KR20220058587A

KR20220058587A - 생물학적 제제의 포획 및 정제 방법

Info

Publication number: KR20220058587A
Application number: KR1020227010898A
Authority: KR
Inventors: 쿠마 다나세카란; 크리스틴 카로셀리; 폴 란제빈
Original assignee: 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-05-09
Also published as: BR112022004000A2; WO2021046443A1; CN114341333A; CA3149955A1; EP4025242A1; MX2022002774A; AU2020343680A1; US20230220320A1; JP2022546587A

Abstract

생물학적 제제, 예컨대 재조합 단백질의 연속 생성, 포획 및 정제 방법이 기재된다. 또한 이러한 생물학적 제제를 포함하는 약제학적 조성물뿐만 아니라, 치료 방법 및 이러한 생물학적 제제의 용도가 기재된다.

Description

생물학적 제제의 포획 및 정제 방법

본 발명의 원리 및 구현예는 일반적으로 생물학적 제제, 특히, 만노스-6-인산염의 고 함량을 갖는 리소좀 효소의 제조에 관한 것이다.

리소좀 저장 장애는 리소좀으로 일컬어지는 세포내 구획 내의 분자 기질, 예컨대 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid), 글리코겐 또는 뮤코다당류(mucopolysaccharide)의 축적을 특징으로 하는 상염색체 열성 유전병 그룹이다. 이들 질병을 갖는 개체는, 이후, 리소좀 내에 누적되는 이들 기질 중 하나 이상의 가수분해의 촉매에 결함이 있는 효소를 코딩하는 돌연변이 유전자를 보유한다. 예를 들어, 산 말타제 결핍증 또는 글리코겐 저장 질병 II형으로도 일컬어지는 폼페병(Pompe disease)은 수종의 리소좀 저장 장애 중 하나이다. 리소좀 장애의 다른 예는 고셔병, GM1-갱글리오시드축적증, 푸코시드축적증, 뮤코다당증, 후를러-샤이에병(Hurler-Scheie disease), 니만-픽(Neimann-Pick) A 및 B 질병 및 파브리병(Fabry disease)을 포함한다. 폼페병은 또한 신경근 질병 또는 대사 근육병으로서 분류된다.

폼페병은 40,000명 중 약 1명꼴로 발생하는 것으로 추정되며, 또한 통상적으로 산 α-글루코시다제로서 일컬어지는 효소 리소좀 α-글루코시다제(EC:3.2.1.20)를 코딩하는 GAA 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 산 α-글루코시다제는 리소좀 내에서 글루코스로의 가수분해를 촉매함으로써, 동물에서 글루코스의 주요 저장형인 분지쇄 다당류인 글리코겐의 대사에 관여한다. 폼페병을 가진 개체는, 불활성이거나, 활성이 감소된 돌연변이체인 결함이 있는 산 α-글루코시다제를 생성하기 때문에, 글리코겐 분해가 서서히 이루어지거나, 전혀 이루어지지 않고, 글리코겐이 다양한 조직, 특히 횡문근의 리소좀 내에 축적되어, 진행성 근육 약화 및 호흡 부전을 포함하는 다양한 종류의 임상 징후를 야기한다. 심근 및 골격근과 같은 조직이 특히 영향을 받는다.

리소좀 저장 장애에 대한 최근 치료 옵션은 재조합 효소를 이용한 효소 대체 요법(ERT)을 포함한다. 예를 들어, 폼페병에 대한 하나의 치료 옵션은 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)를 이용한 ERT를 포함한다. 기존 rhGAA 제품은 젠자임(Genzyme)사로부터의 상표명 알글루코시다제 알파, 마이오자임(Myozyme)® 또는 루미자임(Lumizyme)®으로 공지되어 있다. ERT는 환자의 평생 동안 요구되는 만성 치료이며, 정맥내 주입에 의한 대체 효소의 투여를 포함한다. 그 후, 대체 효소는 순환계로 수송되고, 세포 내의 리소좀으로 유입되어, 축적된 기질(예를 들어, 글리코겐)을 분해하는 작용을 하여, 결함이 있는 내인성 돌연변이 효소의 활성 결함을 보충함에 따라, 질병 증상을 경감시킨다. 유년기 발병 폼페병을 갖는 대상체에서, 알글루코시다제 알파에 의한 치료는, 역대 대조군과 비교하여, 생존을 유의하게 개선하는 것으로 나타났으며, 후기 발병 폼페병에서, 알글루코시다제 알파는, 완만한 것일지라도, 위약과 비교하여, 6-분 보행 시험(6MWT) 및 강제 폐활량(FVC)에서, 통계적으로 유의한 효과를 가진 것으로 나타났다.

그러나, 대부분의 대상체는, 알글루코시다제 알파에 의한 치료가 진행되는 동안, 안정하게 유지되거나 계속 악화된다. 알글루코시다제 알파에 의한 ERT의 분명한 차선적 효과의 원인은 불분명하나, 부분적으로는, 근본적인 근육 병리학의 진행성 성질 또는 현 ERT의 저조한 조직 표적화로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 주입된 효소는 혈장의 pH(약 pH 7.4)를 포함하여, 중성 pH에서 안정하지 못하며, 순환계 내에서 비가역적으로 불활성화될 수 있다. 추가로, 주입된 알글루코시다제 알파는, 가능하게는 만노스-6-인산염(M6P) 잔기에 의한 부적절한 글리코실화로 인해, 주요 질병-관련 근육에서 불충분한 흡수를 나타낸다. 이러한 잔기는 세포 표면의 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와 결합하여, 효소가 세포 및 그 내부의 리소좀으로 유입될 수 있도록 한다. 따라서, 적당량의 활성 효소가 리소좀에 도달할 수 있도록 하기 위해, 고 투여량의 효소가 효과적인 치료를 위해 필요할 수 있으며, 이는 이러한 요법에 비용과 시간이 소모되도록 한다.

rhGAA에는 7개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위가 존재한다. 존재하는 N-연결된 올리고당류(N-글리칸)의 유형에서, 각각의 글리코실화 부위가 이종이므로, rhGAA는 M6P 수용체 및 다른 탄수화물 수용체에 대해 다양한 결합 친화도를 갖는 N-글리칸과 단백질의 복합체 혼합물로 이루어진다. 하나의 M6P 기(단일-M6P)를 갖는 고만노스 N-글리칸을 함유하는 rhGAA는 CIMPR과 낮은(약 7,000 nM) 친화도로 결합하나, 동일한 N-글리칸에 2개의 M6P 기(이중-M6P)를 함유하는 rhGAA는 높은(약 2 nM) 친화도로 결합한다. 비인산화된 단일-M6P, 및 이중-M6P 글리칸의 대표적인 구조가 도 1a에 도시되어 있다. 만노스-6-P 기는 도 1b에 도시되어 있다. 리소좀 내의 경우, rhGAA는 축적된 글리코겐을 효소적으로 분해할 수 있다. 그러나, 기존 rhGAA는 M6P- 및 이중-M6P 보유 글리칸의 총 수준이 낮으며, 따라서, 근육 세포를 불충분하게 표적화함으로써, 리소좀으로의 rhGAA의 저조한 전달을 야기한다. rhGAA의 생산적 약제 표적화가 도 2의 A에 도시되어 있다. 이들 기존 제품 내의 대부분의 rhGAA 분자는 인산화된 N-글리칸을 갖지 않음으로써, CIMPR에 대한 친화도가 부재한다. 비인산화된 고만노스 글리칸은 또한 만노스 수용체에 의해 배출될 수 있으며, 이는 ERT의 비생산적 배출을 야기한다(도 2의 B).

갈락토스 및 시알산을 함유하는 복합체 탄수화물인 다른 유형의 N-글리칸이 또한 rhGAA에 존재한다. 복합체 N-글리칸이 인산화되어 있지 않으므로, 이는 CIMPR에 대한 친화도를 갖지 않는다. 그러나, 갈락토스 잔기가 노출되어 있는 복합 유형 N-글리칸은 간의 간세포에서 아시알로당단백질 수용체에 대해, 중간 정도의 친화도 내지 높은 친화도를 가지며, 이는 rhGAA의 빠른 비생산적 배출을 야기한다(도 2의 B).

기존의 rhGAA, 예컨대 마이오자임®, 루미자임® 또는 알글루코시다제 알파를 제조하기 위해 사용되는 현재의 제조 공정은, 세포성 탄수화물 가공이 자연 발생적으로 복잡하고 조작하기가 매우 까다롭기 때문에, 유의하게 증가된 함량의 M6P 또는 이중-M6P를 갖지 못한다. 따라서, rhGAA의 신규 제조, 포획 및 정제 공정과 같은, 폼페병 치료를 위한 효소 대체 요법에 대한 추가의 개선이 여전히 필요하다.

유사하게, 다른 리소좀 효소와 같이 리소좀으로 표적화되는 다른 재조합 단백질이 또한 CIMPR과 결합한다. 그러나, 리소좀으로 표적화된 기존의 다른 재조합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 현재의 제조 공정은 M6P 또는 이중-M6P의 고 함량을 재조합 단백질에 제공하지 않는다. 따라서, 이들 다른 재조합 단백질의 제조, 포획 및 정제 공정에서의 추가의 개선이 또한 여전히 필요하다.

본 발명의 일 양태는 생물학적 제제를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 양태의 다양한 구현예에서, 방법은 생물반응기에서 숙주 세포를 배양하는 단계 및 적어도 2개의 포획 칼럼 상으로 생물학적 제제-함유 유체(예를 들어, 여과물)를 로딩하는 단계를 포함하며, 여기서 적어도 2개의 포획 칼럼은 총 포획 칼럼 용적을 갖고, 생물반응기 용적 대 총 포획 칼럼 용적의 비는 약 500:1 내지 약 10:1의 범위, 예컨대 약 100:1 내지 약 20:1의 비이다. 상기 양태의 다양한 구현예에서, 총 포획 칼럼 체류 시간(즉, 포획 칼럼에 로딩하는 용적 유속 및 총 포획 칼럼 용적의 비율)은 약 0.5분 내지 200분, 예컨대 약 10분 내지 70분의 범위이다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 생물반응기에서 생물학적 제제를 생성하고 선택적으로 분비하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액을 회수하는 단계; 배지 및/또는 세포 현탁액을 가공하여 생물학적 제제를 함유하는 여과물을 분리하는 단계; 여과물을 적어도 2개의 포획 칼럼 상에 로딩하여 생물학적 제제를 포획하는 단계; 적어도 2개의 포획 칼럼으로부터 제1 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계; 하나 이상의 정제 칼럼 상으로 제1 생물학적 제제 산물을 로딩하는 단계; 및 하나 이상의 정제 칼럼으로부터 제2 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계를 포함하며; 여기서 생물반응기는 생물반응기 용적을 갖고, 적어도 2개의 포획 칼럼은 총 포획 칼럼 용적을 갖고, 생물반응기 용적 대 총 포획 칼럼 용적의 비는 약 500:1 내지 약 10:1의 범위, 예컨대 약 100:1 내지 약 20:1의 비이다. 대안적으로, 하나 이상의 구현예에서, 생물학적 제제는 분비되지 않으며 세포 용해 후 회수된다.

하나 이상의 구현예에서, 생물학적 제제는 재조합 단백질, 바이러스 입자 또는 항체 중 하나 이상을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 재조합 단백질은 숙주 세포에 의해 생성되는 분비된 단백질, 막 단백질 또는 세포내 단백질이다. 하나 이상의 구현예에서, 재조합 단백질은 세포 및/또는 세포 소기관으로부터 여과물 내로 분리된다. 하나 이상의 구현예에서, 여과물은 여과 또는 원심분리에 의해 분리된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 순차적으로 로딩되어 적어도 2개의 포획 칼럼 상으로 여과물의 연속 로딩이 가능하게 한다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 시간 당 약 0.5 칼럼 용적(CV) 내지 약 100 CV, 예컨대 시간 당 약 1 CV 내지 약 40 CV 범위의 여과물 로딩 속도로 적어도 2개의 포획 칼럼 상에 로딩된다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 적어도 2개의 포획 칼럼 상에 로딩되어 각각의 포획 칼럼에 대해 48시간 미만, 예컨대 24시간 미만의 포획 칼럼 로딩 시간이 가능하게 한다.

하나 이상의 구현예에서, 생물학적 제제는 재조합 인간 리소좀 단백질을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 친화도 크로마토그래피 칼럼을 포함한다. 친화도 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A 칼럼 및 단백질 Z 칼럼 중 하나 이상일 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 친화도 크로마토그래피 칼럼을 포함한다. 친화도 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A 칼럼 및 단백질 Z 칼럼 중 하나 이상일 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 제2 생물학적 제제 산물은 생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액의 회수 48시간 이내에 하나 이상의 정제 칼럼으로부터 용리된다.

하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 정제 칼럼은 총 정제 칼럼 용적을 가지며 생물반응기 용적 대 총 정제 칼럼 용적의 비는 약 5,000:1 내지 약 50:1의 범위이다.

하나 이상의 구현예에서, 총 포획 칼럼 용적 대 총 정제 칼럼 용적의 비는 약 20:1 내지 약 1:1의 범위이다.

본 개시내용의 또 다른 양태는 재조합 인간 리소좀 단백질을 제조하는 방법을 기재한다. 일부 구현예에서, 방법은 생물반응기에서 재조합 인간 리소좀 단백질을 생성하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액을 회수하는 단계, 배지 및/또는 세포 현탁액을 가공하여 리소좀 단백질을 함유하는 여과물을 분리하는 단계, 여과물을 적어도 2개의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼 상으로 로딩하여 리소좀 단백질을 포획하는 단계, 적어도 2개의 AEX 칼럼으로부터 제1 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계, 하나 이상의 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼 상으로 제1 생물학적 제제 산물을 로딩하는 단계, 및 하나 이상의 IMAC 칼럼으로부터 제2 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계를 포함하며, 여기서 생물반응기는 생물반응기 용적을 갖고, 적어도 2개의 AEX 칼럼은 총 AEX 칼럼 용적을 갖고, 생물반응기 용적 대 총 AEX 칼럼 용적의 비는 약 500:1 내지 약 10:1의 범위, 예컨대 약 100:1 내지 약 20:1의 비이다.

하나 이상의 구현예에서, 리소좀 단백질은 숙주 세포에 의해 생성되는 분비된 단백질, 막 단백질 또는 세포내 단백질이다. 일부 구현예에서, 세포내 단백질은 세포 용해물을 제조하기 위한 세포 용해에 의해 여과물 내로 분리된다. 일부 구현예에서, 세포 용해물은 여과 또는 원심분리에 의해 여과물로부터 분리된다.

일부 구현예에서, 적어도 2개의 AEX 칼럼은 순차적으로 로딩되어 재조합 인간 리소좀 단백질을 제조하기 위한 적어도 2개의 AEX 칼럼 상으로 여과물의 연속 로딩을 가능하게 한다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 시간 당 약 0.5 칼럼 용적(CV) 내지 약 100 CV, 예컨대 시간 당 약 1 CV 내지 약 40 CV 범위의 여과물 로딩 속도로 적어도 2개의 AEX 칼럼 상에 로딩된다.

일부 구현예에서, 여과물은 적어도 2개의 AEX 칼럼 상에 로딩되어 각각의 AEX 칼럼에 대해 48시간 미만, 예컨대 24시간 미만의 AEX 로딩 시간이 가능하게 한다.

일부 구현예에서, 각각의 AEX 칼럼은 50 L 이하의 칼럼 용적을 갖는다.

하나 이상의 구현예에서, 제2 생물학적 제제 산물은 생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액의 회수 48시간 이내에 하나 이상의 IMAC 칼럼으로부터 용리된다.

하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 IMAC 칼럼은 총 IMAC 칼럼 용적을 가지며 생물반응기 용적 대 총 IMAC 칼럼 용적의 비는 약 5,000:1 내지 약 50:1의 범위이다.

일부 구현예에서, 총 AEX 칼럼 용적 대 총 IMAC 칼럼 용적의 비는 약 20:1 내지 약 1:1의 범위이다.

일부 구현예에서, 각각의 IMAC 칼럼은 20 L 이하의 칼럼 용적을 갖는다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제2 생물학적 제제 산물을 저장하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 생물학적 제제 산물은 24시간 내지 105일의 기간 동안 0℃ 내지 10℃의 온도에서 저장된다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 생물학적 제제 산물은 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80일, 85일, 90일, 95일, 100일 또는 105일 동안 저장된다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 생물학적 제제 산물은 1시간 내지 3일의 기간 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 저장된다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제3 크로마토그래피 칼럼 상으로 제2 생물학적 제제 산물을 로딩하는 단계; 및 제3 크로마토그래피 칼럼으로부터 제3 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 제3 크로마토그래피 칼럼은 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼, 친화도 크로마토그래피 칼럼, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 칼럼, 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 칼럼 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼으로부터 선택된다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 교대 접선 유동 여과(alternating tangential flow filtration, ATF) 및 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF) 중 하나 이상으로부터 배지 및/또는 세포 현탁액을 여과하여 분리된다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제1 생물학적 제제 산물, 제2 생물학적 제제 산물 및 제3 생물학적 제제 산물 중 하나 이상에서 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제2 생물학적 제제 산물 또는 제3 생물학적 제제 산물을 여과하여 여과된 산물을 제공하는 단계 및 여과된 산물로 바이알을 충전하는 단계를 추가로 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 여과된 산물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 생물학적 제제는 rhGAA를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포주 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14 또는 이의 계대배양물을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, (i) 제1 생물학적 제제 산물 또는 제2 생물학적 제제 산물 또는 제3 생물학적 제제 산물 중 적어도 90%는 CIMPR과 결합하고/하거나 (ii) 제1 생물학적 제제 산물 또는 제2 생물학적 제제 산물 또는 제3 생물학적 제제 산물 중 적어도 90%는 단일-M6P 또는 이중-M6P를 보유하는 N-글리칸을 함유한다.

