ES2168785T5 - Absorcion de minerales por las celulas intestinales. - Google Patents

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Abstract

Empleo de los lactobacilli en la preparación de una composición entérica nutritiva, para facilitar o aumentar la absorción de minerales por un mamífero.

Description

Absorción de minerales por las células intestinales.
Esta invención se refiere al empleo de microorganismos Lactobacilli probióticos en la preparación de una composición entérica, para facilitar o aumentar la absorción por los mamíferos, de los minerales de la dieta general.
Los minerales son elementos clave en los principales procesos fisiológicos. El calcio es, por ejemplo, de vital importancia para la formación de los huesos y dientes, la contracción muscular y la síntesis de hormonas. El calcio es también un mensajero secundario esencial en la mayor parte de fenómenos de activación celular.
Los minerales, de los cuales la dieta es la fuente principal, son asimilados por el cuerpo atravesando la mucosa intestinal para pasar a continuación al interior de la corriente sanguínea. El grado de asimilación (o de absorción) de los minerales por el cuerpo, depende de hecho tanto de su solubilidad en el medio intestinal como de la capacidad de las células intestinales para asimilarlos y transferirlos a la corriente sanguínea (R. Wasserman y col., Mineral Absorption in the Monogastric GI Trac. Advances in Experimental Medicine and Biology ("Absorción de los minerales en el tracto GI. Avances en medicina y biología experimental"), 249, 45-65. Plenum Press, N.Y. 1989).
La situación, la eficiencia y los mecanismos de la absorción del calcio a lo largo del intestino, han sido estudiados en ratas y pollos durante muchos años (Bronner F., J. Nutr., 122, 641-643, 1992; Schachter D., Am. J. Physiol., 196, 357-362 (1959). Por razones obvias éticas y técnicas, estos estudios han sido limitados en el hombre (Hylander E. y col., Scand. J. Gastroenterol., 25, 705, (1990) y solamente se han efectuado unos pocos estudios in vitro (Elsherydah A., y col., gastroenterology, 109, 876, 1995; Feher J. J., Am. J. Physiol., 244, C303, 1983: Feher J. J., Cell Calcium, 10, 189, 1989).
Uno de los aspectos más ampliamente estudiados de la absorción mineral es la biodisponibilidad de los minerales en función de la composición de la dieta diaria (Bronner F., J. Nutr., 123, 797, (1993). Sin embargo, muchos minerales que son altamente biodisponibles son también inestables y son inadecuados para el empleo en la dieta. Además, simplemente suplementando la dieta con mayores cantidades de minerales a menudo tiene un efecto negativo sobre las propiedades organolépticas de la dieta.
Una posible solución al problema es la de facilitar o aumentar la absorción de los minerales de la dieta. Sin embargo ha habido pocos estudios sobre los métodos para facilitar o incrementar la absorción de minerales a partir de la dieta y los resultados no han sido consecuentes.
Rasic y col., han informado que los minerales contenidos en los productos lácteos son mejor asimilados cuando estos productos están fermentados. Este efecto se atribuye a la presencia de ácidos en los productos lácteos fermentados (XP002052238: Fermented Fresh Milk Product ("Productos fermentados de leche fresca"), volumen 1, p 114-115, 1978).
Más recientemente, Yaeshima y col., han mostrado también un aumento en la absorción del calcio en ratas a partir de una dieta de suero reforzado con calcio, cuando se consume una combinación de oligosacáridos y Bifidobacteria (XP002052237): Bulletin of the International Dairy Fermentation ("Boletín de la fermentación láctea internacional"), No. 313, 1996).
Sin embargo, Kot y col., han informado que el Lactobacillus acidophilus internaliza de forma natural el Fe^{2+}, y lo oxida a Fe^{3+}; el cual es una forma insoluble que es más difícil de asimilar (J. Agric. Food Chem., 43, 1276-1282, 1995).
