JPH06505011A - ｅｒｂＢ−２受容体タンパク質に結合し且つ細胞性応答を誘導するリガンド成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｅｒｂＢ−２受容体タンパク質に結合し且つ細胞性応答を誘導するリガンド成長 因子発明の分野 本発明は、リガンド成長因子受容体相互作用およびこのような相互作用によって 誘導される細胞性応答の分野に関する。具体的には、６ｒｂＢ−２貫膜タンパク 質に対して独占的に結合することができるリガンドを記載する。本発明は、更に 、ｅｒｂＢ−２リガンド分子を認識し且つ結合しうる抗リガンド分子およびこの ようなリガンドのスクリーニング検定に関する。本発明は、更に、ｅｒｂＢ−２ リガンド、抗リガンド分子およびスクリーニング検定の使用に関する。更に、本 発明は、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを発現しうるクローン化遺伝子に関する 。

発明の背景 トランスフォーミング成長因子リガンドは、足場非依存性増殖検定において細胞 が形質転換された形態学をとり且つ漸進的に増殖するコロニーを形成することを 可能にする熱および酸に安定なポリペプチドの系列に属する（デラルコ（ＤｅＬ ａｒｃｏ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５：４０ ０１〜４００５　（１９７８）；モージス（Ｍｏｓｅｓ）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅ ｓ、、４工：２８４２〜２８４８　（１９８１）；オザンネ（Ｏｚａｎｎｅ）ら 、Ｊ、ｃｅｌｌ、Ｐｈ　５ｉｏ１．．１０旦：１６３〜１８０　（１９８０）； ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳ Ａ、ヱヱ：　３４９４〜３４９８　（１９８０））。表皮成長因子受容体（Ｅ　 Ｇ　Ｆ　Ｒ）並びにその生理学的リガンドである表皮成長因子（ＥＧＦ）および トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）は、多数の正常のおよび悪性の細 胞種の成長調節において顕著な役割を果たしている（カーペンタ−（Ｃａｒｐｅ ｎｔｅｒ）Ｇ、　、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　、旧ｏｃｈｅｍ、　、　５６：８８ １〜９１４　（１９８７））。

ＥＧＦ受容体システムが細胞の発癌性増殖において果たすことがある一つの役割 は、オートクリンに刺激された増殖に依る。細胞がＥＧＦＲを発現し且っＥＧＬ ａｎｃｅｔ、±：１３９８〜１４０２　（１９８７）、ペレズ（Ｐｅｒｅｚ）ら 、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、Ｔｒｅａｔ、、４：１８９〜１９３　（１９８４）） 且つ表皮成長因子受容体およびそのリガンドに関して提唱された類似のオートク リン増殖刺激経路は、更に、成長因子受容体を連想させる構造を有する癌遺伝子 にコードされた貫膜タンパク質の増大するリストで用いることができる。このリ ストとしては、部属遺伝子ｎｅｕおよびそのヒト同等物であるｅｒｂＢ−２また はＮａ　ｔｕｒｅ、３１９　：　２３０−２３４　（１９８６））；　ｃ−ｋｉ 　ｔ　（ヤードン（Ｙａｒｄｅｎ）　ら、ＥＭＢＯ，旦：　３４１〜３３５１　 （９１８７））；　ｒｏｓＰＮＡＳ、８４　：　６３７９〜６３８３　（１９８ ７））；　ｔ　ｒｋ　（７−チン・ザンカ（Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａ）　ら、 Ｎａｔｕｒｅ、３１９ニア４３〜７４８（１９８６））；およびｒｅｔ（タカハ シ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、７：１３７８〜１３８５　（１９８７））がある。部属 遺伝子ｅｒｂＢ−２およびｃ−ｋｉｔは、ＥＧＦＲと顕著に構造的相同性を示す 因子をコードする（ヤードンら、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５７： ４４３〜４７８　（１９８８）。ｅｒｂＢ−２およびその関連癌遺伝子ｎｅｕは ＥＧＦＲと同類であるが、これらのタンパク質は異なる。例えば、ＥＧＦおよび ＴＧＦαなどの既知のＥＧＦＲリガンドは、ｅｒｂＢ−２受容体に対して結合し ない。

（キング（Ｋ　ｉ　ｎ　ｇ）ら、ＥＭＢＯ，ヱ：１６４７　（１９８８）　；お よびスターン（Ｓｔｅｒｎ）　ら、ＥＭＢｏ、７　：１６４７　（１９８８）’ ）。

オートクリン増殖刺激経路によって悪性細胞がインビボで強力な腫瘍成長因子を 分泌することができる場合、成長因子リガンドはヒト絨毛性性腺刺激ホルモンま たはα−フェトプロティンに極めて類似の体液中で検出されるかもしれないし、 腫瘍マーカーおよび予後の変化として用いることができると考えられる。研究は 、ＴＧＦα活性を癌患者の体液中で検出することができるということおよびその 存在が患者の腫瘍の生物学に関する重要な情報を提供することがあるということ を示唆している（ストロンバーブ（Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ）ら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、３２　：　２４７〜２５９　（１９８６）；　トワージック （Ｔｗａｒｄｚｉｃｋ）　ら、Ｊ、Ｎａｔｌ、ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、旦旦 ニア９３−７９８　（１９８２）；シャーウィン（Ｓｈｅ　ｒｗｉ　ｎ）ら、Ｃ ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４３：４０３〜４０７　（１９８３））。

部属遺伝子６ｒｂＢ−２の増幅は、胸部、卵巣、胃、唾液腺中および肺の非小細 胞癌中で発見された（キングら、５ｃｉｅｎｃｅ、２２旦：９７４　（１９８５ ）；スラモン（Ｓ　Ｉ　ａｍｏｎ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４ニア０７　（１ ９８９）；ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、Ｌａｎｃｅｔ、ニー：７６５　（１９８ ６）；フクシゲ（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ）　ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、 旦：９５５（１９８６）；センバ（Ｓｅｍｂａ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２：６４９７　（１９８５）；ワイナー（Ｗｅ　＋ 　ｎ　ｅ　ｔ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、５旦：４２１　（１９９０））、 部属遺伝子ｅｒｂＢ−２の増幅および／または過剰発現は、胸部、卵巣および非 小細胞肺癌での不十分な予後と相互関係があることが分かった（スラモンら、５ ｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７　（１９８６）；スラモンら、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４４ニア０７　（１９８９）；ガーリン（Ｇｕｅｒｉｎ）ら、０ｎｃｏ　ｅｎ ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、旦：２１　（１９８８）　；ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら 、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４９：２０８７　（１９８９）；カーノ（Ｋｅｒｎ ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５１，５０：ｅｒｂＢ−２ 究は、ｅｒｂＢ−２貫膜受容体（ｐ　１８５　）が腫瘍の進行に重要な役割を有 することがあるということを強く示唆している（ディフィオールら、５ｃｉｅｎ ｃｅ、２３ヱ：１７８　（１９８７）；／’ジャク（Ｈｕｄｚｆａｋ）ら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４ニア１５９　（１９８７） ）ＥＧＦＲのリガンドは知られており、すなわち、ＥＧＦおよびＴＧＦαである が、貫膜タンパク質をコードする癌遺伝子、例えば、６ｒｂＢ　２、ｒｏｓ、ｍ ｅｔ等のリガンドはほとんど特性決定されていなかった。ループ（Ｌｕｐｅ）ら 、Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、２４９　：１５５２〜１５５５　（１９９０）は、ＥＧ ＦＲに対して結合し、ＥＧＦＲをリン酸化し、そしてコロニー形成を誘導する能 力がＴＧＦαと似ている３０キロダルトン（ＫＤａ）の糖タンパク質（ｇ　ｐ　 ３０）を同定した。ｇｐ３０のｐ１８５ｅｒｂＢ−２に対する直接結合は結合競 合実験によって確証されており、ｇｐ３０がｐ１８５ｅｒｂＢ−２のリガンドで あることを示唆した。例えば、ループらは、ＥＧＦＲおよびｅｒｂＢ−２受容体 双方を結合する３０ｋＤａのリガンドを同定し且つ特性決定した。

現在のところ、ｅｒｂＢ−２貫膜タンパク質（ｐ１８５ｅｒｂＢ−２）に対して 結合するがＥＧＦＲとは反応しないリガンドは知られていない。このようなリガ ンドはｐ、８５ｅｒｂＢ−２の機能を理解するのに重要であるし、しかも腫瘍形 成に対する強力な治療上のおよび診断上の標的であることができる。

発明の概要 本発明は、ｅｒｂＢ−２貫膜タンパク質（ｐ１８５ｅｒｂＢ−２）に対して特異 的に結合するが、類似の貫膜タンパク質、すなわち、表皮成長因子受容体を認識 しないし且つ結合しない７５キロダルトンの成長因子リガンドまたはその機能的 誘導体に関する。本発明の精製リガンドを得る方法も本発明に包含される。

本発明は、更に、本発明のｅｒｂＢ２リガンドに対して結合する抗リガンド分子 、例えば、抗体または抗体のフラグメントおよび遮断ペプチドに関する。こタン パク質を発現する細胞を検出するためのｅｒｂＢ−２リガンドの使用を含む。

本発明は、更に、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを発現しつる遺伝子をコードす る組換えＤＮＡ分子およびこのような組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞に関する 。

更に、本発明は、胸部、卵巣、胃、肺、前立腺、唾液腺および甲状腺癌を含むｅ ｒｂＢ−２貫膜タンパク質過剰発現に関係した多数の癌を治療する方法に関する 。

離された試料の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。ｅｒｂＢ−２ 細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をポリアクリルアミド−ヒドラジドセファロースビー ズ（シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ））に結合させた。ビーズを水冷１．０Ｍ　ＨＣＩ で十分に洗浄（５容量）した後、ビーズを０−　５Ｍ　ＮａＮ０２（１容量）で 活性化した。温度を０℃で１５〜２０分間保持した後、ビーズを半融ガラス漏斗 で濾過し、そして氷冷１．ＯＭ　ＨＣＩで洗浄した。ビーズを直ちに０．１Ｍス ルファミド酸、続いて氷冷水で洗浄し、そしてＯ５２Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３中に 、ｐＨ６゜０で再懸濁させた（１０容量）。セファロースビーズに対するＥＤＣ 結合の百分率は９０〜９８％であった。ゲル１．０ｍｌをエコノ（Ｅｃｏｎｏ） カラム（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ）、リッチモンド、ＣＡ）に加え且つ約１０ ０ビーズ容量のＰＢＳで洗浄した。カラムを充填した後、５Ｋ−Ｂｒ−３ヒト胸 部癌細胞由来の条件培地をビーズを介して重力によって流した（流速３０ｍ１／ 時）。次に、カラムを５容量のＰＢＳで洗浄し、そして１．０Ｍクエン酸を種々 のｐＨ（４゜０〜２．０）で用いて段階的に溶離した。通常、１０床容量の各ｐ ）ｌ溶液を用いた。全部の画分をＰＤＩＯカラム（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ ｃｔａ）、ピスカタウエイ、ＮＪ）で脱塩した後にそれらの生物活性を試験した 。投入培地および活性含有画分からのアリコートを１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分 析した後、銀染色した。列３は、５Ｋ−Ｂｒ−３細胞からの非濃縮条件培地を示 す。列２はｐＨ３，０での溶離を示し、列１はｐＨ３，５での溶離を示す。大き さはキロダルトンで示す。

図２は、ｇｐａｏまたはＰＩ５の存在下においてインキュベートした細胞からの リン酸化したタンパク質の検出を示す。対照培地はこれらのりガント分子を含ま なかった。

図２Ａ：ＭＤＡ　ＭＢ−４５３細胞を２４ウエルプレート（コスタ−（Ｃｏｓｔ ａｒ））中で９０％密集まで増殖させた。細胞を３７℃において２０ｍＭヘペス （Ｈｅｐｅｓ）含有対照培地、ｐＨ７，０（列１）、ｇｐａｏを５ｎｇ／ｍｌ含 む対照培地（ＰＩ３）　、ｐ　７５を４ｎｇ／ｍｌ含む対照培地伊１３）、ＰＩ ５を８ｎｇ／ｍｌ含む対照培地（ＪＪ４）およびＰＩ５を２ｎｇ／ｍｌ含む対照 培地（列５）で２０分間処理した。培地を除去し、そして細胞を、１％ＳＤＳ。

０．１％β−メルカプトエタノール、０．１５Ｍ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ６，８ ）、１０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ。

２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および２４ｍＭロイペ プチンを含む試料緩衝液１００μｌ中に溶解させた。９５℃で５分後にタンパク 質５０μｇを７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ中に加えた。次に、タンパク質を、ヘラ ファー（Ｈｏｅｆｆｅｒ）電気泳動移動装置（ヘラファー、ＴＥ２２型）を用い るトウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、ＰＮＡＳ、ヱ６．４３５０　（１９８７）の改 良法での電気泳動によるイムノブロッティング用のニトロセルロース膜（ヘーフ ァー・サイエンティフィック・インスッルメンツ（ＨｅｏｆｅｒＳｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア）に移した。

電気泳動移動は、２５ｍＭグリシン、１２９ｍＭ）リス（ｐＨ８，３）および２ ０％メタノールを含む緩衝液中１２５ｍＡにおいて室温で１時間実施した。移動 後に、フィルターを、０゜５％トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０含有トリス緩衝食 塩水中の５％ＢＳＡでブロックした。抗ホスホチロシン抗体（アマ−ジャム（Ａ ｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　）は５％ＢＳＡ（ジグｖＲＩＡ等級）中において固 定化タンパク質と反応した。免疫複合体はアルカリ性ホスファターゼに結合した ヤギ抗マウス抗体によって検出された。次に、プロットを、ＮＢＴおよびＢＣＩ Ｐ　（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））含有発色基質溶液と一緒にインキュベート した。

