EP1567655A2 - Enzymatische herstellung von acylflavonoidderivaten - Google Patents

Enzymatische herstellung von acylflavonoidderivaten

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Publication number
EP1567655A2
EP1567655A2 EP03812154A EP03812154A EP1567655A2 EP 1567655 A2 EP1567655 A2 EP 1567655A2 EP 03812154 A EP03812154 A EP 03812154A EP 03812154 A EP03812154 A EP 03812154A EP 1567655 A2 EP1567655 A2 EP 1567655A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acid
flavonoid
reaction
acyl donor
solvent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03812154A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mohamed Ghoul
Jean-Marc Engasser
Philippe Moussou
Gilles Pauly
Melika Ardhaoui
Aude Falcimaigne
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Health and Care Products France SAS
Original Assignee
Cognis France SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cognis France SAS filed Critical Cognis France SAS
Priority to EP03812154A priority Critical patent/EP1567655A2/de
Publication of EP1567655A2 publication Critical patent/EP1567655A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the invention is in the field of phyto- and biochemistry and relates to a process for the enzymatic production of flavonoid derivatives which are used in the food sector, in cosmetics and in pharmaceutical preparations.
  • flavonoids have been well known for many years. By trapping various oxidizing species, they prevent oxidative damage to biomolecules such as DNA, lipids and proteins. In antioxidant assays, some flavonoids are more effective than nitamines C and E. In addition to this main property, several other biological effects have been demonstrated, including inhibiting the action of enzymes and the proliferation of animal cells, viruses and bacteria. They also have an effect on the vascular system and a strong antioxidant capacity.
  • flavonoids Because of their skin-protecting and cleansing properties and their effects against aging, against skin discoloration and on the appearance of the skin, flavonoids have also been used as components of cosmetic or dermopharmaceutical compositions. Furthermore, they affect the mechanical properties of the hair.
  • the anti-oxidant properties of the flavonoids depend on the molecular principle. Studies of the structure-activity relationship have shown that the antioxidant effect on ortho-hydroxylation on ring B of the molecule, the number of free hydroxyl groups, the presence of a double bond between carbon 2 and 3 in ring C and the presence of a hydroxyl group on carbon 3 ( Figure I) is based.
  • Patent WO 09966062 mentions the chemical acylation of flavonoids (quercetin, galangin, (+) - catechin) by fatty acids (lauric acid, butyric acid, acetic acid ...) and a subsequent enzymatic hydrolysis step by means of a Mucor miehei lipase.
  • This invention has the same disadvantages as the patent FR2778663 (US6235294). After the first performed acylation reaction, the products formed are polyacylated.
  • an enzymatic acylation of flavonoids is carried out using various acids (p-chlorophenylacetic acid, stearic acid, 12-hydroxystearic acid, palmitic acid, palmitic acid, Lauric acid, capric acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, 5-phenylvaleric acid, cumaric acid, oleic acid, linoleic acid).
  • This patent describes a process in which a high concentration of Candida antarctica (40 g / 1) and, based on the flavonoids, an excess of acyl donor is used. The conversion rate of the substrates is low (10 to 20%).
  • the invention relates to a process for the enzymatic synthesis of flavonoid esters and derivatives, in which a) a reaction medium is prepared comprising an organic solvent, a glycosylated flavonoid or aglyconflavonoid, an acyl group donor and an enzymatic catalyst, b) optionally adding further amounts of flavonoid and / or acyl donor during the reaction and c) purifying the esters thus obtained by separating enzymatic particles and the solvent, characterized in that the concentration of water formed during the reaction and / or alcohol is controlled so that it is kept below 150 mM.
  • the present invention a process for the selective acylation of glycosylated flavonoids and aglyconflavonoids - leads to the improvement of the flavonoid derivatives with regard to their stability and solubility in various preparations, while their antioxidative properties are retained or improved.
  • Another particular advantage achieved by these modified flavonoids is that bifunctional molecules with higher biological effectiveness are formed.
  • this method can achieve a significant improvement in terms of the final concentrations of flavonoid esters, the conversion yields (both for the flavonoids and the acyl donor originally present) and in particular the productivity, while the complicated, elaborate purification operations after synthesis can be reduced.
  • R ' represents a Cl-C4-alkyl group, preferably a Cl-C2-alkyl group.
  • This process is characterized in that the reaction medium is first dewatered is used to remove any water present before the start of the reaction, and the water or alcohol formed during the reaction is removed online.
  • Water and / or alcohol are kept at concentrations which are suitable for the solvents and substrates used, preferably at concentrations below 150 mM, particularly preferably below 100 mM.
  • the process is suitable for a variety of aglycon flavonoids and glycosylated flavonoids, and the conversion yields achieved with this mild enzymatic process are above those obtained so far: in the range of 50 to 99%.
  • the enzymatic synthesis is carried out under milder conditions than the chemical syntheses, avoiding the use of toxic solvents such as pyridine, benzene and THF, high temperatures and the accumulation of by-products such as salts or flavonoid degradation products, which would require additional purification steps.
  • this method can achieve a significant improvement in terms of the final concentrations of flavonoid esters, the conversion yields (for both the flavonoids and the acyl donor originally present) and, in particular, the productivity, while the complicated, expensive purification operations after the Synthesis can be reduced.
  • a difference between the method according to the invention and the known methods of the prior art is the way in which the enzymatic reaction is carried out, which enables considerably higher yields, and the large number of different flavonoids that can be used (both glycosylated forms and aglycon forms) ,
  • the main aim of the invention is to reduce all of the above-mentioned disadvantages of existing acylation methods and to propose a method for the enzymatic synthesis of flavonoid esters which, compared to the known methods mentioned above, offers a significant improvement in terms of the final concentrations of flavonoid esters, the conversion yields (both for the flavonoids as well as the originally existing acyl donor) and in particular the productivity, while the complicated, expensive purification operations after the synthesis are reduced.
  • the invention relates to a process for the enzymatic synthesis of flavonoid esters, which is characterized in that predetermined amounts of a flavonoid (glycosylated forms and aglycon forms) or flavonoid derivative, an acyl group donor, an organic solvent, in a reactor designed for the formation of a reaction medium it can be the acyl donor and introduces an enzymatic catalyst, under conditions in which the reaction medium can first be dried to a water concentration of less than 150 mM, preferably less than 100 mM and in which the concentration of water formed during the reaction and / or alcohol can be kept below a predetermined point of 150 mM, preferably 100 mM.
  • This predetermined point is met by on-line removal of the water and / or alcohol formed by adsorption on molecular sieves, by distillation or by pervaporation.
  • This reaction can be carried out in the batch process or also in the fed-batch process with one or more substrates.
  • the molar ratio of flavonoid to acyl donor can be kept constant during the reaction by means of a suitable substrate addition profile. It is thus possible to control how the composition of the reaction medium develops over time, and thus to direct the enzymatic reaction towards maximum production of mono- or multiacylated compounds and at the same time to limit interfering reactions.
  • the flavonoid esters thus obtained are finally purified by separating at least enzymatic particles (for example by decanting, filtering or centrifuging) and the solvent (for example by evaporation, distillation or membrane filtration).
  • the reaction is carried out according to the invention in such a way that the inhibition or deactivation of the enzyme reaction which is observed in the presence of high concentrations of flavonoids, acyl donors or water accumulations is initially restricted.
  • the substrates can be fed gradually in a controlled manner as the reaction proceeds, thereby avoiding reaching concentrations that would inhibit the enzyme reaction.
  • the reaction can be carried out so that the flavonoid: acyl donor molar ratio of 0.01 to 20, preferably from 0.02 to 10.
  • the flavonoid: acyl donor molar ratio of 0.01 to 20, preferably from 0.02 to 10.
  • the molar ratio can be kept constant during the reaction or can be varied in a controlled manner, so that it runs through a defined variation profile over time, but is nevertheless in the above-mentioned range of values throughout the reaction .
  • the synthesis reaction can be optimized by temporarily or continuously withdrawing at least one component of the reaction medium. The component (s) withdrawn may possibly be returned to the reactor after fractionation.
  • the reaction vessel or the reactor used for carrying out the process according to the invention is preferably provided with devices for controlling the temperature, the water and / or alcohol content and the pressure, with devices for adding reagents and with devices for withdrawing products.
  • the temperature is advantageously set to 20-100 ° C. and the partial pressure above the reaction medium is advantageously set to 10 mbar (10 3 Pa) to 1000 mbar (10 5 Pa), starting from one to a concentration of less than 150 mM , preferably below 100 mM set initial water content, the amount of water and / or alcohol is kept below 150 mM, preferably below 100 mM and the reaction medium is advantageously stirred gently.
  • aglycon flavonoid or glycosylated flavonoid or flavonoid derivative used in the invention can be any compound selected from the group consisting of chalcon, flavon, flavanol, anthocyanin and flavanone, flavonol, coumarin, isoflavones and xanthones.
  • the acyl donor compound is selected from known fatty acids or their methyl, ethyl, propyl or butyl esters.
