JP6732660B2 - 組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作するためのオルニチン代謝の調節 - Google Patents

Description

本出願は、２０１４年１月１３日に出願された米国特許仮出願第６１／９２６，４８１号の利益を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に援用する。

高等真核細胞では、メチル化、硫酸化、リン酸化、脂質付加及びグリコシル化を含めた様々な翻訳後修飾が行われている。分泌タンパク質、膜タンパク質及び小胞体を標的にするタンパク質または特定の細胞内オルガネラの多くがグリコシル化されることが知られている。グリコシル化は、特定のアミノ酸に糖部分が共有結合することであり、組換えタンパク質にとって最も一般的でかつ重要な翻訳後修飾の１つである。タンパク質のグリコシル化は、細胞内で多数の機能を有し、タンパク質の折り畳み及び品質管理、分子の輸送及び選別、並びに細胞表面受容体の相互作用などの重要な役割がある。

Ｎ−結合型グリコシル化は、タンパク質中の特定の認識配列（例えばＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を備えるアスパラギン残基へのオリゴ糖の付加によって行われる。Ｎ−結合型糖タンパク質は、マンノース（Ｍａｎ）、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びノイラミン酸からなる標準分枝構造を含む。高マンノースオリゴ糖は、通常、複数のマンノース残基（５つ以上）を有する２つのＮ−アセチルグルコサミンを含む。哺乳動物細胞培養で産生される糖タンパク質は、マンノース５（Ｍａｎ５）、マンノース６（Ｍａｎ６）、マンノース７（Ｍａｎ７）、マンノース８（Ｍａｎ８）及びマンノース９（Ｍａｎ９）などの高マンノース（ＨＭまたはＨＭＮ）グリコフォームを様々な量で含み得る。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって発現される組換え糖タンパク質のグリコフォームは、本来の遺伝要因によって概ね決定されるが、高マンノースグリコフォーム含有量は細胞培養条件による影響も受け得る（Ｐａｃｉｓ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８，２３４８−２３５８）。

グリコシル化は、組換えタンパク質薬物の治療有効性に影響することがある。グリコシル化が治療用糖タンパク質の生物活性、薬物動態、免疫原性、可溶性及び生体内クリアランスに影響を与えることから、グリコシル化の観察及び制御がバイオ医薬品製造の重要なパラメータとなっている。治療用タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量は、重要な品質属性であり、特定の治療用抗体の薬物動態特性に影響を及ぼすことがわかっている（Ｇｏｅｔｚｅ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１，９４９−５９；Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＭＡｂｓ ４，４７５−８７）。したがって、治療用タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を制御するための方法は有益であり得る。

医薬品産業では、組換え治療用糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作し制御することが必要とされており、それを行うための方法は有用であり得る。本発明は、組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を、宿主細胞のオルニチン代謝を調節することによって操作するための方法を提供する。

Ｐａｃｉｓ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８，２３４８−２３５８ Ｇｏｅｔｚｅ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１，９４９−５９ Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＭＡｂｓ ４，４７５−８７

本発明は、細胞培養にて組換えタンパク質を発現する宿主細胞を、宿主細胞のオルニチン代謝を調節する条件下で培養することを含む、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作するための方法を提供する。

一実施形態において、宿主細胞のオルニチン代謝は、宿主細胞中のオルニチンの蓄積を減少させることによって調節される。関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチンの蓄積は、アルギナーゼ阻害剤またはスペルミンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって調節される。別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチンの蓄積は、アルギナーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することで調節される。別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）またはＤＬ−ａ−ジフルオロメチルオルニチンである。別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）である。別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤はＤＬ−ａ−ジフルオロメチルオルニチンである。別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、少なくとも１０μＭである。別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、１０μＭ〜２ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、１０μＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、０．５ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、１ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、２ｍＭである。

別の実施形態において、宿主細胞中のオルニチンの蓄積は、３５μＭ以下のスペルミンを細胞培養培地に添加することによって調節される。関連実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭ〜３５μＭである。別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、１７μＭ〜３５μＭである。別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭ〜１７μＭである。別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、３５μＭである。別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、１７μＭである。別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭである。

別の実施形態において、宿主細胞のオルニチン代謝は、宿主細胞中のオルニチンの蓄積を増加させることによって調節される。関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチンの蓄積は、オルニチン、アルギニン、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ阻害剤またはアルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって調節される。更に別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、少なくとも０．６ｍＭのオルニチンを細胞培養培地に添加することによって調節される。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、０．６〜１４．８ｍＭである。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、６〜１４．８ｍＭである。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、０．６ｍＭである。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、６ｍＭである。

更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、１４．８ｍＭである。別の実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、少なくとも８．７ｍＭのアルギニンを細胞培養培地に添加することによって調節される。更に別の関連実施形態において、アルギニンの濃度は、８．７ｍＭ〜１７．５ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギニンの濃度は、８．７ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギニンの濃度は、１７．５ｍＭである。

別の実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ阻害剤、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤またはアルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することで調節される。関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することで調節される。更に別の関連実施形態において、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤は、α−デフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）である。更に別の関連実施形態において、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤は、ピペロニルブトキシド（ＰＢＯ）である。

別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することで調節される。更に別の関連実施形態において、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤は、５−フルオロメチルオルニチン（Ｆ−ＦＭＯｒｎ）である。更に別の関連実施形態において、宿主細胞は、一酸化窒素シンターゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することで調節される。更に別の関連実施形態において、一酸化窒素シンターゼ阻害剤は、２−エチル−２−チオプソイド尿素またはＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニン及びＬ^Ｇ−モノメチル−Ｌ−アルギニンである。更に別の関連実施形態において、一酸化窒素シンターゼ阻害剤は、Ｎ−ニトロ−Ｌ−アルギニン及びＬ^Ｇ−モノメチル−Ｌ−アルギニンである。

別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、アルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することで調節される。更に別の関連実施形態において、アルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤は、非対称性ジメチル−アルギニン（ＡＤＭＡ）である。

本発明は、高マンノースグリコフォーム含有量が減少した組換えタンパク質を産生するための方法であって、細胞培養にて組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞中のオルニチンの蓄積を減少させることによってオルニチン代謝が調節される、方法を提供する。関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、アルギナーゼ阻害剤またはスペルミンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって減少させる。

関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、アルギナーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することで減少させる。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）またはＤＬ−ａ−ジフルオロメチルオルニチンである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）である。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、ＤＬ−ａ−ジフルオロメチルオルニチンである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、少なくとも１０μＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、１０μＭ〜２ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、１０μＭ〜２０μＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、１０μＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、０．５ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、１ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、２ｍＭである。

別の実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、細胞培養培地中に３５μＭ以下のスペルミンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって減少させる。更に別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭ〜３５μＭである。更に別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、１７μＭ〜３５μＭである。更に別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、０．０７ｍＬ／Ｌ〜０．１７ｍＬ／Ｌである。更に別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、３５μＭである。更に別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、１７μＭである。更に別の関連実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭである。

本発明は、高マンノースグリコフォーム含有量が増加した組換えタンパク質を産生するための方法であって、細胞培養にて組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞中のオルニチン蓄積を増加させることによってオルニチン代謝が調節される、方法を提供する。関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチン、アルギニン、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ阻害剤またはアルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することによって増加させる。

別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、少なくとも０．６ｍＭのオルニチンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって増加させる。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、０．６〜１４．８ｍＭである。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、６〜１４．８ｍＭである。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、０．６ｍＭである。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、６ｍＭである。更に別の関連実施形態において、オルニチンの濃度は、１４．８ｍＭである。

別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、少なくとも８．７ｍＭのアルギニンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって増加させる。更に別の関連実施形態において、アルギニンの濃度は、８．７ｍＭ〜１７．５ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギニンの濃度は、８．７ｍＭである。更に別の関連実施形態において、アルギニンの濃度は、１７．５ｍＭである。

別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ阻害剤、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤またはアルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって増加させる。別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって、増加させる。更に別の関連実施形態において、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤は、α−デフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）である。更に別の関連実施形態において、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤は、ピペロニルブトキシド（ＰＢＯ）である。

別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって増加させる。更に別の関連実施形態において、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤は、５−フルオロメチルオルニチン（Ｆ−ＦＭＯｒｎ）である。

別の関連実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、一酸化窒素シンターゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって増加させる。更に別の関連実施形態において、一酸化窒素シンターゼ阻害剤は、２−エチル−２−チオプソイド尿素またはＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニン及びＬ^Ｇ−モノメチル−Ｌ−アルギニンである。

別の実施形態において、宿主細胞中のオルニチン蓄積は、アルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって増加させる。更に別の関連実施形態において、アルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤は、非対称性ジメチル−アルギニン（ＡＤＭＡ）である。

別の実施形態において、組換えタンパク質を発現する宿主細胞は、回分培養、流加培養、灌流培養またはこれらの組み合わせで培養される。更に別の関連実施形態において、培養は灌流培養である。更に別の関連実施形態において、灌流は連続灌流を含む。更に別の関連実施形態において、灌流速度は一定である。更に別の関連実施形態において、灌流は、１日当たり１．０作業容量以下の速度で実施される。更に別の関連実施形態において、灌流は、交互接線流によって実施される。

別の実施形態において、組換えタンパク質を発現する宿主細胞は、バイオリアクター内で培養される。更に別の関連実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。更に別の関連実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。更に別の関連実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。更に別の関連実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬで接種される。

別の実施形態において、組換えタンパク質を発現する宿主細胞は、無血清細胞培養培地中で培養される。別の関連実施形態において、無血清培養培地が灌流細胞培養培地である。更に別の関連実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。更に別の関連実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

別の実施形態において、組換えタンパク質は、糖タンパク質である。別の実施形態において、組換えタンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質またはサイトカインからなる群から選択される。

別の実施形態において、上記の方法は、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を回収する工程を更に含む。

別の実施形態において、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質は、精製され、薬学的に許容可能な製剤に製剤化される。

別の実施形態において、上述の方法のいずれかによって産生された組換えタンパク質が提供される。関連実施形態において、組換えタンパク質は精製される。別の実施形態において、組換えタンパク質は、薬学的に許容可能な製剤に製剤化される。

