ES2080809T4 - Receptores de factor de necrosis tumoral alfa y beta - Google Patents

Abstract

SE REVELAN PROTEINAS RECEPTORAS DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL, DNAS Y VECTORES DE EXPRESION QUE CODIFICAN LOS RECEPTORES TNF, Y PROCESOS PARA LA PRODUCCION DE RECEPTORES TNF COMO PRODUCTOS DE CULTIVO DE CELDAS RECOMBINANTES

Description

Receptores de factor de necrosis tumoral alfa y beta.

Antecedentes de la invenci´on

La presente invenci´on se refiere en general a receptores de citoquinas y, m´as espec´ıficamente, a receptores de factores de necrosis tumoral.

El factor de necrosis tumoral α (TNFα,tambi´en conocido como caquectina) y el factor de necrosis tumoral β (TNFβ,tambi´en conocido como linfotoxina) son prote´ınas secretoras end´ogenas hom´ologas de mam´ıfero capaces de inducir una amplia variedad de efectos sobre un gran n´umero de tipos de c´elulas. Las grandes similitudes en las caracter´ısticas estructurales y funcionales de estas dos citoquinas han dado como resultado su descripci´on colectiva como “TNF”. Se han aislado clones de cDNA complementario que codifican TNFα (Pennica y otros, Nature 312:724, 1984) y TNFβ (Gray y otros, Nature 312:721, 1984), permitiendo mayor caracterizaci´on estructural y biol´ogica del TNF.

Las prote´ınas de TNF inician su efecto biol´ogico sobre las c´elulas uni´endose a prote´ınas receptoras de TNF (TNF-R) espec´ıficas expresadas sobre la membrana plasm´atica de una c´elula sensible a TNF. Se observ´o en primer lugar que el TNFα yel TNFβ se un´ıan a un receptor com´un en la l´ınea de c´elulas de carcinoma cervical humano ME-180 (Aggarwal y otros, Nature 318:665, 1985). Las estimaciones del tama˜no de los TNF-R determinadas por estudios de marcaje por afinidad variaban de 54 a 175 kDa (Creasey y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3293, 1987; Stauber y otros, J. Biol. Chem. 263:19098, 1988; Hohmann y otros, J. Biol. Chem. 264:14927, 1989). Aunque la relaci´on entre estos TNF-Rs de masa molecular diferente no est´a clara, Hohmann y otros (J. Biol. Chem. 264:14927, 1989) daban cuenta de que al menos existen dos receptores de la superficie celular diferentes para TNF sobre tipos de c´elulas diferentes. Estos receptores tienen una masa molecular aparente de aproximadamente 80 kDa y de aproximadamente 55-60 kDa, respectivamente. Ninguna de las publicaciones anteriores, sin embargo, daba cuenta de la purificaci´on hasta homogeneidad de receptores de TNF de la superfie celular.

Adem´as de los receptores de la superficie celular para TNF, tambi´en se han identificado prote´ınas solubles de orina humana capaces de unirse a TNF (Peetre y otros, Eur. J. Haematol. 41:414, 1988; Seckinger y otros, J. Exp. Med. 167:1511, 1988; Seckinger y otros, J. Biol. Chem. 264:11966, 1989; Solicitud de Patente del Reino Unido, Publicaci´on N◦ 2 218 101 A de Seckinger y otros; Engelmann y otros, J. Biol. Chem. 264:11974, 1989). La prote´ına urinaria soluble que se une a TNF descrita por UK 2 218 101 A tiene una secuencia de amino´acidos N-terminal parcial de Asp-Ser-Val-Cys-Pro-, que corresponde a la secuencia parcial descrita m´as tarde por Engelmann y otros (1989). La relaci´on de las anteriores prote´ınas urinarias solubles de uni´on se elucid´o adicionalmente despu´es de que se presentara la solicitud principal original (N◦ de Serie de EE.UU: 403.241) de la presente solicitud, cuando Engelmann y otros dieron cuenta de la identificaci´on y purificaci´on de una segunda prote´ına urinaria soluble que se une a uni´on a TNF distinta que ten´ıa una secuencia de amino´acidos N-terminal de Val-Ala-Phe-Thr-Pro

(J. Biol. Chem. 265:1531, 1990). Las dos prote´ınas urinarias descritas en UK 2 218 101 A y en las publicaciones de Engelmann y otros se mostraban inmunoqu´ımicamente afines a dos prote´ınas de la superficie celular aparentemente distintas por la capacidad del antisuero contra las prote´ınas de uni´on para inhibir la uni´on de TNF a ciertas c´elulas.

M´as recientemente, dos grupos separados daban cuenta de la clonaci´on y expresi´on moleculares de un TNF-R humano de 55 kDa (Loetscher y otros, Cell 61:351, 1990; Schall y otros, Cell 61:361, 1990). El TNF-R de ambos grupos tiene una secuencia de amino´acidos N-terminal que corresponde a la secuencia de amino´acidos parcial de la prote´ına urinaria de uni´on descrita por UK 2 218 101 A, Engelmann y otros (1989) y Engelmann y otros (1990).

Para elucidar la relaci´on de las m´ultiples formas de TNF-R y las prote´ınas urinarias solubles de uni´on a TNF, o para estudiar las caracter´ısticas estructurales y biol´ogicas de los TNF-Rs y el papel jugado por los TNF-Rs en las respuestas de diversas poblaciones de c´elulas a TNF o a otra estimulaci´on por citoquinas, o para usar los TNF-Rs eficazmente en terapia, diagn´ostico o ensayo, son necesarias composiciones purificadas de TNF-R. Tales composiciones, sin embargo, son obtenibles en rendimientos pr´acticos solamente clonando y expresando genes que codifican los receptores usando tecnolog´ıa de DNA recombinante. Los esfuerzos para purificar la mol´ecula de TNF-R para usar en an´alisis bioqu´ımico o para clonar y expresar genes de mam´ıfero que codifican TNF-R, sin embargo, han sido impedidos por la falta de una fuente adecuada de prote´ına o mRNA del receptor. Antes de la presente invenci´on, no se conoc´ıan l´ıneas de c´elulas para expresar niveles altos de TNF-R constitutivamente y continuamente, lo que imped´ıa la purificaci´on del receptor para la secuenciaci´on o la construcci´on de bibliotecas gen´eticas para la clonaci´on de cDNA.

Sumario de la invenci´on

En una primera modalidad, la invenci´on proporciona una secuencia de DNA aislada que codifica una prote´ına de receptor de TNF (TNF-R) de mam´ıfero biol´ogicamente activa seleccionada de:

(a)

los amino´acidos 1-x de la Figura 2A, en donde x se selecciona de los amino´acidos 163-235; y

(b)

los amino´acidos 1-233 de la Figura 3A.

Una segunda modalidad proporciona una secuencia de DNA aislada que codifica una prote´ına receptora de TNF (TNF-R) de mam´ıfero biol´ogicamente activa seleccionada de:

(a)

secuencias de DNA seleccionadas de la regi´on de codificaci´on del gen de TNF-R natural de mam´ıfero de la Fig. 2A-2B o la Fig. 3A-3B;

(b)

secuencias de DNA capaces de hibridarse hasta las secuencias de (a) bajo condiciones moderadamente rigurosas, esto es a 50◦C en 2xSSC;

(c)

secuencias de DNA que est´an degeneradas como resultado del c´odigo gen´etico hasta la secuencia de

(a)

-(b).

En particular, la presente invenci´on proporciona secuencias de DNA que codifican receptores de TNF solubles.

La presente invenci´on tambi´en proporciona vectores de expresi´on recombinantes que comprenden las secuencias de DNA definidas anteriormente, mol´eculas de TNF-R recombinantes producidas usando los vectores de expresi´on recombinantes, y procesos para producir las mol´eculas de TNF-R recombinantes usando los vectores de expresi´on.

La presente invenci´on tambi´en proporciona composiciones de prote´ına aislada o purificada que comprenden TNF-R, y, en particular, formas solubles de TNF-R.

La presente invenci´on tambi´en proporciona composiciones para uso en terapia, diagn´ostico, ensayo de TNF-R, o para originar anticuerpos para TNF-R, que comprenden cantidades efectivas de prote´ınas receptoras solubles naturales o recombinantes preparadas de acuerdo con los procesos precedentes.

Debido a la capacidad del TNF para unirse espec´ıficamente a receptores de TNF (TNF-Rs), las composiciones de TNF-R purificado ser´an ´utiles en ensayos de diagn´ostico para TNF, as´ı como para producir anticuerpos para el receptor de TNF para usar en diagn´ostico y terapia. Adem´as, las composiciones de receptores de TNF purificados pueden usarse directamente en terapia para unirse a o eliminar TNF, proporcionando de ese modo un medio para regular las actividades inmunitarias de esta citoquina.

Estos y otros aspectos de la presente invenci´on ser´an evidentes en referencia a la siguiente descripci´on detallada.

Breve descripci´on de los dibujos

La Figura 1 es una representaci´on esquem´atica de la regi´on de codificaci´on de diversos cDNAs que codifican TNF-Rs humanos y de rat´on. La secuencia conductora es rayada y la regi´on de transmembrana es s´olida.

La Figura 2A-2B representa la secuencia de cDNA parcial y la secuencia de amino´acidos derivada del clon 1 de TNF-R humano. Los nucle´otidos se enumeran desde el principio de la regi´on no traducida 5’. Los amino´acidos se enumeran desde el principio de la secuencia del p´eptido de se˜nal. La secuencia del p´eptido de se˜nal putativa est´a representada por los amino´acidos -22 a -1. La leucina N-terminal de la prote´ına de TNF-R madura est´asubrayadaen la posici´on 1. La regi´on de transmembrana predicha desde los amino´acidos 236 a 265 tambi´en est´a subrayada. Los t´erminos C de diversos TNF-Rs solubles est´an marcados con una flecha (t).

La Figura 3A-3C representa la secuencia de cDNA y la secuencia de amino´acidos derivada del clon 11 de TNF-R de rat´on. La secuencia del p´eptido de se˜nal putativa est´a representada por los amino´acidos -22 a -1. La valina N-terminal de la prote´ına de TNF-R madura est´asubrayadaen la posici´on 1. La regi´on de transmembrana predicha desde los amino´acidos 234 a 265 tambi´en est´a subrayada.

Descripci´on detallada de la invenci´on

Definiciones

Seg´un se usa aqu´ı, los t´erminos “receptor de TNF” y “TNFR” se refieren a prote´ınas que tienen frecuencias de amino´acidos que son substancialmente similares a las secuencias de amino´acidos del receptor de TNF natural de mam´ıfero, y que son biol´ogicamente activas, seg´un se define debajo, ya que son capaces de unirse a mol´eculas de TNF o transducir una se˜nal biol´ogica iniciada por una mol´ecula de TNF que se une a una c´elula, o reaccionar de forma cruzada con anticuerpos anti-TNFR producidos contra TNF-R de fuentes naturales (es decir, no recombinantes). El TNF-R humano maduro de longitud total es una glicoprote´ına que tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kilodaltons (kDa). Seg´un se usa a lo largo de la memoria descriptiva, el t´ermino “maduro” significa una prote´ına expresada en una forma que carece de una secuencia conductora como puede estar presente en transcriptos de longitud total de un gen natural. Los experimentos que usaban c´elulas COS transfectadas con un cDNA que codifica TNF-R humano de longitud total mostraban que el TNF-R se un´ıa a 125I-TNFα con una Ka aparente de aproximadamente 5 x 109 M−1,y que el TNF-R se un´ıa a 125I-TNFβ con una Ka aparente de aproximadamente 2x109 M−1.Los t´erminos “receptor de TNF” o “TNF-R” incluyen, pero no se limitan a, an´alogos o subunidades de prote´ınas naturales que tienen al menos 20 amino´acidos y que exhiben al menos alguna actividad biol´ogica en com´un con el TNF-R, por ejemplo, construcciones de TNF-R soluble que est´an desprovistas de una regi´on de transmembrana (y se secretan de la c´elula) pero retienen la capacidad para unirse a TNF. Diversos an´alogos de prote´ınas y amino´acidos bioequivalentes se describen con detalle debajo.

La nomenclatura para an´alogos de TNF-R, seg´un se usa aqu´ı, sigue la convenci´on de nombrar la prote´ına (por ejemplo, TNF-R) precedida por hu (para humanos) o mu (para rat´on) y seguido por una Δ (para designar una delecci´on) y el n´umero de amino´acido C-terminal. Por ejemplo, huTNF-RΔ235 se refiere a TNF-R que tiene Asp235 como amino´acido C-terminal (es decir, un polip´eptido que tiene la secuencia de amino´acidos 1-235 de la Figura 2A). En ausencia de cualquier denominaci´on de especie humanaode rat´on, TNF-R se refiere gen´ericamente a TNF-R de mam´ıfero. De forma similar, en ausencia de ninguna denominaci´on espec´ıfica para mutantes de delecci´on, el t´ermino TNF-R significa todas las formas de TNF-R, incluyendo mutantes y an´alogos que poseen actividad biol´ogica de TNF-R.

