EA038986B1 - Высокоактивная кислая альфа-глюкозидаза с повышенным содержанием углеводов - Google Patents

Abstract

Композиция на основе рекомбинантной -глюкозидазы человека (rhGAA), полученная из клеток CHO, которая предусматривает в значительной степени оптимизированную композицию на основе гликанов, состоящую из повышенного количества rhGAA, содержащей N-гликаны, несущие маннозо-6-фосфат (M6P) или бис-M6P, по сравнению с традиционными rhGAA, наряду с низким количеством нефосфорилированных высокоманнозных гликанов и низким количеством концевой галактозы в сложных олигосахаридах. Описываются композиции, содержащие rhGAA, и способы их применения.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Заявка на данное изобретение испрашивает преимущество приоритета согласно предварительной заявке США 62/057842, поданной 30 сентября 2014 г., предварительной заявке США 62/057847, поданной 30 сентября 2014 г., предварительной заявке США 62/112463, поданной 5 февраля 2015 г., предварительной заявке США 62/135345, поданной 19 марта 2015 г., каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Предпосылки к созданию изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение охватывает область медицины, генетики и биохимии рекомбинантных гликопротеинов и, в частности, относится к композициям на основе рекомбинантной альфа-глюкозидазы человека (rhGAA), которые имеют повышенное общее содержание маннозо 6-фосфат-несущих гликанов, которые эффективно целенаправленно воздействуют на CIMPR в мышечных клетках, а затем доставляют rhGAA в лизосомы, где она может снижать аномально высокие уровни накопленного гликогена. RhGAA по настоящему изобретению проявляет превосходные свойства в отношении целенаправленного воздействия на мышечные клетки и последующей доставки к лизосомам по сравнению с традиционными продуктами на основе rhGAA и проявляет другие фармакокинетические свойства, которые делают ее чрезвычайно эффективной для ферментозаместительной терапии субъектов с болезнью Помпе.

Описание предшествующего уровня техники

В качестве существующих ферментозаместительных видов лечения болезни Помпе используют традиционные продукты на основе rhGAA, которые характеризуются низким общим содержанием M6Pи бис-M6P-несущих гликанов. Традиционные продукты известны под названиями Lumizyme®, Myozyme® и алглюкозидаза альфа. Лумизим и миозим представляют собой традиционные формы rhGAA, производимые или реализуемые в виде биологических препаратов компанией Genzyme и одобренные Управлением по надзору в сфере пищевых продуктов и лекарственных средств США, которые описаны посредством ссылки на публикацию Physician's Desk Reference (2014) (которая включена в данный документ посредством ссылки), или в виде продуктов под названием Lumizyme® или Myozyme®, утвержденных FDA для применения в США с 1 октября 2014 г. Алглюкозидаза альфа имеет химическое название [199-аргинин,223-гистидин]препро-а-глюкозидаза (человека); молекулярную формулу C4₇5₈H₇2₆2N₁2₇4O₁₃₆₉S₃₅; номер CAS 420794-05-0. Данные продукты вводят субъекту с болезнью Помпе, также известной как болезнь накопления гликогена II типа (GSD-II) или генерализованный гликогеноз. При помощи ферментозаместительной терапии предпринимают попытки лечения болезни Помпе путем замещения недостающего GAA в лизосомах посредством введения rhGAA, восстанавливая таким образом способность клетки расщеплять лизосомный гликоген.

Болезнь Помпе представляет собой наследственную лизосомную болезнь накопления, которая возникает в результате недостаточной активности кислой α-глюкозидазы (GAA). Субъекты с болезнью Помпе испытывают недостаток или имеют пониженные уровни кислой альфа-глюкозидазы (GAA), фермента, который расщепляет гликоген, и также вещества, которое используется организмом в качестве источника энергии. Данная недостаточность фермента вызывает избыточное накопление гликогена в лизосомах, являющихся внутриклеточными органеллами, содержащими ферменты, которые в норме обеспечивают расщепление гликогена и другого клеточного дебриса или продуктов жизнедеятельности. Накопление гликогена в определенных тканях субъекта с болезнью Помпе, а именно в мышцах, нарушает способность клеток к нормальному функционированию. При болезни Помпе гликоген надлежащим образом не метаболизируется и постепенно накапливается в лизосомах, а именно в клетках скелетных мышц, а при младенческой форме заболевания накапливается в клетках сердечной мышцы. Накопление гликогена приводит к повреждению мышечных и нервных клеток, а также других клеток в пораженных тканях.

Традиционно в зависимости от возраста возникновения болезнь Помпе с клинической точки зрения определяют или как раннюю младенческую форму, или как форму с поздним возникновением. Возраст возникновения имеет зависимость от тяжести генетических мутаций, вызывающих болезнь Помпе. Наиболее тяжелые генетические мутации, вызывающие полную потерю активности GAA, проявляются в виде заболевания с ранним возникновением. Генетические мутации, которые ослабляют активность GAA, но полностью не устраняют ее, ассоциированы с формами болезни Помпе, имеющими отсроченные манифестацию и прогрессирование. Болезнь Помпе, которая возникает в младенческом возрасте, проявляется вскоре после рождения, и она характеризуется мышечной слабостью, дыхательной недостаточностью и сердечной недостаточностью. При отсутствии лечения заболевание, как правило, приводит к летальному исходу в течение двух лет. Болезнь Помпе, которая возникает у лиц юношеского и зрелого возраста, позже проявляется в пожилом возрасте и, как правило, прогрессирует медленнее, чем болезнь, возникшая в младенческом возрасте. Данная форма заболевания, хотя она в целом не оказывает негативного влияния на сердце, может также приводить к смерти из-за слабости скелетных мышц и мышц, вовлеченных в дыхание.

Современное не паллиативное лечение болезни Помпе включает ферментозаместительную терапию

- 1 038986 (ERT) с использованием рекомбинантной GAA (rhGAA) человека, такой как Lumizyme® или Myozyme®.

Вводят rhGAA с целью замещения или восполнения недостающего или дефектного GAA у субъекта с болезнью Помпе. Однако поскольку большая часть rhGAA в традиционных продуктах на основе rhGAA не воздействует целенаправленно на мышечную ткань, то она непродуктивно элиминируется после введения.

Это происходит из-за того, что традиционные rhGAA не имеют высокого общего содержания M6Pи бис-M6P-несущих гликанов, которые нацеливают молекулу rhGAA на CIMPR целевых мышечных клеток, где они затем переносятся в лизосомы клеток. Данному поглощению rhGAA клетками при ферментозаместительной терапии способствует особый углевод, маннозо-6-фосфат (M6P), который связывается с катион-независимым рецептором маннозо-6-фосфата (CIMPR), присутствующим на поверхностях клеток, для последующей доставки экзогенного фермента к лизосомам.

Существует семь возможных N-связанных сайтов гликозилирования в rhGAA. Поскольку каждый сайт гликозилирования является гетерогенным по типу присутствующих N-связанных олигосахаридов (N-гликанов), то rhGAA состоит из сложной смеси белков с N-гликанами, имеющими изменчивую аффинность связывания в отношении рецептора M6P и других углеводных рецепторов. RhGAA, которая содержит высокоманнозные N-гликаны, имеющие одну М6Р-группу (моно-М6Р), связывается с CIMPR с низкой (~6000 нМ) аффинностью, тогда как rhGAA, которая содержит две М6Р-группы в том же N-гликане (6ис-М6Р), связывается с высокой (~2 нМ) аффинностью. Репрезентативные конструкции для нефосфорилированных моно-М6Р- и бис-M6P-гликанов показаны на фиг. 1А. Маннозо-6-P-группа показана на фиг. 1В. Оказавшись внутри лизосом, rhGAA может ферментативным путем расщеплять накопленный гликоген. Однако традиционные rhGAA имеют низкие общие уровни M6P- и бис-M6P-несущих гликанов и, таким образом, в недостаточной степени целенаправленно воздействуют на целевые мышечные клетки, результатом чего является худшая доставка rhGAA в лизосомы. Большинство молекул rhGAA в данных традиционных продуктах не имеет фосфорилированных N-гликанов, из-за чего они характеризуются недостаточной аффинностью к CIMPR. Рецептор маннозы также может освобождаться от высокоманнозных нефосфорилированных гликанов, что приводит к непродуктивному выведению ERT (фиг. 2).

Также в rhGAA присутствует другой тип N-гликанов, сложных углеводов, которые содержат галактозу и сиаловые кислоты. Поскольку сложные N-гликаны являются нефосфорилированными, они не характеризуются аффинностью к CIMPR. Однако N-гликаны сложного типа с доступными галактозными остатками характеризуются аффинностью к асиалогликопротеиновому рецептору печеночных гепатоцитов в диапазоне от умеренной до высокой, что приводит к быстрому непродуктивному выведению rhGAA (фиг. 2).

Гликозилирование GAA или rhGAA может быть модифицировано in vitro ферментативным путем с помощью фосфотрансферазы и экспонирующих ферментов, описанных Canfield, et al., в патенте США № 6534300, для получения М6Р-групп. Ферментативное гликозилирование не может соответствующим образом контролироваться, при этом получают rhGAA с нежелательными иммунологическими и фармакологическими свойствами. Модифицированная ферментативным путем rhGAA может содержать только высокоманнозные N-гликаны, которые все могут быть потенциально фосфорилированы in vitro посредством фосфотрансферазы/экспонирующего фермента и могут содержать в среднем 5-6 М6Р-групп на GAA. Паттерны гликозилирования, полученные путем ферментативной обработки in vitro GAA, являются труднодоступными в связи с тем, что дополнительные концевые остатки маннозы, в частности нефосфорилированные концевые остатки маннозы, оказывают негативное воздействие на фармакокинетику модифицированной rhGAA. Когда такой модифицированный ферментативным путем продукт вводят in vivo, данные маннозные группы обеспечивают повышение непродуктивного выведения GAA, повышение поглощения иммунными клетками GAA, модифицированной ферментативным путем, и снижение терапевтической эффективности rhGAA как результат того, что меньшее количество GAA достигает целевых тканей, таких как миоциты сердечной мышцы или скелетных мышц. Например, концевые нефосфорилированные остатки маннозы являются известными лигандами для рецепторов маннозы в печени и селезенке, которые приводят к быстрой очистке модифицированной ферментативным путем rhGAA и к снижению целенаправленного воздействия на rhGAA целевые ткани. Более того, паттерн гликозилирования модифицированной ферментативным путем GAA, имеющей высокоманнозные N-гликаны, с концевыми нефосфорилированными остатками маннозы имеет сходство с гликопротеинами, которые продуцируются в дрожжах, плесневых грибах и функционально повышают риск инициирования иммунной или аллергической реакции, а именно опасной для жизни тяжелой аллергической (анафилактической) реакции или реакции гиперчувствительности, по сравнению с модифицированной ферментативным путем rhGAA.

Как было разъяснено выше, традиционные продукты на основе rhGAA, подобно Lumizyme®, имеют низкие уровни монофосфорилированных гликанов и еще более низкие уровни бисфосфорилированных гликанов. Для того чтобы терапия болезни Помпе была эффективной, rhGAA должна быть доставлена к лизосомам в мышечных клетках. Сниженное общее количество моно-М6Р- и бис- 2 038986

М6Р-нацеливающих групп в традиционной rhGAA ограничивает клеточное поглощение посредством CIMPR и лизосомную доставку, что делает традиционную ферментозаместительную терапию неэффективной. Например, хотя традиционные продукты rhGAA в дозе 20 мг/кг или в более высоких дозах действительно улучшают некоторые аспекты болезни Помпе, они не способны соответствующим образом уменьшать накопленный гликоген во многих целевых тканях, в частности, в скелетных мышцах для регрессии заболевания.