하나 이상의 구현예에서, rhGAA는 7개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하며, rhGAA 분자 중 적어도 50%는 제1 부위에 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 30%는 제2 부위에 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 30%는 제4 부위에 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 20%는 제4 부위에 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, rhGAA 상에서 N-글리칸의 40% 내지 60%는 복합 유형의 N-글리칸이며; rhGAA는 rhGAA의 mol당 3.0 mol 내지 5.0 mol의 M6P 잔기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 양태의 다양한 구현예에서, 방법은 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계 및 적어도 2개의 AEX 칼럼 상으로 생물학적 제제-함유 유체를 로딩하는 단계를 포함하며, 여기서 적어도 2개의 AEX 칼럼은 총 AEX 칼럼 용적을 갖고, 생물반응기 용적 대 총 AEX 칼럼 용적의 비는 약 500:1 내지 약 10:1의 범위, 예컨대 약 100:1 내지 약 20:1의 비이다. 상기 양태의 다양한 구현예에서, 총 AEX 칼럼 체류 시간(즉, AEX 칼럼으로 로딩하는 용적 유속 및 총 AEX 칼럼 용적의 비율)은 약 0.5분 내지 200분, 예컨대 약 10분 내지 70분의 범위이다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 생물반응기에서 재조합 인간 리소좀 단백질을 분비하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 생물반응기로부터 배지를 회수하는 단계; 배지를 여과하여 여과물을 제공하는 단계; 적어도 2개의 AEX 칼럼 상으로 여과물을 로딩하여 리소좀 단백질을 포획하는 단계; 적어도 2개의 AEX 칼럼으로부터 제1 단백질 산물을 용리하는 단계; 하나 이상의 IMAC 칼럼 상으로 제1 단백질 산물을 로딩하는 단계; 및 하나 이상의 IMAC 칼럼으로부터 제2 단백질 산물을 용리하는 단계를 포함하며; 여기서 생물반응기는 생물반응기 용적을 갖고, 적어도 2개의 AEX 칼럼은 총 AEX 칼럼 용적을 갖고, 생물반응기 용적 대 총 AEX 칼럼 용적의 비는 약 500:1 내지 약 10:1의 범위, 예컨대 약 100:1 내지 약 20:1의 비이다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 2개의 AEX 칼럼은 순차적으로 로딩되어 적어도 2개의 AEX 칼럼 상으로 여과물의 연속 로딩을 가능하게 한다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 시간 당 약 0.5 CV 내지 약 100 CV, 예컨대 시간 당 약 1 CV 내지 약 40 CV 범위의 여과물 로딩 속도로 적어도 2개의 AEX 칼럼 상에 로딩된다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 적어도 2개의 AEX 칼럼 상에 로딩되어 각각의 AEX 칼럼에 대해 48시간 미만, 예컨대 24시간 미만의 AEX 로딩 시간이 가능하게 한다.

하나 이상의 구현예에서, 각각의 AEX 칼럼은 50 L 이하의 칼럼 용적을 갖는다.

하나 이상의 구현예에서, 제2 단백질 산물은 생물반응기로부터 배지의 회수 48시간 이내에 하나 이상의 IMAC 칼럼으로부터 용리된다.

하나 이상의 구현예에서, 하나 이상의 IMAC 칼럼은 총 IMAC 칼럼 용적을 가지며 생물반응기 용적 대 총 IMAC 칼럼 용적 비는 약 5,000:1 내지 약 50:1의 범위이다.

하나 이상의 구현예에서, 총 AEX 칼럼 용적 대 총 IMAC 칼럼 용적의 비는 약 20:1 내지 약 1:1의 범위이다.

하나 이상의 구현예에서, 각각의 IMAC 칼럼은 20 L 이하의 칼럼 용적을 갖는다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제2 단백질 산물을 저장하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 단백질 산물은 24시간 내지 105일의 기간 동안 0℃ 내지 10℃의 온도에서 저장된다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 단백질 산물은 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80일, 85일, 90일, 95일, 100일 또는 105일 동안 저장된다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 단백질 산물은 1시간 내지 3일의 기간 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 저장된다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제3 크로마토그래피 칼럼 상으로 제2 단백질 산물을 로딩하는 단계; 및 제3 크로마토그래피 칼럼으로부터 제3 단백질 산물을 용리하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 제3 크로마토그래피 칼럼은 CEX 칼럼 및 SEC 칼럼으로부터 선택된다.

하나 이상의 구현예에서, 배지를 여과하는 것은 ATF 및 TFF로부터 선택된다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제1 단백질 산물, 제2 단백질 산물 및 제3 단백질 산물 중 하나 이상에서 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 방법은 제2 단백질 산물 또는 제3 단백질 산물을 여과하여 여과된 산물을 제공하는 단계 및 바이알을 여과된 산물로 충전하는 단계를 추가로 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 재조합 인간 리소좀 단백질은 rhGAA이다. 하나 이상의 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포주 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14 또는 이의 계대배양물을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, (i) 제1 단백질 산물 또는 제2 단백질 산물 또는 제3 단백질 산물 중 적어도 90%는 CIMPR과 결합하고/하거나, (ii) 제1 단백질 산물 또는 제2 단백질 산물 또는 제3 단백질 산물 중 적어도 90%는 단일-만노스-6-인산염(단일-M6P) 또는 이중-만노스-6-인산염(이중-M6P)을 보유하는 N-글리칸을 함유한다.

하나 이상의 구현예에서, rhGAA 상에서 N-글리칸의 40% 내지 60%는 복합 유형 N-글리칸이며; rhGAA는 rhGAA의 mol당 3.0 mol 내지 5.0 mol의 M6P 잔기를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 제조된 생물학적 제제 산물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 제제 산물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 또 다른 양태는 리소좀 저장 장애를 치료하기 위한 방법에 관한 것이며, 이 방법은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 리소좀 저장 장애는 폼페병이고, 생물학적 제제 산물은 rhGAA이다. 하나 이상의 구현예에서, 환자에 rhGAA 산물을 포함하는 약제학적 조성물의 투여 4시간 이내에 α-글루코시다제에 대한 약리학적 샤프론(pharmacological chaperone)이 공동 투여된다. 일부 구현예에서, 약리학적 샤프론은 1-데옥시노지리마이신 및 N-부틸-데옥시노지리마이신으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 약리학적 샤프론은 rhGAA 산물과 공동 제형화된다.

다양한 구현예가 하기에 열거된다. 하기에 열거된 구현예는 하기에 열거된 것뿐만 아니라, 본 발명의 범위에 따른 다른 적절한 조합으로 조합될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 추가의 특징은 하기에 작성된 기재내용 및 첨부 도면으로부터 명백해질 것이다:
도 1a는 비인산화된 고만노스 글리칸, 단일-M6P 글리칸, 및 이중-M6P 글리칸을 도시한다.
도 1b는 M6P 기의 화학적 구조를 도시한다.
도 2의 A는 M6P를 보유하는 글리칸을 통한 표적 조직(예를 들어, 폼페병이 있는 대상체의 근육 조직)으로의 rhGAA의 생산적 표적화를 기재한다.
도 2의 B는 비 M6P 글리칸과 비 표적 조직의 결합에 의하거나, 비 표적 조직(예를 들어, 간 및 비장)으로의 비 생산적 약제 배출을 기재한다.
도 3a는 CIMPR 수용체(또한 IGF2 수용체로 공지됨) 및 이러한 수용체의 도메인을 그래프에 의해 도시한다.
도 3b는 CIMPR에 대한 이중- 및 단일-M6P를 보유하는 글리칸의 결합 친화도(nmol당), 만노스 수용체에 대한 고만노스-형 글리칸의 결합 친화도 및 아시알리오당단백질 수용체에 대한 탈시알릴화된 복합체 글리칸의 결합 친화도를 보여주는 표이다. M6P 및 이중-M6P를 보유하는 글리칸을 갖는 RhGAA는 근육에서 CIMPR과 생산적으로 결합할 수 있다.
도 4는 rhGAA를 인코딩하는 DNA에 의한 CHO 세포의 형질전환을 위한 DNA 작제물을 도시한다. CHO 세포를 rhGAA를 인코딩하는 DNA 작제물에 의해 형질전환하였다.
도 5는 재조합 단백질의 제조, 포획 및 정제를 위한 예시적 선행 기술의 공정의 개략도이다.
도 6은 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 생물학적 제제의 제조, 포획 및 정제를 위한 예시적 공정의 개략도이다.
도 7은 생물학적 제제의 제조, 포획 및 정제에서 예시적인 제1 사건 순서를 기재하며, 여기서 생물학적 제제를 함유하는 여과물이 포획 칼럼 1 상에 로딩된다.
도 8은 생물학적 제제의 제조, 포획 및 정제에서 예시적인 제2 사건 순서를 기재하며, 여기서 포획 칼럼 1에 포획된 생물학적 제제가 용리되고 정제 칼럼 상으로 로딩된다. 공정 동안, 생물학적 제제를 함유하는 여과물이 포획 칼럼 2 상에 로딩된다.
도 9는 생물학적 제제의 제조, 포획 및 정제에서 예시적인 제3 사건 순서를 기재하며, 여기서 포획 칼럼 2에 포획된 생물학적 제제가 용리되고 정제 칼럼 상으로 로딩된다. 공정 동안, 생물학적 제제를 함유하는 여과물이 포획 칼럼 1 상에 로딩된다.
도 10은 생물학적 제제의 제조, 포획 및 정제에서 예시적인 제4 사건 순서를 기재하며, 여기서 생물학적 제제가 정제 칼럼으로부터 용리된다.
도 11은 rhGAA의 제조, 포획 및 정제에서 예시적인 사건 순서를 기재하며, 여기서 AEX 칼럼이 포획 칼럼으로 사용되고 IMAC 칼럼이 정제 칼럼으로 사용된다.
도 12는 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 생물학적 제제의 제조, 포획 및 정제를 위한 또 다른 예시적인 공정의 개략도이다.
도 13은 배치(batch) 정제 공정에서 2개의 AEX 포획 칼럼으로부터의 용리 프로파일을 나타낸다.
도 14는 연속 정제 공정에서 2개의 AEX 포획 칼럼으로부터의 용리 프로파일을 나타낸다.
도 15는 배치 정제 공정 및 연속 정제 공정 간 IMAC 정제 칼럼으로부터의 용리 프로파일의 비교를 나타낸다.
도 16은 도 15로부터 배치 정제 공정 및 연속 정제 공정 간 IMAC 정제 칼럼으로부터의 용리 프로파일의 확대 이미지를 나타낸다.

본 발명의 몇몇 예시적인 구현예를 기재하기 전에, 본 발명은 하기의 기재내용에 제시된 구성 또는 공정 단계의 세부사항에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하고, 다양한 방법으로 실시되거나, 실행될 수 있다.

본 개시내용은 생물학적 제제를 생성하고, 포획하고 정제하는 방법을 기재한다. 하나 이상의 구현예에서, 생물학적 제제는 재조합 단백질, 바이러스 입자 또는 항체 중 하나 이상을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 재조합 단백질은 리소좀을 표적화한다. 하나 이상의 구현예에서, 재조합 단백질은 재조합 인간 α-갈락토시다제 A(rhGAA)이다.

하나 이상의 구현예에서, 재조합 단백질은 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 번역-후 및/또는 화학적 변형을 거친다. 예를 들어, 메티오닌 및 트립토판 잔기는 산화를 거칠 수 있다. 또 다른 예로서, N-말단 글루타민은 피로-글루타메이트를 형성할 수 있다. 또 다른 예로서, 아스파라긴 잔기는 아스파르트산으로의 탈아미드화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 아스파르트산 잔기는 이소-아스파르트산으로의 이성질체화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 단백질에서 비쌍 시스테인 잔기는 유리 글루타티온 및/또는 시스테인과 이황화 결합을 형성할 수 있다.

rhGAA가 구체적으로 언급되지만, 본원에 기재된 방법 및 시스템이 다른 재조합 단백질을 생성하고, 포획하고 정제하는 데 사용될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 다양한 구현예에서, 리소좀 효소 α-갈락토시다제 A를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 재조합 단백질이 또한 리소좀을 표적화한다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 또한 다른 생물학적 제제 산물, 예컨대 (예를 들어, 유전자 요법을 위한) 항체 및 바이러스 입자를 생성하고, 포획하고 정제하기 위해 사용될 수 있다.

rhGAA의 생성을 위한 일부 현재 방법은 대형 AEX 칼럼, 예컨대 1미터 직경 X 30 cm 층 높이의 치수를 갖는 AEX 칼럼을 이용한다(즉, 각각의 AEX 칼럼 용적 = 236 L). 이들 대형 AEX 칼럼은 긴 로딩 시간(예를 들어, 96시간)을 가지며, AEX 조건 동안 rhGAA의 낮은 안정성으로 인해, AEX는 2℃ 내지 8℃의 제어되는 온도를 갖는 저온실에서 수행된다. 이어서 대형 AEX 칼럼으로부터의 용리액이 대형 IMAC 칼럼, 예컨대 60 cm 직경 X 20 cm 층 높이의 치수를 갖는 IMAC 칼럼 상에 수동으로 로딩된다(즉, 각각의 IMAC 칼럼 용적 = 56.5 L). 대형 AEX 및 IMAC 칼럼을 갖는 이들 제조 시스템은 또한 몇몇 단점을 갖는다: 큰 설비 차지 공간(footprint); 불량한 생산성(시간 당 수지 리터 당 생성되는 효소); 높은 조작자 관여(인간 오류의 위험이 증가함); 및 AEX 사이클의 일부가 잘못되거나 IMAC 상의 전방 가공이 지연되는 경우의 높은 산물 손실/폐기.

그러나, 놀랍게도 상대적으로 소형의 제조 시스템이 하기 장점 중 하나 이상을 제공할 수 있음이 발견되었다: 포획 칼럼(예를 들어, AEX) 로딩 시간을 감소시키고; 저온실 가공을 배제하고; 설비 차지 공간을 줄이고; 생산성을 개선하고; 포획 칼럼(예를 들어, AEX)으로부터 정제 칼럼(예를 들어, IMAC)으로의 가공 과정이 직선형이므로 조작자 관여를 감소시키고; 생물학적 제제 포획(예를 들어, AEX) 사이클의 일부가 잘못되는 경우 산물 손실/폐기를 최소화한다. 추가적으로, 시스템은 더 작은 칼럼 크기를 사용하며, 이는 다른 단백질로부터 최종 산물의 더 우수한 분리가 달성되도록 돕는다.

따라서, 본 발명의 다양한 양태는 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 인간 리소좀 단백질, 예컨대 rhGAA를 포함하는, 재조합 단백질)의 생성, 포획 및 정제를 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 공정에 의해 생성되는 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 단백질)뿐만 아니라, 약제학적 조성물, 치료 방법 및 이러한 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 단백질)의 용도에 관한 것이다.

정의

본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 문맥 내 및 각 용어가 사용되는 구체적 맥락 내에서 당업계에서의 그의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 발명의 조성물 및 방법 및 이들의 제조 및 사용 방법의 기재 시, 실무자에게 추가적인 지침을 제공하기 위해, 하기 또는 본 명세서의 다른 부분에서 논의된다.

본 명세서에서, 명시적인 언어 또는 필요한 의미로 인해, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, "~를 포함하다"라는 단어 또는 "~를 포함하다" 또는 "~를 포함하는"과 같은 변형은 포괄적인 의미로 사용되는 것으로서, 즉, 언급된 특징의 존재를 명시하는 것이나, 본 발명의 다양한 구현예에서 추가의 특징의 존재 또는 첨가를 배제하는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물반응기 용적"은 생물반응기 내의 작업 용적(즉, 액체 용적)을 지칭한다. 생물반응기 내의 작업 용적은 10000리터 미만, 5000리터 미만, 4000리터 미만, 3500리터 미만, 3000리터 미만, 2500리터 미만, 2000리터 미만, 1500리터 미만, 1000리터 미만, 500리터 미만 또는 250리터 미만일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포획 칼럼"은 생물반응기로부터 생성된 요망되는 생물학적 제제 산물을 포획하는 크로마토그래피 칼럼을 지칭한다. 본 개시내용은 적어도 2개의 포획 칼럼을 사용하는 방법을 기재한다. 다양한 구현예에서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 순차적으로 로딩되어 적어도 2개의 포획 칼럼 상으로 여과물의 연속 로딩을 가능하게 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정제 칼럼"은 요망되는 생물학적 제제 산물이 포획 칼럼 상에 포획된 후 산물을 추가로 정제하기 위해 사용되는 크로마토그래피 칼럼을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "칼럼 용적"은 크로마토그래피 칼럼의 패킹된 층 용적을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "총 ... 칼럼 용적", 예컨대 "총 생물학적 제제 포획 칼럼 용적", 총 AEX 칼럼 용적 등은 특정된 유형의 모든 칼럼의 응집물 칼럼 용적을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "총 ... 칼럼 체류 시간"은 칼럼을 로딩하기 위해 사용되는 용적 유속 및 특정된 유형의 모든 칼럼의 응집물 칼럼 용적의 비율을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 DNA"는 여러 원천(예를 들어, 상이한 유기체)으로부터의 유전 물질을 조합하여 인공적으로 형성된 DNA를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 제제(biologics 또는 biologic)" 또는 "생물학적 제제 산물"은 생체 시스템에서 생성되는 복합 분자 또는 분자의 혼합물을 지칭한다. 생물학적 제제는 종종 재조합 DNA 기술을 사용하여 세포-기반 시스템에서 생성된다. 생물학적 제제의 예는 재조합 단백질, 바이러스 입자 및 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 단백질"은 유전자의 발현을 뒷받침하는 시스템에서 클로닝된 재조합 DNA에서 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭한다. 하나 이상의 구현예에서, 재조합 단백질은 숙주 세포에서 생성되는 분비된 단백질 또는 세포내 단백질이다. 숙주 세포는 원핵생물(예를 들어, 박테리아) 세포, 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유류 세포를 포함하는 진핵생물 세포를 포함하는, 임의의 생물학적 유기체로부터 선택될 수 있다. 특히 요망되는 숙주 세포는 A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, HeLa, 293 세포(기능적 아데노바이러스 E1을 발현함), Saos, C2C12, L 세포, HT1080, HepG2 및 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 및 햄스터를 포함하는 포유동물로부터 유래되는 일차 섬유아세포, 간세포 및 근모세포와 같은 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 포유류 종으로부터 선택된다. 세포를 제공하는 포유류 종의 선택은 본 발명을 제한하거나 포유류 세포의 유형, 즉, 섬유아세포, 간세포, 종양 세포 등을 제한하지 않는다.