“TNF-R soluble” o “sTNF-R”, seg´un se usan en el contexto de la presente invenci´on, se refieren a prote´ınas, o an´alogos substancialmente equivalentes, que tienen una secuencia de amino´acidos correspondiente a toda, o parte de, la regi´on extracelular de un TNF-R natural, por ejemplo, huTNF-RΔ235, huTNF-RΔ185 y huTNF-RΔ163, o secuencias de amino´acidos substancialmente similares a las secuencias de amino´acidos 1163, amino´acidos 1-185, o amino´acidos 1-235 de la Figura 2A, y que son biol´ogicamente activas ya que se unen a ligando de TNF. TNF-Rs solubles equivalentes incluyen polip´eptidos que var´ıan de estas secuencias en una o m´as substituciones, delecciones o adiciones, y que retienen la capacidad para unirse a TNF o para inhibir la actividad de transducci´on de se˜nal de TNF a trav´es de prote´ınas receptoras de TNF unidas a la superficie celular, por ejemplo hu TNF-RΔx, en donde x se selecciona del grupo que consiste en uno cualquiera de los amino´acidos 163-235 de la Figura 2A. Delecciones an´alogas pueden hacerse en muTNF-R. La inhibici´on de la actividad de transducci´on de la se˜nal de TNF puede determinarse transfectando c´elulas con DNAs de TNF-R recombinantes para obtener expresi´on de receptores recombinantes. Las c´elulas se ponen en contacto a continuaci´on con TNF y se examinan los efectos metab´olicos resultantes. Si resulta un efecto que es atribuible a la acci´on de ligando, entonces el receptor recombinante tiene actividad de transducci´on de la se˜nal. Procedimientos ejemplares para determinar si un polip´eptido tiene actividad de transducci´on de la se˜nal son descritos por Idzerda y otros, J. Exp. Med.

171:861

(1990); Curtis y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3045 (1989); Prywes y otros, EMBO

J.

5:2179 (1986) y Chou y otros, J. Biol. Chem. 262:1842 (1987). Alternativamente, tambi´en podr´ıan utilizarse c´elulas primarias o l´ıneas de c´elulas que expresan un receptor de TNF end´ogeno y tienen una respuesta biol´ogica detectable a TNF.

El t´ermino “aislado” o “purificado”, seg´un se usa en el contexto de esta memoria descriptiva para definir la pureza de la prote´ına o las composiciones de prote´ına de TNF-R, significa que la prote´ına a la composici´on de prote´ına est´a substancialmente libre de otras prote´ınas de origen natural o end´ogeno y contiene menos de aproximadamente un 1% en masa de contaminantes de prote´ına residuales de los procesos de producci´on. Tales composiciones, sin embargo, pueden contener otras prote´ınas a˜nadidas como estabilizadores, veh´ıculos, excipientes o agentes co-terap´euticos. El TNF-R se a´ısla si es detectable como una sola banda de prote´ına en un gel de poliacrilamida ti˜nendo con plata.

El t´ermino “substancialmente similares”, cuando se usa para definir secuencias de amino´acidos o ´acidos nucleicos, significa que una secuencia particular, por ejemplo, una secuencia mutante, var´ıa con respecto a una secuencia de referencia en una o m´as substituciones, delecciones o adiciones, cuyo efecto neto es retener la actividad biol´ogica de la prote´ına de TNF-R seg´un puede determinarse, por ejemplo, en uno de los ensayos de uni´on a TNF-R indicados en el Ejemplo 1 debajo. Alternativamente, subunidades y an´alogos de ´acidos nucleicos son “substancialmente similares” a las secuencias de DNA espec´ıficas descritas aqu´ı si: (a) la secuencia de DNA deriva de la regi´on de codificaci´on de un gen de TNF-R de mam´ıfero natural; (b) la secuencia de DNA es capaz de hibridaci´on hasta secuencias de DNA de (a) bajo condiciones moderadamente rigurosas (50◦C, 2 x SSC) y que codifican mol´eculas de TNF-R biol´ogicamente activas; o secuencias de DNA que se degeneran como resultado del c´odigo gen´etico hasta las secuencias de DNA definidas en (a) o (b) y que codifican mol´eculas de TNF-R biol´ogicamente activas.

“Recombinante”, seg´un se usa aqu´ı, significa una prote´ına que deriva de sistemas de expresi´on recombinantes (por ejemplo, microbianos o de mam´ıferos). “Microbianos” se refiere a prote´ınas recombinantes elaboradas en sistemas de expresi´on bacterianos o f´ungicos (por ejemplo, de levadura). Como un producto, “microbiano recombinante” define una prote´ına producida en un sistema de expresi´on microbiano que est´a esencialmente libre de substancias end´ogenas naturales. La prote´ına expresada en la mayor´ıa de los cultivos bacterianos, por ejemplo, E. coli, estar´a libre de glicano. La prote´ına expresada en levadura puede tener un patr´on de glicosilaci´on diferente de aqu´ella expresada en c´elulas de mam´ıfero.

“Biol´ogicamente activo”, seg´un se usa a lo largo de la memoria descriptiva como una caracter´ıstica de los receptores de TNF, significa que una mol´ecula particular comparte suficiente similitud de la secuencia de amino´acidos con las secuencias espec´ıficas de la presente invenci´on descritas aqu´ıpara ser capaces de unirse a cantidades detectables de TNF, transmitir un est´ımulo de TNF a una c´elula, por ejemplo, como un componente de una construcci´on de receptor h´ıbrido, o reaccionar de forma cruzada con anticuerpos anti-TNF-R producidos contra TNF-R de fuentes naturales (es decir, no recombinantes). Preferiblemente, los receptores de TNF biol´ogicamente activos dentro del alcance de la presente invenci´on son capaces de unirse a m´as de 0,1 nmoles de TNF por nmol de receptor y, m´as preferiblemente, m´as de 0,5 nmoles de TNF por nmol de receptor en ensayos de uni´on est´andar (v´ease debajo).

“Secuencia de DNA aislada” se refiere a un pol´ımero de DNa, en forma de un fragmento separado

o como un componente de una construcci´on de DNA m´as grande, que deriva de DNA aislado al menos una vez en forma substancialmente pura, es decir, libre de materiales end´ogenos contaminantes y en una cantidad o concentraci´on que permite la identificaci´on, manipulaci´on y recuperaci´on de la secuencia y sus secuencias de nucle´otidos componentes mediante m´etodos bioqu´ımicos est´andar, por ejemplo, usando un vector de clonaci´on. Tales secuencias se proporcionan preferiblemente en forma de un cuadro de lectura abierto no interrumpido por secuencias no traducidas internas, o intrones, y est´an t´ıpicamente presentes en genes eucari´oticos. El DNA gen´omico que contiene las secuencias relevantes tambi´en podr´ıa usarse como una fuente de secuencias de codificaci´on. Las secuencias de DNA no traducido pueden estar presentes 5’ ´o 3’ a partir del cuadro de lectura abierto, donde las mismas no interfieren con la manipulaci´on olaexpresi´on de las regiones de codificaci´on.

“Secuencia de nucle´otidos” se refiere a un heteropol´ımero de desoxirribonucle´otidos. Las secuencias de DNA que codifican las prote´ınas proporcionadas por esta invenci´on pueden montarse a partir de fragmentos de cDNA y enlazadores de oligonucle´otidos cortos, o a partir de una serie de oligonucle´otidos, para proporcionar un gen sint´etico que es capaz de expresarse en una unidad de transcripci´on recombinante.

Aislamiento de cDNAs que Codifican TNF-R

La secuencia de codificaci´on de TNF-R se obtiene aislando una secuencia de DNA complementario (cDNA) que codifica TNF-R de una biblioteca de cDNA recombinante o DNA gen´omico. Una biblioteca de cDNA se construye preferiblemente obteniendo mRNA poliadenilado a partir de una l´ınea de c´elulas particular que expresa un TNF-R de mam´ıfero, por ejemplo, la l´ınea de c´elulas fibrobl´asticas humanas WI-26 VA4 (ARCC CCL 95,1) y usando el mRNA como una plantilla para sintetizar cDNA de doble filamento. El cDNA de doble filamento se empaqueta a continuaci´on en un vector recombinante, que se introduce en una cepa de E. coli apropiada y se propaga. Tambi´en pueden usarse l´ıneas de c´elulas de rat´on u otros mam´ıferos que expresan TNF-R. Las secuencias de TNF-R contenidas en la biblioteca de cDNA pueden identificarse f´acilmente seleccionando la biblioteca con una prueba de ´acido nucleico apropiada que es capaz de hibridarse con cDNA de TNF-R. Alternativamente, DNAs que codifican prote´ınas de TNF-R pueden montarse mediante ligaci´on de subunidades de oligonucle´otidos sint´eticos correspondientes a toda, o a parte de, la secuencia de las Figuras 2A-2B o 3A-3C para proporcionar una secuencia de codificaci´on completa.

Los cDNAs de receptores de TNF humanos de la presente invenci´on se aislaron mediante el m´etodo de clonaci´on por expresi´on directa. Se construy´o una biblioteca de cDNA aislando en primer lugar mRNA citopl´asmico de la l´ınea de c´elulas fibrobl´asticas humanas WI-26 VA4. Se aisl´o RNA poliadenilado y se us´o para preparar cDNA de doble filamento. Fragmentos de cDNA purificado se ligaron a continuaci´on en DNA de vector pCAV/NOT, que usa secuencias reguladoras derivadas de pD201 (un derivado de pMLSV, previamente descrito por Cosman y otros, Nature 312:768, 1984), SV40 DNA de citomegalovirus, descrito con detalle debajo en el Ejemplo 2. pCAV/NOT se ha depositado en the American Type Culture Collection bajo el N◦ de registro ATCC 68014. Los vectores pCAV/NOT que contienen los fragmentos de cDNA WI26-VA4 se transformaron en cepa de E. coli DH5α. Los transformantes se cultivaron en placas para proporcionar aproximadamente 800 colonias por placa. Las colonias resultantes se recogieron y cada combinaci´on se us´o para preparar DNA de pl´asmido para transfecci´on en c´elulas COS-7, esencialmente seg´un se describe por Cosman y otros, (Nature 312:768, 1984) y Luthman y otros (Nucl. Acid Res. 11:1295, 1983). Los transformantes que expresan receptores de TNF superficiales de c´elulas biol´ogicamente activas se identificaron por selecci´on para su capacidad para unirse a 125I-TNF. En este m´etodo de selecci´on, c´elulas COS-7 transfectadas se incubaron con medio que conten´ıa 125I-TNF, las c´elulas se lavaron para eliminar TNF marcado no unido, y las monocapas de c´elulas se pusieron en contacto con pel´ıcula de rayos X para detectar las concentraciones de uni´on a TNF, seg´un se describe por Sims y otros, Science 241:585 (1988). Los transfectantes detectados de esta manera aparecen como focos oscuros frente a un fondo relativamente claro.

Usando este m´etodo, aproximadamente 240.000 cDNAs se seleccionaron en combinaciones de aproximadamente 800 cDNAs hasta que el ensayo de un grupo de transfectantes indicaba focos positivos para uni´on a TNF. Un material congelado de bacterias de este grupo positivo se hizo crecer en cultivo y se cultiv´o en placas para proporcionar colonias individuales, que se seleccionaron hasta que se identificaba un solo clon (clon 11) que era capaz de dirigir la s´ıntesis de una prote´ına superficial con actividad de uni´on a TNF detectable. La secuencia del clon 11 de cDNA aislado mediante el m´etodo de arriba se representa en las Figuras 3A-3C.

Clones de cDNA adicionales pueden aislarse a partir de bibliotecas de cDNA y otras especies de mam´ıferos mediante hibridaci´on de especies cruzadas. Para usar en hibridaci´on, el DNA que codifica TNF-R puede marcarse covalentemente con una substancia detectable tal como un grupo fluorescente, un ´etodos bien conocidos por aqu´

atomo radiactivo o un grupo quimioluminiscente mediante m´ellos expertos en la t´ecnica. Tales pruebas tambi´en pueden usarse para diagn´ostico in vitro de condiciones particulares.

Como la mayor´ıa de los genes de mam´ıferos, los receptores de TNF de mam´ıferos son codificados presumiblemente por genes de varios exones. Se considera que las construcciones de mRNA alternativas que pueden atribuirse a diferentes casos de empalme (“splicing”) de mRNA despu´es de la transcripci´on, y que comparten grandes regiones de identidad o similitud con los cDNAs reivindicados aqu´ı, est´an dentro del alcance de la presente invenci´on.

Otros cDNAs de TNF-R de mam´ıfero se a´ıslan usando una secuencia de DNA de TNF-R humano apropiado como una prueba para seleccionar una biblioteca de cDNA de mam´ıfero particular mediante hibridaci´on de especies cruzadas.

Prote´ınas y An´alogos

La presente invenci´on proporciona polip´eptidos de TNF-R recombinantes aislados humanos y de rat´on. Los polip´eptidos de TNF-R aislados de esta invenci´on est´an substancialmente libres de otros materiales contaminantes de origen natural o end´ogeno y contienen menos de aproximadamente un 1% en masa de prote´ına en contaminantes residuales de los procesos de producci´on. Las mol´eculas de TNF-R humano naturales se recuperan de lisados de c´elulas como glicoprote´ınas que tienen un peso molecular aparente mediante SDS-PAGE de aproximadamente 80 kilodaltons (kDa). Los polip´eptidos de TNF-R de esta invenci´on est´an opcionalmente sin glicosilaci´on de patr´on natural asociada.