オルニチン代謝の概略。ＡＲＧ：アルギナーゼ、ＡＺ：アンチザイム、ＡＺＩＮ：アンチザイム阻害物質、Ｐ５Ｃ：ピロリン−５−カルボキシレート、ＡＳＰ：アスパラギン酸、ＯＲＮＴ：オルニチントランスポーター、ＧＡＴＭ：グリシンアミジノトランスフェラーゼ、ＮＯＳ：一酸化窒素シンターゼ、ＯＡＴ：オルニチンアミノトランスフェラーゼ、ＯＤＣ：オルニチンデカルボキシラーゼ、ＯＴＣ：オルニチントランスカルバモイラーゼ、ＳＭＳ：スペルミン合成酵素、ＳＲＳ：スペルミジン合成酵素。 高マンノースグリカン濃度に関係する代謝マーカとしてのオルニチンの特定。培地１（Ａ）または培地２（Ｂ）で評価した、流加プロセスの８日目（Ｄ８、白色の棒）、９日目（Ｄ９、灰色の棒）及び１０日目（Ｄ１０、黒色の棒）に検出された、８つの異なる細胞株（細胞株Ａ〜Ｈ）から分泌された組換えモノクローナル抗体の高マンノースグリカン濃度（％ＨＭ）。高マンノースグリカン濃度と消費培地で検出された細胞外オルニチン量との間の相関関係（Ｃ）。８つの細胞株からの９日目の平均オルニチン量と高マンノースグリカン濃度を比較した。ピアソンのＲ値：Ｒ＝０．８３。 高マンノース濃度と細胞外オルニチン量との間の相関関係：Ａ）細胞株Ｈを８つの異なる産生条件（＃１〜＃８）にさらして検出した高マンノースグリコフォーム含有量。Ｂ）対応する細胞外オルニチン相対量。Ｃ）高マンノースグリコフォーム含有量（％）と細胞外オルニチン相対量との間の相関関係。ピアソンのＲ値：Ｒ＝０．７８。 ８つの異なる細胞株から３、６、８、９及び１０日目に収集した細胞沈澱物のアルギナーゼ１のｍＲＮＡ相対発現量。対応する高マンノースグリコフォーム含有量とともに示す。 スペルミンテトラヒドロクロリドを０、７、１７、３５及び１００μＭの濃度で含む細胞培養培地中で増殖させた細胞によって発現された組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量。モック灌流アッセイの５日目にサンプルを収集した。３５μＭのサンプルを対照とした。 ０、７、１７、３５及び１００μＭの濃度のスペルミンテトラヒドロクロリドにさらした細胞培養によって内因的に産生された細胞外オルニチン量（ｍｇ／Ｌ）。モック灌流アッセイの５日目にサンプルを収集した。３５μＭのサンプルを対照とした。 Ｌ−オルニチン一塩酸塩を０、０．６、６及び１４．８ｍＭの濃度で含む細胞培養培地中で増殖させた細胞によって発現された組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量。モック灌流アッセイの５日目にサンプルを収集した。０ｍＭのサンプルを対照とした。 ０．１ｇ／ＬのＬ−オルニチン一塩酸塩を含む細胞培養培地（黒色の棒）または外因的に添加したオルニチンを含まない対照細胞培養培地（白色の棒）で増殖させた細胞株「Ｉ」によって発現された組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量。６、８及び１２日目にサンプルを収集した。 アルギニン一塩酸塩を２．２、４．４、６．５、８．７及び１７．５ｍＭの濃度で含む細胞培養培地中で増殖させた細胞によって発現された組換え糖タンパク質に関する高マンノースグリコフォーム含有量。８．７ｍＭのサンプルを対照とした。モック灌流アッセイの４日目にサンプルを収集した。 種々のアルギナーゼ阻害剤（１、１０及び２０μＭの濃度のＢＥＣ塩酸塩（ＢＥＣ）、ＤＬ−α，ジフルオロメチルオルニチン塩酸塩（ＤＬ−ａ）、Ｎ^Ｇ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン一酢酸塩（ＮＧ）及びＮω−ヒドロキシ−ｎｏｒ−アルギニン二酢酸塩（Ｎｗ））を追加した細胞培養培地中で増殖させた細胞によって発現された組換え糖タンパク質に関する高マンノースグリコフォーム含有量。対照には阻害剤を含めなかった。モック灌流アッセイの４日目にサンプルを収集した。 アルギナーゼ阻害剤であるＢＥＣ塩酸塩（ＢＥＣ）を０．０、０．０１及び０．５ｍＭの濃度で、ＤＬ−α，ジフルオロメチルオルニチン塩酸塩（ＤＬ−ａ）を０．０、０．０１、１．０及び２．０ｍＭの濃度で含む細胞培養培地中で増殖させた細胞によって発現された組換え糖タンパク質に関する高マンノースグリコフォーム含有量。モック灌流アッセイの４日目にサンプルを収集した。

発現した組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量は、宿主細胞中のオルニチン蓄積の影響を受けることから、宿主細胞中のオルニチン代謝を調節することによって、これを操作できることが見出された。

オルニチンは、尿素回路、ポリアミン合成及びアルギニン代謝に関与する、非タンパク質性非コードアミノ酸である。オルニチンはまた、オルニチン−δ−アミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）活性を介したグルタミン酸及びプロリンの前駆体である（図１参照）。ヒトにおいて、ＯＡＴの欠損は、網膜変性及び血中オルニチン蓄積を特徴とする障害である、脳回転状網膜脈絡膜萎縮（ＧＡ）を招く（Ｔａｋｋｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１９７４；５８（１１）：９０７−１６）。ＯＡＴ欠損のマウスモデルでは、アルギニンを制限した食餌により、血中オルニチン濃度が減少し、網膜変性を防ぐことが示されている（Ｗａｎｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０００；９７（３）：１２２４−１２２９）。オルニチンのプトレシンへの変換を触媒するオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、ポリアミン生合成経路の律速酵素である（Ｐｅｇｇ Ａ，ＪＢＣ．２００６；２８１（２１）：１４５２９−１４５３２）。ＯＤＣの合成及び安定性は、ポリアミントランスポーター活性と同じく、環境の浸透条件による影響を受ける（Ｍｕｎｒｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＡ １９７５；４１１（２）：２６３−２８１；Ｔｏｈｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１；２０２（３）：１３２７−１３３１；Ｍｉｃｈｅｌｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９８；３２９：４５３−４５９）。植物中のポリアミン生合成の増加は、浸透圧ストレスへの耐性の増大と関連している（Ａｌｃａｚａｒ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ２００６；２８：１８６７−１８７６）。オルニチンのシトルリンへの変換は、尿素回路の一部であり、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）によって触媒される。ヒトにおけるＯＴＣ欠損は、血中アンモニアの蓄積を引き起こす（Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄｈ．，１９６９ ４４：１４３−１４８）。オルニチン代謝は、サイトゾルとミトコンドリアの両方で行われ、ＯＴＣ及びＯＡＴがミトコンドリア内で起こる代謝ステップを触媒する。ミトコンドリアのオルニチントランスポーターＯＲＮＴ１は、オルニチンのミトコンドリアへの取り込みに必要である。ヒトにおいて、ＯＲＮＴ１の変異は、オルニチンとアンモニアの高血中濃度を特徴とする、高オルニチン血症−高アンモニア血症−ホモシトルリン尿（ＨＨＨ）症候群の原因となる（Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ（１９９９）；２２：１５１−１５８）；（Ｖａｌｌｅ Ｄ ｅｔ ａｌ，２００１，１８５７−１８９６）。

本明細書に記載の通り、細胞培養培地中の細胞外オルニチン量を測定すると、宿主細胞中のオルニチン蓄積の程度は、発現した組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量と相関することが見出された。宿主細胞中のオルニチン代謝を調節することによって、高マンノース含有量の操作を達成することができた。本発明は、細胞培養にて組換えタンパク質を発現する宿主細胞を、宿主細胞のオルニチン代謝を調節する条件下で培養することを含む、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作するための方法を提供する。オルニチン代謝は、宿主細胞中のオルニチンの蓄積を減少または増加させることによって調節することができる。高マンノースグリコフォーム含有量が減少または増加した組換えタンパク質を産生するための方法であって、細胞培養にて組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞中のオルニチンの蓄積が調節される、方法が本明細書にて提供される。

オルニチン代謝とは、オルニチンの生合成、輸送、異化プロセス及び代謝変換に関与する、化学的または酵素的な反応及び経路を指す。尿素回路、ポリアミン合成、クレアチン合成及びミトコンドリアのオルニチン異化経路は、オルニチン代謝の例である。概略を図１に示す。

宿主細胞中のオルニチン蓄積は、オルニチン代謝変化の帰結である。宿主細胞中のオルニチン蓄積の程度は、オルニチン代謝を調節することによって、加減することができる。細胞内の代謝産物量は、細胞外量（すなわち、細胞培養培地中で検出される量）に反映され得る。宿主細胞中のオルニチン蓄積の蓄積指標は、細胞培養培地中に分泌されたオルニチンの量を測定することによって判断することができる。本明細書に記載の通り、オルニチン量の経時的な増加が、外因性オルニチンを欠く細胞培養培地にて認められた。

「高マンノースグリコフォーム含有量」、「高マンノースグリカン濃度」及び「高マンノース種の濃度」は、同じ意味で用いられ、「ＨＭ」、「％ＨＭ」、「ＨＭＮ」または「％ＨＭＮ」という略字で示され、マンノース５（Ｍａｎ５）、マンノース６（Ｍａｎ６）、マンノース７（Ｍａｎ７）、マンノース８（Ｍａｎ８）及びマンノース９（Ｍａｎ９）の各グリカン種を合わせた相対的百分率を指す。

細胞培養培地中に分泌されたオルニチンの量が、細胞培養にて宿主細胞によって発現された組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量と相関することがわかった。アルギナーゼ阻害剤またはスペルミンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって、宿主細胞中のオルニチンの蓄積を減少させると、発現される糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量が減少した。オルニチンまたはアルギニンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって、宿主細胞中のオルニチン蓄積を増加させると、発現される糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量が増加した。

本発明は、アルギナーゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって、宿主細胞中のオルニチン蓄積を調節するための方法を提供する。アルギニンは、オルニチンの代謝前駆体であり、アルギナーゼは、アルギニンのオルニチンへの変換を触媒する酵素である。種々の細胞株の代謝及び発現プロファイルを比較すると、アルギナーゼｍＲＮＡ発現レベルが、オルニチン蓄積量と相関することが観察された。アルギナーゼ活性をアルギナーゼ阻害剤で遮断すれば、オルニチン産生レベルをおそらく減少させることができるであろう。しかしながら、アルギナーゼ阻害剤の有効性は、細胞培養培地中の高濃度アルギニンによって損なわれる可能性がある。加えて、オルニチン蓄積に関与し得る、オルニチンの他の代謝前駆体（すなわち、グルタミン酸及びプロリン、図１参照）がある。

本明細書に記載の通り、アルギナーゼ阻害剤を細胞培養培地に添加することによって、培養した宿主細胞によって発現される組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を調整できることが見出された。アルギナーゼ活性を遮断すると、宿主細胞中のオルニチン産生量が減少し、発現される組換え糖タンパク質の高マンノースグリカン濃度が低下した。

