EA037654B1 - Анти-cd47-антитела и их применения - Google Patents

Анти-cd47-антитела и их применения Download PDF

Info

Publication number
EA037654B1
EA037654B1 EA201791485A EA201791485A EA037654B1 EA 037654 B1 EA037654 B1 EA 037654B1 EA 201791485 A EA201791485 A EA 201791485A EA 201791485 A EA201791485 A EA 201791485A EA 037654 B1 EA037654 B1 EA 037654B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
antibodies
heavy chain
Prior art date
Application number
EA201791485A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791485A1 (ru
Inventor
Аарон Сато
Райан Стаффорд
Цзюньхао Янг
Original Assignee
Селджин Корпорейшн
Аарон Сато
Райан Стаффорд
Цзюньхао Янг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Селджин Корпорейшн, Аарон Сато, Райан Стаффорд, Цзюньхао Янг filed Critical Селджин Корпорейшн
Publication of EA201791485A1 publication Critical patent/EA201791485A1/ru
Publication of EA037654B1 publication Critical patent/EA037654B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

В изобретении предлагаются композиции, способы и применения, в которые вовлечены антитела, которые специфически связываются с CD47 человека. Также предлагаются применения и способы, такие как терапевтические способы, диагностические способы и способы получения таких антител.

Description

Заявка притязает на приоритет на основании предварительной заявки на выдачу патента США №
62/098291, поданной 30 декабря 2014, описание которой включено в настоящую публикацию в виде ссылки в полном объеме.
Ссылка на список последовательностей, поданный в электронной форме
Заявка включает в себя в виде ссылки список последовательностей, поданный вместе с настоящей заявкой в виде текстового файла, озаглавленного Sequence Listing 12827-563-228.txt, созданного 27 декабря 2015 и имеющего размер 87612 байт.
1. Область техники, к которой относится изобретени
В настоящем изобретении предлагаются антитела (анти-CD47-антитела), которые специфично связываются с CD47, и композиции, содержащие такие антитела, включая фармацевтические композиции, диагностические композиции, и наборы. Также предлагаются способы применения анти-CD74-антител для терапевтических и диагностических целей, и способы получения таких анти-CD47-антител, например, с использованием бесклеточных (CF) систем.
2. Уровень техники
CD47, также известный как интегрин-ассоциированный белок (IAP), антиген рака яичников ОА3, Rh-родственный антиген и MER6, является широко простирающимся трансмембранным рецептором, относящимся к надсемейству иммуноглобулинов. SIRPa (сигнальный регуляторный белок α), экспрессированный на макрофагах, взаимодействует с CD47, и такое взаимодействие негативно контролирует эффекторную функцию клеток, обеспечивающих естественный иммунитет, такую как фагоцитоз клетокхозяев. Экспрессия и/или активность CD47 вовлечены в ряд заболеваний и расстройств. Соответственно, имеется потребность в терапевтических средствах, мишенью которых является CD47, а также в улучшенных способах получения таких терапевтических средств.
3. Сущность изобретения
В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются антитела (например, моноклональные антитела), включая их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с CD47 (например, CD47) человека, например с внеклеточным доменом (ECD) CD47. В конкретных аспектах такое анти-CD47-антитело блокирует связывание CD47 с SIRPa, стимулирует фагоцитоз, обладает пониженной или не обладает Fc-эффекторной функцией (например, связывание с FcyR, ADCC или CDC) и/или обладает слабой или не обладает активностью в агглютинации (например, гемагглютинации).
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается моноклональное анти-CD47антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом анти-CD47-антитело является вариантом исходного антитела, и при этом анти-CD47-антитело, получаемое с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессии антитела или больший выход по сравнению с исходным антителом, получаемым в БК-системе экспрессии. В конкретном аспекте антиCD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, которые экспрессируются в БК-системе, являются агликозилированными.
В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается моноклональное анти-CD47-антитело, которое специфично связывается с CD47 человека (например, SEQ ID NO: 38 или 39), при этом анти-CD47антитело при получении с использованием бесклеточной системы имеет более высокий титр экспрессии антител или больший выход по сравнению с исходным антителом, получаемым с использованием бесклеточной системы. В конкретных аспектах титр экспрессии анти-CD47-антитела или выход выше по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза или, по меньшей мере в 3 раза по сравнению с исходным антителом. В конкретных аспектах титр экспрессии анти-CD47-антитела или выход выше по меньшей мере на 25, 50, 75 или 100% по сравнению с исходным антителом. В конкретных аспектах такое антиCD47-антитело является гуманизированным антителом. В конкретных аспектах бесклеточная система включает в себя использование бесклеточного экстракта S30. В конкретных аспектах такая бесклеточная система содержит прокариотическую дисульфидизомеразу DsbC. В некоторых аспектах такое антиCD47-антитело представляет собой IgGi-антитело. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело представляет собой IgG4-антитело. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело представляет собой IgG4-антитело, содержащее аминокислотную замену S228P согласно индексу нумерации EU. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело представляет собой IgG4-антитело, содержащее аминокислотные замены S228P и L235E согласно индексу нумерации EU.
В конкретных аспектах такое исходное антитело для анти-CD47-антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых аспектах такое исходное антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. В конкретных аспектах такое исходное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 3 или 4.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2, и 3 антитела 2А1; и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 антите- 1 037654 ла 2А1.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности GFNIKDYYLH (SEQ ID NO: 14), WIDPDQGDTE (SEQ ID NO: 15) и NAAYGSSSYPMDY (SEQ ID NO: 16), соответственно; и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности KASQDIHRYLS (SEQ ID NO: 17), RANRLVS (SEQ ID NO: 18, и LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 19), соответственно.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается анти-CD47-антитело, содержащее одну или несколько аминокислотных модификаций (например, аминокислотных замен) относительно исходного антитела. В конкретных аспектах такая одна или несколько аминокислотных замен находятся в каркасной области вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи. В конкретных аспектах такое анти-CD47-антитело содержит 13 или 14 аминокислотных модификаций (например, аминокислотных замен) в каркасной области вариабельной области тяжелой цепи. В конкретных аспектах такое анти-CD47-антитело содержит от 1 до 15 аминокислотных модификаций (например, аминокислотных замен) в каркасной области вариабельной области тяжелой цепи. В конкретных аспектах такие аминокислотные модификации представляют собой консервативные аминокислотные замены.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается моноклональное αнти-CD47антитело, которое специфично связывается с CD47 (например, CD47 человека, таким как последовательности SEQ ID NO: 38 или 39) и содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность:
XiQx2qlvqsgaevkkx3gx4svkvsckasgfnikdyylhwvrqapgqx5lewmgwidpdqgdte yaqkx6qx7rvtx8tx9dx10sxhStaymelx12slrsxi3dtax14yycnaaygsssypmdywgqgttvtv (SEQ ID NO: 20), где аминокислота в положении X1 является любой аминокислотой или в положении X1 аминокислота отсутствует, и где аминокислота в каждом из положений X2-Xj4 является любой аминокислотой. В некоторых аспектах X1 представляет собой М или в положении X1 аминокислота отсутствует, X2 представляет собой аминокислоту с гидрофобными боковыми цепями, такую как М или V, X3 представляет собой Т или Р, X4 представляет собой S или А, X5 представляет собой аминокислоту, имеющую алифатические боковые цепи, такую как А или G, X6 представляет собой F или L, X7 представляет собой D или G, X8 представляет собой аминокислоту с гидрофобными боковыми цепями, такую как I или М, X9 представляет собой R или Т, X10 представляет собой R или Т, X11 представляет собой М или Т, X12 представляет собой S или R, X13 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту, такую как Е или D, и X14 представляет собой аминокислоту с гидрофобными боковыми цепями, такую как М или V. В конкретных аспектах VH анmи-CD47-антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21. В некоторых аспектах VH анти-CD47-антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В конкретных аспектах αнти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5. В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. В некоторых аспектах антиCD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
В конкретных аспектах анти-CD47-aнтитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 13 без аминокислоты М на N-конце.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается моноклональное aнти-CD47антитело, которое специфично связывается с CD47 (например, CD47 человека, таким как последовательности SEQ ID NO: 38 или 39), при этом анти-CD47-антитело после введения не вызывает или не стимулирует значимое истощение эритроцитов, анемию или истощение эритроцитов и анемию. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело после введения не вызывает или не стимулирует значимое истощение тромбоцитов. В конкретных аспектах такое анти-CD47-αнтитело не вызывает или не стимулирует значимой агглютинации клеток после введения. В конкретных аспектах такое анти-CD47-aнтитело не вызывает или не стимулирует значимой гемагглютинации эритроцитов после введения. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело ингибирует (например, ингибирует, по меньшей мере, примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%) взаимодействие CD47 с сигнальным регуляторным белком а
- 2 037654 (SIRPa). В конкретных аспектах такое анти-CD47-антитело стимулирует фагоцитоз, такой как опосредованный макрофагами фагоцитоз CD47-экспрессирующей клетки. В некоторых аспектах такое антиCD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, не вызывает или не стимулирует значимого уровня эффекторной функции. В некоторых аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, при экспрессии с использованием бесклеточной системы проявляет более низкую (например, более низкую, по меньшей мере, примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%) аффинность связывания, или не связывается с FcyR, по сравнению с тем, когда оно экспрессируется с использованием клеток СНО. В конкретных аспектах такая более низкая аффинность связывания по меньшей мере на 1 log ниже или по меньшей мере на 2 log ниже. В некоторых аспектах FcyR представляет собой FcyRI, FcyRIIA R131, FcyRIIA H131, FcyRIIB или FcyRIIIA V158.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, является агликозилированным или гликозилированным в меньшей степени (например, по меньшей мере, примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% меньше) при экспрессии с использованием бесклеточной системы, по сравнению с экспрессией в клетках СНО.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается моноклональное анти-CD47антитело, которое специфично связывается с CD47 (например, CD47 человека, таким как последовательность SEQ ID NO: 38 или 39), при этом анти-CD47-антитело (i) стимулирует фагоцитоз, такой опосредованный макрофагами фагоцитоз CD47-экспрессирующей клетки; (ii) не вызывает или не стимулирует значимого уровня гемагглютинации эритроцитов после введения; (iii) не вызывает или не стимулирует значимого уровня ADCC или CDC; и/или (iv) проявляет более низкую (например, ниже, по меньшей мере, примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%) аффинность связывания, или не связывается с FcyR по сравнению с антителом, экспрессируемым с использованием клеток СНО, или по сравнению с исходным антителом.
В некоторых аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой биспецифичное антитело. В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, конъюгировано с определенным средством. В некоторых аспектах средство представляет собой метку или токсин.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество анти-CD47-антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, или его антигенсвязывающего фрагмента. В конкретных аспектах фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH-цепи, область VL-цепи или обе области: область VL-цепи и область VH-цепи анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации. В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, легкую цепь или и тяжелую цепь и легкую цепь антиCD47-антитела, описанного в настоящей публикации. В конкретных аспектах такой полинуклеотид содержит любую из нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 26-32, кодирующую тяжелую цепь. В конкретных аспектах такой полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 33, кодирующую легкую цепь.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается популяция полинуклеотидов, включающая в себя (i) первый полинуклеотид, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие VH или тяжелую цепь анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, и (ii) второй полипептид, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие VL или легкую цепь анти-CD47антитела, описанного в настоящей публикации. В некоторых аспектах такой первый полинуклеотид оперативно связан с первым промотором, а такой второй полинуклеотид оперативно связан со вторым промотором.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается вектор, содержащий один или несколько полинуклеотидов, описанных в настоящей публикации.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается популяция векторов, включающая в себя (i) первый вектор, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие VH или тяжелую цепь анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, и (ii) второй вектор, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие VL или легкую цепь анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается композиция для бесклеточной экспрессии белка, содержащая бесклеточный экстракт и один или несколько полинуклеотидов или векторов, описанных в настоящей публикации. В конкретных аспектах композиция дополнительно содержит бесклеточный экстракт S30. В конкретных аспектах композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, дополнительно содержит прокариотическую дисульфидизомеразу DsbC.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается способ лечения злокачественной опухоли, при этом способ включает в себя введение анти-CD47-антитела, описанного в настоящей пуб- 3 037654 ликации, субъекту, нуждающемуся в таком введении, в количестве, достаточном для лечения злокачественной опухоли у субъекта.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается способ облегчения симптома злокачественной опухоли, при этом способ включает в себя введение анти-CD47-αнтитела, описанного в настоящей публикации, субъекту, нуждающемуся в таком введении, в количестве, достаточном для облегчения одного или нескольких симптомов злокачественной опухоли у субъекта.
В конкретных аспектах такой способ, предлагаемый в настоящем изобретении, дополнительно включает в себя проведение облучения или химиотерапии.
В конкретных аспектах такой способ, предлагаемый в настоящем изобретении, дополнительно включает в себя введение другого противоопухолевого средства.
В конкретных аспектах способов, предлагаемых в настоящем изобретении, злокачественная опухоль представляет собой гематологическую злокачественную опухоль. В конкретном аспекте злокачественная опухоль представляет собой солидную злокачественную опухоль. В некоторых аспектах злокачественная опухоль представляет собой множественную миелому, неходжкинскую лимфому, острый миелоидный лейкоз (AML), рак молочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак/карциному легкого, гепатоклеточную карциному (НСС), саркому или рак головы и шеи.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается изолированная клетка, содержащая один или несколько полинуклеотидов или векторов, описанных в настоящей публикации.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается изолированная клетка, содержащая популяцию полинуклеотидов или векторов, описанных в настоящей публикации.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается изолированная клетка, продуцирующая анти-CD47-антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей публикации.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается популяция клеток-хозяев, включающая в себя (i) первую клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие VH или тяжелую цепь анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, и (ii) вторую клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие VL или легкую цепь анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается способ получения анти-CD47антитела, включающий в себя экспрессию анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, с использованием композиции для бесклеточной экспрессии белка, описанной в настоящей публикации. В некоторых аспектах такой способ дополнительно включает в себя очистку анти-CD47-антитела.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается способ получения анти-CD47антитела, включающий в себя экспрессию анти-CD47-антитела с использованием клетки, описанной в настоящей публикации. В некоторых аспектах такой способ дополнительно включает в себя очистку анth-CD47-антитела.
4. Краткое описание фигур
На фиг. 1А изображена авторадиограмма анти-CD47-антител, экспрессированных с использованием бесклеточной (БК) системы. Образцы 1-10 соответствовали БК-экспрессированным анти-CD47-IgG1 (I), IgG1-5m (2), IgG1-13m (3), IgG1-13mZ (4), IgG4P (5), IgG4P-5m (6), IgG4P-13m (7), IgG4PE (8), IgG4PE5m (9) и IgG4PE-13m (10) антителам, соответственно.
На фиг. 1B изображен график, показывающий титры анти-CD47-антител (мг/л), полученных в БКсистеме экспрессии. Образцы 1-10 соответствовали БК-экспрессированным анти-CD47 IgG1 (1), IgG1-5m (2), IgG1-13m (3), IgG1-13mZ (4), IgG4P (5), IgG4P-5m (6), IgG4P-13m (7), IgG4PE (8), IgG4PE-5m (9) и IgG4PE-13m (10) антителам, соответственно.
На фиг. 2A-2F изображены отдельные сенсограммы, полученные в анализе Biacore анmи-CD47 IgG1-5m (2A), IgG1-13m (2В), IgG1-13mZ (2C), IgG4P-5m (2D), IgG4PE-5m (2E) антител и контрольного антитела (2F).
На фиг. 3А-3С изображены графики, на которых откладывали значения удельной теплоемкости (ккал/моль/°С) против температуры (°С), полученные в анализе термостабильности с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для анmи-CD47 IgG1-13mZ (3А), IgG1-13m (3В) и IgG1-5m (3С) антител.
На фиг. 4 изображен график, на котором против времени (часы) откладывали значения концентрации анти-CD47-антител в плазме (мкг/мл), полученные в фармакокинетических исследованиях с использованием анmи-CD47 IgG4-РЕ-антитела, полученного в клетках СНО, и анmи-CD47 IgG1- и IgG1-5mантител, полученных в БК-системе экспрессии.
На фиг. 5 изображен график, на котором объем опухолей (мм3) откладывали против дней после инокуляции опухолевых клеток RPMI8226 в исследованиях ксенотрансплантатов мышиных опухолей in vivo с использованием анти-CD47 IgG1-5m-антител, полученных в БК-системе экспрессии, в дозах 1 мг/кг, 0,3 мг/кг и 0,1 мг/кг (qwx3).
5. Подробное описание
В одном аспекте в настоящем изобретении предлагаются антитела (например, моноклональные ан- 4 037654 титела) и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с CD47 (например,
CD47 человека). В конкретных аспектах такое анти-CD47-антитело блокирует связывание CD47 с SIRPa, стимулирует фагоцитоз, имеет пониженную или не обладает Fc-эффекторной функцией (например, связывание с FcyR, ADCC или CDC) и/или и/или обладает слабой или не обладает активностью в агглютинации (например, гемагглютинации).
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается моноклональное анти-CD47антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом анти-CD47-антитело является вариантом исходного антитела, и при этом анти-CD47-антитело при получении с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению с исходным антителом, экспрессируемым в БК-системе. В конкретном аспекте анти-CD47антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, которые экспрессируются в БК-системе, являются агликозилированными.
В используемом в настоящем описании смысле термины CD47 или интегрин-ассоциированный белок, или IAP, или антиген рака яичников, или ОА3, или Rh-родственный антиген или MER6 могут быть использованы взаимозаменяемо и относятся к широко простирающемуся трансмембранному рецептору, относящемуся к надсемейству иммуноглобулинов. Аминокислотная последовательность иллюстративного CD47 человека приведена ниже (GenBank, № доступа Q08722.1 (GI:1171879), включенный в настоящее описание в виде ссылки). Сигнальная последовательность (аминокислоты 1-18) подчеркнута.