  • This fatty acid is preferably selected from that of a straight-chain or branched aliphatic acid, saturated, unsaturated or cyclic, having up to 22 carbon atoms, optionally substituted by one or more substituents, from that of hydroxyl, amino, mercapto, halogen and alkyl-SS-alkyl existing Grappe, for example palmitic acid, 16-hydroxyhexadecanoic acid, 12-hydroxystearic acid, 11-mercaptoundecanoic acid, thioctanoic acid or quinic acid, straight-chain or branched aliphatic diacids, saturated or unsaturated, with up to 22 carbon atoms, for example hexadecanedioic acid or azelaic acid, and an aryl aliphatic acid and an aryl aliphatic acid dimeric acid,
  • the reaction can be carried out with the acyl donor as solvent or in a suitable solvent, which can be any organic compound or any mixture of organic compounds in which the selected flavonoids or flavonoid derivatives and acyl donors are wholly or partly solubilized ,
  • the solvent (s) is selected in particular from the following substances: propan-2-ol, butan-2-ol, isobutanol, acetone, propanone, butanone, pentan-2-one, 1,2-ethanediol, 2,3-butanediol , Dioxane, acetonitrile, 2-methylbutan-2-ol, tert-butanol, 2-methylpropanol and 4- Hydroxy-2-methylpentanone, aliphatic hydrocarbons such as heptane, hexane or a mixture of two or more of these solvents.
  • the enzymatic catalyst used must of course effect and promote the transfer of an acyl group from an acyl donor to a flavonoid or flavonoid derivative and is advantageously a protease or lipase, e.g. from Candida antarctica, Rhizomucor miehei, Candida cylindracea, Rhizopus arrhizus, preferably immobilized on a support.
  • a protease or lipase e.g. from Candida antarctica, Rhizomucor miehei, Candida cylindracea, Rhizopus arrhizus, preferably immobilized on a support.
  • the reactor first contains the solvent, the total amount of flavonoids (generally from 1 g / 1 to 200 g / 1) required to obtain the desired final amount of modified flavonoids and the amount of free acid as Acyl donor, which corresponds to the molar ratio (of dissolved flavonoid / acyl donor) originally required (generally from 0.01 to 20).
  • the medium is brought to a temperature of 20-100 ° C., preferably 40-80 ° C.
  • the reactor first contains the solvent, the total amount of flavonoids (in generally from 1 g / 1 to 200 g / 1), which is required to obtain the desired final amount of modified flavonoids, and the amount of free acid as acyl donor, which corresponds to the originally required molar ratio (of dissolved flavonoid / acyl donor) (im generally from 0.01 to 20).
  • the medium is brought under vacuum (10-500 mbar, preferably 50-250 mbar) to a temperature of 20-100 ° C., preferably 40-80 ° C. , heated, and the steam mixture produced is dried in a column filled with molecular sieves and then condensed and returned to the reactor. If necessary, the condensate is led back through a second column filled with molecular sieves. Then the enzyme is added in soluble or immobilized form (from 1 g / 1 to 100 g / 1, preferably from 5 g / 1 to 20 g / 1). During the course of the reaction, solvent is added so that part of the solvent is evaporated off through a column with molecular sieves. The water is removed by exchange in the vapor phase. The steam is condensed and collected in a collecting container.
  • acyl donor is added online in such an amount per unit of time during the reaction that the molar ratio (of dissolved flavonoid / acyl donor) is kept at the required value.
  • the acyl donor is added at a rate which corresponds to the rate of its consumption in the reaction; this rate of consumption can be determined by a preparatory kinetic examination of the enzyme reaction used.
  • the amount of acyl donor added per unit time during the reaction is generally from 0.01 to 10 grams of acyl donor per hour per gram of enzyme catalyst in the reactor.
  • the synthesis process can also be carried out with the addition of flavonoids and solvents.
  • the reactor first contains the solvent, the total amount of free acid as acyl donor (generally from 1 g / 1 to 500 g / 1) required to obtain the desired final amount of modified flavonoids and the amount of Flavonoid, which corresponds to the molar ratio (of dissolved flavonoid acyl donor) originally required (generally from 1 g / 1 to 200 g / 1).
  • the medium is vacuum (10-500 mbar, preferably 50- 250 mbar) to a temperature of 20-100 ° C, preferably 40-80 ° C, and the steam mixture generated is dried in a column filled with molecular sieves and then condensed and returned to the reactor. If necessary, the condensate is recirculated through a second column filled with molecular sieves. Then the enzyme is added in soluble or immobilized form (from 1 g / 1 to 100 g / 1, preferably from 5 g / 1 to 20 g / 1).
  • solvent is added and a vacuum is applied, so that part of the solvent and the water formed are evaporated off.
  • the amount of evaporation is adjusted by controlling the vacuum and the temperature accordingly.
  • the vapors formed are passed over a column filled with molecular sieves.
  • the water is removed by contact with the molecular sieves.
  • the steam is condensed and collected in a collecting tank, in order to be subsequently returned to the reactor.
  • anhydrous solvent is added during the reaction to compensate for evaporation losses and to keep the amount of solvent relatively constant.
  • flavonoid is added in an amount per unit of time such that the molar ratio (of dissolved flavonoid / acyl donor) is kept at the required value.
  • the flavonoid is added at a rate which corresponds to the rate of its consumption in the reaction; this rate of consumption can be determined by a preparatory kinetic examination of the enzyme reaction used.
  • the amount of flavonoid added per unit time during the reaction is generally from 0.01 to 10 grams of flavonoid per hour per gram of enzyme catalyst in the reactor.
  • the synthesis process can also be carried out with the addition of flavonoid, acyl donor and solvent.
  • the reactor first contains the solvent, a variable concentration of flavonoid (preferably higher than the solubility of the flavonoid in the solvent) and the amount of free acid as acyl donor, which corresponds to the molar ratio (of dissolved flavonoid / acyl donor) originally required.
  • the medium is brought under vacuum (10-500 mbar, preferably 50-250 mbar) to a temperature of 20-100 ° C., preferably 40- 80 ° C, heated, and the steam mixture generated is dried in a column filled with molecular sieves and then condensed and returned to the reactor. If necessary, the condensate is returned via a second column filled with molecular sieves. Then the enzyme is added in soluble or immobilized form (from 1 g / 1 to 100 g / 1, preferably from 5 g / 1 to 20 g / 1).
  • solvents are added and a vacuum in the range of 10-500 mbar, preferably 100-250 mbar, is applied.
  • a vacuum in the range of 10-500 mbar, preferably 100-250 mbar.
  • the vapors formed are passed over a column with molecular sieves.
  • the steam is condensed and collected in a collecting container.
  • anhydrous solvent is added during the reaction to compensate for evaporation losses and to keep the amount of solvent relatively constant.
  • flavonoid is added in an amount per unit of time such that the molar ratio (of dissolved flavonoid / acyl donor) is kept at the required value.
  • flavonoid and acyl donor are added in amounts per unit of time, each corresponding to the rate at which they are consumed in the reaction; these consumption rates can be determined by a preparatory kinetic examination of the enzyme reaction used.
  • the continuous synthesis process can alternatively be carried out with the addition and removal of flavonoid, acyl donor and / or solvent and possibly enzyme catalyst.
  • the reactor first contains the solvent, a variable concentration of flavonoid (preferably higher than the solubility of the flavonoid in the solvent) and the amount of free acid as acyl donor, which corresponds to the molar ratio (of dissolved flavonoid / acyl donor) originally required.
  • the medium is brought under vacuum (10-500 mbar, preferably 50-250 mbar) to a temperature of 20-100 ° C., preferably 40-80 ° C.
  • Anhydrous solvent is added during the reaction to compensate for evaporation and stripping losses, and it is still possible to add flavonoid and acyl donor in amounts per unit time to maintain the molar ratio of these two components at the required level.
  • the water is removed through molecular sieves as described above. After dewatering, the evaporated solvent is condensed and returned to the reactor --uriick. If it is advantageous to keep this molar ratio constant during the reaction, flavonoid and acyl donor are added in amounts per unit of time which correspond to their respective consumption rates in the reaction and their respective withdrawal rates.
  • the reaction is carried out as above, but the free acid as acyl donor is replaced by its methyl, ethyl, propyl or butyl ester, preferably its methyl or ethyl ester.
  • the alcohol formed is removed in the same way as above.
  • the acyl donor is used as the solvent.
  • water and / or alcohol present or present in the medium and / or formed during the reaction is removed through a pervaporation membrane, in the vapor or liquid phase.
  • Rutin monopalmitate synthesis was carried out in a 250 ml batch reactor using Candida antarctica lipase (Novozym 435). This is a lipase immobilized on a macroporous acrylic resin. The lipase is supplied with an activity of 7000 PLE xg '1 (propyl laurate synthesis), a water content of 1-2% by weight and an enzymatic protein content in the range between 1 and 10% by weight.
  • PLE xg '1 propyl laurate synthesis
  • a water content of 1-2% by weight a water content of 1-2% by weight
  • an enzymatic protein content in the range between 1 and 10% by weight.
  • 0.75 g (1.2 mmol) of rutin 0.75 g (1.2 mmol) of rutin, 0.315 g (1.2 mmol) of palmitic acid and 250 ml were tert. -Amyl alcohol used. The medium was heated to 60 ° C.
  • This concentration can be varied by adjusting the vacuum and cooling the cooler accordingly.
  • the pressures examined fluctuate between 10 and 700 mbar, and the temperature of the cooler between -20 and 5 ° C. With this procedure it is possible to adjust the water concentration in the reactor to between 5 and 400 mM.