アルギナーゼはまた、オルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）を阻害する（Ｖｉｓｓｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．１２８：１２３５−１２４７）。アルギナーゼ活性を遮断すると、アルギニンからのオルニチン産生が減少するだけでなく、オルニチンをシトルリンに変換させるＯＴＣ活性の抑制を軽減し得ることから、オルニチン蓄積の更なる減少が可能となる（図１参照）。

ＯＴＣ欠損の患者では、アンモニア濃度が上昇する。高マンノースグリカン濃度の高い組換えタンパク質を発現する宿主細胞株中でアルギナーゼの発現または活性の上昇がＯＴＣ阻害を誘発する場合、これもまた、アンモニア濃度の上昇を招き得る。アンモニアの細胞内濃度の上昇は、ゴルジ装置内のｐＨ勾配を変え、グリコシルトランスフェラーゼの準最適な再局在化を誘発する可能性があり、ゴルジ複合体での不完全なグリカン分岐により、高マンノースグリカン濃度がより高くなる。（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，（１９７３）ＮＪＭ ２８８（１）：１−６；Ｈｏｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９６９）Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ４４（２３４）：１４３−１４８；Ｍｕｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，（２００１）Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ２１（３）：３０３−３１８；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８１（２）：１２９−１４０；Ｒｉｖｉｎｏｊａ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２０（１）：１４４−１５４及びＡｘｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １１（８）：６３３−６４４）。

有用なアルギナーゼ阻害剤は、当該技術分野にて知られており、市販供給源から入手可能である。こうしたアルギナーゼ阻害剤には、ＢＥＣ塩酸塩、ＤＬ−α，ジフルオロメチルオルニチン塩酸塩、Ｎ^Ｇ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン及びＮω−ヒドロキシ−ｎｏｒ−アルギニンが挙げられる。一実施形態において、アルギナーゼ阻害剤は、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）またはＤＬ−ａ−ジフルオロメチルオルニチンである。本発明の一実施形態では、アルギナーゼ阻害剤は、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）である。本発明の一実施形態では、アルギナーゼ阻害剤は、ＤＬ−ａ−ジフルオロメチルオルニチンである。

アルギナーゼ阻害剤は、生産性に著しい影響を与えることなく、発現される組換えタンパク質の高マンノースグリカン濃度を減少させるために、少なくとも１０μＭの濃度で細胞培養培地に添加することができる。一実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、１０μＭ〜２ｍＭである。別の実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、１０μＭである。別の実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、０．５ｍＭである。別の実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、１ｍＭである。別の実施形態において、アルギナーゼ阻害剤の濃度は、２ｍＭである。

宿主細胞中のオルニチン蓄積はまた、以下の実施例にて記載するように、スペルミンを含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによっても調節することができる。オルニチンは、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の作用を介して、ポリアミン経路及びポリアミンであるプトレシン、スペルミジン及びスペルミンの合成の起点である。外因的に添加したスペルミンは、直接的にまたはアンチザイムを介して、ＯＤＣを不活性化するために用いることができる（図１参照）。ＯＤＣを不活性化すると、以下に記載するように、オルニチンの蓄積をもたらすことができる。外因的に添加するスペルミンの量を制限することによって、ＯＤＣ活性の抑制を軽減することができ、オルニチンがポリアミン経路を介して代謝され得ることから、宿主細胞中の全体的なオルニチン蓄積が減少する。

スペルミンは、生産性に著しい影響を与えることなく、発現される組換えタンパク質の高マンノースグリカン濃度を減少させるために、３５μＭ以下の濃度で細胞培養培地に添加することができる。一実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭ〜３５μＭである。一実施形態において、スペルミンの濃度は、１７μＭ〜３５μＭである。一実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭ〜１７μＭである。別の実施形態において、スペルミンの濃度は、３５μＭである。別の実施形態において、スペルミンの濃度は、１７μＭである。別の実施形態において、スペルミンの濃度は、７μＭである。

オルニチン代謝を調節するための別の方法は、オルニチンの蓄積を増加させることである。一実施形態において、本発明は、オルニチン、アルギニン、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ阻害剤またはアルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤を含む細胞培養培地中で宿主細胞を培養することによって、宿主細胞中のオルニチン蓄積を調節することを提供する。

本明細書に記載の通り、条件細胞培養培地中の細胞外オルニチン量は、組換え糖タンパク質の高マンノースグリカン濃度と相関することがわかった。オルニチンを含む細胞培養培地中で組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することによって、高マンノースグリカン濃度が増加した組換え糖タンパク質がもたらされることが見出された。

上述の通り、細胞培養培地中のオルニチン蓄積は、オルニチン代謝の変化をおそらく反映するものであり、オルニチン代謝の欠損遺伝子（例えば、ＯＴＣ欠損またはＯＲＮＴ１変異）を有する患者に類似したアンモニアの蓄積をもたらし得る。高マンノース増加を誘発するアンモニアの細胞機序は知られていないが、ゴルジ中のｐＨ勾配の変化により、グリコシルトランスフェラーゼの準最適な再局在化がもたらされる可能性が示唆されている。これらの変化は、グリカン分岐を完全なものにするグリコシル化酵素の利用可能性を減らすことにつながり得、これにより高マンノースグリカン濃度がより高くなる。

別の可能性は、オルニチン蓄積がレドックスホメオスタシスの乱れを誘発する可能性である（Ｚａｎａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９３（４）：１６１−１６８）。オルニチンは、高マンノースと正の相関関係にあり、これは、高マンノースグリコフォーム含有量が細胞レドックス状態によって調節される可能性を示唆している。オルニチンは、脂質酸化反応の量を増大し得る。グリコシル化を調節する酵素の多くが脂質膜結合であることから、オルニチン蓄積によって生じる脂質酸化反応の変化は、ゴルジ中及びＥＲ中のグリコシル化調節酵素の完全性及び活性を変える可能性があり、これに続き、高マンノースグリコフォーム含有量に影響し得る。

オルニチンは、生産性に著しい影響を与えることなく、発現される組換えタンパク質の高マンノースグリカン濃度を増加させるために、少なくとも０．６ｍＭの濃度で細胞培養培地に添加することができる。一実施形態では、オルニチンの濃度は、０．６ｍＭ〜１４．８ｍＭである。一実施形態では、オルニチンの濃度は、６ｍＭ〜１４．８ｍＭである。別の実施形態において、オルニチンの濃度は０．６ｍＭである。別の実施形態において、オルニチンの濃度は６ｍＭである。別の実施形態において、オルニチンの濃度は１４．８ｍＭである。

アルギニンは、オルニチンの代謝前駆体である。外因性アルギニンを含む細胞培養培地で培養した宿主細胞中で発現された組換えタンパク質では、高マンノースグリカン濃度が増加することが見出された。外因性アルギニンの量を増やすと、オルニチン合成に利用できる代謝前駆体が増加するため、宿主細胞中のオルニチン量が増加する。

本発明は、生産性に著しい影響を与えることなく、発現される組換えタンパク質の高マンノースグリカン濃度を増加させるために、アルギニンを少なくとも８．７ｍＭの濃度で添加することによって、宿主細胞中のオルニチン蓄積を調節することを提供する。一実施形態では、アルギニンの濃度は、８．７〜１７．５ｍＭである。別の実施形態において、アルギニンの濃度は、８．７ｍＭである。別の実施形態において、アルギニンの濃度は、１７．５ｍＭである。

オルニチン蓄積は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）またはアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の阻害剤を細胞培養培地に添加することで調節することができ、これにより、宿主細胞中のオルニチン代謝及びオルニチンの蓄積を調節し、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作する方法が提供される。

オルニチン蓄積は、ＯＤＣ及びＯＡＴなどのオルニチン代謝酵素の活性を遮断することによって増加させることができる（図１参照）。α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）及びピペロニルブトキシド（ＰＢＯ）などのＯＤＣに特異的な小分子阻害剤が市販されている。ＯＡＴは、５−フルオロメチルオルニチン（５−ＦＭＯｒｎ）Ｔによって遮断される（Ｄａｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２５３：４８１−４８８）。本発明は、これらの阻害剤を細胞培養に追加して、宿主細胞中のオルニチン蓄積を増加させ、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作することを提供する。

オルニチン蓄積は、アルギニン蓄積を調節する酵素の活性を遮断することによって調節することができる（図１）。２−エチル−２−チオプソイド尿素及びＮ−ニトロ−Ｌ−アルギニン及びＬ^Ｇ−モノメチル−Ｌ−アルギニンなどの小分子阻害剤による一酸化窒素シンターゼの活性の遮断、並びに／または非対称性ジメチル−アルギニン（ＡＤＭＡ）によるアルギニンデカルボキシラーゼ活性の遮断により、アルギニンからのオルニチン変換の流れを向上させることができる。本発明は、これらの阻害剤を細胞培養に追加して、宿主細胞中のオルニチン蓄積を増加させ、組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作することを提供する。

本発明の一実施形態では、細胞培養培地が無血清細胞培養培地であるものが提供される。一実施形態において、細胞培養培地は灌流細胞培養培地である。

本明細書で使用するとき、「細胞培養用培地」（「培養培地」、「細胞培養培地」、「組織培養培地」ともいう）という用語は、細胞、例えば、動物細胞または哺乳動物細胞を増殖させるために使用する任意の栄養素溶液を指し、通常、エネルギー供給源（通常、グルコースなどの炭水化物の形態）；全必須アミノ酸のうちの１つまたは複数、及び通常２０の基本アミノ酸、加えてシステイン；ビタミン及び／または通常低濃度で必要とされる他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸；並びに微量元素、例えば、通常極めて低濃度（通常マイクロモル範囲）で必要とされる無機化合物または天然元素の少なくとも１つまたは複数の成分を提供する。

栄養素溶液は、細胞の増殖を最適化するために、所望により、追加成分、例えば、ホルモン及び他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、血清など）、塩（例えば、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、並びに緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド及び塩基（例えば、アデノシン、チミジン、ヒポキサンチン）、並びにタンパク質及び組織加水分解物（例えば、加水分解した動物タンパク質（動物性副産物、精製ゼラチンまたは植物性原料から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物））、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、細胞保護剤または界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８）、ポリアミン（例えば、プトレシン、スペルミジンまたはスペルミン（例えば、国際公開第２００８／１５４０１４号を参照））、並びにピルビン酸（例えば、米国特許第８０５３２３８号を参照）を培養する細胞の要件及び／または所望の細胞培養パラメータに応じて補充してもよい。