일부 구현예에서, 재조합 단백질은 분비된 단백질, 막 단백질 또는 세포내 단백질일 수 있다. 분비된 단백질은 여과 또는 원심분리에 의해 여과물로 분리될 수 있다. 세포내 단백질은 먼저 세포를 용해시킨 후 여과 또는 원심분리에 의해 여과물로 분리될 수 있다. 막 단백질은 세포를 용해시키고, 초원심분리에 의해 막을 함유하는 재조합물을 분리하고 적절한 계면활성제를 사용하여 막 단백질을 가용화하고 초원심분리에 의해 여과물을 제조하여 비-가용성 막 단백질을 분리함으로써 분리될 수 있다. 계면활성제는 성질 상 음이온성, 양이온성 또는 쯔비터이온성일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리소좀 단백질"은 리소좀, 예컨대 리소좀 효소로 표적화되는 임의의 단백질을 지칭한다. 리소좀 효소 및 연관된 질병의 예는 아래 표 1에 제공된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

하나 이상의 구현예에서, 리소좀 단백질은 알파-갈락토시다제(A 또는 B), β-갈락토시다제, β-헥소스아미니다제(A 또는 B), 갈락토실세라미다제, 아릴설파타제(A 또는 B), β-글루코세레브로시다제, 글루코세레브로시다제, 리소좀 산 리파제, 리소좀 효소 산 스핑고미엘리나제, 포르밀글리신-생성 효소, 이두로니다제(예를 들어, 알파-L), 아세틸-CoA:알파-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제, 글리코사미노글리칸 알파-L-이두로노하이드롤라제, 헤파란 N-설파타제, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제, 이두로네이트-2-설파타제, 갈락토사민-6-설페이트 설파타제, N-아세틸갈락토사민-6-설파타제, 글리코사미노글리칸 N-아세틸갈락토사민 4-설파타제, β-글루쿠로니다제, 히알루로니다제, 알파-N-아세틸 뉴라미니다제(시알리다제), 갱글리오시드 시알리다제, 포스포트랜스퍼라제, 알파-글루코시다제, 알파-D-만노시다제, 베타-D-만노시다제, 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-L-푸코시다제, 바테닌, 팔미토일 단백질 티오에스테라제, 및 기타 바텐(Batten)-관련 단백질(예를 들어, 세로이드-리포푸시노시스 뉴런 단백질 6)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질은 알파-갈락토시다제이다. 일부 구현예에서, 효소는 팔미토일 단백질 티오에스테라제 1 및 2(각각 PPT1 및 PPT2)를 포함하는, 팔미토일 단백질 티오에스테라제(PPT)이다. 일부 구현예에서, 효소는 팔미토일 단백질 티오에스터라제 1이다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질은 CDKL5 결핍 장애, 낭성 섬유증, 알파- 및 베타-지중해빈혈, 겸상 적혈구 빈혈, 마판(Marfan) 증후군, 여린 X 증후군(fragile X syndrome), 헌팅턴병, 혈색소증, 선천성 난청(비증후군), 테이-삭스, 유전성 고콜레스테롤혈증, 뒤시엔느 근위축증, 슈트가르트병, 어셔 증후군, 범맥락막위축, 완전색맹, X-연관 망막층간분리, 혈우병, 위스코트-알드리치 증후군, X-연관 만성 육아종병, 방향족 L-아미노산 탈카복실라제 결핍, 열성 이영양성 수포성 표피박리증, 알파 1 항트립신 결핍, 허친슨-길포드 유전조로증 증후군(HGPS), 누난 증후군, X-연관 중증 복합 면역결핍(X-SCID)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전 장애와 연관된다. 일부 구현예에서, 치료용 단백질은 CDKL5, 콘넥신(Connexin) 26, 헥소스아미니다제 A, LDL 수용체, 디스트로핀(Dystrophin), CFTR, 베타-글로불린, HFE, 헌팅턴(Huntington), ABCA4, 미오신 VIIA(MYO7A), Rab 에스코트 단백질-1(REP1), 사이클릭 뉴클레오티드 관문화 채널 베타 3(CNGB3), 레티노쉬신(retinoschisin) 1(RS1), 헤모글로빈 서브유닛 베타(HBB), 인자 IX, WAS, 시토크롬 B-245 베타 사슬, 도파 탈카복실라제(DDC), 콜라겐 VII형 알파 1 사슬(COL7A1), 서핀(serpin) 패밀리 A 구성원 1(SERPINA1), LMNA, PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, 및 IL2 수용체 γ 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된다.

하나 이상의 구현예에서, 유전 장애(예를 들어, 리소좀 저장 장애)는 아스파르틸글루코사민뇨, 바텐병, 시스틴증, 파브리병, 고셔병 I형, 고셔병 II형, 고셔병 III형, 폼페병, 테이 삭스병, 산드호프병, 이염성 백질이영양증, 점액지질증 I형, 점액지질증 II형, 점액지질증 III형, 점액지질증 IV형, 허를러병, 헌터병, 산필리포병 A형, 산필리포병 B형, 산필리포병 C형, 산필리포병 D형, 모르퀴오병 A형, 모르퀴오병 B형, 마르토-라미병, 슬라이병, 니만-픽병 A형, 니만-픽병 B형, 니만-픽병 C1형, 니만-픽병 C2형, 쉰들러병 I형, 및 쉰들러병 II형으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 리소좀 저장 장애는 활성화제 결핍, GM2-갱글리오시드축적증; GM2-갱글리오시드축적증, AB 변이형; 알파-만노스축적증(2형, 중등도 형태; 3형, 신생아, 중증); 베타-만노스축적증; 리소좀 산 리파제 결핍; 시스틴증(후기-발병 청소년기 또는 청소년 신장병증 유형; 유년기 신장병증); 차나린-도프만(Chanarin-Dorfman) 증후군; 근병증을 갖는 중성 지질 저장 질병; NLSDM; 다논(Danon)병; 파브리병; 파브리병 II형, 후기-발병; 파버병; 파버 지방육아종증; 푸코시드축적증; 갈락토시알산증(복합 뉴라미니다제 및 베타-갈락토시다제 결핍); 고셔병; II형 고셔병; III형 고셔병; IIIC형 고셔병; 고셔병, 비정형, 사포닌 C 결핍으로 인한 것; GM1-갱글리오시드축적증(후기-유년기/청소년기 GM1-갱글리오시드축적증; 성인/만성 GM1-갱글리오시드축적증); 공세포 백색질장애, 크라베병(후기 유년기 발병; 청소년기 발병; 성인 발병); 크라베병, 비정형, 사포닌 A 결핍으로 인한 것; 이염성 백질이영양증(청소년기; 성인); 부분 세레브로시드 설페이트 결핍; 슈도아릴설파타제 A 결핍; 사포닌 B 결핍으로 인한 이염성 백질이영양증; 뮤코다당질축적 장애: MPS I, 허를러 증후군; MPS I, 허를러-샤이에 증후군; MPS I, 샤이에 증후군; MPS II, 헌터 증후군; MPS II, 헌터 증후군; 산필리포 증후군 A형/MPS IIIA; 산필리포 증후군 B형/MPS IIIB; 산필리포 증후군 C형/MPS IIIC; 산필리포 증후군 D형/MPS IIID; 모르퀴오 증후군, A형/MPS IVA; 모르퀴오 증후군, B형/MPS IVB; MPS IX 히알루로니다제 결핍; MPS VI 마르토-라미 증후군; MPS VII 슬라이 증후군; 점액지질증 I, 시알산증 II형; I-세포 질병, 리로이(Leroy)병, 점액지질증 II; 슈도-허를러 다발영양장애/점액지질증 III형; 점액지질증 IIIC/ML III GAMMA; 점액지질증 IV형; 다발 설파타제 결핍; 니만-픽병(B형; C1형/만성 신경병증 형태; C2형; D형/노바스코샤인 유형); 뉴런 지방 갈색소증: CLN6 질병 - 비정형 후기 유년기, 후기-발병 변이형, 초기 청소년기; 바텐-스피엘마이어-보그트(Batten-Spielmeyer-Vogt)/청소년기 NCL/CLN3 질병; 핀란드인 변이형 후기 유년기 CLN5; 잔스키-비엘쇼브스키(Jansky-Bielschowsky)병/후기 유년기 CLN2/TPP1 질병; 커프(Kufs)/성인-발병 NCL/CLN4 질병(B형); 북부 간질/변이형 후기 유년기 CLN8; 산타부오리-할티아(Santavuori-Haltia)/유년기 CLN1/PPT 질병; 폼페병(글리코겐 저장 질병 II형); 후기-발병 폼페병; 피크노다이소스토시스(Pycnodysostosis); 산드호프병/GM2 갱글리오시드축적증; 산드호프병/GM2 갱글리오시드축적증; 산드호프병/GM2 갱글리오시드축적증; 쉰들러병(III형/중간형, 가변적); 칸자키병; 살라병; 유년기 유리 시알산 저장 질병(ISSD); 진행성 근간 대간질을 갖는 척추 근위축(SMAPME); 테이-삭스병/GM2 갱글리오시드축적증; 청소년기-발병 테이-삭스병; 후기-발병 테이-삭스병; 크리스티안슨 증후군; 로웨(Lowe) 안뇌신위축 증후군; 샬코트-마리-투스 4J형, CMT4J; 유니스-바론(Yunis-Varon) 증후군; 양측 측두후두 다소뇌회증(BTOP); X-연관 고칼슘뇨 신장결석증, 덴트(Dent)-1; 및 덴트병 2, 아데노신 탈아미나제 중증 복합 면역결핍(ADA-SCID), 및 뉴런 지방 갈색소증으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 산 말타제 결핍, 글리코겐 저장 질병 II형(GSDII), 및 글리코겐증 II형으로도 지칭되는 "폼페병"이라는 용어는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 GAA 유전자에서의 돌연변이를 특징으로 하는 유전적 리소좀 저장 장애를 지칭하는 것으로 의도된다. 이 용어는 유년기, 청소년기 및 성인 발병형 폼페병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 질병의 초기 및 후기 발병 형태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "산 α-글루코시다제"는 글리코겐의 D-글루코스 단위, 말토스, 및 이소말토스 사이의 α-1,4 연결을 가수분해하는 리소좀 효소를 지칭하는 것으로 의도된다. 대안적 명칭은 리소좀 α-글루코시다제(EC:3.2.1.20); 글루코아밀라제; 1,4-α-D-글루칸 글루코하이드롤라제; 아밀로글루코시다제; 감마-아밀라제 및 엑소-1,4-α-글루코시다제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 산 α-글루코시다제는 GAA 유전자(미국 국립 생명공학 정보 센터(NCBI) 유전자 ID 2548)에 의해 인코딩되며, 이는 염색체 17의 긴 아암에 매핑된다(위치 17q25.2-q25.3). 현재까지 500개 초과의 돌연변이가 인간 GAA 유전자에서 확인되었으며, 이들 중 대부분은 폼페병과 관련된다. 산 α-글루코시다제 효소의 접힘 오류(misfolding) 또는 가공 오류(misprocessing)를 야기하는 돌연변이는 T1064C(Leu355Pro) 및 C2104T(Arg702Cys)를 포함한다. 추가로, 효소의 성숙 및 가공에 영향을 미치는 GAA 돌연변이는 Leu405Pro 및 Met519Thr를 포함한다. 산 α-글루코시다제 단백질의 활성을 위해서는, 아미노산 잔기 516 내지 521의 보존된 헥사펩티드 WIDMNE가 요구된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 약자 "GAA"는 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도되며, 이탤릭체 약자 "GAA"는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 인간 유전자를 지칭하는 것으로 의도된다. 이탤릭체 약자 "Gaa"는 래트 또는 마우스 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 비 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 비 인간 유전자를 지칭하는 것으로 의도되며, 약자 "Gaa"는 비 인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 약자 "rhGAA"는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "알글루코시다제 알파"는 [199-아르기닌, 223-히스티딘]프레프로-α-글루코시다제(인간); 화학물질 색인 정보등록번호 420794-05-0으로서 확인되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도된다. 알글루코시다제 알파는 제품 루미자임® 및 마이오자임®으로서, 2016년 1월에 젠자임에 의해 미국에서 판매 승인되었다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ATB200"은 이제 미국 특허 제10,208,299호로 허여된, PCT 특허 출원 PCT/US2015/053252에 기재된 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도되며, 그 개시 내용은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 재조합 리소좀 단백질(rhGAA, 예컨대 ATB200 포함함)을 제조하는 방법은 미국 특허 제10,227,577호에 기재되어 있으며, 또한 그 전문이 참조로 포함된다. rhGAA를 사용하는 제형 및 방법은 공동-계류 중인 출원 공개 제US 2017/0333534호 및 제US 2018/0228877호에 기재되어 있으며, 또한 이의 전문이 참조로 포함된다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "글리칸"은 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기에 공유 결합된 다당류 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "N-글리칸" 또는 "N-연결된 글리칸"은 아미노산 잔기의 질소 원자와의 공유 결합을 통해 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기에 부착된 다당류 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, N-글리칸은 아스파라긴 잔기의 측쇄의 질소 원자에 공유적으로 결합될 수 있다. 글리칸은 하나 또는 수개의 단당류 단위를 함유할 수 있으며, 단당류 단위는 공유적으로 연결되어 직쇄 또는 분지쇄를 형성할 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, ATB200에 부착된 N-글리칸 단위는, 각각 비의존성으로 N-아세틸글루코사민, 만노스, 갈락토스 또는 시알산으로부터 선택되는 하나 이상의 단당류 단위를 포함할 수 있다. 단백질 상의 N-글리칸 단위는 임의의 적절한 분석 기법, 예컨대 질량 분광분석에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, N-글리칸 단위는 Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro™질량 분광분석기, Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid™ 질량 분광분석기 또는 Waters Xevo® G2-XS QTof 질량 분광분석기와 같은 기기를 사용하여 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광분석(LC-MS/MS)에 의해 결정될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "고-만노스 N-글리칸"은 1개 내지 6개 이상의 만노스 단위를 갖는 N-글리칸을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 고만노스 N-글리칸 단위는 아스파라긴 잔기에 결합되고, 폴리만노스 분지쇄에 추가로 결합된 이중(N-아세틸글루코사민) 사슬을 함유할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 혼용되는 것으로서, 용어 "M6P" 또는 "만노스-6-인산염"은 6 위치에서 인산화된 것으로; 즉, 6 위치에서 하이드록실기에 결합된 인산염 기를 갖는 만노스 단위를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 하나 이상의 N-글리칸 단위의 하나 이상의 만노스 단위는 6 위치에서 인산화되어 만노스-6-인산염 단위를 형성한다. 적어도 하나의 구현예에서, 용어 "M6P" 또는 "만노스-6-인산염"은 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 캡이 부재하는 노출된 인산기를 갖는 만노스 단위뿐만 아니라, 인산기 상에 "캡"으로서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 갖는 만노스 포스포디에스테르 두 종류 모두를 지칭한다. 적어도 하나의 구현예에서, 단백질의 N-글리칸은 다수의 M6P 기를 가질 수 있고, 적어도 하나의 M6P 기는 GlcNAc 캡을 가지며, 적어도 하나의 다른 M6P 기는 GlcNAc 캡이 부재한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "복합체 N-글리칸"은 하나 이상의 갈락토스 및/또는 시알산 단위를 함유하는 N-글리칸을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 복합체 N-글리칸은 고만노스 N-글리칸일 수 있으며, 하나의 만노스 단위 또는 만노스 단위들은 각각 비의존성으로 N-아세틸글루코사민, 갈락토스 및 시알산으로부터 선택되는 하나 이상의 단당류 단위와 추가로 결합할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, N-부틸-1-데옥시노지리마이신 NB-DNJ 또는 (2R,3R,4R,5S)-1-부틸-2-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4,5-트리올로도 공지된 화합물 미글루스타트는 하기의 화학식을 갖는 화합물이다:

미글루스타트의 일종의 제형이 제1형 고셔병을 위한 단일요법으로서, 상표명 Zavesca® 하에 시판되고 있다.

하기에서 논의되는 바와 같이, 미글루스타트의 약제학적으로 허용 가능한 염이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 미글루스타트의 염이 사용되는 경우, 염의 투여량은, 환자에 제공되는 미글루스타트의 용량이, 미글루스타트 유리 염기가 사용되는 경우에 제공되는 양과 균등하도록 조정될 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 1-데옥시노지리마이신 또는 DNJ 또는 (2R,3R,4R,5S)-2-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4,5-트리올로도 공지된 화합물 두보글루스타트(duvoglustat)는 하기의 화학식을 갖는 화합물이다:

두보글루스타트의 염이 사용되는 경우, 염의 투여량은, 환자에 제공되는 두보글루스타트의 용량이, 두보글루스타트 유리 염기가 사용되는 경우에 제공되는 양과 균등하도록 조정될 것이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약리학적 샤프론" 또는 때때로 간략하게는 용어 "샤프론"은 단백질(예를 들어, 자연 발생 단백질 또는 재조합 단백질)과 특이적으로 결합하고 하기의 효과 중 하나 이상을 갖는 분자를 지칭하는 것으로 의도된다:

· 단백질의 안정한 분자 입체형태의 형성을 증대시키고/시키거나;

· 소포체로부터 다른 세포 위치, 바람직하게는 고유의 세포 위치로의 단백질의 적절한 수송을 증대함으로써, 소포체-결합 단백질 분해를 방지하고/하거나;

· 입체형태적으로 불안정하거나 접힘 오류가 있는 단백질의 응집을 방지하고/하거나;

· 단백질의 적어도 일부의 야생형 기능, 안정성 및/또는 활성을 복원시키고/시키거나, 증대시키고/시키거나;

· 단백질을 보유하는 세포의 표현형 또는 기능을 개선한다.