Из-за неспособности доставлять традиционные ферментозаместительные терапевтические средства к лизосомам, такие терапевтические средства часто ассоциированы с другими проблемами, в том числе с вызовом иммунных реакций к GAA. Большая часть GAA в традиционной rhGAA не содержит гликанов, несущих моно- или 6ис-М6Р, которые нацеливают rhGAA на мышечные клетки. Иммунная система субъекта подвергается воздействию данной избыточной нефосфорилированной GAA и может вызывать негативные иммунные реакции, которые обеспечивают узнавание GAA. Индукция иммунных реакций на нефосфорилированную GAA, которая не проникает в целевые ткани и не доставляется в лизосомы, обеспечивает увеличение риска неудачного лечения в связи с иммунологической инактивацией введенной rhGAA и обеспечивает повышение риска вредоносного воздействия на пациента со стороны аутоиммунных или аллергических реакций в результате лечения с использованием rhGAA. В соответствии с настоящим изобретением rhGAA содержит значительно меньшие количества данной нецелевой нефосфорилированной rhGAA, что тем самым снижает воздействие на нее иммунной системы пациента.

По техническим причинам большие дозы создают дополнительную нагрузку на субъекта, а также медицинских работников, которые лечат субъекта, такую как увеличение времени инфузии, необходимого для внутривенного введения rhGAA. Это происходит из-за того, что традиционная rhGAA имеет более высокое содержание нефосфорилированной rhGAA, которая целенаправленно не воздействует на CIMPR в мышечных клетках. RhGAA, которая не связывается с CIMPR в мышечных клетках с последующим проникновением в лизосому, не расщепляет там гликоген ферментативным путем. При введении эквивалентных доз традиционной rhGAA и rhGAA в соответствии с настоящим изобретением большее количество rhGAA в композиции в соответствии с настоящим изобретением связывается с CIMPR на мышечных клетках, а затем доставляется в лизосому. RhGAA по настоящему изобретению предоставляет врачу возможность введения меньшего количества rhGAA с доставкой к лизосоме такого же или большего количества rhGAA.

Современные способы изготовления, используемые для получения традиционной rhGAA, такой как Myozyme®, Lumizyme® или алглюкозидазы альфа, незначительно увеличили содержание M6P или 6ис-М6Р, поскольку обработка клеточных углеводов, естественно, является сложной и исключительно тяжелой для осуществления. С учетом этих недостатков в отношении традиционных продуктов на основе rhGAA авторы настоящего изобретения активно искали и определяли способы эффективного целенаправленного воздействия rhGAA на мышечные клетки и ее доставку к лизосомам, сводя к минимуму непродуктивное выведение rhGAA при введении и делая, таким образом, целенаправленное воздействие rhGAA на мышечную ткань более продуктивным.

Краткое описание изобретения

В ответ на проблемы, связанные с целенаправленным воздействием и введением традиционных форм rhGAA, и на трудности, связанные с получением таких надлежащим образом целенаправленно воздействующих форм rhGAA, авторы настоящего изобретения исследовали и разработали методики получения rhGAA, которая более эффективно целенаправленно воздействует на CIMPR, и доставки ее к лизосомам в мышечных тканях, поскольку она имеет более высокое содержание M6P- и бис-M6P-гликана, чем традиционные композиции на основе rhGAA. Более того, rhGAA по настоящему изобретению имеет легко поддающиеся обработке N-гликаны сложного типа, которые сводят к минимуму непродуктивное выведение rhGAA из тканей, не являющихся мишенью.

Принимая во внимание проблемы, связанные с современными способами ферментозаместительного лечения с использованием традиционных продуктов на основе rhGAA, таких как Lumizyme®, путем тщательного изучения и исследования, авторы настоящего изобретения разработали способ получения rhGAA в клетках CHO со значительно более высоким общим содержанием моно-М6Р- и 6ис-М6Ргликанов, которые целенаправленно воздействуют на CIMPR в мышечных клетках с последующей доставкой rhGAA к лизосомам.

RhGAA, полученная данным способом, также характеризуется выгодными фармакокинетическими свойствами в силу своего общего паттерна гликозилирования, который увеличивает поглощение тканимишени и снижает непродуктивное выведение после введения субъекту с болезнью Помпе. Авторы настоящего изобретения показали, что rhGAA по настоящему изобретению, примером которой является rhGAA, обозначенная как АТВ-200, является более активной и более эффективной в плане целенаправленного воздействия на ткани скелетных мышц, чем традиционная rhGAA, такая как Lumizyme®. В соответствии с настоящим изобретением rhGAA обладает превосходной способностью продуктивно целенаправленно воздействовать на мышечные ткани пациентов с болезнью Помпе и снижать непродуктивное выведение rhGAA, что показано на фиг. 2.

- 3 038986

Превосходная rhGAA в соответствии с настоящим изобретением может быть дополнена или объединена с шаперонами или конъюгирована с другими группами, которые целенаправленно воздействуют на CIMPR в мышечной ткани, такими как части IGF2, которые связываются с этим рецептором. Приведенные ниже примеры показывают, что rhGAA по настоящему изобретению, примером которой является АТВ-200 rhGAA, превосходит существующую стандартную ферментозаместительную терапию, обеспечивая значительно лучшее выведение гликогена из скелетных мышц по сравнению с существующей схемой лечения с использованием традиционного продукта на основе rhGAA - Lumizyme®.

Краткое описание графических материалов

Данный комплект материалов содержит по меньшей мере один графический материал, выполненный в цвете.

На фиг. 1А показан нефосфорилированный высокоманнозный гликан, моно-M6P-гликан и бис-M6P-гликан.

На фиг. 1В показана химическая структура М6Р-группы.

На фиг. 2А изображено продуктивное целенаправленное воздействие rhGAA посредством гликанов, несущих M6P, на целевые ткани (например, мышечные ткани субъекта с болезнью Помпе).

На фиг. 2В описано непродуктивное выведение лекарственного средства из нецелевых тканей (например, печенью и селезенкой) или связывание гликанов без M6P с нецелевыми тканями.

На фиг. 3А в виде графика изображен рецептор CIMPR (также известный как рецептор IGF2) и домены данного рецептора.

На фиг. 3В с помощью таблицы показана аффинность (наномолярная) связывания гликанов, несущих бис- и моно-М6Р для CIMPR, аффинность связывания гликанов высокоманнозного типа с рецепторами маннозы и аффинность связывания десиалированного сложного гликана с рецепторами сиалогликопротеина. RhGAA, которая имеет гликаны, несущие M6P и 6ис-М6Р, может продуктивно связываться с CIMPR на целевых клетках мышц. RhGAA, которая имеет высокоманнозные гликаны и десиалированные гликаны, может продуктивно связываться с нецелевыми клетками, несущими соответствующие рецепторы.

На фиг. 4А и 4В соответственно показаны результаты хроматографии для определения аффинности связывания CIMPR с Lumizyme® и Myozyme®. Прерывистые линии относятся к градиенту элюирования посредством M6P. Элюирование посредством M6P обеспечивает замещение молекул GAA, связанных через M6P-содержащий гликан с CIMPR.

На фиг. 4А показано, что 78% активности GAA в Lumizyme® элюировалось перед добавлением M6P.

На фиг. 4В показано, что 73% активности GAA Myozyme® элюировалось перед добавлением M6P. Только 22 или 27% rhGAA в Lumizyme® или в миозиме соответственно элюировали с помощью M6P.

На данных фигурах показано, что большая часть rhGAA в двух данных традиционных продуктах на основе rhGAA не имеет гликанов с M6P, которые необходимы для целенаправленного воздействия на CIMPR в целевых мышечных тканях.

Фиг. 5. Изображена ДНК-конструкция для трансформирования клеток CHO с помощью ДНК, кодирующей rhGAA. Клетки CHO трансформировали с помощью ДНК-конструкции, кодирующей rhGAA (SEQ ID NO: 4).

На фиг. 6А и 6В показаны результаты аффинной хроматографии CIMPR для миозима и АТВ-200 rhGAA. На фиг. 6В видно, что приблизительно 70% rhGAA в АТВ-200 rhGAA содержали M6P.

Фиг. 7. Очистка АТВ-200 rhGAA, варианты осуществления 1 и 2.

Фиг. 8. Профиль элюирования с помощью Polywax для Lumizyme® и АТВ-200 rhGAA.

Фиг. 9. Краткое описание структур N-гликанов в Lumizyme® по сравнению с тремя различными препаратами на основе АТВ200 rhGAA, обозначенными как BP-rhGAA, ATB200-1 и АТВ200-2.

На фиг. 10А сравнивают аффинность связывания с CIMPR для АТВ-200 rhGAA (левая дорожка) с аффинностью связывания для Lumizyme® (левая дорожка).

На фиг. 10В изображено содержание 6ис-М6Р в Lumizyme® и АТВ-200 rhGAA.

На фиг. 11А сравнивают активность АТВ-200 rhGAA (левая дорожка) с активностью Lumizyme® rhGAA (правая дорожка) в нормальных фибробластах при разных концентрациях GAA.

На фиг. 11В сравнивают активность АТВ-200 rhGAA (левая дорожка) с активностью Lumizyme® rhGAA (правая дорожка) в фибробластах субъекта с болезнью Помпе при разных концентрациях GAA.

На фиг. 11С сравниваются (К_{поглощения}) у фибробластов нормального субъекта и субъекта с болезнью Помпе.

На фиг. 12А показано количество гликогена по отношению к белку в сердечной мышце после взаимодействия с наполнителем (отрицательным контролем), с 20 мг/мл алглюкозидазы альфа или с 5, 10 или 20 мг/кг АТВ-200 rhGAA.

На фиг. 12В показано количество гликогена по отношению к белку в четырехглавой мышце после взаимодействия с наполнителем (отрицательным контролем), с 20 мг/мл Lumizyme® или с 5, 10 или 20 мг/кг АТВ-200 rhGAA.

- 4 038986

На фиг. 12С показано количество гликогена по отношению к белку в трехглавой мышце после взаимодействия с наполнителем (отрицательным контролем), с 20 мг/мл Lumizyme® или с 5, 10 или мг/кг АТВ-200 rhGAA. АТВ-200 rhGAA приводит к значительному уменьшению гликогена в четырехглавой и трехглавой мышце по сравнению с отрицательным контролем и по сравнению с Lumizyme®.

Фиг. 13. Стабильность АТВ-200 rhGAA улучшается в присутствии шаперона АТ2221. Первая дорожка слева на фиг. 13А показывает процент развернутого белка АТВ-200 rhGAA при различных температурах и при показателе pH 7,4 (показатель pH крови). Последняя правая дорожка показывает процент развернутого белка АТВ-200 rhGAA при различных температурах и при показателе pH 5,2 (показатель pH лизосомы). Три промежуточные дорожки показывают влияние 10, 30 или 100 мкг шаперона АТ2221 на укладку белка. Эти данные показывают, что АТ2221 предупреждает разворачивание АТВ-200 rhGAA при показателе pH крови по сравнению с контрольным образцом. Улучшение T_m при нейтральном показателе pH при увеличении АТ2221 изложено на фиг. 13В.