細胞培養培地には、任意の細胞培養プロセス、例えば、限定するものではないが、細胞の回分培養、拡大回分培養、流加培養及び／または灌流もしくは連続培養で通常使用されるもの、及び／または使用することが知られているものが挙げられる。

細胞培養培地の構成成分は、完全に粉砕して粉末培地配合物にしてもよく、必要に応じて、液体サプリメントを細胞培養培地に添加して部分的に粉砕してもよく、あるいは栄養素は、完全に液体形状で細胞培養に添加してもよい。

「基礎」（またはバッチ）細胞培養培地は、通常、細胞培養を開始するために使用され、細胞培養の維持を十分に達成する細胞培養培地を指す。

「増殖」細胞培養培地は、通常、指数関数的な増殖の期間、すなわち「増殖期」中の細胞培養に用いられ、当該期における細胞培養の維持を十分に達成する細胞培養培地を指す。増殖細胞培養培地はまた、宿主細胞株に組み込んだ選択マーカーに対する耐性または生存性を付与する選択剤を含み得る。このような選択剤には、ジェネティシン（Ｇ４１１８）、ネオマイシン、ハイグロマイシンＢ、ピューロマイシン、ゼオシン、メチオニンスルホキシイミン、メトトレキサート、グルタミン不含細胞培養培地、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジンまたはチミジンのみを欠く細胞培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。

「産生」細胞培養培地は、通常、指数関数的な増殖が終了し、タンパク質産生が優勢となる移行期中及び産生期中の細胞培養に用いられ、これらの期中における所望の細胞密度、生存率及び／または生成物の力価の維持を十分に達成する細胞培養培地を指す。

「灌流」細胞培養培地は、通常、灌流または連続培養法によって維持される細胞培養に使用され、本プロセス中における細胞培養の維持を十分に達成する細胞培養培地を指す。灌流細胞培養培地の配合物は、消費培地の除去に用いる方法に適するように、基礎細胞培養培地の配合物よりも、濃縮したものでも、高濃度にしたものでもよい。灌流細胞培養培地は、増殖期と産生期の両方の期間中に使用することができる。

高濃度細胞培養培地は、細胞培養を維持するために必要な栄養素のいくつかまたは全てを含み得、特に、高濃度培地は、細胞培養の産生期の経過中に消費されることが特定されている、または消費されることが知られている栄養素を含み得る。高濃度培地は、ほぼあらゆる細胞培養培地の配合をベースにすることができる。このような高濃度フィード培地は、細胞培養培地の一部または全ての要素を、その通常量の、例えば、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、６００倍、８００倍または更に約１０００倍で含み得る。

細胞培養物には、細胞培養中に形成が困難であり得るまたは急速に枯渇する特定の栄養素を別個の濃縮フィードで追加することができる。このような栄養素は、チロシン、システイン及び／またはシスチンなどのアミノ酸であり得る（例えば、国際公開第２０１２／１４５６８２号を参照）。一実施形態において、チロシンを含む細胞培養培地で増殖した細胞培養物に、細胞培養中のチロシン濃度が８ｍＭを超えないように、チロシンの濃縮溶液を個別に供給する。別の実施形態において、チロシン、シスチンまたはシステインを欠く細胞培養培地中で増殖している細胞培養物に、チロシン及びシスチンの濃縮溶液を個別に供給する。個別フィードは、産生期の前、またはその開始時に始めることができる。個別フィードは、濃縮フィード培地として、同じ日または異なる日に、細胞培養培地への流加により実施することができる。個別フィードは、灌流培地として、同じ日または異なる日に、灌流してもよい。

細胞培養培地は、特定の実施形態において、無血清であるか、及び／または動物由来の生成物もしくは成分を含まない。細胞培養培地は、特定の実施形態において、化学的に既定されており、化学成分の全てがわかっているものである。

動物細胞または哺乳動物細胞は、培養する特定の細胞に適した培地中で培養され、過度な実験をすることなく、当業者によって決定され得ることは、実務者に理解される通りである。市販の培地を用いることができ、これらには、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ１６４０、最小必須培地−α（ＭＥＭ−α）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、αＭＥＭ、イーグル基礎培地（アールＢＳＳ含有）、ＤＭＥＭ高グルコース（グルタミン含有）、ＤＭＥＭ高グルコース（グルタミン不含）、ＤＭＥＭ低グルコース（グルタミン不含）、ＤＭＥＭ：Ｆ１２ １：１（グルタミン含有）、ＧＭＥＭ（グラスゴーＭＥＭ）、ＧＭＥＭ（グルタミン含有）、グレース完全昆虫培地、グレース昆虫培地（ＦＢＳ不含）、ハムＦ−１０（グルタミン含有）、ハムＦ−１２（グルタミン含有）、ＩＭＤＭ（ＨＥＰＥＳ及びグルタミン含有）、ＩＭＤＭ（ＨＥＰＥＳ含有グルタミン不含）、ＩＰ４１昆虫培地、１５（リーボビッツ）（２Ｘ）（グルタミン、フェノールレッド不含）、１５（リーボビッツ）（グルタミン不含）、マッコイ５Ａ改変培地、１９９培地、ＭＥＭイーグル（グルタミン、フェノールレッド不含）（２Ｘ）、ＭＥＭイーグル−アールＢＳＳ（グルタミン含有）、ＭＥＭイーグル−アールＢＳＳ（グルタミン不含）、ＭＥＭイーグル−ハンクスＢＳＳ（グルタミン不含）、ＮＣＴＣ−１０９（グルタミン含有）、リヒターＣＭ培地（グルタミン含有）、ＲＰＭＩ１６４０（ＨＥＰＥＳ、グルタミン及び／またはペニシリン−ストレプトマイシン含有）、ＲＰＭＩ１６４０（グルタミン含有）、ＲＰＭＩ１６４０（グルタミン不含）、シュナイダー昆虫培地または特定の細胞種向けに配合されている当業者に知られている任意の他の培地が挙げられるが、これらに限定されない。上記の例示的な培地には、必要に応じてまたは希望に応じて、任意要素を含めた補充要素または補充成分を適切な濃度または量で添加することができ、これについては当業者に周知であり、慣用的手法によって実施される。

本発明の一実施形態では、宿主細胞が哺乳動物細胞であるものが提供される。一実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

本明細書で使用する細胞株（「宿主細胞」ともいう）は、商業的または化学的な関心の対象となるポリペプチドを発現するように遺伝子操作される。細胞株は、通常、培養にて時間に制限なく維持することができる、一次培養から生じる系統に由来する。これらの細胞は、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染または注入を介して導入されたプラスミドなどの発現ベクター（構築物）を含み得、発現ベクターは、培養プロセスでの発現及び産生に関するタンパク質をコードするコード配列またはその一部を包含する。このような発現ベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含んでいる。産生されるタンパク質及びポリペプチド並びに適切な転写及び翻訳制御エレメントをコードする配列を含む発現ベクターを構築するには、当業者によく知られている方法及び当業者によって実施されている方法を用いることができる。これらの方法には、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの遺伝子組換えが挙げられる。このような技術については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．（または旧版のいずれか）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ（または旧版のいずれか）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９９０に記載されており、これらの全てをあらゆる目的のために本明細書に援用する。

動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、動物または哺乳動物宿主細胞、宿主細胞、組換え細胞、組換え宿主細胞などは全て、本発明のプロセスに従って培養することができる細胞に関する用語である。このような細胞は、通常、哺乳動物から得たまたは哺乳動物に由来する細胞株であり、適切な栄養素及び／または本明細書に記載のものなどの他の要素を含有する培地中での単層培養または浮遊培養のいずれかに置いた場合、増殖し生存することができる。細胞は、通常、タンパク質を発現し分泌できる細胞、または大量の特定タンパク質、より詳細には、目的とする糖タンパク質を培養培地中に発現し分泌するように分子的に操作することができる細胞が選択される。宿主細胞によって産生されるタンパク質は、宿主細胞にとって内因性または相同であり得ることは理解される。あるいは、タンパク質は、宿主細胞にとって異種、すなわち外来であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生し分泌されるヒトタンパク質である。更に、哺乳動物タンパク質、すなわち元々は哺乳動物生物から得たまたは哺乳動物生物に由来するタンパク質が、本開示の方法によって得られ、細胞によって培養培地中に分泌され得る。

本発明の方法は、種々の細胞の培養に用いることができる。一実施形態において、培養細胞は、植物及び／または動物細胞などの真核細胞である。細胞は、哺乳動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、両生類細胞または鳥類細胞であってよい。培養での増殖に適した多種多様な哺乳動物細胞株が米国培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）及び他の寄託機関並びに販売業者から入手可能である。本発明のプロセスにて用いることができる細胞には、ＭＫ２．７細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：５５５−５５６；Ｋｏｌｋｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０９０１−１０９０９及びＷＯ０１／９２３３７Ａ２）、ジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）など；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣＣＣＬ−７０）；ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１）；ＨＥＫ２９３細胞及びＳｐ２／０細胞、５Ｌ８ハイブリドーマ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ＥＬ４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｓｐ２／０細胞、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞及び網膜上皮細胞）並びに樹立細胞系及びそれらの細胞株（例えば、ヒト胚腎臓細胞（例えば、２９３細胞または浮遊培養での増殖用にサブクローン化した２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ−１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ−３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ−７５）；ヒトヘパトーマ細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ−５１）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ−１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，１９８２，Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８）；ＭＣＲ５細胞；ＦＳ４細胞；ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ_２細胞、ＣｌｏｎｅＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫ_１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ_１細胞、ＧＨ_３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ２５６細胞、ＭＨ_１Ｃ_１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、またはこれらの誘導体）、任意の組織または器官（限定するものではないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、小腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃腺、骨髄及び血液）、脾臓に由来する線維芽細胞、線維芽細胞株及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ_１細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣＣＣＬ−８１）；ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ_３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ_１Ｃ_３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、２０７１株（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃ_ＩＩ細胞及びＪｅｎｓｅｎ細胞またはこれらの誘導体）または当業者に知られている任意の他の細胞種が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞は、付着培養、単層培養または浮遊培養、トランスフェクション及びタンパク質（例えば、抗体）の発現に適し得る。細胞は、回分培養、流加培養及び灌流培養または連続培養の各方法で用いることができる。

本発明の一実施形態では、組換えタンパク質を発現する宿主細胞は、バイオリアクター内で培養される。本発明の別の実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。関連実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。更に別の関連実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌの容量を有する。本発明の一実施形態では、細胞培養は、バイオリアクターに無血清培養培地中少なくとも０．５ｘ１０^６細胞／ｍＬを接種することによって確立される。一実施形態において、本発明は、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を回収する工程を更に含む。一実施形態において、本発明は、宿主細胞によって産生された組換えタンパク質が、精製され、薬学的に許容可能な製剤に製剤化されることを提供する。