  • the enzyme was recovered by filtration. The medium was then concentrated by evaporating the solvent. Two extraction systems were used to eliminate substrate residues. A mixture of acetonitrile / heptane (3/5, v / v) was used to remove the palmitic acid, while the rutin was separated by extraction with water / heptane (2/3, v / v).
  • HPLC analysis showed that after 48 hours 95% of the acyl donor was used up.
  • the hesperidin monopalmitate could be obtained by liquid-liquid extraction using the same purification instructions as above.
  • the structure of this hesperidin ester was confirmed by 1 H-NMR analysis.
  • Liquid chromatography analysis showed that 80% of the acyl donor was consumed after 48 hours.
  • the same purification instructions as above enabled the esculin monopalmitate to be obtained using liquid-liquid extraction.
  • the structure of this esculin ester was confirmed by 1H NMR analysis.
  • Example 4 An acylation of rutin with lauric acid was carried out in a 27 ml reactor. Rutin (100 mg, 0.16 mmol) and lauric acid (20 mg, 0.10 mol) were in 20 ml of dried tert-amyl alcohol at 60 ° C. solved. A controlled water content in the reaction medium was adjusted to below 100 mM by adding molecular sieves (4 g). The esterification reaction was started by adding 0.2 g of Candida antartica lipase (Novozym 435). The HPLC analysis showed that the conversion of rutin to the monoester was 76%.
  • Rutin (8, 13 mmol) and dodecanedioic acid (0.3 g, 1.3 mmol) were dissolved in 200 ml of tert-amyl alcohol and heated to 60 ° C. under a vacuum of 150-200 mbars). The vapors formed are passed over a column filled with molecular sieves and recovered. In this way, a low water content of less than 100 mm was achieved in the reactor after a few hours. 2 g of Candida antarctica ipase (Novozym 435) were added.
  • the cleaning method of the liquid-liquid extraction according to Example 1 enabled the recovery of hexadecanedioyl rutin (monoester).
  • the structure of the product was confirmed by 1H-NMR analysis.
  • Esculin was reacted with thioctanoic acid in a 250 ml reactor.
  • Esculin (0.87g, 2.5mmol) and thioctanoic acid (1.23g, 6mmol) were dissolved in 250 ml of tert-amyl alcohol and heated to 60 ° C under vacuum (150-200 mbars). The vapors formed are passed over a column filled with molecular sieves and recovered. In this way, a low water content of less than 100 mm was achieved in the reactor after 21 hours. 2.5 g of Candida antarctica lipase (Novozym 435) was added. After 70 hours, 50% of the esculin had been converted (HPLC analysis).
  • the enzyme was filtered and the reaction medium was concentrated by evaporating the solvent.
  • a mixture of water / heptane / acetonitrile (2/3 / 0.4, v / v / v) was used for extraction, and the ester was then obtained by extraction with dichloromethane. The structure of the ester was verified by 1H NMR.

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von Flavonoidestern und -derivaten, bei dem man a) ein Reaktionsmedium herstellt, enthaltend ein organisches Lösungsmittel, ein glycosyliertes Flavonoid oder Aglyconflavonoid, einen Acylgruppendonor und einen enzymatischen Katalysator, b) gegebenenfalls während der Reaktion weitere Mengen an Flavonoid und/oder Acyldonor zusetzt und c) die so erhaltenen Ester reinigt, indem man enzymatische Partikel und das Lösungsmittel abtrennt, dadurch charakterisiert, dass die Konzentration an während der Reaktion gebildetem Wasser und/oder Alkohol so gesteuert wird, dass sie unter 150 mM gehalten wird.

Description

Herstellung von Flavonoidderivaten
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Phyto- und Biochemie und betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Flavonoidderivaten, die im Lebensmittelbereich, sowie in der Kosmetik und in pharmazeutischen Zubereitungen eingesetzt werden.
Stand der Technik
Die biologischen Wirkungen der Flavonoide sind seit vielen Jahren gut bekannt. Indem sie verschiedene oxidierende Spezies abfangen, verhindern sie eine oxidative Schädigung von Biomolekülen wie DNA, Lipiden und Proteinen. In Antioxidans-Assays sind einige Flavonoide wirksamer als die Nitamine C und E. Neben dieser Haupteigenschaft wurden mehrere weitere biologische Wirkungen aufgezeigt, einschließlich der Ir-hibierung der Wirkung von Enzymen und der Proliferation von Tierzellen, Viren und Bakterien. Weiterhin haben sie eine Wirkung auf das Gefäßsystem und eine starke antioxidative Kapazität.
Wegen ihrer hautschützenden und -reinigenden Eigenschaften und ihrer Wirkungen gegen Altern, gegen Hautverfärbungen und auf das Aussehen der Haut wurden Flavonoide auch als Bestandteile von kosmetischen bzw. dermopharmazeutischen Zusammensetzungen. Weiterhin wirken sie auf die mechanischen Eigenschaften des Haars.
Die Antioxidationseigenschaften der Flavonoide hängen von der Molelmlstniktur ab. Untersuchungen zur Struktur- Wirkungs-Beziehung haben gezeigt, dass die antioxidative Wirkung auf einer ortho-Hydroxylierung am Ring B des Moleküls, der Anzahl freier Hydroxylgruppen, dem Vorhandensein einer Doppelbindung zwischen Kohlenstoff 2 und 3 im Ring C und dem Vorhandensein einer Hydroxylgruppe an Kohlenstoff 3 (Abbildung I ) beruht.
(I)
Die Verwendung dieser Moleküle wird prinzipiell einerseits durch eine sehr geringe Löslichkeit in wäßrigen wie auch organischen Medien und andererseits durch eine geringe Stabilität eingeschränkt. Flavonoide werden durch Licht, Sauerstoff bzw. Oxidationsmittel und Temperaturerhöhungen abgebaut. Diese Einschränkungen verhindern ihren wirksamen Einsatz in Lebensmitteln und kosmetischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Zur Behebung dieses Stabilitätsproblems gibt es verschiedene gut bekannte Strategien: eine Einkapselung oder eine Formulierung mit Antioxidationsmitteln. Keine dieser Lösungen ist jedoch vollständig zufriedenstellend, und es besteht weiterhin ein Bedarf an neuen glycosylierten Flavonoiden und Aglyconflavonoiden mit erhöhter Stabilität.
Zur Verbesserung der Eigenschaften dieser Moleküle wurden enzymatische und chemische Modifikationen vorgeschlagen. So wird in den Patentschriften JP55157580 und JP58131911 die Acylierung von Quercetin mit Fettsäurechloriden in Dioxan in Gegenwart von Pyridin erwähnt. In diesen Patenten wird die Acylierung jedoch in Gegenwart toxischer Lösungsmittel durchgeführt. Die Substratumwandlungsraten sind niedrig. Die Acylierung von Flavon, Flavonol und Flavanon auf gleiche Weise wurde in den Coletica-Patenten FR 2778663 (US6235294) beschrieben. Diese Umsetzung wurde chemisch in Gegenwart eines Fettsäurechlorids oder -anhydrids durchgeführt. Die Durchführung dieser Reaktionen erfordert die Verwendung der aktivierten Fettsäuren und toxischer Lösungsmittel (Pyridin, Chloroform und Toluol). Weiterhin wurden hohe Temperaturen (100°C) verwendet, und die Substratumwandlungsraten waren gering (etwa 10 bis 60%). Außerdem sind diese Reaktionen nicht selektiv, was zu polyacylierten Produkten führt. Im Patent WO 09966062 wird die chemische Acylierung von Flavonoiden (Quercetin, Galangin, (+)-Catechin) durch Fettsäuren (Laurylsäure, Buttersäure, Essigsäure...) und einen anschließenden enzymatischen Hydrolyseschritt durch eine Lipase von Mucor miehei erwähnt. Diese Erfindung weist die gleichen Nachteile wie das Patent FR2778663 (US6235294) auf. Nach der zunächst durchgefiihrten Acylierungsreaktion sind die gebildeten Produkte polyacyliert. Sind Monoester gewünscht, so ist in einem zweiten Schritt eine enzymatische Hydrolyse erforderlich, die nach dem Entfernen der Lösungsmittel der ersten Umsetzung zur Vermeidung einer Desaktivierung des Enzyms durchgeführt wird. Flavonoidmodifikationen wurden auch im Patent EP0618203 beschrieben, in dem die Acylierung von (+/-)-Catechin durch Essigsäure- ethylester und Propionsäureethylester und die Acylierung von Epigallocatechin durch Propionsäure- und Buttersäurephenylester erwähnt werden. Zur Durd--führung dieser Reaktion benötigt man ein teures Enzym (die Carboxylase von Streptomyces rochei), und die Umwandlungsraten der beiden Substrate ist sehr niedrig (weniger als 1% des Acyldonors). Schließlich wird im Henkel/Cognis-Patent WO 0179245 eine enzymatische Acylierung von Flavonoiden (Naringin, Rutin, Asparatin, Orientin, Quercetin, Kampferöl, cis-Orientin, Isoquercitrin) durch verschiedene Säuren (p-Chlorphenylessigsäure, Stearinsäure, 12- Hydroxystearinsäure, Palmitinsäure, Laurinsäure, Caprinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, 5-Phenylvaleriansäure, Cumarsäure, Ölsäure, Linolsäure) beschrieben. In diesem Patent wird ein Verfahren beschrieben, bei dem eine hohe Konzentration an Candida antarctica (40 g/1) und, bezogen auf die Flavonoide, ein Überschuß an Acyldonor verwendet wird. Die Umwandlungsrate der Substrate ist niedrig (10 bis 20%).