図２Ｂ：ＭＤＡ　ＭＢ−４５３細胞を２４ウエルプレート（コスタ−）中で８０ ％密集まで増殖させた。次に、細胞を、１０％Ｐ０４不含透析済みウシ胎児血清 （Ｆ　ＣＳ）および２ｍＭグルタミンを含むＰＯ４不含培地［ＰＯ４］不含ＭＥ Ｍ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）　）で２回で洗浄した。次に、細胞をＰＯ４不含培地 ３ｍｌ／ウェル中で２４時間増殖させた後、培地のカラムを１．０ｍｌ／ウェル に調整し、［３２Ｐｉ］　５ｍＣ１／ウェルを加え、そして細胞を６時間インキ ュベートした。細胞を３７℃において対照培地（列１）、ｇｐａｏを２．０ｎｇ ／ｍｌ含む対照培地（列２）、ＰＩ５を４．０ｎｇ／ｍｌ含む対照培地（列３） 、ＰＩ５を８．Ｏｎｇ／ｍｌ含む対照培地（列４）およびＰＩ５を２．０ｎｇ／ ｍｌ含む対照培地（列５）で２０分間処理した。インキュベーション後、培養皿 を水浴上に置き、そして細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭヘベス、１５０ｍＭ　Ｎ ａＣ１，１，０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ｘ−１００，１ｍＭ　ＥＧＴＡ、５ ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０２．ｍＭオルトヴアナジン酸ナトリウム 、１５ｍＭ　ＰＭＳＦ、ｏイペプチン２０μｇ／ｍｌおよび５ｍＭ　ＡＴＰ、最 終ｐＨ７，５）２００μｌ／ウエルと一緒にＰＢＳを用いて４℃で１０分間２回 洗浄した。細胞溶解液を１０，０００ｇにおいて４℃で１分間遠心分離した。上 澄みを正常ウサギ血清（ＮＲ８）１０μｌと一緒に４℃で１時間インキュベート し、非特異的複合体をプロティンＡ−セファロース（シグマ）を用いて透明にし た。上澄みを、ハジャックら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 。

旦４　：　７１５９　（１９８７）のｅｒｂＢ−２のＣ末端配列に対する多クロ ーン性抗体と一緒にインキュベートした。特異的複合体をプロティンＡ−セファ ロース（シグマ）で沈澱させ、そのペレットを溶解緩衝液で３回洗浄した後、ペ レットを試料緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ６，８）　、２％ＳＤＳ 、１０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルーおよび５％β−メルカ プトエタノール）５０μｍ中に再懸濁させた。９５℃で５分後に試料を７．５％ ５ＤＳ−ＰＡＧＥ中に加えた。

図２Ｃ：ＭＤＡ　ＭＢ−４６８細胞を２４ウエルプレート（コスタ−）中で８０ ％密集まで増殖させた。細胞を、１０％Ｐ０４不含透析済みウシ胎児血清（Ｆｅ ２）および２ｍＭグルタミンを含むＰＯ４不含培地［Ｐｏ４］不含ＭＥＭ　（ギ ブコ）で２回で洗浄した。次に、細胞をＰＯ４不含培地３ｍｌ／ウェル中で２４ 時間増殖させた。続いて、培地の容量を１．０ｍｌ／ウェルに調整し、［３２Ｐ ｉ］５ｍＣ１／ウェルを加え、そして細胞を６時間インキュベートした。

細胞を３７℃において対照培地（列２Ｌｐ７５を１０．Ｏｎｇ／ｍｌ含む対照培 地（列１）　、ＴＧＦａを４．０ｎｇ／ｍｌ含む対照培地（列３）、ＥＧＦを４ ゜０ｎｇ／ｍ　１含む対照培地（列４）およびｇｐａｏを２．０ｎｇ／ｍｌ含む 対照培地（列５）で２０分間処理した。インキュベーション後、培養皿を水浴上 に置き、そして細胞を４℃においてＰＢＳで２回洗浄した。次に、細胞を溶解緩 衝液（５０ｍＭヘペス、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１，０％トリトンｘ−１００， １ｍＭ　ＥＧＴＡ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．２ｍＭオルト ヴアナジン酸ナトリウム、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ、ロイペプチン２０μｇ／ｍｌ および５ｍＭ　ＡＴＰ、最終ｐＨ７，５）２００μｌ／ウエルを用いて４℃で１ ０分間溶解させた。細胞溶解液を１０，０００ｇにおいて４℃で１分間遠心分離 した。

上澄みを正常ウサギ血清（ＮＲ８）１０μｌと一緒に４℃で１時間インキュベー トし、非特異的複合体をプロティンＡ−セファロース（シグマ）を用いて透明に した。上澄みをＥＧＦＲに対する多クローン性抗体（オンコジーン・サイエンス （Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）、Ｎ、Ｙ）と−緒にインキュベートした 。

特異的複合体をプロティンＡ−セファロース（シグマ）で沈澱させ、そのペレッ トを溶解緩衝液で３回洗浄した後、ペレットを試料緩衝液（５０ｍＭトリス−Ｈ Ｃｌ　（ｐＨ６，８）　、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１％ブロモフ ェノールブルーおよび５％β−メルカプトエタノール）５０μｍ中に再懸濁させ た。

９５℃で５分後に試料を７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ中に加えた。

図３は、ヒト胸部癌細胞の増殖に対するＰＩ５の効果を図示する。ＳＫ−Ｂｒ− ３およびＭＤＡ４６８細胞を２４ウエルプレート中の５％ＦＣ８を補足した■Ｍ ＥＭ　（パイオフルーズ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ））中にいれた。２４時間後に培 地を除去し、そしてフィブロネクチン、トランスフェリン、ヘペス、グルタミン 、微量元素およびＢＳＡ　（ＳＦＭ＋）または、精製ｐ７５　（４ｎｇ／ｍｌ） 　、精製ｇｐ３０　（２，Ｏｎｇ／ｍｌ）若しくはＥＧＦ　（１０ｎｇ／ｍｌ） を追加したＳＦＭ＋を含む対照の血清不含培地で置き換えた。細胞を対照の密集 の９０％まで増殖させ且つ計数した。各群を三重反復で検定した。結果を対照に 相対する増殖として示す。実験を３回実施し、その結果は再現性があった。

図４は、ヒト胸部癌細胞の軟質寒天コロニー形成に対するｐ７５の効果を示す。

５Ｋ−Ｂｒ−３細胞を３５ｍｍ組織培養皿（コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ）に 入れた。０．６％寒天および１０％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含むＩＭＥＭ（ パイオフルーズ）１．０ｍｌの下部層を調製した。下部層を凝固させた後、細胞 １ｏ、ｏｏｏ個／皿を、１０％ＦＣ８単独並びに増加濃度のｐ７５（０〜１３２ ｐＭ）およびｇｐａｏ　（０〜３３０ｐＭ）を含む０．４％バクト（Ｂａ　ｃ　 ｔ　ｏ）寒天（ディフコ（Ｄｉｒｃｏ）、デトロイト、ＭＩ）の細胞含有上部層 ０．８ｍｌ中に加えた。試料全部を三重反復で実験し且つ実験は最適クローニン グ効率に関して試験されたＦＣ８中で実施した。細胞を５％ＣＯ２中において３ ７℃で７〜９日間インキュベートした。６０μｍより大きいコロニーをコロニー 計数器で計数した。実験を３回実施し、その結果は再現性があった。

図５は、ヒト胸部癌細胞の軟質寒天コロニー形成に対する可溶性ｐ１８５ｅｒｂ ８−２細胞外ドメインの効果を示す。５Ｋ−Ｂｒ−３細胞を３５ｍｍ組織培養皿 （コスタ−、ケンブリッジ、ＭＡ）に入れた。０．６％寒天および１０％ＦＣ３ を含むＩＭＥＭ（パイオフルーズ）１．０ｍｌの下部層を調製した後、下部層を 凝固させた。指示細胞である細胞ｉｏ、ｏｏｏ個／皿を、試料、０．４％バクト 寒天（ディフコ、デトロイト、ＭＩ）および１０％ＦＣ８を含む上部層０．８ｍ ｌ中に加えた。試料はｐ７５　（０，１５ｎｇ／ｍｌ）、可溶性組換えＥＣＤ（ １２μｇ／ｍｌ）およびＥＤＣ存在下のｐ７５であった。試料全部を三重反復で 実験し且つ実験は最適クローニング効率に関して試験されたＦＣ８中で実施した 。細胞を５％ＣＯ２中において３７℃で７〜９日間インキュベートした。６０μ ｍより大きいコロニーをコロニー計数器で計数した。実験を３回実施し、その結 果は再現性があった。

好ましい実施態様の説明 以下の説明において、リガンド−成長因子受容体相互作用および組換えＤＮＡ技 術の分野で用いられる多数の用語を広範囲に用いる。このような用語を与えられ る範囲を含む明細書および請求の範囲をより明確に且つ一貫して理解させるため に、以下の定義を提供する。

突然変異体 本明細書中で用いられるように、「突然変異体」という用語は、タンパク質のア ミノ酸配列が、いわば、野生種タンパク質中のまたは由来の１個またはそれ以上 のアミノ酸の付加、置換、挿入または欠失の結果として変更されたｅｒｂＢ−２ リガンドの誘導体を含む意味である。ｅｒｂＢ−２リガンドの「生物学的活性突 然変異体」とは、リガンド、特に、受容体結合活性によって保持された全部のま たはある種の生物学的活性を保持するリガンドの突然変異体を意味する。突然変 異は、更に、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列内の１個またはそれ以上のヌクレオチドの 付加、置換、挿入または欠失によるその何等かの配列の変更を示す一般的な用語 として用いることができる。

機能的誘導体 本発明のｅｒｂＢ−２リガンドの「機能的誘導体」とは、誘導体が誘導されるリ ガンドに実質的に類似の生物学的活性を有するリガンドを意味する。「実質的に 類似の」とは、定性的には類似しているが、正常のｅｒｂＢ−２リガンドが有す る活性とは定量的に異なる生物学的活性を意味する。「定性的に類似の生物学的 活性」という表現により、天然のｅｒｂＢ−２リガンドの生物学的活性を多少は 、ｅｒｂＢ−２リガンドの生物学的に活性の「突然変異体」、「フラグメント」 および「変異体」を含むことを意味する。

フラグメント ｅｒｂＢ−２リガンドの「フラグメント」とは、野生種リガンドの完全なアミノ 酸配列の一部分を有するタンパク質分子を示す意味である。リガンドの「生物学 的に活性のフラグメント」とは、リガンドが有する全部またはある種の生物学的 活性を保持するｅｒｂＢ−２リガンドのフラグメントを意味する。例えば、フラ グメントがある種のまたは全部の受容体結合活性を保持する場合、このようなフ ラグメントをｅｒｂＢ−２リガンドの生物学的に活性のフラグメントであるとい う。

衆！体 ｅｒｂＢ−２リガンドの「変異体」は、本来のｅｒｂＢ−２リガンドかまたはそ のフラグメントと構造および生物学的活性が実質的に類似しているが、このよう な分子またはそのフラグメントと同一でないリガンドを示す意味である。変異体 は必ずしも本来の分子由来ではないが、類似のまたは異なる細胞系のいずれの変 化によっても得ることができる。「変異体」という用語は、遺伝的対立遺伝子を 含むことも意味する。したがって、２個のｅｒｂＢ−２リガンドが類似の構造お よび生物学的活性を有するならば、たとえその一方のリガンドの組成または二次 、三次若しくは四次構造がもう一方で見出されるものと同一でないとしても、そ れらはその用語が本明細書中で用いられるような変異体と考えられる。

ｅｒｂＢ−２リガンド ｒｅｒｂＢ−２リガンドｊという用語は、ｅｒｂＢ−２貫膜タンパク質（ｐ１８ ５ｅｒｂＢ−２）に対して結合しうるが、表皮成長因子受容体に対して結合しな いタンパク質分子を示す意味である。本明細書中で用いられるように、ｒｅｒｂ Ｂ−２リガンド」という用語は、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドの機能的誘導体 を全て含むことを意味する。本発明のｅｒｂＢ−２リガンドは、ｃ−ｋｉ　ｔＳ ｎｅｕ、ｒＯ８等のような他の部属遺伝子でコードされた貫層タンパク質を結合 することができ、したがって、ｒｅｒｂＢ−２リガンド」という用語は、ｅｒｂ Ｂ−２貫層受容体を結合するだけのタンパク質分子に制限されない。本発明のｅ ｒｂＢ−２リガンド分子の結合はこのような他の部属遺伝子を発現する細胞の細 胞性応答を誘導することができ、したがって、これらの他の部属遺伝子を発現す る悪性の細胞を有する患者を治療し且つ診断するのに用いることができる。

Ａ、ｅｒｂＢ−２貫膜タンパク質のリガンドループら、Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、２ ４９　：　１５５２〜１５５５　（１９９０）は、ＭＤＡ　ＭＢ−２３１ヒト胸 部癌細胞によって分泌された３０キロダルトン（ｋＤａ）の成長因子の同定およ び精製を報告した。この糖タンパク質（ｇｐ３０）を逐次低親和性ヘパリン−セ ファロースクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによって見掛上均 一に精製した。