Por lo tanto, existe una necesidad de disponer de un medio para facilitar o aumentar la absorción de los minerales presentes en la dieta.
En consecuencia, esta invención proporciona el empleo de lactobacilli probióticos de acuerdo con la reivindica-
ción 1.
Se ha descubierto sorprendentemente mediante el empleo de un modelo in vitro, que los lactobacilli probióticos son capaces de facilitar o aumentar directamente la absorción de minerales por ejemplo, el calcio, magnesio y/o zinc, mediante las células intestinales humanas. Sin pretender unirnos a la teoría, se cree que esto está unido a la inducción de la acidificación del microambiente alrededor de las células intestinales y las bacterias en contacto con las células intestinales. Tanto las bacterias como las células intestinales pueden participar en la inducción de la acidificación. Esta acidificación localizada podría así jugar un papel activo en la solubilidad de minerales y por lo tanto en la capacidad del cuerpo para asimilarlos.
Se describen ahora versiones de la invención a título de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos en los cuales:
La figura 1, representa la absorción basal del calcio mediante las células Caco-2 intestinales en ausencia de lactobacilli;
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La figura 2, representa la influencia de aproximadamente 6,7 x 10^{7} cfu/ml de varias cepas de lactobacilli sobre la absorción del calcio mediante las células intestinales Caco-2;
La figura 3 representa la influencia de aproximadamente 3,4 x 10^{8} cfu/ml de varias cepas de lactobacilli sobre la absorción del calcio mediante las células intestinales Caco-2.
La invención se refiere al empleo de lactobacilli probióticos para la preparación de una composición nutritiva para la administración entérica para facilitar o aumentar la absorción de minerales presentes en una dieta diaria. Los minerales son el calcio, magnesio, y/o zinc. La ingestión de lactobacilli probióticos aumenta la biodisponibilidad de los minerales, es decir hace que los minerales que a menudo no son muy solubles en el intestino, sean más accesibles a las células intestinales.
Puede emplearse cualquier cepa de lactobacilli probiótico de calidad para alimentación. Por ejemplo, pueden utilizarse los siguientes lactobacilli probióticos: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorous, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri y Lactobacillus johnsonii; Lactobacillus paracasei; Lactobacillus reuterii; Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum; Lactobacillus plantarum; Lactobacillus casei especialmente L. casei subsp. casei y L. casei subsp. rhamnosus; Lactobacillus delbruckii especialmente L. delbruckii subsp. lactis, L. delbruckii subsp. helveticus y L. delbruckii subsp. bulgaricus: y Leuconostoc mesenteroides especialmente L. mesenteroides subsp. cremoris, por ejemplo (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology ("Manual de Bergey de Bacteriología sistemática"), vol. 2, 1986, Fujisawa y col., Int. Syst. Bact., 42, 487-491, 1992).
Los lactobacilli probióticos pueden ser capaces de adherirse a las células intestinales pero esto no es necesario. Sin embargo, los lactobacilli probióticos son tales que, de preferencia, por lo menos 50 bacterias, en particular por lo menos 80 bacterias, son capaces de adherirse in vitro a 100 células intestinales. Para seleccionar un tal tipo adherente de bacterias, se disemina un cultivo de bacterias sobre un cultivo confluente de una línea inmortalizada de células epiteliales del intestino (EP 0802257), se lava el cultivo confluente, y se mide el número de bacterias adheridas a las vellosidades de la línea.
Algunas cepas son de hecho capaces de adherirse a las células intestinales humanas, de excluir las bacterias patogénicas que están sobre las células intestinales humanas, y/o actuar sobre el sistema inmunológico humano, permitiendo que reaccione más fuertemente a la agresión externa (capacidad de inmunomodulación), por ejemplo, aumentando la capacidad de gagocitosis de los granulocitos derivados de la sangre humana (J. of Dairy Science, 78, 491-197, 1995; la capacidad de inmunomodulación de la cepa La-1, la cual fue depositada por Nestec S.A. según el tratado de Budapest en la Colección Nacional de cultivo de Microorganismos (CNCM), calle del Dr. Roux 25, 75724 Paris, 30 de Junio de 1992, donde recibió el número de depósito CNCM I-1225). Esta cepa se describe en la patente EP 0577904.