Alle oben beschriebenen Arbeiten sind durch niedrige Ausbeuten gekennzeichnet. Darüber hinaus werden bei den chemischen Modifikationen toxische Lösungsmittel verwendet, die Reaktionen sind unspezifisch, was zu Produktmischungen führt, und die beschriebenen enzymatischen Reaktionen sind auf glycosylierte Flavonoide beschränkt. Die im Stand der Technik erwähnten niedrigen Umwandlungsausbeuten beruhen auf der Tatsache, dass die eingesetzten Verfahren nicht an Reaktionen mit wenig löslichen Substraten angepaßt sind und durch das während der Umsetzung entstehende Wasser in drastischer Weise beeinträchtigt werden.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von Flavonoidestem und -derivaten, bei dem man a) ein Reaktionsmedium herstellt, enthaltend ein organisches Lösungsmittel, ein glycosyliertes Flavonoid oder Aglyconflavonoid, einen Acylgruppendonor und einen enzymatischen Katalysator, b) gegebenenfalls während der Reaktion weitere Mengen an Flavonoid und/oder Acyldonor zusetzt und c) die so erhaltenen Ester reinigt, indem man enzymatische Partikel und das Lösungsmittel abtrennt, dadurch charakterisiert, dass die Konzentration an während der Reaktion gebildetem Wasser und/oder Alkohol so gesteuert wird, dass sie unter 150 mM gehalten wird.
Die vorliegende Erfindung - ein Verfahren zur selektiven Acylierung von glycosylierten Flavonoiden und Aglyconflavonoiden - führt zur Verbesserung der Flavonoidderivate bezüglich ihrer Stabilität und Löslichkeit in verschiedenen Zubereitungen, wobei ihre antioxidativen Eigenschaften erhalten bleiben bzw. verbessert werden. Ein weiterer besonderer Vorteil, der durch diese modifizierten Flavonoide erzielt wird, ist, dass bifunktionelle Moleküle mit höherer biologischer Wirksamkeit gebildet werden.
Verglichen mit den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden läßt sich mit diesem Verfahren eine deutliche Verbesserung in bezug auf die Endkonzentrationen von Flavonoidestem, die Umwandlungsausbeuten (sowohl für die Flavonoide als auch den ursprünglich vorhandenen Acyldonor) und insbesondere die Produktivität erzielen, während die komplizierten, aufwendigen Aufreinigungs-Operationen nach der Synthese reduziert werden.
Bei diesem Verfahren kommt eine Enzymtechnologie unter milden Temperatur- und Druckbedmgungen zum Einsatz, ohne dass dabei irgendwelche gefährlichen Lösungsmittel verwendet werden, wobei die Flavonoidester durch direkte Veresterung oder Umestem gemäß den folgenden Reaktionsschemata gebildet werden:
Flavonoid + RCOOH → Flavonoid-OCOR + H2O Flavonoid + RCOOR' → Flavonoid-OCOR + ROH
wobei R' für eine Cl-C4-Alkylgruppe, vorzugsweise eine Cl-C2-Alkylgruppe, steht.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zunächst das Reaktionsmedium entwässert wird, um vor Beginn der Reaktion vorhandenes Wasser zu entfernen, und das bzw. der während der Reaktion gebildete Wasser bzw. Alkohol on-line entfernt wird. Wasser und/oder Alkohol werden auf Konzentrationen gehalten, die für die verwendeten Lösungsmittel und Substrate geeignet sind, vorzugsweise auf Konzentrationen von unter 150 mM, besonders bevorzugt unter 100 mM.
Das Verfahren eignet sich für eine Vielzahl von Aglyconflavonoiden und glycosylierten Flavonoiden, und die mit diesem milden enzymatischen Verfahren erzielten Umwandlungsausbeuten liegen über den bislang erhaltenen: im Bereich von 50 bis 99%.
Die enzymatische Synthese wird unter milderen Bedingungen als die chemischen Synthesen durchgeführt, wobei der Einsatz von toxischen Lösungsmitteln wie Pyridin, Benzol und THF, hohe Temperaturen und das Anfallen von Nebenprodukten wie Salzen oder Flavonoid- Abbauprodukten, die zusätzliche Reinigungsschritte erfordern würden, vermieden wird.
Verglichen mit den obenerwähnten bekannten Methoden läßt sich mit diesem Verfahren eine deutliche Verbesserung in bezug auf die Endkonzentrationen von Flavonoidestem, die Umwandlungsausbeuten (sowohl für die Flavonoide als auch den ursprünglich vorhandenen Acyldonor) und insbesondere die Produktivität erzielen, während die komplizierten, aufwendigen Aufreinigungsoperationen nach der Synthese reduziert werden.
Ein Unterschied zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und den bekannten Methoden des Standes der Technik ist die Art, in der die enzymatische Reaktion durchgeführt wird, was beträchtlich höhere Ausbeuten ermöglicht, und die Vielzahl verschiedener Flavonoide, die eingesetzt werden können (sowohl glycosylierte Formen als auch Aglyconformen).
Das Hauptziel der Erfindung ist es, alle der obenerwähnten Nachteile bestehender Acylierungsmethoden zu reduzieren und ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von Flavonoidestem vorzuschlagen, das, verglichen mit den obenerwähnten bekannten Methoden, eine deutliche Verbesserung in bezug auf die Endkonzentrationen von Flavonoidestem, die Umwandlungsausbeuten (sowohl für die Flavonoide als auch den ursprünglich vorhandenen Acyldonor) und insbesondere die Produktivität erlaubt, während die komplizierten, aufwendigen Aufreinigungsoperationen nach der Synthese reduziert werden. Hierzu betrifft die Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von Flavonoidestem, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man in einen hierfür ausgelegten Reaktor zur Bildung eines Reaktionsmediums vorbestimmte Mengen eines Flavonoids (glycosylierte Formen und Aglyconformen) oder Flavonoidderivats, eines Acylgruppendonors, eines organischen Lösungsmittels, bei dem es sich um den Acyldonor handeln kann, und eines enzymatischen Katalysators einbringt, unter Bedingungen, bei denen zunächst das Reaktionsmedium auf eine Wasserkonzentration von unter 150 mM, vorzugsweise unter 100 mM getrocknet werden kann und bei der die Konzentration an während der Reaktion gebildetem Wasser und/oder Alkohol unter einem vorgegebenen Punkt von 150 mM, vorzugsweise 100 mM gehalten werden kann. Dieser vorgegebene Punkt wird durch on-line Entfernen des gebildeten Wassers und/oder Alkohols durch Adsorption an Molekularsieben, durch Destillation oder durch Pervaporation eingehalten. Diese Reaktion läßt sich im Batch- Verfahren oder auch im Fed- Batch-Verfahren mit einem oder mehreren Substraten durchfuhren. Beim Fed-Batch- Verfahren läßt sich das Molverhältnis vom Flavonoid zum Acyldonor durch ein geeignetes Substratzugabeprofil während der Reaktion konstant halten. Es ist somit möglich zu steuern, wie sich die Zusammensetzung des Reaktionsmediums im Verlauf der Zeit entwickelt, und somit die enzymatische Reaktion in Richtung auf eine maximale Produktion an mono- oder multiacylierten Verbindungen zu lenken und gleichzeitig störende Reaktionen zu begrenzen. Die so erhaltenen Flavonoidester werden abschließend gereinigt, indem man wenigstens enzymatische Partikel (beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren) und das Lösungsmittel (beispielsweise durch Abdampfen, Destillieren oder Membranfiltration) abtrennt.
Die Umsetzung wird erfindungsgemäß so durchgeführt, dass die Inhibierung bzw. Desaktivierung der Enzymreaktion, die man in Gegenwart hoher Konzentrationen an Flavonoiden, Acyldonoren oder Wasseransammlungen beobachtet, zunächst eingeschränkt ist. Die Substrate können im Verlauf der Reaktion graduell in kontrollierter Weise zugeführt werden, wodurch vermieden wird, dass Konzentrationen erreicht werden, die die Enzymreaktion hemmen würden.
Die Reaktion kann so durchgeführt werden, dass das Flavonoid:Acyldonor-Molverhältnis von 0,01 bis 20 vorzugsweise von 0,02 bis 10 beträgt. Indem man die Werte für das Molverhältnis im Reaktionsmedium in den oben angegebenen Bereichen hält, ist es möglich, entweder höhere Reaktionsgeschwindigkeiten oder maximale Anteile an monoacylierten Flavonoiden zu erzielen. Durch Steuerung von Art und Quantität der im Verlauf der Zeit zugegebenen Reagentien läßt sich das Molverhältnis während der Reaktion konstant halten oder kontrolliert variieren, so dass es im Verlauf der Zeit ein definiertes Variationsprofil durchläuft, sich aber dennoch während der gesamten Reaktion in dem obenerwähnten Wertebereich befindet. Eine Optimierung der Synthesereaktion ist durch zwischenzeitliches oder kontinuierliches Abziehen wenigstens eines Bestandteils des Reaktionsmediums möglich. Der abgezogene Bestandteil/die abgezogenen Bestandteile können möglicherweise nach Fraktionierung in den Reaktor zuriickgeführt werden.