糖タンパク質ｇｐａｏは表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して結合し且っｅ ｒｂＢ−２ ｂＢ−２を過剰発現する細胞中のｐ１８５　のリン酸化を刺激した。

意外にも、ｇｐ３０は、ｅｒｂＢ−２を過剰発現する全ての細胞において細胞ｇ ｐａｏリガンドが４Ｄ５結合部位を認識し且つそれに対して結合したことを示し た。

ｅｒｂＢ−２ ｐ１８５　として既知の１８５ｋｄ貫膜糖タンパク質は、成長因子受容体として 機能し且つ部属遺伝子によってコードされている貫層タンパク質であると考えら れる。ｅｒｂＢ−２発現は多数の腺癌において増幅さね、特に、ヒト胸部癌の約 ３０％において増幅または過剰発現される（マグリー（Ｍａ　ｇｕ　ｒ　ｉ　ｅ ）　ら、Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　０ｎｃｏｌｏ　、１６（２）：１４８〜１５ ５　（１９８９））。ｅｒｂＢ−２を過剰発現する癌細胞を有する患者は、ｅｒ ｂＢ−２過剰発現を示さない癌患者よりもはるかに無疾患期間が短く且つ全体的 に生存者は少ないことが知られている。したがって、ｅｒｂＢ−２過剰発現を示 す悪性疾患を、示さないものと区別することは重要である。したがって、ｅｒｂ Ｂ−２に関係した癌の診断は、特定の種類の癌を治療するのに有効な療法を予め 選択する方法を臨床家に提供する。

ｅｒｂＢ−２ 本発明の６ｒｂＢ−２リガンドは、ｐ１８５　に対する特異性ゆえに極めて重要 である。意外にも、ｅｒｂＢ−２リガンドは、ｐ１８５ｅｒｂＢ−２に極めて類 似の受容体であるＥＧＦＲを認識しないしまたはそれに対して結合しない。この 特性は、ｅｒｂＢ−２を過剰発現する癌細胞に対して特異的に向けられた診断薬 および治療薬の設計を可能にする。

本発明のｅｒｂＢ−２リガンドは７５キロダルトンのタンパク質（ｐ　７５）で 検定において、ｅｒｂＢ−２を過剰発現する細胞系の細胞増殖およびコロニー形 成はｐ７５によって阻害された。更に、ｐ７５は、可溶性ｅｒｂＢ−２細胞外ド メインの抗増殖性効果を逆行させることがある。

Ｂ、ｅｒｂＢ−２リガンドの同定 本発明のｅｒｂＢ−２リガンドの同定は、放射受容体検定を用いて多数の細胞か ら条件培地をスクリーンすることによって達成することができる。いずれの細胞 種も、リガンド生産性細胞を単離するスクリーンにおいて用いることができる。

して結合する標識抗体を用いる。ｅｒｂＢ−２受容体細胞外ドメインに対して向 けられた抗体は周知である。本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを同定するのに好ま しい抗体は４Ｄ５（ハジャクら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、旦：１１６５ （１９８９））およびＭＯＩ９３（カスプルジク（Ｋａｓｐｒｚｙｋ）ら、Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｃ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　（１９ ９０））である。４Ｄ５およびＭＯ１９３はそれぞわ、ジエネンテク（Ｇｅｎｅ ｎｔｅｃｈ）、ＣＡおよびモレキュラー・オンコロジー〇インコーポレーテツド （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、）、ＭＤ＃Ｘら入手するこ とができる。

細胞外ドメインの同一の結合部位を認識し且つそれに対して結合する。した力（ つて、これらの抗体を競合的結合検定において用いて、本発明のｅｒｂＢ−２リ ガンドを生産する細胞系を同定することができる。当業者は、細胞外ドメイン上 の種々の結合部位またはエピトープを認識する他の抗体を周知の技法によって生 じて、従来記載されなかった多数のリガンドを同定することができるということ を理解するであろう。したがって　、１８　ｓ　ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ　２の細胞外ド メイン上の異なる位置に結合する種々の抗体の使用は、独特のリガンドの単離を 提供することができる。

本発明の検定において、条件培地を一般的に用いられる方法にしたがって調製す る。例えば、細胞培養による培地から細胞を除去し且つアミコン（Ａｍｉｃｏｎ ）限外濾過装置で１００倍に濃縮する（ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、、旦旦：　３１７９〜３１８３　（１９８９ ）；ループら、（ＪＢＣ公報に提出された）；およびベイツ（Ｂａｔｅｓ）リガ ンドを生産する細胞を検出する方法を提供する。この方法において、条件培地中 のリガンドは、ｐ１８５°ｒｂＢ−２タンパク質に対する結合に関して標識抗体 と競合する。６ｒｂＢ−２に結合した標識の量を監視してリガンドの存在を決定 する。例えば、ｅｒｂＢ−２受容体に結合した標識の減少はリガンドの存在を示 す。

Ｃ，ｅｒｂＢ−２リガンドの精製 本発明により、リガンドを生産する細胞から６ｒｂＢ−２リガンドを単離するこ とができる。リガンドを生産する細胞はいずれも、本発明において記載した方法 にしたがって出発物質として用いることができる。細胞種は、典型的に、ｅｒｂ Ｂ−２受容体を過剰発現する細胞である。好ましくは、５Ｋ−Ｂｒ−３を用いて 本発明の７５ｋＤａのｅｒｂＢ−２リガンドを単離する。この菌株は当業者に周 知であり且つアメリカンφタイプ・カルチャー・コレクシ９ン（Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、ロックビル、メリー ランド州、ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ受託番号、ＨＴＢ　３０）に寄託されている。し かしながら、ｅｒｂＢ−２リガンドまたはその機能的誘導体を含むことが分かっ ている細胞はいずれも、細胞および／またはその培地からこのような因子を単離 し且つ精製するのに用いることができる。本発明のリガンド番よ、例えば、組換 え体リガンドを発現する宿主細胞から単離することができる。

本発明のリガンドは細胞から排出されると考えられる。したがって、１ノガンド を培地から精製するのが一般的である。しかしながら、細胞抽出物は、本発明の リガンドを精製するための源として役立つことができる。

典型的には、所望のリガンドを生産する細胞を、細胞増殖を導く培地中で増殖さ せる。細胞を除去し且つ所望のリガンドを培地から精製する。

本発明のリガンドは、一般的に用いられる既知のタンｌ＜り質精製技術、例え（ ｉ、抽出、沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ フィー、ゲル濾過等を用いることによって培地または細胞から抽出し且つ精製す ることができる。本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを単離する最も好まし０方法【 よ、カラムマトリックスに対して結合したｅｒｂＢ−２受容体細胞外ドメインを 用０るアフィニティークロマトグラフィーによる。

当業者に明らかであるように、タンパク質を生産する天然の宿主由来の細胞外パ ー（Ａｌｐｅｒ）　ら、Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ分は、カラムマトリッ クスに対して結合したそのタンノくり質力（細胞外ドメインの所望のｅｒｂＢ− ２リガンド結合部位を含むという条件で、本発明によるｅｒｂＢ−２リガンドを 精製するのに用いることができることは理解される。ヤマモトＢ−２受容体遺伝 子を含むプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロッ クビル、ＭＤ　（ＡＴＣＣ受託番号５７５８４）から入手することができる。

アフィニティークロマトグラフィー精製法を用いて、ｅｒｂＢ−２リガンドは細 胞培地から実質的に精製された。本明細書中で用いられる「実質的に純粋の」ま たは「実質的に精製された」という用語は、天然の状態でのタンパク質に通常関 係したいずれの化合物も実質的に含まない、すなわち、混入するタンパク質およ び炭水化物成分を実質的に含まないリガンドを記載する意味である。更に、その 用語は、当業者によって用いられる１種類またはそれ以上の純粋性または均一性 によって均一である本発明のリガンドを記載する意味である。例えば、実質的に 純粋なリガンドタンパク質は、以下、すなわち、分子量、クロマトグラフィー技 術およびこの種の他のパラメーターなどのパラメーターに関する標準実験偏差の 範囲内の定数および再現性を示す。しかしながら、その用語は、ｅｒｂＢ−２リ ガンドと他の化合物との人工または合成混合物を除外する意味ではない。更に、 その用語は、酵素の生物学的活性の妨げとならないし、そして例えば、不完全な 精製によって存在することがある少量の不純物の存在を除外する意味ではない。

Ｄ、ｅｒｂＢ−２リガンド遺伝子のクローニング種々の方法のいずれも、本発明 の６ｒｂＢ−２リガンド遺伝子をクローン化するのに用いることができる。この ような方法の一つは、リガンド遺伝子を有するインサートの存在に関して（ｅｒ ｂＢ−２リガンドを発現する細胞由来の）ＤＮＡインサートのシャトルベクター ライブラリーを分析することを必要とする。このような分析は、細胞をベクター でトランスフェクトした後にリガンド結合活性の発現を検定することによって実 施することができる。これらの遺伝子をクローン化するのに好ましい方法は、ｅ ｒｂＢ−２リガンドタンパク質のアミノ酸配列を決定することを必要とする。こ の仕事を達成するために、所望のリガンドタンパク質を自動シークエンサーによ って精製し且つ分析することができる。或いは、各タンパク質を臭化シアンまた はプロテアーゼ、例えば、パパイン、キモトリプシン若しくはトリプシンを用い るようにフラグメント化することができる（オーイケ（Ｏｉｋｅ）、Ｙ、ら、Ｊ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：９７５１〜９７５８　（１９８２）；リュ　（ Ｌｉｕ）、Ｃ，ら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔ。

質の完全なアミノ酸配列を決定することは可能であるが、これらの分子のペプチ ドフラグメントの配列を決定することが好ましい。

１個またはそれ以上の適当なペプチドフラグメントの配列が決定されたら、それ らをコードすることができるＤＮＡ配列を検討する。遺伝コードは縮重するので 、２個以上のコドンを用いて特定のアミノ酸をコードすることができる（ワト’ ／：／　（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｊ、Ｄ、、Ｉｎ二Ｍｏ１ｅｃｕｌａｔ二」ユ」ユｆ ｆ１ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第３版、　Ｗ、　Ａ、ベンジャミン・インコーホ レーテッド（Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ、）、メンロー拳パーク、ＣＡ　（１９ ７７）。

３５６〜３５７頁）。ペプチドフラグメントを分析して、最低の縮重を有するオ リゴヌクレオチドによってコードされることができるアミノ酸の配列を確認する 。

これは、好ましくは、単一コドンのみによってコードされるアミノ酸を有する配 列を確認することによって達成される。時々、このようなアミノ酸配列を単一の オリゴヌクレオチドのみによってコードすることができるが、アミノ酸配列を類 似のオリゴヌクレオチドのいずれのセットによってもコードすることができるこ とが多い。重要なことに、セットのメンバー全部が、ペプチドフラグメントをコ ードすることができるオリゴヌクレオチドを含み、したがって、ペプチドフラグ メントをコードする遺伝子と同一のヌクレオチド配列を潜在的に含むが、セット の一方のメンバーのみがこの遺伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配 列を有する。このメンバーはセット内に存在し且つセットのもう一方のメンバー の存在下でさえもＤＮＡにハイブリッド形成することができるので、ペプチドを コードする遺伝子をクローン化するのに単一のオリゴヌクレオチドを用いる同じ 方法でオリゴヌクレオチドの非分割セットを用いることは可能である。

上記に記載したのと極めて類似の方法において、ペプチドフラグメントをコード することができるオリゴヌクレオチド配列または配列のセットに対して相補的で あるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチド のセット）を用いることができる。

所望の６ｒｂＢ−２リガンド遺伝子のフラグメントをコードすることができる（ またはこのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットに対し て相補的である適当なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを 吐記に記載した方法を用いて）確認し、合成し、そして当該技術分野において周 知の手段により、ＤＮＡまたは遺伝子源に応じたｃＤＮＡ調製試料に対してハイ ブリッド形成する。典型的には、真核性遺伝子の単離はｃＤＮＡライブラリーを スクリーンすることによって行なゎゎ、同時にＤＮＡライブラリーを用いて原核 性遺伝子を単離する。核酸ハイブリダイモーションの技術は、本明細書中にスプ リンルハーバー（Ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ＮＹ（１９８Ａｐｐ ｒｏａｃｈ、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、　ワシントン、ＤＣ（１９８５）に 開示されている。用いられたＤＮＡまたはｃＤＮＡ源は、所望の配列に富んでい るのが好ましい。この種の富裕は、ｅｒｂＢ−２リガンド合成を誘導する条件下 で培養された細胞からＲＮＡを抽出することによって得られたｃＤＮＡから最も 容易に得ることができる。

上記に記載したようなまたは類似の技術は、ヒトトランスフォーミング成長因子 −α（プリンク（Ｄｅｒｙｎｃ）ら、Ｃｅｌ　ｌ　３８　（１）：２８７〜２９ ８（１９８４）’）　、＝ヮトリ表皮成長因子受容体（ラクス（Ｌ　ａ　ｘ）ら 、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、８　（５）：１９７０〜１９７８　（１９８８））、ヒト アルデヒドデヒドロゲナーゼ（シュ　（Ｈｓｕ）、Ｌ、Ｃ，ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　旦２　：　３７７１〜３７７５　（１９８５））　 、フィブロネクチン（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）、Ｓ、ら、Ｅｕｒ、Ｍｏ１．Ｂｉ ｏｌ。

