF-\alpha, se esperaba que las formas acortadas de heregulina que se iniciaban alrededor de la Ser221 y que finalizaban alrededor de G1u277 de la Figura 4 tuvieran actividad biológica. Se identificaron y expresaron regiones análogas en todas las heregulinas. Una de las formas acortadas se construyó para tener un residuo Asp
N-terminal seguido de los residuos 221 a 177 de la HRG-\alpha. Debido a una mutación accidental de desplazamiento del marco de lectura después de la Glu277, la secuencia de la HRG-\alpha se prolongó 13 aminoácidos más en el extremo carboxi-terminal. Así, el extremo carboxi-terminal fue Glu277 de la HRG-\alpha seguido por la secuencia de 13 aminoácidos RPNARLPPGVFYC (SEC ID Nº.20).

La expresión de esta construcción se indujo mediante crecimiento de las células en medio sin fosfato durante aproximadamente 20 horas. La proteína recombinante se purificó recogiendo el sedimento celular y resuspendiéndolo en Tris 10 mM (pH 8), homogeneizándolo e incubándolo a 4ºC durante 40 min y centrifugándolo por último a 15 Krpm (Sorvall). El sobrenadante se concentró con una membrana de ultrafiltración de 30K (Amicon) y se aplicó el filtrado a una columna MonoQ equilibrada con Tris 10 mM, pH 8. Las fracciones del paso de fluido de la columna MonoQ se adustaron a TFA al 0,05% (ácido trifluoroacético) y se sometieron a una HPLC de fase inversa C4. La elución se produjo con un gradiente de acetonitrilo del 10-25% en TFA al 0,1%/H_{2}0. Se eliminó el solvente mediante liofilización y la proteína purificada se resuspendió con albúmina sérica bovina al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato. La Figura 10 muestra los resultados de la autofosforilación del receptor HER2 con las células MCF-7 en respuesta a la proteína purificada derivada de E.coli. Este material demostró una actividad biológica completa con un EC_{50} de 0,8 nM. El material purificado también se analizó en ensayos de crecimiento celular (Ejemplo 5), hallándose que era un potente estimulador del crecimiento celular.

El vector de expresión recombinante para la síntesis de HRG-\beta1 se construyó de forma similar a la HRG-\alpha. El vector de expresión contiene el DNA que codifica para los aminoácidos Ser207 a Leu273 de la HRG-\beta1 (Figura 4). Este DNA que codifica para la HRG-\beta1 se ayustó de forma recombinante en el vector de expresión cadena abajo del promotor de la fosfatasa alcalina y de la secuencia líder STII. Un residuo serina adicional se ayustó en el carboxi-terminal como resultado del proceso de construcción recombinante. El vector de expresión que codifica para la HRG-\beta1 se utilizó para transformar E. coli y se expresó en el medio desprovisto de fosfato. Las E. coli inducidas se sedimentaron mediante centrifugación, se resuspendieron en Tris 10 mM (pH 7,5) y se sonicaron. Los restos celulares se sedimentaron por centrifugación y el sobrenadante se filtró con un filtro estéril antes del ensayo. La expresión de la HRG-\beta1 se confirmó mediante la detección de la proteína con capacidad para estimular la autofosforilación del receptor HER2 en las células MCF-7.

Se construyó un vector de expresión parecido, tal como se describió para HRG-\beta1 (anteriormente) con un residuo tirosina C terminal en lugar del residuo serina. Este vector se transformó en E. coli y se expresó como antes. La purificación de esta proteína recombinante se logró tal como se describió para la HRG-\alpha. Los análisis de espectrometría de masas pusieron de manifiesto que la proteína purificada consistía de formas más cortas de lo esperado. La secuenciación aminoacídica mostró que la proteína tenía el residuo N-terminal deseado (Ser), pero por espectrometría de masas se mostró que se hallaba truncado en el extremo C-terminal. La mayoría de las proteínas (>80%) consistieron de una forma de 51 aminoácidos de largo con una metionina C terminal (Met271) (SEC ID Nº:9). También se detectó una pequeña cantidad de una forma más corta (49 residuos) truncada en Va1269. Sin embargo, ambas formas acortadas mostraron una actividad biológica completa en el ensayo de autofosforilación del receptor HER2.