따라서, 약리학적 샤프론은 리소좀 단백질을 포함한다. 예를 들어, 산 α-글루코시다제에 대한 샤페론은 산 α-글루코시다제와 결합하여, 산 α-글루코시다제의 적절한 접힘, 수송, 비응집 및 활성을 야기하는 분자이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 효소, 억제제 또는 길항제 및 작용제의 활성 부위와 결합하는 활성 부위 특이적 샤프론(ASSC)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적어도 하나의 구현예에서, 약리학적 샤프론은 산 α-글루코시다제의 억제제 또는 길항제일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 산 α-글루코시다제와 결합하여, 산 α-글루코시다제의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나, 중화하는 임의의 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 약리학적 샤프론은 미글루스타트이다. 산 α-글루코시다제의 약리학적 샤프론의 또 다른 비제한적인 예는 두보글루스타트이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성 부위"는 단백질의 특이적 생물학적 활성과 관련되고 이에 필요한 단백질의 영역을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 활성 부위는, 기질 또는 다른 결합 대상물과 결합하고 화학 결합의 형성 및 절단에 직접 관여하는 아미노산 잔기에 기여하는 부위일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, "치료 유효 용량" 및 "유효량"은, 대상체에서 치료 반응을 야기하기에 충분한 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 및/또는 샤프론 및/또는 이들의 조합의 양을 지칭하는 것으로 의도된다. 치료 반응은 사용자(예를 들어, 임상의)가, 본원에 기재되고 당업계에 공지된 임의의 대용 임상 마커 또는 증상을 포함하여, 요법에 대한 유효한 반응으로 인식하는 임의의 반응일 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 치료 반응은 당업계에 공지된 것과 같은 폼페병의 하나 이상의 증상 또는 마커의 완화 또는 억제일 수 있다. 폼페병의 증상 또는 마커는 저하된 산 α-글루코시다제 조직 활성; 심근병증; 심장비대; 특히 몸통 또는 하지에서의 진행성 근육 약화; 심한 저혈압; 대설증(macroglossia)(및 일부 경우, 혀의 돌출); 연하, 흡인 및/또는 섭식 곤란; 호흡 부전; 간비대(중등도); 안면 근육 이완; 무반사; 운동 불내성; 운동성 호흡 곤란; 기좌 호흡; 수면 무호흡증; 오전 두통; 졸림; 척추전만 및/또는 측만증; 심부건 반사의 저하; 하부 요통; 및 발달 운동 이정표 미충족을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 산 α-글루코시다제에 대해 억제 효과를 갖는 샤프론(예를 들어, 미글루스타트)의 농도는 생체내 투여시 샤프론의 희석(및 결과적으로 평형의 변화에 기인한 결합 변화), 생체이용률 및 대사로 인해, 본 발명의 목적을 위한 "유효량"을 구성할 수 있음을 유의해야 한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "효소 대체 요법" 또는 "ERT"는 비 천연 정제 효소를 이러한 효소가 결핍된 개체에 도입하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 투여 단백질은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 이 용어는 또한 정제 효소의 투여가 달리 필요하거나 유익한 개체에게 정제 효소를 도입하는 것을 지칭한다. 적어도 하나의 구현예에서, 이러한 개체는 효소 결핍증을 앓고 있다. 도입 효소는 시험관내에서 생성된 정제된 재조합 효소 또는 예를 들어, 태반 또는 동물 우유와 같은 단리 조직이나 유체 또는 식물로부터 정제된 단백질일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "조합 요법"은 2종 이상의 별도의 요법이 동시에 또는 연속적으로 시행되는 임의의 요법을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 각각의 요법이 별도로 수행되는 경우, 그의 효과와 비교하여, 조합 요법의 결과는 증대된다. 이러한 증대는, 요법이 단독으로 수행되는 경우 그에 의해 달성되는 결과와 비교하여 유리한 결과를 야기할 수 있는 다양한 요법의 효과의 임의의 개선을 포함할 수 있다. 증대된 효과 또는 결과는, 증대된 효과가, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 추가적 효과보다 더 큰 상승작용적 증대; 증대된 효과가, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 추가적 효과와 실질적으로 동일한 추가적 증대; 또는 증대된 효과가, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 추가적 효과보다는 더 낮으나, 각 요법이 그 자체로 수행되는 경우의 효과보다는 여전히 더 큰 상승작용적 효과 미만을 포함할 수 있다. 증대된 효과는, 치료 효능 또는 결과를 측정할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스 입자"는 캡시드로 공지된 단백질 피막에 의해 둘러싸인 유전 물질(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함하는 것으로 의도된다. 바이러스 입자의 예는 아데노-연관 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 아데노바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 구현예에서, 바이러스 입자는 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 바이러스 입자는 벡터의 발현을 증가시키고/시키거나 안정화하는 추가 요소, 예컨대 프로모터(예를 들어, 하이브리드 CBA 프로모터(CBh) 및 인간 시냅신 1 프로모터(hSyn1)), 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bGH폴리A)), 안정화 요소(예를 들어, 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사 후 조절 요소(WPRE)) 및/또는 SV40 인트론을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 벡터는 게놈 내 요망되는 부위에서 상동성 재조합을 촉진하는 영역이 측면에 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이에 따라 요망되는 단백질의 발현을 제공한다(문헌[Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438]; 미국 특허 제6,244,113호(Zarling 등); 및 미국 특허 제6,200,812호(Pati 등) 참고).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린을 지칭하며, 여기서 면역글로불린은 천연 및/또는 재조합 면역글로불린을 포함한다. 천연 면역글로불린의 원천은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 실험실, 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 염소, 돼지, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 원숭이를 포함하는 포유동물일 수 있다. 원천은 항체 생성을 초래하는 면역원성 반응을 유도하기 위해 특이적인 항원에 천연 또는 인공 노출될 수 있다. 대안적으로, 재조합 면역글로불린은 또한 적절한 숙주 세포에서 생성될 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 인간에 투여되는 경우, 생리학적으로 내성이며, 일반적으로, 부반응을 생성시키지 않는 분자체 및 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은, 동물 및 더욱 특히 인간용으로서 미연방 또는 주 정부 규제 당국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 등재된 것을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는, 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비히클을 지칭하는 것으로 의도된다. 적절한 약제학적 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 적어도 하나의 구현예에서, 문헌[E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences", 제18판] 또는 다른 재판에 기재되어 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 인간 또는 비 인간 동물을 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "항 약제 항체"는 대상체에 투여되는 약제와 특이적으로 결합하고 대상체로의 약제의 투여에 대한 체액성 면역 반응의 적어도 일부분으로서 대상체에 의해 생성되는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 약제는 치료용 단백질 완제 의약품이다. 대상체에서의 항 약제 항체의 존재는, 생명을 위협하는 면역 반응을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 경증 내지 중증 범위의 면역 반응을 야기할 수 있으며, 이는 아나필락시스, 사이토카인 방출 증후군 및 주 기능을 매개하는 내인성 단백질의 교차 반응성 중화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가로 또는 대안적으로, 대상체에서의 항 약제 항체의 존재는 약제의 효율을 저하시킬 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "중화 항체"는 약제의 기능을 중화하는 작용을 하는 항 약제 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 적어도 하나의 구현예에서, 치료 단백질 완제 의약품은, 대상체에서 그 발현이 감소되거나 부재하는 내인성 단백질의 대상물이다. 적어도 하나의 구현예에서, 중화 항체는 내인성 단백질의 기능을 중화하는 작용을 할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약(about)" 및 "대략(approximately)"은, 측정 성질 또는 정확도를 감안한, 측정된 양의 허용 오차를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 오차는, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 측정을 위해 제공된 유효 숫자의 수에 의해 나타낼 수 있으며, 측정을 위해 기록된 가장 정확한 유효 숫자의 ±1의 변동을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 오차의 통상의 예는 일정한 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트(%) 내, 바람직하게는 10% 내, 및 더욱 바람직하게는 5% 내이다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템에서, 용어 "약" 및 "대략"은 일정한 값의 척도의 1배 내, 바람직하게는 5배 내 및 더욱 바람직하게는 2배 내의 값을 의미할 수 있다. 본원에 제공된 수량은, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약" 또는 "대략"이 명시되지 않은 경우에도, 유추될 수 있는 근사치이다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "동시에"는, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 동일한 시간 또는 전 또는 후의 합리적으로 짧은 시간 기간 이내를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 2종의 치료가 서로 동시에 시행되는 경우, 하나의 치료는 2종의 치료 중 후속 치료의 준비에 필요한 시간이 허용되도록, 나머지 치료의 전 또는 후에 시행될 수 있다. 따라서, 2종의 치료의 "동시 시행"은 하나의 치료 후, 20분 이하, 약 20분, 약 15분, 약 10분, 약 5분, 약 2분, 약 1분 또는 1분 미만 후에, 후속 치료가 이어지는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이, 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하고, 일반적으로 수용성 또는 지용성 또는 분산성이며, 목적 용도에 효과적인 염을 의미하는 것으로 의도된다. 이 용어는 약제학적으로-허용 가능한 산 부가 염 및 약제학적으로-허용 가능한 염기 부가 염을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[S. M. Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp. 1-19]에 적절한 염의 목록이 개진되어 있다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로-허용 가능한 산 부가 염"은, 유리 염기의 생물학적 역가 및 특성을 보유하는 그의 염을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 생물학적으로 또는 달리는 바람직하지 않게는, 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 질산, 인산 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 무기산, 및 아세트산, 트리플루오로아세트산, 아디프산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 부티르산, 캄포르산, 캄포설폰산, 신남산, 시트르산, 디글루콘산, 에탄설폰산, 글루탐산, 글리콜산, 글리세로인산, 헤미설픽산(hemisulfic acid), 헥산산, 포름산, 푸마르산, 2-하이드록시에탄설폰산(이세티온산), 젖산, 하이드록시말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메시틸렌설폰산, 메탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 니코틴산, 2-나프탈렌설폰산, 옥살산, 파모산, 펙틴산, 페닐아세트산, 3-페닐프로피온산, 피발산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 설파닐산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산, 운데카노산 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 유기산에 의해 형성되지 않는다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로-허용 가능한 염기 부가 염"은 유리 산의 생물학적 역가 및 특성을 보유하는 그의 염을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 생물학적으로 또는 달리는 바람직하지 않게는, 암모니아 또는 암모늄의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염, 또는 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등과 같은 금속 양이온을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 무기 염기에 의해 형성되지 않는다. 약제학적으로-허용 가능한 비독성 유기 염기로부터 유래하는 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 4차 아민 화합물, 자연 발생 치환 아민, 사이클릭 아민 및 염기성 이온-교환 수지를 포함하는 치환 아민, 예컨대 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 트리프로필아민, 트리부틸아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카마인, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 테트라메틸암모늄 화합물, 테트라에틸암모늄 화합물, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 폴리아민 수지 등의 염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

ATB200 rhGAA

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, 재조합 단백질, 예컨대 rhGAA)은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되며, 알글루코시다제 알파와 같은 기존의 재조합 단백질의 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여, 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 산 α-글루코시다제는 미국 특허 제10,208,299호에 기재되어 있는 바와 같이, 본원에서 ATB200으로서 지칭되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제이다. ATB200은, 높은 친화도를 가지며(약 2 nM 내지 4 nM의 K _D ), 폼페 섬유아세포 및 골격근 근아세포에 의해 효율적으로 내재화되는(약 7 nM 내지 14 nM의 K _흡수 ) 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와 결합하는 것으로 나타났다. ATB200은 생체내에서 특성화되었으며, 알글루코시다제 알파(약 60분의 t_1/2)보다 더 짧은 겉보기 혈장 반감기(약 45분의 t_1/2)를 갖는 것으로 나타났다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 효소이다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 미국 특허 제8,592,362호에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO: 1에 제시된 야생형 GAA 아미노산 서열을 가지며, GenBank 수탁 번호 AHE24104.1(GI:568760974)을 갖는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는, 관찰된 9개의 GAA 유전자 일배체형 중 가장 우성인 것에 의해 인코딩되는 인간 산 α-글루코시다제 효소인 글루코시다제 알파이다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 처음에는 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 야생형 GAA의 전장의 952개의 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되며, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 아미노산의 일부분, 예를 들어 처음 56개의 아미노산이 제거되는 세포내 가공을 거친다. 따라서, 숙주 세포에 의해 분비되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제는, 처음에 세포 내에서 발현되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제보다 더 짧은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 이러한 더 짧은 단백질은 SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 단지, 신호 펩티드 및 전구체 펩티드를 포함하는 처음 56개의 아미노산이 제거됨으로써, 896개의 아미노산을 갖는 단백질이 생성된다는 점에서, SEQ ID NO: 1과 상이하다. SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열에 대비하여, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 결실, 치환 및/또는 삽입을 갖는 것과 같은, 아미노산 수의 다른 변형이 또한 가능하다. 일부 구현예에서, rhGAA 산물은 상이한 아미노산 길이를 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자의 혼합물을 포함한다.

적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 단백질 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 번역 후 및/또는 화학적 변형을 거친다. 예를 들어, 메티오닌 및 트립토판 잔기는 산화를 거칠 수 있다. 또 다른 예로서, N-말단의 글루타민은 피로-글루타메이트(pyro-glutamate)를 형성할 수 있다. 또 다른 예로서, 아스파라긴 잔기는 아스파르트산으로의 탈아미드화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 아스파르트산 잔기는 이소-아스파르트산으로의 이성질체화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 단백질 내의 비쌍 시스테인 잔기는 유리 글루타티온 및/또는 시스테인과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이 효소는 처음에는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되며, 이러한 효소는 번역 후 및/또는 화학적 변형 중 하나 이상을 거친다. 이러한 변형은 또한 본 개시내용의 범위 내에 있다.

GAA 및 이러한 변이체 인간 GAA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 고려되며 본 발명에 따라 rhGAA를 재조합에 의해 발현시키기 위해 사용될 수 있다.

바람직하게는, 총 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 분자 중 70%, 65%, 60%, 55%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 이하는 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위가 부재하거나, 양이온 비의존성인 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와의 결합능이 부재한다. 대안적으로, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 분자 중 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% 미만 또는 그 이상은 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 적어도 하나의 N-글리칸 단위를 포함하거나 CIMPR과의 결합능을 갖는다.

재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 분자는 그의 글리칸 상에 1개, 2개, 3개 또는 4개의 만노스-6-인산염(M6P) 기를 가질 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 분자 상의 단지 하나의 N-글리칸만이 M6P(단일 인산화)를 보유할 수 있거나, 단일 N-글리칸이 2개의 M6P 기(이중 인산화)를 보유할 수 있거나, 동일한 재조합 단백질 분자 상의 2개의 상이한 N-글리칸이 각각 단일 M6P 기를 보유할 수 있다. 재조합 단백질 분자는 또한 M6P 기를 보유하지 않는 N-글리칸을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 평균적으로 N-글리칸은 3 mol/mol 초과의 M6P 및 4 mol/mol 초과의 시알산을 함유함으로써, 재조합 단백질은 평균적으로 재조합 단백질의 몰당 적어도 3 몰의 만노스-6-인산염 잔기 및 재조합 단백질의 몰당 적어도 4 몰의 시알산을 포함한다. 평균적으로, 재조합 단백질 상의 총 글리칸 중 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%가 단일-M6P 글리칸의 형태일 수 있고, 예를 들어, 총 글리칸 중 약 6.25%가 단일 M6P 기를 보유할 수 있고, 평균적으로, 재조합 단백질 상의 총 글리칸 중 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%가 이중-M6P 글리칸의 형태이며, 평균적으로 총 재조합 단백질 중 25% 미만이 CIMPR과 결합한 인산화 글리칸을 함유하지 않는다.

재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)은 0.5 mol/mol 내지 7.0 mol/mol 리소좀 단백질의 범위 또는 0.5 mol/mol, 1.0 mol/mol, 1.5 mol/mol, 2.0 mol/mol, 2.5 mol/mol, 3.0 mol/mol, 3.5 mol/mol, 4.0 mol/mol, 4.5 mol/mol, 5.0 mol/mol, 5.5 mol/mol, 6.0 mol/mol, 6.5 mol/mol 또는 7.0 mol/mol 리소좀 단백질을 포함하는 하위범위의 임의의 중간 값의 M6P를 보유하는 N-글리칸의 함량 평균값을 가질 수 있다. M6P-보유 또는 이중-M6P-보유 글리칸 수의 평균값이 상이한 리소좀 단백질 조제물을 제공하기 위해, 리소좀 단백질을 분획화함으로써, 특정 분획을 선택하거나, 상이한 분획을 선택적으로 조합함으로써, 표적 조직에서 리소좀을 표적화하는 리소좀 단백질을 추가로 지정할 수 있다.

일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)은 평균적으로, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)의 몰당 2.0 몰 내지 8.0 몰의 M6P를 보유할 것이다. 이러한 범위는 2.0 mol, 2.5 mol, 3.0 mol, 3.5 mol, 4.0 mol, 4.5 mol, 5.0 mol, 5.5 mol, 6.0 mol, 6.5 mol, 7.0 mol, 7.5 mol 및 8.0 mol M6P/mol 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)을 포함하여, 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다.