MWPLVAALLL GSACCGSAQL LFNKTKSVEF TFCNDTWIP BKVTNMEAQN
TTEVYVKWKF
KGRDIYTFDG ALNKSTVPTD FSSAKIEVSQ LLKGDASLKM DKSDAVSHTG
NYTCEVTELT
121 REGETIIELK YRWSWFSPN ENILIVIFPI FAILLFWGQF GIKTLKYRSG
GMDEKTIALL
181 VAGLVITVIV IVGAILFVPG EYSLKNATGL GLIVTSTGIL ILLHYYVFST
AIGLTSFVIA
241 ILVIQVIAYI LAWGLSLCI AACIPMHGPL LISGLSILAL AQLLGLVYMK
FVASNQKTIQ
301 PPRKAVEEPL NAFKESKGMM NDE (SEQ ID NO: 38)
Для ясности, аминокислотная последовательность приведенного в качестве примера CD47 человека, за исключением сигнальной последовательности приведена ниже.
QLLFNKTKSV EFTFCNDTW IPBKVTNMEA QNTTEVYVKW KFKGRDIYTF
DGALNKSTVP
TDFSSAKIEV SQLLKGDASL KMDKSDAVSH TGNYTCEVTE LTREGETIIE LKYRWSWFS
121 PNENILIVIF PIFAILLFWG QFGIKTLKYR SGGMDEKTIA LLVAGLVITV IVIVGAILFV
181 PGEYSLKNAT GLGLIVTSTG ILILLHYYVF STAIGLTSFV IAILVIQVIA
YILAWGLSL
241 CIAACIPMHG PLLISGLSIL ALAQLLGLVY MKFVASNQKT IQPPRKAVEE
PLNAFKESKG
301 MMNDE (SEQ ID NO: 39)
Термины красная кровяная клетка (клетки) и эритроцит(ты) являются синонимами и используются в настоящем описании взаимозаменяемо.
Термин агглютинация относится к слипанию клеток, тогда как термин гемагглютинация относится к слипанию конкретной подгруппы клеток, т.е. красных кровяных клеток. Таким образом, гемагглютинация является типом агглютинации.
5.1. Антитела
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагаются антитела, которые специфично связываются с CD47 (например, CD47 человека). В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагаются анти-CD47-антитела, содержащие модификации в одном или нескольких аминокислотных остатках (например, 5-13 аминокислотных замен в каркасной области вариабельной области тяжелой цепи),
- 5 037654 которые неожиданно обеспечивают возможность улучшенной продукции в бесклеточной (БК) системе экспрессии по сравнению с исходным антителом без модификаций. В некоторых аспектах такие антиCD47-антитела ингибируют взаимодействие SIRPa с CD47, являются агликозилированными, стимулируют фагоцитоз, либо in vivo, либо in vitro или в обоих условиях, обладают противоопухолевой активностью (например, без стимуляции агглютинации, такой как гемагглютинация), и/или обладают низкой или не обладают Fc-эффекторной функцией (например, связыванием с FcyR, ADCC или CDC).
В некоторых вариантах антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящей публикации, могут содержать последовательности, которые в природе не существуют в репертуаре антител зародышевой линии животного или млекопитающего (например, человека) in vivo.
В используемом в настоящем описании смысле, и если специально не указано иное, термины примерно или приблизительно означают в пределах плюс или минус 10% от данного значения или диапазона. В тех случаях, когда требуется целое число, термины означают в пределах плюс или минус 10% от данного значения или диапазона, округленное либо вверх, либо вниз до ближайшего целого числа.
В используемом в настоящем описании смысле термины антитело и иммуноглобулин и Ig являются терминами, используемыми в данной области, и могут быть использованы в настоящем описании взаимозаменяемо, и относятся к молекуле с антигенсвязывающим участком, который специфично связывает антиген.
Антитела могут включать, например, моноклональные антитела, полученные путем рекомбинации антитела, моноспецифичные антитела, полиспецифичные антитела (включая биспецифичные антитела), человеческие антитела, гуманизированные антитела, антитела грызунов (например, антитела мыши или крысы), химерные антитела, синтетические антитела и тетрамерные антитела, содержащие две молекулы тяжелой цепи и две молекулы легкой цепи. В конкретных вариантах антитела могут включать без ограничения мономер легкой цепи антитела, мономер тяжелой цепи антитела, димер легкой цепи антитела, димер тяжелой цепи антитела, пару легкая цепь антитела-тяжелая цепь антитела, интраантитела, гетероконъюгированные антитела, однодоменные антитела и моновалентные антитела. В конкретном варианте антитела могут включать антигенсвязывающие фрагменты или связывающие эпитоп фрагменты, такие как без ограничения одноцепочечные антитела или одноцепочечные Fv (sFCv) (например, включая моноспецифичные, биспецифичные и т.д.), верблюдизированные антитела, аффиантитела, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, F(ab')2-фрагменты и связанные дисульфидными связями Fv (sdFv). В некоторых вариантах антитела, описанные в настоящей публикации, относятся к популяциям поликлональных антител.
Антитела могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY), любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi или IgG2) или любого подкласса (например, IgG2a или IgG2b) молекулы иммуноглобулина. В некоторых вариантах антитела, описанные в настоящей публикации, представляют собой IgG-антитела или их класс (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека) или подкласс. В некоторых вариантах антитела, описанные в настоящей публикации, представляют собой IgG1-антитела (например, IgG1 человека) или их подкласс. В некоторых вариантах IgG1-антитела, описанные в настоящей публикации, содержат одну или несколько аминокислотных замен и/или делеций в константной области. В некоторых вариантах антитела, описанные в настоящей публикации, представляют собой IgG4антитела (например, IgG4 человека) или их подкласс. В некоторых вариантах IgG4-антитела, описанные в настоящей публикации, содержат одну или несколько аминокислотных замен и/или делеций в константной области.
В используемом в настоящем описании смысле антиген представляет собой остаток или молекулу, которая содержит эпитоп, с которым антитело может специфично связываться. Как таковой, антиген также специфично связывается антителом.
В используемом в настоящем описании смысле эпитоп является термином, используемым в данной области, и относится к локализованной области антигена, с которой антитело может специфично связываться. Эпитоп может быть линейным эпитопом или конформационным, нелинейным или прерывистым эпитопом. В случае полипептидного антигена, например, эпитоп может представлять собой следующие друг за другом непрерывно аминокислоты полипептида (линейный эпитоп), или эпитоп может содержать аминокислоты из двух или более не следующих друг за другом областей полипептида (конформационный, нелинейный или прерывистый эпитоп). Специалисту в данной области будет понятно, что, в общем, линейный эпитоп может зависеть или может не зависеть от вторичной, третичной или четвертичной структуры.
В используемом в настоящем описании смысле термины иммуноспецифично связывает, иммуноспецифично распознает, специфично связывает и специфично распознает являются аналогичными терминами в контексте антител и относятся к молекулам, которые связываются с антигеном/эпитопом, как такое, связывание понятно специалисту в данной области. Например, молекула (например, антитело), которая специфично связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами, обычно с более низкой аффинностью, которую определяют, например, в иммуноанализах, анализах на основе резонанса поверхностного плазмона, например, Biacore™, платформа KinExA (Sapidyne Instruments, Boise, ID) или в других анализах, известных в данной области. В конкретном варианте моле- 6 037654 кулы, которые специфично связываются с антигеном, связываются с антигеном с Ka, которая, по меньшей мере, на 2 log, 2,5 log, 3 log, 4 log или больше, чем Ka в том случае, когда молекулы связываются с другим антигеном. В другом конкретном варианте молекулы, которые специфично связываются с антигеном, перекрестно не взаимодействуют с другими белками. В другом конкретном варианте молекулы, которые специфично связываются с антигеном, перекрестно нее взаимодействуют с другими не-CD47белками.
В используемом в настоящем описании смысле термин моноклональное антитело является хорошо известным в данной области термином, который относится к антителу, полученному из популяции гомогенных или по существу гомогенных антител. Термин моноклональное не ограничен каким либо конкретным способом получения антитела. В общем, популяция моноклональных антител может быть создана клетками, популяцией клеток или клеточной линией. В конкретных вариантах моноклональное антитело в используемом в настоящем описании смысле представляет собой антитело, продуцированной одной клеткой или линией клеток, при этом антитело иммуноспецифично связывается с эпитопом CD47, который определен, например, в ELISA или другом анализе связывания антигена или анализе конкурентного связывания, известном в данной области или описанном в примерах, предлагаемых в настоящем изобретении. В конкретных вариантах моноклональное антитело может быть химерным антителом или гуманизированным антителом. В некоторых вариантах моноклональное антитело является моновалентным антителом или поливалентным (например, бивалентным) антителом.
В используемом в настоящем описании смысле термин неприродная аминокислота относится к аминокислоте, которая не является протеиногенной аминокислотой или ее модифицированным посттрансляционно вариантом. В частности, термин относится к аминокислоте, которая не является одной из 20 обычных аминокислот или пирролизином или селеноцистеином или их модифицированными посттрансляционно вариантами.
В используемом в настоящем описании смысле термин поликлональные антитела относится к популяции антител, которая включает в себя множество разных антител, которые иммуноспецифично связываются с одним и тем же и/или с разными эпитопами в антигене или антигенах.
В используемом в настоящем описании смысле термины вариабельная область или вариабельный домен относится к части антитела, обычно части легкой или тяжелой цепи антитела, обычно примерно от 110 до 120 аминоконцевым аминокислотам в зрелой тяжелой цепи и примерно от 90 до 2100 аминоконцевым аминокислотам в зрелой легкой цепи. Вариабельные области содержат определяющие комплементарность области (CDR), фланкированные каркасными областями (FR). Обычно пространственная ориентация CDR и FR представлена следующим образом, в направлении от N-конца к С-концу: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Не имея намерения быть связанными с каким-либо конкретным механизмом или теорией, полагают, что CDR легкой и тяжелой цепей, главным образом, ответственны за взаимодействие антитела с антигеном и за специфичность антитела по отношению к эпитопу. В конкретном варианте нумерация положений аминокислот в антителах, описанных в настоящей публикации, соответствует индексу EU, как описано Kabat с соавторами (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. В некоторых вариантах вариабельная область представляет собой вариабельную область человека. В некоторых вариантах вариабельная область содержит CDR грызунов (например, мыши или крысы) и каркасные области (FR) человека. В конкретных вариантах вариабельная область является вариабельной областью примата (например, человека или примата, отличного от человека). В некоторых вариантах вариабельная область содержит CDR грызунов (например, мыши или крысы) и каркасные области (FR) примата (например, человека или примата, отличного от человека). В качестве не ограничивающего примера вариабельную область, описанную в настоящей публикации, получают в результате сборки двух или более фрагментов последовательностей человека в составную человеческую последовательность.
В некоторых аспектах CDR антитела могут быть определены согласно (i) системе нумерации Kabat (Kabat с соавторами (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391; и Kabat с соавторами (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242); или (ii) схеме нумерации Chothia, на которую в настоящем описании будут сделаны ссылки в виде CDR Chothia (смотри, например, Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol., 196: 901-917; AlLazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273: 927-948; Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol., 227:799-817; Tramontano A et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(1): 17 5-82; и патент США № 7709226); или (iii) системе нумерации ImMunoGeneTics (IMGT), например, как описано в Lefranc, M.-P., 1999, The Immunologist, 7: 132-136 и Lefranc, M.-P. et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27: 209-212 (CDR IMGT); или (iv) MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262: 732-745. Смотри также, например, публикации Martin, A., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domens, в Antibody Engineering, Rontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422439, Springer-Verlag, Berlin (2001).
Что касается системы нумерации Kabat, то CDR в молекуле тяжелой цепи антитела обычно присутствуют в положениях аминокислот 31-35, которые необязательно могут содержать одну или две дополнительных аминокислоты после 35 (называемых согласно системе нумерации Kabat 35A и 35В) (CDR1), в положениях аминокислот 50-65 (CDR2), и положениях аминокислот 95-102 (CDR3). При использова
- 7 037654 нии системы нумерации Kabat, CDR в молекуле легкой цепи антитела обычно присутствуют в положениях аминокислот 24-34 (CDR1), положениях аминокислот 50-56 (CDR2) и положениях аминокислот 8997 (CDR3). Как хорошо известно специалистам в данной области, при использовании системы нумерации Kabat фактическая линейная аминокислотная последовательность вариабельного домена антитела может содержать меньше или может содержать дополнительные аминокислоты вследствие укорочения или удлинения FR и/или CDR, и при этом номер аминокислоты по системе Kabat необязательно является таким же, как линейный номер аминокислоты.
Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY) , любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi или IgA2) или любого подкласса (например, IgG2a или IgG2b или их смесь) молекулы иммуноглобулина. В некоторых вариантах антитела, описанные в настоящей публикации, представляют собой IgG-антитела (например, IgG человека) или их класс (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека) или подкласс.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь антитела, например, отдельную легкую цепь и тяжелую цепь. Что касается легкой цепи, то в конкретном варианте легкая цепь антитела, описанного в настоящей публикации, является легкой цепью каппа (к). В другом конкретном варианте легкая цепь антитела, описанного в настоящей публикации, является легкой цепью лямбда (λ). В другом варианте легкая цепь представляет собой смешанную последовательность, например, вариабельная легкой цепи содержит последовательность легкой цепи каппа, а константная область легкой цепи содержит последовательность легкой цепи лямбда, или наоборот. В некоторых вариантах легкая цепь антитела, описанного в настоящей публикации, является легкой цепью каппа человека или легкой цепью лямбда человека. Не ограничивающие примеры последовательностей константных областей человека описаны в данной области, например, смотри патент США № 5693780 и Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например, моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-анmитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению с тем случаем, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессировано в БКсистеме, и при этом анти-CD47-антитело содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, например, 1-15 аминокислотных модификаций по сравнению с исходным анти-CD47-антителом. В конкретном аспекте одна или несколько аминокислотных модификаций, например, 1-15 аминокислотных модификаций находятся в тяжелой цепи или VH (например, SEQ ID NO: 1). В конкретном аспекте одна или несколько аминокислотных модификаций, например, 1-15 аминокислотных модификаций находятся в каркасной области VH (например, SEQ ID NO: 1) . В некоторых аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, которое является вариантом исходного анти-CD47-антитела, содержит CDR (например, CDR Kabat) исходного анти-CD47-антитела.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-анmитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессируется в БКсистеме, и при этом анти-CD47-антитело содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, например, 1-15 аминокислотных модификаций, по сравнению с исходным анти-CD47-антителом. В конкретном аспекте одна или несколько аминокислотных модификаций, например, 5 или 14 аминокислотных модификаций, находятся в тяжелой цепи или VH (например, SEQ ID NO: 1) . В конкретном аспекте одна или несколько аминокислотных модификаций, например, 5, 10, 13 или 14 аминокислотных модификаций, находятся в каркасной области VH (например, SEQ ID NO: 1) . В конкретном аспекте одна или несколько аминокислотных модификаций, например, 5, 13 или 14 аминокислотных модификаций, находятся в каркасной области VH (например, SEQ ID NO: 1) . В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагается анти-CD47-антитело, которое является вариантом исходного анmи-CD47-антитела, содержащим CDR (например, CDR Kabat) исходного анти-CD47-антитела. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом аллотипа Z изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG4, таким как IgG4P или IgG4PE.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например, моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-анmитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случае, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессируется в БК
- 8 037654 системе. В конкретных вариантах исходным анти-CD47-антителом является антитело АВ6.12 (смотри, например, публикацию заявки на выдачу патента США № US 2014/0140989 А1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме). Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) антитела АВ6.12 приведены ниже, где CDR Kabat подчеркнуты. В некоторых аспектах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, является вариантом исходного антитела АВ6.12 и содержит CDR (например, CDR Kabat) исходного антитела АВ6.12, например SEQ ID NO: 14-19. В некоторых аспектах такое анти-CD47антитело является антителом изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых аспектах такое антиCD47-антитело является антителом изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом аллотипа Z изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG4, таким как IgG4P или IgG4PE.
Вариабельная область тяжелой цепи (VH) анти-CD47-антитела АВ6.12 (CDR Kabat 1-3 подчеркнуты, SEQ ID NO: 14-16):
QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDTE
YAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV (SEQ
ID NO: 1)
Вариабельная область легкой цепи (VL) анти-CD47-антитела АВ6.12 (CDR Kabat 1-3 подчеркнуты, SEQ ID NO: 17-19):
ΝIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGVPSRFSG
SGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 12)
В конкретном варианте анти-CD47? описанное в настоящей публикации, содержит одну или несколько аминокислотных модификаций (например, 1-15 аминокислотных модификаций), например в каркасной области VH исходного антитела, например, исходного антитела, выбранного из анти-CD47антител, описанных в публикации заявки на выдачу патента США № US 2014/0140989 А1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме, например, анти-CD47-антител, описанных в таблице 1 в публикации заявки на выдачу патента США № US 2014/0140989 А1 (например, антиCD47-антител 2А1, АВ2.03, АВ2.04, АВ2.05, АВ2.06, АВ2.07, АВ2.08, АВ2.09, АВ2.13, АВ3.09, АВ6.12, АВ6.13, АВ6.14, АВ6.17, АВ10.13, АВ10.14, АВ11.05, АВ12.05, АВ15.05, АВ16.05, АВ17.05, АВ22.05, АВ23.05, АВ24.05 и АВ25.05).