A título de ejemplo, es posible emplear la cepa probiótica Lactobacillus acidophilus CNCM I-1225. Esta cepa se reclasificó recientemente entre las bacterias Lactobacillus johnsonii, subsecuentemente con la nueva taxonomía propuesta por Fujisawa y col., la cual tiene ahora autoridad en el campo de la taxonomía de los lactobacilos acidofílicos (Int. J. Syst. Bact., 42, 487-791, 1992). Otras bacterias probióticas están también disponibles, como las descritas en EP 0199535 (Gorbach y col.), US 5296221 (Mitsuoka y col.), US 556785 (Instituto Pasteur) o US 5591428 (Probi AB), por ejemplo.
Las composiciones nutritivas comprenden de preferencia una cantidad suficiente de lactobacilli probióticos vivos para facilitar la absorción de minerales por las células intestinales, por ejemplo como mínimo 10^{6} cfu/ml, en particular 10^{7}-10^{11} cfu/ml, de preferencia 10^{8}- 10^{11} cfu/ml ("cfu" significa "colony forming unit" ("unidad formadora de colonias").
La composición nutritiva puede contener también otras bacterias si se desea: por ejemplo otras bacterias probióticas.
La composición nutritiva puede también incluir una fuente de proteínas adecuada: por ejemplo una fuente de proteínas animal o vegetal. Son fuentes adecuadas de proteínas, las proteínas de la leche, proteínas de soja, proteínas de arroz, proteínas del trigo, proteínas del sorgo y similares. Las proteínas pueden estar en forma intacta o bien hidrolizadas.
La composición nutritiva puede también incluir una fuente adecuada de hidratos de carbono; por ejemplo sucrosa, fructosa, glucosa, maltodextrina y similares.
La composición nutritiva puede contener también una fuente adecuada de lípidos: por ejemplo una fuente de lípidos adecuada animal o vegetal. Fuentes de lípidos adecuadas incluyen las grasas de la leche, aceite de girasol, aceite de colza, aceite de oliva, aceite de cártamo y similares.
La composición nutritiva puede también reforzarse con minerales y vitaminas. Es especialmente preferido reforzar la composición nutritiva con calcio.
Las composiciones nutritivas pueden prepararse en forma de composiciones alimenticias proyectadas para el consumo humano o animal. Las composiciones alimenticias adecuadas pueden presentarse en forma de líquidos, polvos y sólidos.
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La composición nutritiva puede ser fermentada para obtener una cantidad suficiente de lactobacilli probiótico. Las composiciones fermentadas basadas sobre la leche son así particularmente adecuadas. El término "leche" se aplica no solamente a las leches animales sino también a lo que corrientemente se llaman leches vegetales, es decir, un extracto de materiales vegetales tratados o sin tratar tales como legumbres (soja, garbanzos, lentejas y similares) o semillas oleaginosas (colza, soja, sésamo, algodón y similares), el cual extracto contiene proteínas en solución o en suspensión coloidal, las cuales son coagulables mediante una acción química, mediante fermentación ácida y/o por el calos. Ha sido posible someter a estas leches vegetales a tratamientos térmicos similares a los de las leches animales. Ha sido también posible someterlas a tratamientos que les son específicos, tales como la decoloración, desodorización y tratamiento para la supresión de sabores indeseables. Finalmente, la palabra "leche" designa mezclas de leches animales y leches vegetales.
Es también posible añadir, mezclar o recubrir la composición nutritiva durante su preparación, con una cantidad apropiada de un cultivo de lactobacilli probiótico en forma de líquido, concentrado, seco o encapsulado, de acuerdo con lo necesario.