Gemäß einer Ausfuhrungsform der Erfindung kann vorgesehen sein, zwischenzeitlich oder kontinuierlich das gesamte Reaktionsmedium abzuziehen und nach Fraktionierung einen oder mehrere Bestandteile des abgezogenen Mediums wieder in den Reaktor zu injizieren.
Das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Reaktionsgefäß bzw. der hierfür verwendete Reaktor ist vorzugsweise mit Vorrichtungen zur Steuerung der Temperatur, des Wasser- und/oder Alkoholgehalts und des Drucks, mit Vorrichtungen zur Zugabe von Reagentien und mit Vorrichtungen zum Abziehen von Produkten versehen.
Während des Ablaufs der Synthesereaktion wird die Temperatur vorteilhafterweise auf 20 - 100°C und der Partialdruck über dem Reaktionsmedium vorteilhafterweise auf 10 mbar (103 Pa) bis 1000 mbar (105 Pa) eingestellt, ausgehend von einem auf eine Konzentration von unter 150 mM, vorzugsweise unter 100 mM eingestellten Ausgangswassergehalt, die Menge an Wasser und/oder Alkohol wird auf unter 150 mM, vorzugsweise unter 100 mM gehalten und das Reaktionsmedium wird vorteilhafterweise leicht gerührt.
Zum Erhalt von Zubereitungen aus hochreinen Flavonoidestem kann weiterhin vorgesehen sein, zusätzliche abschließende Fraktionierangsoperationen durchzuführen, beispielsweise indem man die verbliebenen Flavonoide oder Fette durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln oder superkritischen Fluiden, durch Destillation bzw. molekulare Destillation, durch Ausfällen oder durch Kristallisieren abtrennt. Bei dem in der Erfindung verwendeten Aglyconflavonoid oder glycosylierten Flavonoid bzw. Flavonoidderivat kann es sich um eine beliebige aus der von Chalcon, Flavon, Flavanol, Anthocyan und Flavanon, Flavonol, Cumarin, Isoflavonen und Xanthonen gebildeten Gruppe ausgewählte Verbindung handeln.
Die Acyldonorverbindung wird unter bekannten Fettsäuren bzw. deren Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylestem ausgewählt. Diese Fettsäure wird vorzugsweise aus der von einer geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Säure, gesättigt, ungesättigt oder cyclisch, mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus der aus Hydroxyl, Amino, Mercapto, Halogen und Alkyl-S-S- alkyl bestehenden Grappe, beispielsweise Palmitinsäure, 16-Hydroxyhexadecansäure, 12- Hydroxystearinsäure, 11-Mercaptoundecansäure, Thioctansäure oder Chinasäure, geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Disäuren, gesättigt oder ungesättigt, mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Hexadecandisäure oder Azelainsäure, einer arylaliphatischen Säure und einer davon abgeleiteten dimeren Säure, einer Zimtsäure, gegebenenfalls substituiert durch einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus der aus Hydroxyl, Nitro, Alkyl, Alkoxy und Halogenatomen bestehenden Gruppe, beispielsweise Kaffeesäure (3,4-Dihydroxyzimtsäure), Ferulasäure (4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure) oder Cumarsäure (4-Hydroxyzimtsäure), einer Benzoesäure, gegebenenfalls substituiert durch einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus der Gruppe Hydroxyl, Nitro, Alkyl, Alkoxy und Halogenatomen, beispielsweise Gallussäure (3,4,5-Trihydroxybenzoesäure), Vanillinsäure (4-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure) oder Protocatechusäure (3,4- Dihydroxybenzoesäure) gebildeten Gruppe ausgewählt. Die Fettsäureester werden vorzugsweise aus den Methyl- oder Ethylestem der obigen Verbindungen ausgewählt.
Die Reaktion läßt sich mit dem Acyldonor als Lösungsmittel oder in einem geeigneten Lösungsmittel, bei dem es sich um eine beliebige organische Verbindung oder eine beliebige Mischung organischer Verbindungen handeln kann, in der die ausgewählten Flavonoide bzw. Flavonoidderivate und Acyldonoren ganz oder teilweise solubilisiert werden, durchführen. So wird das/die Lösungsmittel insbesondere aus den folgenden Substanzen ausgewählt: Propan- 2-ol, Butan-2-ol, Isobutanol, Aceton, Propanon, Butanon, Pentan-2-on, 1,2-Ethandiol, 2,3- Butandiol, Dioxan, Acetonitril, 2-Methylbutan-2-ol, tert.-Butanol, 2-Methylpropanol und 4- Hydroxy-2-methylpentanon, aliphatischen Kohlenwasserstoffen wie Heptan, Hexan oder einer Mischung von zwei oder mehreren dieser Lösungsmittel.
Der verwendete enzymatische Katalysator muß natürlich den Transfer einer Acylgruppe von einem Acyldonor zu einem Flavonoid bzw. Flavonoidderivat bewirken und fördern und ist vorteilhafterweise eine Protease oder Lipase, z.B. aus Candida antarctica, Rhizomucor miehei, Candida cylindracea, Rhizopus arrhizus, vorzugsweise auf einem Träger immobilisiert.
Im Betracht der verschiedenen obenerwähnten Merkmale kann man sich mehrere verschiedene Ausführungsformen der Erfindung vorstellen, insbesondere in Hinsicht auf die Art der verwendeten Reagentien und die bevorzugten zu erreichenden Ziele.
In einer ersten Ausfiihrungsform kann man sich somit ein Syntheseverfahren in einem Batch- Reaktor vorstellen (beide Substrate werden in den Reaktor mit Lösungsmittel und Enzym gegeben). In diesem Fall enthält der Reaktor zunächst das Lösungsmittel, die Gesamtmenge an Flavonoiden (im allgemeinen von 1 g/1 bis 200 g/1), die erforderlich ist, um die gewünschte Endmenge an modifizierten Flavonoiden zu erhalten, und die Menge an freier Säure als Acyldonor, die dem ursprünglich erforderlichen Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid/Acyldonor) (im allgemeinen von 0,01 bis 20) entspricht. Um einen festgelegten Punkt der Menge an Wasser im Reaktor von unter 100 mM zu erzielen, wird das Medium unter Vakuum (10-500 mbar, vorzugsweise 50-250 mbar) auf eine Temperatur von 20 -100°C, vorzugsweise 40 -80°C, erhitzt, und die erzeugte Dampfinischung wird in einer mir Molekularsieben gefüllten Säule getrocknet und anschließend kondensiert und in den Reaktor zurückgeführt. Falls erforderlich wird das Kondensat über eine zweite mit Molekularsieben gefüllte Säule zuräckgeführt. Dann wird das Enzym in löslicher oder immobilisierter Form (von 1 g/1 bis 100 g 1, vorzugsweise von 5 g/1 bis 20 g/1) zugesetzt. Während der Reaktion gebildetes Wasser wird über die mit Molekularsieben gefüllte Säule entfernt, indem man das Vakuum und die Temperatur im Reaktor entsprechend einstellt.
In einer zweiten Ausführungsform kann man sich somit ein Syntheseverfahren vorstellen, bei dem Acyldonor und Lösungsmittel während der Umsetzung zugegeben werden. In diesem Fall enthält der Reaktor zunächst das Lösungsmittel, die Gesamtmenge an Flavonoiden (im allgemeinen von 1 g/1 bis 200 g/1), die erforderlich ist, um die gewünschte Endmenge an modifizierten Flavonoiden zu erhalten, und die Menge an freier Säure als Acyldonor, die dem ursprünglich erforderlichen Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid/Acyldonor) (im allgemeinen von 0,01 bis 20) entspricht. Um einen festgelegten Punkt der Menge an Wasser im Reaktor von unter 100 mM zu erzielen, wird das Medium unter Vakuum (10-500 mbar, vorzugsweise 50-250 mbar) auf eine Temperatur von 20-100°C, vorzugsweise 40-80°C, erhitzt, und die erzeugte Dampfinischung wird in einer mit Molekularsieben gefüllten Säule getrocknet und anschließend kondensiert und in den Reaktor zurückgeführt. Falls erforderlich wird das Kondensat über eine zweite mit Molekularsieben gefüllte Säule --nriickgeführt. Dann wird das Enzym in löslicher oder immobilisierter Form (von 1 g/1 bis 100 g/1, vorzugsweise von 5 g/1 bis 20 g/1) zugesetzt. Während des Ablaufs der Reaktion wird Lösungsmittel zugesetzt, so dass ein Teil des Lösungsmittels über eine Säule mit Molekularsieben abgedampft wird. Das Wasser wird durch Austausch in der Dampfphase entfernt. Der Dampf wird kondensiert und in einem Auffangbehälter gesammelt.
Um die Lösungsmittelmenge relativ konstant zu halten, führt man während der Reaktion online Acyldonor in einer solchen Menge pro Zeiteinheit zu, dass das Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid/Acyldonor) auf dem erforderlichen Wert gehalten wird. Somit wird, wenn es vorteilhaft ist, dieses Molverhältnis während der Reaktion konstant zu halten, der Acyldonor mit einer Geschwindigkeit zugesetzt, die der Geschwindigkeit seines Verbrauchs in der Umsetzung entspricht; diese Geschwindigkeit des Verbrauchs läßt sich durch eine vorbereitende kinetische Untersuchung der eingesetzten Enzymreaktion bestimmen. Die während der Reaktion pro Zeiteinheit zugesetzte Menge an Acyldonor beläuft sich im allgemeinen auf von 0,01 bis 10 Gramm Acyldonor pro Stunde pro Gramm Enzymkatalysator im Reaktor.