限定するものではないが、理解のために、タンパク質産生のための細胞培養及び培養工程には、３つの一般的種類、すなわち、回分培養、拡大回分・流加培養、灌流培養またはこれらの組み合わせを含み得ることは当業者であれば理解するであろう。回分培養において、細胞は最初培地中で培養され、この培地は除去も、交換も、追加もされない。すなわち、細胞には、培養工程中または終了前に、新鮮な培地が「供給」されない。所望の生成物は、培養工程の終了時に回収される。

流加培養では、工程中に、新鮮な培地を１日に１回またはそれ以上（または連続的に）培養培地に追加することにより、培養工程時間が延長される。すなわち、細胞には、培養行程中に新しい培地が「供給（フィード）」される（「フィード培地」）。流加培養は、種々の供給計画及び上述した回数、例えば、毎日、１日おき、２日おきなど、１日に１回以上、または１日に１回未満などを伴い得る。更に、流加培養では、フィード培地を連続的に供給することができる。次いで、所望の生成物を培養／産生工程の終了時に回収する。

灌流培養は、細胞培養物に新鮮な灌流培地が供給され、消費培地が除去されるものである。細胞培養物への新鮮な培地の灌流及び消費培地の除去は、連続的、段階的、断続的またはこれらのうちのいずれかもしくは全ての組み合わせであってよい。灌流速度は、１日当たり１．０作業容量未満から１日当たり複数作業容量までの範囲であり得る。好ましくは、細胞は、培養物中に保持され、除去される消費培地は、細胞を実質的に含まないか、または培養物中の細胞よりもはるかに少ない細胞を含む。細胞培養によって発現された組換えタンパク質も同様に培養物中に保持され得、消費培地とともに除去されることがある。消費培地の除去は、遠心分離、沈殿または濾過を含む多数の手段によって実施することができる。例えば、Ｖｏｉｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８２：７５１−６５を参照されたい。好ましい濾過方法は、交互接線流濾過である。交互接線流は、ＡＴＦ装置を用いて中空糸フィルタモジュールを介して培地を吸い上げることによって維持される。例えば、米国特許第６，５４４，４２４号；Ｆｕｒｅｙ（２００２）Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．２２（７），６２−６３を参照されたい。このフィルタにより、大きさまたは分子量に基づいて粒子が分離される。フィルタは、用途に応じて、孔径または分画分子量（ＭＷＣＯ）値に基づいて選択することができる。フィルタには、膜フィルタ、セラミックフィルタ及び金属フィルタが挙げられ、スパイラル形もしくは管状またはシート形状を含む、任意の形状であってよい。

「灌流流量」という用語は、バイオリアクターを通過する（添加及び除去される）培地の量を指し、通常、所与の時間内における一部または複数の作業容量で表される。「作業容量」とは、細胞培養に使用するバイオリアクター容量の量を指す。一実施形態では、灌流流量は、１日当たり１作業容量以下である。

細胞培養は、動物または哺乳動物の細胞培養のために通常用いられる培養容器及び／または培養装置を使用して、組換えタンパク質の小規模産生から大規模産生までの条件下で、実施することができる。組織培養皿、Ｔフラスコ及びスピナーフラスコが実験室ベンチ規模で使用されるものであることは、当業者に理解される通りである。大規模装置での培養に関しては、限定するものではないが、発酵型タンク培養装置、エアリフト型培養装置、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養、攪拌タンクバイオリアクターシステム、充填層型培養装置及び使い捨てバッグまたは当業者に知られた任意の他の好適な装置を用いることができる。ローラーボトルまたは攪拌タンクバイオリアクターシステムとともに、マイクロキャリアを用いてもよいし、用いなくてもよい。これらのシステムは、回分、流加または灌流／連続モードで操作され得る。加えて、培養装置またはシステムは、フィルタ、重力、遠心力などを用いる細胞分離装置などの追加の装置を備えてよい。

組換えタンパク質の産生は、多段階培養プロセスにて行うことができる。多段階プロセスでは、２つまたはそれ以上の異なる段階で細胞を培養する。例えば、最初に、細胞増殖及び生存率を最大化する環境条件下での１つ以上の増殖期にて細胞を培養し、次いで、タンパク質産生を最大化する条件下での産生期に移行する。哺乳動物細胞による組換えタンパク質の産生ための商業的プロセスでは、最終産生培養に先立って、異なる培養容器（Ｎ−ｘ〜Ｎ−１）内で生じる複数の増殖期、例えば、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の増殖期が存在する。増殖期及び産生期は、１つ以上の移行期が先行してもよいし、移行期によって分けられてもよい。産生期は、大規模に行うことができる。

細胞培養の「増殖期」という用語は、指数関数的な細胞増殖の時期（すなわち、対数期）を指し、この時期には、通常、細胞が急速に***する。細胞は、約１日、約２日、約３日もしくは約４日または４日より長い期間、増殖期に維持される。細胞を増殖期に維持する期間は、例えば、細胞種、細胞の増殖速度及び細胞条件に基づいて変動する。

「移行期」という用語は、増殖期と産生期との間の期間を指す。一般に、移行期は、増殖期から産生期へのシフトを助けるように培養条件が制御され得る時である。制御され得る種々の細胞培養パラメータには、温度、オスモル濃度、ビタミン、アミノ酸、糖、ペプトン、アンモニウム及び塩のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞培養の「産生期」という用語は、細胞増殖が横這いになる時期を指す。対数的な細胞増殖は、通常、この期の前または間に終わり、タンパク質産生が優勢になる。流加及び灌流細胞培養プロセスは、この段階における所望の細胞密度、生存率及び生成物の力価を達成し維持するために、細胞培養培地を追加するか、新鮮な培地を供給する。産生期は、大規模に行うことができる。大規模細胞培養は、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００リットルの容量を維持することができる。好ましい実施形態において、産生期は、５００Ｌ、１０００Ｌ及び／または２０００Ｌのバイオリアクターで実施される。

通常、最終産生培養の前の細胞培養物は、２つの先行期であるシードトレインと接種トレインを経る。シードトレイン期（Ｎ−Ｘ）は、小規模に生じ、細胞は数の上で急速に増大する。接種物トレイン期（Ｎ−１）には、細胞は更に増大して、産生バイオリアクターのための接種物、例えば、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬの接種物を生成する。シード及びＮ−１トレインは、任意の培養方法、通常、回分細胞培養によって生じさせることができる。１５×１０^６細胞／ｍＬを上回るＮ−１細胞密度が産生バイオリアクターの播種に一般的である。Ｎ−１細胞密度がより高いと、産生バイオリアクターで所望の細胞密度に至るのに必要な時間を減少させるか、または更に省くことができる。Ｎ−１よりも高い細胞密度を達成する好ましい方法は、交互接線流濾過を用いる灌流培養である。交互接線流濾過を用いる灌流プロセス手段によって増殖したＮ−１細胞培養物は、任意の所望の密度、例えば９０×１０^６細胞／ｍＬまたはそれ以上の密度の細胞をもたらし得る。Ｎ−１細胞培養物は、単一ボーラス接種培養株を生成するために使用してもよいし、または複数の産生バイオリアクターに接種するために維持されるローリングシード保存培養株として用いることもできる。接種密度は、産生される組換えタンパク質の量に正の影響を与え得る。産生量は、接種密度が増加するに伴って増加する傾向にある。力価の改善は、より高い接種密度に関係するだけでなく、産生状態に置かれる細胞の代謝状態及び細胞サイクル状態による影響を受ける可能性がある。

「細胞密度」という用語は、培養培地の所与の容積中の細胞数を指す。「生細胞密度」は、標準的な生存率アッセイ（トリパンブルー色素排除法など）によって特定される、培養培地の所与の容積中の生細胞の数を指す。「パック細胞容積」（ＰＣＶ）という用語は、「パーセントパック細胞容積」（％ＰＣＶ）ともいい、細胞培養物の全容積に対して細胞が占める容積の比率であり、百分率で表される（Ｓｔｅｔｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．Ｄｅｃ ２０：９５（６）：１２２８−３３参照）。パック細胞容積は、細胞密度と細胞直径の関数であり、パック細胞容積の増加は、細胞密度もしくは細胞直径のいずれかまたはその両方の増加から生じ得る。パック細胞容積は、細胞培養物中の固形分量の測定値である。

産生中、増殖期は、産生期よりも高い温度で生じ得る。例えば、増殖期は、約３５℃〜約３８℃の第１の温度設定点で生じ得、産生期は、約２９℃〜約３７℃、任意に約３０℃〜約３６℃または約３０℃〜約３４℃の第２の温度設定点で生じ得る。

加えて、カフェイン、酪酸塩及び／またはヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）などのタンパク質産生の化学誘導物質を温度変化と同時にまたはその前またはその後に添加してよい。誘導物質が温度変化の後に添加される場合、温度変化から１時間〜５日後、任意に温度変化から１〜２日後に添加することができる。細胞培養は、細胞が所望のタンパク質を産生する間、数日または更に数週間、維持され得る。

細胞を所望の生理学的状態に維持するための別の方法は、細胞培養物を低Ｌ−アスパラギン条件にさらすことにより細胞増殖停止を誘発することである（例えば国際公開第２０１３／００６４７９号を参照）。細胞増殖停止は、限界濃度のＬ−アスパラギンを含む培養培地を介して、かつ細胞培養にてＬ−アスパラギン濃度を低く維持することで、達成及び維持され得る。Ｌ−アスパラギンの濃度を５ｍＭ以下に維持することを用いることで、細胞を増殖停止状態に維持することができ、これにより生産性が向上する。

細胞サイクルの進行並びに細胞サイクルに関連する転写、ＤＮＡ修復、分化、老化及びアポトーシスの関連プロセスを制御することが知られているまたはそう考えられている化合物である、細胞サイクル阻害剤もまた、細胞増殖停止を誘発するのに有用である。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）などのサイクル機構と相互作用する細胞サイクル阻害剤が有用であり、他の経路からのタンパク質（例えばＡＫＴ、ｍＴＯＲ）及び細胞サイクルに直接的または間接的に影響する他の経路からのタンパク質と相互作用する分子も同様である。

本発明の方法に適した細胞培養条件は、細胞の回分培養、流加培養もしくは灌流（連続）培養またはこれらの方法の任意の組み合わせに通常用いられる周知のものであり、ｐＨ、溶存酸素（Ｏ_２）及び二酸化炭素（ＣＯ_２）、攪拌並びに湿度及び温度に注意を払う。