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например, моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-антитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессируется в БКсистеме, и при этом анти-CD47-антитело содержит VH, содержащую следующую последовательность от N-конца к С-концу:
X1QX2QLVQSGAEVKKX3GX4SVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQX5LEWMGWIDPDQGDTEY
AQKX6QX7RVTX8TX9DX10SX11STAYMELX12SLRSX13DTAX14YYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTT
VTV (SEQ ID NO: 20) ,
где подчеркнутые аминокислотные остатки х1-х14 расположены в порядке от N-конца к С-концу, где X1 представляет собой М или в положении X1 аминокислота отсутствует, X2 представляет собой аминокислоту с гидрофобными боковыми цепями, такую как М или V, X3 представляет собой Т или Р, X4 представляет собой S или А, X5 представляет собой кислоту, имеющую алифатические боковые цепи, такую как А или G, X6 представляет собой F или L, X7 представляет собой D или G, X8 представляет собой аминокислоту с гидрофобными боковыми цепями, такую как I или М, X9 представляет собой R или Т, X10 представляет собой R или Т, Xn представляет собой М или Т, X12 представляет собой S или R, X13 представляет собой отрицательно заряженную аминокислоту, такую как Е или D, и X14 представляет собой аминокислоту с гидрофобными боковыми цепями, такую как М или V.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, содержит VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20, где аминокислота в положении X1 является любой аминокислотой, такой как М, X2 не является М, X3 не является Т, X4 не является S, X5 не является А, X6 не является F, X7 не является D, X8 не является I, X9 не является R, X10 не является R, Xn не является М, X12 не является S, X13 не является Е, и/или X14 не является М. В конкретных аспектах любые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 из X1-X14 не являются указанными аминокислотами. В конкретных аспектах, аминокислотная последовательность VH не является аминокислотной последовательностью VH антитела АВ6.12, например, аминокислотная последовательность VH не является последовательностью SEQ ID NO: 1.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, содержит VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20, где аминокислота в положении X7 не является G, X9 не
- 9 037654 является А и/или Хц не является S. В конкретных аспектах любые 1, 2 или 3 из Х7, Х9 и Х11 не являются указанными аминокислотами. В конкретных аспектах когда аминокислота в положении X7 является G,
X8 представляет собой М и/или Х10 представляет собой Т, X9 не является А и/или Х11 не является S.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, содержит VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20, где аминокислота в положении X7 не является G, X8 не является М, X9 не является Е, Х10 не является Т и/или X11 не является Т. В конкретных аспектах любые 1, 2, 3 или 4 из Х7-Х11 не являются указанными аминокислотами. В конкретных аспектах, когда аминокислота в положении X7 является G, X8 представляет собой М, Х10 представляет собой Т, X9 не является Е и Хп представляет собой Т.
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, содержит VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 20, при этом VH не содержит аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, описанных в публикации заявки на выдачу патента США № US2014/0140989 А1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. В конкретном аспекте анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, содержит VH, содержащую консенсусную последовательность SEQ ID NO: 20, при этом VH не содержит каркасных областей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, описанных в публикации заявки на выдачу патента США № US2014/0140989 А1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.
В конкретных аспектах Х1 представляет собой М, Х2 представляет собой V, Х3 представляет собой Р, Х4 представляет собой А, Х5 представляет собой G, Х6 представляет собой L, Х7 представляет собой G, Х8 представляет собой М, Х9 представляет собой Т, Х10 представляет собой Т, Х11 представляет собой Т, Х12 представляет собой R, Х13 представляет собой D и/или Х14 представляет собой V. В конкретных вариантах любые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 из Х1-Х14 означают указанные аминокислоты.
В конкретных аспектах Х1 представляет собой М, Х2 представляет собой М, Х3 представляет собой Р, Х4 представляет собой S, Х5 представляет собой А, Х6 представляет собой F, Х7 представляет собой G, Х8 представляет собой I, Х9 представляет собой R, Х10 представляет собой R, Х11 представляет собой Т, Х12 представляет собой R, Х13 представляет собой Е и/или Х14 представляет собой V. В конкретных вариантах любые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 из Х1-Х14 являются указанными аминокислотами.
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, не является антителом АВ6.12. В конкретном аспекте анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, не содержит VH (например, SEQ ID NO: 1) и/или VL (например, SEQ ID NO: 12) антитела АВ6.12.
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит одну из следующих аминокислотных последовательностей VH, приведенных в табл. 1.
Таблица 1. Аминокислотная последовательность VH
SEQ ID NO: Описание Аминокислотная последовательность VH
20 Консенсусна я X1QX2QLVQS GAEVKKX3GX4 S VKVS CKASGFNIKDYYLHWVRQ APGQX5LEWMGWIDPDQGDTEYAQKX6QX7RVTX8TX9DX10SX11 S TAYMELX12S LRSX13DTAX14YYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTT VTV
21 13m MQVQLVQS GAEVKKPGASVKVS CKAS G ΕΝIKDYYLHWVRQAPG QGLEWMGWIDPDQGDTEYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRS LRSDDTAVYYCNAAYGS S SYPMDYWGQGT TVTV
22 5m MQMQLVQS GAEVKKPGS SVKVS CKAS G ΕΝIKDYYLHWVRQAPG QALEWMGWIDPDQGDTEYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRS LRSDDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например, моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-антитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случае, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессируется в БКсистеме, и при этом анти-CD47-антитело содержит VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 21. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело представляет собой антитело изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом аллотипа Z изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG4, таким как IgG4P или IgG4PE.
- 10 037654
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например, моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-антитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессируется в БКсистеме, и при этом анти-CD47-антитело содержит VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 22. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом аллотипа Z изотипа IgG1. В некоторых аспектах такое анти-CD47-антитело является антителом изотипа IgG4, таким как IgG4P или IgG4PE.
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело (IgG1-13m), предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь IgG1, содержащую аминокислотную последовательность, которая указана ниже: MQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIDPDQGDT
EYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 5).
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело (IgG1-13mZ), предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь аллотипа IgG1-Z, содержащую аминокислотную последовательность, которая указана ниже:
MQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIDPDQGDT
EYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 6).
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело (IgG1-5m), предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь IgG1, содержащую аминокислотную последовательность, которая указана ниже:
MQMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDT
EYAQKFQGRVTITRDRSTSTAYMELRSLRSEDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 7).
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело (IgG4P-13m), предлагаемое в настоящем изобретении, содержит антитело IgG4P, содержащее аминокислотную последовательность, которая указана ниже:
- 11 037654
MQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIDPDQGDT
EYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSSAS
TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO: 8).
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело (IgG4P-5m), предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь IgG4P, содержащую аминокислотную последовательность, которая указана ниже:
MQMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDT
ЕYAQKFQGRVTITRDRS Т S TAYMELRS LRSEDTAVYYCNAAYGS S SYPMDYWGQGT TVTVS SAS
TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSLGK (SEQ ID NO: 9).
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело (IgG4PE-13m) , предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь IgG4PE, содержащую аминокислотную последовательность, которая указана ниже:
MQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQGLEWMGWIDPDQGDT
EYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTVSSAS
TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO: 10).
В конкретном аспекте анти-CD47-антитело (IgG4PE-5m), предлагаемое в настоящем изобретении, содержит тяжелую цепь IgG4PE, содержащую аминокислотную последовательность, которая указана ниже:
MQMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQALEWMGWIDPDQGDT
ЕYAQKFQGRVTITRDRS Т S TAYMELRS LRSEDTAVYYCNAAYGS S SYPMDYWGQGT TVTVS SAS
TKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA
VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK (SEQ ID NO: 11).
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например, моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-антитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело, в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессируется в БКсистеме, и при этом анти-CD47-антитело содержит легкую цепь, содержащую константную область легкой цепи каппа или лямбда (например, константную область легкой цепи каппа или лямбда человека), например SEQ ID NO: 13.
- 12 037654
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается антитело, например, моноклональное антитело, которое специфично связывается с CD47 человека, при этом такое анти-CD47-антитело является вариантом исходного анти-CD47-антитела, при этом анти-CD47-антитело, в случае получения с использованием бесклеточной (БК) системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное анти-CD47-антитело экспрессируется в БКсистеме, и при этом анти-CD47-антитело содержит (i) VH, описанную в настоящей публикации (например, SEQ ID NO: 20, 21 или 22) или тяжелую цепь, описанную в настоящей публикации (например, любую из SEQ ID NO: 5-11), и (ii) легкую цепь, содержащую константную область легкой цепи каппа или лямбда (например, константную область легкой цепи каппа или лямбда человека), например, SEQ ID NO: 13, которая указана ниже (легкая цепь анти-CD47-антитела (IgK)), или SEQ ID NO: 13 без аминокислоты М на N-конце:
MNIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCKASQDIHRYLSWFQQKPGKVPKHLIYRANRLVSGV
PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD
EQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13)
В конкретном варианте анти-CD47, описанное в настоящей публикации, не является анти-CD47антителом, описанным в публикации заявки на выдачу патента США № US 2014/0140989 А1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме, например, любым из анти-CD47антител, приведенных в табл. 1 в указанной публикации (например, анти-CD47-антитело 2А1, АВ2.03, АВ2.04, АВ2.05, АВ2.06, АВ2.07, АВ2.08, АВ2.09, АВ2.13, АВ3.09, АВ6.12, АВ6.13, АВ6.14, АВ6.17,
АВ10.13, АВ10.14, АВ11.05, АВ12.05, АВ15.05, АВ16.05, АВ17.05, АВ22.05, АВ23.05, АВ24.05 и
АВ25.05) или каким-либо антителом, содержащим любую из последовательностей SEQ ID NO: 5-30, приведенных в указанной публикации.
В некоторых вариантах анти-CD47-антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, или его анти генсвязывающий фрагмент относится к изотипу IgG. В некоторых вариантах константная область антитела является областью изотипа IgG1 человека, имеющей аминокислотную последовательность:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
KSCDKTHTCP PCPAPE|LL]GG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS
HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQY^ STYRWSVLT VLHQDWLNGK
EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV
MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34)
В некоторых вариантах константная область IgG1 человека модифицирована в положении аминокислоты Asn297 (обведено прямоугольником, нумерация Kabat), чтобы предотвратить гликозилирование антитела, например Asn297Ala (N297A). В некоторых вариантах константная область антитела модифицирована в положении аминокислоты Leu235 (нумерация Kabat), чтобы изменить взаимодействия с Fcрецепторами, например Leu235Glu (L235E) или Leu235Ala (L235A). В некоторых вариантах константная область антитела модифицирована в положении аминокислоты Leu234 (нумерация Kabat), чтобы изменить взаимодействия с Fc-рецепторами, например, Leu234Ala (L234A). В некоторых вариантах константная область антитела изменена в обоих положениях аминокислот 234 и 235, например Leu234Ala и Leu235Ala (L234A/L235A) (индекс EU, Kabat с соавторами, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest).
В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагается константная область анти-CD47антитела изотипа IgG2 человека, имеющая аминокислотную последовательность:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER
KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP
EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQE^STER WSVLTWHQ DWLNGKEYKC
KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG
FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN
VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 35)
В некоторых вариантах константная область IgG2 человека модифицирована в положении аминокислоты Asn297 (заключено в прямоугольник, нумерация Kabat), чтобы предотвратить гликозилирование антитела, например, Asn297Ala (N297A).
- 13 037654
В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагается константная область анти-CD47антитела изотипа IgG3 человека, имеющая аминокислотную последовательность:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRVEL
KTPLGDTTHT CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSC
DTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED
PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK PREEQY^STF RWSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE WESSGQPENN YNTTPPMLDS NIFSCSVMHE ALHN^FTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: DGSFFLYSKL : 36) TVDKSRWQQG
В некоторых вариантах константная область IgG3 человека модифицирована в положении аминокислоты Asn297 (заключено в прямоугольник, нумерация Kabat), чтобы предотвратить гликозилирование антитела, например, Asn297Ala (N297A). В некоторых вариантах константная область IgG3 человека модифицирована в положении аминокислоты 435, чтобы продлить время полужизни, например, Arg435His (R435H) (индекс EU, Kabat с соавторами, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest).
В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагается константная область анти-CD47 антитела изотипа IgG4 человека, имеющая аминокислотную последовательность:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK
WNSGALTSGV
DYFPEPVTVS
HTFPAVLQSS
GLYSLSSWT
VPSSSLGTKT
YTCNVDHKPS
NTKVDKRVES kygppcp||cp apef|l|ggpsv
FLFPPKPKDT
LMISRTPEVT
CVWDVSQED
PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK
PREEQF^STY
RWSVLTVLH
QDWLNGKEYK
CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK
GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK
NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVE
WESNGQPENN
YKTTPPVLDS
DGSFFLYSRL
TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSLGK (SEQ ID
NO: 37)
В некоторых вариантах константная область IgG4 человека модифицирована в шарнирной области, чтобы предотвратить или уменьшить обмен нитями, например, Ser228Pro (S228P). В других вариантах константная область IgG4 человека модифицирована в положении аминокислоты 235, чтобы изменить взаимодействия с Fc-рецепторами, например, Leu235Glu (L235E). В некоторых вариантах константная область IgG4 человека модифицирована в шарнире и в положении аминокислоты 235, например, Ser228Pro и Leu235Glu (S228P/L235E). В некоторых вариантах константная область IgG4 человека модифицирована в положении аминокислоты Asn297 (нумерация Kabat), чтобы предотвратить гликозилирование антитела, например, Asn297Ala (N297A). В некоторых вариантах осуществления изобретения константная область IgG4 человека модифицирована в положениях аминокислот Ser228, Leu235 и Asn297 (например, S228P/L235E/N297A) (индекс EU, Kabat с соавторами, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest). В других вариантах осуществления изобретения антитело является антителом подкласса IgG4 человека и не имеет гликозилирования. В таких вариантах гликозилирование может быть исключено в результате мутации в положении 297 (нумерация Kabat), например N297A. В других вариантах гликозилирование может быть исключено при продуцировании антитела в клетке-хозяине, которая не обладает способностью к посттрансляционному гликозилированию, например, в системе, полученной на основе бактерий или дрожжей, или в модифицированной системе экспрессии в клетках млекопитаю щих.
В некоторых вариантах константная область IgG человека модифицирована, чтобы изменить зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC) , например, имеет аминокислотные модификации, описанные в Natsume et al., 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J. Immunol, 166(4): 2571-5; Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276(9): 6591-6604; Stavenhagen et al., 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J. Immunol., 148: 3461-3468; приведенные в обзоре Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11.
В некоторых вариантах константная область IgG человека модифицирована, чтобы индуцировать гетеродимеризацию. Например, при наличии аминокислотной модификации в домене СН3 в положении аминокислоты Thr366, которая может заменена более объемной аминокислотой, например, Try (T366W), он способен предпочтительно спариваться со вторым доменом СН3, имеющим аминокислотные модификации на менее объемные аминокислоты в положениях Thr366, Leu368 и Tyr407, например, Ser, Ala и Val, соответственно (T366S/L368A/Y407V). Гетеродимеризация посредством модификаций СН3 может быть дополнительно стабилизирована введением дисульфидной связи, например, в результате замены
- 14 037654
Ser354 на Cys (S354C) и Y349 на Cys (Y349C) на противоположных доменах СН3 (обзор в Carter, 2001
Journal of Immunological Methods, 248: 7-15).
В других аспектах гликозилирование антитела отсутствует, но антитело не модифицировано в положении аминокислоты Asn297 (нумерация Kabat). В таких вариантах гликозилирование может быть, например, исключено при продуцировании антитела в клетке-хозяине, у которой отсутствует способность к посттрансляционному гликозилированию, например, в системе, полученной на основе бактерий или дрожжей, или в модифицированной системе экспрессии в клетках млекопитающих. В некоторых аспектах такая система может представлять собой БК-систему экспрессии.
В некоторых вариантах анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотные последовательности, имеющие определенный процент идентичности исходному антителу.
Определение идентичности в процентах между двумя последовательностями (например, аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты) может быть осуществлено с использованием математического алгоритма. Не ограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм, описанный в Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264 2268, модифицированный, как описано в Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403. Поиск нуклеотидов BLAST может быть осуществлен с использованием установок параметров в программе NBLAST, например, оценка=100, длина слова=12, чтобы получить нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам нуклеиновых кислот, описанным в настоящей публикации. Поиски белков BLAST могут быть осуществлены с использованием установок параметров в программе XBLAST, например, оценка 50, длина слова=3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекуле белка, описанной в настоящей публикации. Чтобы получить выравнивания с пробелами в целях сравнения, можно использовать Gapped BLAST, который описан в Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389 3402. Альтернативно, можно использовать PSI BLAST, чтобы осуществить итеративный поиск, который выявляет отдаленные взаимосвязи между молекулами (там же). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI Blast, можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) (смотри, например, National Center for Biotechnology Information (NCBI) на веб-сайте в интернете, ncbi.nlm.nih.gov). Другим предпочтительным не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller, 1988, CABIOS 4: 11 17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета компьютерных программ для выравнивания последовательностей GCG. В случае применения программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать таблицу взвешенных остатков РАМ120, штраф за длину пробела 12 и штраф за пробел 4.
Идентичность в процентах между двумя последовательностями может быть определена с использованием методик, сходным с методиками, описанными выше, с разрешением или без разрешения пробелов. При вычислении идентичности в процентах обычно посчитывают только точные совпадения.
В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен VL, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, при этом антитело специфично связывается с CD47. В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен VL, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом антитело содержит CDR (например, CDR 1-3 VL), которые идентичны CDR (например, CDR 1-3 VL) последовательности SEQ ID NO: 12 (например, SEQ ID NO: 1719).
В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, при этом антитело специфично связывается с CD47. В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен легкой цепи, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом антитело содержит CDR (например, CDR 1-3 VL), которые идентичны CDR (например, CDR 1-3 VL) последовательности SEQ ID NO: 13 (например, SEQ ID NO: 17-19).
В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит домен VH, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей
- 15 037654 мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом анmи-CD47-антитело, в случае получения с использованием бесклеточной системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случае, когда исходное антитело продуцируется в БК-системе экспрессии. В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен VH, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом антитело содержит CDR (например, CDR 1-3 VL), которые идентичны CDR (например, CDR 1-3 VL) последовательности SEQ ID NO: 1 (например, SEQ ID NO: 14-16).
В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, при этом антитело специфично связывается с CD47 и при этом анти-CD47-антитело в случае получения с использованием бесклеточной системы экспрессии имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное антитело продуцируется в БК-системе экспрессии. В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен тяжелой цепи, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом антитело содержит CDR (например, CDR 1-3 VL) , которые идентичны CDR (например, CDR 1-3 VL) последовательности SEQ ID NO: 2 (например, SEQ ID NO: 17-19).