In einer dritten Ausfuhrungsform der Erfindung kann das Syntheseverfahren auch unter Zugabe von Flavonoiden und Lösungsmittel durchgeführt werden. In diesem Fall enthält der Reaktor zunächst das Lösungsmittel, die Gesamtmenge an freier Säure als Acyldonor (im allgemeinen von 1 g/1 bis 500 g/1), die erforderlich ist, um die gewünschte Endmenge an modifizierten Flavonoiden zu erhalten, und die Menge an Flavonoid, die dem ursprünglich erforderlichen Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid Acyldonor) (im allgemeinen von 1 g/1 bis 200 g/1) entspricht. Um einen festgelegten Punkt der Menge an Wasser im Reaktor von unter 100 mM zu erzielen, wird das Medium unter Vakuum (10-500 mbar, vorzugsweise 50- 250 mbar) auf eine Temperatur von 20-100°C, vorzugsweise 40-80°C, erhitzt, und die erzeugte Dampfinischung wird in einer mit Molekularsieben gefüllten Säule getrocknet und anschließend kondensiert und in den Reaktor --urückgeführt. Falls erforderlich wird das Kondensat über eine zweite mit Molekularsieben gefüllte Säule --i-rückgeführt. Dann wird das Enzym in löslicher oder immobilisierter Form (von 1 g/1 bis 100 g/1, vorzugsweise von 5 g/1 bis 20 g/1) zugesetzt.
Während des Ablaufs der Umsetzung setzt man Lösungsmittel zu und legt ein Vakuum an, so dass ein Teil des Lösungsmittels und das gebildete Wasser abgedampft werden. Die Verdampfungsmenge wird durch eine entsprechende Steuerung des Vakuums und der Temperatur eingestellt. Die gebildeten Dämpfe werden über eine mit Molekularsieben gefüllte Säule geführt. Durch den Kontakt mit den Molekularsieben wird das Wasser entfernt. Nach dem Entfernen des Wassers wird der Dampf kondensiert und in einem Auffangbehälter gesammelt, um dann später in den Reaktor zurückgeführt zu werden. Gegebenenfalls führt man während der Reaktion wasserfreies Lösungsmittel zum Ausgleich von Verdampfungsverlusten zu und um die Lösungsmittelmenge relativ konstant zu halten. Weiterhin wird Flavonoid in einer solchen Menge pro Zeiteinheit zugesetzt, dass das Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid/Acyldonor) auf dem erforderlichen Wert gehalten wird. Somit wird, wenn es vorteilhaft ist, dieses Molverhältnis während der Reaktion konstant zu halten, das Flavonoid mit einer Geschwindigkeit zugesetzt, die der Geschwindigkeit seines Verbrauchs in der Umsetzung entspricht; diese Geschwindigkeit des Verbrauchs läßt sich durch eine vorbereitende kinetische Untersuchung der eingesetzten Enzymreaktion bestimmen. Die während der Reaktion pro Zeiteinheit zugesetzte Menge an Flavonoid beläuft sich im allgemeinen auf von 0,01 bis 10 Gramm Flavonoid pro Stunde pro Gramm Enzymkatalysator im Reaktor.
In einer vierten Ausführungsform der Erfindung kann das Syntheseverfahren auch unter Zugabe von Flavonoid, Acyldonor und Lösungsmittel durchgefilhrt werden. In diesem vierten Fall enthält der Reaktor zunächst das Lösungsmittel, eine variable Konzentration an Flavonoid (vorzugsweise höher als die Löslichkeit des Flavonoids im Lösungsmittel) und die Menge an freier Säure als Acyldonor, die dem ursprünglich erforderlichen Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid/Acyldonor) entspricht. Um einen festgelegten Punkt der Menge an Wasser im Reaktor von unter 100 mM zu erzielen, wird das Medium unter Vakuum (10-500 mbar, vorzugsweise 50-250 mbar) auf eine Temperatur von 20-100°C, vorzugsweise 40- 80°C, erhitzt, und die erzeugte Dampfinischung wird in einer mit Molekularsieben gefüllten Säule getrocknet und anschließend kondensiert und in den Reaktor zurückgeführt. Falls erforderlich wird das Kondensat über eine zweite mit Molekularsieben gefüllte Säule zurückgeführt. Dann wird das Enzym in löslicher oder immobilisierter Form (von 1 g/1 bis 100 g/1, vorzugsweise von 5 g/1 bis 20 g/1) zugesetzt.
Während des Ablaufs der Umsetzung setzt man Lösungsmittel zu und legt ein Vakuum im Bereich von 10-500 mbar, vorzugsweise 100-250 mbar, an. Zum Entfernen des Wassers werden die gebildeten Dämpfe über eine Säule mit Molekularsieben geführt. Der Dampf wird kondensiert und in einem Auffangbehälter gesammelt. Gegebenenfalls führt man während der Reaktion wasserfreies Lösungsmittel zum Ausgleich von Verdampfungsverlusten zu und um die Lösungsmittelmenge relativ konstant zu halten. Weiterhin wird Flavonoid in einer solchen Menge pro Zeiteinheit zugesetzt, dass das Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid/Acyldonor) auf dem erforderlichen Wert gehalten wird.
Ist es vorteilhaft, dieses Molverhältnis während der Reaktion konstant zu halten, so setzt man Flavonoid und Acyldonor in Mengen pro Zeiteinheit zu, die jeweils der Geschwindigkeit ihres Verbrauchs in der Umsetzung entsprechen; diese Verbrauchsgeschwindigkeiten lassen sich durch eine vorbereitende kinetische Untersuchung der eingesetzten Enzymreaktion bestimmen.
In einer fünften Ausführungsform der Erfindung kann das kontinuierliche Syntheseverfahren alternativ unter Zugabe und Abziehen von Flavonoid, Acyldonor und/oder Lösungsmittel und möglicherweise Enzymkatalysator durchge-f-üirt werden. In diesem fünften Fall enthält der Reaktor zunächst das Lösungsmittel, eine variable Konzentration an Flavonoid (vorzugsweise höher als die Löslichkeit des Flavonoids im Lösungsmittel) und die Menge an freier Säure als Acyldonor, die dem ursprünglich erforderlichen Molverhältnis (von gelöstem Flavonoid/Acyldonor) entspricht. Um einen festgelegten Punkt der Menge an Wasser im Reaktor von unter 100 mM zu erzielen, wird das Medium unter Vakuum (10-500 mbar, vorzugsweise 50-250 mbar) auf eine Temperatur von 20-100°C, vorzugsweise 40-80°C, erhitzt, und die erzeugte Dampfinischung wird in einer mit Molekularsieben gefüllten Säule getrocknet und anschließend kondensiert und in den Reaktor --urückgeführt. Falls erforderlich wird das Kondensat über eine zweite mit Molekularsieben gefüllte Säule zr-irückgeführt. Dann wird das Enzym in löslicher oder immobilisierter Form zugesetzt. Während die Umsetzung stattfindet, werden kontinuierlich oder zwischenzeitlich Substanzen aus dem Reaktionsmedium abgezogen. Liegt das Enzym in immobilisierter Form vor, so kann es im Reaktor zurückgehalten werden. Nach der Trennung kann man das Lösungsmittel und möglicherweise das Flavonoid und/oder den Acyldonor in den Reaktor zurückführen. Während der Reaktion wird wasserfreies Lösungsmittel zugesetzt, so dass Verluste durch Verdampfen und Abziehen ausgeglichen werden, und es ist weiterhin möglich, Flavonoid und Acyldonor zuzusetzen, in solchen Mengen pro Zeiteinheit, dass das Molverhältnis dieser beiden Bestandteile auf dem erforderlichen Wert gehalten wird. Das Wasser wird wie oben beschrieben durch Molekularsiebe entfernt. Nach dem Entwässern wird das verdampfte Lösungsmittel kondensiert und wieder in den Reaktor --uriickgeführt. Ist es vorteilhaft, dieses Molverhältnis während der Reaktion konstant zu halten, so werden Flavonoid und Acyldonor in Mengen pro Zeiteinheit zugesetzt, die ihren jeweiligen Verbrauchsgeschwindigkeiten in der Umsetzung und ihren jeweiligen Abzugsgeschwindigkeiten entsprechen.
Bei einer sechsten Ausführungsform führt man die Umsetzung wie oben durch, ersetzt jedoch die freie Säure als Acyldonor durch ihren Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylester, vorzugsweise ihren Methyl- oder Ethylester. Der gebildete Alkohol wird auf die gleiche Weise wie oben entfernt.
In einer siebten Ausfiihrungsform wird der Acyldonor als Lösungsmittel verwendet.
In einer achten Ausführungsform wird im Medium vorhandenes bzw. vorhandener und/oder während der Umsetzung gebildetes Wasser und/oder Alkohol durch eine Pervaporationsmembran entfernt, in der Dampf- oder Flüssigphase.