На фиг. 14 с помощью данной таблицы показано, что комбинация АТВ-200 rhGAA и шаперона АТ2221 обеспечивает значительно лучшее выведение гликогена у мышей, нокаутированных по GAA, по сравнению с обработками с использованием Lumizyme® и АТ2221 или с контрольными образцами, обработанными с использованием или Lumizyme®, или АТВ200 rhGAA без шаперона АТ2221.

Фиг. 15. Остаточный гликоген в четырехглавой мышце после обработки с помощью лумизимом, АТВ-200 rhGAA или АТВ-200 rhGAA и разными концентрациям шаперона АТ2221.

Фиг. 16. Улучшение состояния при патологии скелетных мышц у мышей, получавших АТВ200 + миглустат (АТ2221), по сравнению с теми, которых обрабатывали с помощью только ERT. PAS-окрашивание гликогена (фиг. 16А) и ЕМ (фиг. 16В) в мышечной ткани мышей с KO по GAA, обработанных традиционной rhGAA или АТВ-200 rhGAA и миглустатом (АТ-2221).

Фиг. 16С. Оценка пролиферации лизосом по маркеру LAMP-1.

Фиг. 16D. Определение мышечных волокон I типа и II типа.

Фиг. 17. Улучшение состояния при патологии скелетных мышц у мышей, получавших АТВ-200 + миглустат (АТ2221), по сравнению с теми мышами, которых обрабатывали с помощью только ERT.

Окрашивание гликогена PAS (фиг. 17А) и ЕМ в мышечной ткани KO по GAA мышей, обработанных традиционной rhGAA или АТВ-200 rhGAA и миглустатом (АТ-2221).

Фиг. 17В. Оценка пролиферации лизосом по маркеру LAMP-1.

Подробное описание настоящего изобретения

Определения.

Термины, используемые в данном описании, в целом имеют их обычные значения в данной области, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, где используется каждый термин. Определенные термины обсуждаются ниже или в других местах в данном описании, чтобы обеспечить дополнительное указание для практикующего специалиста при описании композиций и способов по настоящему изобретению и их получении и использовании.

Термин GAA относится к кислой α-глюкозидазе человека (GAA), ферменту, который катализирует гидролиз α-1,4- и а-1,6-гликозидных связей лизосомного гликогена, а также к вставочным, родственным или замещенным вариантам аминокислотной последовательности GAA и к фрагментам более длинной последовательности GAA, которая проявляет ферментативную активность.

Термин rhGAA используют для того, чтобы отличать эндогенную GAA от синтетической или полученной рекомбинантным путем GAA, такой как полученной путем трансформации клеток CHO с помощью ДНК, кодирующей GAA. Иллюстративная последовательность ДНК, кодирующая GAA, представляет собой NP_000143.2 (SEQ ID NO: 4), которая включена в данный документ посредством ссылки. GAA и rhGAA могут присутствовать в композиции, содержащей смесь молекул GAA, имеющих различные паттерны гликозилирования, как, например, смесь молекул rhGAA, несущих моно-М6Р-или 6ис-М6Р-группы на их гликанах, и молекулы GAA, которые не несут M6P или 6ис-М6Р. GAA и rhGAA можно также дополнять другими соединениями, а именно шаперонами, или их можно связывать с другими функциональными группами в составе GAA или с конъюгатом на основе rhGAA, а именно связывать с молекулами IGF2, которые нацеливают конъюгат на CIMPR с последующей его доставкой в лизосомы.

Субъектом или пациентом является предпочтительно человек, при этом можно также подвергать лечению других млекопитающих и животных, не относящихся к человеку, имеющих нарушения, которые включают накопление гликогена. Субъектом может быть плод, новорожденный, ребенок, юноша или взрослый с болезнью Помпе или с другим нарушением, связанным с депонированием или накоплением гликогена. Примером индивидуума, который подлежит лечению, является индивидуум (плод, новорожденный, ребенок, юноша, подросток или взрослый человек) с GSD-II (например, с младенческой GSD-II, юношеской формами GSD-II или с возникшей во взрослом возрасте GSD-II). Индивидуум может иметь остаточную активность GAA или активность, не поддающуюся измерению. Например, индивидуум с GSD-II может иметь активность GAA, которая составляет менее приблизительно 1% от нормальной активности GAA (младенческая GSD-II), активность GAA, которая составляет приблизительно 1-10% от

- 5 038986 нормальной активности GAA (ювенильная GSD-II) или активность GAA, которая составляет приблизительно 10-40% от нормальной активности GAA (GSD-II у взрослого).

Термины лечить и лечение, используемые в данном документе, относятся к облегчению одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, к предупреждению или отсрочке возникновения одного или нескольких симптомов заболевания и/или к уменьшению тяжести или частоты возникновения одного или нескольких симптомов заболевания. Например, лечение может означать улучшение кардиологического статуса (например, увеличение конечно-диастолических и/или конечносистолических объемов или уменьшение, облегчение или предупреждение прогрессирующей кардиомиопатии, которую, как правило, обнаруживают при GSD-II) или функции легких (например, увеличение жизненной емкости легких по сравнению с емкостью исходного уровня и/или нормализация сниженного насыщения кислородом во время крика); улучшение неврологического развития и/или двигательных навыков (например, увеличение балла при оценке по шкале AIMS); снижение уровней гликогена в ткани индивидуума, пораженного данным заболеванием; или любые комбинации данных эффектов. В одном предпочтительном варианте осуществления лечение включает улучшение кардиологического статуса, в частности, выражающегося уменьшением или предупреждением GSD-II-ассоциированной кардиомиопатии.

Термины улучшать, увеличивать или снижать, используемые в данном документе, указывают на уровни, которые связаны с измерением исходного уровня, а именно с измерением у того же индивидуума до начала лечения, описанного в данном документе, или измерения у индивидуума контрольной группы (или у множества индивидуумов контрольной группы) при отсутствии лечения, описанного в данном документе. Индивидуум контрольной группы является индивидуумом, страдающим такой же формой GSD-II (или младенческой, ювенильной или приобретенной), как и подлежащий лечению индивидуум, который имеет приблизительно такой же возраст, как и индивидуум, подлежащий лечению (чтобы обеспечивать возможность сопоставления стадий заболевания индивидуума, которого лечат, и индивидуума(ов) контрольной группы).

Термин очищенный, используемый в данном документе, относится к материалу, который выделяли в условиях, которые снижают или устраняют присутствие посторонних материалов, т.е. контаминантов, в том числе нативных материалов, из которых получен материал. Например, очищенный белок является предпочтительно, по сути, свободным от других белков или нуклеиновых кислот, с которыми он ассоциирован в клетке; очищенная молекула нуклеиновой кислоты является предпочтительно, по сути, свободной от белков или других посторонних молекул нуклеиновых кислот, с которыми ее можно обнаружить в клетке.

Используемый в данном документе термин по сути, свободный используют в рабочем порядке в контексте аналитического тестирования материала. Предпочтительно очищенный материал, по сути, свободный от контаминантов, является по меньшей мере на 95% чистым; более предпочтительно по меньшей мере на 97% чистым и еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% чистым. Чистоту можно оценивать с помощью хроматографии, гель-электрофореза, иммунологического анализа, анализа по определению состава, биологического анализа, ферментного анализа и других способов, известных в данной области. В конкретном варианте осуществления очищенный означает, что уровень контаминантов ниже уровня, приемлемого для регуляторных органов по безопасному введению человеку или животному, не относящемуся к человеку. Рекомбинантные белки можно выделять из клеток CHO или очищать от них с использованием способов, известных в данной области, в том числе с помощью хроматографической сортировки по размеру, аффинной хроматографии или анионообменной хроматографии.

Термин генетически модифицированный или рекомбинантный относится к клетками, а именно к клеткам СНО, которые экспрессируют определенный продукт гена, а именно rhGAA или АТВ-200 rhGAA, после введения нуклеиновой кислоты, содержащей кодирующую последовательность, которая кодирует продукт гена, в сочетании с регуляторными элементами, которые регулируют экспрессию кодирующей последовательности. Введение нуклеиновой кислоты можно выполнять с помощью способов, известных в данной области, в том числе путем целенаправленного воздействия на ген и гомологичной рекомбинации. Используемый в данном документе термин также включает клетки, которые были подвергнуты изменению посредством методик генной инженерии для экспрессии или сверхэкспрессии эндогенного гена или продукта гена, экспрессируемого такой клеткой не в обычном состоянии, например посредством технологии активации генов.

Болезнь Помпе относится к аутосомно-рецессивной LSD, характеризующейся дефицитом активности кислой α-глюкозидазы (GAA), которая ухудшает метаболизм лизосомного гликогена. Дефицит фермента приводит к накоплению лизосомного гликогена и приводит к прогрессирующей слабости скелетной мускулатуры, снижению сердечной деятельности, дыхательной недостаточности и/или ухудшению деятельности ЦНС на поздних стадиях заболевания. Генетические мутации в гене GAA приводят или к уменьшению экспрессии, или к получению мутантных форм фермента с измененной устойчивостью и/или с биологической активностью, которые в конечном итоге приводят к возникновению заболевания (см. в общем Hirschhorn R., 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid α-Glucosidase (Acid

- 6 038986

Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, New York, 7^th ed., pages 2443-2464). Три установленные клинические формы болезни Помпе (младенческая, юношеская и взрослая) коррелируют с уровнем остаточной активности α-глюкозидазы (Reuser A.J. et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). Младенческая форма болезни Помпе (I типа или А), наиболее часто встречающаяся и наиболее тяжелая, характеризуется задержкой в развитии, общим пониженным тонусом, гипертрофией сердца и кардиореспираторной недостаточностью в течение второго года жизни. Юношеская форма болезни Помпе (II типа или В) является промежуточной по тяжести и характеризуется преобладанием симптомов, связанных с мышцами, без кардиомегалии. Индивидуумы с юношеской формой болезни Помпе обычно умирают до достижения 20-летнего возраста из-за дыхательной недостаточности. Болезнь Помпе у взрослых (III тип или С) часто проявляется в виде медленно прогрессирующей миопатии, возникающей в подростковом возрасте или уже в конце шестого десятилетия (Felicia K.J. et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135). Было показано, что при болезни Помпе α-глюкозидаза интенсивно посттрансляционно модифицируется посредством гликозилирования, фосфорилирования и протеолитического процессинга. Для оптимального катализа гликогена требуется химическое превращение 110-килодальтонного (кДа) предшественника в 76- и 70-килодальтонные зрелые формы путем протеолиза в лизосоме. Используемый в данном документе термин болезнь Помпе относится ко всем типам болезни Помпе. Лекарственные формы и схемы дозирования, раскрытые в данном документе, можно использовать для лечения, например, болезни Помпе I типа, II типа или III типа.

Неограничивающие варианты осуществления настоящего изобретения

Композиция на основе rhGAA, полученная из клеток СНО, содержит повышенное количество rhGAA, содержащей N-гликаны, несущие моно-маннозо-6-фосфат (M6P) или 6ис-М6Р, по сравнению с традиционной rhGAA, примером которой является Lumizyme® (алглюкозидаза-альфа; CAS 420794-05-0). Иллюстративная композиция на основе rhGAA в соответствии с настоящим изобретением представляет собой АТВ-200 (иногда обозначаемую как АТВ-200, АТВ-200 или CBP-rhGAA), которая описана в примерах. RhGAA по настоящему изобретению (АТВ-200), как было показано, связывает CIMPR с высокой аффинностью (K_D~2-4 нМ) и подвергается эффективному поглощению фибробластами при болезни Помпе и миобластами скелетных мышц (К_{поглощен}ия~7-14 нМ). АТВ-200 характеризовали in vivo и было показано, что она имеет более короткий кажущийся период полувыведения из плазмы крови (t_1/2~45 мин) по сравнению с настоящей rhGAA ERT (t_1/2~60 мин).