В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом анти-CD47-антитело, в случае получения с использованием бесклеточной системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное антитело продуцируется в БК-системе экспрессии. В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен тяжелой цепи, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом антитело содержит CDR (например, CDR 1-3 VL) , которые идентичны CDR (например, CDR 1-3 VL) последовательности SEQ ID NO: 3 (например, SEQ ID NO: 17-19).
В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, при этом антитело специфично связывается с CD47 и при этом анти-CD47-антитело, в случае получения с использованием бесклеточной системы экспрессии, имеет более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению со случаем, когда исходное антитело продуцируется в БК-системе экспрессии. В некоторых вариантах антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен тяжелой цепи, имеющий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, при этом антитело специфично связывается с CD47, и при этом антитело содержит CDR (например, CDR 1-3 VL) , которые идентичны CDR (например, CDR 1-3 VL) последовательности SEQ ID NO: 4 (например, SEQ ID NO: 17-19).
В некоторых аспектах анти-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют одну или несколько требуемых характеристик, таких как, в качестве не ограничивающего примера, блокирование взаимодействия между CD47 и его лигандом SIRPa и/или стимуляция (например, индукция или усиление) фагоцитоза без стимуляции (например, индукции или усиления) гемагглютинации эритроцитов, а также противоопухолевая активность. Например, анmи-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, блокируют по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% взаимодействия между CD47 и SIRPa, по сравнению с уровнем взаимодействия между CD47 и SIRPa в отсутствие анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, стимулируют
- 16 037654 (например, индуцируют или усиливают) фагоцитоз клеток, например, CD47-экспрессирующих клеток (например, клеток CCRF-CEM), например, макрофагами. В одном аспекте уровень фагоцитоза в присутствии анти-CD47-антител, описанных в настоящей публикации, возрастает по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по сравнению с уровнем фагоцитоза в присутствии анти-CD47-антител, описанных в настоящей публикации.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, не стимулируют (например, не индуцируют или не повышают), или не вызывают значимого уровня агглютинации клеток, например, анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, не стимулируют (например, не индуцируют или не повышают) или не вызывают значимого уровня гемагглютинации эритроцитов. В одном аспекте уровень агглютинации в присутствии анти-CD47-антител, описанных в настоящей публикации, снижается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 99% по сравнению с уровнем агглютинации в присутствии анти-CD47 антител, которые как известно, индуцируют агглютинацию, таких как мышиное антитело МСА911 против CD47 человека (BRIC126) . В некоторых аспектах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, не стимулируют (например, не индуцируют или не повышают) или не вызывают значимого уровня агглютинации, если уровень агглютинации в присутствии анти-CD47-антител, описанных в настоящей публикации, снижен по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 99% по сравнению с уровнем агглютинации в присутствии существующих анти-CD47-антител, которые, как известно, индуцируют агглютинацию, таких как мышиное антитело МСА911 против CD47 человека (BRIC126).
Анти-CD47-антител, описанные в настоящей публикации, также включают моноклональные антитела, которые специфично связывают CD47, при этом антитело не стимулирует (например, не индуцирует или не повышает) или не вызывает значимого уровня агглютинации, например, гемагглютинации красных кровяных клеток (гемагглютинации RBC).
В некоторых аспектах уровень истощения RBC определяют посредством измерения количества RBC у субъекта после введения средства для лечения, например, анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации. В некоторых вариантах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, не стимулируют (например, не индуцируют или не повышают) или не вызывают значимый уровень истощения RBC, если количество RBC у субъекта после введения анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, находится в пределах нормы для здорового субъекта. Например, количество RBC в норме у здорового мужчины составляет примерно от 4,7 до примерно 6,1 миллионов клеток на микролитр образца крови. Например, количество RBC в норме у здоровой женщин составляет от 4,2 до примерно 5,4 миллионов клеток на микролитр образца крови. В некоторых аспектах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, не стимулируют (например, не индуцируют или не повышают) или не вызывают значимого уровня истощения RBC, если количество RBC у субъекта после введения (например, через 5 мин, 10 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 12 часов, 24 часа, 2 дня, 4 дня, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца или больше) анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, составляет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% от количества RBC перед введением. В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, не стимулируют (например, не индуцируют или не повышают) или не вызывают значимого уровня истощения RBC, если количество RBC у субъекта после введения (через 5 мин, 10 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 12 часов, 24 часа, 2 дня, 4 дня, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца или больше) анти-CD47 антитела, описанного в настоящей публикации, составляет по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 99 или 99,5% от количества RBC у субъекта после введения плацебо (например, наполнителя). Количество RBC определяют стандартными для данной области способами.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, не стимулируют (например, не индуцируют или не повышают) или не вызывают значимого уровня истощения тромбоцитов. Например, введение анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, приводит к процентному содержанию оставшихся тромбоцитов по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%.
Также анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, включают без ограничения антитела, которые не связываются или обладают низкой аффинностью связывания с FcY-рецептором (FcyR). Например, константная область анти-CD47-антитела, например, в случае получения с использованием БК-системы экспрессии, имеет более низкую аффинность связывания с Fcy, чем константная область анти-CD47-антитела, например, в случае получения с использованием системы экспрессии в клетке
- 17 037654 хозяине (например, в клетках СНО).
Специалистам в данной области будет понятно, что можно количественно оценить, без излишнего экспериментирования, уровень агглютинации, например, уровень гемагглютинации RBC. Например, специалистам в данной области будет понятно, что уровень гемагглютинации устанавливают, измеряя площадь пятна RBC после осуществления анализа гемагглютинации в присутствии описанных антиCD47-антител, как описано в примерах ниже. В некоторых случаях, площадь пятна RBC в присутствии анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, сравнивают с площадью пятна RBC в отсутствие анти-CD47-антитела, например, при наличии нулевой гемагглютинации. Таким образом, гемагглютинацию количественно оценивают относительно контрольного исходного уровня. Увеличенная площадь пятна RBC соответствует более высокому уровню гемагглютинации.
Альтернативно также можно использовать денситометрию пятна RBC, чтобы количественно оценить гемагглютинацию.
Специалистам в данной области будет понятно, что можно количественно оценить, без излишнего экспериментирования, уровень истощения RBC. Например, специалистам в данной области будет понятно, что уровень истощения RBC устанавливают, например, измеряя количество RBC (т.е., общее количество RBC в образце крови), например, с использованием счетчика клеток или гемацитометра. Специалистам в данной области будет понятно, что RBC из образца крови перед подсчетом необязательно могут быть выделены посредством фракционирования цельной крови с использованием, например, центрифугирования. В некоторых случаях количество RBC в присутствии анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, сравнивают с количеством RBC в отсутствие CD47-антитела, например, при наличии нулевого истощения RBC. Таким образом, уровень истощения RBC нормализуют относительно контрольного исходного уровня.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, проявляют ингибирующую активность, например, ингибируя экспрессию CD47 (например, ингибируя экспрессию CD47 на поверхности клеток), его активность и/или передачу сигнала, или препятствуя взаимодействию между CD47 и SIRPa. В некоторых аспектах анти-CD47 антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, полностью или частично снижают или иным образом модулируют экспрессию или активность CD47 при связывании или ином взаимодействии с CD47, например, с CD47 человека. Снижение или модулирование биологической функции CD47 является полным, значимым или частичным при взаимодействии между антителами и полипептидом и/или пептидом CD47 человека. Считают, что анти-CD47-антиmела, описанные в настоящей публикации, полностью ингибируют экспрессию или активность CD47, когда уровень экспрессии или активности CD47 в присутствии антитела снижается по меньшей мере на 95%, например, на 96, 97, 98, 99 или 100% по сравнению с уровнем экспрессии или активности CD47 в отсутствие взаимодействия, например, связывания с антителом, описанным в настоящей публикации. В конкретном аспекте считают, что анти-CD47-антитела значимо ингибируют экспрессию или активность CD47, когда уровень экспрессии или активности CD47 в присутствии CD47-антитела снижается по меньшей мере на 50%, например, на 55, 60, 75, 80, 85 или 90% по сравнению с уровнем экспрессии или активности CD47 в отсутствие связывания с CD47-антителом, описанным в настоящей публикации. В некоторых аспектах считают, что анти-CD47-антитела частично ингибируют экспрессию или активность CD47, когда уровень экспрессии или активности CD47 в присутствии антитела снижается менее чем на 95%, например, на 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 85 или 90% по сравнению с уровнем экспрессии или активности CD47 в отсутствие взаимодействия, например, связывания с антителом, описанным в настоящей публикации.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат один или несколько неприродных аминокислотных остатков в сайт-специфичных положениях. Смотри, например, публикацию заявки на выдачу патента США № US 2014/0046030 А1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. В конкретных аспектах неприродные аминокислотные остатки в сайт-специфичных положениях создают преимущество в отношении выхода продукции антител, растворимости, аффинности связывания и/или активности. Не ограничивающие примеры неприродных аминокислот были описаны, смотри, например, публикацию заявки на выдачу патента США № US 2014/0066598 А1.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагаются анти-CD47-анmитела, конъюгированные с конъюгируемым остатком или средством, таким как метка или токсин. Конъюгируемым остатком может быть любой конъюгируемый остаток, который, как полагает специалист в данной области, является полезным. Например, конъюгируемым остатком может быть полимер, такой как полиэтиленгликоль, который может улучшать стабильность антитела in vitro или in vivo. Конъюгируемый остаток может обладать терапевтической активностью, при этом получают конъюгат антитело-лекарственное средство. Конъюгируемым остатком может быть молекулярной нагрузкой, которая является опасной для клеток-мишеней. Конъюгируемым остатком может быть метка, применимая для выявления или диагностики. В некоторых аспектах конъюгируемый остаток непосредственно связан с антителом ковалентной связью. В некоторых аспектах конъюгируемый остаток связан с антителом через линкер. В конкретных аспектах конъюгируемый остаток или линкер связан через одну из неприродных аминокислот анти- 18 037654
CD47-антитела. Примеры конъюгируемых остатков и линкеров были описаны, например, смотри публикацию заявки на выдачу патента США № US2014/0046030 А1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.
5.2. Получение антител
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящей публикации, которые иммуноспецифично связываются с CD47 (например, ECD CD47 человека) могут быть получены любым способом, известным в данной области, например, путем химического синтеза или с использованием основанных на рекомбинации способов экспрессии (например, в БК-системах экспрессии).
В таких способах можно использовать обычные методики молекулярной биологии, микробиологии, генетического анализа, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПЦР, синтеза и модификации олигонуклеотидов, гибридизации нуклеиновых кислот и родственных областей в данной области. Такие методики описаны, например, в публикациях, цитированных в настоящем описании, и полно освещенные в литературе. Смотри, например,, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные обновления); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные обновления) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть получены с использованием БК-системы экспрессии, например, БК-системы экспрессии, которая известна в данной области, и описана, например, в примерах ниже. Например, БК-системы экспрессии могут содержать бесклеточные экстракты, такие как бесклеточные экстракты S30 с DsbC и 20 аминокислотами (например, природными или неприродными), и необязательно, одно или несколько веществ: йодацетамид, глутамат магния, глутамат аммония, глутамат калия, пируват натрия, AMP, GMP, UMP и CMP, оксалат натрия, путресцин, спермидин, фосфат калия, Т7 RNAP и окисленный (GSSG) глутатион. Плазмиды для тяжелой цепи и плазмиды для легкой цепи добавляют непосредственно в композицию БКэкстракта для продукции полипептидов и очистки.
В некоторых аспектах БК-система экспрессии представляет собой систему транскрипции и трансляции in vitro, которая описана в публикации Yin et al., mAbs, 2012, 4: 217-225, включенной в виде ссылки в полном объеме. В некоторых аспектах для бесклеточной системы используют бесклеточной экстракт из эукариотической клетки или из прокариотической клетки. В некоторых аспектах прокариотической клеткой является Е. coli.
В конкретных вариантах для БК-системы экспрессии можно использовать систему, которая описана в публикации заявки на выдачу патента США № US 2014/0315245, которая включена в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме. Например, БК-система экспрессии может содержать бактериальный экстракт, содержащий систему окислительного фосфорилирования и компоненты, необходимые для бесклеточного синтеза белка, и в некоторых вариантах может дополнительно содержать экзогенный белок шаперон, например, протеиндисульфидизомеразу (PDI) или пептид-пролил-цис-транс-изомеразу. В конкретных вариантах PDI является членом семейства Dsb (образование дисульфидной связи) Е. coli, например, DsbA или DsbC. В некоторых вариантах, БК-система экспрессии содержит клеточный экстракт Е. coli штамма SBDG028, SBDG031 или SBDG044, которые описаны в публикации заявки на выдачу патента США № US 2014/0315245, который может быть получен, как описано в Zawada et al., Biotechnology and Bioengineering (2011) vol. 108, No. 7.
В конкретных аспектах анти-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат аминокислотные модификации, которые позволяют продуцировать антитело с использованием БКсистем экспрессии лучше, чем исходных антител. В конкретном аспекте анти-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, которые получены с использованием БК-систем экспрессии, являются агликозилированными.
Моноклональные антитела, например, могут быть получены с использованием широкого множества способов, известных в данной области, включая применение способов на основе гибридомы, рекомбинантов и фагового дисплея или их сочетания. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием способов на основе гибридом, включая способы, известные в данной области и описанные, например, в Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). Термин моноклональное антитело в используемом в настоящем описании смысле не ограничен антителами, полученными с использованием методики на основе гибридом. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием рекомбинации из клеток-хозяев, сконструированных так, чтобы они экспрессировали антитело, описанное в настоящей публикации (например, анти-CD47антитело, содержащее CDR из любого из антител Ab235-Ab255) или его фрагмент, например, легкую цепь и/или тяжелую цепь такого антитела.
- 19 037654
Кроме того, антитела, описанные в настоящей публикации, или их антигенсвязывающие фрагменты также могут быть созданы с использованием различных способов фагового дисплея, известных в данной области. В способах фагового дисплея функциональные домены антитело представлены на поверхности фаговых частиц, которые несут кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения антител, описанных в настоящей публикации, включают способы, описанные в Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; заявке PCT № PCT/GB91/O1 134; международных публикациях № WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO97/13844; и в патентах США № 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108.
Антитела, описанные в настоящей публикации, могу, например, включать химерные антитела. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части антитела получены из разных молекул иммуноглобулина. Например, химерное антитело может содержать вариабельную область моноклонального антитела мыши или крысы, слитую с константной областью антитела человека. Способы получения химерных антител известны в данной области. Смотри, например, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al. , 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; и патенты США № 5807715, 4816567, 4816397 и 6331415.
Антитела или антигенсвязывающие фрагменты
Полученные с использованием таких способов, которые описаны в настоящей публикации, можно выделить, используя стандартные, хорошо известные способы. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть соответствующим образом отделены, например, от культуральной среды, асцитной жидкости, сыворотки, клеточного лизата, веществ в реакционной смеси для синтеза или тому подобного обычными способами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, хроматография на белок А-сефарозе, гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. В используемом в настоящем описании смысле изолированное или очищенное антитело представляет собой по существу не содержащее клеточного материала или других белков из клеточного или тканевого источника, из которого получают антитело, или по существу не содержащее химических предшественников или других химических веществ в случае химического синтеза, или компонентов БК-системы экспрессии, используемой для получения антител.
Антитела, описанные в настоящей публикации, включают фрагменты антител, которые узнают специфичные антигены CD47, и могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области. Например, Fab- и F(ab')2-фрагменты, описанные в настоящей публикации, могут быть получены протеолитическим расщеплением молекул иммуноглобулина с использованием таких ферментов, как папаин (чтобы получить Fab-фрагменты) или пепсин (чтобы получить F(ab')2-фрагменты). Fab-фрагмент соответствует одному из двух плеч молекулы антитела и содержит полную легкую цепь, спаренную с VH и доменами СН1 тяжелой цепи. F(ab')2-фрагмент содержит два антигенсвязывающих плеча молекулы антитела, связанных дисульфидными связями в шарнирной области. Альтернативно, фрагменты антител, описанные в настоящей публикации, могут быть получены обычным образом хорошо известными способами экспрессии рекомбинантов. Смотри, например, публикацию РСТ № WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34: 26-34; и Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043.
Антитела, описанные в настоящей публикации, могут, например, включать гуманизированные антитела, например, деиммунизированные или составные антитела человека.
Гуманизированное антитело может содержать последовательности константной области человека. В некоторых вариантах гуманизированное антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE и любой изотип, включая IgGi, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах гуманизированное антитело может содержать константные последовательности легкой цепи каппа или лямбда.
Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием множества способов, известных в данной области, включая без ограничения CDR-прививки (европейский патент № ЕР 239400; международная публикация № WO 91/09967; и патенты США № 5225539, 5530101 и 5585089), винирование или изменение поверхности (европейские патенты № ЕР 592106 и ЕР 519596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; и Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969-973), перетасовку цепей (патент США № 5565332) и способы, описанные, например, в патенте США № 6407213, патенте США № 5766886, WO 9317105, Tan et al. , J. Immunol. 169: 1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5): 353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3): 267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10): 895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s- 5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2): 409-10 (1994) и Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3): 959-73 (1994). Смотри также публикацию патента США № US 2005/0042664 A1 (Feb. 24, 2005), при том каждая из публикаций включена в настоящее
- 20 037654 описание в виде ссылки в полном объеме.
Антитела, описанные в настоящей публикации, могут быть, например, полиспецифичными, например, биспецифичными антителами. Способы получения полиспецифичных (например, биспецифичных антител) описаны, смотри, например, патенты США № 7951917, 7183076, 8227577, 5837242, 5989830,
5869620, 6132992 и 8586713.
Однодоменные антитела, например, антитела, не имеющие легких цепей, могут быть получены способами, хорошо известными в данной области. Смотри Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231: 25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3): 253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4) : 277302; патент США № 6005079; и международные публикации № WO 94/04678, WO 94/25591 и WO 01/44301.