El TNF-R de mam´ıfero de la presente invenci´on incluye TNFR humano y de rat´on. Los TNF-Rs de mam´ıfero pueden obtenerse mediante hibridaci´on de especies cruzadas, usando un cDNA de un solo filamento derivado de la secuencia de DNA de TNF-R humano como prueba de hibridaci´on para aislar cDNAs de TNF-R de bibliotecas de cDNA de mam´ıfero.

Los derivados de TNF-R dentro del alcance de la invenci´on tambi´en incluyen diversas formas estructurales de la prote´ına primaria que retienen actividad biol´ogica. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, una prote´ına de TNF-R puede estar en forma de sales ´acidas o b´asicas,

o puede estar en forma neutra. Los residuos de amino´acidos individuales tambi´en pueden modificarse mediante oxidaci´on o reducci´on.

La estructura de amino´acidos primaria puede modificarse formando conjugados covalentes o agregativos con otros restos qu´ımicos, tales como grupos glicosilo, l´ıpidos, grupos fosfato, acetilo y similares, o creando mutantes de secuencias de amino´acidos. Los derivados covalentes se preparan enlazando grupos funcionales particulares a cadenas laterales de amino´acidos de TNF-R o a los t´erminos N o C. Otros derivados de TNF-R dentro del alcance de esta invenci´on incluyen conjugados covalentes o agregativos de TNF-R o sus fragmentos con otras prote´ınas o polip´eptidos, tales como mediante s´ıntesis en cultivo recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Por ejemplo, el p´eptido conjugado puede ser una secuencia de polip´eptido de se˜nal (o conductora) en la regi´on N-terminal de la prote´ına que dirige cotranslacionalmente o postranslacionalmente la transferencia de la prote´ına de su sitio de s´ıntesis a su sitio de funci´on dentro o fuera de la membrana o pared celular (por ejemplo, el conductor de factor α de levaduras). Las fusiones de prote´ınas de TNF-R pueden comprender p´eptidos a˜nadidos para facilitar la purificaci´on o identificaci´on de TNF-R (por ejemplo, poli-His). La secuencia de amino´acidos del receptor de TNF tambi´en puede enlazarse al p´eptido Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp y otros, Bio/Technology 6:1204, 1988). La ´ultima secuencia es altamente antig´enica y proporciona un ep´ıtope unido reversiblemente mediante un anticuerpo monoclonal espec´ıfico, que permite el ensayo r´apido y la purificaci´on f´acil de prote´ına recombinante expresada. Esta secuencia tambi´en se disocia espec´ıficamente mediante enteroquinasa mucosa bovina en el residuo inmediatamente siguiente al apareamiento Asp-Lys. Las prote´ınas de fusi´on protegidas con este p´eptido tambi´en pueden ser resistentes a degradaci´on intracelular en E. coli.

Los derivados de TNF-R tambi´en pueden usarse como inmun´ogenos, reactivos en inmunoensayos basados en receptores, o como agentes de uni´on para procedimientos de purificaci´on por afinidad de TNF u otros ligandos de uni´on. Los derivados de TNF-R tambi´en pueden obtenerse mediante agentes de reticulaci´on, tales como ´ester de M-maleimidobenzoil-succinimida y Nhidroxisuccinimida, en residuos de ciste´ına y lisina. Las prote´ınas de TNF-R tambi´en pueden unirse covalentemente a trav´es de grupos laterales reactivos a diversos substratos insolubles, tales como estructuras de agarosa activadas con bromuro de cian´ogeno, activadas con bisoxirano, activadas con carbonildiimidazol o activadas con tosilo, o adsorbiendo a superficies de poliolefina (con o sin reticulaci´on de glutaraldeh´ıdo). Una vez unido a un substrato, el TNF-R puede usarse para unirse selectivamente (para prop´ositos de ensayo o purificaci´on) a anticuerpos anti-TNF-R o a TNF.

La presente invenci´on tambi´en incluye TNF-R con o sin glicosilaci´on de patr´on natural asociada. El TNF-R expresado en sistemas de expresi´on de levadura o de mam´ıfero, por ejemplo, c´elulas COS-7, puede ser similar o ligeramente diferente en peso molecular y patr´on de glicosilaci´on a las mol´eculas naturales, dependiendo de los sistemas de expresi´on. La expresi´on de DNAs de TNF-R en bacterias tales como

E. coli proporciona mol´eculas no glicosiladas. An´alogos mutantes funcionales de TNF-R de mam´ıfero que tiene sitios de N-glicosilaci´on inactivados pueden producirse mediante s´ıntesis y ligaci´on de oligonucle´otidos o mediante t´ecnicas de mutag´enesis espec´ıficas para el sitio. Estas prote´ınas an´alogas pueden producirse en una forma homog´enea de carbohidrato reducido con buen rendimiento usando sistemas de expresi´on de levadura. Los sitios de N-glicosilaci´on en prote´ınas eucari´oticas se caracterizan por el triplete de amino´acidos Asn-A1-Z, donde A1 es cualquier amino´acido excepto Pro, y Z es Ser o Thr. En esta secuencia, la asparagina proporciona un grupo amino de cadena lateral para ligaz´on covalente de carbohidrato. Tal sitio puede eliminarse substituyendo Asn o el residuo Z por otro amino´acido, suprimiendo Asn o Z, o insertando un amino´acido que no es Z entre A1 y Z, o un amino´acido distinto a Asn entre Asn y A1.

Los derivados de TNF-R tambi´en pueden obtenerse mediante mutaciones de TNF-R o sus subunidades. Un mutante de TNF-R, seg´un se denomina aqu´ı, es un polip´eptido hom´ologo a TNF-R pero que tiene una secuencia de amino´acidos diferente al TNF-R natural debido a una delecci´on, inserci´on o substituci´on.

An´alogos bioequivalentes de prote´ınas de TNF-R pueden construirse, por ejemplo, haciendo diversas substituciones de residuos o secuencias o suprimiendo residuos o secuencias terminales o internos no necesarios para la actividad biol´ogica. Por ejemplo, los residuos de ciste´ına pueden suprimirse (por ejemplo, Cys178) o reemplazarse con otros amino´acidos para evitar la formaci´on de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos durante la renaturalizaci´on. Otros procedimientos para la mutag´enesis implican modificaci´on de residuos de amino´acido dib´asicos adyacentes para mejorar la expresi´on en sistemas de levadura en los que est´a presente actividad de proteasa de KEX2. Generalmente, las substituciones deben hacerse conservativamente; es decir, los amino´acidos substitutos m´as preferidos son aqu´ellos que tienen caracter´ısticas fisioqu´ımicas que se asemejan a aqu´ellas del residuo que va a reemplazarse. De forma similar, cuando se adopta una estrategia de delecci´on o inserci´on, debe considerarse el efecto potencial de la delecci´on olainserci´on sobre la actividad biol´ogica. Las secuencias polipept´ıdicas substancialmente similares, seg´un se define anteriormente, comprenden generalmente un n´umero similar de secuencias de amino´acidos, aunque los truncamientos C-terminales para el prop´osito de construir TNF-Rs solubles contar´an con menos secuencias de amino´acidos. Para preservar la actividad biol´ogica de los TNFRs, las delecciones y las substituciones dar´an como resultado, preferiblemente, secuencias hom´ologas o substituidas conservativamente, lo que significa que un residuo dado es reemplazado por un residuo biol´ogicamente similar. Ejemplos de substituciones conservativas incluyen substituci´on de un residuo alif´atico por otro, tales como Ile, Val, Leu, o Ala por otro, o substituciones de un residuo polar por otro, tales como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Otras substituciones conservativas tales, por ejemplo, substituciones de regiones enteras que tienen caracter´ısticas de hidrofobia similares, son bien conocidas. Por otra parte, las diferencias de amino´acidos particulares entre TNF-Rs humano, de rat´on yde otros mam´ıferos sugieren substituciones conservativas adicionales que pueden hacerse sin alterar las caracter´ısticas biol´ogicas esenciales del TNF-R.

Las subunidades de TNF-R pueden construirse suprimiendo residuos o secuencias terminales o internas. Secuencias particularmente preferidas incluyen aqu´ellas en las que la regi´on de transmembrana y el dominio intracelular de TNF-R se suprimen o se substituyen por residuos hidr´ofilos para facilitar la secreci´on del receptor en el medio de cultivo celular. La prote´ına resultantesedenomina mol´ecula de TNF-R soluble que retiene su capacidad para unirse a TNF. Una construcci´on de TNF-R soluble particularmente preferida es TNFRΔ235 (la secuencia de amino´acidos 1-235 de la Figura 2A), que comprende la regi´on extracelular entera de TNF-R, terminando con Asp235 inmediatamente adyacente a la regi´on de transmembrana. Amino´acidos adicionales pueden suprimirse de la regi´on de transmembrana mientras que se retiene la actividad de uni´on a TNF. Por ejemplo, huTNF-RΔ183 que comprende la secuencia de amino´acidos 1-183 de la Figura 2A, y TNF-RΔ163 que comprende la secuencia de amino´acidos 1-163 de la Figura 2A, retienen la capacidad para unirse al ligando de TNF seg´un se determina usando los ensayos de uni´on descritos debajo en el Ejemplo 1. TNF-RΔ142, sin embargo, no retiene la capacidad de unirse al ligando de TNF. Esto sugiere que se requieren una o ambas de Cys157 yCys163 para la formaci´on de un puente de disulfuro intramolecular para el pliegue apropiado de TNF-R. Cys178,que se suprimi´o sin ning´un efecto adverso aparente sobre la capacidad del TNF-R soluble para unirse a TNF, no parece ser esencial para el pliegue apropiado de TNF-R. As´ı, se esperar´ıa que cualquier substituci´on C-terminal para Cys163 resultara en un TNF-R soluble biol´ogicamente activo. La presente invenci´on completa tales construcciones de TNF-R soluble correspondientes a toda, o parte de, la regi´on extracelular de TNF-R que termina con cualquier amino´acido despu´es de Cys163 . Otras delecciones C-terminales, tales como TNF-FΔ157, pueden hacerse por comodidad cortando cDNA de TNF-R con enzimas de restricci´on apropiadas y, si es necesario, reconstruyendo secuencias espec´ıficas con enlazadores de oligonucle´otidos sint´eticos. Las construcciones de TNF-R resultantes se insertan a continuaci´on y se expresan en vectores de expresi´on apropiados y se ensaya su capacidad para unirse a TNF, seg´un se describe en el Ejemplo 1. Los TNF-Rs solubles biol´ogicamente activos que resultan de tales construcciones tambi´en se contemplan para estar dentro del alcance de la presente invenci´on.

Las mutaciones en secuencias de nucle´otidos construidas para expresi´on de TNF-R an´alogo deben, por supuesto, preservar la fase de cuadro de lectura de las secuencias de codificaci´on y, preferiblemente, no crear´an regiones complementarias que pudieran hibridarse para producir estructuras de mRNA secundarias tales como bucles u horquillas que afectar´ıan adversamente a la traducci´on del mRNA receptor. Aunque puede predeterminarse un sitio de mutaci´on, no es necesario que la naturaleza de la mutaci´on de pors´´´

ı se predetermine. Por ejemplo, para seleccionar las caracterısticas optimas de los mutantes en un sitio dado, la mutag´enesis al azar puede efectuarse en el cod´on diana y los mutantes de TNF-R expresados seleccionarse para la actividad deseada.

No todas las mutaciones en la secuencia de nucle´otidos que codifica TNF-R se expresar´an en el producto final, por ejemplo, pueden hacerse substituciones de nucle´otidos para mejorar la expresi´on, principalmente para evitar bucles de estructura secundaria en el mRNA transcrito (v´ease EPA 75.444A, incorporada aqu´ı mediante referencia), o para proporcionar codones que son traducidos m´as f´acilmente por el hu´esped seleccionado, por ejemplo, los codones de preferencia de E. coli bien conocidos para la expresi´on de E. coli.

Pueden introducirse mutaciones en lugares particulares sintetizando oligonucle´otidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricci´on que permiten la ligaci´on a fragmentos de la secuencia natural. Despu´es de la ligaci´on, la secuencia reconstruida resultante codifica un an´alogo que tiene la inserci´on, substituci´on o delecci´on de amino´acidos deseada.

Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutag´enesis espec´ıfica para el sitio dirigida a oligonucle´otidos para proporcionar un gen alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo con la substituci´on, delecci´on o inserci´on requerida. M´etodos ejemplares para hacer las alteraciones indicadas anteriormente son descritos por Walder y otros (Gene 42:133, 1986); Bauer y otros (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Enero de 1985, 12-19); Smith y otros (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las Patentes de EE.UU. N◦ 4.518.584 y 4.737.462 describen t´ecnicas adecuadas, y se incorporan aqu´ı mediante referencia.