Аминокислотная последовательность rhGAA может быть по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 95 или 99% идентична последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1, 3 или 4, или содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более делеций, замен или вставок в аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1, 3 или 4. В некоторых вариантах осуществления GAA или rhGAA по настоящему изобретению, такие как rhGAA в АТВ-200, GAA или rhGAA, будут содержать аминокислотную последовательность GAA дикого типа, такую как последовательность с SEQ 1D NO: 1 или 3. В других неограничивающих вариантах осуществления rhGAA содержит совокупность аминокислотных остатков, присутствующих в GAA дикого типа, где совокупность включает аминокислотные остатки GAA дикого типа, которые образуют активный сайт для связывания с субстратом и/или для расщепления субстрата. В одном варианте осуществления rhGAA представляет собой α-глюкозидазу, которая представляет собой фермент кислую α-глюкозидазу (GAA) человека, кодируемую наиболее преобладающим из девяти выявленных гаплотипов данного гена. RhGAA по настоящему изобретению, в том числе АТВ-200 rhGAA, может содержать аминокислотную последовательность, которая на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательностью α-глюкозидазы человека, а именно такую последовательность, которая приведена под номером доступа AHE24104.1 (GI:568760974)(SEQ ID NO: 1) и которая включена в данный документ посредством ссылки на патент США № 8592362, или идентична аминокислотной последовательности NP_000143.2 (SEQ ID NO: 4). Нуклеотидная и аминокислотная последовательность для GAA также приведена под SEQ ID NO: 2 и 3 соответственно. Варианты данной аминокислотной последовательности также включают варианты с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более аминокислотными делениями, вставками или заменами в нижеописанной аминокислотной последовательности GAA. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие GAA и подобные варианты GAA человека, также предусматриваются, и их можно использовать для рекомбинантной экспрессии rhGAA в соответствии с настоящим изобретением.

Различные алгоритмы выравнивания и/или программы можно использовать для расчета идентичности между двумя последовательностями, в том числе FASTA или BLAST, которые используют как часть программного пакета для анализа последовательностей GCG (университет штата Висконсин, г. Мэдисон, Висконсин), и их можно использовать, например, со стандартными настройками. Например, предусматриваются полипептиды, которые по меньшей мере на 70, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичны конкретным полипептидам, описанным в данном документе, и предпочтительно проявляющие, по сути, такие же функции, а также полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды. Если не указано иное, оценка сход

- 7 038986 ства будет основываться на использовании BLOSUM62. При использовании BLASTP процент сходства основывается на положительной оценке в BLASTP, а процент идентичности последовательности основывается на оценках идентичности посредством BLASTP. Оценки идентичности согласно BLASTP показывают количество и долю общих остатков в парах последовательностей с высоким баллом подобия, которые являются идентичными; и положительные оценки согласно BLASTP показывают количество и долю остатков, для которых оценки выравнивания имеют положительное значение и которые имеют схожесть друг с другом. Настоящим раскрытием предусматриваются и охватываются аминокислотные последовательности, имеющие данные степени идентичности или сходства или любую промежуточную степень идентичности или сходства с аминокислотными последовательностями, раскрытыми в настоящем документе. Полинуклеотидные последовательности сходных полипептидов получают с использованием генетического кода, и они могут быть получены с помощью традиционных способов, в частности обратной трансляции ее аминокислотной последовательности с использованием генетического кода.

Предпочтительно не более чем в 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5% общей rhGAA в композиции в соответствии с настоящим изобретением отсутствует N-гликан, несущий M6P или бисM6P, или у нее отсутствует способность связываться с катион-независимым рецептором маннозо-6фосфата (CIMPR). В качестве альтернативы 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, <100% или более rhGAA в композиции содержит по меньшей мере один N-гликан, несущий M6P и/или бисM6P, или обладает способностью связываться с CIMPR.

Молекулы rhGAA в композиции на основе rhGAA по настоящему изобретению могут иметь 1, 2, 3 или 4 М6Р-группы в своих гликанах. Например, лишь один N-гликан в молекуле rhGAA может нести M6P (монофосфорилированный), отдельный N-гликан может нести две М6Р-группы (бисфосфорилированный) или два разных N-гликана в одной и той же молекуле rhGAA могут нести отдельные М6Р-группы. Молекулы rhGAA в композиции на основе rhGAA также могут иметь N-гликаны, не несущие М6Р-групп. В другом варианте осуществления в среднем N-гликаны содержат более 3 моль/моль M6P и более 4 моль/моль сиаловой кислоты. В среднем по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% общих гликанов в rhGAA может присутствовать в виде моно-M6P-гликана, например приблизительно 6,25% от общих гликанов могут нести отдельную М6Р-группу и в среднем по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0% от общих гликанов в rhGAA находятся в форме бис-M6P-гликана, и в среднем менее 25% общей rhGAA по настоящему изобретению не содержит фосфорилированного гликана, связывающегося с CIMPR.

Композиция на основе rhGAA в соответствии с настоящим изобретением может иметь среднее содержание N-гликанов, несущих M6P, в диапазоне от 0,5 до 7,0 моль/моль rhGAA или любое промежуточное значение в поддиапазоне, в том числе 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 или 7,0 моль/моль rhGAA. В примерах показано, что rhGAA по настоящему изобретению можно фракционировать с целью обеспечения композиций на основе rhGAA с разными средними количествами M6Pнесущих или бис-M6P-несущих гликанов в rhGAA, что обеспечивает дальнейшую оптимизацию целенаправленного воздействия rhGAA на лизосомы в целевых тканях путем отбора определенных фракций или путем избирательного объединения разных фракций.

Не более 60% N-гликанов в rhGAA может быть полностью сиалировано, например не более 10, 20, 30, 40, 50 или 60% N-гликанов может быть полностью сиалировано. В некоторых вариантах осуществления от 4 до 20% всех N-гликанов в композиции на основе rhGAA являются полностью сиалированными.

В других вариантах осуществления не более 5, 10, 20 или 30% N-гликанов в rhGAA несут сиаловую кислоту и концевую Gal. Этот диапазон включает все промежуточные значения и поддиапазоны, например от 7 до 30% общих N-гликанов в rhGAA в композиции могут нести сиаловую кислоту и концевую Gal.

В еще одних вариантах осуществления не более 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% N-гликанов в rhGAA имеют только концевую Gal и не содержат сиаловую кислоту. Этот диапазон включает все промежуточные значения и поддиапазоны, например от 8 до 19% общих N-гликанов в rhGAA в композиции могут иметь только концевую Gal и не содержать сиаловую кислоту.

В других вариантах осуществления по настоящему изобретению от 40, 45, 50, 55 до 60% всех N-гликанов в rhGAA в композиции представляют собой N-гликаны сложного типа или не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% всех N-гликанов в rhGAA в композиции представляют собой N-гликаны гибридного типа; не более 5, 10 или 15% N-гликанов высокоманнозного типа в rhGAA в композиции являются нефосфорилированными; по меньшей мере 5 или 10% N-гликанов высокоманнозного типа в rhGAA в композиции фосфорилированы моно-М6Р и/или по меньшей мере 1 или 2% N-гликанов высокоманнозного типа в rhGAA в композиции фосфорилированы 6ис-М6Р. Эти значения включают все промежуточные значения и поддиапазоны. Композиция на основе rhGAA в соответствии с настоящим изобретением может соответствовать одному или нескольким диапазонам содержания, описанным выше.

В некоторых вариантах осуществления композиция на основе rhGAA по настоящему изобретению будет нести в среднем от 2,0 до 8,0 остатка сиаловой кислоты на моль rhGAA. Этот диапазон включает все промежуточные и поддиапазоны, в том числе 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0 остатка/моль rhGAA. Остатки сиаловой кислоты могут предупреждать непродуктивное выведение

- 8 038986 посредством асиалогликопротеиновых рецепторов.

Композицию на основе rhGAA по настоящему изобретению предпочтительно получают с помощью клеток CHO, таких как линии клеток CHO, GA-ATB-200, или с помощью субкультуры или производного такой культуры клеток СНО. ДНК-конструкции, которые экспрессируют аллельные варианты GAA или другой вариант GAA аминокислотных последовательностей, таких как последовательности, которые по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентичны с SEQ ID NO: 1, можно сконструировать и экспрессировать в клетках СНО. Специалисты в данной области могут выбирать альтернативные векторы, подходящие для трансформации клеток CHO, для получения таких ДНК-конструкций.

Авторы настоящего изобретения выявили, что rhGAA, имеющую превосходную способность к целенаправленному воздействию на CIMPR и лизосомы клеток, а также паттерны гликозилирования, которые снижают ее непродуктивное выведение in vivo, можно получать при использовании клеток яичника китайского хомячка (СНО). Эти клетки можно индуцировать для экспрессии rhGAA со значительно повышенными уровнями общих M6P и 6ис-М6Р по сравнению с традиционными продуктами на основе rhGAA. Например, рекомбинантная GAA человека, полученная при помощи данных клеток, примером которой является rhGAA ATB-200, описанная в данных примерах, имеет значительно больше M6P- и 6ис-М6Р-групп, целенаправленно воздействующих на клетки мышц, по сравнению с традиционной GAA, а именно Lumizyme®, и, как было показано, она эффективно связывается с CIMPR и эффективно поглощается скелетными мышцами и сердечной мышцей. Также было показано, что имеющийся паттерн гликозилирования обеспечивает благоприятный фармакокинетический профиль и снижает непродуктивное выведение in vivo.

В соответствии с настоящим изобретением rhGAA может быть составлена в виде фармацевтической композиции или использована в получении лекарственного препарата для лечения болезни Помпе или других состояний, ассоциированных с дефицитом GAA. Композиции могут быть составлены с физиологически приемлемым носителем или наполнителем. Носитель и композиция могут быть стерильными и в остальном соответствовать способу введения.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, воду, солевые растворы (например, NaCl), солевой раствор, забуференный физиологический раствор, спирты, глицерин, этанол, аравийскую камедь, растительные масла, бензиновые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, углеводы, такие как лактоза, амилоза или крахмал, сахара, такие как маннит, сахароза или другие, декстроза, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу и поливинилпирролидон и им подбные, а также их комбинации. Фармацевтические препараты можно, в случае необходимости, смешивать со вспомогательными средствами, например поверхностноактивными веществами, такими как полисорбаты, подобные полисорбату 80, смазывающие вещества, консерванты, стабилизаторы, смачивающие средства, эмульгаторы, соли, оказывающие влияние на осмотическое давление, буферы, красители, вкусовые и/или ароматические вещества и им подобные, которые не оказывают вредного воздействия на активные соединения. В предпочтительном варианте осуществления используют водорастворимый носитель, подходящий для внутривенного введения.

Композиция или лекарственный препарат, в случае необходимости, могут также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих средств или буферных средств, регулирующих показатель pH. Композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, пилюлю, капсулу, состав с замедленным высвобождением или порошок. Композиция также может быть составлена в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Состав для перорального введения может содержать стандартные носители, такие как фармацевтически чистый маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, поливинилпирролидон, натрия сахарин, целлюлоза, углекислый магний и им подобные. В предпочтительном варианте осуществления rhGAA вводят посредством внутривенной инфузии.