Ｏｒｇａｎ、Ｊ、４：２５１９〜２５２４　（１９８５））　、ヒトエストロゲ ン受容体遺伝子（ワルター（Ｗａｉｔｅｒ）、Ｐ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦２　：　７８８９〜７８９３　（１９８５））　 、組織型プラミノーゲン活性化因子（ペニヵ（Ｐｅｎｎｉ　ｃａ）、Ｄ、ら、Ｎ ａｔｕｒｅ旦旦１：２１４〜２２１　（１９８３））およびヒト末期胎盤アルカ リ性ホスフのクローニングをうまく可能にした。

本発明のｅｒｂＢ−２リガンド遺伝子をクローニングする別の方法において、発 現ベクターのライブラリーは、このようなリガンドを発現ベクター中に発現しつ る細胞からＤＮＡまたはｃＤＮＡをクローン化することによって製造される。

次に、抗リガンド分子（抗体または遮断ペプチド）に対して結合し、しかも本発 明のｅｒｂＢ−２リガンドタンパク質またはそのフラグメント若しくは変異体と 同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができるヌクレオチ ド配列を有するタンパク質を発現することができるメンバーに関してライブラリ ーをスクリーンする。

Ｅ、ｅｒｂＢ−２リガンド遺伝子の発現ｅｒｂＢ−２リガンド遺伝子またはこの 遺伝子の少なくとも一部分を含むＤＮＡ分子は、発現ベクター中に機能的に結合 し且つ宿主細胞中に導入されてその細胞によるリガンドの発現を可能にすること ができる。二つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列および望ましいリ ガンドタンパク質コード配列）は、その二つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１ ）フレームシフト突然変異の導入を引き起こさない、（２）所望のタンパク質コ ード遺伝子配列の転写を指示するプロモーター領域配列の能力を妨げない、また は（３）プロモーター領域配列によって転写される所望のタンパク質遺伝子配列 の能力を妨げない場合に機能的に結合しているという。

ｅｒｂＢ−２リガンドタンパク質をコードするＤＮＡ配列は慣用的な技法によっ てベクターＤＮＡと組換えすることができる。本発明は、原核性がまたは真核性 細胞における所望の融合タンパク質の発現を包含する。真核性宿主としては、イ ンビボかまたは組織培養中の酵母（特に、サツカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ））、真菌（特に、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）） 、哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたは霊長類細胞）がある。

酵母および哺乳動物細胞は、それらを更に、グリコジル化を含む翻訳後ペプチド 修飾することができるという実質的な利点を提供する。これらの宿主での所望の タンパク質の生産に利用することができる強力プロモーター配列および高コピー 散のプラスミドを用いる多数の組換えＤＮＡ計画が存在する。

酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子産物上のリーダー配列を認識し且つリ ーダー配列を有するペプチドを分泌する（すなわち、プレペプチド）。哺乳動物 細胞は、正しい折りたたみまたは正しい位置でのグリコジル化を含むタンパク質 分子に対する翻訳後修飾を提供する。

宿主として有用であることができる哺乳動物細胞としては、繊維芽細胞起原の細 胞、例えば、ＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋｌおよびそれらの誘導体がある。哺乳動 物宿主に関しては、若干の可能なベクターシステムが所望の融合タンパク質の発 現に利用可能である。宿主の性質に応じて、広範囲の転写および翻訳調節配列を 用いることができる。転写および翻訳調節シグナルは、高水準の発現を有する特 定の遺伝子とその調節シグナルが関係しているウィルス源、例えば、アデノウィ ルス、ウシ乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス等に由来することができる。或い は、哺乳動物発現産物からのプロモーター、例えば、アクチン、コラーゲン、ミ 芽シン等を用いることができる。抑制または活性化を可能にする転写開始調節シ グナルは、遺伝子の発現を変調することができるように選択することができる。

興味深いのは、温度を変化させることによって発現を抑制若しくは開始すること ができる温度感受性である調節シグナルまたは代謝産物などの化学的調節を受け るものである。

真核性宿主での所望の融合タンパク質の発現には、真核性調節領域を用いる必要 がある。このような領域は、概して、ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプ ロモーター領域を含む。好ましい真核性プロモーターとしては、マウスメタロチ オネイン■遺伝子のプロモーター（ハマー（Ｈａｍｅ　ｒ）　、　Ｄ、ら、Ｊ。

Ｍｏｌ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、１　：　２７：３−２８８　（１９８２））；ヘル ペスウィルスのＴＫプロモーター（マクナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）、Ｓ、　、 Ｃｅｌ　１３１　：　３５５〜３６５　（１９８２）　）；　ＳＶ４０初期プ０ モー９−（ベノイスト（Ｂｅｎｏ　ｉ　ｓ　ｔ）　、Ｃ０ら、Ｎａｔｕｒｅ（ロ ンドン）　２９ｏ：３ｏ４〜３１０　（１９８１））；酵母ｇａ１４遺伝子プロ モーター（ジａン７．トン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）、Ｓ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　７９．二６９７１〜６９７５　（１９８２））　；シルバー（Ｓｉ 　１ｖｅｒ）、Ｐ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ旦Δ と　旦１　：　５９５１〜５９５５　（１９８４））がある。

周知のように、真核性ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコードするコドン で開始する。この理由で、真核性プロモーターと、所望の融合タンパク質をコー ドするＤＮＡ配列との結合は、メチオニンをコードすることができるいずれの介 在コドン（すなわち、ＡＵＧ）も含まないことを確実にすることが好ましい。

このようなコドンの存在は、融合タンパク質の形成（ＡＵＧコドンが所望の融合 タンパク質をコードするＤＮＡ配列と同一の読み取り枠にある場合）かまたはフ レームシフト突然変異（ＡＵＧコドンが所望の融合タンパク質をコードする配列 と同一の読み取り枠にない場合）を引き起こす。

６ｒｂＢ−２リガンドタンパク質の発現は、原核性細胞で達成することもできる 。好ましい原核性宿主としては、細菌、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、バチ ルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａ　１ｍ ｏｎｅ　ｌ　ｌ　ａ）　、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）等がある。特に興味 深い最近宿主としては、大腸菌に１２および他の腸内細菌（例えば、ネズミチフ ス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または霊菌（Ｓｅｒ ｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ））並びに種々のシュードモナス種がある。

原核性宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよび制御配列と一致する必要があ る。

原核性細胞（例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔ　ｉ　ｌ　ｉ　ｓ）　、シ ュードモナス属、ストレプトミセス属等）において所望のリガンドタンパク質を 発現するには、所望のリガンドタンパク質をコードする配列を機能的原核性プロ モーターに対して機能的に結合する必要がある。このようなプロモーターは構造 性であるかまたは、更に好ましくは、調節可能（即ち、誘導可能または抑制解除 可能）であることができる。構造性プロモーターの例としては、バクテリオファ ージλのｉｎｔプロモーターおよびｐＢＲ３２２のｂ−ラクタマーゼ遺伝子のｂ ｌａプロモーター等がある。誘導可能な原核性プロモーターの例としては、バク テリオファージλの主要な左右のプロモーター（Ｐ　およびＰＲ）、大腸菌のｔ ｒｐ、ｒｅｃＡＳ　１ａｃＺ、ｌａｃｌｌｇａｌおよびｔａｃプロモーター、ａ −アミラーゼ（ウルマネン（Ｕｌｍａｎｅｎ）、１．　ら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、１６２＋１７６〜１８２　（１９８５））　、枯草菌の５−２８特異的プ ロモーター（ジルマ：／　（Ｇ　ｉ　１ｍａｎ）、Ｍ、Ｚ、ら、Ｇｅｎｅ　３２ ：１１〜２０　（１９８４））、バチルス属のバクテリオファージのプロモータ ー（グリツァン（Ｇ　ｒ　ｙ　ｃ　ｚ　ａ　ｎ）、Ｔ、Ｊ、、Ｉｎ：Ｔｈｅ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｆｏｌｏ　ｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アカデミツ ク・プレス争インコーボレーテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、 ）、ＮＹ（１９８２））およびストいる。

更に、原核性細胞での適当な発現には、遺伝子コード配列から上流のリポソーム 結合部位の存在が必要である。このようなリポソーム結合部位は、例えば、ゴー ルド（Ｇｏ　ｌ　ｄ）　、Ｌ、ら、（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３ ５：３６５〜４０４　（１９８１））に開示されている。

所望のタンパク質コード配列および機能的に結合したプロモーターは、非複製Ｄ ＮＡ　（またはＲＮＡ）分子として受容体原核性または真核性細胞中に導入する ことができ、それらは直鎖分子かまたは、更に好ましくは、閉鎖共有結合環分子 であってよい。このような分子は自律複製することができないので、所望のりガ ント分子の発現は導入された配列の一時的発現によって生じることができる。或 いは、永久的な発現は、宿主染色体中への導入された配列の組込みによって生じ ることができる。

一つの実施態様において、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中に組込むことが できるベクターを用いる。導入されたＤＮＡを染色体中に安定に組込んだ細胞は 、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１種類またはそれ以上の遺伝 標識を更に導入することによって選択することができる。遺伝標識は、宿主にお ける栄養要求性（例えば、一般的な酵母栄養要求性遺伝標識である１ｅｕ２また はりｒａ３）、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質または銅のような重金属等を補 足することができる。選択可能な標識遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に 対して直接的に結合するかまたは同時形質転換によって同一の細胞中に導入する ことができる。

好ましい実施態様において、導入された配列は受容体宿主において自律複製する ことができるプラスミドまたはウィルスベクター中に組込まれる。広範囲のベク ターのいずれもこの目的に用いることができる。特定のプラスミドまたはウィル スベクターを選択する場合に重要な因子としては、ベクターを含む受容体細胞を 認識し且つベクターを含まない受容体細胞から選択することができる容易さ；特 定の宿主において望まれるベクターのコピー数；および異なる種の宿主細胞間で ベクターを往復させることができることが望ましいかどうかということがある。

一連の酵母遺伝子発現システムをいずれも用いることができる。このような発現 ベクターの例としては、酵母２−ミクロン環、発現プラミドＹＥＰ１３、ＹＣＰ およびＹＲＰ等またはそれらの誘導体がある。このようなプラスミドは当該技術 分野において周知である（ポートスタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）、Ｄ、ら、ｙユ ａｍｉ　Ｗｎｔｒ、Ｓ　ｍ　、１９：２６５〜２７４　（１９８２）；ブローチ （Ｂｒｏａｃｈ）、　Ｊ、　Ｒ，、Ｉｎ：Ｔｈｅ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ　 Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、＝７−ルド・スプリング＋＋ハ ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）、コールド・スプリング−／＼−ｔ＜　＋、　Ｎ　Ｙ、４４５〜４７０ 頁（１９８１）、ブローチ、Ｊ、Ｒ，、Ｃｅ１ｌ　２８：２０３〜２０４（１９ ８２））。

哺乳動物宿主に関して、いくつかの可能なベクターシステムが発現に利用可能で ある。ベクターの一つのクラスは、動物ウィルス、例えば、ウシ乳頭腫ウィルス 、ポリオーマウィルス、アデノウィルスまたはＳＶ４０ウィルス由来の染色体外 プラスミドを自律複製することを提供するＤＮＡ要素を用いる。第二のクラスの ベクターは、所望の遺伝子配列の宿主染色体中への組込みに頼る。導入されたＤ ＮＡを染色体中に安定に組込んだ細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を 可能にする１種類またはそれ以上の遺伝標識を更に導入することによって選択す ることができる。遺伝標識は、栄養要求性宿主に対するプロトトロピー、殺生物 剤耐性、例えば、抗生物質または銅のような重金属等を提供することができる。

選択可能な標識遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に対して直接的に結合す るかまたは同時形質転換によって同一の細胞中に導入することができる。追加の 要素がｍＲＮＡ（７）Ｊｔ適合成に必要とされることもある。これらの要素とし ては、スプライスシグナル並びに転写プロモーター、エンハンサ−および終結シ グナルを挙げることができる。このような要素を組込むｃＤＮＡ発現ベクターと しては、オカヤ７．Ｈ，，Ｍｏｌ、ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３：２８０　（１９８ ３）に記載されたものおよびその他がある。

好ましい原核性ベクターとしては、大腸菌、例えば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１ 、ｐｓｃｌｏｌ、ｐＡｃＹｃ１８４、πＶＸなどにおいて複製することができる ものなどのプラスミドがある。このようなプラスミドは、例えば、マニアテイス 、Ｔ、ら（Ｉｎ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング”／１１＜−拳プレス、コールド・ス プリング・ハーバ−、ＮＹ　（１９８２）によって開示されている。バチルス属 プラスミドとしては、ｐｃ１９４、ｐｃ２２１、ｐＴ１２７等がある。このよう なプラスミドは、グリツァン、Ｔ、（Ｉｎ：ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｉ、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ）、ＮＹ（１９８２）、３０７〜３２９頁）によって開示されてい る。適当なストレプトミセス属プラスミドとしては、ｐＩＪｌｏｌ　（ケンドー ル（Ｋｅｎｄａｌｌ）、に、Ｊ、ら、二Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．１６９：４１７７ 〜４１８３　（１９８７））およびストレプトミセス属バクテリオファージ、例 えば、φＣ３１（チャタ−（Ｃｈａｔｅｒ）、に、Ｆ、ら、Ｉｎ：５ｉｘｔｈ　 ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ ｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏ　。

アカデミアイ−カイト（Ａｋａｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ）、　ブダペスト、ハ ンガリー（１９８６）、４５〜５４頁）がある。シュードモナスプラスミドは、 ジ璽−ン（Ｊｏｈｎ）、Ｊ、Ｆ、ら、　（Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、８： ６９３〜７０４　（１９８６）　）およびイザキ（Ｉｚａｋｉ）、に、（ユλ」 し−ムーＢａｃｔｅｒｉｏ１．３３ニア２９〜７４２　（１９７８））によって 論及されている。