Антитела человека могут быть получены с использованием любого способа, известного в данной области. Например, можно использовать хорошо известных трансгенных мышей, которые неспособны экспрессировать функциональные эндогенные мышиные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены иммуноглобулинов человека. Альтернативно, можно использовать, например, способы фагового дисплея, описанные выше. Кроме того, в некоторых вариантах антитела человека могут быть получены, например, с использованием гибридом мыши-человека. Например, лимфоциты периферической крови человека, трансформированные вирусом Эпштейн-Барр (EBV), могут быть слиты с клетками миеломы мыши, чтобы получить гибридомы мыши-человека, секретирующие моноклональные антитела человека, и такие гибридомы мыши-человека могут быть подвергнуты скринингу, чтобы определить гибридомы, которые секретируют моноклональные антитела человека, которые иммуноспецифично связываются с антигеном-мишенью (например, ECD CD47 человека). Такие способы известны и описаны в данной области, смотри, например, Shinmoto et al., Cytotechnology, 2004, 46: 19-23; Naganawa et al., Human Antibodies, 2005, 14: 27-31.
Вариабельные домены антител с требуемыми специфичностями связывания (участками связывания антитело-антиген) могут быть слиты с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. Предпочтительно слияние с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере, часть шарнира, области СН2 и СН3. Предпочтительно наличие первой константной области тяжелой цепи (СН1), содержащей участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующий по меньшей мере, в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияние с тяжелой цепью иммуноглобулина, и при необходимости, легкой цепью иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы, и векторами совместно трансформируют подходящий организм хозяина. Подробности создания биспецифичных антител смотри, например, в Suresh et al. , Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Согласно другому способу, описанному в WO 96/27011, область контакта между парой молекул антител может быть сконструирована так, чтобы максимизировать процентное содержание гетеродимеров, которые извлекают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область контакта содержит, по меньшей мере, часть области СН3 константного домена антитела. В таком способе, одну или несколько небольших боковых цепей аминокислот из области контакта первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозином или триптофаном). Компенсирующие впадины идентичного или меньшего размера, чем крупная боковая цепь(цепи) создают на области контакта второй молекулы антитела. Заменяя крупные боковые цепи аминокислот меньшими по размеру боковыми цепями (например, аланином или треонином). Таким образом обеспечивается механизм увеличения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.
Биспецифичные антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифичные F(ab')2-антитела). Способы создания биспецифичных антител из фрагментов антител описаны в литературе. Например, биспецифичные антитела могут быть получены с использованием химического связывания. Brennan с соавторами (Science 229: 81 (1985)) описывают способ, в котором интактные антитела протеолитически расщепляют, чтобы создать фрагменты F(ab')2. Такие фрагменты восстанавливают в присутствии средства, образующего комплексы с дитиолом, арсенита натрия, чтобы стабилизировать локальные дитиолы и предотвратить образование межмолекулярных дисульфидов. Затем созданные Fab'-фрагменты превращают в производные тионитробензоата (TNB). Затем один из Fab'-TNB-производных снова превращают в Fab'-тиол восстановлением с использованием меркаптоэтиламина и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab'-TNB-производного, чтобы образовать биспецифичное антитело. Полученные биспецифичные антитела могут быть использованы в качестве средств для селективной иммобилизации ферментов.
5.2.1. Полинуклеотиды, клетки и векторы
В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагаются полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описанное в настоящей публикации, или его фрагмент (например, вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи), которая иммуноспецифично связывается с антигеном CD47, и векторы, например, векторы, содержащие такие полинуклеотиды, для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах (например, Е. coli и клетках млекопитающих). В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагаются клетки (например, клетки-хозяева). Также в настоящем изобретении предлагаются способы получения антитела и антиген
- 21 037654 связывающих фрагментов, описанных в настоящей публикации.
В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагаются полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или тяжелую цепь антитела, описанного в настоящей публикации. В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагаются полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь и тяжелую цепь антитела, описанного в настоящей публикации. Полинуклеотиды могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую цепь, содержащую FR и CDR VL антител, описанных в настоящей публикации. Полинуклеотиды могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь, содержащую FR и CDR VH антител, описанных в настоящей публикации. В конкретных вариантах полинуклеотид, описанный в настоящей публикации, кодирует область цепи VL SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 13 без аминокислоты М на N-конце. В конкретных вариантах полинуклеотид, описанный в настоящей публикации, кодирует область цепи VH с любой из последовательностей SEQ ID NO: 5-11, 2022. В конкретных вариантах полинуклеотид, описанный в настоящей публикации, кодирует легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. В конкретных вариантах полинуклеотид, описанный в настоящей публикации, кодирует тяжелую цепь, содержащую любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5-11.
В конкретных вариантах полинуклеотид, описанный в настоящей публикации, содержит нуклеотидную последовательность, представленную в табл. 2, кодирующую легкую цепь или тяжелую цепь анти-CD47-антитела, предлагаемого в настоящем изобретении.
Таблица 2. Нуклеотидные последовательности VH и VL анти-CD47-антитела
SEQ ID NO: Нуклеотидные последовательности
26 Ahth-CD47 IgGl-13m НС: ATGCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCGGAAGTCAAGAAACCGGGTGCAAGCG TCAAAGTTTCGTGCAAGGCGAGCGGTTTCAATATCAAAGACTATTATCTGCACTG GGTTCGTCAGGCTCCGGGCCAAGGCCTGGAGTGGATGGGTTGGATCGATCCGGAC CAGGGCGACACGGAGTACGCTCAGAAGCTGCAGGGTCGTGTTACCATGACCACCG ACACCAGCACGAGCACCGCGTACATGGAACTGCGCTCTCTGCGTTCGGATGATAC CGCGGTGTACTATTGCAACGCCGCGTACGGTAGCAGCAGCTATCCGATGGATTAT TGGGGTCAAGGCACTACGGTGACTGTCAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCGTCCG TGTTTCCGCTGGCGCCAAGCTCCAAGAGCACCAGCGGTGGCACGGCCGCACTGGG TTGTCTGGTAAAAGATTACTTTCCTGAGCCGGTGACCGTGAGCTGGAATTCAGGT GCACTGACGTCCGGCGTTCACACGTTCCCGGCAGTTCTGCAGAGCTCCGGTTTGT ACAGCCTGTCTAGCGTCGTGACGGTGCCGAGCAGCAGCCTGGGTACCCAAACCTA САТ Т Т G СААС G Т ТААС СATAAGС С GAGСААТАССAAAGТ Т GAGAAGAAAGТ СGAA CCTAAGAGCTGTGATAAGACGCATACCTGTCCGCCGTGCCCGGCACCGGAACTGT TGGGCGGTCCGAGCGTGTTCCTGTTTCCGCCGAAGCCGAAAGATACCCTGATGAT
- 22 037654
TAGCCGCACCCCTGAGGTGACGTGCGTGGTTGTGGACGTTAGCCATGAGGATCCA GAGGTCAAATTCAATTGGTATGTCGATGGTGTTGAGGTTCACAATGCCAAGACCA AACCGCGTGAAGAACAGTACAATAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACGGT CCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGTAAGGTCAGCAACAAG GCGCTGCCAGCACCGATTGAAAAGACCATTTCTAAAGCGAAAGGTCAGCCGCGTG AGCCGCAAGTCTATACCCTGCCGCCGTCGCGCGATGAGCTGACTAAAAACCAGGT TAGCCTGACGTGCCTGGTGAAAGGTTTCTACCCGAGCGACATCGCGGTGGAGTGG GAGAG СAAC G G T СAAC C GGAGAATAAC TACAAAAC СAC С С CAC CGGTCTTG GAC T CCGATGGCAGCTTCTTTCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAAAGCCGTTGGCA ACAGGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACCCAAAAATCCCTGAGCCTGAGCCCGGGTAAGTAA
27 Ahth-CD47 IgGl-13mZ HC: ATGCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCGGAAGTCAAGAAACCGGGTGCAAGCG TCAAAGTTTCGTGCAAGGCGAGCGGTTTCAATATCAAAGACTATTATCTGCACTG GGTTCGTCAGGCTCCGGGCCAAGGCCTGGAGTGGATGGGTTGGATCGATCCGGAC CAGGGCGACACGGAGTACGCTCAGAAGCTGCAGGGTCGTGTTACCATGACCACCG ACACCAGCACGAGCACCGCGTACATGGAACTGCGCTCTCTGCGTTCGGATGATAC CGCGGTGTACTATTGCAACGCCGCGTACGGTAGCAGCAGCTATCCGATGGATTAT TGGGGTCAAGGCACTACGGTGACTGTCAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCGTCCG TGTTTCCGCTGGCGCCAAGCTCCAAGAGCACCAGCGGTGGCACGGCCGCACTGGG TTGTCTGGTAAAAGATTACTTTCCTGAGCCGGTGACCGTGAGCTGGAATTCAGGT GCACTGACGTCCGGCGTTCACACGTTCCCGGCAGTTCTGCAGAGCTCCGGTTTGT ACAGCCTGTCTAGCGTCGTGACGGTGCCGAGCAGCAGCCTGGGTACCCAAACCTA CAT T T G CAAC G T TAAC CATAAG С C GAG СAATAC CAAG G T T GACAAAAAAG T T GAA CCGAAATCTTGTGATAAAACTCATACCTGTCCGCCGTGCCCGGCGCCTGAGCTGT TGGGTGGTCCGTCGGTCTTTCTGTTCCCGCCGAAGCCGAAAGACACCCTGATGAT TAGCCGCACCCCGGAAGTTACGTGCGTCGTCGTGGATGTCAGCCACGAGGACCCG GAGGTTAAGTTCAATTGGTATGTCGATGGCGTGGAGGTTCACAACGCGAAAACCA AGCCGCGTGAGGAACAATACAATAGCACGTATCGCGTAGTGAGCGTGCTGACCGT GCTGCACCAAGATTGGCTGAATGGTAAAGAATACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAG GCATTGCCGGCACCGATCGAAAAGACGATCAGCAAAGCGAAAGGCCAACCGCGTG AACCGCAGGTCTATACCCTGCCGCCGAGCCGTGAAGAAATGACGAAAAACCAAGT TAGCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCGAGCGACATCGCCGTCGAGTGG GAGTCTAACGGCCAGCCGGAAAACAATTACAAAACCACGCCGCCAGTCCTGGACA GCGACGGTAGCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTCGATAAAAGCCGTTGGCA
- 23 037654
GCAGGGTAATGTGTTCAGCTGCAGCGTTATGCATGAGGCGCTGCACAATCACTAT ACCCAGAAATCCTTGTCCCTGTCCCCGGGTAAGTAA
28 Ahth-GD47 IgGl-5m HC: ATGCAAATGCAATTGGTACAAAGCGGTGCGGAAGTAAAGAAACCGGGTTCGTCGG TAAAGGT TAGC T GTAAAGCTTCTGGCTT CAATAT CAAGGAT ТАС TAT С T GCAC T G GGTGCGTCAGGCGCCAGGTCAGGCCTTGGAATGGATGGGCTGGATTGACCCGGAT CAAGGTGACACCGAATATGCCCAAAAGTTTCAGGGTCGTGTGACCATCACCCGTG ACCGTAGCACCTCCACCGCATATATGGAGCTGCGTAGCCTGCGCAGCGAAGATAC TGCGGTGTATTACTGCAATGCGGCCTATGGTAGCAGCTCCTATCCGATGGATTAC TGGGGCCAGGGTACCACGGTGACGGTTAGCAGCGCAAGCACCAAGGGCCCGAGCG TTTTCCCTCTGGCGCCGAGCAGCAAAAGCACTAGCGGCGGTACGGCAGCCCTGGG TTGTCTGGTTAAAGATTACTTTCCGGAACCGGTTACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCGCTGACCAGCGGTGTTCACACGTTTCCGGCGGTTCTGCAGAGCAGCGGTCTGT ATTCTTTGAGCTCCGTCGTCACCGTCCCGTCTAGCTCGCTGGGCACGCAGACGTA CAT С T G CAAT G T TAAC CATAAG С C GAG CAATAC CAAAG T T GAGAAGAAAG T C GAA CCTAAGAGCTGTGATAAGACGCATACCTGTCCGCCGTGCCCGGCACCGGAACTGT TGGGCGGTCCGAGCGTGTTCCTGTTTCCGCCGAAGCCGAAAGATACCCTGATGAT TAGCCGCACCCCTGAGGTGACGTGCGTGGTTGTGGACGTTAGCCATGAGGATCCA GAGGTCAAATTCAATTGGTATGTCGATGGTGTTGAGGTTCACAATGCCAAGACCA AACCGCGTGAAGAACAGTACAATAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACGGT CCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGTAAGGTCAGCAACAAG GCGCTGCCAGCACCGATTGAAAAGACCATTTCTAAAGCGAAAGGTCAGCCGCGTG AGCCGCAAGTCTATACCCTGCCGCCGTCGCGCGATGAGCTGACTAAAAACCAGGT TAGCCTGACGTGCCTGGTGAAAGGTTTCTACCCGAGCGACATCGCGGTGGAGTGG GAGAG CAAC G G T CAAC C GGAGAATAAC TACAAAAC CAC С C CAC CGGTCTTG GAG T CCGATGGCAGCTTCTTTCTGTACTCTAAACTGACCGTTGACAAAAGCCGTTGGCA ACAGGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAC ACCCAAAAATCCCTGAGCCTGAGCCCGGGTAAGTAA
29 Ahth-CD47 IgG4-13m HC: ATGCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCGGAAGTCAAGAAACCGGGTGCAAGCG TCAAAGTTTCGTGCAAGGCGAGCGGTTTCAATATCAAAGACTATTATCTGCACTG GGTTCGTCAGGCTCCGGGCCAAGGCCTGGAGTGGATGGGTTGGATCGATCCGGAC CAGGGCGACACGGAGTACGCTCAGAAGCTGCAGGGTCGTGTTACCATGACCACCG ACACCAGCACGAGCACCGCGTACATGGAACTGCGCTCTCTGCGTTCGGATGATAC CGCGGTGTACTATTGCAACGCCGCGTACGGTAGCAGCAGCTATCCGATGGATTAT
- 24 037654
TGGGGTCAAGGCACTACGGTGACTGTCAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCGTCTG TGTTTCCGTTGGCACCGTGCAGCCGTAGCACTAGCGAATCCACTGCAGCGCTGGG TTGCCTGGTTAAGGACTATTTCCCGGAGCCGGTTACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCAGCGGTGTTCACACGTTTCCAGCCGTCCTGCAGAGCAGCGGTCTGT ACAGCCTGAGCTCGGTGGTGACCGTTCCGAGCAGCTCTCTGGGTACCAAAACCTA TACСTGTAATGTCGATСACAAACCGTСTAACACGAAGGTCGATAAACGTGTTGAA AGCAAGTACGGTCCGCCTTGTCCGCCGTGCCCGGCACCGGAGTTTCTGGGCGGTC CGTCCGTATTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGATACCTTGATGATTAGCCGTAC GCCAGAGGTCACGTGCGTCGTGGTGGACGTTAGCCAAGAGGATCCGGAAGTCCAA TTCAACTGGTACGTGGACGGTGTCGAGGTGCACAATGCCAAAACCAAGCCGCGTG AAGAACAGTTTAACAGCACTTACCGCGTCGTTAGCGTCCTGACCGTGCTGCACCA AGATTGGCTGAATGGTAAAGAGTACAAGTGCAAGGTTAGCAATAAGGGTCTGCCG AGCAGCATCGAGAAAACCATTAGCAAGGCGAAAGGTCAACCGCGCGAGCCACAGG TCTACACGCTGCCGCCGAGCCAAGAAGAAATGACCAAAAATCAGGTTAGCCTGAC TTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCGAGCGATATTGCAGTTGAATGGGAGAGCAAC GGCCAGCCTGAGAACAACTATAAGACGACCCCGCCAGTGCTGGACAGCGATGGCA GCTTCTTTTTGTATTCTCGTCTGACCGTGGACAAGTCCCGTTGGCAAGAGGGCAA TGTGTTCAGCTGTTCTGTCATGCACGAAGCGCTGCATAACCATTACACCCAGAAG TCCCTGAGCCTGTCGCTGGGCAAATAA
30 Ahth-CD47 IgG4P-5m HC: ATGCAAATGCAATTGGTACAAAGCGGTGCGGAAGTAAAGAAACCGGGTTCGTCGG TAAAGGT TAGC T GTAAAGC TTCTGGCTT CAATAT CAAGGAT ТАС TAT С T GCAC T G GGTGCGTCAGGCGCCAGGTCAGGCCTTGGAATGGATGGGCTGGATTGACCCGGAT CAAGGTGACACCGAATATGCCCAAAAGTTTCAGGGTCGTGTGACCATCACCCGTG ACCGTAGCACCTCCACCGCATATATGGAGCTGCGTAGCCTGCGCAGCGAAGATAC TGCGGTGTATTACTGCAATGCGGCCTATGGTAGCAGCTCCTATCCGATGGATTAC TGGGGCCAGGGTACCACGGTGACGGTTAGCAGCGCAAGCACCAAGGGCCCGTCTG TGTTTCCGTTGGCACCGTGCAGCCGTAGCACTAGCGAATCCACTGCAGCGCTGGG TTGCCTGGTTAAGGACTATTTCCCGGAGCCGGTTACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCAGCGGTGTTCACACGTTTCCAGCCGTCCTGCAGAGCAGCGGTCTGT ACAGCCTGAGCTCGGTGGTGACCGTTCCGAGCAGCTCTCTGGGTACCAAAACCTA TACСTGTAATGTCGATCACAAACCGTСTAACACGAAGGTCGATAAACGTGTTGAA AGCAAGTACGGTCCGCCTTGTCCGCCGTGCCCGGCACCGGAGTTTCTGGGCGGTC CGTCCGTATTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGATACCTTGATGATTAGCCGTAC GCCAGAGGTCACGTGCGTCGTGGTGGACGTTAGCCAAGAGGATCCGGAAGTCCAA
- 25 037654
TTCAACTGGTACGTGGACGGTGTCGAGGTGCACAATGCCAAAACCAAGCCGCGTG AAGAACAGTTTAACAGCACTTACCGCGTCGTTAGCGTCCTGACCGTGCTGCACCA AGATTGGCTGAATGGTAAAGAGTACAAGTGCAAGGTTAGCAATAAGGGTCTGCCG AGCAGCATCGAGAAAACCATTAGCAAGGCGAAAGGTCAACCGCGCGAGCCACAGG TCTACACGCTGCCGCCGAGCCAAGAAGAAATGACCAAAAATCAGGTTAGCCTGAC TTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCGAGCGATATTGCAGTTGAATGGGAGAGCAAC GGCCAGCCTGAGAACAACTATAAGACGACCCCGCCAGTGCTGGACAGCGATGGCA GCTTCTTTTTGTATTCTCGTCTGACCGTGGACAAGTCCCGTTGGCAAGAGGGCAA TGTGTTCAGCTGTTCTGTCATGCACGAAGCGCTGCATAACCATTACACCCAGAAG TCCCTGAGCCTGTCGCTGGGCAAATAA
31 Ahth-CD47 IgG4PE-13m HC: ATGCAAGTCCAATTGGTCCAGAGCGGTGCGGAAGTCAAGAAACCGGGTGCAAGCG TCAAAGTTTCGTGCAAGGCGAGCGGTTTCAATATCAAAGACTATTATCTGCACTG GGTTCGTCAGGCTCCGGGCCAAGGCCTGGAGTGGATGGGTTGGATCGATCCGGAC CAGGGCGACACGGAGTACGCTCAGAAGCTGCAGGGTCGTGTTACCATGACCACCG ACACCAGCACGAGCACCGCGTACATGGAACTGCGCTCTCTGCGTTCGGATGATAC CGCGGTGTACTATTGCAACGCCGCGTACGGTAGCAGCAGCTATCCGATGGATTAT TGGGGTCAAGGCACTACGGTGACTGTCAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCGTCTG TGTTTCCGTTGGCACCGTGCAGCCGTAGCACTAGCGAATCCACTGCAGCGCTGGG TTGCCTGGTTAAGGACTATTTCCCGGAGCCGGTTACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCAGCGGTGTTCACACGTTTCCAGCCGTCCTGCAGAGCAGCGGTCTGT ACAGCCTGAGCTCGGTGGTGACCGTTCCGAGCAGCTCTCTGGGTACCAAAACCTA TACСTGTAATGTCGATСACAAACCGTСTAACACGAAGGTCGATAAACGTGTTGAA AGCAAGTACGGTCCGCCTTGTCCGCCGTGCCCGGCACCGGAGTTTGAGGGCGGTC CGTCCGTATTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGATACCTTGATGATTAGCCGTAC GCCAGAGGTCACGTGCGTCGTGGTGGACGTTAGCCAAGAGGATCCGGAAGTCCAA TTCAACTGGTACGTGGACGGTGTCGAGGTGCACAATGCCAAAACCAAGCCGCGTG AAGAACAGTTTAACAGCACTTACCGCGTCGTTAGCGTCCTGACCGTGCTGCACCA AGATTGGCTGAATGGTAAAGAGTACAAGTGCAAGGTTAGCAATAAGGGTCTGCCG AGCAGCATCGAGAAAACCATTAGCAAGGCGAAAGGTCAACCGCGCGAGCCACAGG TCTACACGCTGCCGCCGAGCCAAGAAGAAATGACCAAAAATCAGGTTAGCCTGAC TTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCGAGCGATATTGCAGTTGAATGGGAGAGCAAC GGCCAGCCTGAGAACAACTATAAGACGACCCCGCCAGTGCTGGACAGCGATGGCA GCTTCTTTTTGTATTCTCGTCTGACCGTGGACAAGTCCCGTTGGCAAGAGGGCAA TGTGTTCAGCTGTTCTGTCATGCACGAAGCGCTGCATAACCATTACACCCAGAAG