Композиция или лекарственный препарат могут быть составлены с помощью рутинных методик в виде фармацевтической композиции, приспособленной для введения человеку. Например, в предпочтительном варианте осуществления композиция для внутривенного введения представляет собой раствор в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция может также включать растворитель и местный анестетик для облегчения боли в месте инъекции. В целом ингредиенты обеспечивают или отдельно, или смешанными в стандартной лекарственной форме, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически запаянном контейнере, таком как ампула или пакет-саше, с указанием количества активного средства. Если композиция предназначена для введения посредством инфузии, ее можно вносить в инфузионный флакон, содержащий стерильную фармацевтически чистую воду, солевой раствор или смесь декстроза/вода. При введении композиции посредством инфузии может предусматриваться ампула со стерильной водой для инъекции или с солевым раствором для смешивания ингредиентов до введения.

RhGAA может быть составлена в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные со свободными аминогруппами, такими как полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и им подобных, и образованные со свободными карбоксильными группами, такими как полученные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов желе

- 9 038986 за, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и им подобных.

RhGAA (или композицию или лекарственный препарат, содержащие GAA) вводят подходящим путем. В одном варианте осуществления GAA вводят внутривенно. В других вариантах осуществления GAA вводят путем непосредственного введения в целевую ткань, такую как сердечная или скелетная мышца (например, внутримышечно) или в нервную систему (например, путем непосредственной инъекции в мозг; интравентрикулярно; интратекально). В случае необходимости можно одновременно использовать больше одного пути.

RhGAA (или композиция, или лекарственный препарат, содержащие GAA) вводят в терапевтически эффективном количестве (например, при величине дозы, которая при введении с равными интервалами является достаточной для лечения болезни, в частности для уменьшения тяжести симптомов, ассоциированных с заболеванием, предупреждения или задержки возникновения заболевания и/или также для уменьшения тяжести или частоты возникновения симптомов заболевания, как описано выше). Количество, которое будет терапевтически эффективным при лечении заболевания, будет зависеть от природы и выраженности последствий заболевания и может определяться с помощью стандартных клинических методик. Кроме того, in vitro или in vivo анализы можно необязательно использовать для содействия в определении оптимальных диапазонов дозы. Подлежащая использованию точная доза также будет зависеть от способа введения и тяжести заболевания и должна быть определена в соответствии с заключением врача и состоянием каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы с кривых зависимости доза-ответ, полученных при использовании in vitro или животных модельных тест-систем. В предпочтительном варианте осуществления терапевтически эффективное количество составляет менее или равняется 20 мг фермента/кг массы тела индивидуума, предпочтительно находится в диапазоне, составляющем приблизительно 1-10 мг фермента/кг массы тела и еще более предпочтительно составляет приблизительно 10 мг фермента/кг массы тела или приблизительно 5 мг фермента/кг массы тела. Эффективная доза для конкретного индивидуума может варьироваться (например, в сторону увеличения или уменьшения) со временем в зависимости от потребностей индивидуума. Например, количество может быть увеличено при соматическом заболевании или стрессе, или при появлении или увеличении количества антител к GAA, или при ухудшении симптомов.

Терапевтически эффективное количество GAA (или композицию или лекарственный препарат, содержащие GAA) вводят с равными интервалами в зависимости от происхождения и выраженности эффектов заболевания и на постоянной основе. Введение с равными интервалами, используемое в данном документе, указывает, что терапевтически эффективное количество вводят периодически (в отличие от разовой дозы). Интервал можно определять с помощью стандартных клинических методик. В предпочтительных вариантах осуществления GAA вводят один раз в месяц, два раза в два месяца; один раз в неделю; два раза в неделю или ежедневно. Интервал введения для потребности отдельного индивидуума не является фиксированным интервалом и может варьироваться со временем в зависимости от потребностей индивидуума. Например, интервал между дозами может быть уменьшен при соматическом заболевании или стрессе, или при появлении или увеличении антител к GAA, или при ухудшении симптомов заболевания. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество 5, 10, 20, 50, 100 или 200 мг фермента/кг массы тела вводят два раза в неделю, один раз в неделю или один раз в две недели с шапероном или без шаперона.

GAA или rhGAA по настоящему изобретению можно получать для последующего использования, а именно в сосуде с разовой дозой или в шприце, или в бутылке, или в мешке для внутривенного введения. Наборы, содержащие GAA или rhGAA, а также необязательно наполнители или другие активные ингредиенты, такие как шапероны или другие лекарства, могут быть заключены в упаковочный материал и снабжены инструкциями для восстановления, разведения или дозирования для лечения субъекта, нуждающегося в таком лечении, а именно пациента с болезнью Помпе.

GAA (или композиция, или лекарственный препарат, содержащие GAA) можно вводить отдельно или в сочетании с другими средствами, такими как шаперон. Можно вводить rhGAA с разными степенями гликозилирования моно-М6Р или 6ис-М6Р или вводить комбинации rhGAAs с разными уровнями M6P или 6ис-М6Р.

В некоторых вариантах осуществления композицию на основе rhGAA по настоящему изобретению будут составлять в комплексе с шапероном или смешивать с ним, с таким как АТ-2220 или АТ-2221. Шапероны, упоминаемые иногда как фармакологические шапероны, представляют собой соединения, которые при составлении комплекса или при совместном введении с rhGAA модифицируют его фармакокинетические и другие фармакологические свойства. Иллюстративные шапероны, являющиеся примером в данном документе, включают АТ2221 (миглустат, N-бутил-дезоксиноджиримицин) и АТ2220 (дувоглустат HCl, 1-дезоксиноджиримицин). Данное образование комплексов или смешивание может происходить вне организма или в организме, например, при введении отдельных доз rhGAA и шаперона. Например, целенаправленное воздействие активной rhGAA, ее фракций или производных по настоящему изобретению на CIMPR, а в дальнейшем на клеточные лизосомы можно улучшить путем ее объединения с дувоглустатом-HCl (АТ2220, дезоксиноджиримицином, АТ2220) или миглустатом (АТ2221, N-бутилдезоксиноджиримицином). Приведенные ниже примеры показывают значительное расщепление суб- 10 038986 страта гликогена в основных скелетных мышцах мышей с нокаутом по GAA, получающих rhGAA с хорошими нацеливающими свойствами по настоящему изобретению в комбинации с шапероном.

Другой аспект по настоящему изобретению относится к клеткам CHO, или их производным, или другим эквивалентам, которые продуцируют rhGAA в соответствии с настоящим изобретением. Примером такой линии клеток CHO является GA-ATB-200 или ее субкультура, которая продуцирует композицию на основе rhGAA, что описано в данном документе. Такие линии клеток CHO могут содержать множество копий гена, а именно 5, 10, 15 или 20 или больше копий полинуклеотида, кодирующего GAA.

Соединения с высоким содержанием M6P и 6ис-М6Р rhGAA по настоящему изобретению, такие как АТВ-200 rhGAA, можно получать с помощью трансформации клеток CHO (клеток яичника китайского хомячка) посредством ДНК-конструкции, которая кодирует GAA. Хотя клетки CHO ранее использовали для получения rhGAA, не было оценено то, что трансформированные клетки CHO можно культивировать и выбирать таким способом, при котором будет продуцироваться rhGAA с высоким содержанием M6P- и бис-M6P-гликанов, которые целенаправленно воздействуют на CIMPR. Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что можно было трансформировать линии клеток CHO, отбирать трансформантов, которые продуцируют rhGAA с высоким содержанием гликанов, несущие M6P или 6ис-М6Р, которые целенаправленно воздействуют на CIMPR, и стабильно экспрессировать данную rhGAA с высоким содержанием M6P. Таким образом, родственный аспект по настоящему изобретению описан для способа получения данных линий клеток СНО. Данный способ включает трансформирование клетки CHO при помощи ДНК, кодирующей GAA или вариант GAA, отбор клетки CHO, в хромосому(ы) которой стабильно интегрирована ДНК, кодирующая GAA, и которая стабильно экспрессирует GAA, и отбор клетки CHO, которая экспрессирует GAA с высоким содержанием гликанов, несущих M6P или 6ис-М6Р, и необязательно отбор клетки CHO, характеризующейся N-гликанами с высоким содержанием сиаловой кислоты и/или характеризующейся низким содержанием нефосфорилированных N-гликанов высокоманнозного типа.

Данные линии клеток CHO можно использовать для получения композиций на основе rhGAA и rhGAA в соответствии с настоящим изобретением путем культивирования линии клеток CHO и выделения указанной композиции из культуры клеток СНО.

Композицию на основе rhGAA по настоящему изобретению или ее фракции или производные успешно используют для лечения субъекта, имеющего состояние, нарушение или заболевание, ассоциированное с недостаточностью лизосомной GAA, путем введения композиции на основе rhGAA. Субъект, нуждающийся в лечении, представляет собой субъекта с болезнью накопления гликогена II типа (болезнью Помпе), а также субъекта с другими состояниями, нарушениями или заболеваниями, которые получат пользу от введения rhGAA.

Приведенные ниже примеры показывают, что rhGAA по настоящему изобретению (АТВ-200) захватываются клетками скелетных мышц, связываются с CIMPR и эффективно удаляют гликоген из клеток скелетных мышц при ее введении в значительно сниженной дозе по сравнению с традиционными продуктами на основе rhGAA. Снижение не более чем на 75% гликогена в миобластах скелетных мышц достигали у мышей с нокаутом по GAA, используя схему внутривенного введения АТВ-200 один раз в две недели. Эти снижения превысили те, которые обеспечиваются тем же самым количеством Lumizyme®, показывая, что rhGAA по настоящему изобретению с повышенным содержанием N-гликанов, несущих M6P и 6ис-М6Р, обеспечивают превосходное расщепление гликогенного субстрата. За счет улучшенного целенаправленного воздействия, фармакодинамики и фармакокинетики композицию на основе rhGAA по настоящему изобретению можно вводить в более низкой дозе по сравнению с традиционными продуктами, такими как rhGAA Lumizyme® или Myozyme®.