構築物を含むベクターまたはＤＮＡ配列を発現用に調製したら、ＤＮＡ構築物を 適当な宿主中に導入形質転換）することができる。様々な技法、例えば、プロト プラストフュージョン、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーションまたは 他の慣用的な技法を用いることができる。融合後、細胞を培地中で増殖させ且つ 適当な活性に関してスクリーンする。配列の発現は本発明の組換えｅｒｂＢ−２ リガンドタンパク質の生産を引き起こす。

Ｆ０組換えｅｒｂＢ−２リガンドの精製本発明の６ｒｂＢ−２リガンドタンパク 質は、クローン化したリガンド遺伝子を含む組換え体宿主の発酵によって生産す ることができる。クローン化タンパク質を生産する哺乳動物細胞などの組換え体 宿主は、当該技術分野において周知の技法によって増殖させ且つ採取することが できる。

本発明の組換えｅｒｂＢ−２リガンドタンパク質は、一般的に用いられる既知の タンパク質精製技術、例えば、抽出、沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ア フィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過等を用いることによって組換え体宿 主またはその培地から抽出し且つ精製することができる。本発明のｅｒｂＢ−２ リガンドタンパク質を５Ｋ−Ｂｒ−３から単離するのに用いられる生化学的技法 は、これらのタンパク質を組換え体宿主から精製する場合に特に興味深い。

Ｇ、抗リガンド分子 本発明は、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドに対して共有または非共有結合する抗 リガンド分子に関する。制限されることなく、本発明の抗リガンド分子としては 、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドに対して共有または非共有結合することができ る抗体、遮断ペプチドおよび任意の他の分子、化合物、化学物質等がある。

本発明による遮断ペプチドは、遮断ペプチドが分子に対して結合するようにそれ らが分子と特異的に反応することができるかまたは分子に対して親和性を有する 場合に分子を「結合しうる」。本発明の遮断ペプチドの例は、ｅｒｂＢ−２貫膜 受容体の細胞外ドメインである。典型的に、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドに対 して結合する細胞外ドメインのペプチドフラグメントを用いることができるが、 このようなｅｒｂＢ−２貫膜受容体の機能的誘導体を用いてもよい。このような 誘導体としては、例えば、ｎｅｕＳＣ−ｋｉ　ｔＳｍｅ　ｔまたは、成長因子受 容体を連想させる構造を有する任意の貫層チロシンキナーゼを挙げることができ る。

本発明の遮断ペプチドは、多数の周知の技法によって製造することができる。

合成ペプチドは自動タンパク賀合成機を用いて構築することができる。或いは、 本発明の遮断ペプチドは組換えＤＮＡ技術によって生じることができる。例えば 、所望のペプチドをコードするＤＮＡ分子は、形質転換した細胞において前記の ペプチドの発現を得ることができるようにプロモーターまたは他の調節配列に対 して機能的に結合することができる。所望の遮断ペプチドを生産する多数の方法 は当業者には容易に明らかである。

本発明の遮断ペプチドが、当該技術分野において周知の標準的な技法によって検 出可能に標識することができるしまたは治療薬と結合することができるというこ とは当業者に理解される。本発明の遮断ペプチドを検出可能に標識するのに用い ることができる検出可能な標識の例を下記に記載する。

本明細書中で用いられる「治療薬」という用語は、細胞に対して密接に結合して 導入された場合にその細胞の生存または生殖の助けとならないように該細胞を死 滅させ、破壊し、増殖または生殖を阻害し、さもなければ正常な生理機能または 代謝を妨げることができる何等かの分子、化合物、タンパク質等を表わす意味で ある。適当な治療薬の例としては、細胞毒性薬、毒素、同位体、内分泌療法等が ある。用いることができる具体的な細胞毒性薬は、アドリアマイシン、シクロホ スファミド、５−フルオロウラシル、メトトレキセート、シスプラチン、カルポ プラチン、ビンクリスチン、ｖＰ−１６、プレオマイシン、マイトマイシンＣ等 である。毒素としては、リシンＡ１ジフテリアおよびシュードモナス属を挙げる ことが。適当な同位体の例としては、Ｐ３２、インジウム、イツト！功ムおよび ヨウ素がある。適当な内分泌療法の例としては、ジエチルベストロール（ＤＥＳ ）、タモキシフェンおよびＬＨＲＨ拮抗薬がある。

抗体は、それが分子と特異的に反応することによってその分子を抗体に対して結 合することができる場合に、分子を「結合しうる」または分子に「対して向けら れる」といわれる。「エピトープ」または「結合部位」という用語は、抗体を認 識し且つそれによって結合することができる抗原の一部分を表わす意味である。

抗原は１個または２個以上のエピトープを有することができる。「抗原」は、そ の抗原のエピトープに対して結合しうる抗体を産生ずる動物を誘導しつる。上記 で論及した特異的反応は、抗原が極めて選択的な方法でその対応する抗体と反応 し、そして他の抗原によって誘発されることがある多数の他の抗体とは反応しな いことを示す意味である。本発明の抗原は、同定された全てのリガンドであるこ とができる。具体的には、ｐ７５　ｅｒｂＢ−２リガンドを用いて、本発明によ る抗ｐ７５リガンド抗体を生じることができる。

本明細書中で用いられる［抗体Ｊ　（Ａｂ）または「単クローン性抗体Ｊ（Ｍａ ｂ）という用語は、ハプテンまたは抗原を結合することができる完全な分子並び にそれらのフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ　（ａｂ’　）　２フラグメ ントなど）を含む意味である。ＦａｂおよびＦ　（ａ　ｂ’　）　２フラグメン トは完全な抗体のＦｃフラグメントを欠失し、循環からより速やかに除去さね、 そして完全な杭木発明において用いられる抗体は、様々な方法のいずれによって も製造することができる。例えば、ｅｒｂＢ２リガンドを生産する細胞（または それらの両分、溶解産物等）を動物に投与して、抗原を結合しつる多クローン性 抗体を含む血清の生産を誘導することができる。ｅｒｂＢ−２リガンドを生産す る細胞は培地中にタンパク質を排出するので、その培地をｅｒｂＢ−２リガンド 抗原源として用いることができる。好ましい方法において、本発明のｅｒｂＢ− ２リガンド調製試料は、それが天然の不純物を実質的に含まないように製造され 且つ精製される。次に、このような調製試料を動物に導入して、より大きい特異 的活性を有する多クローン性抗血清を生産する。

本発明の抗体は単クローン性抗体または多クローン性抗体（またはそれらのハプ テン結合性フラグメント）であってよい。このような単クローン性抗体は、ハイ ブリドーマ技術を用いて製造することができる（コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら、 Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）；コーラ−ら、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：５１１　（１９７６）；コーラ−ら、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：２９２　（１９７６）：ハンマリングビア、Ｎ、Ｙ、、５ ６３〜６８１頁（１９８１））。概して、このような方法は、実質的に純粋なｅ ｒｂＢ−２リガンドタンパク賀で動物を免疫することを行なう。

免疫された動物の牌臓細胞を抽出し且つ適当な骨髄種細胞系と融合する。適当な 骨髄種細胞系のいずれも本発明によって用いることができるが；しかしながら、 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州 から入手可能な適当な親骨髄種細胞系（ＳＰ２０）を用いてよい。融合後、得ら れたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に維持した後、ワンズ（Ｗａｎ ｄｓ）、Ｊ、Ｒ，ら（本明細書中に参考として包含されるＧａ５ｔｒｏｅｎｔｅ ｒｏｌｏ　旦０：　２２５〜２３２　（１９８１）　）によって記載されたよう な限界希釈によってクローン化する。次に、このような選択によって得られたハ イブリドーマ細胞を検定して、ｅｒｂＢ−２リガンドに対して結合することがで きる抗体を分泌するクローンを同定する。

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）　並びに抗体の他のフラグメントを、完全な抗体と同 一の方法において試料中のｅｒｂＢ−２リガンドを検出するための本明細書中に 開示された方法にしたがって用いることができるということは理解される。この ようなフラグメントは、典型的に、タンパク質分解開裂によって（Ｆａｂを生し るのに）パパインまたは（Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２を生じるのに）ペプシンなど の酵素を用いて生産される。或いは、ハプテン結合性フラグメントを、組換えＤ ＮＡ技術の適用または合成化学によって生じることができる。

遮断ペプチドと同様に、抗体は治療薬に結合することができる。本発明の抗リガ ンド抗体に結合することができる治療薬の適当な例としては、制限されないが、 細胞毒性薬、毒素および同位体がある。適当な治療薬の例は前記に記載されてい Ｈ，ｅｒｂＢ−２リガンドを検出する検定本発明の抗体、抗体のフラグメントま たは遮断ペプチドを含む抗リガンド分子を用いてｅｒｂＢ２リガンドの存在を検 出することができる。したがって、抗体（またはそれらのフラグメント）および 遮断ペプチドを組織学および生検において用いて、胸部癌、肝臓癌、卵巣癌、肺 癌、結腸癌等に罹患している患者でのｅｒｂＢ−２リガンド発現を検出すること ができる。このような検出は様々な検定のいずれを用いても達成することができ る。例えば、抗体および抗体フラグメントを放射性標識することにより、ｅｒｂ Ｂ−２リガンドをラジオイムノアッセイを用いることによって検出することが可 能である。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の十分な説明は、参考として本明細 書中に包含されるワークス（Ｗｏｒｋｓ）、Ｔ、Ｓ、らによるＬａｂｏｒａｔｏ ｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎＭｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｙ、ノース・ホランド・パブリッシング・カンバ＝−（ Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ）、ＮＹ　 （１９７８）に見出さね、特に、チャード（Ｃｈａｒｄ）、Ｔ、による「ラジオ イムノアッセイおよび関連技術への導入（ＡｎＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ 　Ｒａｄｉｏｊｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ）Ｊと題する章で論及されている。或いは、蛍光、酵素または他の適当 な標識を用いることができる。検出可能に標識された遮断ペプチドを同様の方法 で用いて、ｅｒｂＢ−２リガンドを検出することができる。

或いは、６ｒｂＢ−２リガンドの検出は、インビボでの映像技術によって達成す ることができ、そこにおいて、標識抗体、それらのフラグメントまたは遮断ペプ チドを患者に与え、そしてｅｒｂＢ−２リガンドを発現する胸部癌、卵巣癌、肝 臓癌、肺癌または結腸癌の存在を何等かの組織試料を予め取り出すことなく検出 する。このようなインビボ検出法は、他の検出法よりも侵略的ではないという利 点を有し、そして更に、患者から容易に取り出すことができない組織中の抗原発 現性細胞の存在を検出することができる。

前記で論及した検定により、抗体、それらのフラグメントまたは遮断ペプチドは 、種々の標識および標識方法のいずれを用いても標識することができる。本発明 において用いることができる標識の種類の例としては、制限されないが、酵素標 識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、毒素標識および化学発 光標識がある。

適当な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレ アーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、 α−グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ 、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコー スオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタ ラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチ ルコリンエステラーゼ等がある。

適当な放射性同位体標識の例は当業者に容易に明らがである。本発明において用 いるのに適当な非放射性同位体標識も当業者に知られている。

適当な蛍光標識の例としては、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、 ローダミン標識、フィコシアニン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニ ン標識、０−フタルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）標識、フルオレスカミ ン（ｆ　Ｊｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）標識等がある。

適当な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシンおよびコレラ毒素がある 。化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族ア クリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリシュウ（ａ　ｃ　ｒ　ｆ 　ｄ　ｉ　ｎ　ｉ　ｕ）塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ル シフェラーゼ標識、エクオリン標識等がある。

当業者は、本発明によって用いることができる他の適当な標識を熟知している。

これらの標識の抗体またはそれらのフラグメントに対する結合は、当業者に一般 的に知られている標準的な技法を用いて達成することができる。典型的な技法は ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）、Ｊ、Ｈ，ら、（ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ ヱ旦：１〜３１　（１９７６）　）およびシュルス（Ｓｃｈｕｒｓ）、Ａ、Ｈ， Ｗ。

Ｍ、（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　呈上：１〜４０　（１９７７））によっ て記載されている。後者目已ホされているカップリング技術は、グルタルアルデ ヒド法、過ヨウ素酸塩法、シマレイミド法、ｍ−マレイミド−ベンジル−Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミド法であり、いずれの方法も本明細書中に参考として包含 される。

抗体、抗体のフラグメントまたは遮断ペプチドの検出は、担体を用いることによ って改良することができる。周知の担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および 変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱がある。担体の 性質は本発明の目的のためにある程度まで可溶性がまたは不溶性であることがで きる。その支持材料は、事実上、結合した分子が抗原に対して結合することがで きる限りの何等かの可能な構造的形状を有する。例えば、支持体形状はビーズの 場合のような球状または試験管の内面若しくはロッドの外面の場合のような円筒 形であってよい。或いは、その表面はシート、試験用ストリップ等のように平で あってよい。当業者は、抗体および遮断ペプチドを結合するのに適当な多数の他 の担体に注目しているしまたは日常的な実験を用いることによってそれらを確認 することができる。