Tanto las formas monovalentes como las formas polivalentes de TNF-R son ´utiles en las composiciones ylos m´etodos de esta invenci´on. Las formas polivalentes poseen sitios de uni´on a TNF-R m´ultiples para el ligando de TNF. Por ejemplo, un TNF-R soluble divalente puede consistir en dos repeticiones en t´andem de los amino´acidos 1-235 de la Figura 2A, separadas por una regi´on enlazadora. Tambi´en pueden construirse formas polivalentes alternas, por ejemplo, acoplando qu´ımicamente TNF-R a cualquier mol´ecula portadora cl´ınicamente aceptable, a un pol´ımero seleccionado del grupo que consiste en Ficoll, polietilenglicol o dextrano usando t´ecnicas de acoplamiento convencionales. Alternativamente, el TNF-R puede acoplarse qu´ımicamente a biotina, y dejar a continuaci´on que el conjugado de biotina-TNF-R se una a avidina, dando como resultado mol´eculas de avidina/biotina/TNF-R tetravalentes. El TNF-R tambi´en puede acoplarse covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y el conjugado resultante precipitarse con anti-DNP o anti-TNP-IgM, para formar conjugados dec´ameros con una valencia de 10 para los sitios de uni´on a TNF-R.

Tambi´en puede producirse una mol´ecula de anticuerpo quim´erico recombinante que tiene secuencias de TNF-R que substituyen los dominios variables de cualquiera o ambas de las cadenas pesada y ligera de la mol´ecula de inmunoglobulina y que tienen dominios de regi´on constantes no modificados. Por ejemplo, puede producirse TNF-R/IgG1 quim´erico a partir de dos genes quim´ericos -una quimera de TNF-R/cadena ligera κ humana (TNF-R/Cκ) y la quimera de TNF-R/cadena pesada γ1humana (TNFR/Cγ−1). Despu´es de la transcripci´on y la traducci´on de los dos genes quim´ericos, los productos gen´eticos se montan en una sola mol´ecula de anticuerpo quim´erico que tiene TNF-R desplegado bivalentemente. Tales formas polivalentes de TNF-R pueden tener afinidad de uni´on mejorada para ligando de TNF. Detalles adicionales que se refieren a la construcci´on de tales mol´eculas de anticuerpo quim´erico se describen en WO 89/09622 y EP 315062.

Expresi´on de TNF-R Recombinante

La presente invenci´on proporciona vectores de expresi´on recombinantes para ampliar o expresar DNA que codifica TNF-R. Los vectores de expresi´on recombinantes son construcciones de DNA replicable que tienen fragmentos de DNA sint´eticos o derivados de cDNA que codifican TNF-R de mam´ıfero o an´alogos bioequivalentes unidos operablemente a elementos reguladores de la transcripci´on olatraducci´on adecuados derivados de genes de mam´ıfero, microbio, virus o insecto. Una unidad de transcripci´on comprende generalmente un montaje de (1) un elemento o elementos gen´eticos que tienen un papel regulador en la expresi´on gen´etica, por ejemplo, promotores o mejoradores de la transcripci´on, (2) una secuencia estructural o de codificaci´on que se transcribe en mRNA y se traduce en una prote´ına, y (3) secuencias de iniciaci´on y terminaci´on de la transcripci´on y la traducci´on apropiadas, seg´un se describe con detalle debajo. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripci´on, una secuencia que codifica sitios de uni´on ribos´omicos de mRNA adecuados. La capacidad para replicarse en un hu´esped, habitualmente concebida por un origen de replicaci´on, y un gen de selecci´on para facilitar el reconocimiento de los transformantes pueden incorporarse adicionalmente. Las regiones de DNA se enlazan operablemente cuando son funcionalmente afines entre s´ı. Por ejemplo, DNA para un p´eptido de se˜nal (conductor secretor) se enlaza operablemente a DNA para un polip´eptido si se expresa como un precursor que participa en la secreci´on del polip´eptido; un promotor se enlaza operablemente a una secuencia de codificaci´on si controla la transcripci´on de la secuencia; o un sitio de uni´on a ribosomas se enlaza operablemente a una secuencia de codificaci´on si est´a situado a fin de permitir la traducci´on. Generalmente, unido operablemente significa contiguo y, en el caso de conductores secretores, contiguo y en cuadro de lectura. Los elementos estructurales destinados a usar en sistemas de expresi´on de levaduras incluyen preferiblemente una secuencia conductora que permite la secreci´on extracelular de prote´ına traducida por una c´elula hu´esped. Alternativamente, cuando la prote´ına recombinante se expresa sin una secuencia conductora o de transporte, puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo puede disociarse posteriormente de forma opcional de la prote´ına recombinante expresada para proporcionar un producto final.

Las secuencias de DNA que codifican receptores de TNF de mam´ıfero que van a expresarse en un microorganismo no contendr´an, preferiblemente, intrones que pudieran terminar prematuramente la transcripci´on de DNA en mRNA; sin embargo, la terminaci´on prematura de la transcripci´on puede ser deseable, por ejemplo, cuando dar´a como resultado mutantes que tienen truncamientos C-terminales ventajosos, por ejemplo, delecci´on de una regi´on de transmembrana para dar un receptor soluble no unido a la membrana celular. Debido a la degeneraci´on del c´odigo, puede haber variaci´on considerable en secuencias de nucle´otidos que codifican la misma secuencia de amino´acidos. Otras modalidades incluyen secuencias capaces de hibridarse en las secuencias de cDNA proporcionadas bajo condiciones moderadamente rigurosas (50◦C, 2 x SSC) y otras secuencias que se hibridan o degeneran hasta aqu´ellas que codifican polip´eptidos receptores de TNF biol´ogicamente activos.

El DNA de TNF-R recombinante se expresa o amplia en un sistema de expresi´on recombinante que comprende un monocultivo substancialmente homog´eneo de microorganismos hu´espedes adecuados, por ejemplo, bacterias tales como E. coli o levadura tal como S. cerevisiae, que tienen integrado establemente (mediante transformaci´on o transfecci´on) una unidad de transcripci´on recombinante en DNA cromos´omico

o tienen la unidad de transcripci´on recombinante como un componente de un pl´asmido residente. Generalmente, las c´elulas que constituyen el sistema son la progenie de un solo transformante ancestral. Los sistemas de expresi´on recombinantes que se definen aqu´ı expresar´an prote´ına heter´ologa durante la inducci´on de los elementos reguladores enlazados a la secuencia de DNA o al gen sint´etico que va a expresarse.

Las c´elulas hu´esped transformadas son c´elulas que se han transformado o transfectado con vectores de TNF-R construidos usando t´ecnicas de DNA recombinante. Las c´elulas hu´esped transformadas expresan ordinariamente TNF-R, pero las c´elulas hu´esped transformadas con prop´ositos de clonaci´on o ampliaci´on de DNA de TNF-R no necesitan expresar TNF-R. El TNF-R expresado se depositar´aen la membrana celular o se secretar´a en el sobrenadante de cultivo, dependiendo del DNA de TNF-R seleccionado. C´elulas hu´esped adecuadas para expresi´on de TNF-R de mam´ıfero incluye procariotas, levadura oc´elulas eucari´oticas superiores bajo el control de promotores apropiados. Los procariotas incluyen organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las c´elulas eucari´oticas superiores incluyen l´ıneas de c´elulas estabilizadas de origen mam´ıfero seg´un se describe debajo. Los sistemas de traducci´on libres de c´elulas tambi´en se emplear´ıan para producir TNF-R de mam´ıfero usando RNAs derivados de las construcciones de DNA de la presente invenci´on. Los vectores de clonaci´on y expresi´on apropiados para usar con hu´espedes celulares bacterianos, f´ungicos, de levadura y mam´ıferos son descritos por Pouwels y otros (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985), cuya descripci´on revelante se incorpora aqu´ı mediante referencia.

Los hu´espedes de expresi´on procari´oticos pueden usarse para expresi´on de TNF-R que no requiere procesamiento proteol´ıtico y de disulfuro intensivo. Los vectores de expresi´on procari´oticos comprenden generalmente uno o m´as marcadores seleccionables fenot´ıpicos, por ejemplo, un gen que codifica prote´ınas que confieren resistencia a los antibi´oticos o que suministran un requerimiento autotr´ofico, y un origen de replicaci´on reconocido por el hu´esped para asegurar la ampliaci´on dentro del hu´esped.Hu´espedes procari´oticos adecuados para transformaci´on incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas especies dentro de los g´eneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque tambi´en pueden emplearse otros como un asunto de elecci´on.

Vectores de expresi´on utiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y

´un origen bacteriano de replicaci´on derivado de pl´asmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos gen´eticos del vector de clonaci´on bien conocido pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promea Biotec, Madison, WI, EE.UU.). Estas secciones de “esqueleto” de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que va a expresarse. E. coli se transforma t´ıpicamente usando derivados de pBR322, un pl´asmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar y otros, Gene 2:95, 1977). pBR322 contiene genes para resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y proporciona as´ı medios simples para identificar c´elulas transformadas.

Los promotores usados com´unmente en vectores de expresi´on microbianos recombinantes incluyen el sistema promotor de βlactamasa (penicilinasa) y el sistema promotor de lactosa (Chang y otros, Nature 275:615, 1978; y Goeddel y otros, Nature 281:544, 1979), el sistema promotor de tript´ofano (trp) (Goeddel y otros, Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y EPA 36.776) y promotor de tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresi´on bacteriano particularmente ´de fago λ y el represor termol´Los

util emplea el promotor PL abil cI857ts. vectores de pl´asmidos disponibles de the American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor PL de λ incluyen pl´asmido pHUB2, residente en cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092) y pPLc28, residente en RR1 de E. coli (ATCC 53082).

Las prote´ınas de TNF-R recombinante tambi´en pueden expresarse en hu´espedes de levadura, preferiblemente de la especie Saccharomyces, tales como S. cerevisiae. Tambi´en puede emplearse levadura de otros g´eneros, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura contendr´an generalmente un origen de replicaci´on del pl´asmido de levadura 2μ o una secuencia que se replica aut´onomamente (ARS), un promotor, DNA que codifica TNF-R, secuencias para la terminaci´on de la poliadenilaci´on y la transcripci´on y un gen de selecci´on. Preferiblemente, los vectores de levadura incluir´an un origen de replicaci´on y un marcador seleccionable que permite la transformaci´on de levadura y E. coli, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y S. cerevisiae TRP1 o el gen URA3, que proporciona un marcador de selecci´on para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para desarrollarse en tript´ofano, y un promotor derivado de un gen de levadura altamente expresado para inducir la transcripci´on de una secuencia estructural aguas abajo. La presencia de la lesi´on de TRP-1 o URA3 en el genoma de la c´elula hu´esped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformaci´on mediante crecimiento en ausencia de tript´ofano o uracilo.

Secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura incluyen los promotores para metalotione´ına, 3-fosfoglicerato-quinasa (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicol´ıticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y otros, Biochem. 17:4900, 11978), tales como enolasa, gliceraldeh´ıdo-3-fosfato-deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvatodescarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvatoquinasa, triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa, y glucoquinasa. Vectores y promotores adecuados para usar en expresi´on de levadura se describen adicionalmente en R. Hitzeman y otros, EPA 73.657.

Los vectores de levadura preferidos pueden montarse usando secuencias de DNA de pUC18 para selecci´on y replicaci´on en E. coli (gen Ampr y origen de replicaci´on) y secuencias de DNA de levadura que incluyen un promotor ADH2 reprimible con glucosa y conductor de secreci´on de factor α.El promotor ADH2 ha sido descrito por Russell y otros. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y otros (Nature 300:724, 1982). El conductor de factor α de levadura, que dirige la secreci´on de prote´ınas heter´ologas, puede insertarse entre el promotor y el gen estructural que va a expresarse. V´eanse, por ejemplo, Kurjan y otros, Cell 30:933, 1982; y Bitter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. La secuencia conductora puede modificarse para contener, cerca de su extremo 3’, uno o m´as sitios de restricci´on ´utiles para facilitar la fusi´on de la secuencia conductora a genes extra˜nos.

Procedimientos de transformaci´on de levaduras adecuados son conocidos por aqu´ellos de experiencia en la t´ecnica; una t´ecnica ejemplar es descrita por Hinnen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978, seleccionando transformantes de Trp+ en un medio selectivo que consiste en un 0,67% de base nitrogenada de levadura, un 0,5% de casamino´acidos, un 2% de glucosa, 10 μg/ml de adenina y 20 μg/ml de uracilo o transformantes de URA+ en un medio que consiste en un 0,67 de YNB, con amino´acidos y bases seg´un se describe por Sherman y otros, Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1986.

Cepas de hu´esped transformadas por vectores que comprenden el promotor ADH2 pueden desarrollarse para expresi´on en un medio rico que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, y glucosa al 1% o 4% complementada con 80 μg/ml de adenina y 80 μg/ml de uracilo. La desrepresi´on del promotor ADH2 se produce durante el agotamiento de la glucosa del medio. Los sobrenadantes de levadura en bruto se recogen por filtraci´on y se mantienen a 4◦C antes de purificaci´on adicional.