Ее можно использовать для расщепления, снижения или удаления гликогена из сердечной мышцы, гладкой мышцы или поперечно-полосатой мышцы. Примеры скелетных или поперечно-полосатых мышц, подвергаемых лечению, включают по меньшей мере одну мышцу, выбранную из группы, состоящей из мышцы, отводящей мизинец (стопы), мышцы, отводящей мизинец (кисти), отводящей мышцы стопы, короткой мышцы, отводящей большой палец стопы, длинной мышцы, отводящей большой палец кисти, короткой отводящей мышцы, мышцы, приводящей большой палец стопы, длинной приводящей мышцы, большой приводящей мышцы, мышцы, приводящей большой палец кисти, локтевой мышцы, суставной мышцы локтя, суставной мышцы колена, черпалонадгортанной мышцы, мышцы aryjordanicus, задней ушной мышцы, двуглавой мышцы плеча, двуглавой мышцы бедра, плечевой мышцы, плечелучевой мышцы, щечной мышцы, луковично-губчатой мышцы промежности, нижнего констриктора глотки, среднего констриктора глотки, верхнего констриктора глотки, клювовидно-плечевой мышцы, мышцы, сморщивающей бровь, мышцы, поднимающей яичко, перстнещитовидной мышцы, оболочки яичка из гладкой мышечной ткани, глубокой поперечной мышцы промежности, дельтовидной мышцы, мышцы, опускающей угол рта, мышцы, опускающей нижнюю губу, диафрагмы, двубрюшной мышцы, двубрюшной мышцы (передняя проекция), мышцы выпрямляющей позвоночник, подвздошно-реберной мышцы, длиннейшей мышцы выпрямляющей позвоночник, внутренней межреберной мышцы, короткого лучевого разгибателя запястья, длинного лучевого разгибателя запястья, локтевого разгибателя запястья, разги- 11 038986 бателя мизинца (кисти), разгибателя пальцев (кисти), короткого разгибателя пальцев (стопы), длинного разгибателя пальцев (стопы), длинного разгибателя большого пальца стопы, разгибателя указательного пальца, короткого разгибателя большого пальца, длинного разгибателя большого пальца кисти, лучевого сгибателя запястья, локтевого сгибателя запястья, короткого сгибателя мизинца (стопы), короткого сгибателя мизинца (кисти), короткого сгибателя пальцев, длинного сгибателя пальцев (стопы), глубокого сгибателя пальцев кисти, поверхностного сгибателя пальцев кисти, короткого сгибателя пальцев, длинного сгибателя пальцев, лобной мышцы, икроножной мышцы, нижней близнецовой мышцы, верхней близнецовой мышцы, подбородочно-язычной мышцы, подбородочно-подъязычной мышцы, большой ягодичной мышцы, средней ягодичной седалищной мышцы, малой ягодичной седалищной мышцы, тонкой мышцы, подъязычно-язычной мышцы, подвздошной мышцы, нижней косой мышцы, нижней прямой мышцы, подостной мышцы, внешней межреберной мышцы, глубокой межреберной мышцы, внутренней межреберной мышцы, внутренней косой мышцы живота, тыльной межкостной мышцы кисти, тыльной межкостной мышцы стопы, ладонной межкостной мышцы кисти, межкостной подошвенной мышцы стопы, межостистой мышцы, межпоперечной мышцы, внутренней мышцы языка, седалищно-пещеристой мышцы, латеральной перстнечерпаловидной мышцы, латеральной крыловидной мышцы, латеральной прямой мышцы, широчайшей мышцы спины, мышцы, поднимающей угол рта, мышцы, поднимающей задний проход, копчиковой мышцы, подвздошно-копчиковой мышцы, лобково-копчиковой мышцы, лобково-прямокишечной мышцы, лобково-влагалищной мышцы, мышцы, поднимающей верхнюю губу, мышцы, поднимающей верхнюю губу и крыло носа, мышцы, поднимающей верхнее веко, мышцы, поднимающей лопатку, мышцы, напрягающей небную занавеску, мышцы, поднимающей ребра, длинной мышцы головы, длинной мышцы шеи, червеобразной мышцы стопы (4), червеобразной мышцы кисти, жевательной мышцы, медиальной крыловидной мышцы, медиальной прямой мышцы, подбородочной мышцы, мышцы язычка, челюстно-подъязычной мышцы, носовой мышцы, косой черпаловидной мышцы, нижней косой мышцы головы, верхней косой мышцы головы, наружной запирательной мышцы, внутренней запирательной мышцы (А), внутренней запирательной мышцы (В), лопаточно-подъязычной мышцы, мышцы, противопоставляющей мизинец (кисти), мышцы, противопоставляющей большой палец кисти, круговой мышцы глаза, круговой мышцы рта, небно-язычной мышцы, небно-глоточной мышцы, короткой ладонной мышцы, длинной ладонной мышцы, гребенчатой мышцы, большой грудной мышцы, малой грудной мышцы, короткой малоберцовой мышцы, длинной малоберцовой мышцы, третьей малоберцовой мышцы, грушевидной мышцы (А), грушевидной мышцы (В), подошвенной мышцы, подкожной мышцы шеи, подколенной мышцы, задней перстнечерпаловидной мышцы, мышцы гордецов, квадратного пронатора, круглого пронатора, большой поясничной мышцы, малой поясничной мышцы, пирамидальной мышцы, квадратной мышцы бедра, квадратной мышцы поясницы, квадратной мышцы подошвы, прямой мышцы живота, передней прямой мышцы головы, латеральной прямой мышцы головы, большой задней прямой мышцы головы, малой задней прямой мышцы головы, прямой мышцы бедра, большой ромбовидной мышцы, малой ромбовидной мышцы, мышцы смеха, трубно-глоточной мышцы, портняжной мышцы, передней лестничной мышцы, средней лестничной мышцы, малой лестничной мышцы, задней лестничной мышцы, полуперепончатой мышцы, полусухожильной мышцы, передней зубчатой мышцы, нижней задней зубчатой мышцы, верхней задней зубчатой мышцы, камбаловидной мышцы, мышцы сфинктера ануса, сфинктера уретры, ременной мышцы головы, ременной мышцы шеи, стременной мышцы, грудино-ключично-сосцевидной мышцы, грудино-подъязычной мышцы, грудинощитовидной мышцы, шило-язычной мышцы, шило-подъязычной мышцы, шило-подъязычной мышцы (передняя проекция), шилоглоточной мышцы, подключичной мышцы, подреберной мышцы, подлопаточной мышцы, поверхностной поперечной мышцы промежности, верхней косой мышцы, верхней прямой мышцы, супинатора, надостной мышцы, височной мышцы, височно-теменной мышцы, напрягателя широкой фасции бедра, мышцы, напрягающей барабанную перепонку, мышцы, напрягающей небную занавеску, большой круглой мышцы, малой круглой мышцы, щиточерпаловидной и голосовой мышцы, щитонадгортанной мышцы, щитоподъязычной мышцы, передней большеберцовой мышцы, задней большеберцовой мышцы, поперечной черпаловидной мышцы, поперечно-остистой многораздельной мышцы, поперечно-остистой мышцы-вращателя, поперечно-остистой-полуостистой мышцы, поперечной мышцы живота, поперечной мышцы груди, трапециевидной мышцы, трехглавой мышцы, промежуточной широкой мышцы бедра, латеральной широкой мышцы бедра, медиальной широкой мышцы бедра, большой скуловой мышцы и малой скуловой мышцы.

Композицию на основе GAA по настоящему изобретению можно также вводить в мышечное волокно или использовать для лечения мышечного волокна 1 типа (медленно сокращающегося), или мышечного волокна 2 типа (быстро сокращающегося) или субъекта, у которого накапливается гликоген в таких мышечных волокнах. I тип, медленно сокращающаяся или красная мышца, густо пронизана капиллярами и богата митохондриями и миоглобином, придающими мышечной ткани ее характерный красный цвет. Она может переносить больше кислорода и поддерживать аэробную активность с использованием жиров или углеводов в качестве топлива. Медленно сокращающиеся волокна сокращаются в течение длительного периода времени, но с небольшой силой. Тип II, быстро сокращающаяся мышца, имеет три основных подтипа (IIa, IIx и IIb), которые различаются как по скорости сокращения, так и по

- 12 038986 вырабатываемой силе. Быстро сокращающиеся волокна сокращаются быстро и мощно, но очень быстро наступает усталость, с поддержанием лишь коротких всплесков активности в анаэробном режиме, прежде чем сокращение мышцы станет болезненным. Они вносят наибольший вклад в мышечную силу и имеют больший потенциал в увеличении массы. Тип IIb является анаэробной, гликолитической, белой мышцей, которая наименее богата митохондриями и миоглобином. У мелких животных (например, грызунов) это основной тип быстрой мышцы, что объясняет бледный цвет их мышечной ткани.

Композицию на основе rhGAA по настоящему изобретению, ее фракции или производные можно вводить системно, например посредством внутривенной (IV) инфузии, или вводить непосредственно в требуемый участок, а именно в сердечную или скелетную мышцу, такую как четырехглавая мышца, трехглавая мышца или диафрагма. Ее можно вводить в миоциты, в частности в мышечные ткани, мышцы или группы мышц. Например, такое лечение с помощью композиции на основе rhGAA можно проводить путем внутримышечного введения непосредственно в четырехглавую мышцу, трехглавую мышцу или диафрагму субъекта.

Как указано выше, композицию на основе rhGAA по настоящему изобретению, ее фракции или производные можно объединять в комплекс или смешивать с шапероном, таким как АТ-2220 (дувоглустатом HCl, 1-дезоксиноджиримицином), или АТ-2221(миглустатом, N-бутил-дезоксиноджиримицином), или их солями для улучшения фармакокинетики при введении rhGAA. RhGAA и шаперон можно вводить вместе или по отдельности.

При одновременном введении GAA в композиции она может быть предварительно нагружена шапероном. В качестве альтернативы GAA и шаперон можно вводить по отдельности, одновременно или в разное время.

Иллюстративные дозы АТ2221 находятся в диапазоне от 0,25 до 400 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 200 мг/кг и наиболее предпочтительно от 2 до 50 мг/кг. Конкретные дозы АТ2221 включают 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 и 50 мг/кг. Эти дозы можно объединять с rhGAA, с такой как АТВ-200 rhGAA, при молярном соотношении АТ2221 и rhGAA в диапазоне от 15:1 до 150:1. Конкретные соотношения включают 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 60: 1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 100:1, 125:1 и 150:1. RhGAA и АТ2221 можно вводить совместно в таких количествах или молярных соотношениях или параллельно, последовательно или по отдельности. Указанный выше диапазон включает все промежуточные поддиапазоны и уровни промежуточных продуктов, а именно все целые значения между конечными точками диапазона.

Иллюстративные дозы АТ2220 находятся в диапазоне от 0,1 до 120 мг/кг, предпочтительно от 0,25 до 60 мг/кг и наиболее предпочтительно от 0,6 до 15 мг/кг. Конкретные дозы АТ2220 включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 и 30 мг/кг. Эти дозы можно объединять с rhGAA, с такой как АТВ-200 rhGAA, при молярном соотношении АТ2220 и rhGAA в диапазоне от 15:1 до 150:1. Конкретные отношения включают 15:1, 20: 1, 25:1, 50:1, 60: 1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 100:1, 125:1 и 150:1. RhGAA и АТ2220 можно вводить совместно в таких количествах или при молярных соотношениях или параллельно, последовательно или по отдельности. Указанный выше диапазон включает все промежуточные поддиапазоны и уровни промежуточных продуктов, а именно все целые значения между конечными точками диапазона.

Композицию на основе rhGAA по настоящему изобретению, ее фракции или производные можно также использовать для метаболизирования, расщепления, удаления или снижения другим способом уровня гликогена в ткани, мышце, мышечном волокне, мышечных клетках, лизосомах, органеллах, клеточных компартментах или цитоплазме. Субъекту вводят композицию на основе rhGAA, необязательно наряду с шапероном или лекарственным средством, которое снижает иммунные ответы на rhGAA.

В другом варианте осуществления данного способа использования rhGAA по настоящему изобретению можно использовать для модуляции лизосомной пролиферации, аутофагии или экзоцитоза в клетке путем введения rhGAA, ее фракций или производных в клетки, ткани или субъектам, нуждающимся в такой модуляции, необязательно в комбинации с шапероном или необязательно в виде конъюгата с другим целенаправленно воздействующим фрагментом. Аутофагия представляет собой катаболический механизм, который позволяет клетке расщеплять гликоген или нежелательные или неработоспособные клеточные компоненты с помощью активности ее лизосом. Данный способ может также включать системное или местное введение композиции на основе GAA нуждающемуся в лечении субъекту.