本発明の結合性分子（抗リガンド分子）は、更に、「三部分」または「サンドイ ッチ」検定としても知られるイムノメトリックアッセイにおいて用いるのに適応 することができる。典型的なイムノメトリックアッセイにおいて、一定量の非標 識抗体または抗体のフラグメントを、試験される液体（すなわち、血液、リンパ 、リキフフイド（ｌｉｑｕｉｆｉｅｄ）、便、組織ホモジネート等）中に不溶性 である固体支持体に対して結合させ、そして一定量の検出可能に標識した可溶性 抗体を加えて、固相抗体、ペプチド抗原および標識抗体間に形成された三重複合 体の検出および／または定量を可能にする。標識された遮断ペプチドは、本発明 による検定において用いた抗体の代わりにまたはそれと組合わせて用いることも できるということは当業者に明らかである。

典型的なイムノメトリックアッセイとしては、固相に対して結合した抗体または 遮断ペプチドを試験される試料と最初に接触させて、二重の固相抗体−抗原複合 体または遮断ペプチド−抗原複合体の形成によって試料から抗原を抽出する「前 進」検定がある。適当なインキュベート期間の後、固体支持体を洗浄して、もし あるならば未反応の抗原を含む液体試料の残留物を除去した後、未知量の標識抗 体または標識遮断ペプチド（「リポータ−分子」として機能する）を含む溶液と 接触させる。標識された分子が、非標識抗体または遮断ペプチドによって固体支 持体に結合した抗原と複合体をつくることを可能にする第二のインキュベーショ ン期間後に、固体支持体の二回目の洗浄をして未反応の標識抗体を除去する。

この種類の前進サンドイッチ検定は、簡単な「イエス／ノー」検定であり、ｅｒ ｂＢ−２リガンド抗原が存在するか否かを決定することができるしまたは標識抗 体若しくは標識遮断ペプチドの測定値を既知量の抗原を含む標準試料で得られた 値と比較することによって定量的に行なうことができる。このような「三部分」 または「サンドイッチ」検定は、ワイド（Ｗｉｄｅ）によってキルカーム（Ｋｉ ｒｋｈａｍ）およびハンター（Ｈｕｎ　ｔ　ｅ　ｒ）監修のＲａｄｉｏｉｍｕｎ ｅ　Ａｓ５ａｙ　Ｍｅｔｈｏｄ、Ｅ、＆　Ｓ、リビングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓ ｔｏｎｅ）、ニブインバラ、１９７０の１９９〜２０６頁に記載されている。

ｅｒｂＢ−２リガンド抗原を検出するのにも有用であることができるもう一つの 種類の「サンドイッチ」検定では、いわゆる「同時」または「逆」検定を用いる 。同時検定は、固体支持体に対して結合した抗体または遮断ペプチドおよび標識 抗体または遮断ペプチド双方を試験される試料に対して同時に加えるような１回 のインキュベーション工程を必要とする。インキュベーションを完了後に、固体 支持体を洗浄して液体試料の残留物および複合体を作らなかった標識抗体または ペプチドを除去する。次に、固体支持体と結合した標識抗体または遮断ペプチド の存在を、慣用的な「前進」サンドイッチ検定で行なったように決定する。

「逆」検定においては、液体試料に対する標識抗体または標識遮断ペプチドの溶 液の段階的添加に続いて、適当なインキュベーション期間を用いた後に、固体支 持体に対して結合した非標識抗体または非標識遮断ペプチドを加える。第二のイ ンキュベーション後に、固相を慣用的な方式で洗浄して、試験される試料の残留 物および未反応標識抗体または遮断ペプチドの溶液をそこから除去する。次に、 固体支持体に結合した標識抗体または標識遮断ペプチドの測定を、「同時」およ び「前進」検定の場合と同様に決定する。

上記で説明したように、ｅｒｂＢ−２リガンド抗原のイムノメトリックアッセイ は、特定の結合性分子を「リポータ−分子」で標識することを必要とする。前記 で定義のこれらのリポータ−分子または標識は慣用的であり且つ当該技術分野で 周知である。本発明の実施において、酵素標識は好ましい実施態様である。考え られる全てのイムノメトリックアッセイとして用いるのに理想的な単一の酵素は 存在しない。それよりも、酵素が特定の検定システムに適しているものを決定す る必要がある。酵素の選択に関して臨界的に重要なのは、純粋な酵素の代謝回転 数（単位時間に生成物に変換される酵素部位当りの基質分子の数）、酵素標品の 純度、その生成物の検出感度、酵素反応の検出の容易さおよび速度、試験液体中 の干渉性因子または酵素様活性の不存在、酵素および誉の結合体の安定性、酵素 およびその結合体の利用可能性および費用等である。本発明のイムノメトリック アッセイにおいて好ましい標識として用いられる酵素としては、ペルオキシダー ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコー スオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼおよびグルコー ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼがある。

更に、本発明の検定において用いるための材料は、キット製品に適しているのが 理想的である。このようなキットは、バイアル、試験管等のような１個またはそ れ以上の容器手段を厳重に密閉して収容するように仕切られたキャリヤ一手段を 含むことができる。前記の容器手段はそれぞれ、その方法で用いられる個別の要 素の一つを含む。

例えば、前記の容器手段の一つは、免疫吸着剤を結合したペプチドフラグメント を含むことができる。このようなフラグメントは、個別の固相免疫吸着剤に対し てまたは直接的に容器の内壁に対して結合させることができる。第二の容器は、 検出可能に標識された抗体または遮断ペプチドを凍結乾燥状態でまたは溶液中に 含むことができる。

キャリヤーは、更に、種々の、予め決定されたそして既知の量の抗原をそれぞれ が含んでいる多数の容器を含むことができる。次に、これらの後者の容器を用い て、未知量の抗原を含む試料から得られた結果に内挿することができる標準曲線 を作成することができる。

■、抗ソリガン１分子用途 本発明の抗リガンド分子は、多数の治療および診断上の用途をする。例えば、治 療上の用途は、癌に罹患していると疑われる患者での癌療法を含むことができる 。具体的には、本発明の抗リガンド分子、例えば、抗体または遮断ペプチドを用 いて、ｅｒｂＢ−２リガンドを生産するおよび／またはｅｒｂＢ−２受容体タン パク質を過剰発現する腺癌細胞を有する患者を治療することができる。

治療の一つの種類は、治療薬に結合した抗体の使用を含むことができる。治療薬 に結合した遮断ペプチドを同様の方法で用いてもよい。治療薬に結合した有効量 の抗リガンドを患者に対して投与することにより、ｅｒｂＢ−２リガンドおよび ／またはｅｒｂＢ−２受容体を発現する患者の腺癌細胞の増殖を阻害するかまた は死滅させ、それによって癌の治療を提供することができる。ＥＧＦＲを過剰発 現する正常および悪性の細胞は、患者に対する抗リガンド−治療用結合体薬の投 与によって影響されない。したがって、抗リガンド結合体による患者の治療は、 インビボでのｅｒｂＢ−２過剰発現性癌細胞を選択的に阻害しまたは破壊するこ とができる。

本発明の癌治療方法により、結合した抗リガンドは、ｅｒｂＢ−２リガンドとの 癌細胞の結合によって癌細胞を認識し且つそれにたいして結合することができる 。制限されることなく、癌細胞に対する結合の機序は、細胞表面上にすなわちリ ガンドの発現および／または分泌のために位置したｅｒｂＢ−２リガンドの認識 を必要とすることがある。

結合した抗リガンドが、リガンドとの相互作用によって線源細胞と結合すなわち 密接に関係したら、治療薬はその細胞を阻害または死滅させることができる。

この方法において、本発明の療法は特定の標的、すなわち、ｅｒｂＢ−２リガン ドに関係している癌細胞に選択的である。ｅｒｂＢ−２リガンドに関係していな い正常細胞および他の細胞（ｅｒｂＢ−２リガンドを発現しないしまたは結合し ない細胞）は、大部分はこの療法によって影響されないらしい。

或いは、本発明の抗リガンドを用いて、腺癌細胞増殖の誘導を防止または阻害す ることができる。例えば、　１　ｓ　ｓ　ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ　２受容体を含む癌細 胞を低濃度のｅｒｂＢ−２リガンド存在下において増殖させる。ｅｒｌ）Ｂ−２ リガンド成長因子がその受容体と相互作用するのを防止することにより、癌５懸 者を治療する手段を提供することができる。

本発明の細胞増殖を阻害する方法により、抗リガンドはｅｒｌ〕Ｂ−２リガンド に対して結合することができる。排出されたｅｒｈＢ−２リガンドのインビボで の結合はりガント−抗リガンド複合体を生成し、そわ末よって立体的δこかまた は他の方法でのりガント−受容体相互作用を防止または阻害することができる。

したがって、本発明は、有効量の抗リガンドを患者に投与することによってこの 、Ｊ：うな患者での腺癌細胞増殖を防止または阻害する治療法を提供する。

本発明の抗リガンドの多数の他の治療上の用途を考案することができることは理 解される。このような療法は、他の既知の治療技術を本発明の抗リガンドと組合 わせて用いることを含むことができる。本発明は、記載された治療的処置に制限 されることを意味しているのではなく、したがって、単に例示として提示１．て いる。

更に、腺癌細胞を阻害または死滅させるのに十分な有効量の本発明の抗リガンド の投与は、悪性細胞の種類、患者の体重、用いられる治療薬の種類等を含む多数 の因子に応じて変更することができる。当業者は、特定の悪性細胞をインビトロ またはインビボで阻害または死滅させるのに必要な量を最小限度の実験によって 容易に決定することができるということを理解する。

本発明の抗リガンド分子の診断上の用途としては、例えば、患者由来の試料中の ｅｒｂＢ−２リガンドの検出を挙げることができる。このような試料は、体組織 、体液（例えば、血液、尿、涙滴、唾液、血清および脳を髄液）、便、細胞抽出 物等であってよい。

６ｒｂＢ−２リガンドを検出する方法により、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを インビトロで細胞培地中に排出させる。インビトロで更に分泌されるもう一つの 成長因子であるＴＧＦαは、癌患者の体液中で同定された。したがって、本発明 の成長因子（ｅｒｂＢ−２リガンド）は、癌患者からの体液、僕等中で検出する ことができる。

患者由来の試料中での本発明のｅｒｂＢ−２リガンドの検定は、したがって、癌 を診断する方法を提供することができる。すなわち、患者由来の試料中のｅｒｂ Ｂ−２リガンドの検出は、患者でのｅｒｂＢ−２リガンド発現性細胞の存在を示 す。更に、抗リガンドはｅｒｂＢ−２リガンドに特異的であるので、その検定は 、患者の腫瘍の生物学に関する情報を提供することができる。例えば、ｅｒｂＢ −２受容体を過剰発現する腺癌細胞を有する癌患者は、ｅｒｂＢ−２リガンド過 剰発現を示さない癌患者よりも無疾患期間がはるかに短く且つ全体的に生存者は 少ない、：とが知られている。ｅｒｈＢ−２リガンド成長因子の検出は、したが って、予後検査として役立つことかでき、臨床医が患者を治療するのに一層有効 な療法を選択することを可能にする。

Ｊ、ｅｒｂＢ−２リガンドの用途 本発明のｅｒｂＢ−２リガンドは、診断用および治療用双方に用いることができ る。具体的には、ｅｒｂＢ−２リガンドを患者に用いて、ｅｒｂＢ−２受容体タ ンパク質を過剰発現する腺癌細胞を検出することができる。このような患者のこ れらの細胞の増殖を阻害しまたは破壊する治療も、本発明によって達成すること ができる。

１．８５ｋＤａの貫層タンパク質をコードするｅｒｂＢ−２癌原遺伝子の発現は 、特定の侵略的悪性細胞種を識別する遺伝標識として役立つ。ｅｒｂＢ−２受容 体は貫層タンパク質であるので、その細胞外ドメインは細胞表面上のそのリガン ドとの相互作用に影響を受けやすい。したがって、ｐ１８５ｅｒｂＢ−２に対し て特異的に結合する本発明のリガンドを用いて、ｅｒｂＢ−２受容体を発現する 細胞を検出することができる。意外にも、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドはＥＧ ＦＲと反応しないし、このようにｅｒｂＢ−２受容体に特異的である。したがっ て、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドは患者の特定の癌細胞を検出することができ 、モしてｅｒｂＢ−２受容体を過剰発現することができない正常細胞または悪性 細胞を認識しないことがある。この特徴は、ｅｒｂＢ−２発現性悪性細胞の初期 の検出が患者の予後および治療を指示することができるという点で重要である。

本発明により、ｅｒｂＢ−２リガンドによる診断は、患者での１　ｓ　５ｅ　ｒ 　ｂ　Ｂ　２過剰発現性癌細胞の検出を含む。患者でのこのような細胞の検出は 、種々のインビトロ検定またはインビボ映像技術のいずれによっても達成するこ とができる。これらのインビトロおよびインビボ技術の例は、好ましい実施態様 の説明のＨの項に開示されている。ｅｒｂＢ−２リガンドを用いるインビトロ検 定またはインビボ映像技術において用いるための材料も、キット製品に適してい るのが理想的である。

当業者は、これらの検定によって種々の標識および標識方法を用いることができ るということを理解する。本発明において用いることができる標識の種類の例と しては、制限されないが、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性同位体標識、 蛍光標識、毒素標識および化学発光標識がある。これらの標識のｅｒｂＢ−２リ ガンドタンパク質に対する結合は、当業者に一般的に知られている標準的な技法 を用いて達成することができる。

本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを用いて癌に罹患している患者を治療することが できる。ｅｒｂＢ−２リガンドによる治療法は、本発明のｅｒｂＢ−２リガンド に対して結合することができる細胞に対して特異的に集中している。この方法で は、本発明の治療方法によって、ｅｒｂＢ−２受容体を過剰発現する悪性細胞の 増殖を阻害しまたは破壊することができる。