재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 N-글리칸의 최대 60%가 완전히 시알릴화될 수 있으며, 예를 들어, 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%의 N-글리칸이 완전히 시알릴화될 수 있다. 일부 구현예에서, 총 N-글리칸 중 4% 내지 20%가 완전히 시알릴화된다. 다른 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 N-글리칸 중 5%, 10%, 20% 또는 30% 이하가 시알산 및 말단 갈락토스 잔기(Gal)를 보유한다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예를 들어, 재조합 단백질 상의 총 N-글리칸 중 7% 내지 30%가 시알산 및 말단 갈락토스를 보유할 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 재조합 단백질 상의 N-글리칸 중 5%, 10%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 이하는 말단 갈락토스만을 가지며, 시알산을 함유하지 않는다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예를 들어, 조성물 중 재조합 단백질 상의 총 N-글리칸 중 8% 내지 19%는 말단 갈락토스만을 가질 수 있으며, 시알산을 함유하지 않는다.

본 발명의 다른 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 총 N-글리칸 중 40%, 45%, 50%, 55% 내지 60%가 복합체형 N-글리칸이거나; 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 총 N-글리칸 중 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% 이하가 혼성체형 N-글리칸이고/이거나; 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 고만노스형 N-글리칸 중 5%, 10% 또는 15% 이하가 비인산화된 것이고/이거나; 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 고만노스형 N-글리칸 중 적어도 5% 또는 10%가 단일-M6P 인산화된 것이고/이거나; 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 고만노스형 N-글리칸 중 적어도 1 또는 2%가 이중-M6P 인산화된 것이다. 이들 값은 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)은 전술된 함량 범위 중 하나 이상을 충족할 수 있다.

일부 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)은 평균적으로, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)의 몰당 2.0 몰 내지 8.0 몰의 시알산 잔기를 보유할 것이다. 이러한 범위는 2.0 mol, 2.5 mol, 3.0 mol, 3.5 mol, 4.0 mol, 4.5 mol, 5.0 mol, 5.5 mol, 6.0 mol, 6.5 mol, 7.0 mol, 7.5 mol 및 8.0 mol 잔기/mol 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)을 포함하여, 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 시알산 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 존재는 아시알로당단백질 수용체에 의해 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)의 비생산적 배출을 방지할 수 있는 것으로 여겨진다.

하나 이상의 구현예에서, 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)은 재조합 단백질의 특정 N-글리코실화 부위에 M6P 및/또는 시알산 단위를 갖는다. 예를 들어, 상기에 언급된 바와 같이, rhGAA 상에는 7개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위가 존재한다. 이들 잠재적 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 2의 하기의 위치에 존재한다: N84, N177, N334, N414, N596, N826 및 N869. 유사하게는, SEQ ID NO: 1의 전장의 아미노산 서열의 경우, 이들 잠재적 글리코실화 부위는 하기의 위치에 존재한다: N140, N233, N390, N470, N652, N882 및 N925. rhGAA의 다른 변이체는 아스파라긴 잔기의 위치에 따라, 유사한 글리코실화 부위를 가질 수 있다. 일반적으로, 단백질 아미노산 서열 중 ASN-X-SER 또는 ASN-X-THR의 서열은 잠재적 글리코실화 부위를 나타내며, 단, X는 HIS 또는 PRO일 수 없다.

다양한 구현예에서, rhGAA는 특정 N-글리코실화 프로파일을 갖는다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N84 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N140)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제1 N-글리코실화 부위에 이중-M6P 단위를 보유한다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N177 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N223)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제2 N-글리코실화 부위에 이중-M6P 단위를 보유한다. 하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N334 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N390)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위에 인산화된다. 예를 들어, 제3 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 비인산화된 고만노스 글리칸, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸, 및 혼성체형 글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%의 rhGAA는 제3 N-글리코실화 부위에 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 20%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N414 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N470)에서 인산화된다. 예를 들어, 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 단일-M6P 및/또는 이중-M6P 단위의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에 단일-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에 이중-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% 또는 25%의 rhGAA는 제4 N-글리코실화 부위에 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N596 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N692)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위에 인산화된다. 예를 들어, 제5 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 푸코실화된 디-안테너리 복합체 글리칸을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제5 N-글리코실화 부위에 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N826 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N882)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위에 인산화된다. 예를 들어, 제6 N-글리코실화 부위는 주종으로서, 디-, 트리- 및 테트라-안테너리 복합체 글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 rhGAA는 제6 N-글리코실화 부위에 시알릴화된다.

하나 이상의 구현예에서, 적어도 5%의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 2의 경우 N869 및 SEQ ID NO: 1의 경우 N925)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에 인산화된다. 일부 구현예에서, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 또는 65% % 미만의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에 임의의 글리칸을 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 30%, 35% 또는 40%의 rhGAA는 제7 N-글리코실화 부위에 글리칸을 갖는다.

하나 이상의 구현예에서, rhGAA 상의 N-글리칸의 40% 내지 60%는 복합 유형 N-글리칸이며; rhGAA는 rhGAA의 mol당 3.0 mol 내지 5.0 mol의 M6P 잔기를 포함한다.

다양한 구현예에서, rhGAA는 평균 rhGAA의 mol당 0 mol 내지 5 mol의 푸코스 함량, rhGAA의 mol당 10 mol 내지 30 mol의 GlcNAc 함량, rhGAA의 mol당 5 mol 내지 20 mol의 갈락토스 함량, rhGAA의 mol당 10 mol 내지 40 mol의 만노스 함량, rhGAA의 mol당 2 mol 내지 8 mol의 M6P 함량 및 rhGAA의 mol당 2 mol 내지 8 mol의 시알산 함량을 갖는다. 다양한 구현예에서, rhGAA는 평균 rhGAA의 mol당 2 mol 내지 3 mol의 푸코스 함량, rhGAA의 mol당 20 mol 내지 25 mol의 GlcNAc 함량, rhGAA의 mol당 8 mol 내지 12 mol의 갈락토스 함량, rhGAA의 mol당 22 mol 내지 27 mol의 만노스 함량, rhGAA의 mol당 3 mol 내지 5 mol의 M6P 함량 및 rhGAA의 mol당 4 mol 내지 7 mol의 시알산 함량을 갖는다.

재조합 단백질(예를 들어, rhGAA)은 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO 세포주 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14에 의하거나, 이러한 CHO 세포 배양의 계대배양물 또는 유도체에 의해 생성된다. 산 α-글루코시다제의 대립유전자 변이체 또는 다른 변이체 산 α-글루코시다제 아미노산 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 발현하는 DNA 작제물이 CHO 세포에서 작제되고 발현될 수 있다. 이들 변이체 산 α-글루코시다제 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 대비하여, 결실, 치환 및/또는 삽입을 함유할 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열에 대비하여, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 결실, 치환 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 당업자는 이러한 DNA 작제물의 생성을 위해, CHO 세포의 형질전환에 적절한 대안적 벡터를 선택할 수 있다.

GCG 서열 분석 패키지(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 위스콘신 대학)의 일부로서 이용 가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함하여, 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 2개의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 디폴트 설정으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 구체적 폴리펩티드와 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드뿐만 아니라, 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 달리 명시되지 않는 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용을 기반으로 할 것이다. BLASTP가 사용되는 경우, 유사성 퍼센트는 BLASTP 양의 점수를 기반으로 하며, 서열 동일성 퍼센트는 BLASTP 동일성 점수를 기반으로 한다. BLASTP "동일성"은 높은 점수의 서열 쌍에서의 동일한 총 잔기의 수 및 분획을 나타내고; BLASTP "양성"은, 정렬 점수가 양의 값을 가지며, 서로 유사한 잔기의 수 및 분획을 나타낸다. 본원에 개시된 아미노산 서열에 대해 이러한 동일성 또는 유사성 정도 또는 임의의 중간 정도의 유사성의 동일성을 갖는 아미노산 서열이 고려되며, 본 개시내용에 의해 포괄된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 코드를 사용하여 추론되며, 이는 통상의 수단, 특히, 유전자 코드를 사용한 아미노산 서열의 역번역에 의해 얻을 수 있다.

미국 특허 제10,208,299호에 기재된 바와 같이, 생체내에서 그의 비생산적 배출을 감소시키는 글리코실화 패턴뿐만 아니라, 양이온-비의존성 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR) 및 세포 리소좀을 표적화하는 월등한 능력을 가진 재조합 인간 산 α-글루코시다제가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 세포는, 알글루코시다제 알파와 같은 기존의 재조합 인간 산 α-글루코시다제 산물보다 유의하게 더 고수준의, 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 발현시키도록 유도될 수 있다. 예를 들어, ATB200에 의해 예시된 바와 같이, 이들 세포에 의해 생성된 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 루미자임®과 같은 기존의 산 α-글루코시다제보다 유의하게 더 많은 근육 세포-표적화 만노스-6-인산염(M6P) 및 이중-만노스-6-인산염 N-글리칸 잔기를 갖는다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이러한 광범위한 글리코실화에 의해, ATB200 효소가 더욱 효율적으로 표적 세포 내로 흡수될 수 있게 됨으로써, 예를 들어, 훨씬 더 낮은 M6P 및 이중-M6P 함량을 갖는 알글루코시다제 알파와 같은 다른 재조합 인간 산 α-글루코시다제보다 더욱 효율적으로 순환계로부터 배출될 수 있게 되는 것으로 여겨진다. ATB200은 CIMPR과 효율적으로 결합하고 골격근 및 심근에 의해 효율적으로 흡수되며, 유리한 약동학적 프로파일을 제공하고 생체내에서 비생산적인 배출을 감소시키는 글리코실화 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다.

또한, ATB200의 광범위한 글리코실화가, 예를 들어, 알글루코시다제 알파와 비교하여, ATB200의 면역원성의 감소에 기여할 수 있는 것으로 고려된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 포유류 당이 보존된 단백질의 글리코실화는 일반적으로 산물의 용해도를 증대시키며, 산물의 응집 및 면역원성을 감소시킨다. 글리코실화는, 면역계로부터 면역원성 단백질 에피토프를 보호할 뿐만 아니라, 단백질 응집을 최소화함으로써 단백질의 면역원성을 간접적으로 변이시킨다(문헌[Guidance for Industry - Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein products, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research, August 2014]). 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여는 항 약제 항체를 유도하지 않는다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여는 대상체에서, 알글루코시다제 알파의 투여에 의해 유도되는 항 약제 항체의 수준보다 더 낮은 항 약제 항체의 발생을 유도한다.

미국 특허 제10,208,299호에 기재된 바와 같이, CHO 세포와 같은 세포가 상기 문헌 내에 기재된 rhGAA를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 이러한 rhGAA는 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 CHO 세포주의 예는 상기 문헌 내에 기재된 바와 같은 rhGAA 조성물을 생성하는 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14 또는 그의 계대배양물이다. 이러한 CHO 세포주는 GAA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5개, 10개, 15개 또는 20개 이상의 복제물과 같은 다수의 유전자 복제물을 함유할 수 있다.

고 M6P 및 이중-M6P rhGAA, 예컨대 ATB200 rhGAA는, GAA를 인코딩하는 DNA 작제물에 의해 CHO 세포를 형질전환시킴으로써 생성될 수 있다. CHO 세포는 rhGAA의 제조에 종래부터 사용되어 왔으나, 형질전환된 CHO 세포가, CIMPR을 표적화하는 M6P 및 이중-M6P 글리칸의 고 함량을 갖는 rhGAA를 생성하는 방식으로 배양되고 선택될 수 있음은 이해되지 않았다.

놀랍게도, CHO 세포주를 형질전환시키고, CIMPR을 표적화하는 M6P 또는 이중-M6P를 보유하는 글리칸의 고 함량을 함유하는 rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선택하며, 이러한 고-M6P rhGAA를 안정하게 발현시키는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 CHO 세포주의 제조 방법이 또한 미국 특허 제10,208,299호에 기재되어 있다. 이러한 방법은 GAA 또는 GAA 변이체를 인코딩하는 DNA에 의해 CHO 세포를 형질전환시키는 단계, GAA를 인코딩하는 DNA를 그의 염색체(들) 내로 안정하게 혼입시키고, GAA를 안정하게 발현하는 CHO 세포를 선택하는 단계 및 M6P 또는 이중-M6P를 보유하는 글리칸의 고 함량을 갖는 GAA를 발현하는 CHO 세포를 선택하는 단계, 및 선택적으로, 시알산 함량이 높은 N-글리칸을 가지고/가지거나 비인산화된 고만노스 함량이 낮은 N-글리칸을 갖는 CHO 세포를 선택하는 단계를 포함한다.

CHO 세포주를 배양하고, CHO 세포의 배양물로부터 상기 조성물을 회수함으로써, 이들 CHO 세포주를 사용하여 rhGAA 및 rhGAA 조성물을 생성할 수 있다.

생물학적 제제의 생성, 포획 및 정제

본 발명의 다양한 구현예는 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 인간 리소좀 단백질, 예컨대 rhGAA, 항체 및 바이러스 입자를 포함하는 재조합 단백질)의 생성 및/또는 포획 및/또는 정제 방법에 관한 것이다. 생물학적 제제의 생성, 포획 및 정제를 위한 예시적인 선행 기술의 공정(600)을 도 5에 도시한다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따른 생물학적 제제의 생성, 포획 및 정제를 위한 예시적인 공정을 도 6 및 7에 도시한다. 도 6은 2개의 포획 칼럼(예를 들어, AEX 칼럼) 및 1개의 정제 칼럼(예를 들어, IMAC 칼럼)을 갖는 구성을 도시하는 반면, 도 7은 2개의 포획 칼럼(예를 들어, AEX 칼럼) 및 2개의 정제 칼럼(예를 들어, IMAC 칼럼)을 갖는 구성을 도시한다.

도 5 내지 도13에서, 화살표는 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 인간 리소좀 단백질, 예컨대 rhGAA)를 함유하는 다양한 액상에 대한 이동 방향을 표시한다. 생물반응기(601)는 생물학적 제제(예를 들어, rhGAA)를 생성하는 세포, 예컨대 CHO 세포의 배양물을 함유한다. 생물학적 제제는 재조합 단백질, 항체 및 바이러스 입자를 포함한다. 재조합 단백질은 분비된 단백질, 막 단백질 또는 세포내 단백질일 수 있다. 생물반응기(610)는 세포를 배양하기 위해 적절한 임의의 생물반응기, 예컨대 관류, 배치 또는 유가식(fed-batch) 생물반응기일 수 있다. 다양한 구현예에서, 생물반응기는 약 1 L 내지 약 20,000 L의 용적을 갖는다. 예시적 생물반응기 용적은 약 1 L, 약 10 L, 약 20 L, 약 30 L, 약 40 L, 약 50 L, 약 60 L, 약 70 L, 약 80 L, 약 90 L, 약 100 L, 약 150 L, 약 200 L, 약 250 L, 약 300 L, 약 350 L, 약 400 L, 약 500 L, 약 600 L, 약 700 L, 약 800 L, 약 900 L, 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 약 2,500 L, 약 3,000 L, 약 3,500 L, 약 4,000 L, 약 5,000 L, 약 6,000 L, 약 7,000 L, 약 8,000 L, 약 9,000 L, 약 10,000 L, 약 15,000 L 및 약 20,000 L를 포함한다.

도 5 내지 도 13에 도시된 바와 같이, 배지 및/또는 세포 현탁액이 생물반응기로부터 회수될 수 있다. 이러한 회수는 관류 생물반응기에 있어서 연속일 수 있거나 배치 또는 유가식 반응기에 있어서 배치식(batchwise)일 수 있다. 배지 및/또는 세포 현탁액은 가공되어 세포 현탁 가공 시스템(603)을 통해 생물학적 제제를 함유하는 여과물을 분리한다. 하나 이상의 구현예에서, 세포 현탁액 가공 시스템은 세포 용해, 여과, 원심분리 및 막 가용화의 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 제제는 분비된 재조합 단백질이다. 일부 구현예에서, 배지로부터 회수된 세포는 생물반응기로 재도입되며 분비된 재조합 단백질을 포함하는 배지는 추가 가공될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액 가공 시스템(603)은 여과 시스템을 포함한다. 여과 시스템은 교대 접선 유동 여과(ATF) 시스템, 접선 유동 여과(TFF) 시스템, 원심분리 여과 시스템 등을 포함하는 임의의 적절한 여과 시스템일 수 있다. 다양한 구현예에서, 여과 시스템은 약 10 나노미터 내지 약 2 마이크로미터의 공극 크기를 갖는 필터를 사용한다. 예시적 필터 공극 크기는 약 10 nm, 약 20 nm, 약 30 nm, 약 40 nm, 약 50 nm, 약 60 nm, 약 70 nm, 약 80 nm, 약 90 nm, 약 100 nm, 약 150 nm, 약 200 nm, 약 250 nm, 약 300 nm, 약 350 nm, 약 400 nm, 약 500 nm, 약 600 nm, 약 700 nm, 약 800 nm, 약 900 nm, 약 1 μm, 약 1.5 μm 및 약 2 μm를 포함한다.

다양한 구현예에서, 배지 및/또는 세포 현탁액 회수 속도는 약 1 L/일 내지 약 20,000 L/일이다. 예시적 배지 및/또는 세포 현탁액 회수 속도는 약 1 L/일, 약 10 L/일, 약 20 L/일, 약 30 L/일, 약 40 L/일, 약 50 L/일, 약 60 L/일, 약 70 L/일, 약 80 L/일, 약 90 L/일, 약 100 L/일, 약 150 L/일, 약 200 L/일, 약 250 L/일, 약 300 L/일, 약 350 L/일, 약 400 L/일, 약 500 L/일, 약 600 L/일, 약 700 L/일, 약 800 L/일, 약 900 L/일, 약 1,000 L/일, 약 1,500 L/일, 약 2,000 L/일, 약 2,500 L/일, 약 3,000 L/일, 약 3,500 L/일, 약 4,000 L/일, 약 5,000 L/일, 약 6,000 L/일, 약 7,000 L/일, 약 8,000 L/일, 약 9,000 L/일, 약 10,000 L/일, 약 15,000 L/일 및 약 20,000 L/일을 포함한다. 대안적으로, 배지 및/또는 세포 현탁액 회수 속도는 약 0.1 내지 약 3 반응기 용적/일과 같이, 생물반응기 용적의 함수로서 표시될 수 있다. 예시적 배지 및/또는 세포 현탁액 회수 속도는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 2, 약 2.5 및 약 3 반응기 용적/일을 포함한다.