本発明の方法は、目的とする組換えタンパク質を発現する細胞を培養するために用いることができる。発現された組換えタンパク質は、培養培地中に分泌され得、そこから回収及び／または収集することができる。加えて、タンパク質は、当該培養物または成分から（例えば、培養培地から）既知のプロセス並びに当該技術分野にて知られた及び／または販売業者から入手可能な製品を用いて、精製または部分的に精製することができる。次いで、精製したタンパク質を「製剤化」することができる。これは、薬学的に許容可能な製剤へと緩衝液が交換され、滅菌され、バルク包装され、かつ／または最終ユーザ向けに包装されることを意味する。薬学的に許容可能な製剤は、希釈剤、担体、溶解剤、乳化剤、保存料及び／または補助剤を含み得る。薬学的に許容可能な製剤の調製は、当業者の技術範囲内であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．１９９５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載のものなどが挙げられる。

本発明の一実施形態では、組換えタンパク質が糖タンパク質であるものが提供される。本発明の一実施形態では、組換えタンパク質がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質またはサイトカインからなる群から選択されるものが提供される。また、本発明の方法によって産生される、組換えタンパク質も提供される。一実施形態において、組換えタンパク質は、薬学的に許容可能な製剤に製剤化される。

本明細書で使用するとき、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書を通じて同じ意味で用いられ、ペプチド結合によって互いに連結された２つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質はまた、修飾を含み得、これらには、限定するものではないが、糖タンパク質をもたらすグリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰリボース化が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「糖タンパク質」という用語は、抗体を含むペプチド及びタンパク質であって、少なくとも１つのオリゴ糖側鎖（マンノース残基を含む）を有するものを指す。糖タンパク質は、宿主細胞に対して相同であってもよいし、使用する宿主細胞に対して異種、すなわち外来であってもよい。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞によって産生されるヒト糖タンパク質である。このような糖タンパク質は、通常、「組換え糖タンパク質」と呼ばれる。ある特定の実施形態において、宿主細胞によって発現される糖タンパク質は、直接培地中に分泌される。

タンパク質は、タンパク質系薬物を含む、科学的または商業的な関心対象であり得る。タンパク質には、とりわけ、抗体、融合タンパク質及びサイトカインが挙げられる。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、細胞培養法を用いて組換え動物細胞株によって産生することができ、「組換えペプチド」、「組換えポリペプチド」及び「組換えタンパク質」と呼ぶことがある。発現するタンパク質は、細胞内で産生され得るか、または培養培地中に分泌され得、そこから回収及び／または収集することができる。

本発明の方法によって有利に産生させることが可能な哺乳動物タンパク質の非限定的な例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７（５３２２）：５５−６０）、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ，ＷＯ０１／３６６３７）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ，ＷＯ９７／０１６３３）、胸腺間質由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、豪州特許第５８８８１９号）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（米国特許第６，２０４，３６３号）、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、巨核球成長発達因子、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトフィブリノゲン様２タンパク質（ＦＧＬ２；ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００６８２；Ｒｕｅｇｇ ａｎｄ Ｐｙｔｅｌａ（１９９５），Ｇｅｎｅ １６０：２５７−６２）成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、α−インターフェロン、γ−インターフェロン及びコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン（米国特許第４，６９５，６２３号及び同第４，８９７４７１号）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ １−５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン、コロニー刺激因子、リンフォトキシン−β、白血病抑制因子及びオンコスタチン−Ｍのタンパク質のうちの１つの全てまたは一部と同一であるか、または実質的に類似したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。本発明の方法に従って産生することができるタンパク質の説明については、例えば、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ａｌｌ ｖｏｌｕｍｅｓ（Ａｇｇａｒｗａｌ ａｎｄ Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ，ｅｄｓ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１９９８）；Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙ ａｎｄ Ｌｅｉｇｈ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）；及びＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｖｏｌｓ．１ ａｎｄ ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｔｚｅ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，２００３）に認められ得る。

更に、本発明の方法は、上記のタンパク質のいずれかの受容体、かかる受容体もしくは上記のタンパク質のいずれかに対する拮抗物質のアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むタンパク質、及び／またはかかる受容体もしくは拮抗物質に実質的に類似したタンパク質を産生するのに有用であり得る。これらの受容体及び拮抗物質には、腫瘍壊死因子受容体の両形態（ＴＮＦＲ、ｐ５５及びｐ７５とも呼ばれる、米国特許第５，３９５，７６０号及び米国特許第５，６１０，２７９号）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体（Ｉ型及びＩＩ型；欧州特許第０４６０８４６号、米国特許第４，９６８，６０７号及び米国特許第５，７６７，０６４号）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（米国特許第６，３３７，０７２号）、ＩＬ−１アンタゴニストまたは抑制剤（米国特許第５，９８１，７１３号、同第６，０９６，７２８号及び同第５，０７５，２２２号）、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体（欧州特許第０３６７５６６号及び米国特許第５，８５６，２９６号）、ＩＬ−１５受容体、ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１８受容体、Ｆｃ受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍ及び白血病抑制因子の受容体、ＮＦ−κＢ活性化受容体（ＲＡＮＫ、ＷＯ０１／３６６３７及び米国特許第６，２７１，３４９号）、オステオプロテゲリン（米国特許第６，０１５，９３８号）、ＴＲＡＩＬ受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４を含む）並びにＦａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）などの死ドメインを含む受容体が挙げられる。

本発明を用いて産生することができる他のタンパク質には、分化抗原（ＣＤタンパク質とも呼ばれる）もしくはこれらのリガンドのアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むタンパク質、またはこれらのいずれかに実質的に類似したタンパク質が挙げられる。このような抗原については、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ，１９９６）に開示されている。類似のＣＤタンパク質については、後続のワークショップで開示されている。このような抗原の例には、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０及びこれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンドなど）が挙げられる。ＣＤ抗原のいくつかは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーであり、４１ＢＢ及びＯＸ４０も含み得る。リガンドは、４１ＢＢリガンド及びＯＸ４０リガンドがそうであるように、ＴＮＦファミリーのメンバーであることが多い。

酵素活性タンパク質またはこれらのリガンドを、本発明を用いて産生することができる。例としては、ＴＮＦ−α変換酵素を含む、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメインファミリーメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１抗トリプシン、上記の酵素のうちのいずれかのリガンド、並びに多数の他の酵素及びこれらのリガンドのタンパク質もしくはこれらのリガンドのうちの１つの全てもしくは部分を含むタンパク質、またはこれらのうちの１つに実質的に類似したタンパク質が挙げられる。

「抗体」という用語は、任意のアイソタイプもしくはサブクラスのグリコシル化免疫グロブリン及び非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及、または特異的結合について未変性抗体に匹敵するこれらの抗原結合領域への言及を包含し、特に指定のない限り、ヒト、ヒト化、キメラ、多重特異性、モノクローナル、ポリクローナル及びオリゴマーまたはこれらの抗原結合断片を含む。抗原結合断片または領域、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、二量体、Ｆｄ、ｄＡｂ、マキシボディ、単鎖抗体分子、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、二量体、三量体、四量体及び標的ポリペプチドに特異的抗原結合を与えるのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを有するタンパク質も挙げられる。「抗体」という用語には、組換え手段によって調製、発現、作成または単離したもの、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトした宿主細胞から単離した抗体を含むが、これらに限定されない。

抗体の例には、タンパク質のいずれか１つまたはそれらの組み合わせを認識するものが挙げられるが、これらに限定されず、これらのタンパク質には、上記のタンパク質及び／またはＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＦＧＬ２、ＰＤＧＦ−β及びこれらの類似体（米国特許第５，２７２，０６４号及び同第５，１４９，７９２号参照）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体（米国特許第６，２３５，８８３号参照）ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、オステオプロテゲリンリガンド、インターフェロンγ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ；ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ、ＴＡＬＬ−１及びｚＴＮＦ４としても知られる；Ｄｏ ａｎｄ Ｃｈｅｎ−Ｋｉａｎｇ（２００２），Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．１３（１）：１９−２５参照）、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣ１、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関して発現される遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌及び／または膵臓癌を有する患者の血清中に高濃度で存在する腫瘍関連エピトープ、***、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺及び／もしくは腎臓の癌細胞上、並びに／または黒色腫、神経膠腫もしくは神経芽細胞腫の細胞上に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍の壊死性コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３及び４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリン付着因子、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（第ＶＩＩａ因子組織因子の阻害剤）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（Ｔ細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ１０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、スクレロスチン、Ｌ−セレクチン、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）並びに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の抗原を含むがこれらに限定されない。本発明の方法を用いて産生することができる既知の抗体の具体例には、アダリムマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、アレムツズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブペゴル、セツキシマブ、コナツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、ラベツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、ロベリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、ザルツムマブ、及びザノリムマブが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、例えば、上記のタンパク質のうちのいずれかを含む組換え融合タンパク質を産生するために用いることができる。例えば、本発明の方法を用いて、上記のタンパク質のうちの１つに加えて、多量化ドメイン、例えば、ロイシンジッパー、コイルドコイル、免疫グロブリンのＦｃ部分または実質的に類似したタンパク質を含む組換え融合タンパク質を産生することができる。例えば、ＷＯ９４／１０３０８；Ｌｏｖｅｊｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８−１２９３；Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−０５；Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０−８３；Ｈａｋａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：２５５−６４を参照されたい。このような組換え融合タンパク質のなかでも、受容体の部分が抗体のＦｃ部分に融合したタンパク質、例えば、エタネルセプト（ｐ７５ ＴＮＦＲ：Ｆｃ）及びベラタセプ（ＣＴＬＡ４：Ｆｃ）が特に挙げられる。キメラタンパク質及びポリペプチド、並びに上記のタンパク質及びポリペプチドのうちのいずれかの断片もしくは部分、または変異体、多様体もしくは類似体も同様に、本発明の方法によって産生することができる好適なタンパク質、ポリペプチド及びペプチドに含まれる。

本出願にて使用される用語は、当該技術において標準的なものであるが、ある特定の用語の定義については、特許請求の範囲の意味の明瞭性及び確定性を保証するために、本明細書中に記載している。単位、接頭辞及び記号は、ＳＩに認められた形態で示され得る。本明細書に列挙された数値範囲は、その範囲を定義する数を含むものであり、その定義範囲内の各整数を含み、これを支持するものである。本明細書に記載の方法及び技術は、概して、特に指定のない限り、当該技術分野にて周知の従来の方法に従って、また本明細書全体を通して引用し論じる種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されている通りに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい。限定するものではないが、特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含む、本出願に引用された全ての文献または文献の一部は、参照により明示的に本明細書に援用される。本発明の実施形態にて記載することは、本発明の他の実施形態と組み合わせて用いることができる。