Se ha descubierto que la microencapsulación de los lactobacilli probióticos tiene ventajas terapéuticas. Primeramente, la microencapsulación aumenta significativamente la supervivencia de los lactobacilli probióticos y por lo tanto el número de lactobacilli probióticos que llegan al intestino. Aún en forma más importante, los lactobacilli probióticos se liberan gradualmente en el intestino, lo cual permite una acción prolongada de los lactobacilli probióticos sobre la absorción de minerales por las células intestinales.
De preferencia, para encapsular los lactobacilli probióticos, se liofilizan o se secan por pulverización dichos lactobacilli probióticos (EP 0818529), y se incorporan en un gel, que consiste, por ejemplo, en un ácido graso solidificado, un alginato de sodio, hidroxipropil-metilcelulosa polimerizada o polivinilpirrolidona polimerizada. Para ello se incorporan como referencia las indicaciones dadas en la patente FR 2.443.247.
Las composiciones nutritivas no necesitan contener hidratos de carbono necesariamente para activar la fermentación mediante los lactobacilli probióticos en el medio intestinal. Por el contrario, la más fácil absorción de los minerales es independiente de la actividad fermentativa de los lactobacilli probióticos, pero más bien parece resultar del contacto directo entre los lactobacilli y las células intestinales. Se cree que induce la acidificación del microambiente, lo cual produce por lo tanto una mejor solubilización de los minerales.
Sin embargo, se desea conseguir la renovación o la multiplicación específica de los lactobacilli probióticos en el medio intestinal de forma que se prolongue el efecto de una más fácil absorción de los minerales. Esto puede lograrse añadiendo fibras a la composición nutritiva, las cuales facilitan la multiplicación específica de los lactobacilli probióticos en el medio intestinal. Estas fibras son solubles y fermentables.
Estas fibras pueden seleccionarse de, por ejemplo, pectinas vegetales, chito-, fructo-, gentio-, galacto-, isomalto-, mano- o xilo-oligosacáridos o oligosacáridos de la soja, por ejemplo (Playne y col., Bulletin de IDF 313, grupo B42, sesión anual de Septiembre 95, Viena).
Las pectinas preferidas son polímeros de ácido \alpha-1,4-D-galacturónico con un peso molecular del orden de 10 a 400 kDa, los cuales pueden purificarse a partir de zanahorias o tomates, por ejemplo (JP 60164432). Los galactooligosacáridos preferidos comprenden un grupo sacárido que consiste de 2 a 5 unidades repetidas con la estructura [-\alpha-D-Glu-(1\rightarrow4)-\beta-D-Gal-(1\rightarrow6)-] (Yakult Honsa Co., Japón). Los fructo-oligosacáridos preferidos son las inulin-oligofructosas extraídas de la chicoria que pueden comprender por ejemplo, de 1 a 9 unidades repetitivas de la estructura [-\beta-D-Fru-(1\rightarrow2)-\beta-D-Fru-(1\rightarrow2)-] (WO94/12541; Raffinerie Tirlemontoise S.A., Bélgica), o bien oligo-sacáridos sintetizados de unidades de sucrosa que pueden comprender, por ejemplo, una porción de sacárido consistente en 2 a 9 unidades repetitivas de estructura [-\alpha-D-Glu-(1\rightarrow2)-\beta-D-Fru-(1\rightarrow2)-] (Meiji Seika Kasiha Co., Japón). Los malto-oligosacáridos preferidos comprenden un grupo sacárido consistente en 2 a 7n unidades repetitivas de estructura [-\alpha-D-Gal-(1\rightarrow4)-] (Nihon Shokuhin Kako Co., Japón). Las isomaltosas preferidas comprenden un grupo sacárido consistente en 2 a 6 unidades repetitivas de estructura [-\alpha-D-Glu-(1\rightarrow6)-] (Showa Sangyo Co., Japón). Los gentiooligosacáridos preferidos comprenden un grupo sacárido consistente en 2 a 5 unidades repetitivas de estructura [-\beta-D-Glu-(1\rightarrow6)-] (Nihon Shokuhin Kako Co., Japón). Finalmente, los xilo-oligosacáridos preferidos comprenden un grupo sacárido consistente en 2 a 9 unidades repetitivas, de estructura [-\beta-xil-(1\rightarrow4)-] (Suntory Co., Japón), por ejemplo.