本発明のｅｒｂＢ−２リガンドの多数の治療上の用途を考案することができるこ とは理解される。したがって、本発明は、記載された治療的処置に制限される意 味ではなく、したがって単に例示として提示している。

本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを用いる癌治療の一つの態様は、リガンド−治療 薬結合体に関する。本発明のｅｒｂＢ−２リガンド結合体は、ｅｒｂＢ−２受容 体を過剰発現する腺癌細胞に対して結合することができる。ｅｒｂＢ−２リガン ド結合体を細胞に対して結合したら、治療薬は細胞を死滅させまたは増殖を阻害 することができる。

この方法において、患者に対する有効量のリガンド結合体の投与は、インビボで の特定の種類の癌細胞を破壊しまたは増殖阻害することができる治療として役立 つ。ＥＧＦＲを発現する正常および悪性の細胞は、本発明のりガント−治療薬結 合体の投与によって影響されない。

本発明のｅｒｂＢ−２リガンドを用いる治療の第二の態様は、成長因子の阻害作 用に関する。意外にも、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドは、十分な濃度において 腺癌細胞の増殖を阻害または抑制することができる阻害剤として作用する。多数 の癌細胞のいずれも、ｅｒｂＢ−２リガンドがその細胞と相互作用することがで きるならば、本発明のｅｒｂＢ−２リガンドによって増殖が阻害されることがあ る。典型的には、ｅｒｂＢ−２受容体を過剰発現する悪性細胞を阻害する。この ような細胞としては、制限されないが、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺ま たは唾液腺の癌細胞を挙げることができる。本発明のｅｒｂＢ−２リガンドによ って影響されない細胞としては、ｅｒｂＢ−２受容体をコードする部属遺伝子を 過剰発現しない正常細胞および悪性細胞がある。

腫瘍細胞のインビトロまたはインビボでの阻害は、有効量の本発明のｅｒｂＢ− ２リガンドの投与によって達成することができる。当業者は、細胞増殖を阻害す るのに十分な量は、細胞種類、患者の体重、用いられる治療薬の種類等に応じて 変化することを理解する。これらの変数は、少ない実験で当業者によって容易に 決定することができる。

４Ｄ５放射受容体検定を用いて、種々のヒト細胞系由来の条件培地を１　ｓ　５ ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ　２結合活性の存在に関してスクリーンした。条件培地はベイツ ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４６：１７０７〜１７１３　（１９８６）に記載さ れたように集められた。要約すると、培地をアミコン限外濾過セル（ＹＭ５膜） （アミコン、デンバーズ、ＭＡ）中で１００倍に濃縮した。透明にし且つ濃縮し たら、培地を一２０℃で貯蔵し、同時に、下記の日数の間連続的に採集を行なっ た。濃縮した培地をスペクトラフォア（Ｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｒｅ）３チユービ ング（スペクトラル・メディカル・インダストリーズ（ＳｐｅｃｔｒａｌＭｅｄ ｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ｏサンセルス、ＣＡ）を用いて１００容量 の０．１Ｍ酢酸に対して４℃で２日間にわたって透析した。透析中に沈澱した物 質を４℃において４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により除去し；プｐ１８ ５ｅｒｂＢ−２の細胞外ドメインに対する単クローン性抗体６Ｅ９（フェンドリ ー（Ｆｅｎｄｌｙ）ＢｌＭ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５０：１５５０〜１５ ５８　（１９９０））を対照として用いて、６ｒｂＢ−２オンコブロチインまた は細胞からそれらの増殖培地中に流出されるその一部分が４Ｄ５検定の妨げにな るかもしれない可能性を除外した。流出したｅｒｂＢ−２細胞外ドメインは、４ Ｄ５と独占的に競合するｅｒｂＢ−２リガンドに対立するものとして、４Ｄ５お よび６Ｅ９双方のｐ１８５ｅｒｂＢ−２に対する結合と競合すると考えられる。

ｐｌｓ　５ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ　２細胞外ドメインに対して向けられている抗体はい ずれも、対照抗体が４Ｄ５またはＭＯＩ９３結合の妨げにならない、すなわち、 対照抗体および試験抗体が細胞外ドメイン上の同一の結合部位に結合しないとい う条件で、６Ｅ９の代わりに対照抗体として用いることができる。

結合検定を記載されたように行なった（ループら、５ｃｉｅｎｃｅ、２４９：１ ５５２　（１９９０））ｏ増殖している５Ｋ−Ｂｒ−３細胞を、数種類の濃度の 条件培地の存在下においてヨウ素化した抗ｅｒｂＢ−２抗体（４Ｄ５または６Ｅ ９）と−緒にインキュベートした。培地は、５Ｋ−Ｂｒ−３、ＭＣＦ−７、Ｈ８ ５７８Ｔ１ＭＤＡ　ＭＢ−４５３、ＢＴ−５４９、ＭＤＡ　ＭＢ−４６８および ＭＤＡ　ＭＢ−１５７胸部癌細胞並びに若干の非悪性および形質転換した胸部上 皮細胞に由来した（研究された細胞系は非悪性胸部上皮１８４細胞であって、不 死化１８４ＡＩＮ４細胞並びに癌遺伝子で形質転換した１８４ＡＩＮ４Ｔ　（Ｓ Ｖ−４０）　、１８４ＡＩＮ４Ｈ（ｒａｓ）、１８４ＡＩＮ４Ｍ　（ｍｙｃ）　 、１８４ＡＩＮ４ＴＨ（ＳＶ−４０，ｍｙｃ）および１８４ＡＩＮ４ＭＨ（ｍｙ ｃ、ｒａＳ）細胞を評価した。）。ＭＤＱ　ＭＢ−２３１からの条件培地を、こ れらの細胞がｇｐａｏを分泌することが知られていたので陽性の対照として用い た。検査された１５種類の培地の一つである５Ｋ−Ｂｒ−３細胞からのものだけ が、ｐ１８５ｅｒｂＢ−２結合に関して４Ｄ５と競合する能力を示した。

５Ｋ−Ｂｒ−３細胞はｅｒｂＢ−２リガンドを分泌すると考えられるので、本発 明の次の段階は、推定上のリガンドが、ｇｐａｏの分泌と一致すると考えられる ヘパリン結合性を示すかどうかを決定することであった。５Ｋ−Ｂｒ−３細胞か らの培地をヘパリンクロマトグラフィーによって処理した後に１　ｓ　ｓ　ｅ　 ｒ　ｂ　Ｂ　２結合活性は検出されなかったということは、ｇｐａｏが培地中に 存在しないということかまたは、５Ｋ−Ｂｒ−３細胞はｐｌｓ　ｓ　ｅ　ｒ　ｂ 　Ｂ　２細胞外ドメイン（Ｅ　ＣＤ）を培地中に放出するので、ＥＣＤがヘパリ ン結合性を妨げているかもしれないし若しくは細胞外ドメインに結合したカラム からを洗い落とされたかもしれないということを示唆した。

本発明の次の段階は、ｐ１８５８ｒｂ８−２ＥＣＤの妨げにならない精製方法ｒ ｂＢ−２ を開発することであった。組換えｐｌｓ５　細胞外ドメイン（Ｅ　ＣＤ）（ジエ ネテク・インコーホレーテッド（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）、ＣＡから入手 された）をポリアクリルアミド−ヒドラジドセファロースアフィニティークロマ トグラフィーマトリックスに結合させた（工ヴロミーズ（Ａｖｒｏｍｅａｓ）　 ら、５ｃａｎｄ、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、８ニア　（１９７８））。この細胞 外ドメインの分子量は約９４キロダルトンであった。

ヨウ素化した４Ｄ５抗体のカラムに対する結合を実証することによってその結合 を検査した。ＭＯＩ９３などの他の抗体を用いることもできる。５Ｋ−Ｂｒ−３ 細胞からの濃縮した条件培地をカラムに充填し、得られた物質の溶離を１．０Ｍ クエン酸を用いて４．０〜２．０のｐＨ範囲で段階的に行って、ｅｒｂＢ−２Ｅ ＣＤおよび推定上のリガンドを解離させた。４Ｄ５結合検定において画分のｐ１ ８５ｅｒｂ８−２結合性を検査した。

１回の精製により、３．０〜３．５の溶離ｐＨで７５キロダルトンの見掛は上均 −のポリペプチドを生成した。試料の均一性は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（レームリ（ Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）　Ｕ、　Ｋ、　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　＋６８０　（ １９７０））上において銀染色（モリシー（Ｍｏｒｉｓｓｅｙ）、Ｊ、Ｈ，、Ａ ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１７７：３０７　（１９８１））による分析によって確証さ れた（図１）。この調製試料が更に別の実験に用いるための源であった。

５Ｋ−Ｂｒ−３の条件培地のｐ）Ｉａ、Ｏ〜３．　５の溶離でＥＣＤ親和性カラ ムから得られた７５ｋＤａのポリペプチド（ｐ　７５）が実際にｅｒｂＢ−２オ ンコブロチインのリガンドであるということを確証するために、本発明者は２種 類の独立した検定を用いた。本発明者は、最初に４Ｄ５放射受容体検定を用いて 、（ｐＨ３，０〜３．　５で溶離された）ｐ７５が５Ｋ−Ｂｒ−３細胞中のｅ　 ｒｂＢ−２受容体に対して特異的に結合するが、他のクロマトグラフィー画分ま たはフロースルーからの物質はこのような活性を示さなかったということを確証 した（表１）。ヨウ素化した６Ｋ９抗体のｐ１８５ｅｒｂト２に対する結合はｐ ７５によって変更されなかったということは、溶離した物質がｐ１８５ｅｒｂＢ −２ＥＣＤではなかったということを示唆した。

表１ ｐ１８５”５Ｂ　”結合％　ＥＧＦＲ結合％対照　１００　１００ フロースルー　９９　９６ ｐＨ２９９９５ ｐＨ２，５９１９５ ｐＨ３９９５ ｐＨ３，５１８９９ ｐｉ−１，４６３９８ 表１，５Ｋ−Ｂｒ−３細胞の条件培地由来のクロマトグラフィー画分（ｐ　７５ ）のｐ１８５ｅｒｂＢ−２およびＥＧＦＲに対する結合。

５Ｋ−Ｂｒ−３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を２４ウエルプレート中の５％ Ｆ　ＣＳ　Ｉ　ＭＥＭ　（パイ、ｔ７／Ｌ、−ズ）中ニイれた（細胞１００，０ ００個／ウマトゲラフイーカラム中に充填した。フロースルーおよび１Ｍクエン 酸（ｐＨ勾配４〜２）で溶離した画分を集めた。中和（ｐＨ７，４）およびＰＢ Ｓにょる脱塩後、画分のｐ１８５ｅｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ結合活性を検査し た。ヨウ素化した４Ｄ５抗体ｔ−用いｒｓＫ−Ｂｒ−３ｍ胞１：おｋするｐ１８ ５　ｅｒｂ”　２結合性を評価し、そしてヨウ素化ＥＧＦを用いてＭＤＡ−ＭＢ −４６８細胞におけるＥＧＦＲ結合性を評価した。結果を対照（非処理）の結合 性の百分率として示す。各実験を三重反復で実施したが、いずれの場合にもＳＤ は１５％未膚であった。

ｇｐａｏはＥＧＦＲおよびｐ１８５ｅｒｂト２双方に対する共通のリガンドとし て識別されたので、本発明者は、ＭＤＡ　ＭＢ−４６８細胞およびヨウ素化ＥＧ Ｆを用いるＥＧＦＲ結合検定において５Ｋ−Ｂｒ−３の条件培地からの溶離画分 全部の活性を検査した。この検定において、対照として用いたＥＧＦおよびｇｐ ａｏは、用量依存性でヨウ素化ＥＧＦの結合性を変化させた。これに対して、５ Ｋ−Ｂｒ−３の条件培地由来の溶離画分のうちで活性を示したものはなく、ｐ７ ５がＥＧＦＲに対して結合しないということを示した（表１）。

ｐ７５はｅｒｂＢ−２癌遺伝子産物と相互作用するので、本発明者は、次に、ｐ ７５が　ｔ　ｓ　５ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ　２を活性化したかどうかを追及した。本発 明者は、ｅｒｂＢ−２オンコブロチインを過剰発現するが検出可能な量のＥＧＦ Ｒを発現ｔ、ないＭｐＡ　ＭＢ−４５３ヒ）胸部ｍｍ胞を用いて、ｐ１８５　ｅ 　ｒ　ｂ　Ｂ　２　ヲリン酸化するｐ７５の能力を研究した。最初に、本発明者 は、ウェスタンプロット分析において抗ホスホチロシン単りローン性抗体を用い て、ｐ７５がＭＤＡＭＢ−４５３細胞中のチロシンリン酸化を活性化したことを 確認した（トウビンＭＤＡ　ＭＢ−４５３細胞を［３２Ｐｉ］で標識し、そして ｐ１８５ｅｒｂＢ−２のＣ末端ドメインと反応するがＥＧＦＲとの交差反応性を 示さない多知−ン性抗体を用いてｐ１８５ｅｒｂＢ−２オンコブロチインを免疫 沈澱させることによって確証された（ハジャクら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、基４ニア１５９（１９８７））（図２Ｂ）。ＭＤＡ ＭＢ−４５３細胞をＥＧＦで処理した場合、リン酸化は観察されなかった。対照 実験において、リン酸化したＥＧＦＲは、ｇｐａｏ、ＥＧＦおよびＴＧＦαによ る処理後に抗ＥＧＦＲ抗体を用いてＭＤＡ　ＭＢ−４６８細胞から沈澱したが、 しかしながら、ｐ７５はこれらの細胞においてＥＧＦＨのリン酸化を誘導しなか った（図２Ｃ）。これらの観察は、ｐ７５とその受容体ｐ１８５ｅｒｂＢ−２と の独占的相互作用の仮説を支持した。