연속식 또는 유가식 공정의 경우, 새로운 배지가 생물반응기에 제공되는 속도는 약 1 L/일 내지 약 20,000 L/일 수 있다. 예시적 배지 도입 속도는 약 1 L/일, 약 10 L/일, 약 20 L/일, 약 30 L/일, 약 40 L/일, 약 50 L/일, 약 60 L/일, 약 70 L/일, 약 80 L/일, 약 90 L/일, 약 100 L/일, 약 150 L/일, 약 200 L/일, 약 250 L/일, 약 300 L/일, 약 350 L/일, 약 400 L/일, 약 500 L/일, 약 600 L/일, 약 700 L/일, 약 800 L/일, 약 900 L/일, 약 1,000 L/일, 약 1,500 L/일, 약 2,000 L/일, 약 2,500 L/일, 약 3,000 L/일, 약 3,500 L/일, 약 4,000 L/일, 약 5,000 L/일, 약 6,000 L/일, 약 7,000 L/일, 약 8,000 L/일, 약 9,000 L/일, 약 10,000 L/일, 약 15,000 L/일 및 약 20,000 L/일을 포함한다. 대안적으로, 배지 도입 속도는 약 0.1 내지 약 3 반응기 용적/일과 같이, 생물반응기 용적의 함수로서 표시될 수 있다. 예시적 배지 도입 속도는 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1, 약 1.1, 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 2, 약 2.5 및 약 3 반응기 용적/일을 포함한다.

세포 현탁액 가공 시스템을 통해 가공된 후, 수집된 여과물은 포획 시스템(605) 상으로 로딩된다. 포획 시스템(605)은 하나 이상의 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있다.

도 6에서, 포획 시스템(605)은 2개의 포획 칼럼(605a 및 605b)을 포함한다. 도 13은 2개의 크로마토그래피 시스템을 도시하며 여기서 각각의 시스템은 단일 포획 칼럼을 포함한다. 즉 포획 칼럼(605a)은 하나의 크로마토그래피 시스템의 일부이고 포획 칼럼(605b)은 별도의, 그러나 동일한 크로마토그래피 시스템의 일부이다. 도 6 및 도 12 둘 모두에서, 포획 칼럼은 포획 칼럼(605a)의 통과액이 포획(605b)으로 흐르지 않도록 병렬로 배열된다. 오히려, 일단 포획 칼럼(605a)이 로딩되면, 밸브(604)는 포획 칼럼(605a) 대신 제2 포획 칼럼(605b)으로 여과물의 흐름의 방향을 바꾼다. 하나 이상의 구현예에서, 포획 칼럼(605a 및 605b)의 로딩은 칼럼 사이에서 앞뒤로 순환되어 생물반응기로부터 포획 칼럼 상으로 배지의 연속 로딩이 가능하게 한다. 2개를 초과하는 포획 칼럼이 사용되면, 칼럼은 순차적으로 또는 상이한 순서로 로딩될 수 있다.

도 7 내지 도 10은 2개의 포획 칼럼, 포획 칼럼 1 및 포획 칼럼 2를 기재하며, 정제 칼럼은 생물학적 제제의 연속 정제를 위해 순차적으로 작동한다. 도 7에서, 포획 칼럼 l에는 생물학적 제제를 함유하는 여과물이 로딩된다. 도 8에서, 포획된 생물학적 제제는 포획 칼럼 l로부터 용리되고 정제 칼럼 상으로 로딩되면서 동시에 여과물은 포획 칼럼 2 상으로 로딩된다. 도 9에서, 포획된 생물학적 제제는 포획 칼럼 2로부터 용리되고 정제 칼럼 상에 로딩되면서 동시에 여과물은 포획 칼럼 1 상으로 로딩된다. 도 10에서, 정제된 생물학적 제제는 정제 칼럼으로부터 용리된다.

다양한 구현예에서, 포획 시스템(605)은 생물학적 제제의 직접적 산물 포획을 위해 하나 이상의 포획 칼럼(예를 들어, AEX)을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 칼럼은 AEX 칼럼이며 생물학적 제제는 분비된 재조합 단백질, 특히 고 M6P 함량을 갖는 리소좀 단백질이다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 여과된 배지로부터 재조합 단백질을 포획하기 위한 AEX 크로마토그래피의 사용은, 하나 이상의 M6P 기를 갖는 재조합 단백질의 더 많은 음 전하로 인해, 포획된 재조합 단백질 산물이 더 높은 M6P 함량을 갖도록 보장하는 것으로 사료된다. 결과적으로, 비인산화된 재조합 단백질 및 숙주 세포 불순물은 칼럼 수지와 결합하지 않을 뿐만 아니라, 고도로 인산화된 재조합 단백질, 및 비인산화된 재조합 단백질 및 숙주 세포 불순물은 칼럼을 통해 통과된다. 따라서, AEX 크로마토그래피를 사용하여, AEX 수지에 대한 M6P-함유 단백질의 높은 친화도로 인해 단백질 산물의 M6P 함량을 부화시킬 수 있다(즉, 더 많은 M6P를 갖는 단백질을 선택할 수 있음).

추가로, 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 또한, AEX 크로마토그래피를 사용한 재조합 단백질의 직접적 산물 포획의 존재가, 단백분해효소 및 단백질을 분해할 수 있고/있거나 단백질을 탈인산화시킬 수 있는 다른 효소를 함유하는 배지로부터 높은 M6P 함량을 갖는 재조합 단백질이 회수되는 것을 보장하는 것으로 사료된다. 결과적으로, 고품질의 산물이 보존된다.

적절한 AEX 크로마토그래피 칼럼은, 음으로 하전된 분자, 예컨대 음으로 하전된 단백질과 결합하는 화학적 작용기를 갖는다. 예시적 작용기는 1차, 2차, 3차 및 4차 암모늄 또는 아민기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 작용기는 막(예를 들어, 셀룰로스 막) 또는 통상의 크로마토그래피 수지와 결합할 수 있다. 예시적 칼럼 배지는 GE Healthcare Lifesciences로부터의 SP, CM, Q 및 DEAE Sepharose® Fast Flow 배지를 포함한다.

관심 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 단백질)에 따라, 다른 포획 칼럼이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, CEX, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 및/또는 IMAC 칼럼이 또한 포획 칼럼으로 사용될 수 있다. 다른 포획 칼럼은 또한 생물학적 제제에 특이적인 항체를 포함하는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 칼럼이 항체를 포획하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 칼럼이 바이러스 입자를 포획하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A 칼럼 및 단백질 Z 칼럼을 포함한다. 일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피 칼럼이 포획 칼럼으로 사용될 수 있다.

포획 칼럼(예를 들어, AEX 칼럼)의 용적은 임의의 적절한 용적, 예컨대 0.1 L 내지 1,000 L일 수 있다. 예시적 칼럼 용적은 약 0.1 L, 약 0.2 L, 약 0.3 L, 약 0.4 L, 약 0.5 L, 약 0.6 L, 약 0.7 L, 약 0.8 L, 약 0.9 L, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 약 10 L, 약 20 L, 약 30 L, 약 40 L, 약 50 L, 약 60 L, 약 70 L, 약 80 L, 약 90 L, 약 100 L, 약 150 L, 약 200 L, 약 250 L, 약 300 L, 약 350 L, 약 400 L 및 약 500 L, 약 600 L, 약 700 L, 약 800 L, 약 900 L 및 약 1,000 L를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 포획 칼럼(예를 들어, AEX 칼럼)은 생물반응기 크기 및/또는 포획 칼럼 상으로 로딩되는 여과물의 유속에 비해 상대적으로 작다. 하나 이상의 구현예에서, 생물반응기 용적 대 총 포획 칼럼 용적의 비는 약 약 500:1 내지 약 10:1의 범위이다. 예시적인 비는 약 500:1, 약 450:1, 약 400:1, 약 350:1, 약 300:1, 약 250:1, 약 200:1, 약 150:1, 약 100:1, 약 90:1, 약 80:1, 약 70:1, 약 60:1, 약 50:1, 약 40:1, 약 30:1, 약 20:1 및 약 10:1을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 총 포획 칼럼 체류 시간(예를 들어, 총 AEX 칼럼 체류 시간)은 0.5분 내지 200분의 범위이다. 예시적인 총 포획 칼럼 체류 시간은 0.5분, 1분, 1.5분, 2분, 2.5분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 110분, 120분, 130분, 140분, 150분, 160분, 170분, 180분, 190분 및 200분을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 시간 당 약 0.5 CV 내지 약 100 CV의 범위의 여과물 로딩 속도로 적어도 2개의 포획 칼럼 상에 로딩된다. 예시적인 여과물 로딩 속도는 시간 당 약 0.5 CV, 약 1 CV, 약 2 CV, 약 3 CV, 약 4 CV, 약 5 CV, 약 6 CV, 약 7 CV, 약 8 CV, 약 9 CV, 약 10 CV, 약 11 CV, 약 12 CV, 약 13 CV, 약 14 CV, 약 15 CV, 약 20 CV, 약 25 CV, 약 30 CV, 약 35 CV, 약 40 CV, 약 45 CV, 약 50 CV, 약 55 CV, 약 60 CV, 약 65 CV, 약 70 CV, 약 75 CV, 약 80 CV, 약 85 CV, 약 90 CV, 약 95 CV 및 약 100 CV를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 여과물은 분 당 약 10 mL 내지 약 10,000 mL의 범위의 여과물 로딩 속도로 적어도 2개의 포획 칼럼 상에 로딩된다. 예시적인 여과물 로딩 속도는 분 당 약 10 mL, 약 11 mL, 약 12 mL, 약 13 mL, 약 14 mL, 약 15 mL, 약 20 mL, 약 25 mL, 약 30 mL, 약 35 mL, 약 40 mL, 약 45 mL, 약 50 mL, 약 55 mL, 약 60 mL, 약 65 mL, 약 70 mL, 약 75 mL, 약 80 mL, 약 85 mL, 약 90 mL, 약 95 mL, 약 100 mL, 약 150 mL, 약 200 mL, 약 250 mL, 약 300 mL, 약 350 mL, 약 400 mL, 약 450 mL, 약 500 mL, 약 550 mL, 약 600 mL, 약 650 mL, 약 700 mL, 약 750 mL, 약 800 mL, 약 850 mL, 약 900 mL, 약 950 mL, 약 1,000 mL, 약 1,100 mL, 약 1,200 mL, 약 1,300 mL, 약 1,400 mL, 약 1,500 mL, 약 2,000 mL, 약 2,500 mL, 약 3,000 mL, 약 3,500 mL, 약 4,000 mL, 약 4,500 mL, 약 5,000 mL, 약 6,000 mL, 약 7,000 mL, 약 8,000 mL, 약 9,000 mL 및 약 10,000 mL을 포함한다.

예시적 AEX 칼럼 조건이 아래에서 표 2에 제공된다:

생물학적 제제 함유 여과물이 포획 시스템(605) 상으로 로딩된 후, 생물학적 제제는 칼럼에서 pH 및/또는 염 함량을 변화시킴으로써 칼럼(들)으로부터 용리된다.

용리된 생물학적 제제는 추가 정제 단계 및/또는 품질 보증 단계를 거칠 수 있다. 예를 들어, 도 5에 도시된 바와 같이, 용리된 생물학적 제제는 바이러스 사멸 단계(607)를 거칠 수 있다. 이러한 바이러스 사멸(607)은 낮은 pH 사멸, 계면활성제 사멸, 또는 당업계에 공지된 다른 기법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 생물학적 제제는 다른 요망되지 않는 바이러스보다 더 강력한 바이러스 입자(예를 들어, AAV)이다. 이러한 구현예에서, 바이러스 사멸 단계는 또한 요망되지 않는 바이러스를 선택적으로 사멸시키기 위해 수행될 수 있다.

도 5에 도시된 임의의 단계는 또한 바이러스 사멸, 추가적인 크로마토그래피 시스템, 추가적인 여과, 최종 산물 조정 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 도 6 및 도 7에 나타낸 시스템에 적용될 수 있다.

바이러스 사멸 단계(607)로부터의 생물학적 제제 산물은 제2 크로마토그래피 시스템(609) 내로 도입되어 생물학적 제제 산물을 추가 정제할 수 있다. 대안적으로, 포획 시스템(605)으로부터 용리된 생물학적 제제는 제2 크로마토그래피 시스템(609)으로 직접 공급될 수 있다. 다양한 구현예에서, 제2 크로마토그래피 시스템(609)은 하나 이상의 정제 칼럼을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 칼럼은 불순물의 추가 제거를 위한 IMAC 칼럼을 포함한다. 예시적인 금속 이온은 코발트, 니켈, 구리, 철, 아연 또는 갈륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 칼럼은 불순물의 추가 제거를 위한 AEX 칼럼을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 칼럼은 불순물의 추가 제거를 위한 CEX 칼럼을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 칼럼은 불순물의 추가 제거를 위한 친화도 칼럼(예를 들어, 단백질 A 칼럼 또는 단백질 Z 칼럼)을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 칼럼은 불순물의 추가 제거를 위한 크기 배제 칼럼을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제 칼럼은 불순물의 추가 제거를 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼을 포함한다.

제2 크로마토그래피 칼럼(예를 들어, IMAC 칼럼)의 용적은 임의의 적절한 용적, 예컨대 0.01 L 내지 100 L일 수 있다. 예시적 칼럼 용적은 약 0.01 L, 약 0.02 L, 약 0.03 L, 약 0.04 L, 약 0.05 L, 약 0.06 L, 약 0.07 L, 약 0.08 L, 약 0.09 L, 약 0.1 L, 약 0.2 L, 약 0.3 L, 약 0.4 L, 약 0.5 L, 약 0.6 L, 약 0.7 L, 약 0.8 L, 약 0.9 L, 약 1 L, 약 1.5 L, 약 2 L, 약 2.5L, 약 3 L, 약 3.5 L, 약 4 L, 약 4.5 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 약 10 L, 약 15 L, 약 20 L, 약 25 L, 약 30 L, 약 35 L, 약 40 L 및 약 50 L, 약 60 L, 약 70 L, 약 80 L, 약 90 L 및 약 100 L를 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 포획 칼럼으로부터의 용리액은 분 당 약 10 mL 내지 약 30,000 mL의 범위의 로딩 속도로 하나 이상의 정제 칼럼 상에 로딩된다. 예시적인 정제 칼럼 로딩 속도는 분 당 약 10 mL, 약 11 mL, 약 12 mL, 약 13 mL, 약 14 mL, 약 15 mL, 약 20 mL, 약 25 mL, 약 30 mL, 약 35 mL, 약 40 mL, 약 45 mL, 약 50 mL, 약 55 mL, 약 60 mL, 약 65 mL, 약 70 mL, 약 75 mL, 약 80 mL, 약 85 mL, 약 90 mL, 약 95 mL, 약 100 mL, 약 150 mL, 약 200 mL, 약 250 mL, 약 300 mL, 약 350 mL, 약 400 mL, 약 450 mL, 약 500 mL, 약 550 mL, 약 600 mL, 약 650 mL, 약 700 mL, 약 750 mL, 약 800 mL, 약 850 mL, 약 900 mL, 약 950 mL, 약 1,000 mL, 약 1,100 mL, 약 1,200 mL, 약 1,300 mL, 약 1,400 mL, 약 1,500 mL, 약 2,000 mL, 약 2,500 mL, 약 3,000 mL, 약 3,500 mL, 약 4,000 mL, 약 4,500 mL, 약 5,000 mL, 약 6,000 mL, 약 7,000 mL, 약 8,000 mL, 약 9,000 mL, 약 10,000 mL, 약 15,000 mL, 약 20,000 mL, 약 25,000 mL 및 약 30,00 mL을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 생물반응기 용적 대 총 정제 칼럼 용적의 비는 약 5,000:1 내지 약 50:1의 범위이다. 예시적인 비는 약 5,000:1, 약 4,500:1, 약 4,000:1, 약 3,500:1, 약 3,000:1, 약 2,500:1, 약 2,000:1, 약 1,500:1, 약 1,000:1, 약 900:1, 약 800:1, 약 700:1, 약 600:1, 약 500:1, 약 400:1, 약 300:1, 약 200:1, 약 150:1, 약 100:1, 약 90:1, 약 80:1, 약 70:1, 약 60:1 및 약 50:1을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, 총 포획 칼럼 용적 대 총 정제 칼럼 용적의 비는 약 20:1 내지 약 1:1의 범위이다. 예시적인 비는 약 20:1, 약 15:1, 약 10:1, 약 9:1, 약 8:1, 약 7:1, 약 6:1, 약 5:1, 약 4.5:1, 약 4:1, 약 3.5:1, 약 3:1, 약 2.5:1, 약 2:1, 약 1.9:1, 약 1.8:1, 약 1.7:1, 약 1.6:1, 약 1.5:1, 약 1.4:1, 약 1.3:1, 약 1.2:1, 약 1.1:1 및 약 1:1을 포함한다.

예시적 IMAC 칼럼 조건이 아래에서 표 3에 제공된다:

여과물을 함유하는 생물학적 제제를 제2 크로마토그래피 시스템(609) 상으로 로딩한 후, 생물학적 제제가 칼럼(들)으로부터 용리된다. 도 5에 도시된 바와 같이, 용리된 생물학적 제제는 바이러스 사멸 단계(611)를 거칠 수 있다. 바이러스 사멸(607)에 의한 것과 같이, 바이러스 사멸(611)은 낮은 pH 사멸, 계면활성제 사멸 또는 당업계에 공지된 다른 기법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 사멸(607) 또는 (611) 중 하나만이 사용되거나, 바이러스 사멸이 정제 공정 중 동일한 단계에 수행된다.