Ejemplo 8 Aislamiento de variantes de heregulina \beta2 y \beta3

Se aislaron variantes de heregulina-\beta2 y \beta3 con el fin de obtener clones de cDNA que se extendieran más allá en la dirección 5'. Una librería de cDNA cebada específicamente se construyó en \lambdagt10 utilizando el cebador antisentido sintetizado químicamente 3'-CCTTCCCGTTCTTCTTCCTCGCTCC-5' (SEC ID Nº:21). Este cebador se localiza entre los nucleótidos 167-190 en la secuencia de \lambdaher16 (Figura 4). El aislamiento del clon \lambda5'her13 (no confundirse con el \lambdaher13) se logró hibridando una sonda sintética de DNA correspondiente con el extremo 5' de \lambdaher16 en condiciones de alta astringencia con la librería de cDNA cebada específicamente. La secuencia nucleotídica de \lambda5'her13 se muestra en la Figura 11 (SEC ID Nº:22). La secuencia nucleotídica de 496 pb de A5'her13 es homóloga a la secuencia de \lambdaherl6 entre los nucleótidos 309-496 de \lambda5'her13 y 3-190 de \lambdaher16. La secuencia de \lambda5'her13 prolonga el marco abierto de lectura de \lambdaher16 en 102 aminoácidos.

El aislamiento de las formas variantes de la heregulina-\beta se logró hibridando una librería de cDNA, derivada de los mRNAs MDA-MB-231 en \lambdagt10 y cebada con oligodT, con sondas sintéticas correspondientes con el extremo 5' de \lambda5'her13 y con la región similar a EGF rica en cisteinas de \lambdaher16. Se identificaron tres variantes de heregulina-\beta, se aislaron y se secuenciaron. Las identidades de secuencia aminoacídica entre todas las heregulinas se muestran en la Figura 15 (SEC ID Nº:26-30).

Los polipéptidos de HRG de \lambdaher76 (heregulina-\beta2) (SEC ID Nº:23), \lambdaher78 (heregulina-\beta3) (SEC ID Nº:24) y \lambdaher84 (similar a la heregulina-\beta2)(SEC ID Nº:25) se consideran variantes de \lambdaher11.1db1 (heregulina-\beta1) porque, aunque la secuencia aminoacídica deducida es idéntica entre la cisteína 1 y la cisteína 6 del motivo similar a EGF, su secuencia diverge antes del dominio transmembrana predicho, que probablemente se inicia con el aminoácido 248 en \lambdaher11.1dbl. Las secuencias nucleotídicas y las secuencias aminoacídicas deducidas de \lambdaher76, \lambdaher78 y \lambdaher84 se muestran en las figuras 12, 13 y 14.

Cada una de las variantes contiene un codón de parada a 148 pb 5' del primer codón de metionina en sus secuencias. En consecuencia, el codón ATG en la posición nucleotídica 135-137 de \lambdaher16 y el correspondiente ATG en los otros clones de heregulina pueden definirse como la metionina iniciadora (aminoácido 1). Mientras que todos los clones \lambdaher11.1dbl, \lambdaher76, \lambdaher84 y \lambdaher78 codifican para el aminoácido glutamina en la posición 38 (Figura 15), el clon her16 codifica para la arginina (Figura 4, posición 82).

La secuencia aminoacídica deducida de \lambdaher76 (heregulina-\beta1) pone de manifiesto un clon de tamaño completo que codifica para 637 aminoácidos. Éste comparte una secuencia aminoacídica deducida idéntica con el \lambdaher11.1dbl, excepto que se han delecionado los residuos correspondientes a los aminoácidos 232-239 de \lambdaher11.1dbl. La secuencia aminoacídica deducida de \lambdaher84 muestra que posee la misma secuencia aminoacídica que el \lambdaher76 desde la metionina iniciadora (aminoácido 1, Figura 15) al área semejante al EGF y el dominio transmembrana. Sin embargo, el \lambdaher84 acaba en un codón de parada temprano en la arginina 421 (numeración según el \lambdaher84). En consecuencia, la secuencia 3' no traducida diverge. La secuencia aminoacídica deducida de \lambdaher78 (heregulina-\beta3) es idéntica a las heregulinas \beta1 y -\beta2 hasta el aminoácido 230, a partir del cual la secuencia diverge durante 11 aminoácidos y luego acaba. Así, la heregulina-\beta3 no tiene región transmembrana. La secuencia 3' no traducida no es idéntica con la de otros clones.