La cantidad de fibras de la composición nutritiva depende de su capacidad para promocionar el desarrollo de lactobacilli probióticos. Como fórmula general, la composición nutritiva puede contener desde 1 hasta el 50% de tales fibras (en peso, relativo al de materia seca). La concentración de lactobacilli probiótico puede ser por lo menos 10^{5} CFU de lactobacilli probióticos por g de fibras, de preferencia 10^{4} a 10^{7} CFU/g de fibras.
Otra ventaja proporcionada por las fibras consiste en el hecho de que el tránsito intestinal se retrasa a causa de las fibras. Este es particularmente el caso si la cantidad de fibras es grande, es decir, del orden de 20-50% relativo al peso de la composición. Puesto que el lactobacilli probiótico es gradualmente eliminado por la acción del tránsito intestinal, es posible de esta manera, prolongar la acción beneficiosa del lactobacilli probiótico sobre la absorción de minerales por el intestino.
\newpage
Las composiciones nutritivas pueden estar en forma de cualquier alimento adecuado administrado entéricamente. Por ejemplo, la composición nutritiva puede tomar la forma de una leche fermentada (EP 0577904), para niños (EP 0827697, un queso fresco (PCT/EP 97/06947), un queso maduro, un helado (WO 98/09535), una galleta rellena de nata (EP 704164; EP 666031), una salchicha seca y/o un paté (EP 689769).
Las composiciones nutritivas pueden estar también en una forma adecuada para las personas que no puede tolerar los productos lácteos. Estas composiciones nutritivas no contendrán derivados lácteos alergénicos. Por ejemplo para niños que son alérgicos a las proteínas de la leche, la composición nutritiva puede ser formulada para contener derivados lácteos hipoalergénicos. Estos derivados lácteos pueden estar de acuerdo con la norma europea 96/4/EC que especifica que en una leche hipoalergénica, las proteínas alergénicas deben ser inmunológicamente por lo menos 100 veces menos detectables que en una leche no hidrolizada (Off. J. Europ. Comm. NoL49/12, anexo punto 5.a. 1996: Fritsche y col., Int. Arch. Aller. y Appl. Imm., 93, 289, 293, 1990).
Las composiciones nutritivas son particularmente adecuadas para el tratamiento o profilaxis de personas que tienen deficiencias minerales, o para compensar las deficiencias fisiológicas debidas a una dieta baja en minerales, o para satisfacer los importantes requerimientos fisiológicos de minerales en los niños, mujeres embarazadas, mujeres que dan el pecho a sus hijos, y personas ancianas.
Esta invención se describe ahora además por medio de ejemplos específicos. Los porcentajes están dados en peso a no ser que se indique otra cosa. Estos ejemplos se dan a título de ilustración solamente y de ninguna manera constituyen una limitación a la invención.
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Ejemplo 1
- Materiales: Se obtiene el ^{45}CaCl_{2} de Amersham, el amarillo Lucifer de Sigma, el colágeno I de Centrix Pharmaceuticals, PBS, HEPES y los componentes del medio de cultivo celular de Gibco, y los soportes de cultivo de Falcon.