Diversos sistemas de cultivo de c´elulas de mam´ıfero o insecto tambi´en se emplean ventajosamente para expresar prote´ına recombinante. La expresi´on de prote´ınas recombinantes en c´elulas de mam´ıfero se prefiere particularmente debido a que tales prote´ınas est´an generalmente plegadas correctamente, est´an modificadas apropiadamente y son completamente funcionales. Ejemplos de l´ıneas de c´elulas hu´esped de mam´ıfero adecuadas incluyen las l´ıneas COS-7 de c´elulas de ri˜n´on de mono, descritas por Gluaman (Cell 23:175, 1981), y otras l´ıneas de c´elulas capaces de expresar un vector apropiado, incluyendo, por ejemplo, c´elulas L, l´ıneas de c´elulas C-127, 3T3, de ovario de h´amster chino (CHO), HeLa y BHK. Los vectores de expresi´on de mam´ıfero pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicaci´on, un promotor adecuado y un mejorador enlazado al gen que va a expresarse, y otras secuencias no transcritas 5’ ´´on a

o 3’ de flanqueo, y secuencias 5’ o 3’ no traducidas, tales como sitios de uni´ribosomas necesarios, un sitio de poliadenilaci´on, sitios dadores y aceptores de empalme, y secuencias de terminaci´on de la transcripci´on. Se da cuenta de sistemas de baculovirus para la producci´on de prote´ınas heter´ologas en c´elulas de insecto por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Las secuencias de control de la transcripci´on y la traducci´on en vectores de expresi´on que van a usarse para transformar c´elulas de vertebrados pueden proporcionarse mediante fuentes v´ıricas. Por ejemplo, promotores y mejoradores usados com´unmente derivan de Polioma, Adenovirus 2, Virus de Simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de DNA derivadas del genoma v´ırico SV40, por ejemplo, el origen de SV40, los sitios promotor inicial y final, mejorador, de empalme y de poliadenilaci´on pueden usarse para proporcionar los otros elementos gen´eticos requeridos para la expresi´on de una secuencia de DNA heter´ologo. Los promotores inicial y final son particularmente utiles debido a que se

´obtienen f´acilmente a partir del virus como un fragmento que tambi´en contiene el origen v´ırico de SV40 de replicaci´on (Fiers y otros, Nature 273:113, 1978). Tambi´en pueden usarse fragmentos de SV40 m´as peque˜nos o m´as grandes, con tal de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind 3 hasta el sitio Bgl1 situado en el origen v´ırico de replicaci´on. Adem´as, pueden utilizarse secuencias promotora de TNF-R gen´omico de mam´ıfero, de control y/o de se˜nal, con tal de que tales secuencias de control sean compatibles con la c´elula hu´esped elegida. Detalles adicionales que se refieren al uso de un vector de gran expresi´on de mam´ıfero para producir receptor de TNF de mam´ıfero recombinante son proporcionados en los Ejemplos 2 y 7 debajo. Vectores ejemplares pueden construirse seg´un se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983).

Un sistema ´util para un alto nivel de expresi´on de cDNAs receptores de mam´ıfero en c´elulas epiteliales mamarias de rat´on C127 pueden construirse substancialmente como se describe por Cosman y otros (Mol. Immunol. 23:935, 1986).

En aspectos preferidos de la presente invenci´on, los vectores de expresi´on recombinantes que comprenden cDNAs de TNF-R est´an integrados establemente en un DNA de una c´elula hu´esped. Se alcanzan niveles esperados de producto de expresi´on seleccionando l´ıneas de c´elulas que tienen n´umeros ampliados de DNA de vector. Las l´ıneas de c´elulas que tienen n´umeros ampliados de DNA de vector se seleccionan, por ejemplo, transformando una c´elula hu´esped con un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica una enzima que es inhibida por un f´armaco conocido. El vector tambi´en puede comprender una secuencia de DNA que codifica una prote´ına deseada. Alternativamente, la c´elula hu´esped puede cotransformarse con un segundo vector que comprende la secuencia de DNA que codifica la prote´ına deseada. Las c´elulas hu´esped transformadas o cotransformadas se cultivan a continuaci´on en concentraciones crecientes del f´armaco conocido, seleccionando de ese modo las c´elulas resistentes al f´armaco. Tales c´elulas resistentes al f´armaco sobreviven en concentraciones incrementadas del f´armaco t´oxico mediante superproducci´on de la enzima que es inhibida por el f´armaco, frecuentemente como resultado de ampliaci´on del gen que codifica la enzima. Cuando la resistencia al f´armaco est´a causada por un incremento en el n´umero de copias del DNA de vector que codifica la enzima inhibible, hay una coampliaci´on concomitante del DNA de vector que codifica la prote´ına deseada (TNF-R) en el DNA de las c´elulas hu´esped.

Un sistema preferido para tal coampliaci´on usa el gen para dihidrofolato-reductasa (DHFR), que puede estar inhibido por el f´armaco metotrexato (MTX). Para alcanzar coampliaci´on, una c´elula hu´esped que carece de un gen activo que codifica DHFR se transforma con un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica DHFR y una prote´ına deseada, o se cotransforma con un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica DHFR y un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica la prote´ına deseada. Las c´elulas hu´esped transformadas o cotransformadas se cultivan en medios que contienen niveles crecientes de MTX, y se seleccionan aquellas l´ıneas de c´elulas que sobreviven.

Un sistema de coampliaci´on particularmente preferido usa el gen para glutamina-sintetasa (GS), que es responsable de la s´ıntesis de glutamato y amon´ıaco, usando la hidr´olisis de ATP en ADP y fosfato para conducir la reacci´on. La GS se somete a inhibici´on mediante una variedad de inhibidores, por ejemplo metionina-sulfoximina (MSX). As´ı, el TNF-R puede expresarse en altas concentraciones coampliando c´elulas transformadas con un vector que comprende la secuencia de DNA para GS y una prote´ına deseada, o cotransformarse con un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica GS y un vector que comprende una secuencia de DNA que codifica la prote´ına deseada, cultivando la c´elula hu´esped en medios que contienen niveles crecientes de MSX y seleccionando c´elulas supervivientes. El sistema de coampliaci´on de GS, los vectores de expresi´on recombinantes apropiados y las l´ıneas de c´elulas se describen en las siguientes solicitudes PCT: WO 87/04462, WO 89/01036, WO 89/10404 y WO 86/05807.

Las prote´ınas recombinantes se expresan preferiblemente mediante coampliaci´on de DHFR con GS en una c´elula hu´esped de mam´ıfero, tales como c´elulas de Ovario de H´amster Chino (CHO), o, alternativamente, en una l´ınea de c´elulas de mieloma de rat´on, tal como SP2/0-Ag14 o NSO o una l´ınea de c´elulas de mieloma de rata, tal como YB2/3.0-Ag20, descritas en las solicitudes PCT WO/89/10404 y WO 86/05807.

Un vector ecuari´otico preferido para expresi´on de DNA de TNF-R se describe debajo en el Ejemplo

2. Este vector, denominado pCAV/NOT, derivaba del vector de gran expresi´on de mam´ıfero pDC201 y contiene secuencias reguladoras de SV40, adenovirus-2 y citomegalovirus humano.

Purificaci´on de TNF-R Recombinante

Receptores de TNF de mam´ıfero purificados o an´alogos se preparan cultivando sistemas de hu´esped/vector apropiados para expresar los productos de traducci´on recombinantes de los DNAs de la presente invenci´on, y a continuaci´on se purifican en medios de cultivo o extractos de c´elulas.

Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que secretan prote´ınas recombinantes en medios de cultivo pueden concentrarse en primer lugar usando un filtro de concentraci´on de prote´ınas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltraci´on Amicon o Millipore Pellicon. Despu´es de la etapa de concentraci´on, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificaci´on adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una mol´ecula de TNF o lectina o anticuerpo unida a un soporte adecuado. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio ani´onico, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa y otros tipos empleados com´unmente en purificaci´on de prote´ınas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio cati´onico. Intercambiadores cati´onicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren grupos sulfopropilo.

Finalmente, pueden emplearse una o m´as etapas de cromatograf´ıa l´ıquida de alta eficacia en fase inversa(RP-HPLC) que empleamedios de RP-HPLC hidr´ofobos, por ejemplo, gel de s´ılice que tiene grupos metilo u otros grupos alif´aticos pendientes, para purificar adicionalmente una composici´on de TNF-R. Alguna o todas las etapas de purificaci´on precedentes, en diversas combinaciones, tambi´en pueden emplearse para proporcionar una prote´ına recombinante homog´enea.

La prote´ına recombinante producida en cultivos bacterianos se a´ısla habitualmente mediante extracci´on inicial de n´odulos de c´elulas, seguido por una o m´as etapas de concentraci´on, desalado, intercambio i´onico acuoso o cromatograf´ıa de exclusi´on por tama˜nos. Finalmente, puede emplearse cromatograf´ıa l´ıquida de alta eficacia (HPLC) para las etapas de purificaci´on finales. Las c´elulas microbianas empleadas en la expresi´on de TNF-R recombinante de mam´ıfero pueden romperse mediante cualquier m´etodo conveniente, incluyendo ciclos de congelaci´on-descongelaci´on, tratamiento con ultrasonidos, rotura mec´anica

o uso de agente para lisis de c´elulas.

La fermentaci´on de levadura que expresa TNF-R de mam´ıfero como una prote´ına secretada simplifica mucho la purificaci´on. La prote´ına recombinante secretada resultante de una fermentaci´on a gran escala puede purificarse por m´etodos an´alogos a aqu´ellos descritos por Urdal y otros (J. Chromatog. 296:171, 1984). Esta referencia describe dos etapas de HPLC en fase inversa secuenciales para purificaci´on de GM-CSF humano recombinante en una columna de HPLC preparativa.

El TNF-R humano sintetizado en cultivo recombinante se caracteriza por la presencia de componentes de c´elulas no humanas, incluyendo prote´ınas, en cantidades y de un car´acter que dependen de las etapas de purificaci´on tomadas para recuperar TNF-R humano del cultivo. Estos componentes ser´an ordinariamente de origen de levadura, procari´otico o eucari´otico superior no humano y preferiblemente est´an presentes en cantidades contaminantes inocuas, del orden de menos de aproximadamente un 1% en peso. Adem´as, el cultivo de c´elulas recombinantes permite la producci´on de TNF-R libre de prote´ınas que pueden estar asociadas normalmente con TNF-R como se encuentra en la naturaleza en sus especies de origen, por ejemplo, en c´elulas, exudados celulares o fluidos corporales.

Administraci´on Terap´eutica de TNF-R Soluble Recombinante

La presente invenci´on proporciona m´etodos para usar composiciones terap´euticas que comprenden una cantidad efectiva de prote´ınas de TNF-R solubles y un diluyente y veh´ıculo adecuado, y m´etodos para suprimir respuestas inflamatorias dependientes de TNF-R en humanos, que comprenden administrar una cantidad efectiva de prote´ına de TNF-R soluble.

Para uso terap´eutico, prote´ına de TNF-R soluble purificada se administra a un paciente, preferiblemente un humano, para tratamiento de una manera apropiada a la indicaci´on. As´ı, por ejemplo, composiciones de prote´ına de TNF-R soluble pueden administrarse mediante inyecci´on en bolo, infusi´on continua, liberaci´on sostenida a partir de implantes, u otra t´ecnica adecuada. T´ıpicamente, un agente terap´eutico de TNF-R soluble se administrar´a en forma de una composici´on que comprende prote´ına purificada junto con veh´ıculos, excipientes o diluyentes fisiol´ogicamente aceptables. Tales veh´ıculos ser´an at´oxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparaci´on de tales composiciones implica combinar el TNF-R con tampones, antioxidantes tales como ´acido asc´orbico, polip´eptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), prote´ınas, amino´acidos, carbohidratos, incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutationa y otros estabilizantes y excipientes. Soluci´on salina tamponada neutra o soluci´on salina mezclada con alb´umina de suero no espec´ıfica son diluyentes apropiados ejemplares. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando soluciones de excipiente apropiado (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse en pruebas. La cantidad y frecuencia de administraci´on depender´an, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y la gravedad de la indicaci´on que se est´a tratando, la respuesta deseada, el estado del paciente, etc.

Las prote´ınas de TNF-R solubles se administran con el prop´osito de inhibir respuestas dependientes de TNF. Se cree que una variedad de enfermedades o estados son causados por TNF, tales como caquexia ychoque s´eptico. Adem´as, otras citoquinas clave (IL-1, IL-2 y otros factores de estimulaci´on de colonias) tambi´en pueden inducir producci´on de TNF por el hu´esped significativa. Por lo tanto, pueden usarse composiciones de TNF-R soluble, por ejemplo, para tratar caquexia o choque s´eptico o para tratar efectos secundarios asociados con terapia de citoquinas. Debido a los papeles principales que IL1 e IL-2 juegan en la producci´on de TNF, una terapia de combinaci´on usando receptores de IL-1 o receptores de IL-2 puede preferirse en el tratamiento de indicaciones cl´ınicas asociadas con TNF.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustraci´on, y no a modo de limitaci´on.