하나 이상의 구현예에서, 제2 크로마토그래피 시스템(609)으로부터의 용리액은 저장될 수 있다. 예를 들어, rhGAA, 예컨대 ATB200은 IMAC 용리액 중에서 특히 안정할 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 크로마토그래피 시스템으로부터의 용리액(예를 들어, IMAC 용리액)은 24시간 내지 105일의 기간 동안 0℃ 내지 10℃의 온도에서 저장된다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 크로마토그래피 시스템으로부터의 용리액은 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80일, 85일, 90일, 95일, 100일 또는 105일 동안 저장된다. 하나 이상의 구현예에서, 제2 크로마토그래피 시스템으로부터의 용리액은 1시간 내지 3일의 기간 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 저장된다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 바이러스 사멸 단계(611)로부터의 생물학적 제제 산물은 제3 크로마토그래피 시스템(613) 내로 도입되어 생물학적 제제 산물을 추가 정제할 수 있다. 대안적으로, 제2 크로마토그래피 시스템(609)으로부터 용리된 생물학적 제제는 제3 크로마토그래피 시스템(613)으로 직접 공급될 수 있다. 다양한 구현예에서, 제3 크로마토그래피 시스템(613)은 불순물의 추가 제거를 위한 하나 이상의 AEX 칼럼, CEX 칼럼, 크기 배제 칼럼, 친화도 칼럼, 소수성 상호작용 크로마토그래피 칼럼 및/또는 SEC 칼럼을 포함한다. 이어서 생물학적 제제 산물이 제3 크로마토그래피 시스템(613)으로부터 용리된다.

제3 크로마토그래피 칼럼(예를 들어, CEX 또는 SEC 칼럼)의 용적은 임의의 적절한 용적, 예컨대 0.01 L 내지 200 L일 수 있다. 예시적 칼럼 용적은 약 0.01 L, 약 0.02 L, 약 0.03 L, 약 0.04 L, 약 0.05 L, 약 0.06 L, 약 0.07 L, 약 0.08 L, 약 0.09 L, 약 0.1 L, 약 0.2 L, 약 0.3 L, 약 0.4 L, 약 0.5 L, 약 0.6 L, 약 0.7 L, 약 0.8 L, 약 0.9 L, 약 1 L, 약 1.5 L, 약 2 L, 약 2.5L, 약 3 L, 약 3.5 L, 약 4 L, 약 4.5 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 약 10 L, 약 15 L, 약 20 L, 약 25 L, 약 30 L, 약 35 L, 약 40 L 및 약 50 L, 약 60 L, 약 70 L, 약 80 L, 약 90 L, 약 100 L, 약 150 L 및 약 200 L를 포함한다.

예시적 CEX 칼럼 조건이 아래에서 표 4에 제공된다:

생물학적 제제 산물은 또한 추가 가공을 거칠 수 있다. 예를 들어, 또 다른 여과 시스템(615)을 사용하여, 바이러스를 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 여과는 5 nm 내지 50 μm의 공극 크기를 갖는 필터를 사용한다. 다른 산물 가공은, 생물학적 제제 산물이 최종 산물 제형을 위해, 멸균되고, 여과되고, 농축되고, 저장되고/되거나, 첨가되는 추가의 성분을 가질 수 있는 산물 조정 단계(617)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 제제 산물은 2배 내지 10배의 배수로 농축될 수 있다. 이러한 최종 산물을 사용하여, 바이알을 충전할 수 있으며, 추후 사용을 위해, 동결건조시킬 수 있다.

생물학적 제제의 투여

통상의 절차에 따라, 생물학적 제제 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 인류 투여용으로 조정된 약제학적 조성물로서 제형화할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위의 통증을 완화하기 위해, 가용화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은, 예를 들어, 활성 제제의 정량이 표시된 앰플 또는 포와 같은 밀폐형 밀봉 용기 내에 동결건조된 건조 분말 또는 물 무함유 농축물로서, 단위 투여 형태로 개별적으로 또는 함께 혼합되어 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 이는 약제학적 등급의 멸균수, 염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병에 의해 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수 앰플이 제공될 수 있다.

일부 구현예에서, 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 단백질, 예컨대 rhGAA)(또는 생물학적 제제를 함유하는 조성물 또는 의약품)은 적절한 경로에 의해 투여된다. 일 구현예에서, 생물학적 제제는 정맥내로 투여된다. 다른 구현예에서, 생물학적 제제(예를 들어, rhGAA)는 심근 또는 골격근(예를 들어, 근육내) 또는 신경계(예를 들어, 뇌 내로의 직접 주사; 뇌실내; 뇌척수액내)와 같은 표적 조직으로의 직접 투여에 의해 투여된다. 요망되는 경우, 1종 초과의 경로가 동시에 사용될 수 있다.

생물학적 제제(예를 들어, 재조합 단백질, 예컨대 rhGAA)(또는 생물학적 제제를 함유하는 조성물 또는 의약품)은 치료 유효량(예를 들어, 정기적 간격으로 투여되는 경우, 질병 관련 증상을 완화하고, 질병의 발병을 예방하거나, 지연시키고/시키거나, 질병 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시킴으로써, 질병을 치료하기에 충분한 투여량)으로 투여된다. 질병의 치료에 치료적으로 유효한 양은 질병의 효과의 성질 및 정도에 따라 다를 것이며, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 최적의 투여량 범위의 확인을 위해, 시험관내 또는 생체내 검정이 선택적으로 사용될 수 있다. 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질병의 중증도에 따라 다를 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래하는 용량-반응 곡선으로부터 추산될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 예컨대 약 5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 통상적으로 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 생물학적 제제는 재조합 단백질이다. 일부 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg 또는 약 100 mg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여된다. 특정 개체를 위한 유효 용량은 개체의 필요에 따라, 시간 경과에 따라 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)할 수 있다. 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 존재하는 때 또는 항-산 α-글루코시다제 항체가 존재하거나 증가하는 경우, 또는 질병 증상이 악화되는 경우, 양이 증가할 수 있다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제(또는, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 함유하는 조성물 또는 의약품)의 치료 유효량이 질병의 효과의 성질과 정도 및 진행중의 기준에 따라, 정기적 간격으로 투여된다. 본원에 사용되는 바와 같이, "정기적 간격"의 투여는 치료 유효량이 주기적으로(1회 용량과 구별됨) 투여되는 것을 나타낸다. 간격은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 매월, 격월; 매주; 매주 2회; 또는 매일 투여된다. 단일 개체에 대한 투여 간격은 일정한 간격일 필요는 없지만, 개체의 필요에 따라, 시간 경과에 따라 변화할 수 있다. 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 존재하는 때, 항-재조합 인간 산 α-글루코시다제 항체가 존재하거나 증가하는 경우, 또는 질병 증상이 악화되는 경우, 용량간의 간격이 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg 또는 200 mg 효소/kg 체중의 치료 유효량이 샤프론의 존재 또는 부재하에 1주일에 2회, 매주 또는 매격주 투여된다.

생물학적 제제(예를 들어, 재조합 단백질, 예컨대 rhGAA)은 추후 사용을 위해, 예컨대 단위 용량 바이알 또는 주사기, 또는 정맥내 투여용 병 또는 백(bag)으로 제조될 수 있다. 생물학적 제제(예를 들어, 재조합 단백질, 예컨대 rhGAA)뿐만 아니라, 선택적 부형제 또는 다른 활성 성분, 예컨대 샤프론 또는 다른 약제를 함유하는 키트는 포장재 내에 동봉될 수 있으며, 폼페병 환자와 같이 치료를 필요로 하는 대상체의 치료를 위해, 재구성, 희석 또는 투약을 위한 지침이 함께 제공될 수 있다.

rhGAA 및 약리학적 샤프론의 조합 요법

다양한 구현예에서, 본원에 기재된 공정에 의해 생성된 rhGAA(예를 들어, ATB200)는, 예컨대 미글루스타트 또는 두보글루스타트와 같은 약리학적 샤프론과의 조합 요법에 사용될 수 있다.

적어도 하나의 구현예에서, 약리학적 샤프론(예를 들어, 미글루스타트)은 경구 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 200 mg 내지 약 400 mg의 경구 용량, 또는 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg 또는 약 400 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 233 mg 내지 약 400 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 250 mg 내지 약 270 mg의 경구 용량, 또는 약 250 mg, 약 255 mg, 약 260 mg, 약 265 mg 또는 약 270 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 260 mg의 경구 용량으로 투여된다.

당업자는 약 70 kg의 평균 체중을 가진 성인 환자의 경우, 약 200 mg 내지 400 mg의 범위 또는 그 범위 내의 임의의 더 작은 범위의 미글루스타트의 경구 용량이 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 유아, 아동 또는 저체중 성인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 약 70 kg보다 유의하게 더 낮은 체중을 갖는 환자의 경우, 의사에 의해 더 작은 용량이 적절한 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 50 mg 내지 약 200 mg의 경구 용량, 또는 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 125 mg, 약 150 mg, 약 175 mg 또는 약 200 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 65 mg 내지 약 195 mg의 경구 용량, 또는 약 65 mg, 약 130 mg 또는 약 195 mg의 경구 용량으로 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 경구 투여에 적절한 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태로 투여되고, 이는, 즉시-, 지연-, 변형-, 지속-, 규칙적(pulsed)- 또는 제어-방출 용도를 위해, 선택적으로 착향 및 착색제와 함께, 사용 전에 물 또는 적절한 다른 비히클과의 재구성을 위한 정제, 캡슐, 질좌약, 엘릭서제(elixir), 용액 또는 현탁액, 겔, 시럽, 구강 세정제 또는 건조 분말을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 정제, 캡슐, 로젠지(lozenge), 캔디형 알약(pastille), 알약, 볼루스, 분말, 페이스트, 과립, 불릿(bullet), 당의정 또는 프리믹스 조제물과 같은 고체 조성물이 또한 사용될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 정제로서 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 캡슐로서 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 50 mg 내지 약 300 mg의 미글루스타트를 함유한다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 65 mg의 미글루스타트를 함유한다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 130 mg의 미글루스타트를 함유한다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태는 약 260 mg의 미글루스타트를 함유한다. 투여 형태가 약 65 mg의 미글루스타트를 함유하는 경우, 미글루스타트는 4개의 투여 형태의 투여량 또는 260 mg의 미글루스타트의 총 용량으로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 유아, 아동 또는 저체중 성인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 70 kg의 평균 성인 체중보다 유의하게 더 낮은 체중을 갖는 환자의 경우, 미글루스타트는 1종의 투여 형태(65 mg의 미글루스타트의 총 용량), 2종의 투여 형태(130 mg의 미글루스타트의 총 용량) 또는 3종의 투여 형태(195 mg의 미글루스타트의 총 용량)의 투여량으로 투여될 수 있다.

경구용 고체 및 액체 조성물은 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 고체 또는 액체 형태일 수 있는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 함유할 수 있다. 정제 또는 캡슐은 결합제, 충전제, 윤활제, 붕괴제 또는 습윤제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여, 통상의 수단에 의해 제조될 수 있다. 적절한 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 전호화 전분, 폴리비닐피롤리돈, 포비돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필 에틸셀룰로스(HPEC), 하이드록시프로필 셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴, 아카시아, 락토스, 미정질 셀룰로스, 인산수소칼슘, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트, 탈크, 실리카, 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분, 전분 글리콜산나트륨, 라우릴황산나트륨, 시트르산나트륨, 탄산 칼슘, 이염기성 인산칼슘, 글리신 크로스카르멜로스 나트륨 및 복합체 실리케이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 정제는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 피복될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 Zavesca®(Actelion Pharmaceuticals)로서 시판되는 제형으로서 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 동시에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제는 순차적으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 3시간 미만 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 2시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 2시간 미만 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1.5시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1시간 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 50분 내지 약 70분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 55분 내지 약 65분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 30분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 25분 내지 약 35분 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 27분 내지 약 33분 전에 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여와 동시에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 20분 이내에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 15분 이내에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 10분 이내에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후 5분 이내에 투여된다.

적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여의 최대 2시간 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 30분 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1시간 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 1.5시간 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 약 2시간 후에 투여된다.

본 발명의 또 다른 양태는 폼페병의 조합 요법을 필요로 하는 환자에서 이를 위한 키트를 제공한다. 키트는 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태, 본원에 규정된 바와 같은 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태, 및 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태 및 재조합 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태를 이를 필요로 하는 환자에 투여하기 위한 지침을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 정제 또는 캡슐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 본원에 기재된 바와 같은 경구 투여 형태이다. 적어도 하나의 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태는 본원에 기재된 바와 같이 주입에 적절한 멸균 용액이다. 적어도 하나의 구현예에서, 투여 형태의 투여를 위한 지침은 본원에 기재된 바와 같이, 정맥내 주입에 의해 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태를 투여하기 전에 미글루스타트를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 투여 형태를 경구 투여하기 위한 지침을 포함한다.

이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 ATB200에 대한 약리학적 샤프론으로 작용하며 그의 활성 부위와 결합하는 것으로 사료된다. 예를 들어, 미글루스타트는 접히지 않은 ATB200 단백질의 백분율을 저하시키고 ATB200의 활성 입체형태를 안정시켜, 혈장의 중성 pH에서 변성 및 비가역적인 불활성화를 방지하며, 순환계 조건에서 충분히 오래 생존하여 조직에 도달하고 흡수될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, ATB200의 활성 부위와 미글루스타트의 결합은 또한 중성 기질인 글리코겐이 활성 부위에 접근하는 것을 방지함으로써, ATB200의 효소 활성의 억제를 야기할 수 있다. 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제가 본원에 기재된 조건하에서 환자에 투여되는 경우, 혈장 및 조직 내의 미글루스타트 및 ATB200의 농도는, ATB200이 조직 내로 흡수되어 리소좀에 표적화될 수 있을 때까지 안정하나, 미글루스타트의 빠른 배출로 인해, 리소좀 내에서 ATB200에 의한 글리코겐의 가수분해가 미글루스타트의 존재에 의해 과도하게 억제되지 않으며, 효소가 충분한 활성을 보유하여 치료적으로 유용할 수 있도록 하는 것으로 사료된다.

상기에 기재된 모든 구현예는 조합될 수 있다. 이는 다음과 관련된 특정 구현예를 포함한다:

·약리학적 샤프론, 예를 들어 미글루스타트의 성질; 및 이것이 특이적인 활성 부위;

·약리학적 샤프론(예를 들어, 미글루스타트)의 투여량, 투여 경로 및 담체의 성질을 포함하는 약제학적 조성물의 유형 및 시판되는 조성물의 용도;

·대상체에서 발현이 감소하거나 부재하는 내인성 단백질의 대상물일 수 있는 약제, 예를 들어 치료적 단백질 완제 의약품, 적절하게는 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA), 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현되고 알글루코시다제 알파의 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 함량과 비교하여 하나 이상의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 증가된 함량을 포함하며; 적절하게는, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 성질;

·재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 N-글리칸 단위, 예를 들어 재조합 단백질에 부착된 N-아세틸글루코사민, 갈락토스, 시알산 또는 이들의 조합으로부터 형성된 복합체 N-글리칸의 수 및 유형;

·만노스-6-인산염 및/또는 이중-만노스-6-인산염을 형성하는 재조합 단백질(예를 들어, rhGAA) 상의 만노스 단위의 인산화의 정도;

·대체 효소(예를 들어, 재조합 인간 산 α-글루코시다제)의 투여량 및 투여 경로(예를 들어, 정맥내 투여, 특히 정맥내 주입, 또는 표적 조직으로의 직접 투여) 및 담체 및 치료 유효량을 포함하는 제형의 유형;

·약리학적 샤프론(미글루스타트) 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 간격;

·치료학적 반응의 성질 및 조합 요법의 결과(예를 들어, 개별적으로 수행된 각 요법의 효과와 비교하여 증대된 결과);

·조합 요법의 투여, 예를 들어 미글루스타트 및 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 동시 투여 또는, 예를 들어, 미글루스타트는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 이전 또는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 이후 또는 재조합 인간 산 α-글루코시다제의 투여 전 또는 후의 특정 시간 이내에 투여되는 순차적 투여의 시기; 및

·치료되는 환자(예를 들어, 인간과 같은 포유동물)의 성질 및 개체가 앓고 있는 질환(예를 들어, 효소 결핍증).

상기 목록의 구현예 중 임의의 것은 목록 내의 다른 구현예 중 하나 이상과 조합될 수 있다.

실시예

본 발명의 다른 특징은, 예로서, 본 발명의 원리를 예시하는 하기의 비제한적인 실시예로부터 명백해질 것이다.

실시예 1: 단일- 또는 이중-M6P-보유 N-글리칸의 고 함량을 갖는 ATB200 rhGAA를 생성하는 CHO 세포의 제조

rhGAA를 발현하는 DNA를 사용하여 CHO 세포를 형질감염시킨 후, rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선별하였다. rhGAA를 인코딩하는 DNA를 사용하여 CHO 세포를 형질전환시키기 위한 DNA 작제물이 도 4에 도시되어 있다. rhGAA를 발현하는 DNA를 사용하여 CHO 세포를 형질감염시킨 후, rhGAA를 생성하는 형질전환체를 선별하였다.

형질감염 후, 안정하게 혼입된 GAA 유전자를 함유하는 DG44 CHO(DHFR-) 세포를 하이포크산틴/티미딘 결핍(-HT) 배지를 사용하여 선별하였다.