- Cultivos de células: La línea celular humana Caco-2, aislada de un adenocarcinoma de colon, se obtiene de American Type Culture Collection (pasaje 41). Las células se colocan en cultivo en una cantidad de 4 x 10^{4} células/cm^{2} en DMEM conteniendo 4,5 g/litro de glucosa, 20% de suero de feto de ternera térmicamente inactivado, 1 mg/ml de fungizone, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 200 \mug/ml de gentamicina y 1% de aminoácidos no esenciales. Las células se tripsinizan regularmente y se colocan en cultivo de nuevo a 1:20. Las células empleadas en los experimentos de transporte de calcio son colocadas en cultivo a 1 x 10^{6} células/cm^{2} en insertos permeables previamente recubiertos con una capa de colágeno I a 50 \mug/ml. En todos los casos, las células se mantienen en una incubadora con un 10% de CO_{2}/90% de aire a 37ºC y el medio se reemplaza cada dos días.
- Viabilidad de las células Caco-2: con el fin de excluir la posibilidad de que la potenciación de la absorción del calcio por las células intestinales en presencia de lactobacilli, se deba al daño celular, se empleó una porción de cada muestra que se utiliza para el ensayo del calcio, para un ensayo de la actividad hexosaminidasa (Landegren y col., J. Immunol. Meted. 67, 379-378, 1984). Este ensayo colorimétrico hace posible cuantificar la lisis celular y/o la muerte mediante la medición de la actividad hexosaminidasa liberada en el sobrenadante a partir del citosol de las células dañadas. Los resultados muestran que en todos los experimentos, la actividad hexosaminidasa es equivalente en presencia de lactobacilli.
- Permeabilidad del césped celular: La integridad del césped formado por las células Caco-2 al final de su crecimiento y de su diferenciación se evalúa mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) empleando un voltímetro/ohmímetro Millicel-ERS. Los experimentos de absorción del calcio se efectúan cuando esta resistencia alcanza por lo menos 700 ohmios x cm^{2}. La permeabilidad del césped celular durante los experimentos de absorción del calcio se evalúa mediante la medición del nivel de difusión (en %) del amarillo Lucifer, una molécula que no atraviesa la membrana celular.
- Transporte del calcio: Las células Caco-2 se cultivan sobre insertos durante 3 a 5 semanas. El día del experimento, el césped celular se lava dos veces en PBS y a continuación el compartimiento del fondo del inserto que incorpora la serosa (polo basolateral de las células) recibe 2,5 ml de tampón de carga (140 mM de NaCl, 5,8 mM de KCl, 0,34 mM de NaH_{2}PO_{4}, 0,44 mM de KH_{2}PO_{4}, 0,8 mM de MgSO_{4}, 20 mM de HEPES, 4 mM de glutamina, 25 mM de glucosa, pH 7,4), suplementado con 2,5 mM de CaCl_{2}, mientras que el compartimiento superior del inserto que incorpora el lumen intestinal (polo apical de las células), recibe 1,5 ml del tampón de carga, suplementado con 10 mM de CaCl_{2} y trazas de ^{45}CaCl_{2} y amarillo Lucifer. Los insertos se colocan a continuación a 37ºC y se retiran 50 \mul de muestra de los compartimentos del fondo y superior, a intervalos regulares.
La radioactividad contenida en estas muestras se evalúa mediante contaje del centelleo líquido, y hace posible el extrapolar sobre la cantidad de CaCl_{2} frío absorbido. El transporte basal de calcio se expresa como n moles de calcio transportado al compartimiento del fondo del inserto. La difusión del amarillo Lucifer detectada por el espectrofluorímetro en el compartimiento del fondo está expresado en % de la cantidad introducida en el compartimiento superior.
- Influencia de los lactobacilli : Las cepas Lactobacillus johnsonii LaI (CNCM 1-1225), La17, La22, La31; Lactobacillus acidophilus La10, La18, La31: Lactobacillus bulgaricus Lfi5, YL8: Lactobacillus paracasei ST11: Lactobacillus gasseri LGA7: Lactobacillus reuteri LR7 y Streptococcus termophilus Sfi20, YS4 (Nestec collection, Lausanne, Suiza), se colocan en cultivo en condiciones anaeróbicas en caldo MRS para Lactobacillus o M17 para Streptococcus durante dos veces 24 horas, se lavan en PBS y se resuspenden en tampón de carga antes de ser introducidas en el compartimiento superior de los insertos. El ratio Caco-2:bacterias es a continuación 1:100 de acuerdo con los ensayos (6,7 x 10^{7} ó 3,4 x 10^{8} cfu/ml en el compartimiento superior de los insertos, para los ensayos presentados en las figuras 2 y 3). La absorción del calcio se evalúa de acuerdo con el protocolo mencionado más arriba.