Ejemplos

Ejemplo 1

Ensayos de Uni´on

A. Radiomarcaje de TNFα yTNFβ.TNFα humano recombinante, en forma de una prote´ına de fusi´on que contiene un octap´eptido hidr´ofilo en el t´ermino N, se expres´o en levadura como una prote´ına secretada y se purific´o por cromatograf´ıa de afinidad (Hopp y otros, Bio/Technology 6:1204, 1988). El TNFβ humano recombinante se adquiri´o de R&D Systems (Minneapolis, MN). Ambas prote´ınas se radiomarcaron usando el agente en fase s´olida disponible comercialmente, IODO-GEN (Pierce). En este procedimiento, 5 μg de IODO-GEN se cultivaron en placas en el fondo de un tubo de vidrio de 10 x 75 mm y se incubaron durante 20 minutos a 4◦C con 75 μlde fosfato s´odico 0,1 M, pH 7,4, y 20 μl(2 mCi) de Na 125I. Esta soluci´on se transfiri´o a continuaci´on a un segundo tubo de vidrio que conten´ıa 5 μgde TNFα (o TNFβ)en 45 μl de PBS durante 20 minutos a 4◦C. La mezcla de reacci´on se fraccion´omediante filtraci´on en gel en un volumen de lecho de 2 ml de Sephadex G-25 (Sigma) equilibrado en medio 1640 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) que conten´ıa un 2,5% (p/v) de alb´umina de suero bovino (BSA), un 0,2% (p/v) de azida s´odica y Hepes 20 mM, pH 7,4 (medio de uni´on). La combinaci´on final de 125I-TNF se diluy´o hasta una soluci´on de reserva de trabajo de 1 x 10−7 M en medio de uni´on y se almacen´o durante un mes a 4◦Csin p´erdida detectable de actividad de uni´on al receptor. La actividad espec´ıfica es rutinariamente 1 x 106 cpm/mmol de TNF.

B. Uni´on a C´elulas Intactas. Se efectuaron ensayos de uni´on con c´elulas intactas mediante dos m´etodos. En el primer m´etodo, las c´elulas se hicieron crecer en primer lugar en suspensi´on (por ejemplo U 937) o mediante adherencia sobre placas de cultivo de tejidos (por ejemplo, WI26-VA4, expresando las c´elulas COS el receptor de TNF recombinante). Las c´elulas adherentes se eliminaron posteriormente mediante tratamiento con EDTA 5 mM durante 10 minutos a 37 grados cent´ıgrados. Los ensayos de uni´on se realizaron a continuaci´on mediante un m´etodo de separaci´on de aceite de ftalato (Dower y otros, J. Immunol 132:751, 1984) esencialmente como se describe por Park y otros (J. Biol. Chem. 261:4177, 1986). La uni´on no espec´ıfica de 125I-TNF se midi´o en presencia de un exceso molar de 200 veces o m´as de TNF no marcado. Se incluy´oazida s´odica (0,2%) en un ensayo de uni´on para inhibir la internalizaci´on de 125ITNF por las c´elulas. En el segundo m´etodo, se ensay´o la capacidad de c´elulas COS transfectadas con el pl´asmido que contiene TNF-R, y que expresan receptores de TNF sobre la superficie, para unirse a 125I-TNF mediante el ensayo de uni´on en placa descrito por Sims y otros (Science 241:585, 1988).

C. Ensayos de Uni´on en Fase S´olida. La capacidad de TNF-R para adsorberse establemente a nitrocelulosa a partir de extractos detergentes de c´elulas humanas que todav´ıa retienen la actividad de uni´on a TNF proporcionaba un medio para detectar TNF-R. Se prepararon extractos de c´elulas mezclando un n´odulo de c´elulas con 2 x un volumen de PBS que contiene Triton X-100 al 1% y un c´octel de inhibidores de proteasa (fluoruro de fenilmetil-sulfonilo 2 mM, pepstatina 10 μM, leupeptina 10 μM, o-fenantrolina 2 mM y EGTA 2 mM) sometiendo a un v´ortice vigoroso. La mezcla se incub´o en hielo durante 30 minutos, despu´es de lo cual se centrifug´o a 12.000 x g durante 15 minutos a 8◦C para eliminar los n´ucleos y otros residuos. Al´ıcuotas de 2 microlitros de extractos de c´elulas se pusieron sobre membranas de nitrocelulosa BA85/21 secas (Schleicher y Schuell, Keene, NH) y se dejaron secar. Las membranas se incubaron en discos para cultivo de tejidos durante 30 minutos en Tris (0,05 M) se a˜nadi´osoluci´on salina (0,15 M), pH 7,5, que conten´ıa un 3% p/v de BSA para bloquear los sitios de uni´on no espec´ıfica. La membrana se cubri´o a continuaci´on con 125ITNF 5 x 10−11 M en PBS + BSA al 3% y se incub´o durante 2 horas a 4◦Ccon remoci´on. Al final de este tiempo, las membranas se lavaron tres veces en PBS, y se secaron y se colocaron en una pel´ıcula X-Omat de Kodak durante 18 horas a -70◦C.

Ejemplo 2

Aislamiento de cDNA de TNF-R Humano Mediante Expresi´on Directa de Prote´ına Activa en C´elulas COS-7.

Se seleccion´ola expresi´on de TNF-R de diversas l´ıneas de c´elulas humanas bas´andose en su capacidad para unirse a TNF marcado con 125I. Se encontr´oque la l´ınea de c´elulas de fibroblastos humanos WI-26 VA4 expresaba un n´umero razonable de receptores por c´elula. Los estudios de uni´on en equilibrio mostraban que la l´ınea de c´elulas exhib´ıa uni´on bif´asica de 125I-TNF con aproximadamente 4.000 sitios de alta afinidad (Ka =1x 1010 M−1) y 15.000 sitios de baja afinidad (Ka =1x 108 M−1)por c´elula.

Se construy´o una biblioteca de cDNA no dimensionada mediante transcripci´on inversa de mRNA poliadenilado aislado de RNA total extra´ıdo de c´elulas fibrobl´asticas humanas WI-26 VA4 que se hacen crecer en presencia de mit´ogeno de hierba carminera usando t´ecnicas est´andar (Gubler y otros, Gene 25:263, 1983; Ausubel y otros, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1987). Las c´elulas se recogieron mediante lisis de las c´elulas en una soluci´on de hidrocloruro de guanidina y el RNA total se aisl´o como se describe previamente (March y otros, Nature 315:641, 1985).

Poli A+ RNA se aisl´o mediante cromatograf´ıa con oligo-dTcelulosa y se prepar´ocDNA de doble filamento mediante un m´etodo similar al de Gubler y Hoffman (Gene 25:263, 1983). En resumen, el poli A+ RNA se convirti´o enunh´ıbrido de RNA-cDNA mediante transcriptasa inversa usando oligo-dT como iniciador. El h´ıbrido de RNA-cDNA se convirti´o a continuaci´on en cDNA de doble filamento usando RNAasa H en combinaci´on con DNApolimerasa I. El cDNA de doble filamento resultante se trunc´oen los extremos con DNA-polimerasa T4. Al cDNA truncado en los extremos se a˜nadieron adaptadores de enlazador EcoRI (que tiene sitios NotI internos) que se fosforilaron en un solo extremo (gen in vitro). El cDNA adaptado por enlazador se trat´o con polinucle´otido-quinasa T4 para fosforilar la regi´on saliente 5’ del adaptador de enlazador y los enlazadores no ligados se eliminaron haciendo pasar el cDNA sobre una columna de Sepharose CL4B. El cDNA adaptado por enlazador se lig´o a una concentraci´on equimolar de corte de EcoR1 y brazos desfosforilados de bacteri´ofago λgt10 (Huynh y otros, DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, ed., IRL Press, pp. 49-78). El DNA ligado se empaquet´oen part´ıculas de fago usando un estuche disponible comercialmente para generar una biblioteca de recombinantes (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, EE.UU.). Los recombinantes se ampliaron adicionalmente cultivando en placas fago sobre un tamiz bacteriano de cepa de E. coli c600(hfl−).

El DNA de fago se purific´o de la biblioteca de cDNA de λgt10 resultante y los insertos de cDNA se cortaron por digesti´on con la enzima de restricci´on Not1. Despu´es de la electroforesis del digesto a trav´es de un gel de agarosa, se aislaron cDNAs mayores de 2.000 pb.

Los cDNAs resultantes se ligaron en el vector de expresi´on eucari´otico pCAV/NOT, que se dise˜n´opara expresar secuencias de cDNA insertadas en su sitio de clonaci´on m´ultiple cuando se transfectan a c´elulas de mam´ıfero. pCAV/NOT se mont´o a partir de pDC201 (un derivado de pMLSV, descrito previamente por Cosman y otros, Nature 312:768, 1984), SV40 y DNA de citomegalovirus y comprende, en secuencia con la direcci´on de la transcripci´on desde el origen de la replicaci´on: (1) secuencias SV40 de coordinados 5171-270 que incluyen el origen de replicaci´on, secuencias mejoradoras y promotores inicial y final; (2) secuencias de citomegalovirus que incluyen las regiones promotora y mejoradora (nucle´otidos 671 a +63 de la secuencia publicada por Boechart y otros (Cell 41:521, 1985); (3) secuencias de adenovirus-2 que contienen el primer ex´on y parte del intr´on entre los exones primero y segundo del conductor tripartito, el segundo ex´on y parte del tercer ex´on del conductor tripartito en un sitio de clonaci´on m´ultiple (MCS) que contiene sitios para Xhol, Kpn1, Sma1, Not1 y Bgl1; (4) secuencias de SV40 de coordinados 4127-4100 y 2770-2533 que incluyen las se˜nales de poliadenilaci´on y terminaci´on para la transcripci´on primera; (5) secuencias derivadas de pBR322 y secuencias asociadas con virus VAI y VAII de pDC201, con secuencias de adenovirus 10532-1156 que contienen los genes VAI y VAII, seguidas por secuencias de pBR322 de 4363-2486 y 1094375 que contienen el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de replicaci´on.

La biblioteca de cDNA de WI-26 VA4 resultante en pCAV/NOT se us´oparatransformar cepade E. coli DH5α, y se cultivaron en placas los recombinantes para proporcionar aproximadamente 800 colonias por placa y suficientes placas para proporcionar aproximadamente 50.000 colonias totales por selecci´on. Las colonias se retiraron de cada placa, se combinaron, y se prepar´o DNA de pl´asmido de cada combinaci´on. El DNA combinado se us´o a continuaci´on para transfectar una capa subconfluente de c´elulas COS-7 de mono usando DEAE-dextrano seguido por tratamiento con cloroquina, seg´un se describe por Luthman y otros (Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983) y McCutchan y otros (J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986). Las c´elulas se hicieron crecer en cultivo durante tres d´ıas para permitir la expresi´on transitoria de las secuencias insertadas. Despu´es de tres d´ıas, los sobrenadantes de cultivo se descartaron y las monocapas de c´elulas en cada placa se ensayaron para la uni´on a TNF como sigue. 3 ml de medio de

R

uni´on que conten´ıa FLAG®-TNF marcado por 125I1,2 x10−11 Mse a˜nadi´o a cada placa y las placas se incubaron a 4◦C durante 125 minutos. Este medio se descart´o a continuaci´on, y cada placa se lav´o una vez con medio de uni´on fr´ıo (que no conten´ıa TNF marcado) y dos veces con PBS fr´ıo. Los bordes de cada placa se rompieron a continuaci´on, dejando un disco plano que se puso en contacto con pel´ıcula de rayos X durante 72 horas a -70◦C usando un pantalla de intensificaci´on. La actividad de uni´on a TNF se visualiz´osobre las pel´ıculas expuestas como un foco oscuro contra un fondo relativamente uniforme.

Despu´es de que se hubieron seleccionado aproximadamente 240.000 recombinantes de la biblioteca de esta manera, se observ´o que una combinaci´on de transfectante proporcionaba focos de uni´on a TNF que eran claramente evidentes contra la exposici´on de fondo.

Un material congelado de bacterias de la combinaci´on positiva se us´o a continuaci´on para obtener placas de aproximadamente 150 colonias. Se hicieron r´eplicas de estas placas sobre filtros de nitrocelulosa, y las placas se separaron a continuaci´on y se prepar´o DNA de pl´asmido y se transfect´o como se describe anteriormente para identificar una placa positiva. Las bacterias de colonias individuales de la r´eplica de nitrocelulosa de esta placa se hicieron crecer en cultivos de 0,2 ml, que se usaron para obtener DNA de pl´asmido, que se transfect´oen c´elulas COS-7 seg´un se describe anteriormente. De esta manera, se aisl´o un solo clon, clon 1, que era capaz de inducir la expresi´on de TNF-R humano en c´elulas COS. El vector de expresi´on pCAV/NOT que conten´ıa el clon de cDNA de TNF-R se ha depositado en the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU. (N◦ de Registro 68088) bajo el nombre pCAV/NOT-TNF-R, el 6 de Septiembre de 1989.