Beispiele
Beispiel 1:
Die Rutinmonopalmitatsynthese wurde in einem 250-ml-Batch-Reaktor unter Verwendung von Candida antarctica-Lipase (Novozym 435) durchgeführt. Hierbei handelt es sich um eine auf einem makroporösen Acrylharz immobilisierte Lipase. Die Lipase wird mit einer Aktivität von 7000 PLE x g'1 (Propyllauratsynthese), einem Wassergehalt von 1-2 Gew.-% und einem enzymatischen Proteingehalt im Bereich zwischen 1 und 10 Gew.-% geliefert. Für diese Synthese wurden 0,75 g (1,2 mmol) Rutin, 0,315 g (1,2 mmol) Palmitinsäure und 250 ml tert. -Amylalkohol verwendet. Das Medium wurde unter Vakuum (150 mbar) auf 60°C erhitzt, und der gebildete Dampf wurde über eine auf 60°C erhitzte und mit 50 g Molekularsieben gefüllte Säule geleitet. Das vorhandene Wasser wurde also in der Gasphase entfernt, was sehr viel effektiver ist als in der Flüssigphase. Der entwässerte Dampf wurde kondensiert und über eine zweite Säule, die mit der gleichen Menge an Molekularsieben gefüllt war, in den Reaktor zurückgeführt. Durch diese Vorgehensweise war es möglich, nach 6 h einen Ausgangswassergehalt von unter 100 mM zu erhalten und die Substrate zu solubilisieren. Dann wurde das Enzym (2,5 g) zugesetzt. Die Umsetzung wurde bei 60°C unter Vakuum (150 mbar) durchgeführt, und das gebildete Wasser wurde auf die gleiche Weise wie zur ursprünglichen Trocknung entfernt, wodurch dessen Konzentration auf unter 100 mM gehalten wurde.
Diese Konzentration läßt sich durch eine entsprechende Einstellung des Vakuums und Kühlen des Kühlers variieren. Die untersuchten Drücke schwanken zwischen 10 und 700 mbar, und die Temperatur des Kühlers zwischen -20 und 5°C. Durch diese Vorgehensweise ist es möglich, die Wasserkonzentration im Reaktor auf zwischen 5 und 400 mM einzustellen.
Nach 48 Stunden Umsetzung zeigte die Produktanalyse durch HPLC, dass die Umwandlungsausbeuten für die beiden Substrate etwa 90% betrugen.
Am Ende der Reaktion wurde das Enzym durch Filtrieren wiedergewonnen. Das Medium wurde dann durch Abdampfen des Lösungsmittels konzentriert. Zum Eliminieren von Substratresten wurden zwei Extraktionssysteme eingesetzt. Zum Entfernen der Palmitinsäure wurde eine Mischung von Acetonitril/Heptan (3/5, v/v) verwendet, während das Rutin durch Extraktion mit Wasser/Heptan (2/3, v/v) abgetrennt wurde.
Die Straktur des Produkts wurde durch 1H-NMR- Analyse bestätigt.
1H-NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ 0,8 (t, 3H), 1 (d, 3H), 1,25 (m, 24H), 1,45 (m, 2H), 2,1 (m, 2H), 3,1-3,6 (breit, C-H Zucker), 3,7 (d, 1H), 4,45 (s, 1H), 4,65 (t, 1H), 5,3 (breit, OH Zucker), 5,1 (breit, OH Zucker), 5,45 (d, 1H), 6,2 (s, 1H), 6,4 (s, 1H), 6,8 (d, 1H), 7,6 (m, 2H), 12,6 (s, 1H, C5-OH) ppm
Beispiel 2:
Die Acylierung von Hesperidin (0,75 g, 1,2 mmol) mit Palmitinsäure (0,315 g, 1,2 mmol) wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Die HPLC- Analyse zeigte, dass nach 48 Stunden 95% des Acyldonors verbraucht waren. Durch die gleiche Aufreinigungsvorschrift wie oben konnte mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion das Hesperidinmonopalmitat gewonnen werden. Die Struktur dieses Hesperidinesters wurde durch 1H-NMR-Analyse bestätigt.
1H-NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ 0,83 (t, 3H), 1,0 (d, 3H), 1,05 (breit, 24H), 1,20 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 3,4-3,6 (breit, C-H Zucker), 3,8 (s, 3H), 4,15 (s, 1H), 4,58 (s, 1H), 4,75 (m, 2H), 5,0 (m, 1H), 5,18 (dd, 1H), 5,4 (d, 1H), 5,48 (d, 1H), 6,14 (m, 1H), 6,18 (s, 1H), 7,0 (m, 3H), 9,15 (s, 1H), 12,05 (s, lH) ppm
Beispiel 3:
Die Acylierung von Esculin (0,75 g, 2 mmol) mit Palmitinsäure (0,523 g, 2 mmol) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Flüssigchromatographieanalyse zeigte, dass nach 48 Stunden 80% des Acyldonors verbraucht waren. Durch die gleiche Aufreinigungsvorschrift wie oben konnte mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion das Esculinmonopalmitat gewonnen werden. Die Straktur dieses Esculinesters wurde durch 1H-NMR~Analyse bestätigt.
1H-NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ 0,8 (t, 3H), 1,15 (breit, 24H), 1,4 (m, 2H), 2,25 (m, 2H), 3,2 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 4,1 (dd, 1H), 4,35 (d, 1H), 4,85 (d, 1H), 5,25 (s, 1H), 5,35 (d, 1H), 6,2 (d, 1H), 6,8 (s, 1H), 7,3 (s, 1H), 7,85 (d, 1H) ppm
Beispiel 4 Eine Acylierung von Rutin mit Laurinsäure wurde in einem 27 ml — Reaktor ausgeführt. Rutin (100 mg, 0.16 mmol) und Laurinsäure (20 mg, 0.10 mol) wurden in 20 ml getrocknetem tert-Amylalkohol bei 60°C. gelöst. Im Reaktionsmedium wurde ein kontrollierter Wassergehalt durch Zugabe von Molekularsieben (4 g) auf unter 100 mM eingestellt und gehalten. Die Veresterungsreaktion wurde durch Zugabe von 0.2 g Lipase von Candida antartica (Novozym 435) gestartet. Die HPLC- Analyse zeigte, dass die Umsetzung von Rutin zum Monoester bei 76 % lag.
Beispiel 5
Die Acylierung von Esculin (100 mg, 0.27mmol) mit Laurinsäure (54 mg, 0.27mmol) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die HPLC-Analyse ergab eine Umsetzungsrate zum Esculinmonoester von 82 %.
Beispiel 6
Die Acylierung von Esculin (100 mg, 0.27mmol) mit l l-Aminoundecansäure (55mg,
0.27mmol) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die HPLC-Analyse ergab eine Umsetzungsrate zum Monoester von 61 %.
Beispiel 7
Die Acylierung von Esculin (100 mg, 0.27mmol) mit 11-Mercaptoundecansäure (59mg,
0.27mmol) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die Umsetzung von Esculin zum Monoester lag bei 68 % (HPLC-Analyse).
Beispiel 8
Die Acylierung von Esculin (100 mg, 0.27mmol) mit Adipinsäure (40 mg, 0.27mmol) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die HPLC-Analyse ergab eine Umsetzungsrate von 70 %.zum Esculinmonoester. Beispiel 9
Die Acylierung von Rutin (100 mg, 0.16mmol) mit Dodecandisäure (38 mg, O.lόmmol - equimolar) wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die HPLC-Analyse ergab eine Umsetzungsrate zum Rutinmonoester von 75 %.
Beispiel 10
Die Acylierung von Rutin (100 mg, 0.16mmol) mit Dodecandisäure (754 mg, 3.27 mmol - Säureüberschuss) - wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die HPLC-Analyse zeigte eine Umsetzung von Rutin zu 75 %, wobei das Verhältnis von Di- Estern zu Mono-Estem bei 4 : 1 lag.
Beispiel 11
Die Umsetzung von Rutin mit Dodecandisäure mit Überschuss von Rutin wurde in einem 250 ml - Reaktor durchgeführt.
Rutin (8, 13 mmol) und Dodecandisäure (0.3 g, 1.3 mmol) wurden in 200 ml tert- Amylalkohol gelöst und unter Vacuum 150-200 mbars) auf 60°C erhitzt. Die gebildeten Dämpfe werden über eine mit Molekularsieben gefüllte Säule geführt und zurückgewonnen. Auf diese Weise wurde nach einigen Stunden ein geringer Wassergehalt von unter lOOmM im Reaktor erreicht. 2 g Candida antarctica- ipase (Novozym 435) wurden zugesetzt. Nach 4 Tagen wurde eine Umsetzungsrate Dodecandisäure zu Dodecandioyl di-rutin (2 Moleküle Rutin verbunden durch ein Disäuremolekül), und zu Dodecandioyl ratin (monoester) von 100% erreicht (HPLC-Analyse).
Beispiel 12
Die Acylierung von Esculin (8, 21.7 mmol) mit Dodecandisäure (5 g, 21.7 mmol - Säureüberschuss) - wurde wie in Beispiel 11 beschrieben durchgeführt. Die HPLC-Analyse zeigte, dass nach 5 Tagen die Umsetzungsrate zum Esculinmonoester 92 % betrag. Beispiel 13
Die Acylierung von Rutin (100 mg, 0.16mmol) mit Hexadecandisäure (47 mg, O.lόmmol) - wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. 87% des Rutins wurden umgesetzt (HPLC-Analyse).