Ejemplo 9 Expresión de las formas de heregulina-\beta

Con el fin de expresar las formas de la heregulina-\beta en las células de mamífero, las secuencias nucleotídicas de cDNA de tamaño completo de \lambdaher76 (heregulina-\beta2) o \lambdaher84 se subclonaron en el vector de expresión en mamíferos pRK5.1. Este vector es un derivado de pRK5 que contiene un promotor de citomegalovirus seguido por un intrón en 5', un poliengarce de clonaje y una señal de poliadenilación temprana de SV40. Se transfectaron las células de mono COS7, o, las humanas 293 y se analizó el medio condicionado en el ensayo de autofosforilación de p185^{HER2} en las células MCF-7. Una respuesta positiva confirmó la expresión de los cDNAs de \lambdaher76 (heregulina-\beta2) y \lambdaher84 (heregulina-\beta3).

Los sobrenadantes de un experimento de expresión transitoria a gran escala se concentraron en una membrana YM10 (Amicon)y se aplicaron a una columna de Sepharose-heparina tal como se describió en el Ejemplo 1. La actividad (ensayo de fosforilación de tirosinas) se detectó en el agrupado de elución con NaCl 0,6 M, purificándose a continuación en una columna de ácido poliaspártico, tal como se describió anteriormente para los análisis en gel de SDS y ensayos de actividad. Las fracciones activas de esta columna, que se purificaron muy intensamente contenían una banda proteica con un peso molecular de aproximadamente 45.000 D. Así, la proteína expresada tiene propiedades cromatográficas y estructurales que son similares a las de la forma nativa de la heregulina, originalmente aislada de las células MDA 231. Los experimentos de expresión transitoria a pequeña escala con las construcciones realizadas con el cDNA \lambdaher84 también presentaron niveles comparables de actividad en los sobrenadantes celulares de esta forma de variante. La expresión de la variante minus-transmembrana, heregulina\beta3, se halla actualmente en investigación.

Ejemplo 10

Los cDNAs de pro-HRG-\alpha y pro-HRG-\beta1 se ayustaron en los vectores de expresión derivados del virus de Epstein Barr que contenían un promotor de citomegalovirus. Las rHGRs se purificaron (esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 2) a partir del medio condicionado sin suero de las células CEN4 transfectadas de forma estable (células de riñón humanas 293 (ATCC Nº. 1573), que expresan el transactivador EBNA-1 del virus de Epstein Barr. En otros experimentos, las construcciones de expresión transitoria de tamaño completo pro-HRG-\alpha, -\beta1 y \beta-2 proporcionaron actividad de fosforilación de p185^{HER} en el medio condicionado de células de riñón humano COS7 transfectadas. Sin embargo, construcciones similares de pro-HRG-\beta3 de tamaño completo no presentaron actividad, lo que sugiere que el dominio hidrofóbico ausente en la pro-HRG-\beta3, pero presente en las otras pro-HRGs es necesario para la secreción de la proteína madura. Las versiones truncadas de la pro-HRG-\alpha (63 aminoácidos, serina 177 a tirosina 239) y la pro-HRG-\beta1 (68 aminoácidos, serina 177 a tirosina 241), codificando cada una para la unidad estructural de GFD y para las regiones flanqueantes inmediatas, también se expresaron en E. coli; las versiones truncadas homólogas de HRG-\beta3 se espera que se expresen como moléculas activas. Estas proteínas truncadas se purificaron en el espacio periplásmico y el caldo de cultivo de E. coli transformada con los vectores de expresión diseñados para secretar las proteínas recombinantes (C.N. Change, M.REy, B. Cochenr, H. Heyneker, G. Grya,Gene, 55:189 (1987)). Estas proteínas también estimularon la fosforilación de tirosinas de 5 p185^{HER2}, pero no de p107^{HER1}, indicando que la actividad biológica de HRG reside en el dominio semejante a EGF de la proteína y que las porciones de carbohidrato no son esenciales para la actividad en este ensayo. El NTD no inhibe ni suprime esta actividad.