Ejemplo 3

Construcci´on de cDNAs que Codifican huTNF-RΔ235 Soluble

Un cDNA que codifica un huTNF-RΔ235 soluble (que tiene la secuencia de amino´acidos 1-235 de la Figura 2A) se construy´o cortando un fragmento de 840 pb de pCAV/NOT-TNF-R con las enzimas de restricci´on Not1 y Pvu2. Not1 corta en el sitio de clonaci´on m´ultiple de pCAV/NOT-TNF-R y Pvu2 corta dentro de la regi´on de codificaci´on de TNF-R 20 nucle´otidos 5’ de la regi´on de transmembrana. Para reconstruir el extremo 3’ de las secuencias de TNF-R, se sintetizaron dos oligonucle´otidos y se hibridaron para crear el siguiente enlazador de oligonucle´otidos:

Este enlazador de oligonucle´otidos tiene sitios de restricci´on de Pvu2 y Bgl2 terminales, regenera 20 nucle´otidos del TNF-R, seguido por un cod´on de terminaci´on (subrayado) y un sitio de restricci´on de BamH1 (para comodidad al aislar el TNF-R soluble total mediante digesti´on con Not1/BamH1). Este oligonucle´otido se lig´o a continuaci´on con el inserto de TNF-R de Not1/Pvu2 de 840 pb en pCAV/NOT cortado con Bgl2/Not1 para dar psolhuTNFRΔ235/CAVNOT, que se transfect´oen c´elulas COS-7 seg´un se describe anteriormente. Este vector de expresi´on induce la expresi´on de TNF-R humano soluble que es capaz de unirse a TNF.

Ejemplo 4

Construcci´on de cDNAs que Codifican huTNF-RΔ185 Soluble

Un cDNA que codifica un huTNF-RΔ185 soluble (que tiene la secuencia de amino´acidos 1-185 de la Figura 2A) se construy´o cortando un fragmento de 640 pb de pCAV/NOT-TNF-R con las enzimas de restricci´on Not1 y Bgl2. Not1 corta en el sitio de clonaci´on m´ultiple de pCAV/NOT-TNF-R y Bgl2 corta dentro de la regi´on de codificaci´on de TNF-R en el nucle´otido 637, que est´a 237 nucle´otidos 5’ de la regi´on de transmembrana. Se sintetizaron los siguientes enlazadores de oligonucle´otidos:

Los enlazadores de oligonucle´otidos anteriores reconstruyen el extremo 3’ de la mol´ecula receptora hasta el nucle´otido 608, seguido por un cod´on de terminaci´on (subrayado). Estos oligonucle´otidos se ligaron a continuaci´on con el inserto de TNF-R Not1 de 640 pb en pCAV/NOT cortado con Not1 para dar el vector de expresi´on psolTNF-RΔ185/CAVNOT, que se transfect´oen c´elulas COS-7 como se describe anteriormente. Este vector de expresi´on induc´ıa la expresi´on de TNF-R humano soluble que era capaz de unirse a TNF.

Ejemplo 5

Construcci´on de cDNAs que Codifican huTNF-RΔ163 Soluble

Un cDNA que codifica un huTNF-RΔ163 soluble (que tiene la secuencia de amino´acidos 1-163 de la Figura 2A) se construy´o cortando un fragmento de 640 pb de pCAV/NOT-TNF-R con las enzimas de restricci´on Not1 y Bgl2 seg´un se describe en el Ejemplo 4. Se sintetizaron los siguientes enlazadores de oligonucle´otidos:

Este enlazador de oligonucle´otidos anterior reconstruye el extremo 3’ de la mol´ecula receptora hasta el nucle´otido 642 (amino´acido 163), seguido por un cod´on de terminaci´on (subrayado). Este oligonucle´otido se lig´o a continuaci´on con el inserto de TNF-R de Not1 de 640 pb en pCAV/NOT cortado con Not1 para dar el vector de expresi´on psolTNFRΔ163/CAVNOT, que se transfect´oen c´elulas COS-7 seg´un se describe anteriormente. Este vector de expresi´on induc´ıa la expresi´on de TNF-R humano soluble que era capaz de unirse a TNF en el ensayo de uni´on descrito en el Ejemplo 1.

Ejemplo 6

Construcci´on de cDNAs que Codifican huTNF-RΔ142 Soluble

Un cDNA que codifica un huTNF-RΔ142 soluble (que tiene la secuencia de amino´acidos 1-142 de la Figura 2A) se construy´o cortando un fragmento de 550 pb de pCAV/NOT-TNF-R con las enzimas de

restricci´on Not1 y AlwN1. AlwN1 corta dentro de la regi´on de codificaci´on de TNF-R en el nucle´otido

549. Se sintetiz´o el siguiente enlazador de oligonucle´otidos:

Este enlazador de oligonucle´otidos anterior reconstruye el extremo 3’ de la mol´ecula receptora hasta el nucle´otido 579 (amino´acido 142), seguido por un cod´on de terminaci´on (subrayado). Este oligonucle´otido se lig´o a continuaci´on con el inserto de TNF-R de Not1/AlwN1 de 550 pb en pCAV/NOT cortado con Not1/Bgl2 para dar el vector de expresi´on psolTNFRΔ142/CAVNOT, que se transfect´oen c´elulas COS7seg´un se describe anteriormente. Este vector de expresi´on no induc´ıa la expresi´on de TNFR humano soluble que era capaz de unirse a TNF. Se cree que esta construcci´on particular no expresaba TNF-R biol´ogicamente activo debido a que se eliminaban uno o m´as residuos de ciste´ına esenciales (por ejemplo, Cys157 oCs163) requeridos para uni´on intramolecular (para formaci´on de la estructura terciaria apropiada de la mol´ecula de TNF-R).

Ejemplo 7

Expresi´on de Receptores de TNF Solubles en C´elulas de CHO

El receptor de TNF soluble se expres´oen c´elulas de Ovario de H´amster Chino (CHO) usando el sistema de amplificaci´on del gen de glutamina-sintetasa (GS), substancialmente como se describe en las solicitudes de patente PCT N◦ Wo 87/04462 y WO 89/01036. En resumen, las c´elulas de CHO se transfectan con un vector de expresi´on que contiene genes para TNF-R y GS. Las c´elulas de CHO se seleccionan para expresi´on de gen de GS bas´andose en la capacidad del DNA transfectado para conferir resistencia a bajos niveles de metionina-sulfoximina (MSX). Los casos de ampliaci´on de la secuencia de GS en tales c´elulas se seleccionan usando concentraciones de MSX elevadas. De este modo, secuencias de TNF-R contiguas tambi´en se amplifican y se alcanza expresi´on de TNF-R mejorada.

El vector usado en el sistema de expresi´on de GS era psolTNFR/P6/PSVLGS, que se construy´o como sigue. En primer lugar el vector pSVLGS.1 (descrito en las Solicitudes PCT N◦ WO87/04462 y WO89/01036, y disponible de Celltech, Ltd. Berkshire, UK) se cort´o con enzima de restricci´on BamH1 y se desfosforil´o con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP) para evitar que el vector se religara a s´ı mismo. El fragmento de pSVLGS.1 cortado con BamH1 se lig´o a continuaci´on a un fragmento de BamH1 a Bgl2 de 2,4 kb de pEE6hCMV (descrito en la Solicitud PCT N◦ WO89/01036, tambi´en disponible de Ceeltech) que se cort´o con Bgl2, BamH1 y Fsp1 para evitar dos fragmentos de tama˜no similar, para dar un vector de 11,2 kb denominado p6/PSVLGS.1. pSVLGS.1 contiene el gen marcador seleccionable de glutamina-sintetasa bajo control del promotor final de SV40. El fragmento de BamH1 a Bgl2 de pEE6hCMV contiene el promotor primario inmediato principal de citomegalovirus humano (hCMV), un polienlazador, y la se˜nal de poliadenilaci´on primaria de SV40. Las secuencias de codificaci´on para TNF-R soluble se a˜nadieron a p6/PSVLGS.1 cortando un fragmento de Not1 a BamH1 del vector de expresi´on psolTNFR/CAVNOT (elaborado de acuerdo con el Ejemplo 3 anterior), se trunc´o en los extremos con Klenow y se lig´o con p6/PSVLGS.1 desfosforilado cortado con SmaI, colocando de ese modo las secuencias de codificaci´on de solTNF-R bajo el control del promotor de hCMV. esto daba como resultado un solo vector de pl´asmido en el que las unidades de transcripci´on SV40/GS y hCMB/solTNF-R se transcriben en direcciones opuestas. Este vector se denomin´o psolTNFR/P6/PSVLGS.

psolTNFR/P6/PSVLGS se us´o para transfectar c´elulas de CHOK1 (disponibles de ATCC, Rochville, MD, bajo el n´umero de registro CCL 61) como sigue. Una monocapa de c´elulas CHO-K1 se hizo crecer hasta su confluencia en Medio Esencial M´ınimo (MEM) 10X (Gibco: 330-1581AJ) sin glutamina y complementado con suero bovino fetal dializado al 10% (Gibco: 220-6300AJ), piruvato s´odico 1 mM (Sigma), amino´acidos no esenciales en MEM (Gibco: 320-1140AG), asparagina y glutamato 500 mM (Sigma) y nucle´osidos (adenosina, guanosina, citidina y uridina 30 μM y timidina 10 μM) (Sigma).

Aproximadamente 1 x 106 c´elulas por c´apsula de Petri de 10 cm se transfectaron con 10 μgde psolTNFR/P6/PSVLGS mediante precipitaci´on con fosfato c´alcico est´andar, substancialmente como se describe por Graham & van der Eb, Virology 52:456 (1983). Las c´elulas se sometieron a choque con glicerol (glicerol al 15% en medio de cultivo libre de suero durante aproximadamente 1,5 minutos) aproximadamente 4 horas despu´es de la transfecci´on, substancialmente como se describe por Frost & Williams, Virology 91:39 (1978), y a continuaci´on se lavaron con medio libre de suero. Un d´ıa m´as tarde, las c´elulas transfectadas se alimentaron con medio selectivo reciente que contiene MSX con una concentraci´on final de 25 μm. Las colonias de c´elulas supervivientes resistentes a MSX eran visibles en 3-4 semanas. Las colonias supervivientes se transfectaron a placas de 24 cavidades y se dejaron crecer hasta confluencia en medio selectivo. Se ensay´o a continuaci´on de la actividad de TNF-R soluble del medio acondicionado de cavidades confluentes usando el ensayo de uni´on descrito en el Ejemplo 1 anteriormente. Estos ensayos indican que las colonias expresaban TNF-R soluble biol´ogicamente activo.

Para seleccionar para ampliaci´on del gen GS, varias l´ıneas de c´elulas resistentes a MSX se transfectan con psolTNFR/P6/PSVLGS y se dejan crecer en diversas concentraciones de MSX. Para cada l´ınea de c´elulas, aproximadamente 1 x 106 c´elulas se cultivan en placas en concentraciones gradualmente crecientes de 100 μm, 250 μm, 500 μmy1 μm de MSX y se incuban durante 10-14 d´ıas. Despu´es de 14 d´ıas, aparecen colonias resistentes a los niveles superiores de MSX. Se ensaya la actividad de TNF-R de las colonias supervivientes usando el ensayo de uni´on descrito arriba en el Ejemplo 1. Cada una de estas l´ıneas de c´elulas altamente resistentes contiene c´elulas que surgen de m´ultiples casos de ampliaci´on independientes. A partir de estas l´ıneas de c´elulas, se a´ısla una o m´as de las l´ıneas de c´elulas m´as altamente resistentes. Las c´elulas ampliadas con altas velocidades de producci´on se clonan a continuaci´on limitando la clonaci´on en diluci´on. Los cultivos de c´elulas en masa de los transfectantes secretan TNF-R soluble activo.

Ejemplo 8

Expresi´on de TNF-R Humano Soluble en Levadura

TNF-R humano soluble se expres´o en levadura con el vector de expresi´on pIXY432, que derivaba del vector de expresi´on de levadura pIXY120 y del pl´asmido pYEP352. pIXY120 es id´entico a pYαHuGM (ATCC 53157), excepto que no contiene inserto de cDNA e incluye un sitio polienlazador/de clonaci´on m´ultiple con un sitio de restricci´on de Nco1.

Un fragmento de DNA que codifica receptor de TNF y adecuado para clonaci´on en el vector de expresi´on de levadura pIXY120 se gener´o en primer lugar mediante ampliaci´on por reacci´on en cadena de polimerasa (PCR) de la porci´on extracelular del receptor de longitud total de pCAV/NOT-TNF-R (ATCC 68088). Los siguientes iniciadores se usaron en esta ampliaci´on por PCR:

Iniciador del Extremo 5’

Iniciador del Extremo 3’ (sentido contrario)

El iniciador de oligonucle´otidos del extremo 5’ usado en la ampliaci´on inclu´ıa un sitio de restricci´on de Asp718 en su extremo 5’, seguido por nucle´otidos que codifican el extremo 3’ de la secuencia conductora de factor α de levadura (Pro-Leu-Asp-Lys-Arg) y aqu´ellos que codifican los 8 amino´acidos del p´eptido

R

FLAG®(AspTyrLysAspAspAspAspLys) fusionado a la secuencia que codifica el extremo 5’ del receptor

R

maduro. El p´eptido FLAG®(Hopp y otros, Bio/Technology 6:1204, 1988) es una secuencia altamente antig´enica que se une reversiblemente al anticuerpo monoclonal M1 (ATCC HB 9259). El oligonucle´otido usado para generar el extremo 3’ del fragmento derivado por PCR es el filamento de sentido contrario de DNA que codifica secuencias que terminan el cuadro de lectura abierto del receptor despu´es del nucle´otido 704 de la regi´on de codificaci´on madura (despu´es del residuo Asp que precede al dominio de transmembrana) introduciendo un cod´on de detenci´on TAA (subrayado). El cod´on de detenci´on es seguido a continuaci´on por un sitio de restricci´on BamH1. Las secuencias de DNA que codifican TNF-R se ampl´ıan a continuaci´on mediante PCR, substancialmente como se describe por Innis y otros, eds., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, 1990).