- 26 037654
TCCCTGAGCCTGTCGCTGGGCAAATAA
32 Ahth-CD47 IgG4PE-5m НС: ATGCAAATGCAATTGGTACAAAGCGGTGCGGAAGTAAAGAAACCGGGTTCGTCGG TAAAGGTTAGCТGTAAAGCТТСТGGCТТСААТАТCAAGGATТАСТАТСТGCACТG GGTGCGTCAGGCGCCAGGTCAGGCCTTGGAATGGATGGGCTGGATTGACCCGGAT CAAGGTGACACCGAATATGCCCAAAAGTTTCAGGGTCGTGTGACCATCACCCGTG ACCGTAGCACCTCCACCGCATATATGGAGCTGCGTAGCCTGCGCAGCGAAGATAC TGCGGTGTATTACTGCAATGCGGCCTATGGTAGCAGCTCCTATCCGATGGATTAC TGGGGCCAGGGTACCACGGTGACGGTTAGCAGCGCAAGCACCAAGGGCCCGTCTG TGTTTCCGTTGGCACCGTGCAGCCGTAGCACTAGCGAATCCACTGCAGCGCTGGG TTGCCTGGTTAAGGACTATTTCCCGGAGCCGGTTACCGTGTCCTGGAACTCTGGC GCCCTGACCAGCGGTGTTCACACGTTTCCAGCCGTCCTGCAGAGCAGCGGTCTGT ACAGCCTGAGCTCGGTGGTGACCGTTCCGAGCAGCTCTCTGGGTACCAAAACCTA ТАССТGТААТGТСGATСАСАААССGТСТAACACGAAGGТСGATАААСGТGТТGAA AGCAAGTACGGTCCGCCTTGTCCGCCGTGCCCGGCACCGGAGTTTGAGGGCGGTC CGTCCGTATTCCTGTTCCCGCCGAAACCGAAAGATACCTTGATGATTAGCCGTAC GCCAGAGGTCACGTGCGTCGTGGTGGACGTTAGCCAAGAGGATCCGGAAGTCCAA TTCAACTGGTACGTGGACGGTGTCGAGGTGCACAATGCCAAAACCAAGCCGCGTG AAGAACAGTTTAACAGCACTTACCGCGTCGTTAGCGTCCTGACCGTGCTGCACCA AGATTGGCTGAATGGTAAAGAGTACAAGTGCAAGGTTAGCAATAAGGGTCTGCCG AGCAGCATCGAGAAAACCATTAGCAAGGCGAAAGGTCAACCGCGCGAGCCACAGG TCTACACGCTGCCGCCGAGCCAAGAAGAAATGACCAAAAATCAGGTTAGCCTGAC TTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCGAGCGATATTGCAGTTGAATGGGAGAGCAAC GGCCAGCCTGAGAACAACTATAAGACGACCCCGCCAGTGCTGGACAGCGATGGCA GCTTCTTTTTGTATTCTCGTCTGACCGTGGACAAGTCCCGTTGGCAAGAGGGCAA TGTGTTCAGCTGTTCTGTCATGCACGAAGCGCTGCATAACCATTACACCCAGAAG TCCCTGAGCCTGTCGCTGGGCAAATAA
33 Ahth-CD47 IgK: ATGAACATCCAAATGACTCAATCCCCATCCGCAATGTCCGCATCCGTAGGTGACC GCGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGCCAGGATATTCATCGTTATCTGAGCTGGTT TCAACAGAAACCGGGCAAGGTTCCTAAGCATCTGATTTACCGCGCGAACCGCTTG GTTAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGCAGCGGTTCTGGCACCGAGTTCACCC TGACGATCTCCAGCCTGCAACCGGAAGATTTTGCGACGTACTACTGCCTGCAGTA TGACGAGTTCCCGTATACCTTTGGTGGTGGTACGAAGGTGGAAATCAAACGTACT GTGGCCGCTCCGAGCGTTTTCATTTTTCCGCCGTCGGATGAGCAATTGAAATCTG
GTACCGCGAGCGTCGTTTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCGCGTGAGGCTAAGGT GCAATGGAAGGTCGATAACGCGCTGCAGAGCGGTAATAGCCAGGAAAGCGTCACC GAACAGGATAGCAAAGACAGCACCTACTCTTTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCA AGGCCGACTATGAGAAACACAAAGTTTACGCATGTGAGGTCACGCACCAGGGCCT GAGCAGCCCGGTGACCAAAAGCTTCAATCGTGGCGAATGCTAA
В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагается полинуклеотид, оперативно связанный с промотором для экспрессии такой полинуклеотидной последовательности в клетке-хозяине. В некоторых вариантах промотор получен из генома клеток млекопитающих (например, промотор металло- 27 037654 тионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса, промотор 7,5K вируса вакцинии). В конкретном варианте экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела, описанные в настоящей публикации, регулируется конститутивным промотором, индуцируемым промотором или тканеспецифичным промотором.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагается полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, например, отдельную легкую цепь и тяжелую цепь. Что касается легкой цепи, то в конкретном варианте полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь каппа. В другом конкретном варианте полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь лямбда. В другом конкретном варианте полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описанное в настоящей публикации, содержащее легкую цепь каппа человека или легкую цепь лямбда человека. Например, последовательность константных областей человека могут представлять собой последовательности, описанные в патенте США № 5693780.
В конкретном варианте полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описанное в настоящей публикации, которое иммуноспецифично связывается с полипептидом CD47, при этом антитело содержит тяжелую цепь, при этом константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи гамма (γ) человека, например, константной области тяжелой цепи гамма (γ) 1 человека, константной области тяжелой цепи гамма (γ) 2 человека, константной области тяжелой цепи гамма (γ) 3 человека или константной области тяжелой цепи гамма (γ) 4 человека.
5.2.2. Клетки и векторы
В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагаются клетки (например, клетки-хозяева), экспрессирующие (например, рекомбинантно) антитела, описанный в настоящей публикации (или их антигенсвязывающие фрагменты), которые специфично связываются с CD47 и родственными полинуклеотидами, и экспрессирующие векторы, например, полинуклеотиды и экспрессирующие векторы, подходящие для применения в БК-системах экспрессии. В настоящем изобретении предлагаются векторы (например, экспрессирующие векторы), содержащие полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие анти-CD47 антитела или фрагмент, для экспрессии рекомбинантов в БКсистемах экспрессии. В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагаются способы получения анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, включающие в себя экспрессию такого антитела с использованием БК-системы экспрессии, например, в условиях, приводящих к повышенному титру экспрессии или выходу антител.
В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагаются векторы (например, экспрессирующие векторы), содержащие полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие анти-CD47 антитела или фрагмент, для экспрессии рекомбинантов в клетках-хозяевах, например, в клетках млекопитающих. Также в настоящем изобретении предлагаются клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для рекомбинантной экспрессии анти-CD47-антител, описанных в настоящей публикации (например, антитела человека или гуманизированного антитела). В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагаются способы получения антитела, описанного в настоящей публикации, включающий в себя экспрессию такого антитела с использованием клеток-хозяев.
Рекомбинантная экспрессия антитела, описанного в настоящей публикации (например, полноразмерного антитела, тяжелой и/или легкой цепи антитела или одноцепочечного антитела, описанного в настоящей публикации) , которое специфично связывается с CD47, заключается в конструировании экспрессирующего вектора, содержащего полинуклеотид, который кодирует антитело. После получения полинуклеотида, кодирующего молекулу антитела, тяжелую и/или легкую цепь антитела или его фрагмент (например, вариабельные домены тяжелой и/или легкой цепи), описанных в настоящей публикации, может быть получен вектор для продукции молекулы антитела с использованием методики рекомбинантной ДНК способами, хорошо известными в данной области. Таким образом, способы получения белка посредством экспрессии полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или фрагмент антитела (например, легкую цепь или тяжелую цепь) описаны в настоящей публикации. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, можно применять для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности, кодирующие антитело или фрагмент антитела (например, легкую цепь или тяжелую цепь), и соответствующие сигналы регуляции транскрипции и трансляции. Такие способы включают, например, методики рекомбинантной ДНК in vitro, способы синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Также предлагаются реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу антитела, описанного в настоящей публикации, тяжелую или легкую цепь антитела, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела или его фрагмента, или CDR тяжелой или легкой цепи, оперативно связанную с промотором. Такие векторы могут, например, содержать нуклеотидную последовательность, кодирую- 28 037654 щую константную область молекулы антитела (смотри, например, международные публикации № WO
86/05807 и WO 89/01036; и патент США № 5122464), и вариабельные домены антитела могут быть клонированы в таком векторе для экспрессии полной тяжелой, полной легкой цепи, или обеих полных тяжелой и легкой цепей.
Экспрессирующий вектор может быть перенесен в клетку (например, в клетку-хозяина) обычными способами, и затем полученные клетки можно культивировать обычными способами, чтобы получить антитело, описанное в настоящей публикации или его фрагмент. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело, описанное в настоящей публикации, или его фрагменты, или его тяжелую или легкую цепь или их фрагмент, или одноцепочечное антитело, описанное в настоящей публикации, оперативно связанный с промотором для экспрессии таких последовательностей в клетке-хозяине. В некоторых вариантах для экспрессии двухцепочечных антител, векторы, кодирующие и тяжелую и легкую цепи, отдельно, могут быть коэкспрессированы в клетке-хозяине для экспрессии полной молекулы иммуноглобулина, как подробно описано ниже. В некоторых вариантах клетка-хозяин содержит вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий и тяжелую цепь и легкую цепь антитела, описанного в настоящей публикации или его фрагмента. В конкретных вариантах клетка-хозяин содержит два разных вектора, первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела, описанного в настоящей публикации, или его фрагмента, и второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела, описанного в настоящей публикации, или его фрагмента. В других вариантах первая клетка-хозяин содержит первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела, описанного в настоящей публикации, или его фрагмента, а вторая клетка-хозяин содержит второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела, описанного в настоящей публикации. В конкретных вариантах тяжелая цепь/вариабельная область тяжелой цепи, экспрессированная первой клеткой, ассоциирует с легкой цепью/вариабельной областью легкой цепи второй клетки с образованием анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагается популяция клетокхозяев, содержащая такую первую клетку-хозяина и такую вторую клетку-хозяина.
В конкретном варианте в настоящем изобретении предлагается популяция векторов, содержащая первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий легкую цепь/вариабельную область легкой цепи анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, и второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь/вариабельную область тяжелой цепи анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации.
Множество систем хозяин-экспрессирующий вектор можно применять для экспрессии молекулы антитела, описанного в настоящей публикации (смотри, например, патент США № 5807715) . Такие системы хозяин-экспрессирующий вектор представляют собой носители, с помощью которых могут быть получены и затем очищены представляющие интерес кодирующие последовательности, а также представляют собой клетки, которые при трансформации или трансфекции соответствующими кодирующими нуклеотидными последовательностями, могут экспрессировать молекулу антитела, описанного в настоящей публикации, in situ. Такие системы включают без ограничения микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli и В. subtilis), трансформированные экспрессирующими векторами на основе рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими последовательности, кодирующие антитело; дрожжи (например, Saccharomyces Pichia), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы на основе клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом), содержащими последовательности, кодирующие антитело; системы на основе растительных клеток (например, зеленых водорослей, таких как Chlamydomonas reinhardtii), инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом мозаики табака, TMV) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Ti-плазмидой), содержащими последовательности, кодирующие антитело; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS, CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa и NIH 3Т3), несущих рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7,5K вируса вакцинии). В конкретном варианте клетками для экспрессии антител, описанных в настоящей публикации, или его антигенсвязывающего фрагмента являются клетки СНО, например клетки СНО из СНО GS System™ (Lonza). В конкретном варианте экспрессирующим вектором млекопитающих является pOptiVEC™ или pcDNA3.3. В конкретном варианте бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, или эукариотические клетки (например, клетки млекопитающих), предназначенные специально для экспрессии целых молекул рекомбинантных антител, применяют для экспрессии рекомбинантной молекулы антитела. Например, клетки млекопи- 29 037654 тающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), в сочетании с таким вектором, как вектор, содержащий основной промоторный элемент немедленного раннего гена цитомегаловируса человека, является эффективной системой экспрессии для получения антител (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; и Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2). В некоторых вариантах антитела, описанные в настоящей публикации, продуцируется клетками СНО или клетками NSO. В конкретном варианте экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела, описанные в настоящей публикации, которые иммуноспецифично связываются с CD47, регулируется конститутивным промотором, индуцируемым промотором или тканеспецифичным промотором.
В бактериальных системах количество экспрессирующих векторов может быть соответствующим образом выбрано, в зависимости от применения, предполагаемого для экспрессируемой молекулы антитела. Например, когда необходимо получить большое количество такого антитела для создания фармацевтических композиций молекулы антитела, могут требоваться векторы, которые обеспечивают экспрессию высоких уровней продуктов в виде слитых белков, которые легко можно очистить. Такие векторы включают, без ограничения, экспрессирующий вектор Е. coli pUR278 (Ruther et al. , 1983, EMBO 12: 1791), в котором последовательность, кодирующая антитело, может быть лигирована отдельно в вектор в рамке с областью, кодирующей lac Z, так чтобы продуцировать слитый белок; pIN-векторы (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 55035509); и тому подобные. Например, также можно использовать векторы pGEX для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-S-трансферазой (GST). В общем, такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены из лизированных клеток посредством адсорбции и связывания с агарозными шариками, покрытыми глутатионом, с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Сконструированы векторы pGEX, включающие в себя сайты расщепления протеазами тромбином или фактором Ха для того, чтобы клонированный продукт генамишени можно было освобождать от остатка GST.
В системе насекомых, в качестве вектора можно использовать, например, вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV), чтобы экспрессировать чужеродные гены. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая антитело последовательность может быть отдельно клонирована в несущественных областях (например, в гене полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, промотор полиэдрина).
В клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать ряд основанных на вирусах систем экспрессии. В тех случаях, когда в качестве экспрессирующего вектора используют аденовирус, представляющая интерес последовательность, кодирующая антитело, может быть лигирована в комплекс регуляции транскрипции/ трансляции, например, поздний промотор и состоящую из трех частей лидерную последовательность. Затем такой химерный ген может быть встроен в аденовирусный геном посредством рекомбинации in vitro или in vivo. Инсерция в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) будет приводить к образованию рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способным к экспрессии молекулы антитела в инфицированном хозяине (например, смотри Logan and Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1: 355-359). Также могут требоваться специфичные сигналы инициации для эффективной трансляции встроенных последовательностей, кодирующих антитело. Такие сигналы включают кодон инициации ATG и близлежащие последовательности. Кроме того, кодон инициации должен быть в фазе с рамкой считывания требуемой кодирующей последовательности, чтобы гарантировать трансляцию полной вставки. Такие экзогенные сигналы регуляции трансляции и кодоны инициации могут быть разного происхождения, как природного, так и синтетического. Эффективность экспрессии может быть повышена включением соответствующих элементов энхансеров транскрипции, терминатора транскрипции и т.д. (смотри, например, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).
Кроме того, может быть выбран штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию встроенных последовательностей или модифицирует и процессирует генный продукт особым требуемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессирование (например, расщепление) белковых продуктов может быть важным для функционирования белка. Разные клетки-хозяева обладают характеристиками и специфичными механизмами для посттрасляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы хозяев могут быть выбраны так, чтобы обеспечить правильную модификацию и процессинг экспрессируемого чужеродного белка. С указанной целью можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые имеют клеточный аппарат для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки СНО, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, HEK 293, NIH 3Т3, W138, ВТ483, Hs578T, HTB2, ВТ2О и T47D, NS0 (линия клеток миеломы мышей, которая эндогенно не продуцирует никаких цепей иммуноглобулинов), CRL7O3O и HsS78Bst. В некоторых вариантах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации (например, антитело, содержащее CDR любого из антител Ab235-Ab255) продуцируют в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО.
Для долговременной, обеспечивающий высокий выход продукции рекомбинантных белков, могут
- 30 037654 быть созданы стабильно экспрессирующие клетки. Например, могут быть сконструированы клеточные линии, которые стабильно экспрессируют анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, или его антигенсвязывающий фрагмент. В конкретных вариантах клетка, предлагаемая в настоящем изобретении, стабильно экспрессирует легкую цепь/вариабельный домен легкой цепи и тяжелую цепь/вариабельный домен тяжелой цепи, которые ассоциируют с образованием антитела, описанного в настоящей публикации, или его антигенсвязывающего фрагмента.
В некоторых аспектах вместо применения экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные начала репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, контролируемой соответствующими элементами, регулирующими экспрессию (например, промотором, энхансерными последовательностями, терминаторами транскрипции, участками полиаденилирования и т.д.) и селектируемым маркером. После введения чужеродной ДНК/полинуклеотида сконструированным клеткам можно обеспечить возможность расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, и затем переводят на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает резистентность к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти с образованием очагов, которые в свою очередь могут быть клонированы и размножены до клеточных линий. Такой способ преимущественно может быть использован для конструирования клеточных линий, которые экспрессируют анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, или его фрагмент. Такие сконструированные клеточные линии могут, в частности, применяться при скрининге и оценке композиций, которые прямо или опосредованно взаимодействуют с молекулой антитела.
Можно использовать ряд систем селекции, включая без ограничения гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska and Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al. , 1980, Cell 22: 8-17) в клетках tk-, hgprt- или aprt-, соответственно. Также, можно использовать резистентность к антиметаболитам в качестве основы для селекции следующих генов: dhfr, который придает резистентность к метотрексату (Wigler et al. , 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, который придает резистентность к микофеноловой кислоте (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, который придает резистентность к аминогликозиду G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; и Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5): 155-2 15); и hygro, который придает резистентность к гигромицину (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинанбтной ДНК, могут быть обычным образом использованы, чтобы осуществить селекцию требуемого рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); и в главе 12 и 13 в публикации Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1, и такие публикации включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.
Уровни экспрессии молекул антител могут быть повышены за счет амплификации вектора (обзор смотри в Bebbington and Hentschel, Use of Vectors based on Gene Amplification for Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)) . В том случае, когда маркер в векторной системе экспрессии антитела может быть амплифицирован, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клеток-хозяев, будет повышать количество копий маркерного гена. Так как амплифицируемая область ассоциирована с геном антитела, продукция антитела также будет возрастать (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
Клетка-хозяин может быть котрансфицирована двумя или более экспрессирующими векторами, описанными в настоящей публикации, первым вектором, кодирующим полипептид, полученный из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, полученный из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые способны в равной мере экспрессировать полипептиды тяжелой и легкой цепей. Клетки-хозяева могут быть котрансфицированы разными количествами двух или более экспрессирующих векторов. Например, клетки-хозяева могут быть трансфицированы с использованием любого из следующих соотношений первого экспрессирующего вектора и второго экспрессирующего вектора: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 или 1:50.
Альтернативно, можно использовать один вектор, который кодирует и способен экспрессировать полипептиды и тяжелой и легкой цепей. В таких ситуациях легкая цепь должна быть помещена перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсичной свободной тяжелой цепи (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; и Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197-2199). Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей могут содержать кДНК или геномную ДНК. Экспрессирующий вектор может быть одноцисторонным или полицистронным. Полицистронная конструкция нуклеиновой кислоты может кодировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше, или в диапазоне 2-5, 5-10 или 10-20 генов/нуклеотидных последовательностей. Например, бицистронная конструкция нуклеиновой кислоты может содержать в следующем порядке: промотор, первый ген (например, тяжелой цепи антитела, описанного в настоящей
- 31 037654 публикации), и второй ген (например, легкой цепи антитела, описанного в настоящей публикации). В таком экспрессирующем векторе транскрипция обоих генов может управляться промотором, тогда как трансляция мРНК с первого гена может осуществляться механизмом зависимого от кэпа сканирования, а трансляция мРНК второго гена может осуществляться независимым от кэпа механизмом, например, посредством IRES.
После получения молекулы антитела, описанного в настоящей публикации, посредством экспрессии рекомбинантов, она может быть очищена любым способом, известным в данной области для очистки молекулы иммуноглобулина, например, хроматографией (например, ионообменной, аффинной, в частности, на основе аффинности к конкретному антигену после белка А, и хроматографией по размеру на колонках), центрифугированием, на основе дифференциальной растворимости или любым другим стандартным способом очистки белков. Кроме того, антитела, описанные в настоящей публикации, могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в настоящей публикации, или иными, известными в данной области, чтобы облегчить очистку.
В конкретных вариантах антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей публикации, выделяют или очищают. Обычно изолированное антитело представляет собой антитело, которое по существу не содержит других антител с другими антигенными специфичностями, отличными от специфичностей выделяемого антитела. Например, в конкретном варианте препарат антитела, описанного в настоящей публикации, по существу не содержит клеточного материала и/или химических предшественников. Выражение по существу не содержит клеточного материала включает препараты антитела, в которых антитело отделено от клеточных компонентов клеток, из которых его выделяют или в которых оно рекомбинантно экспрессировано. Таким образом, антитело, которое по существу не содержит клеточного материала, включает препараты антитела, содержащие менее чем примерно 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 или 0,1% (сухой массы) гетерологичного белка (также называемого в настоящем описании белок-контаминант) и/или вариантов антитела, например, разных посттрансляционно модифицированных форм антитела или других разных вариантов антитела (например, фрагментов антитела). В том случае, когда антитело продуцируется рекомбинатно, оно также обычно по существу не содержит культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее чем примерно 20, 10, 2, 1, 0,5 или 0,1% от объема препарата белка. В том случае, когда антитело получают в результате химического синтеза, оно обычно по существу не содержит химических предшественников или других химических веществ, т.е., отделено от химических предшественников или других химических веществ, которые вовлечены в синтез белка. Соответственно, такие препараты антитела содержат менее чем примерно 30, 20, 10 или 5% (сухой массы) химических предшественников или соединений, отличных от представляющего интерес антитела. В конкретном варианте антитела, описанные в настоящей публикации, выделяют или очищают.
5.3. Фармацевтические композиции и наборы
В настоящем изобретении предлагаются композиции, фармацевтические композиции и наборы, содержащие одно или несколько антител (например, анти-CD47-антител), описанных в настоящей публикации, или их антигенсвязывающих фрагментов или их конъюгатов. В конкретных аспектах композиции (например, фармацевтические композиции), описанные в настоящей публикации, могут быть предназначены для применений in vitro, in vivo или ex vivo. He ограничивающие примеры применений включают применения для модулирования (например, ингибирования или индукции/усиления) активности CD47 и применения для сдерживания или лечения расстройства, например, злокачественной опухоли. В конкретных вариантах в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая антитело (например, гуманизированное антитело), описанное в настоящей публикации (или его антигенсвязывающий фрагмент) и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
В используемом в настоящем описании смысле термин фармацевтически приемлемый представляет собой одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или указанный в списке в Фармакопее США, Европейской фармакопее или других общеизвестных фармакопеях для применения на животных и более конкретно на человеке.
Препараты, содержащие одно или несколько антител, предлагаемых в настоящем изобретении, или их антигенсвязывающие фрагменты, могут быть получены для хранение смешиванием антитела, имеющего требуемую степень очистки, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington: Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD) . Такие препараты могут быть, например, в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов.
Фармацевтические носители, подходящие для введения антител, предлагаемых в настоящем изобретении, включают любые таки носители, которые, как известно специалистам в данной области, подходят для конкретного способа введения. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буфер, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
- 32 037654
Препараты, которые необходимо применять для введения in vivo, могут быть стерильными. Стерилизацию можно легко осуществить, например, посредством фильтрации, например, через стерильные мембраны для фильтрации.
В конкретных аспектах фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат терапевтически эффективные количества одного или нескольких антител или антигенсвязывающих фрагментов, предлагаемых в настоящем изобретении, в фармацевтически приемлемом носителе. Такие фармацевтические композиции применимы для профилактики, лечения, сдерживания или облегчения состояния или расстройства, описанного в настоящей публикации, или одного или несколько его симптомов.
Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, могут содержать одно или несколько антител, предлагаемых в настоящем изобретении, или их антигенсвязывающих фрагментов. В одном варианте предлагаются композиции, в которых антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящей публикации, приготовлены в виде подходящих фармацевтических препаратов, таких как растворы, суспензии, порошки, препараты длительного высвобождения или эликсиры в стерильных растворах или суспензиях для парентерального введения, или в виде препарата, представляющего собой трансдермальный пластырь, и в виде ингаляторов сухого порошка.
В одном варианте композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, готовят для введения одной дозы. Чтобы приготовить композицию, взвешенную часть соединения растворяют, суспендируют, диспергируют или иным образом смешивают с выбранным носителем в эффективной концентрации, такой чтобы подвергаемое лечению состояние было ослаблено, предотвращено, или был ослаблен один или несколько симптомов.
В некоторых аспектах в настоящем изобретении предлагается антитело внесенное в фармацевтически приемлемый носитель в эффективном количестве, достаточном для оказания терапевтически полезного эффекта в отсутствие или с минимальными или незначительными нежелательными побочными эффектами для пациента, подвергаемого лечению.
Концентрации анти-CD47-антитела в фармацевтической композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, будут зависеть, например, от физико-химических свойств антитела, схемы дозирования и вводимого количества, а также других факторов.
Фармацевтические композиции, описанные в настоящей публикации, предлагаются для введения человеку или животным (например, млекопитающим) в стандартных лекарственных формах, таких как стерильные парентеральные (например, внутривенные) растворы или суспензии, содержащие подходящие количества соединений или их фармацевтически приемлемых производных. Фармацевтические композиции также предлагаются для введения человеку и животным в стандартной лекарственной форме, такой как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы и пероральные или назальные растворы или суспензии, и эмульсии масло в воде, содержащие подходящие количества анти-CD47-антитела или его фармацевтически приемлемых производных. В одном вариант антитело готовят в виде препарата и вводят в стандартных формах, содержащих однократную дозу, или в формах для множественного дозирования. Стандартные лекарственные формы, содержащие однократную дозу, в используемом в настоящем описании смысле относятся к физически дискретным единицам, подходящим для человек или животных (например, млекопитающих), и отдельно упакованным. Каждая стандартная доза содержит предварительно определяемое количество анти-CD47-антитела, достаточное для получения требуемого терапевтического эффекта, вместе с требуемым фармацевтическим носителем, наполнителем или разбавителем. Примеры стандартных лекарственных форм включают ампулы и шприцы, и упакованные по отдельности таблетки или капсулы. Стандартные лекарственные формы могут быть введены частями или по несколько штук. Форма для множественного дозирования представляет собой множество идентичных стандартных лекарственных форм, упакованных в одну емкость для введения в виде отдельной стандартной дозы. Примеры форм для множественного дозирования включают флаконы, бутылочки с таблетками или капсулами или бутылочки. Таким образом, в конкретных аспектах форма для множественного дозирования представляет собой множество стандартных доз, которые не разделяют при упаковке.
В некоторых вариантах одно или несколько анти-CD47-антител, описанных в настоящей публикации, или их антигенсвязывающих фрагментов находятся в жидком фармацевтическом препарате. Жидкие вводимые фармацевтические композиции могут быть приготовлены, например, растворением. Диспергированием или образом смешиванием антитела и необязательных фармацевтических адъювантов в носителе, таком как, например, вода, физиологический раствор соли, водный раствор декстрозы, глицерин, гликоли и тому подобное, с получением при этом раствор или суспензия. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, предназначенная для введения, также может содержать минорные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажнители, эмульгаторы, солюбилизаторы и средства для рН-буферов и тому подобные.
Способы приготовления таких форм дозирования известны и будут понятны специалистам в данной области; например, смотри, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington: Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006) Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD.
Парентеральное введение в одном варианте характеризуется как инъекция, либо подкожно, либо
- 33 037654 внутримышечно, либо внутривенно, которая также предусмотрена в настоящем изобретении. Инъекционные средства могут быть получены в обычных формах, либо в виде жидких растворов, либо суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления раствора или суспензии в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Инъекционные средства, растворы и эмульсии также содержат один или несколько эксципиентов. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, физиологический раствор соли, декстроза, глицерин или этанол. Другие пути введения могут включать энтеральное введение, интрацеребральное введение, назальное введение, внутриартериальное введение, внутрисердечное введение, внутрикостную инфузию, интратекальное введение и внутрибрюшинное введение.
Препараты для парентерального введения включают готовые стерильные растворы для инъекции, стерильные сухие растворимые продукты, такие как готовые лиофилизированные порошки для объединения с растворителем непосредственно перед применением, включая таблетки для подкожного применения, готовые стерильные суспензии для инъекции, стерильные сухие нерастворимые продукты, готовые для объединения с наполнителем непосредственно перед применением, и стерильные эмульсии. Растворы могут быть либо водными, либо неводными.
В случае внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор соли или фосфатно-солевой буфер (PBS), и растворы, содержащие загустители и солюбилизаторы, такие как глюкоза, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль и их смеси.
Фармацевтически приемлемые носители, используемые в парентеральных препаратах, включают водные наполнители, неводные наполнители, противомикробные средства, средства для изотоничности, буферы, антиоксиданты, местные анестетики, суспендирующие и диспергирующие средства, эмульгаторы, секвестрирующие или хелатирующие средства и другие фармацевтически приемлемые вещества.
Фармацевтические носители также включают этиловый спирт, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль в качестве смешиваемых с водой наполнителей; и гидроксид натрия, хлористоводородную кислоту, лимонную кислоту или молочную кислоту для корректировки рН.
В некоторых вариантах внутривенная или внутриартериальная инфузия стерильного водного раствора, содержащего анти-CD47-антитело или фрагмент, описанные в настоящей публикации, является эффективным способом введения.
Другой вариант представляет собой стерильный водный или масляный раствор или суспензию, содержащие анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, инъецируемые при необходимости получения требуемого фармакологического эффекта.
В конкретных вариантах анти-CD47-антитело, описанное в настоящей публикации, может быть суспендировано в тонкоизмельченной или другой подходящей форме. Форма получаемой в результате смеси зависит от ряда факторов, включая предполагаемый способ введения и растворимость соединения в выбранном носителе или наполнителе.
В других вариантах фармацевтические препараты представляют собой лиофилизированные порошки, которые могут быть перерастворены для введения в виде растворов, эмульсий и других смесей. Они также могут быть перерастворены и приготовлены в виде твердых веществ или гелей.
Лиофилизированный порошок может быть приготовлен, например, растворением анти-CD47антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, в подходящем растворителе. В некоторых вариантах лиофилизированный порошок является стерильным. Подходящие растворители могут содержать эксципиент, который повышает стабильность, или другой фармакологический компонент порошка или восстановленного раствора, приготовленного из порошка. Эксципиенты, которые можно применять, включают без ограничения декстрозу, сорбит, фруктозу, кукурузный сироп, ксилит, глицерин, глюкозу, сахарозу или другое подходящее средство. Подходящий растворитель также может содержать буфер, такой как цитрат, фосфат натрия или калия или другой такой буфер, известный специалистам в данной области, в одном варианте, примерно при нейтральном рН. Последующее стерильное фильтрование раствора, за которым следует лиофилизация в стандартных условиях, известных специалистам в данной области, позволяют получить препарат. В одном варианте получаемый в результате раствор будет распределен по флаконам для лиофилизации. Лиофилизированный порошок можно хранить в подходящих условиях, таких как при температуре примерно от 4°С до комнатной температуры.
Перерастворение такого лиофилизированного порошка водой для инъекции позволяет получать препарат, применимый для парентерального введения. Для перерастворения лиофилизированный порошок добавляют к стерильной воде или другому подходящему носителю.