本発明は、本明細書に記載する、本発明の個々の態様の単なる例示であることが意図された具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等の方法及び構成要素は、本発明の範囲内である。実際、本明細書中に示され説明されているものに加え、本発明の種々の変更が上記の説明及び添付図面から当業者には明らかであろう。このような変更も特許請求の範囲に含まれることが意図される。

実施例１
細胞外オルニチン量が高マンノースグリコフォーム含有量と相関することが判明した。５％超〜２０％未満の範囲の高マンノースグリコフォーム含有量を有する組換え抗体を発現する８つのＣＨＯ細胞株を本実験に選択した（細胞株Ａ〜細胞株Ｈ）。所有者が異なる２つの細胞培養培地をそれぞれオルニチンを含めずに用いて（培地１及び培地２）、細胞を振盪フラスコ内で１０日の流加培養で増殖させた。消費培地のサンプルを培養の８日目、９日目及び１０日目に採取し、大規模メタボロミクス分析にかけた。％ＨＭは、Ｅｎｄｏ−Ｈ ｒＣＥ−ＳＤＳ法を用いて、その後、以下に記載のＨＩＬＩＣ方法に代えて、特定した。大規模メタボロミクス分析により、培地構成成分を液体クロマトグラフィーで分離し、高分解能分光測定法で検出して、消費培地中のオルニチンの相対量を特定した。構成成分については、そのフラグメンテーションスペクトルを既知の化合物のスペクトルライブラリーと照合することによって同定した。各構成成分の相対存在量を質量分析信号のピーク面積から特定した。培地１及び培地２において、８日目、９日目及び１０日目に細胞株Ａ〜Ｈから分泌されたモノクローナル抗体の高マンノースグリカン濃度（％ＨＭ）を図２Ａ及びＢに示す。図２Ｃは、パーセント高マンノース濃度と細胞外オルニチン量との相関関係を示す。この相関関係は、９日目のサンプルから得たデータを用いて、８つ全ての細胞株（四角で表示）を比較することによって特定した。この結果により、高マンノースグリコフォーム含有量と細胞外オルニチン量との間の強い相関関係が示唆された。

次に、細胞株Ｈを３Ｌバイオリアクター内で流加培養にて増殖させた。培養期間は１２日であった。３日目、５日目、７日目及び９日目に、７％、９％、９％及び９％の４つのボーラス供給を行った。加えて、５０％グルコース溶液を、２ｇ／Ｌを上回るグルコース濃度を維持するのに必要な場合、３日目から開始して毎日添加した。産生バイオリアクターは、増殖４日後に１５×１０^５細胞／ｍｌで接種した。細胞は、産生期が開始するまで増殖培地中に維持した。次いで、８つの異なるプロセス条件を比較した。条件１は、対照とした。産生フィード培地には、何ら変更を加えなかった。

条件２は、ベタインをフィード培地に２４ｍＭの濃度で０日目に追加した。これ以上のベタインは与えなかった。３日目、５日目、７日目及び９日目に、７％、９％、９％及び９％の４つのボーラス供給を行った。加えて、５０％グルコース溶液を、２ｇ／Ｌを上回るグルコース濃度を維持するのに必要な場合、３日目から開始して毎日添加した。

条件３及び４では、硫酸銅の除去を試験した。産生基礎培地粉末から硫酸銅を除去した。条件３を対照とし、硫酸銅原液を基礎培地に添加した。条件４では、いかなる培地にも硫酸銅を添加せず、銅欠乏培養環境を作った。条件３と４の両方に関して、両方とも銅を含有する同一のボーラス「フィード」培地で処理した。

条件５〜８では、高オスモル濃度及び低オスモル濃度を試験した。条件５及び６では、細胞に９０％産生バッチ培地を与えた。すなわち、１０％少ない栄養素を供給した。これにより、細胞がオスモル濃度の減少を受けることになる。条件６では、細胞培養培地をＮａＣｌの滴定により、約３００ｍＯｓｍの対照濃度に戻した。条件７及び８では、細胞に８５％フィード培地を与え、条件８の培地は、ＮａＣｌの滴定により、対照濃度に戻した。

消費培地のサンプルを培養の３日目、６日目、８日目、９日目及び１０日目に採取し、大規模メタボロミクス分析にかけた。

再度、細胞外オルニチン含有量と高マンノースグリコフォーム含有量との間の有意な相関関係があった。図３Ａは、細胞株Ｈを８つの異なるバイオリアクター条件（＃１〜＃８）にさらしたときに検出されたパーセント高マンノースグリカン濃度を示す。図３Ｂは、対応する細胞外オルニチン量を示す。図３Ｃは、パーセント高マンノース濃度と細胞外オルニチン量との相関関係を示す。この相関関係は、９日目のサンプルから得たデータを用いて、８つ全ての条件（四角で表示）を比較することによって特定した。

実施例２
実施例１に記載した８つの細胞株を用いて、アルギナーゼ１のｍＲＮＡ発現レベルを、１０日の流加産生培養中の選択した日に測定した。

ｍＲＮＡ発現レベルは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を製造者の説明書に従って用いて分析した。

アルギナーゼ１は、アルギニンのオルニチンへの変換を触媒する酵素であり、高マンノースの濃度がより高いと、経時的に、細胞株中で上方制御されることが判明した（図４参照）。これは、アルギナーゼ活性を遮断し、オルニチン産生量を減少させるアルギナーゼ阻害剤による特異的ターゲティングを用いれば、高マンノースグリカン濃度が低下し得ることを示唆している。

実施例３
本実施例は、組換え糖タンパク質を発現する宿主細胞中のオルニチン蓄積を調節することによって、組換え糖タンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を操作することに取り組むことを説明するものである。

細胞株、細胞培養及び培地
細胞株Ｈを本研究に用いた。３ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）中に１Ｌ作業容量で細胞を維持し、自動ＣＯ_２インキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）内で３６℃、５％ＣＯ_２の標準加湿条件下及び７０ｒｐｍの振盪で培養した。４日ごとに、５００ｎＭ濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）を含む選択増殖培地中で細胞を継代培養し、続けて、増殖培地に移し、接種し、４日間培養した後、以下に記載の実験のために２４ウェルプレートに播種した。

小規模モック灌流
２４ディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）での改変モック灌流を用いて、高マンノース（ＨＭＮ）調整に対する、スペルミン、アルギニン、オルニチン及びアルギナーゼ濃度の影響を評価した。実験計画に従って、アルギニンを含まない配合の灌流培地を小規模モック灌流実験３（アルギニン濃度研究）に用いた。小規模モック灌流実験４では、全てのアルギナーゼ阻害剤を灌流培地に添加した。ＢＥＣ塩酸塩、ＤＬ−α，ジフルオロメチルオルニチン塩酸塩、Ｎ^Ｇ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン一酢酸塩及びＮω−ヒドロキシ−ｎｏｒ−アルギニン二酢酸塩の４つのアルギナーゼ阻害剤は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）より購入した。

簡潔に述べれば、各ウェルについて、ＣＨＯ細胞を、作業容量３ｍＬで１０〜２０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の設定密度にてプレートに播種した。Ｋｕｈｎｅｒインキュベータ（Ｋｕｈｎｅｒ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、３６℃、５％ＣＯ_２、８５％相対湿度及び振盪２２５ｒｐｍ、軌道径５０ｍｍで、３日または４日間、細胞を培養した。２４時間ごとに、細胞を２００×ｇで５分間、遠心分離にかけ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）、消費培地を回収し、次いで、各ウェルに３ｍＬの新鮮な培地を補充した。収集した消費培地は、力価、主な代謝産物及びパーセント高マンノース（％ＨＭＮ）（必要時）について分析した。次いで、細胞を回収し、細胞数を計測し、生存率を測定した。

細胞増殖、代謝産物及び抗体力価の分析
生細胞密度及び生存率は、Ｃｅｄｅｘセルカウンター（Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ，Ｂｅｉｌｅｆｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて特定した。グルコース、乳酸、アンモニア、グルタミン、グルタミン酸を含む代謝産物については、ＮｏｖａＢｉｏｐｒｏｆｉｌｅ Ｆｌｅｘ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から得た。消費培地中の抗体濃度は、内径５０ｍｍ×４．６ｍｍのＰＯＲＯＳ Ａ／２０タンパク質Ａカラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を備えたＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）アッセイを用いて特定した。サンプルを注入した後、カラムをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．１）で洗浄してＣＨＯ宿主細胞のタンパク質を除去した。次いで、結合した抗体を酸性ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝１．９）で溶出し、２８０ｎｍのＵＶ吸光度で検出して抗体濃度を定量化した。

ＨＩＬＩＣグリカンマップ
Ｎ−グリカンが異なる種の抗体を親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって分析した。精製した抗体をＮ−グリコシダーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）によって、３７℃で２時間、分離させ、グリカンを遊離した。遊離したグリカンを２−アミノ安息香酸で標識し、ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎ Ｓカートリッジ（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｈｅｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて洗浄した。次いで、精製したグリカンを脱塩して、アッセイ用に水で再構成した。ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて、内径１００ｍｍ×２．１ｍｍのＢＥＨ ＧｌｙｃａｎカラムでＨＩＬＩＣクロマトグラフィーを実施し、溶出したグリカンを蛍光検出器によって各種グリカンの異なる溶出時間に基づいて検出し、特定し、限定した。

小規模モック灌流実験１：スペルミン濃度研究
５つの異なる濃度のスペルミンを本研究で試験した。０、７、１７、３５及び１００μＭのスペルミンテトラヒドロクロリド（スペルミン４ＨＣｌ）を含む灌流細胞培養培地を試験した。３５μＭのスペルミンを含む灌流培地を対照とした。５日目のサンプルからの結果は、スペルミン濃度が減少するにつれて、％ＨＭＮが減少することを示している（図５参照）。力価は、スペルミンの減少／枯渇による影響を受けなかった。ＨＭ濃度の減少は、培地中のスペルミンの量が減少したときに、オルニチン量が減少することによって達成された。図６に示す通り、オルニチンの量は、スペルミン濃度の減少に伴って減少した。

小規模モック灌流実験２：オルニチン濃度研究
４つの異なる濃度のＬ−オルニチン一塩酸塩を試験した。１４．８、６、０．６及び０（対照）ｍＭのＬ−オルニチン一塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む灌流細胞培養培地を用いた。この結果により、オルニチン濃度が増加するにつれて、％ＨＭＮが増加することが示された（図７参照）。細胞株Ｉを２Ｌバイオリアクター内で用いて、第２の実験を実施した。細胞株Ｉは、ＩｇＧ２抗体を発現し、流加条件下で増殖させた。１つのバイオリアクターには、培養の０日目に、単一追加の０．１ｇ／ＬのＬ−オルニチン一塩酸塩を入れ、第２のバイオリアクターは、オルニチンを含まない対照とした。ダイズ加水分解物を含む細胞培養培地中で、培養物を１２日間維持した。ダイズ加水分解物を含むボーラスフィード培地を４日目及び８日目に供給した。