RhGAA в соответствии с настоящим изобретением, которая обогащена моно-М6Р и 6ис-М6Р в сравнении с Lumizyme® и Myozyme и которая обладает благоприятными фармакокинетическими свойствами, обеспечиваемыми ее паттерном гликозилирования, также можно использовать для лечения других состояний, требующих катаболизма сложных углеводов, таких других нарушений, при которых гликоген или другие углеводы, расщепленные посредством rhGAA, накапливаются в лизосомах или других частях клетки, а именно в доступной для rhGAA цитоплазме, таких как болезнь накопления гликогена III типа. Ее также можно использовать в целях, отличных от терапевтических, а именно для получения пищевых продуктов, напитков, химических и фармацевтических продуктов, которые требуют катаболизма сложных углеводов, таких как крахмал и гликоген, до их мономеров.

- 13 038986

Примеры

Следующие неограничивающие примеры иллюстрируют аспекты настоящего изобретения.

Раздел I. АТВ-200 rhGAA и ее свойства.

Ограничения существующих в настоящее время продуктов на основе rhGAA - Myozyme® и Lumizyme®.

Для оценки действия rhGAA в Myozyme® и Lumizyme®, единственных одобренных в настоящее время средств для лечения болезни Помпе, эти препараты на основе rhGAA вводили в колонку с CIMPR (которая связывает rhGAA с M6P-груnпами), а затем элюировали при помощи свободного градиента M6. Фракции собирали в 96-луночный планшет и активность GAA анализировали на субстрате 4MU-α-глюкоза. Относительные количества связанного и несвязанного rhGAA определяли на основе активности GAA и записывали как функцию от общего количества фермента.

На фиг. 5 представлены проблемы, ассоциированные с традиционными ERT (Myozyme® и Lumizyme®): 73% rhGAA в Myozyme® (фиг. 4В) и 78% rhGAA в Lumizyme® (фиг. 4А) не связываются с CIMPR, см. крайние левые пики на каждой фигуре. Только 27% rhGAA в Myozyme® и 22% rhGAA в Lumizyme® содержат M6P, которые могут продуктивно нацеливать ее на CIMPR в мышечных клетках, см. фиг. 2, на которой представлено продуктивное нацеливание лекарственного средства и непродуктивное выведение лекарственного средства.

Эффективная доза Myozyme® и Lumizyme® соответствует количеству rhGAA, содержащей M6P, которое целенаправленно воздействует на CIMPR в мышечных клетках. Однако большая часть rhGAA в этих двух традиционных продуктах не воздействует целенаправленно на CIMPR-рецептор в целевых мышечных клетках. Введение традиционной rhGAA, где большое количество rhGAA не воздействует целенаправленно на мышечные клетки, увеличивает риск аллергической реакции или вызова иммунного ответа на не целенаправленно воздействующую rhGAA.

Получение клеток CHO, продуцирующих АТВ-200 rhGAA с высоким содержанием моно- или бисM6P-несущих N-гликанов.

Клетки CHO трансфицировали с помощью ДНК, которая экспрессирует rh-GAA, с последующим отбором трансформантов, продуцирующих rhGAA. ДНК-конструкция для трансформирования клеток CHO при помощи ДНК, кодирующей rh-GAA, показана на фиг. 5. Клетки CHO трансфицировали с помощью ДНК, которая экспрессирует rh-GAA, с последующим отбором трансформантов, продуцирующих rhGAA.

После трансфекции клетки DG44 CHO (DHFR-клетки), содержащие стабильно интегрированный ген GAA, отбирали при помощи среды без гипоксантина/тимидина (-HT)). Амплификацию экспрессии GAA в этих клетках стимулировали путем обработки метотрексатом (MTX, 500 нМ). Пулы клеток, которые экспрессировали высокие количества GAA, идентифицировали при помощи анализов активности фермента GAA и использовали для создания отдельных клонов, продуцирующих rhGAA. Отдельные клоны получали в культуральных чашках с полутвердой средой, снимали при помощи системы ClonePix и переносили в планшеты с 24 глубокими лунками. Отдельные клоны анализировали в отношении активности фермента GAA для идентификации клонов, экспрессирующих высокие уровни GAA. Используемые кондиционированные среды для определения активности GAA представляли собой субстрат 4-MU-α-глюкозидазу. Клоны, продуцирующие повышенные уровни GAA, что измеряли при помощи анализов фермента GAA, дополнительно оценивали в отношении жизнеспособности, способности к росту, продуктивности GAA, структуры N-гликана и стабильной экспрессии белка. Линии клеток CHO, в том числе линию клеток CHO GA-ATB-200, экспрессирующие rhGAA с повышенным содержанием N-гликанов с моно-М6Р или 6ис-М6Р, выделяли при помощи данной процедуры.

Очистка rhGAA ATB-200 rhGAA.

Множество партий rhGAA в соответствии с настоящим изобретением получали во встряхиваемых колбах и в перфузионных биореакторах с использованием линии клеток CHO GA-ATB-200 и измеряли связывание CIMPR. Подобное показанному на фиг. 6В и 7 связывание CIMPR-рецептора (~70%) наблюдали для очищенной ATB-200 rhGAA из разных производственных партий, означая, что ATB-200 rhGAA может стабильно продуцироваться. Как показано на фиг. 6А и 6В, rhGAA из Myozyme® и Lumizyme® проявляли значительно меньшую степень связывания CIMPR, чем ATB-200 rhGAA.

Аналитическое сравнение АТВ-200 с лумизимом.

Жидкостную хроматографию со слабым анионным обменом (WAX) использовали для фракционирования ATB-200 rhGAA в соответствии с концевым фосфатом. Профили элюции получали путем элюирования средства для ERT возрастающими количествами солей. Профили контролировали при помощи УФ (А280 нм). ATB-200 rhGAA получали из клеток CHO и очищали. Lumizyme® получали из коммерческих источников. Lumizyme® показывает высокий пик слева в его профиле элюирования. ATB-200 rhGAA показывает четыре выступающих пика элюирования справа от Lumizyme® (фиг. 8). Это подтверждает, что ATB-200 rhGAA фосфорилировался в большей степени, чем Lumizyme®, поскольку это оценивание проводили по окончательному расчету, а не по аффинности к CIMPR.

Характеристика олигосахаридов ATB-200 rhGAA.

- 14 038986

Очищенные гликаны из ATB-200 rhGAA и Lumizyme® оценивали при помощи MALDI-TOF для определения структур отдельных гликанов, имеющихся в каждом средстве для ERT (фиг. 9). Было выявлено, что образцы АТВ-200 содержат незначительно меньшие количества нефосфорилированных N-гликанов высокоманнозного типа, чем Lumizyme®. Повышенное содержание M6P-гликанов в АТВ-200 по сравнению с Lumizyme нацеливает АТВ-200 rhGAA на мышечные клетки с большей эффективностью. Высокий процент монофосфорилированных и бис-фосфорилированных структур, определенных при помощи MALDI, согласуется с профилями CIMPR, которые показали значительно большую степень связывания АТВ-200 с CIMPR-рецептором. Анализ N-гликанов посредством массспектрометрии MALDI-TOF подтвердил, что в среднем каждая молекула АТВ200 содержит по меньшей мере одну природную структуру N-гликана с 6ис-М6Р. Такое повышенное содержание N-гликанов с бисM6P в АТВ-200 rhGAA непосредственно коррелирует со связыванием с CIMPR с высокой аффинностью в анализах связывания с использованием планшета с рецептором M6P (KD приблизительно 2-4 нМ), фиг. 10А.

Характеристика аффинности АТВ-200 к CIMPR.

Кроме того, для обеспечения более высокого процента rhGAA, который может связываться с CIMPR, важно понимать свойство такого взаимодействия. Связывание Lumizyme® и АТВ200 rhGAA с рецептором определяли при помощи анализа связывания с использованием планшета с CIMPR. Вкратце, покрытые CIMPR планшеты использовали для захвата GAA. Различные концентрации rhGAA использовали в отношении иммобилизованного рецептора и не связанную rhGAA вымывали. Количество оставшейся rhGAA определяли по активности GAA. Как показано на фиг. 10А, АТВ-200 rhGAA связывалась с CIMPR значительно лучше, чем Lumizyme.

На фиг. 10В показано относительное содержание бис-M6P-гликанов в лумизиме, традиционной rhGAA и АТВ-200 в соответствии с настоящим изобретением. В случае Lumizyme® в среднем только 10% молекул имеют бис-фосфорилированный гликан. В противоположность этому, в случае АТВ-200 в среднем каждая молекула rhGAA имеет по меньшей мере один бис-фосфорилированный гликан.

ATB-200 rhGAA усваивалась фибробластом более эффективно, чем лумизим.

Относительное клеточное поглощение rhGAA из АТВ-200 и Lumizyme® сравнивали с использованием линии нормальных клеток-фибробластов и линии клеток-фибробластов при болезни Помпе. Сравнения включали 5-100 нМ АТВ-200 rhGAA в соответствии с настоящим изобретением и 10-500 нМ традиционной rhGAA из Lumizyme®. После 16-часовой инкубации находящуюся за пределами rhGAA инактивировали при помощи TRIS-основания и клетки промывали 3 раза при помощи PBS перед сбором. Усвоенную GAA измеряли при помощи гидролиза 4MU-α-глюкозида и строили график относительно общего количества клеточного белка, результаты показаны на фиг. 11.

Было показано, что АТВ-200 rhGAA эффективно интернализировалась в клетки (фиг. 11А и 11В), на которых соответственно показано, что АТВ-200 rhGAA усваивалась как нормальными клеткамифибробластами, так и клетками-фибробластами при болезни Помпе и что она усваивается в большей степени, чем традиционная rhGAA из Lumizyme®. АТВ-200 rhGAA насыщает клеточные рецепторы приблизительно при 20 нМ, тогда как Lumizyme® необходимо приблизительно 250 нМ. Константа эффективности поглощения (К_{поглощен}ия), экстраполированная из этих результатов, составляет 2-3 нМ для АТВ-200 и 56 нМ для Lumizyme®, что показано на фиг. 11С. Эти результаты позволяют предположить, что АТВ-200 rhGAA представляет собой хорошее нацеливаемое средство для лечения болезни Помпе.

Раздел II. Доклинические исследования.

АТВ-200 rhGAA с высокой степенью гликозилирования была значительно лучше, чем традиционное средство для ERT в отношении выведения гликогена в скелетных мышцах KO по GAA мышей.

Как объяснялось выше, ферментозаместительная терапия (ERT), при которой используют рекомбинантную GAA человека (rhGAA), является единственным одобренным видом лечения, доступным для болезни Помпе. Эта ERT предусматривает специальный углевод, маннозо-6-фосфат (M6P), для поглощения клетками и последующей их доставки к лизосомам через катион-независимые рецепторы M6P (CIMPR) на клеточной поверхности. Однако существующая в настоящее время ERT с rhGAA предусматривает низкие количества M6P, что ограничивает целенаправленное воздействие лекарственного средства и эффективность в пораженных заболеванием тканях. Авторы настоящего изобретения разработали линию продуцирующих клеток и способ получения, при помощи которого получают rhGAA (обозначенную как АТВ-200 rhGAA) с высокой степенью гликозилирования и более высоким содержанием M6P, чем у традиционной rhGAA, в частности структуру N-гликана с 6ис-М6Р с высоким сродством, для улучшенного нацеливания лекарственного средства. АТВ-200 rhGAA связывает CI-MPR с высокой аффинностью (KD~2-4 нМ) и эффективно усваивается фибробластами при болезни Помпе и миобластами скелетной мускулатуры (К_{поглощения}~7-14 нМ).