Ejemplo 11

Se examinaron diversos tejidos humanos para la presencia de mRNA de HRG. Se hallaron transcritos en el tejido de mama, ovario, testículos, próstata, corazón, músculo esquelético, pulmón, hígado, riñón, glándulas salivares, intestino delgado y bazo, pero no así en tejido de estómago, páncreas,. útero o placenta. Mientras que muchos de estos tejidos expresan las mismas tres clases de transcritos que las células MDA-MB-231 (6,6 Kb, 2,5 Kb y 1,8 Kb), únicamente se observó el mensajero de 6,6 Kb en el corazón y el músculo esquelético. En el cerebro, se observó un único transcrito de 2,2 Kb y en los testículos se observó el transcrito de 6,6 Kb junto con otros de 2,2 Kb, 1,9 Kb y 1,5 Kb. El patrón de expresión específica de tejidos observado por las diferentes HRG difiere del de p185^{HER2}; por ejemplo, el hígado, bazo y cerebro adultos contienen HRG pero no transcritos de p185^{HER2}, mientras que el estómago, el páncreas, el útero y la placenta contienen transcritos de p185^{HER2} pero carecen del mRNA de HRG.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

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(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Estructura, Producción y Utilización de la Heregulina

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 30

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(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

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(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 460, Point San Bruno Blvd.

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO DE LECTURA POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE SOPORTE: disco de 5,25 pulgadas, 360 Kb

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NUMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA: 21 de Mayo de 1992

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NUMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA: 11 de Mayo de 1992

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NUMERO DE LA SOLICITUD:07/847743

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA: 6 de Marzo de 1992

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NUMERO DE LA SOLICITUD: 07/705256

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA: 24 de Mayo de 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NUMERO DE LA SOLICITUD: 07/765212

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA: 25 de Septiembre de 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NUMERO DE LA SOLICITUD:07/790801

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA: 8 de Noviembre de 1991

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Hensley, Max D.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NUMERO DE REGISTRO; 27.043

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NUMERO DE ACTA/REFERENCIA: 712P4

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415/266-1994

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TELEX: 910/371-7168

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CNCAAT

\hfill

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AATAAA

\hfill

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Xaa}

\sac{Phe Met Val Lys Asp Leu Xaa Asn Pro}\hfill 24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys}

\sac{Glu Xaa Gly Xaa Gly Lys}\hfill 21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Xaa Val Asn Gly Gly Glu}\hfill 13

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTGAGAAGG AGAAGACCTT CTGTCGTGAA TCGGACGGCG AG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2199 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:7:

2

3

300

4

400

5

500

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 669 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:8:

7

700

8

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 732 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:9:

10

11

12

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:10:

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:11:

15

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2010 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:12:

16

17

170

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 669 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:13:

19

20

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:14:

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 91 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:15:

23

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LJ SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 82 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:16:

25

\vskip0.666000\baselineskip

(2)INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 87 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:17:

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 87 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:18:

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:19:

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Pro Asn Ala Arg Leu Pro Gly Val Phe Tyr Cys}\hfill 13

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCTCGCTCCT TCTTCTTGCC CTTCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 496 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:22:

29

30

\newpage

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2490 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:23:

31

32

33

330

34

340

35

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1715 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:24:

36

37

38

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2431 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: N.A.

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:25:

39

40

41

42

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 625 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:26:

43

44

440

45

450

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 645 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:27:

46

47

470

48

480

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 637 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:28:

49

50

51

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 420 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:29:

52

53

530

2) INFORMACION PARA LA SEC ID Nº:30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 241 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº:30:

54

540

55

Claims (40)

1. Procedimiento que comprende la producción de una composición que incluye un polipéptido aislado, el cual comprende una secuencia de por lo menos 15 residuos aminoacidicos con una actividad efectora o antigénica in vivo de una heregulina (HRG) de las Figuras 4, 8, 12, 13 ó 15 y por lo menos una identidad de secuencia aminoacídica del 75% con éstas.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido aislado de heregulina tiene actividad antigénica.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad biológica de heregulina.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la heregulina es la HRG-GFD (dominio del factor de crecimiento).