けるｐ７５の生物学的効果を試験した。ｐ７５は、過剰発現性細胞である５Ｋ− Ｂｒ−３、ＢＴ−４７４およびＭＤＡ　ＭＢ−４５３の細胞増殖を４ｎｇ／ｍｌ の濃度（ｐ７５ポリペプチドの濃度は４Ｄ５結合検定によって決定した）で７０ 〜８０％まで阻害した。ＥＧＦＲを過剰発現するＭＤＡ　ＭＢ−４６８細胞にお １．１で、またはｐ１８５ｅｒｂＢ−２若しくはＥＧＦＲを過剰発現しないＭＣ Ｆ−７細胞においては阻害が観察されなかった。対照として用いたｇｐａｏは、 ５Ｋ−Ｂｒ−３およびＭＤＡ　ＭＢ−４６８細胞の増殖を阻害した（図３）。足 場非依存性増殖検定において、ｐ７５は５Ｋ−Ｂｒ−３およびＭＤＡ　ＭＢ−４ ５３細胞の軟質寒天コロニー形成を６０〜７０％まで阻害した。

本発明者の最初の実験であるｐ７５は胸部癌細胞の増殖を阻害したので、本発明 者は、ｐ７５が阻害リガンドであったかまたはｐ７５の阻害機能がｅｒｂＢ−２ 受容体の過剰刺激の結果束じたと考えた。本発明者は、３．３ｐＭの極めて低用 量でのｐ７５　（０，２５ｎｇ／ｍりが５Ｋ−Ｂｒ−３に対して刺激増殖効果を 有することを観察した（図４）。等モル濃度でのｇｐａｏの増殖効果はｐ７５の それと同様であった（図Ａ）。更に別の対照としての１〜１１００ｎの濃度での ＥＧＦは５Ｋ−Ｂｒ−３細胞の増殖に対して有意の効果がなかった。ｐ７５で得 られた結果は阻害リガンドの可能性に反論した。細胞増殖に対する成長因子の用 量に関係した逆説的効果が文献で報告された。

低濃度のｇｐａｏは５Ｋ−Ｂｒ−３細胞の増殖を刺激したが、高濃度は増殖阻害 であった（ループら、Ｓｃｉ　ｅｎｃｅ、２４９　：１５５２　（１９９０）） 、ＥＧＦＲ過剰発現性胸部癌細胞ＭＤＡ　ＭＢ−４６８並びにＡ４３１癌細胞は 高用量のＥＧＦによって増殖阻害されるが、極めて低用量のＥＧＦによって刺激 される（カワモト（１（ａｗａｍｏ　ｔ　ｏ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２４９ニア７６１　（１９８４）；エニス（Ｅｎｎｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｅｎ ｄｏｃｒ、。

生理学的用量のニステロゲンによって増殖阻害されることが報告された（クシュ 性細胞外ドメインの相互作用を研究した。予想されたがもしれないように、５Ｋ −Ｂｒ−３細胞に対する可溶性ｐ１８５ｅｒｂト２ＥｃＤの添加はそれらの軟質 寒天コロニー形成を阻害した。このＥＣＤの阻害効果は、可溶性ドメインと細胞 性　１　ｓ　ｓ　ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ　２受容体との二量体化に依るかまたはそれら の増殖に奉賀的であり、したがって細胞増殖の阻害をもたらすｐ７５の結合およ び中和に依ることができる。ＥＣＤはｐ、８５ｅｒｂＢ−２を過剰発現する細胞 において独占的にコロニー形成を阻害した（図５）。ＭＤＡ　ＭＢ−４６８およ びＭＣＦ−７細胞おいて阻害は観察されなかった。ｅｒｂＢ−２ＥＣＤが５Ｋ− Ｂｒ−３細胞のコロニー形成を阻害した機序を理解するために、増殖刺激用量の ｐ７５をＥＣＤ処理した細胞に加えた。ＥＣＤの阻害効果は刺激性用量のｐ７５ の添加によって逆行し、複合体調節経路がｐ１８５ｅｒｂＢ−２に関して存在し うろことが示唆された（図５）。

ｋＤａの新規のポリペプチドを同定した。極めて高濃度のｅｒｂＢ−２を有する 細胞に対するｐ７５の効果は、他の既知のリガンドであるｇｐａｏの報告された 効果と同様であった。ｇｐａｏと対照的に、ｐ７５はｐ１８５ｅｒｂト２受容体 に特異的であると考えられる。更に、本発明者は、ｅｒｂＢ−２受容体を過剰発 現する細胞が、それらの増殖に必要とされるそのリガンドの一つを分泌すること もできるという証拠を提供しており、したがって、オートウリンループが暗示さ れる。本発明者は、このおよび他のｅｒｂＢ−２リガンドの操作が、ヒト新生物 の増殖に対する重要な生物学的効果を有する結果となりうると考える。

医学、免疫学、ハイブリドーマ技術、薬学および／または関連分野における技術 者に明らかである、本発明を実施する上記に記載した態様の変更は、下記の請求 の範囲の範囲内であることを意味する。

この明細書に記述された公開および特許出願は全て、本発明が関する当業者の技 術水準を示すものである。公開および特許出願は全て、それぞれの個々の公開ま たは特許出願が具体的に且つ別個に参考として包含されることを示すかのように 、ある程度まで参考として本明細書中に包含される。

前述の発明を、理解を明確にするための例示および実施例によっである程度詳細 に記載したが、ある種の変更および修正を請求の範囲の範囲内で実施することが できるということは明らかである。

浄書（内容に変更なし） ＊任旦晋軍 磁−τ口Ｃ 手続補正書 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９２１００３２９ ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　ジョージタウン・ユニバーシティ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｂ　８３１０−２Ｊ３３１５６６　９０１５−２Ｊ ３３１５７４　Ｄ　９０１５−２Ｊ Ｉ

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．ｅｒｂＢ−２受容体タンパク質（ｐ１８５ｅｒｂＢ−２）に対して結合しう るが表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して結合できない実質的に純粋なｅｒ ｂＢ−２リガンドまたはその機能的誘導体。
2. ２．前記のリガンドがｅｒｂＢ−２受容体発現性細胞系由来である請求項１に記 載の実質的に純粋なｅｒｂＢ−２リガンド。
3. ３．前記のリガンドがＳＫ−Ｂｒ−３由来である請求項２に記載の実質的に純粋 なｅｒｂＢ−２リガンド。
4. ４．前記のリガンドの分子量が約７５キロダルトンである請求項３に記載の実質 的に純粋なｅｒｂＢ−２リガンド。
5. ５．前記のリガンドがＰ１８５ｅｒｂＢ−２のリン酸化を誘導しうる請求項４に 記載の実質的に純粋なｅｒｂＢ−２リガンド。
6. ６．前記のリガンドが、組換えｅｒｂＢ−２リガンドを発現しうる宿主由来であ る請求項１に記載の実質的に純粋なｅｒｂＢ−２リガンド。
7. ７．前記のリガンドが腺癌細胞の増殖を阻害しうる請求項１に記載の実質的に純 粋なｅｒｂＢ−２リガンド。
8. ８．前記の腺癌細胞が、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺または唾液腺の腺 癌細胞から成る群より選択される請求項７に記載の実質的に純粋なｅｒｂＢ−２ リガンド。
9. ９．前記のリガンドが、分子量約７５キロダルトンであり、Ｐ１８５ｅｒｂＢ− ２のリン酸化を誘導しうるし、そして腺癌細胞の増殖を阻害しうる請求項１に記 載の実質的に純粋なｅｒｂＢ−２リガンド。
10. １０．治療薬に結合している請求項１に記載のｅｒｂＢ−２リガンド。
11. １１．前記の治療薬が、細胞毒性薬、毒素および同位体から成る群より選択され る請求項１０に記載のｅｒｂＢ−２リガンド。
12. １２．前記のリガンドが検出可能に標識されている請求項１に記載のｅｒｂＢ− ２リガンド。
13. １３．請求項１に記載のｅｒｂＢ−２リガンドをコードする遺伝子を含む組換え ＤＮＡ分子。
14. １４．請求項１３に記載の組換えＤＮＡ分子によって形質転換されている宿主細 胞。
15. １５．前記の宿主が真核性細胞である請求項１４に記載の宿主細胞。
16. １６．前記の宿主が哺乳動物細胞である請求項１５に記載の宿主細胞。
17. １７．請求項１に記載のｅｒｂＢ−２リガンドに対して結合しうる抗リガンド分 子。
18. １８．前記の抗リガンドが、抗体、抗体フラグメントおよび遮断ペプチドから成 る群より選択される請求項１７に記載の抗リガンド分子。
19. １９．前記の抗リガンドが検出可能に標識されている請求項１７に記載の抗リガ ンド分子。
20. ２０．前記の抗リガンドが治療薬に結合している請求項１７に記載の抗リガンド 分子。
21. ２１．前記の治療薬が、細胞毒性薬、毒素および同位体から成る群より選択され る請求項２０に記載の抗リガンド分子。
22. ２２．患者のｅｒｂＢ−２発現性腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該患 者に対して該細胞の増殖を阻害するのに十分な一定量の請求項１に記載のｃｒｂ Ｂ−２リガンドを投与することを含む上記の方法。
23. ２３．前記の細胞が、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺または唾液腺の腺癌 細胞である請求項２２に記載の方法。
24. ２４．前記のリガンドを前記の患者に対して一日に約１ｎｇ〜１ｇ投与すること を含む請求項２２に記載の方法。
25. ２５．患者のｃｒｂＢ−２発現性腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該患 者に対して該細胞の増殖を阻害するのに十分な一定量の請求項１０に記載のｅｒ ｂＢ−２リガンド結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を投与することを含む上記の方 法。
26. ２６．前記の細胞が、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺または唾液腺の腺癌 細胞である請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記のリガンド結合体を前記の患者に対して一日に約１ｎｇ〜１ｇ投与す ることを含む請求項２５に記載の方法。
28. ２８．患者のｅｒｂＢ−２発現性腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該患 者に対して該細胞の増殖を阻害するのに十分な一定量の請求項１７に記載の抗リ ガンド分子を投与することを含む上記の方法。
29. ２９．前記の細胞が、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺または唾液腺の腺癌 細胞である請求項２８に記載の方法。
30. ３０．前記の抗リガンドを前記の患者に対して一日に約１ｎｇ〜１ｇ投与するこ とを含む請求項２８に記載の方法。
31. ３１．患者のｅｒｂＢ−２発現性腺癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該患 者に対して該細胞の増殖を阻害するのに十分な一定量の請求項２０に記載の抗リ ガンド分子結合体を投与することを含む上記の方法。
32. ３２．前記の細胞が、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺または唾液腺の腺癌 細胞である請求項３１に記載の方法。
33. ３３．前記の抗リガンド分子結合体を前記の患者に対して一日に約１ｎｇ〜１ｇ 投与することを含む請求項３１に記載の方法。
34. ３４．患者においてＰ１８５ｅｒｂＢ−２を発現する細胞を検出する方法であっ て、 ａ．該患者由来の試料を検出可能に標識されたｅｒｂＢ−２リガンドと接触させ ；そして ｂ．該試料中の該ｅｒｂＢ−２リガンドの存在を検出することを含む上記の方法 。
35. ３５．前記の試料が、体組織、血液、尿、唾液、涙滴、血清、脳脊髄液および便 から成る群より選択される請求項３４に記載の方法。
36. ３６．患者においてＰ１８５ｅｒｂＢ−２を発現する細胞を検出する方法であっ て、 ａ．該患者に対して検出可能に標識されたｅｒｂＢ−２リガンドを投与し；そし て ｂ．全身のインビボ映像によって該細胞の存在を検出することを含む上記の方法 。
37. ３７．患者においてｅｒｂＢ−２リガンド発現性細胞の存在を検出する方法であ って、 ａ．該患者由来の試料を検出可能に標識された抗リガンド分子と接触させ；そし て ｂ．該試料中のｅｒｂＢ−２リガンドの存在を検出することを含む上記の方法。
38. ３８．前記の試料が、体組織、血液、尿、唾液、涙滴、血清、脳脊髄液および便 から成る群より選択される請求項３７に記載の方法。
39. ３９．患者においてｅｒｂＢ−２リガンド発現性細胞の存在を検出する方法であ って、 ａ．該患者に対して検出可能に標識された抗リガンド分子を投与し；そしてｂ． 全身のインビボ映像によって該細胞の存在を検出することを含む上記の方法。
40. ４０．前記のリガンドが腺癌細胞の増殖を刺激しうる請求項１に記載の実質的に 純粋なｅｒｂＢ−２リガンド。
41. ４１．前記の腺癌細胞が、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺および唾液腺の 腺癌細胞から成る群より選択される請求項４０に記載の実質的に純粋なｅｒｂＢ −２リガンド。
42. ４２．腺癌細胞を、該細胞の増殖を刺激するのに十分な一定量の請求項４０に記 載のｅｒｂＢ−２リガンドで処理することを含む、該細胞の増殖を刺激する方法 。
43. ４３．前記の細胞が、胸部、肺、卵巣、胃、甲状腺、前立腺または唾液腺の腺癌 細胞である請求項４２に記載の方法。