АТВ-200 rhGAA выводит гликоген значительно лучше, чем Lumizyme® из скелетной мускулатуры. Оценивали влияние введения Lumizyme® и АТВ-200 rhGAA в отношении выведения гликогена у KO по GAA мышей. Животным проводили два внутривенных болюсных введения (один раз в две недели); ткани собирали через две недели после введения последней дозы и анализировали в отношении активности

- 15 038986

GAA и содержания гликогена (фиг. 12). АТВ-200 rhGAA и rhGAA из Lumizyme® одинаково эффективны в отношении выведения гликогена из сердца (фиг. 12А). Как показано на фиг. 12В и 12С, АТВ-200 rhGAA в дозе, составляющей 5 мг/кг, была эквивалентна rhGAA из Lumizyme® в дозе, составляющей 20 мг/кг, в отношении снижения уровня гликоген в скелетных мышцах; АТВ-200 в дозе, составляющей 10 и 20 мг/кг, была значительно эффективнее, чем Lumizyme® в отношении выведения гликогена из скелетных мышц.

Аргументация в отношении совместного введения АТВ-200 rhGAA с АТ2221 (CHART Technology).

Шаперон связывается и стабилизирует rhGAA из средства для ERT, повышает поглощение активного фермента тканями, улучшает переносимость и потенциально уменьшает иммуногенность. Как показано выше, устойчивость белка-средства для ERT при неблагоприятных условиях была значительно улучшена при использовании CHART™. CHART: дополненная шапероном заместительная терапия, см. http://www.amicusrx.com/chaperone.aspx (последний доступ 22 сентября 2015 г.), что включено при помощи ссылки. Как показано на фиг. 13А и 13В, устойчивость АТВ-200 была значительно улучшена при помощи АТ2221 (миглустата, N-бутил-дезоксиноджиримицина). Фолдинг белка rhGAA контролировали при 37°С путем тепловой денатурации в нейтральном (pH 7,4 - окружающая среда плазмы крови) или кислом (pH 5,2 - лизосомная окружающая среда) буфере. АТ2220 стабилизировал белок rhGAA в буфере с нейтральным показателем pH после 24 ч.

Совместное введение Myozyme® с АТ2221 (миглустатом) по сравнению с совместным введением АТВ-200 rhGAA с миглустатом.

KO по GAA мышей возрастом 12 недель обрабатывали Lumizyme® или АТВ200, 20 мг/кг внутривенно, один раз в две недели, 4 инъекции; миглустат совместно вводили в дозе, составляющей 10 мг/кг, перорально, за 30 мин до введения rhGAA, как указано. Ткани собирали через 14 дней после введения последней дозы фермента для измерения уровня гликогена. На фиг. 14 показано относительное снижение уровня гликогена в скелетной мускулатуре на примере четырехглавой мышцы и трехглавой мышцы.

Снижение уровня гликогена в ткани при помощи АТВ-200 rhGAA, совместно вводимого с фармакологическим шапероном АТ2221 (миглустатом).

Было обнаружено, что комбинация фармакологического шаперона и АТВ-200 rhGAA повышает выведение гликогена in vivo. KO по GAA мышам проводили два внутривенных болюсных введения rhGAA в дозе, составляющей 20 мг/кг, один раз в две недели. Фармакологический шаперон АТ2221 вводили перорально за 30 мин до rhGAA в дозе, составляющей 0, 1, 2 и 10 мг/кг. Ткани собирали через две недели после введения последней дозы средства для ERT и анализировали в отношении активности GAA, содержания гликогена, специфичного для клеток гликогена и лизосомной пролиферации.

На фиг. 15 показано, что у животных, получающих АТВ200 + шаперон АТ2221, проявлялось повышенное выведение гликогена из четырехглавой мышцы. АТВ-200 rhGAA (20 мг/кг) снижала уровень гликогена в большей степени, нежели такая же доза Lumizyme®, и когда АТВ-200 rhGAA объединяли с 10 мг/кг АТ2220, тогда достигали примерно нормальных уровней гликогена в мышце.

На фиг. 16А и 16В показано, что в отличие от традиционной rhGAA, которая показала ограниченное снижение уровня гликогена (показанное обширными сигналами PAS в виде пятен), АТВ-200 rhGAA исключительно показала значительное снижение сигналов PAS. Совместное введение с 10 мг/кг миглустата приводило к значительному дополнительному снижению в субстрате. При помощи ТЕМ выявили, что большая часть гликогена в лизосомах находилась в виде мембрано-связанного электронно-плотного материала, что соответствует сигналам PAS в виде пятен. Совместное введение АТВ-200 rhGAA с миглустатом снижало количество, размер и плотность содержащих субстрат лизосом, что указывает на целенаправленную доставку АТВ-200 rhGAA к мышечным клеткам с последующей доставкой в лизосомы.

Из исследования (два внутривенных болюсных введения один раз в две недели), показанного выше, ткани подвергали обработке при помощи маркера LAMP 1 в отношении лизосомной пролиферации, усиление экспрессии является другим признаком болезни Помпе. LAMP: ассоциированный с лизосомой мембранный белок. Из исследования (два внутривенных болюсных введения EOW), показанного выше, ткань камбаловидной мышцы обрабатывали для окрашивания LAMP 1 в смежных участках и специфическим к волокнам I типа антителом (NOQ7.5.4D) в смежных участках, фиг. 16С и 16D, АТВ-200 rhGAA приводила к более существенному снижению LAMP1 по сравнению с традиционной rhGAA со снижениями, приводящими к уровням, наблюдаемым у животных WT, фиг. 16С).

Кроме того, в отличие от rhGAA, где эффект в основном ограничен волокнами I типа (медленно сокращающимися, помеченными звездочкой), АТВ-200 rhGAA также приводила к существенному снижению сигналов LAMP1 во фракции волокон II типа (быстро сокращающихся) (верхушки красных стрелок) (фиг. 16D). Важно, что совместное введение с миглустатом дополнительно повышает степень опосредованного АТВ-200 снижения пролиферации LAMP1 в большинстве волокон II типа (фиг. 16С и 16D). Как результат, по-видимому, отсутствует значимая специфическая в отношении типа волокон разница в уровне сигналов LAMP1. Схожие результаты были получены с четырехглавой мышцей и диафрагмой (данные не показаны).

В отдельном и подобным образом спланированном исследовании эффект АТВ-200 ± АТ2221 изуча

- 16 038986 ли в течение длительного срока с четырьмя внутривенными болюсными введениями один раз в две недели. В сердце основное хранилище в кардиомиоцитах легко выводили путем повторного введения или rhGAA, или АТВ-200 до уровней, наблюдаемых у животных дикого типа (WT) (фиг. 17А). Однако субстрат в клетках гладких мышц сердца, по всей видимости, выводился предпочтительно при помощи АТВ-200 rhGAA, что указывает на потенциально более широкое биораспределение АТВ-200 по сравнению с rhGAA (звездочками отмечен просвет кровеносных сосудов сердца). Важно, что совместное введение с миглустатом дополнительно повышает степень опосредованного АТВ-200 снижения пролиферации LAMP1.

Из этих результатов видно, что АТВ-200 rhGAA, которая характеризуется повышенными уровнями M6P и 6ис-М6Р в своих N-гликанах, эффективно целенаправленно воздействует на CIMPR в скелетных мышцах. АТВ-200 rhGAA также характеризуется легко преобразуемыми N-гликанами сложного типа, которые сводят к минимуму непродуктивное выведение in vivo, характеризуется фармакокинетическими свойствами, подходящими для ее использования in vivo, и проявляет хорошее целенаправленное воздействие на ключевые мышечные ткани in vivo. Также было показано, что АТВ-200 rhGAA лучше, чем общепринятый стандарт лечения, лумизим, в отношении снижения уровня гликогена в мышечной ткани, и что комбинация АТВ-200 rhGAA и шаперона АТ2221 дополнительно повышает степень удаления гликогена из целевых тканей и снижает степень проявления мышечной патологии.

Claims (19)

1. Композиция, содержащая рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека (rhGAA), продуцируемую из клеток яичника китайского хомячка (СНО), где 40-60% N-гликанов в rhGAA представляют собой N-гликаны сложного типа и где rhGAA содержит 3,0-5,0 моль остатка маннозо-6-фосфата (M6P) на 1 моль rhGAA.

2. Композиция по п.1, где rhGAA содержит от 3,0 до 4,0 моль M6P на 1 моль rhGAA.

3. Композиция по п.1, где rhGAA содержит от 4,0 до 5,0 моль M6P на 1 моль rhGAA.

4. Композиция по п.1, где rhGAA дополнительно содержит по меньшей мере 4 моль остатка сиаловой кислоты на 1 моль rhGAA.

5. Композиция по п.1, где не более 6,5% N-гликанов в rhGAA представляют собой N-гликаны гибридного типа, не более 15% N-гликанов высокоманнозного типа в rhGAA являются нефосфорилированными, по меньшей мере 10% N-гликанов высокоманнозного типа в rhGAA фосфорилированы моно-М6Р и/или по меньшей мере 2% N-гликанов высокоманнозного типа в rhGAA фосфорилированы 6ис-М6Р.

6. Композиция по п.1, где rhGAA дополнительно содержит от 2,0 до 8,0 моль остатка сиаловой кислоты на 1 моль rhGAA.

7. Композиция по п.1, где композиция дополнительно содержит фармакологический шаперон.

8. Композиция по п.1, где rhGAA содержит по меньшей мере один бис-фосфорилированный N-гликан на rhGAA.

9. Композиция по п.1, где 45-55% N-гликанов в rhGAA являются N-гликанами сложного типа.

10. Композиция по п.1, где 50% N-гликанов в rhGAA являются N-гликанами сложного типа.

11. Композиция по п.1, где rhGAA содержит 4 моль M6P на 1 моль rhGAA, 4,5 моль сиаловой кислоты на 1 моль rhGAA и по меньшей мере один бис-фосфорилированный N-гликан на rhGAA.

12. Композиция по п.11, где композиция дополнительно содержит фармакологический шаперон N-бутил-дезоксиноджиримицин или его соль.

13. Применение композиции по п.1 в лечении болезни Помпе у субъекта.

14. Применение по п.13, где указанная композиция вводится в сердечную мышцу субъекта.

15. Применение по п.13, где указанная композиция вводится в четырехглавую, трехглавую или другую скелетную мышцу субъекта.

16. Применение по п.13, где указанная композиция вводится в диафрагму субъекта.

17. Применение по п.13, где указанная композиция объединена с фармакологическим шапероном и где указанная композиция и указанный фармакологический шаперон вводятся либо совместно в виде одной фармацевтической композиции, либо раздельно.

18. Применение по п.13, где указанная композиция объединена с 1-дезоксиноджиримицином или его солью и где указанная композиция и указанный 1-дезоксиноджиримицин или его соль вводятся либо совместно в виде одной фармацевтической композиции, либо раздельно.

19. Применение по п.13, где указанная композиция объединена с N-бутил-дезоксиноджиримицином или его солью, и где указанная композиция и указанный N-бутил-дезоксиноджиримицин или его соль вводятся либо совместно в виде одной фармацевтической композиции, либо раздельно.

- 17 038986

Структура и рецепторная аффинность к высокоманнозным олисахаридам и фосфорилированным олигосахаридам