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la heregulina es la heregulina-\alpha, -\beta1, -\beta2 o \beta3 tal como se muestra en la Figura 15, o los alelos o análogos animales de lo mismo.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la heregulina es la heregulina humana-\alpha-dominio del factor de crecimiento (GFD).

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la heregulina es la heregulina humana-\beta-GFD, heregulina-\beta2-GFD o la heregulina-\beta3-GFD.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la heregulina es una heregulina GFD (dominio del factor de crecimiento).

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, que además comprende un adyuvante inmune.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la heregulina-GFD comprende un polipéptido inmunogénico, que no es la heregulina.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la heregulina consiste en un dominio N-terminal (NTD) y un dominio del factor de crecimiento (GFD).

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la heregulina es un polipéptido transmembrana NTD-GFD.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la heregulina es la HRG-GFD.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la heregulina comprende un dominio citoplasmático.

16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la heregulina es la NTD-GFD y tiene una secuencia aminoacídica con por lo menos una identidad de secuencia del 85% con una secuencia nativa de heregulina-\alpha, -\beta1, -\beta3 NTD-GFD, tal como se muestra en la Figura 15, o los alelos o análogos animales de los mismos.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido de heregulina comprende una enzima.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la heregulina es la HRG-\alpha.

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la heregulina-\alpha tiene un aminoácido sustituido, delecionado o insertado adyacente a cualquiera de los residuos 1-23, 107-108, 121-123, 128-130 y 163-247, tal como se muestra en la Figura 15.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la heregulina es la HRG-\beta1.

21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la heregulina-\beta1 tiene un aminoácido sustituido, delecionado o insertado adyacente a cualquiera de los residuos 1-23, 107-108, 121-123, 128-130 y 163-252, tal como se muestra en la Figura 15.

22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la heregulina es la HRG-\beta2.

23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde la heregulina la HRG-\beta2 tiene un aminoácido sustituido, delecionado o insertado adyacente a cualquiera de los residuos 1-23, 107-108, 121-123, 128-130 y 163-244, tal como se muestra en la Figura 15.

24. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la heregulina es la HRG-\beta3.

25. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la heregulina es la HRG-\beta3 tiene un aminoácido sustituido, delecionado o insertado adyacente a cualquiera de los residuos 1-23, 107-108, 121-123, 128-130 y 163-241, tal como se muestra en la Figura 15.

26. Procedimiento que comprende la producción de un anticuerpo aislado que es capaz de unirse específicamente a un polipéptido de heregulina de acuerdo con la reivindicación 1.

27. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, que es capaz de unirse específicamente a una heregulina-\alpha, heregulina-\beta1, heregulina-\beta2, o heregulina-\beta3.

28. Procedimiento que comprende la producción de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido según la reivindicación 1.

29. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el ácido nucleico codifica para el polipéptido de heregulina-\alpha, heregulina-\beta1, heregulina-\beta2, o la heregulina-\beta3.

30. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el ácido nucleico codifica para una heregulina-GFD.

31. Procedimiento que comprende la producción de un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28.

32. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ácido nucleico codifica para una heregulina-GFD.

33. Procedimiento que comprende la producción de una célula huésped transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 31.

34. Procedimiento que comprende el cultivo de la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 33, para expresar la heregulina y recuperarla de la célula huésped.

35. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la heregulina es la heregulina-\alpha, la heregulina-\beta1, la heregulina-\beta2, o la heregulina-\beta3, tal como se muestra en la Figura 15 o los alelos o análogos animales.

36. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la heregulina es la heregulina-NTD-GFD.

37. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34, en donde la heregulina es la heregulina-GFD.

38. Procedimiento de determinación de la presencia de un ácido nucleico de heregulina, que comprende poner en contacto el ácido nucleico de la reivindicación 28 con un ácido nucleico de la muestra test y la determinación de que 14 hibridación ha tenido lugar.

39. Procedimiento de amplificación de una muestra test de ácido nucleico que comprende realizar una reacción en cadena de la polimerasa de ácido nucleico con el ácido nucleico de la reivindicación 28.

40. Procedimiento para la purificación de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la adsorción de la heregulina de una solución contaminada en una resina de Sepharose-heparina o una de intercambio catiónico.