이들 세포에서의 GAA 발현의 증폭을 메토트렉세이트 처리(MTX, 500 nM)에 의해 유도하였다. 다량의 GAA를 발현하는 세포 풀(pool)을 GAA 효소 활성 검정에 의해 확인하고 rhGAA를 생성하는 개별 클론을 확립하는 데 사용하였다. 개별 클론을 반고체 배지 플레이트 상에 생성시키고, ClonePix 시스템에 의해 발출하였으며, 깊은 24-웰 플레이트로 옮겼다. 개별 클론을 GAA 효소 활성에 대해 검정하여 고수준의 GAA를 발현하는 클론을 확인하였다. GAA 활성을 결정하기 위한 일정한 조건의 배지에는 4-MU-α-글루코시다제 기질을 사용하였다. GAA 효소 검정에 의해 측정된 바와 같이, 더 고수준의 GAA를 생성하는 클론을 생육력, 성장능력, GAA 생산성, N-글리칸 구조 및 안정한 단백질 발현에 대해 추가로 평가하였다. CHO 세포주 GA-ATB-200을 포함하고, 증대된 단일-M6P 또는 이중-M6P N-글리칸을 갖는 rhGAA를 발현하는 CHO 세포주를 이 절차를 사용하여 단리하였다.

실시예 2: ATB200 rhGAA의 포획 및 정제를 위한 개념-증명 계획

ATB200 rhGAA를 발현하는 세포를 생물반응기에서 배양한다. 세포 배지를 회수하고, 여과하고, 이후 사용을 위해 냉동한다. 이어서 해동된 수확물을 포함하는 벌크 용기를 배치 모드로 사용하여 각각 칼럼 용적 15.7 mL(1 cm 직경 x 20 cm 층 높이)을 갖는 2개의 AEX 칼럼에 로딩한다. AEX 칼럼에 1.57 mL/분의 유속으로 로딩한다. 총 AEX 칼럼 체류 시간(즉, AEX 칼럼에 로딩하는 용적 유속 및 총 AEX 칼럼 용적의 비율)은 20분이다.

연속 공정을 하기 프로토콜에 따라 구동시켰다:

· 2개의 순서(대조군 조건과 동일한 수의 구동과 같음)를 실행함

· 각각의 AEX 용리액을 IMAC 칼럼 상에서 연속 가공할 것임

i. 순서 1

1. AEX1 로딩 → STP AEX1 용리액을 IMAC 상으로 → IMAC 용리액(IMACa) 수집

2. AEX2 로딩 → STP AEX2 용리액을 IMAC 상으로 → IMAC 용리액(IMACb) 수집

ii. 순서 2

배치 공정을 또한 하기 프로토콜에 따라 대조군으로서 구동시켰다:

· 4회의 구동(각각의 AEX 칼럼: AEX1, AEX2 상에서 2회의 구동)을 실행함

· 각각의 AEX 용리액을 수집하고 IMAC 칼럼 상에서 가공할 것임

i. 대조군 구동 1 = AEX1 로딩 → AEX1 용리액 수집 → AEX1 용리액을 IMAC 상으로 로딩 → IMAC 용리액 수집

ii. 대조군 구동 2 = AEX2 로딩 → AEX2 용리액 수집 → AEX2 용리액을 IMAC 상으로 로딩 → IMAC 용리액 수집

iii. 대조군 구동 3 = AEX1 로딩 → AEX1 용리액 수집 → AEX1 용리액을 IMAC 상으로 로딩 → IMAC 용리액 수집

iv. 대조군 구동 4 = AEX2 로딩 → AEX2 용리액 수집 → AEX2 용리액을 IMAC 상으로 로딩 → IMAC 용리액 수집

각각의 AEX 칼럼에 대한 공정 조건을 아래에서 표 5에 제공한다:

대조군 공정 및 연속 공정을 위한 용리 프로파일을 도 13 및 도 14에 각각 도시한다.

이어서 AEX 용리액을 칼럼 용적 3.9 mL(1 cm 직경 x 5 cm 층 높이)를 갖는 단일 IMAC 칼럼 상에 로딩한다. IMAC 칼럼을 0.65 mL/분의 유속으로 로딩한다. 총 AEX 칼럼 용적 대 IMAC 칼럼 용적의 비는 대략 8:1이다. 배치 정제 공정 및 연속 정제 공정 둘 모두에 대한 용리 프로파일을 기록하였고, 이를 도 15 및 도 16에 도시한다. IMAC 칼럼에 대한 공정 조건을 아래에서 표 6에 제공한다:

상기 실시예에 따른 연속 공정에 따라 생성된 rhGAA는 대조군(이전 배치 모드) 공정에 따라 생성된 rhGAA와 필적하였고, 이에 따라 본 실시예 2에서 연속 공정을 사용한 산물 품질의 손실이 없음을 보여준다. 그러나, 본 실시예 2의 연속 공정을 시행하는 제안된 설비의 차지 공간은 설비 차지 공간에서 4배 내지 5배 감소를 제공할 것으로 추정된다.

배치 정제 및 연속 정제로부터의 최종 산물을 분석하였다. 데이터를 표 7 내지 표 9에 기재한다.

^a활성 회복은 AEX 및 IMAC 단위 공정 둘 모두를 통한 총 공정 회복이다.

실시예 3: ATB200 rhGAA의 포획 및 정제를 위한 상업적-규모의 플랜트

ATB200 rhGAA를 발현하는 세포를 대형 생물반응기(예를 들어, 500 L 내지 2,000 L)에서 배양한다. 세포 배지를 연속적으로 회수하고, 여과하고, 각각 5 L 내지 25 L의 칼럼 용적을 갖는 2개의 AEX 칼럼 상으로 로딩한다. AEX 칼럼을 도 6에 도시된 포획 칼럼으로 배열한다. 생물반응기 용적 대 총 AEX 칼럼 용적의 비는 약 100:1 내지 약 20:1의 범위이다. AEX 용리액을 IMAC 칼럼 상으로 직접 로딩한다. IMAC 칼럼 용적은 1 L 내지 10 L이며 총 AEX 칼럼 용적 대 IMAC 칼럼 용적의 비는 2:1 내지 10:1이다. 도 11은 rhGAA의 정제에서 AEX 칼럼 및 IMAC 칼럼에 대한 예시적인 작업 순서를 기재한다.

본원에 기재된 구현예는 본 발명의 조성물 및 방법의 예시로서 의도되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 기재내용과 전반적으로 일치하고, 당업자에게 용이하게 명백한 다양한 변형 및 변화가 포함되는 것으로 의도된다. 첨부된 청구범위는 실시예에 제시된 특정 구현예에 의해 제한되어서는 안되지만, 기재내용과 전반적으로 일치하도록, 최광의 해석이 주어져야 한다.

그 전문의 개시내용이 모든 목적을 위해, 본원에 참조로 포함되는 특허, 특허 출원, 공보물, 제품 설명서, GenBank 수탁 번호 및 프로토콜이 본 출원 전반에 걸쳐 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Amicus Therapeutics, Inc. <120> METHOD FOR CAPTURING AND PURIFICATION OF BIOLOGICS <130> AT19-008-PCT <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 952 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val 305 310 315 320 Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile 325 330 335 Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln 340 345 350 Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly 355 360 365 Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr 370 375 380 Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val 385 390 395 400 Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe 405 410 415 Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser 435 440 445 Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg 450 455 460 Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val 465 470 475 480 Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu 485 490 495 Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe 500 505 510 Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly 515 520 525 Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val 530 535 540 Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser 545 550 555 560 Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly 565 570 575 Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly 580 585 590 Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg 595 600 605 Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 625 630 635 640 Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu 645 650 655 Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg 660 665 670 Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser 675 680 685 Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala 690 695 700 Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly 705 710 715 720 Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser 725 730 735 Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile 740 745 750 Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro 755 760 765 Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly 770 775 780 Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser 785 790 795 800 Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val 805 810 815 His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr 820 825 830 Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr 835 840 845 Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser 850 855 860 Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala 865 870 875 880 Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly 885 890 895 Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala 900 905 910 Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr 915 920 925 Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950 <210> 2 <211> 896 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro 1 5 10 15 Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser 20 25 30 Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu 35 40 45 Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala 50 55 60 Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu 85 90 95 Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg 100 105 110 Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys 115 120 125 Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val 130 135 140 His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu 145 150 155 160 Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu 165 170 175 Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn 210 215 220 Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro 225 230 235 240 Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu 245 250 255 Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu 260 265 270 Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly 275 280 285 Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr 290 295 300 Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp 305 310 315 320 Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr 325 330 335 Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met 340 345 350 Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe 355 360 365 Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met 370 375 380 Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg 385 390 395 400 Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr 405 410 415 Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro 420 425 430 Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala 435 440 445 Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn 450 455 460 Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn 465 470 475 480 Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu 485 490 495 Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His 500 505 510 Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His 515 520 525 Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg 530 535 540 Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp 545 550 555 560 Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu 565 570 575 Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly 580 585 590 Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu 595 600 605 Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu 610 615 620 Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg 625 630 635 640 Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu 645 650 655 Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe 660 665 670 Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu 675 680 685 Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys 690 695 700 Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln 705 710 715 720 Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala 725 730 735 Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro 740 745 750 Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile 755 760 765 Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro 770 775 780 Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu 785 790 795 800 Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala 805 810 815 Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu 820 825 830 Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val 835 840 845 Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly 850 855 860 Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp 865 870 875 880 Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 885 890 895

Claims

생물학적 제제를 제조하는 방법으로서,
생물반응기에서 생물학적 제제를 생성하고 선택적으로 생물학적 제제를 분비하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액을 회수하는 단계;
배지 및/또는 세포 현탁액을 가공하여 생물학적 제제를 함유하는 여과물을 분리하는 단계;
적어도 2개의 포획 칼럼 상으로 여과물을 로딩하여 생물학적 제제를 포획하는 단계;
적어도 2개의 포획 칼럼으로부터 제1 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계;
하나 이상의 정제 칼럼 상으로 제1 생물학적 제제 산물을 로딩하는 단계; 및
하나 이상의 정제 칼럼으로부터 제2 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계
를 포함하는 방법(여기서, 생물반응기는 생물반응기 용적을 갖고, 적어도 2개의 포획 칼럼은 총 포획 칼럼 용적을 가지며, 생물반응기 용적 대 총 포획 칼럼 용적의 비는 약 500:1 내지 약 10:1의 범위임).
제1항에 있어서, 생물학적 제제는 재조합 단백질, 바이러스 입자 또는 항체 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 재조합 단백질은 숙주 세포에 의해 생성되는 분비된 단백질, 막 단백질 또는 세포내 단백질인, 방법.
제3항에 있어서, 재조합 단백질은 세포 및 세포 소기관으로부터 여과물로 분리되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 여과물은 여과 또는 원심분리에 의해 분리되는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 순차적으로 로딩되어 적어도 2개의 포획 칼럼 상으로 여과물의 연속 로딩을 가능하게 하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 여과물은 시간 당 약 0.5 칼럼 용적(CV) 내지 약 100 CV 범위의 여과물 로딩 속도로 적어도 2개의 포획 칼럼 상에 로딩되는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 여과물은 적어도 2개의 포획 칼럼 상으로 로딩되어 각각의 포획 칼럼에 대해 48시간 미만의 포획 칼럼 로딩 시간을 가능하게 하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제는 재조합 인간 리소좀 단백질을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 친화도 크로마토그래피 칼럼을 포함하는, 방법.
제11항에 있어서, 친화도 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A 칼럼 및 단백질 Z 칼럼 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 포획 칼럼은 적어도 2개의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 친화도 크로마토그래피 칼럼을 포함하는, 방법.
제18항에 있어서, 친화도 크로마토그래피 칼럼은 단백질 A 칼럼 및 단백질 Z 칼럼 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제13항 및 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 크기 배제 크로마토그래피 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정제 칼럼은 하나 이상의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 생물학적 제제 산물은 생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액의 회수 48시간 이내에 하나 이상의 정제 칼럼으로부터 용리되는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 정제 칼럼은 총 정제 칼럼 용적을 가지며 생물반응기 용적 대 총 정제 칼럼 용적의 비는 약 5,000:1 내지 약 50:1의 범위인, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 총 포획 칼럼 용적 대 총 정제 칼럼 용적의 비는 약 20:1 내지 약 1:1의 범위인, 방법.
재조합 인간 리소좀 단백질을 제조하는 방법으로서,
생물반응기에서 재조합 인간 리소좀 단백질을 생성하고 선택적으로 재조합 인간 리소좀 단백질을 분비하는 숙주 세포를 배양하는 단계;
생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액을 회수하는 단계;
배지 및/또는 세포 현탁액을 가공하여 리소좀 단백질을 함유하는 여과물을 분리하는 단계;
여과물을 적어도 2개의 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼 상으로 로딩하여 리소좀 단백질을 포획하는 단계;
적어도 2개의 AEX 칼럼으로부터 제1 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계;
하나 이상의 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼 상으로 제1 생물학적 제제 산물을 로딩하는 단계; 및
하나 이상의 IMAC 칼럼으로부터 제2 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계
를 포함하는 방법(여기서, 생물반응기는 생물반응기 용적을 갖고, 적어도 2개의 AEX 칼럼은 총 AEX 칼럼 용적을 가지며, 생물반응기 용적 대 총 AEX 칼럼 용적의 비는 약 500:1 내지 약 10:1의 범위임).
제27항에 있어서, 리소좀 단백질은 숙주 세포에 의해 생성되는 분비된 단백질, 막 단백질 또는 세포내 단백질인, 방법.
제28항에 있어서, 세포내 단백질은 세포 용해물을 제조하기 위해 세포를 용해시킴으로써 여과물 내로 분리되는, 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, 세포 용해물은 여과 또는 원심분리에 의해 여과물로부터 분리되는, 방법.
제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 AEX 칼럼은 순차적으로 로딩되어 적어도 2개의 AEX 칼럼 상으로 여과물의 연속 로딩을 가능하게 하는, 방법.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 여과물은 시간 당 약 0.5 칼럼 용적(CV) 내지 약 100 CV 범위의 여과물 로딩 속도로 적어도 2개의 AEX 칼럼 상으로 로딩되는, 방법.
제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 여과물은 적어도 2개의 AEX 칼럼 상으로 로딩되어 각각의 AEX 칼럼에 대해 48시간 미만의 AEX 로딩 시간을 가능하게 하는, 방법.
제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 AEX 칼럼은 50 L 이하의 칼럼 용적을 갖는, 방법.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 생물학적 제제 산물은 생물반응기로부터 배지 및/또는 세포 현탁액의 회수 48시간 이내에 하나 이상의 IMAC 칼럼으로부터 용리되는, 방법.
제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 IMAC 칼럼은 총 IMAC 칼럼 용적을 가지며 생물반응기 용적 대 총 IMAC 칼럼 용적의 비는 약 5,000:1 내지 약 50:1의 범위인, 방법.
제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 총 AEX 칼럼 용적 대 총 IMAC 칼럼 용적의 비는 약 20:1 내지 약 1:1의 범위인, 방법.
제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 IMAC 칼럼은 20 L 이하의 칼럼 용적을 갖는, 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 생물학적 제제 산물을 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제39항에 있어서, 제2 생물학적 제제 산물이 24시간 내지 105일의 기간 동안 0℃ 내지 10℃의 온도에서 저장되는, 방법.
제40항에 있어서, 제2 생물학적 제제 산물이 1시간 내지 3일의 기간 동안 15℃ 내지 30℃의 온도에서 저장되는, 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 크로마토그래피 칼럼 상으로 제2 생물학적 제제 산물을 로딩하는 단계; 및
제3 크로마토그래피 칼럼으로부터 제3 생물학적 제제 산물을 용리하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 제3 크로마토그래피 칼럼이 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 칼럼, 친화도 크로마토그래피 칼럼, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 칼럼, 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC) 칼럼, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 칼럼 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 여과물은 교대 접선 유동 여과(alternating tangential flow filtration, ATF) 및 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF) 중 하나 이상으로부터 배지 및/또는 세포 현탁액을 여과함으로써 분리되는, 방법.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생물학적 제제 산물, 제2 생물학적 제제 산물 및 제3 생물학적 제제 산물 중 하나 이상에서 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 생물학적 제제 산물 또는 제3 생물학적 제제 산물을 여과하여 여과된 산물을 제공하는 단계 및 바이알을 여과된 산물로 충전하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 여과된 산물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 제제는 재조합 인간 α-글루코시다제(rhGAA)를 포함하는, 방법.
제48항에 있어서, rhGAA는 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는, 방법.
제50항에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포주 GA-ATB-200 또는 ATB-200-001-X5-14 또는 이의 계대배양물을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 제1 생물학적 제제 산물 또는 제2 생물학적 제제 산물 또는 제3 생물학적 제제 산물 중 적어도 90%가 양이온-비의존성 마노스-6-인산염 수용체(CIMPR)와 결합하거나
(ii) 제1 생물학적 제제 산물 또는 제2 생물학적 제제 산물 또는 제3 생물학적 제제 산물 중 적어도 90%가 단일-만노스-6-인산염(단일-M6P) 또는 이중-만노스-6-인산염(이중-M6P)을 보유하는 N-글리칸을 함유하는, 방법.
제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA는 7개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 50%는 제1 부위에 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 30%는 제2 부위에 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 30%는 제4 부위에 2개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하고, rhGAA 분자 중 적어도 20%는 제4 부위에 1개의 만노스-6-인산염 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 생물학적 제제 산물.
제54항의 생물학적 제제 산물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
리소좀 저장 장애를 치료하는 방법으로서, 제55항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제56항에 있어서, 리소좀 저장 장애는 폼페병이고, 생물학적 제제 산물은 rhGAA인, 방법.
제57항에 있어서, 환자에 rhGAA 산물을 포함하는 약제학적 조성물의 투여 4시간 이내에 α-글루코시다제에 대한 약리학적 샤프론이 공동 투여되는, 방법.
제58항에 있어서, 약리학적 샤프론은 1-데옥시노지리마이신 및 N-부틸-데옥시노지리마이신으로부터 선택되는, 방법.
제59항에 있어서, 약리학적 샤프론은 rhGAA 산물과 공동 제형화되는, 방법.