Die Reinigungsmethode der Flüssig-Flüssig-Extraktion gemäß Beispiel 1 ermöglichte eine Wiederfindung von Hexadecandioyl-Rutin (Monoester). Die Struktur des Produkts wurde durch 1H-NMR-Analyse bestätigt.
1H NMR : (400 MHz, DMSO d6) : δ 0.76 (d, 3H), 1.2 (m, 60H), 1.5 (m, 12H), 2.2 (m, 12H), 3.1-3.6 (broad, 8H), 3.7 (d, 1H), 4.45 (s, 1H), 4.65 (t, 1H), 5.43 (d, 1H), 6.18 (d, 1H), 6.36 (d, 1H), 6.84 (d, 1H), 7.50 (m, 2H) ppm.
Beispiel 14
Die Acylierung von Esculin ( 100 mg, 0.27mmol) mit Hexadecandisäure (78mg, 0.27mmol) - wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die HPLC-Analyse ergab eine Umsetzungsrate von 89 % zum Esculinmonoester.
Beispiel 15
Die Umsetzung von Esculin mit Thioctansäure erfolgte in einem 250 ml - Reaktor. Esculin (0.87g, 2.5mmol) und Thioctansäure (1.23g, 6mmol) wurden in 250 ml tert- Amylalkohol gelöst und unter Vacuum (150-200 mbars) auf 60°C erhitzt. Die gebildeten Dämpfe werden über eine mit Molekularsieben gefüllte Säule geführt und zurückgewonnen. Auf diese Weise wurde nach 21 Stunden ein geringer Wassergehalt von unter lOOmM im Reaktor erreicht. 2,5 g Candida antarctica-Lipase (Novozym 435) wurden zugesetzt. Nach 70 Stunden waren 50 % des Esculins umgesetzt (HPLC-Analyse). Nach Ablauf der Reaktion wurde das Enzym filtriert und das Reaktionsmedium durch Verdampfen des Lösungsmittels konzentriert. Zur Entfernung überschüssiger Thioctansäure wurde eine Mischung aus Wasser/Heptane/Acetonitrile (2/3/0.4, v/v/v) zur Extraktion eingesetzt, die Gewinnung des Esters erfolgte danach durch Extraktion mit Dichlormethan. Die Struktur des Esters wurde durch 1H NMR verifiziert. 1H MR : (400 MHz, DMSO d6): 1.2-1.9 (broad, 8H), 2.1-2.4(broad, 4H), 3.2 (m, 2H), 3.5 (m, 1H), 3.7 (m, 1H), 4.12 (dd, 1H), 4.35 (d, 1H), 4.85 (d, 1H), 5.23 (d, 1H), 5.33 (d, 1H), 6.26(d, 1H), 6.84 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.86 (d, 1H) ppm.
Beispiel 16
Die Umsetzung von Rutin mit Phenylpropionsäure erfolgte in einem 250 ml - Reaktor. Rutin (8g, 13 mmol) und Phenylpropionsäure (10 g, 67 mmol) wurden in 200 ml tert- Amylalkohol gelöst und unter Vacuum (150-200 mbars) auf 60°C erhitzt. Die gebildeten Dämpfe werden über eine mit Molekularsieben gefüllte Säule geführt und zurückgewonnen. Auf diese Weise wurde nach 17 Stunden ein geringer Wassergehalt von unter 100 mM im Reaktor erreicht. 13 g Candida antarctica-L pase (Novozym 435) wurden zugesetzt. Die HPLC-Analyse des Produktes ergab nach einer Reaktionszeit von 105 Stunden eine Umsetzung zum Rutinmonoester von 55 %.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Flavonoidestem und -derivaten, bei dem man a) ein Reaktionsmedium herstellt, enthaltend ein organisches Lösungsmittel, ein glycosyliertes Flavonoid oder Aglyconflavonoid, einen Acylgruppendonor und einen enzymatischen Katalysator, b) gegebenenfalls während der Reaktion weitere Mengen an Flavonoid und/oder Acyldonor zusetzt und c) die so erhaltenen Ester reinigt, indem man enzymatische Partikel und das Lösungsmittel abtrennt, dadurch charakterisiert, dass die Konzentration an während der Reaktion gebildetem Wasser und/oder Alkohol so gesteuert wird, dass sie unter 150 mM gehalten wird.
2. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch charakterisiert, dass die Konzentration an während der Reaktion gebildetem Wasser und/oder Alkohol so gesteuert wird, dass sie unter 100 mM gehalten wird.
3. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch charakterisiert, dass das Molverhältnis von Flavonoid zu Acyldonor im Reaktionsmedium so eingestellt ist, dass es während des Verfahrens im Bereich von 0,01 bis 20,00 liegt.
4. Verfahren nach Ansprach 1, dadurch charakterisiert, dass das Molverhältnis von Flavonoid zu Acyldonor im Reaktionsmedium so eingestellt ist, dass es während des Verfahrens im Bereich von 0,02 bis 10,00 liegt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem man weiterhin dem Reaktionsmedium kontinuierlich oder zwischenzeitlich weitere Mengen an wenigstens einem Flavonoid in fester Form oder in Form einer flüssigen Lösung, Lösungsmittel, enzymatischem Katalysator in löslicher oder immobilisierter Form und Azyldonorverbindung alleine oder solubilisiert im Lösungsmittel zusetzt.
6. Verfahren nach Ansprach 1, bei dem man weiterhin zwischenzeitlich oder kontinuierlich wenigstens einen Bestandteil des Reaktionsmediums abzieht und diesen wenigstens einen abgezogenen Bestandteil nach Fraktionierung wieder in den Reaktor zuräckführt.
7. Verfahren nach Ansprach 6, bei dem man weiterhin zwischenzeitlich oder kontinuierlich das gesamte Reaktionsmedium abzieht und nach Fraktionierung einen oder mehrere Bestandteile des abgezogenen Mediums wieder in den Reaktor injiziert.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei während der Reaktion die Temperatur auf 20- 100°C eingestellt wird, der Partialdrack über dem Reaktionsmedium auf 10 mbar bis 1000 mbar eingestellt wird und das Reaktionsmedium gerührt wird.
9. Verfahren nach Ansprach 1, bei dem man weiterhin verbliebene Flavonoide oder verbliebenen Acyldonor durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln oder superkritischen Fluiden, durch Destillation, durch Kristallisation, durch Adsorption oder durch Ausfällen eliminiert.
10. Verfahren nach Ansprach 1, bei dem man weiterhin die dargestellten Flavonoidester durch Ausfällen oder chromatographische Trennung fraktioniert.
11. Verfahren nach Ansprach 1, bei dem das Flavonoid ausgewählt ist aus der Gruppe, die gebildet wird von Chalcon, Flavon, Flavonol, Flavanon, Anthocyan, Flavanol, Cumarin, Isoflavon und Xanthon.
12. Verfahren nach Ansprach 1, wobei die Acyldonorverbindung ausgewählt ist aus der Grappe, die gebildet wird von geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Säuren, gesättigt, ungesättigt oder cyclisch, mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert durch einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus der aus Hydroxyl, Amino, Mercapto, Halogen und Alkyl-S-S-alkyl bestehenden Gruppe, beispielsweise Palmitinsäure, 16-Hydroxyhexadecansäure, 12-Hydroxystearinsäure, 11-Mercaptoundecansäure, Thioctansäure oder Chinasäure, geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Disäuren, gesättigt oder ungesättigt, mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Hexadecandisäure ode A-zelainsäure, einer arylaliphatischen Säure und einer davon abgeleiteten dimeren Säure, einer Zimtsäure, gegebenenfalls substituiert durch einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus der aus Hydroxyl, Nitro, Alkyl, Alkoxy und Halogenatomen bestehenden Grappe, beispielsweise Kaffeesäure (3,4-Dihydroxyzimtsäure), Ferulasäure (4-Hydroxy-3- methoxyzimtsäure) oder Cumarsäure (4-Hydroxyzimtsäure), einer Benzoesäure, gegebenenfalls substituiert durch einen oder mehrere Substituenten ausgewählt aus der Grappe Hydroxyl, Nitro, Alkyl, Alkoxy und Halogenatomen, beispielsweise Gallussäure (3,4,5-Trihydroxybenzoesäure), Vanillinsäure (4-Hydroxy-3-methoxy- benzoesäure) oder Protocatechusäure (3,4-Dihydroxybenzoesäure), oder deren Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butylestem.
13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Grappe, die gebildet wird von Propan-2-ol, Butan-2-ol, Isobutanol, Aceton, Propanon, Butanon, Pentan-2-on, 1,2-Ethandiol, 2,3-Butandiol, Dioxan, Acetonitril, 2-Methylbutan-2-ol, tert.-Butanol, 2-Methylpropanol und 4-Hydroxy-2- methylpentanon, aliphatischen Kohlenwasserstoffen wie Heptan und Hexan und Mischungen aus mindestens zwei dieser Komponenten.
14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem organischen Lösungsmittel um den Acyldonor handelt.
15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der enzymatische Katalysator eine Protease und/oder Lipase umfaßt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Protease und/oder Lipase auf einem Träger immobilisiert ist.
17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wasser und/oder der Alkohol in der Gas- oder Flüssigphase durch Molekularsiebe aus dem Medium entfernt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Wasser und/oder der Alkohol in der Gas- oder Flüssigphase durch Pervaporation aus dem Medium entfernt wird.
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