グリカンプロファイリングは、ペプチドマッピングによって実施した。Ｒｅｎら（２００９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９２ １２−２１）が記載した方法と類似の方法を用いて、抗体をトリプシンで分解した。具体的には、各抗体約５０〜７０μｇを、０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の７．０ＭグアニジンＨＣｌ、６ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて３７℃で３０分間、変性し、還元した。変性／還元した各サンプルを１４ｍＭのヨード酢酸により２５℃で２５分間アルキル化した後、８ｍＭのＤＴＴを添加することによって反応物をクエンチした。次いで、Ｐｉｅｒｃｅ界面活性剤除去スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）を製造者の推奨プロトコールに従って用いて、還元／アルキル化した抗体サンプルを、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に交換した。バッファー交換したサンプルを、トリプシン３．５μｇにより３７℃で６０分間、インキュベートした。分解物を２．２μＬの１０％酢酸を添加することによってクエンチした。分解された抗体約１２〜１７μｇを分析のために注入した。

分解された抗体について、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ）に直接接続したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムを用いて分析した。Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ ３００ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、２．１×１５０ｍｍ、粒子１．７μを４０℃で流量０．２ｍＬ／分にて用いて、タンパク質分解性ペプチドを分離した。移動相Ａは、水中０．０２％ＴＦＡであり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０１８％ＴＦＡであった。０．５〜４０％Ｂのグラジエントを用いて９０分でペプチドを溶出し、次いで、カラムを洗浄し、平衡化した。質量分析計は、分解能１２０，０００のオービトラップでのフルＭＳスキャン、次いで、動的除外を伴うリニアトラップでの５回のデータ依存的ＣＩＤ ＭＳ／ＭＳスキャンに設定した。グリカンプロファイリングに関する自動データ分析をＭａｓｓＡｎａｌｙｚｅｒを用いて実施した（Ｚｈａｎｇ，（２００９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８１：８３５４−８３６４参照）。

この結果は、オルニチン濃度が増加するにつれて、％ＨＭＮが増加することを再度示している（図８参照）。

小規模モック灌流実験３：アルギニン濃度研究
５つの異なる濃度のアルギニンを本研究で試験した。３．６８６、１．３８、０．９２及び０．４６ｇ／Ｌのアルギニンを含む灌流細胞培養培地を試験した。１．８４３ｇ／Ｌのアルギニンを含む灌流培地を対照として用いた。この結果は、アルギニン濃度が増加するにつれて、％ＨＭＮが増加することを示している（図９参照）。

小規模モック灌流実験４：アルギナーゼ阻害剤研究
２系列のアルギナーゼ阻害剤実験を実施した。実験の第１の系列には、４つの市販のアルギナーゼ阻害剤（ＢＥＣ塩酸塩、ＤＬ−α，ジフルオロメチルオルニチン塩酸塩、Ｎ^Ｇ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン一酢酸塩及びＮω−ヒドロキシ−ｎｏｒ−アルギニン二酢酸塩）を、１、１０及び２０μＭの３つの異なる濃度で細胞培養に添加した。対照は、阻害剤非含有であった。本実験から、ＢＥＣ及びＤＬ−αの阻害剤が％ＨＭの減少に最も効果的であることが結論付けられた（図１０）。

実験の第２の系列は、ＢＥＣ阻害剤及びＤＬ−α阻害剤を用いて実施した。ＢＥＣ阻害剤は、０（対照）、１０μＭ及び０．５ｍＭの濃度で灌流細胞培養培地にて試験した。ＤＬ−α阻害剤は、０（対照）、１０μＭ、１．０ｍＭ及び２．０ｍＭの濃度で灌流培養培地にて試験した。２つの阻害剤の濃度が増加するにつれて、％ＨＭが減少することが実証された（図１１を参照）。

Claims (34)

1. 組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を減少させるための方法であって、アルギナーゼ阻害剤を含む細胞培養にて、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、
   ここで、組換えタンパク質を発現する宿主細胞がアルギナーゼ阻害剤を含まない細胞培養にて培養されたときと比べて、前記宿主細胞中のオルニチン産生が減少され、
   前記組換えタンパク質が、アルギナーゼ阻害剤を含まない細胞培養中で発現されたときよりも、低減された高マンノースグリコフォーム含量を有する、方法。
2. 宿主細胞中のオルニチン蓄積が、アルギナーゼ阻害剤を細胞培養に添加することで調節される、請求項１に記載の方法。
3. アルギナーゼ阻害剤が、Ｎ^Ｇ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン一酢酸塩、Ｎω−ヒドロキシ−ｎｏｒ−アルギニン二酢酸塩、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン） 及びＤＬ−α−ジフルオロメチルオルニチンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. アルギナーゼ阻害剤が、ＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）である、請求項３に記載の方法。
5. アルギナーゼ阻害剤が、ＤＬ−α−ジフルオロメチルオルニチンである、請求項３に記載の方法。
6. アルギナーゼ阻害剤が、
   （ａ）１μＭ、１０μＭ又は２０μＭの濃度を有するＮ^Ｇ−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニン一酢酸塩、
   （ｂ）１０μＭ又は２０μＭの濃度を有するＮω−ヒドロキシ−ｎｏｒ−アルギニン二酢酸塩、
   （ｃ）１μＭ、１０μＭ、２０μＭ又は０．５ｍＭの濃度を有するＢＥＣ（Ｓ−（２−ボロノエチル）−ｌ−システイン）、又は
   （ｄ）１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１ｍＭ又は２ｍＭの濃度を有するＤＬ−α−ジフルオロメチルオルニチン
   である、請求項３に記載の方法。
7. アルギナーゼ阻害剤の濃度が、
   （ａ）少なくとも１０μＭ、
   （ｂ）１０μＭ〜２ｍＭ、
   （ｃ）１０μＭ、
   （ｄ）０．５ｍＭ、
   （ｅ）１ｍＭ、及び
   （ｆ）２ｍＭ
   からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を減少させるための方法であって、スペルミンを含む細胞培養にて、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、
   ここで、組換えタンパク質を発現する宿主細胞が、より高濃度のスペルミンと共に細胞培養にて培養されたときと比べて、前記宿主細胞中のオルニチン産生が減少され、
   前記組換えタンパク質が、より高濃度のスペルミンを有する細胞培養中で発現されたときよりも、低減された高マンノースグリコフォーム含量を有する、方法。
9. ３５μＭ以下のスペルミンが細胞培養に加えられる、請求項８に記載の方法。
10. スペルミンの濃度が、
    （ａ）７μＭ〜３５μＭ、
    （ｂ）１７μＭ〜３５μＭ、
    （ｃ）７μＭ〜１７μＭ、
    （ｄ）３５μＭ、
    （ｅ）１７μＭ、及び
    （ｆ）７μＭ
    からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 組換えタンパク質の高マンノースグリコフォーム含有量を増加させるための方法であって、オルニチン、アルギニン、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ阻害剤又はアルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤からなる群から選択される一つを含む細胞培養にて、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含む、方法。
12. 宿主細胞中のオルニチン蓄積が、少なくとも０．６ｍＭのオルニチンを細胞培養培地に添加することによって調節される、請求項１１に記載の方法。
13. オルニチンの濃度が、
    （ａ）０．６〜１４．８ｍＭ、
    （ｂ）６〜１４．８ｍＭ、
    （ｃ）０．６ｍＭ、
    （ｄ）６ｍＭ、及び
    （ｅ）１４．８ｍＭ
    からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 宿主細胞中のオルニチン蓄積が、少なくとも８．７ｍＭのアルギニンを細胞培養培地に添加することによって調節される、請求項１１に記載の方法。
15. アルギニンの濃度が、
    （ａ）８．７ｍＭ〜１７．５ｍＭ、
    （ｂ）８．７ｍＭ、及び
    （ｃ）１７．５ｍＭ
    からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 高マンノースグリコフォーム含有量が減少した組換えタンパク質を産生するための方法であって、アルギナーゼ阻害剤又はスペルミンを含む細胞培養にて組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞中のオルニチン蓄積を減少させることによってオルニチン代謝が調節される、方法。
17. 細胞培養が、スペルミンを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 細胞培養が、アルギナーゼ阻害剤を含む、請求項１６に記載の方法。
19. 高マンノースグリコフォーム含有量が増加した組換えタンパク質を産生するための方法であって、オルニチン、アルギニン、オルニチンアミノトランスフェラーゼ阻害剤、一酸化窒素シンターゼ阻害剤又はアルギニンデカルボキシラーゼ阻害剤からなる群から選択される一つを含む細胞培養にて組換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞中のオルニチン蓄積を増加させることによってオルニチン代謝が調節される、方法。
20. 組換えタンパク質を発現する前記宿主細胞が、回分培養、流加培養、灌流培養又はこれらの組み合わせで培養される、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 培養が、灌流培養である、請求項２０に記載の方法。
22. 灌流が、連続灌流を含む、請求項２１に記載の方法。
23. 灌流の速度が一定である、請求項２１又は２２に記載の方法。
24. 灌流が、
    （ａ）１日当たり１．０作業容量以下の速度で実施される、又は
    （ｂ）交互接線流によって実施される、
    請求項２１又は２２に記載の方法。
25. 組換えタンパク質を発現する宿主細胞が、バイオリアクター内で培養される、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
26. バイオリアクターの容量が
    （ａ）少なくとも５００Ｌ、
    （ｂ）少なくとも５００Ｌ〜２０００Ｌ、及び
    （ｃ）少なくとも１０００Ｌ〜２０００Ｌ
    からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. バイオリアクターは、少なくとも０．５×１０^６細胞／ｍＬで接種される、請求項２５又は２６に記載の方法。
28. 組換えタンパク質を発現する宿主細胞が、無血清細胞培養培地中で培養される、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
29. 無血清培養培地が、灌流細胞培養培地である、請求項２８に記載の方法。
30. 宿主細胞が、
    （ａ）哺乳動物細胞、又は
    （ｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
    である、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
31. 組換えタンパク質が、糖タンパク質である、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
32. 組換えタンパク質が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え融合タンパク質又はサイトカインからなる群から選択される、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
33. 宿主細胞によって産生された組換えタンパク質を回収する工程を更に含む、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
34. 宿主細胞によって産生された組換えタンパク質が、精製され、薬学的に許容可能な製剤に製剤化される、請求項１及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。

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