- Resultados del transporte basal del calcio: se estableció en los insertos un gradiente de calcio, mediante la introducción de 2,5 mM de CaCl_{2} en el compartimiento del fondo, el cual corresponda la concentración normal de plasma humano, y arbitrariamente 10 mM de CaCl_{2} en el compartimiento superior, lo cual correspondería a un contenido en calcio de una dieta alimenticia. Como se muestra por los resultados de un experimento representativo ilustrado por la figura 1, la absorción basal de calcio por las células caco-2 aumenta con el tiempo para alcanzar hasta 600 n moles/inserto, abarcadas aproximadamente 3 x 10^{6} células después de 4 horas. Como una comprobación de la integridad del césped celular durante el experimento, se midió la difusión del amarillo Lucifer que resultó ser inferior al 2%.
- Medida de la influencia de los lactobacilli : en las figuras 2 y 3, la absorción de calcio por las células Caco-2 aumentan significativamente en presencia de las cepas adherentes La1 y La22 del Lactobacillus johnsonii, en presencia de las cepas no adherentes La10 y La18 del Lactobacillus acidophilus y en presencia de las cepas L. paracasei (ST11), L. gasseri (LGA7) y L. reuterii (KR7).
La capacidad de las bacterias de adherirse a las células intestinales no parece por lo tanto ser correlativa directamente con su capacidad de aumentar la absorción del calcio mediante estas mismas células. En todos estos experimentos la difusión del amarillo Lucifer se ha modulado de forma similar pero permanece insignificante.
Se observa también una disminución del pH del compartimiento superior de los insertos, cuando las células Caco-2 están en presencia de lactobacilli, independientemente de la cepa, excepto con la cepa Sfi20 (tabla 1). No existe por lo tanto ninguna correlación entre el aumento de la absorción del calcio y la disminución del pH. Sin embargo, ciertas cepas bacterianas capaces de aumentar la absorción del calcio no son capaces de acidificar el medio experimental en ausencia de Caco-2. Esto significa que la acidificación en presencia de Caco-2 y de bacterias requiere una colaboración entre los dos tipos de organismos y podría ser debido a las células Caco-2.
TABLA 1 Influencia de los lactobacilli sobre el pH del medio experimental en ausencia o en presencia de células caco-2
1
Ejemplo 2
Se efectuaron ensayos similares a los efectuados en el ejemplo 1 para determinar la influencia de los lactobacilli sobre la absorción del calcio mediante las células intestinales en presencia de inulina marcada (^{3}H-inulina, Amersham: fibra prebiótica trazadora). Los resultados confirman que los lactobacilli probióticos aumentan in vitro la absorción de minerales mediante las células intestinales.
Ejemplo 3
Se efectuaron ensayos similares a los efectuados en el ejemplo 1 con el fin de determinar la influencia de los lactobacilli sobre la absorción del magnesio, hierro y zinc mediante las células intestinales. Los resultados confirman que los lactobacilli probióticos aumentan in vitro la absorción de minerales mediante las células intestinales.