El fragmento de DNA derivado por PCR que codifica TNF-R humano soluble se subclon´o en el vector de expresi´on de levadura pIXY120 digiriendo el fragmento de DNA derivado por PCR con enzimas de restricci´on BamH1 y Asp718, digiriendo pIXY120 con BamH1 y Asp718, y ligando el fragmento de PCR al vector de corte in vitro con DNA-ligasa T4. La construcci´on resultante (pIXY424) fusiona el cuadro de

R

lectura abierto del receptor de TNF soluble en FLAG®en cuadro con la secuencia conductora de factor α completa ycolocalaexpresi´on en la levadura bajo el auspicio del promotor regulado de alcoholdeshidrogenasa (ADH2) de levadura. La identidad de la secuencia de nucle´otidos del receptor de TNF soluble llevado en pIXY424 con aqu´ellos en el clon 1 de cDNA se verific´o mediante secuenciaci´on de DNA usando el m´etodo de terminaci´on de la cadena de disesoxinucle´otido. pIXY424 se transform´o a continuaci´on en cepa de E. coli RR1.

El receptor de TNF humano soluble tambi´en se expres´o y secret´o en levadura en un segundo vector. Este segundo vector se gener´o recubriendo el pl´asmido pIXY424 de E. coli y digiriendo con enzimas de restricci´on EcoR1 y BamH1 para aislar el fragmentoos que abarca la regi´on que codifica el promotor

R

ADH2, el conductor de factor α, el receptor de TNF soluble en FLAG®yel cod´on de detenci´on. Este fragmento se lig´oin vitro en pl´asmido pYEP352 cortado con EcoR1 y BamH1 (Hill y otros, Yeast 2:163 (1986)), para dar el pl´asmido de expresi´on pIXY432, que se transform´o en cepa de E. coli RR1.

Para probar la secreci´on del receptor de TNF humano soluble a partir de levadura, pIXY424 se purific´o y se introdujo en una cepa de levadura diploide de S. cerevisiae (XV2181) mediante electroporaci´on y selecci´on para adquisici´on del gen TRP1+ de levadura llevado por el pl´asmido sobre medio que carece de tript´ofano. Para ensayar la secreci´on del receptor dirigido por pIXY432, el pl´asmido se introdujo en la cepa de levadura PB149-6b mediante electroporaci´on seguida por selecci´on para el gen URA3+ llevado por el pl´asmido con crecimiento sobre medio que carece de uracilo. Los cultivos durante la noche se dejaron crecer a 30◦C en los medios selectivos apropiados. Los transformantes PB149-6b/pIXY434 se diluyeron en medio de YEP-glucosa al 1% y se dejaron crecer a 30◦C durante 38-40 horas. Los sobrenadantes se prepararon por eliminaci´on de c´elulas mediante centrifugaci´on, y filtraci´on de los sobrenadantes a trav´es de filtros de 0,45 μ.

El nivel de receptor secretado en los sobrenadantes se determin´o mediante inmuno-goteo-manchado. En resumen, 1 μl de sobrenadantes, y diluciones de los sobrenadantes, se hizo gotear sobre filtros de nitrocelulosa y se dejaron secar. Despu´es de bloquear la uni´on a prote´ınas no espec´ıfica con una soluci´on

R

de BSA al 3%, los filtros se incubaron con anticuerpo anti-FLAG®M1 diluido, el anticuerpo en exceso se elimin´o mediante lavado y a continuaci´on diluciones de anticuerpos anti-IgG de rat´on conjugados con peroxidasa de r´abano picante se incubaron con los filtros. Despu´es de la eliminaci´on de los anticuerpos secundarios en exceso, se a˜nadieron substratos de peroxidasa y se dej´o que procediera el desarrollo de color durante aproximadamente 10 minutos antes de la eliminaci´on de la soluci´on de substrato.

R

El material reactivo anti-FLAG®encontrado en los sobrenadantes mostraba que eran secretados niveles significativos de receptor por ambos sistemas de expresi´on. Las comparaciones mostraban que el sistema pIXY432 secretaba aproximadamente 8-16 veces m´as receptor de TNF humano soluble que el sistema pIXY424. Se ensay´o la actividad de TNF-R soluble de los sobrenadantes, seg´un se describe en el Ejemplo 1, mediante su capacidad para unirse a 125I-TNFα y bloquear la uni´on a TNFα.Se encontr´o que los sobrenadantes de pIXY432 conten´ıan niveles significativos de TNF-R soluble activo.

Ejemplo 9

Aislamiento de cDNAs de TNF-R de Rat´on

Se aislaron cDNAs de TNF-R de rat´on a partir de una biblioteca de cDNA elaborada de c´elulas 7B9 de rat´on, una l´ınea de c´elulas T cooperadoras dependientes de ant´ıgeno derivada de rat´on C57BL/6, mediante hibridaci´on de especies cruzadas con una prueba de TNF-R humano. La biblioteca de cDNA se construy´oen λZAP (Stratagene, San Diego), substancialmente como se describe anteriormente en el Ejemplo 2, aislando RNA poliadenilado de las c´elulas 7B9.

Una prueba de cDNA de TNF-R humano de doble filamento se produjo cortando un fragmento de Not1 de aproximadamente 3,5 kb del clon 1 de TNF-R humano y marcando son 32P el cDNA usando iniciadores al azar (Boehringer-Mannheim).

La biblioteca de cDNA de rat´on se ampli´o una vez y se seleccionaron un total de 900.000 placas, substancialmente como se describe en el Ejemplo 2, con la prueba de cDNA de TNF-R humano. Aproximadamente 21 placas positivas se purificaron, y los pl´asmidos de Bluescript que conten´ıan insertos enlazados con EcoR1 se cortaron (Stratagene, San Diego). La secuenciaci´on de ´acidos nucleicos de una porci´on de clon 11 de TNF-R de rat´on indicaba que la secuencia de codificaci´on del TNF-R de rat´on era aproximadamente un 88% hom´ologa a la secuencia de nucle´otidos correspondiente de TNF-R humano. Una secuencia de nucle´otidos parcial de clon 11 de cDNA de TNF-R de rat´on se indica en las Figuras 3A-3B.

Ejemplo 10

Preparaci´on de Anticuerpos Monoclonales para TNF-R

Se emplearon preparaciones de TNF-R recombinante purificado, por ejemplo, TNF-R humano, o c´elulas COS transfectadas que expresan altos niveles de TNF-R para generar anticuerpos monoclonales contra TNF-R usando t´ecnicas convencionales, por ejemplo, aqu´ellas descritas en la Patente de EE.UU.

4.411.993. Es posible que tales anticuerpos sean ´utiles para interferir con la uni´on de TNF a receptores de TNF, por ejemplo, para mejorar efectos t´oxicos u otros efectos no deseados del TNF, o como componentes de ensayo de diagn´ostico o investigaci´on para TNF o receptor de TNF soluble.

Para inmunizar los ratones, inmun´ogeno de TNF-R se emulsiona en adyuvante de Freund completo y se inyecta en cantidades que var´ıan de 10-100 μgsubcut´aneamente en ratones Balb/c. De diez a veinte d´ıas m´as tarde, los animales inmunizados se estimulan con inmun´ogeno adicional emulsionado en adyuvante de Freund incompleto y se estimulan peri´odicamente posteriormente con un esquema de inmunizaci´on de semanal a bisemanal. Muestras de suero se toman peri´odicamente mediante sangrado retroorbital o escisi´on de la punta del rabo para ensayar mediante ensayo de goteo-manchado (s´andwich de anticuerpos) o ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas). Tambi´en son adecuados otros procedimientos. Despu´es de la detecci´on de una concentraci´on de anticuerpo apropiada, se les da a los animales positivos una inyecci´on intravenosa de ant´ıgeno en soluci´on salina. De tres a cuatro d´ıas m´as tarde, los animales se sacrifican, los esplenocitos se recogen y se fusionan con la l´ınea de c´elulas de mieloma de rat´on NS1. Las l´ıneas de c´elulas de hibridoma generadas mediante este procedimiento se cultivan en placas sobre placas de microvaloraci´on m´ultiples en un medio selectivo de HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferaci´on de c´elulas no fusionadas, h´ıbridos de mieloma, e h´ıbridos de c´elulas del bazo.

Losclonesdehibridoma as´ı generados pueden seleccionarse mediante ELISA para reactividad con TNF-R, por ejemplo, mediante adaptaciones de la t´ecnica descrita por Engvall y otros, Immunochem.

8:871 (1971) y en la Patente de EE.UU. 4.703.004. Los clones positivos se inyectan a continuaci´on en las cavidades peritoneales de ratones Balb/c singen´eticos para producir ascitis que contienen altas concentraciones (>1 mg/ml) de anticuerpo monoclonal anti-TNF-R. El anticuerpo monoclonal resultante puede purificarse mediante precipitaci´on con sulfato am´onico seguida por cromatograf´ıa de exclusi´on en gel, y/o cromatograf´ıa de afinidad basada en la uni´on de anticuerpo a Prote´ına A de Staphylococcus aureus.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una secuencia de DNA aislada que codifica una proteína de receptor de TNF (TNF-R) de mamífero biológicamente activa seleccionada de:

   (a)

   los aminoácidos 1-x de la Figura 2A, donde x se selecciona de los aminoácidos 163235; y

   (b)

   los aminoácidos 1-233 de la Figura 3A.

2. 2. Una secuencia de DNA aislada que codifica una proteína de receptor de TNF (TNF-R) de mamífero biológicamente activa seleccionada de:

   (a)

   secuencias de DNA seleccionadas de la región de codificación del gen de TNF-R natural de mamífero de la Figura 2A-2B o la Figura 3A-3B;

   (b)

   secuencias de DNA capaces de hibridar a las secuencias de (a) bajo condiciones moderadamente rigurosas, esto es a 50ºC en 2xSCC; y

   (c)

   secuencias de DNA que están degeneradas como resultado del código genético hasta las secuencias de (a) – (b).

3. 3.

   Una secuencia aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que codifica una proteína de TNF-R humana soluble que comprende la secuencia de aminoácidos 1-235 de la Figura 2A.

4. 4.

   Una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el residuo de aminoácido 46 es reemplazado por Ile o Thr y el residuo de aminoácido 118 es reemplazado por Val o Ile.

5. 5.

   Una secuencia de DNA aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que codifica una proteína de TNF-R humana soluble que comprende la secuencia de aminoácidos 1-185 de la Figura 2A.

6. 6.

   Una secuencia de DNA aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que codifica una proteína de TNF-R humana soluble que comprende la secuencia de aminoácidos 1-163 de la Figura 2A.

7. 7.

   Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de DNA según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. 8.

   Un procedimiento para preparar una proteína de TNF-R de mamífero biológicamente activa que comprende cultivar una célula huésped adecuada que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 7 bajo condiciones que promueven la expresión.

9. 9.

   Una proteína de TNF-R de mamífero biológicamente activa purificada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de los residuos de aminoácidos 1-x de la Figura 2A, en la que x se selecciona de los aminoácidos 163-225; y los aminoácidos 1-233 de la Figura 3A.

10. 10.

    Una proteína de TNF-R biológicamente activa purificada de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende la secuencia de residuos de aminoácidos 1-235 de la Figura 2A.

11. 11.

    Una proteína de TNF-R biológicamente activa purificada de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende la secuencia de residuos de aminoácidos 1-185 de la Figura 2A.

12. 12.

    Una proteína de TNF-R biológicamente activa purificada de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende la secuencia de residuos de aminoácidos 1-163 de la Figura 2A.

13. 13.

    Uso de una proteína de TNF-R de mamífero según la reivindicación 9 en la preparación de un medicamento para regular respuestas inmunes en mamíferos.

14. 14.

    El método de la reivindicación 13, en el que la proteína de TNF-R es TNF-R humana y el mamífero a ser tratado es un ser humano.

15. 15.

    El uso de una proteína de TNF-R de mamífero según la reivindicación 12 en la preparación de una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral a un paciente humano para regular respuestas inmunes.

16. 16.

    Un procedimiento para detectar moléculas de TNF o TNF-R o la interacción de las mismas que comprende el uso de una proteína de receptor TNF de mamífero de acuerdo con la reivindicación 9, o codificada por las secuencias de DNA de las reivindicaciones 1 ó 2.

17. 17.

    Anticuerpos inmunoreactivos con receptores TNF de mamífero de acuerdo con la reivindicación

18. 9.