Ejemplo 4
Encapsulación de las bacterias de ácido láctico
En un depósito de 100 litros, se preparan 80 litros de medio de cultivo con la siguiente composición en %:
3
La inoculación se efectúa con 1 litro de un cultivo de 20 horas del Lactobacillus johnsonii La1 (CNCM I-1225). El medio se incuba durante 12 horas a 30ºC. El caldo de cultivo se centrifuga y se retiran 240 g de células. Se diluyen en 250 ml de leche desnatada suplementada con 7% de lactosa. La mezcla se congela empleando nitrógeno líquido. El liofilizado se efectúa a 40ºC durante la noche. Se prepara una dispersión del 5% del polvo obtenido, en una grasa vegetal hidrogenada que tiene un punto de fusión de 42ºC y se liquida a 45ºC. La dispersión se inyecta a 45ºC a la presión de 4 bars, al mismo tiempo que nitrógeno líquido, en una cantidad de 1 parte de dispersión por 5 partes de nitrógeno, en la parte superior de un cilindro vertical de 1,5 m de diámetro y 10 m de alto. Se coloca un recipiente en el fondo del cilindro el cual contiene nitrógeno líquido en el cual se recogen las microperlas que contienen las bacterias cuyo diámetro varía entre 0,1 y 0,5 m. Las microperlas se colocan a continuación en un lecho fluidizado y se pulveriza una solución alcohólica conteniendo 8% de "zein" sobre el lecho, en una cantidad tal que la capa de "zein" formada alrededor de las microperlas represente un 5% de su peso.
Las microperlas se incorporan a continuación en una composición alimenticia prevista para facilitar la absorción de minerales por las células intestinales.
Ejemplo 5
Se prepara una base concentrada para helado, mezclando a 60-65ºC durante 20 minutos aproximadamente 11% de ácido láctico, 8,8% de sólidos de leche (sólidos no grasos), 25% de sucrosa, 5% de jarabe de glucosa y 0,6% de Emulstab® SE30. La base se homogeneiza a 72-75ºC y a 210 bars (2 etapas a 210/50 bars), se pasteuriza a 85ºC durante 22 segundos (pasteurizador APV, Francia, Evreux, 400 litros/hora), se enfría a 4ºC y 40% de leche acidificada por Lactobacillus johnsonii La-1 (5 x 10^{8} cfu/ml) y se añaden cepas Bifidobacterium longum Bi16 (3 x 10^{8} cfu/ml) a la misma. La composición de esta base concentrada se detalla en la tabla a continuación.
4 
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la maduración de la crema durante 12 horas a 5ºC, se congela hasta un exceso del 95% en volumen (congelador Crepaco, Francia, Evreux: 160 litros de producto/hora).
Se prepara una masa de galleta que contiene 10% de fructo-oligosacárido Raftilose® L30 (Raffinerie Tirle-montoise S.A. BE), de acuerdo con la receta detallada en la tabla que sigue a continuación. Después de cocer, la galleta se conforma convencionalmente en un cono. Después de enfriar, se recubre el interior de los conos por pulverización con una película de grasa y a continuación, se llenan los conos con el helado batido descrito más arriba. Para un cono de galleta de 11,5 g, se emplean, 130 ml de helado batido (aproximadamente 65 g) y 5 g de chocolate (pulverizando encima de la nata).
6
De esta forma se proporciona 1,1 g de fibras y aproximadamente 10^{8} cfu/g de lactobacilli por cornete de helado. Las fibras, al promover el desarrollo específico de los lactobacilli en el tracto intestinal, promueven así la asimilación de minerales.

Claims (7)

1. Empleo de los lactobacilli probióticos en la preparación de una composición entérica nutritiva, para el tratamiento o profilaxis de deficiencias en calcio, magnesio y/o zinc.
2. Empleo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el lactobacilli es la bacteria Lactobacillus que es capaz de adherirse a las células intestinales.
3. Empleo de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual el lactobacilli es el Lactobacillus johnsonii cepa CNCM I-1225.
4. Empleo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la composición entérica nutritiva contiene de 10^{7} a 10^{11} cfu de lactobacilli.
5. Empleo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la composición entérica nutritiva contiene proteínas de la leche.
6. Empleo de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual la composición entérica nutritiva es una fórmula para niños que comprende un hidrolizado hipo-alergénico de proteína de leche.
7. Empleo de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la composición entérica nutritiva comprende además, fibras prebióticas.
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