В некоторых аспектах анти-CD47-антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть приготовлены для местного введения или местного нанесения, такого как местное нанесение на кожу и слизистые оболочки, например, в глаз, в форме гелей, кремов и лосьонов и для внесения в глаз или для интрацистернального или интраспинального применения. Местное введение предполагается для трансдермальной доставки, а также для введения в глаза или слизистые, или для ингаляционной терапии. Также можно вводить назальные растворы активного соединения отдельно или в сочетании с другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
Анти-CD47-антитела и другие композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, также могут быть приготовлены для целенаправленной доставки к конкретную ткань, орган или другую область тела
- 34 037654 субъекта, подвергаемого лечению. Многие такие способы целенаправленной доставки хорошо известны специалистам в данной области. Все такие способы целенаправленной доставки предполагаются в настоящем изобретении для применения таких композиций. Не ограничивающие примеры способов целенаправленной доставки смотри, например, в патентах США № 6316652, 6274552, 6271359, 6253872, 6139865, 6131570, 6120751, 6071495, 6060082, 6048736, 6039975, 6004534, 5985307, 5972366, 5900252, 5840674, 5759542 и 5709874. В некоторых вариантах анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, целенаправленно доставляют (или вводят иным образом) в органы зрения, костный мозг, желудочно-кишечный тракт, легкие, головной мозг или суставы. В конкретных вариантах анти-CD47антитело, описанное в настоящей публикации, способно пересекать гематоэнцефалический барьер.
В настоящем изобретении предлагается фармацевтическая упаковка или набор, содержащие одну или несколько емкостей, наполненный одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций, описанных в настоящей публикации, такими как одно или несколько анти-CD47-антител, предлагаемых в настоящем изобретении. Необязательно к такой емкости(емкостям) могут прилагаться уведомление в форме, утвержденной государственным ведомством, контролирующим производство, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, и в таком уведомлении отражено одобрение введения человеку ведомством по производству, применению и продаже.
Также в настоящем изобретении предлагаются наборы, содержащие одно или несколько антител или фрагментов антител, описанных в настоящей публикации. В одном варианте набор содержит антитело или фрагмент антитела, описанные в настоящей публикации, в одной или нескольких емкостях. В конкретном варианте наборы, описанные в настоящей публикации, содержат, по существу, очищенный антиген CD47 в качестве контроля. В другом конкретном варианте наборы, описанные в настоящей публикации, дополнительно содержат контрольное антитело, которое не взаимодействует с антигеном CD47. В другом конкретном варианте наборы, описанные в настоящей публикации, содержат один или несколько элементов для выявления связывания модифицированного антитела с антигеном CD47 (например, антитело может быть конъюгировано с регистрируемым субстратом, таким как флуоресцирующее соединение, ферментативный субстрат, радиоактивное соединение или люминесцирующее соединение, или второе антитело, которое узнает первое антитело, может быть конъюгировано с регистрируемым субстратом). В конкретных вариантах набор, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать рекомбинантно полученный или химически синтезированный антиген CD47. Антиген CD47, находящийся в наборе, также может быть связан с твердой подложкой. В более конкретном варианте средства для выявления в описанном выше наборе включают твердую подложку, с которой связан антиген CD47. Такой набор также может содержать несвязанное меченое репортером антитело против Ig человека или антитело против Ig мыши/крысы. В таком варианте связывание антитела с антигеном CD47 может быть выявлено на основании связывания указанного меченого репортером антитела.
5.4. Применения и способы
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагаются способы модулирования активности CD47 с использованием анти-CD47-антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящей публикации.
В конкретных вариантах в настоящем изобретении предлагаются способы ингибирования (например, частичного ингибирования) активности CD47 с использованием анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации. В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагаются способы сдерживания или лечения состояния или расстройства, такого как злокачественная опухоль, с использованием анти-CD47-анmитела, описанного в настоящей публикации. В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагаются способы профилактики состояния или расстройства, такого как злокачественная опухоль, с использованием анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации.
В конкретных вариантах в настоящем изобретении предлагаются способы сдерживания, лечения, профилактики или предотвращения злокачественной опухоли, включающие в себя введение субъекту, нуждающемуся в таком воздействии терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящей публикации, которые специфично связываются с CD47 (например, CD47 человека). В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагается способ ослабления, подавления или уменьшения прогрессирования или тяжести одного или нескольких симптомов, ассоциированных со злокачественной опухолью.
В используемом в настоящем описании смысле вводить или введение относится к акту инъекции или одной физической доставки вещества (например, гуманизированного анти-CD47-антитела. предлагаемого в настоящем изобретении, или его антигенсвязывающего фрагмента) субъекту или пациенту (например, человеку), такой как доставка в слизистую, местная, интрадермальная, парентеральная, внутривенная, подкожная, внутримышечная доставка и/или любой другой способ физической доставки, описанный в настоящей публикации или известный в данной области.
В используемом в настоящем описании смысле термины эффективное количество или терапевтически эффективное количество относятся к количеству терапевтического средства (например, антитела или фармацевтической композиции, предлагаемых в настоящем изобретении), которое является достаточным для снижения и/или ослабления тяжести и/или уменьшения продолжительности данного со
- 35 037654 стояния, расстройства или заболевания (например, злокачественной опухоли, метастазов или ангиогенеза) и/или связанного с ним симптома. Такие термины также охватывают количество, необходимо для снижения, замедления или ослабления дальнейшего развития или прогрессирования данного заболевания, снижения, замедления или ослабления рецидива, развития или появления данного заболевания для улучшения или усиления профилактического или терапевтического эффекта(ов) других терапевтических средств (например, других терапевтических средств, отличных от αнти-CD47-антитела, предлагаемого в настоящем изобретении). В некоторых вариантах эффективное количество в используемом в настоящем описании смысле также относится к количеству антитела, описанного в настоящей публикации, для достижения конкретного результата.
В используемом в настоящем описании смысле термин в сочетании в контексте введения других терапевтических средств относится к применению более одного терапевтического средства. Использование термина в сочетании не ограничивает порядок, в котором вводят терапевтические средства.
Терапевтические средства можно вводить, например, друг за другом, последовательно, одновременно или в виде сопутствующего введения.
В используемом в настоящем описании смысле термины сдержать, сдерживать и сдерживание относится к полезным эффектам, которые субъект получает в результате терапии (например, профилактическим или терапевтическим средством), которая не приводит к излечению состояния, ассоциированного с CD47. В некоторых вариантах субъекту вводят одно или несколько терапевтических средств (например, профилактических или терапевтических средств, таких как антитело, описанное в настоящей публикации), чтобы сдержать состояние или расстройство, описанное в настоящей публикации, один или несколько его симптомов, для того чтобы предотвратить прогрессирование или ухудшение состояния или расстройства.
В используемом в настоящем описании смысле термины препятствовать или препятствование в контексте состояния или расстройства, предлагаемого в настоящем изобретении (например, аутоиммунного расстройства, иммунологического расстройства, злокачественной опухоли или воспаления), относятся к полному или частичному ингибированию (например, менее чем 100, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 или 5%) или блокированию развития, рецидивов, появления или распространения состояния или расстройства, предлагаемого в настоящем изобретении (например, злокачественной опухоли, метастазов или ангиогенеза), и/или связанного с ним симптома в результате введения терапевтического средства или сочетания терапевтических средств, предлагаемых в настоящем изобретении (например, сочетания профилактических или терапевтических средств, таких как антитело, описанное в настоящей публикации).
В используемом в настоящем описании смысле термины субъект и пациент используют взаимозаменяемо. В используемом в настоящем описании смысле субъектом является млекопитающее, такое как животное, отличное от примата (например, коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, козы, кролики, крысы, мыши и т.д.), или примат (например, обезьяна и человек), например, человек. В одном варианте субъектом является млекопитающее, например, человек, у которого диагностировано состояние или расстройство, описанное в настоящем изобретении (например, злокачественная опухоль, метастазы или ангиогенез). В другом варианте субъектом является млекопитающее, например, человек, для которого существует риск развития состояния или расстройства, описанного в настоящем изобретении (например, злокачественной опухоли, метастазов или ангиогенеза). В другом варианте субъектом является человек.
В некоторых вариантах CD47 амплифицируется в клетках субъекта, например, человека. Идентификация амплификации cd47 в образце от субъекта может быть выполнена в анализах, известных специалисту в данной области, таких как, например, количественная ПЦР с обратной транскрипцией, анализа с использованием иммуноблотов, фингерпринтинг ДНК, кариотипирование (например, с использованием многоцветной флуоресцентной гибридизации in situ (mFISH)), сравнительная геномная гибридизация и определение профиля экспрессии генов. В качестве не ограничивающего примера экспрессию белка в образцах опухолей можно охарактеризовать с использованием иммуногистохимических анализов, чтобы измерить количество белка CD47, присутствующего в образце.
Идентификация мутаций или делеций в образце от субъекта может быть осуществлена с использованием анализов, известных специалисту в данной области, таких как, например, экстракция ДНК, получение комплементарной ДНК и секвенирование кДНК. Последовательность кДНК, например, может быть использована для получения продукта трансляции способами, известными специалисту в данной области. Генетические делеций и аминокислотные замены могут быть идентифицированы, например, путем сравнения последовательности из образца, полученного от субъекта, с последовательностью дикого типа и/или консенсусной последовательностью.
В некоторых вариантах CD47 амплифицируют у субъекта, подвергаемого лечению способами, предлагаемыми в настоящем изобретении. Идентификацию амплификации CD47 в образце от субъекта осуществляют в анализах, известных специалисту в данной области, таких как, например, количественная ПЦР с обратной транскрипцией или анализы с использованием иммуноблотов. Идентификацию мутаций или делеций в образце от субъекта осуществляют в анализах, известных специалисту в данной области, таких как, например, экстракция ДНК, получение комплементарной ДНК и секвенирование кДНК. Последовательность кДНК, например, используют для получения продукта трансляции способами, из- 36 037654 вестными специалисту в данной области. Генетические делеций и аминокислотные замены идентифицируют, например, сравнивая последовательность из образца от субъекта с последовательностью дикого типа и/или консенсусной последовательностью.
В используемом в настоящем описании смысле термины терапии и терапия могут относиться к любому протоколу(ам), способу(ам), композициям, препаратам и/или средству(средствам), которые можно использовать для профилактики, лечения, сдерживания или ослабления состояния или расстройства или его симптома (например, состояния или расстройства, предлагаемого в настоящем изобретении (например, злокачественной опухоли) или одного или нескольких симптомов, ассоциированных с состоянием или расстройством). В некоторых вариантах термины терапии и терапия относятся к терапии с использованием лекарственных средств, адъювантной терапии, лучевой терапии, хирургии, биологической терапии, поддерживающей терапии и/или другой терапии, полезной для лечения, сдерживания, профилактики или ослабления состояния или расстройства или одного или нескольких его симптомов (например, злокачественной опухоли или одного или нескольких симптомов, ассоциированных с состоянием или расстройством). В некоторых вариантах термин терапия относится к терапии с использованием другого средства, отличного от анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, или его фармацевтической композиции. В конкретных вариантах дополнительная терапия и дополнительные терапии относятся к другой терапии, отличной от лечения с использованием анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, или его фармацевтической композиции. В конкретном варианте терапия включает в себя применение анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, в качестве адъювантной терапии. Например, с использованием анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, в сочетании с лечением лекарственным средством, биологической терапией, хирургическим вмешательством и/или поддерживающей терапией.
В используемом в настоящем описании смысле гематологическая злокачественная опухоль относится к злокачественной опухоли крови и включает наряду с прочим лейкоз, лимфому и миелому. Лейкоз относится к злокачественной опухоли крови, в случае которой слишком много лимфоцитов, которые неэффективны в борьбе с инфекцией, таким образом вытесняющих другие составляющие части крови, такие как тромбоциты и эритроциты. Известно, что случаи лейкоза классифицируют как острые или хронические. Некоторые формы лейкоза включают в качестве не ограничивающего примера острый лимфоцитарный лейкоз (ALL); острый миелоидный лейкоз (AML); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); хронический миелоидный лейкоз (CML); миелопролиферативное расстройство/неоплазму (MPDS); и миелодиспластический синдром. Лимфома может относиться наряду с прочим к ходжкинской лимфоме, как к вялотекущей, так и агрессивной неходжкинской лимфоме, лимфоме Беркитта и фолликулярной лимфоме (мелкоклеточной и крупноклеточной). Миелома может относиться к множественной миеломе (ММ), гигантоклеточной миеломе, миеломе тяжелых цепей и миеломы легких цепей или миеломе БенсДжонса.
Не ограничивающие примеры состояния, которое можно лечить или подавлять с использованием анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, включают гематологическую злокачественную опухоль и/или солидные опухоли.
Заболевания или расстройства, связанные с аномальной экспрессией, активностью и/или передачей сигнала CD47, включают в качестве не ограничивающего примера гематологическую злокачественную опухоль и/или солидные опухоли. Гематологические злокачественные опухоли включают, например, лейкоз, лимфому и миелому. Некоторые формы лейкоза включают в качестве не ограничивающего примера острый лейкоцитарный лейкоз (ALL); острый миелоидный лейкоз (AML); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); хронический миелоидный лейкоз (CML); миелопролиферативное расстройство/неоплазму (MPDS); и миелодиспластический синдром. Некоторые формы лимфомы включают в качестве не ограничивающего примера, ходжкинскую лимфому, как вялотекущую, так и агрессивную неходжкинскую лимфому, лимфому Беркитта и фолликулярную лимфому (мелкоклеточную и крупноклеточную). Некоторые формы миеломы включают в качестве не ограничивающего примера множественную миелому (ММ), гигантоклеточную миелому, миелому тяжелых цепей и миелому легких цепей или миелому Бенс-Джонса. Солидные опухоли включают, например, опухоли молочной железы, опухоли яичника, опухоли легкого, опухоли поджелудочной железы, опухоли простаты, меланомные опухоли, опухоли прямой и ободочной кишки, опухоли легкого, опухоли головы и шеи, опухоли мочевого пузыря, опухоли пищевода, опухоли печени и опухоли почек.
Симптомы, ассоциированные со злокачественными опухолями и другими неопластическими расстройствами, включают, например, воспаление, лихорадку, общее недомогание, жар, боль, часто локализованную в области воспаления, потерю аппетита, потерю массы, отек, головную боль, усталость, сыпь, анемию, мышечную слабость, мышечное утомление и абдоминальные симптомы, такие как, например, абдоминальная боль, диарея или запор.
В конкретных аспектах в настоящем изобретении предлагаются aнmи-CD47-aнтителa, применимые для лечения, замедления прогрессирования, сдерживания, предотвращения рецидивов или ослабления симптома злокачественной опухоли (например, MM, NHL, AML, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, немелкоклеточного рака/карциномы легкого, гепатоклеточной карциномы (НСС), саркомы, и
- 37 037654 рака головы и шеи). Например, CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, применимы для лечения гематологических злокачественных новообразований и/или опухолей, например, гематологических злокачественных новообразований и/или опухолей. Например, CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, применимы для лечения опухолей CD47+. В качестве не ограничивающего примера CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, применимы для лечения неходжкинской лимфомы (NHL), острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), острого миелоидного лейкоза (AML), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), хронического миелоидного лейкоза (CML), множественной миеломы (ММ), рака молочной железы, рака яичника, рака головы и шеи, рака мочевого пузыря, меланомы, рака прямой и ободочной кишки, рака поджелудочной железы, рака легкого, лейомиомы, лейомиосаркомы, глиомы, глиобластомы и т.д.. Солидные опухоли включают, например, опухоли молочной железы, опухоли яичника, опухоли легкого (например, NSCLC), опухоли поджелудочной железы, опухоли простаты, опухоли меланомы, опухоли прямой и ободочной кишки, опухоли легкого, опухоли головы и шеи, опухоли мочевого пузыря, опухоли пищевода, опухоли печени (например, гепатоклеточную карциному), саркому и опухоли почек.
В конкретном варианте в настоящем изобретении предлагается способ лечения злокачественной опухоли (например, гематологического расстройства/злокачественной опухоли или солидной злокачественной опухоли) у субъекта, включающий в себя введение (например, введение одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в таком введении, (i) анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, или его антигенсвязывающего фрагмента, который специфично связывается с CD47, таким как CD47 человека, и (ii) другого противоопухолевого средства. В некоторых вариантах противоопухолевым средством является химиотерапевтическое средство (например, блокатор разборки микротрубочек, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы и средство, поперечно сшивающее или повреждающее ДНК). В некоторых вариантах противоопухолевым средством является ингибитор тирозинкиназы (например, GLEEVEC® (мезилат иматиниба) или SUTENT® (SU11248 или сунитиниб)). Другие не ограничивающие примеры ингибиторов тирозинкиназы включают 706 и AMNI07 (нилотиниб). RAD00I, PKC412, гефитиниб (IRESSA™), эрлотиниб (TARCEVA®), сорафениб (NEXAVAR®) , пазопаниб (VOTRIENT™), акситиниб, босутиниб, цедираниб (RECENTIN®) , SPRYCEL® (досатиниб), лапатиниб (TYKERB®), лестауртиниб, нератиниб, нилотиниб (TASIGNA®) , семаксаниб, тоцераниб (PALLADIA™), вандетаниб (ZACTIMA™) и ваталаниб.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения злокачественной опухоли (например, гематологического расстройства/злокачественной опухоли или солидной злокачественной опухоли) у субъекта, включающий в себя введение (например, введение одновременно или последовательно) субъекту, нуждающемуся в таком введении, (i) анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, или его антигенсвязывающего фрагмента, который специфично связывается с CD47, таким как CD47 человека, и (ii) лучевой терапии.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ стимулирования (например, индукции или усиления) фагоцитоза, например, опосредованной макрофагами фагоцитарной гибели опухолевых клеток, включающий в себя осуществление контакта эффективного количества анти-CD47антитела, описанного в настоящей публикации, которое специфично связывается с CD47 человека, с опухолевыми клетками. Также в настоящем изобретении предлагается способ стимулирования (например, индукции или усиления) фагоцитоза, например, опосредованной макрофагами фагоцитарной гибели опухолевых клеток, у субъекта, нуждающегося в таком стимулировании (например, у субъекта с опухолевыми клетками, такими как опухолевые клетки, экспрессирующие CD47), включающий в себя введение субъекту эффективного количества анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, которое специфично связывается с CD47 человека.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ уменьшения объема опухоли, включающий в себя осуществление контакта эффективного количества анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, которое специфично связывается с CD47 человека, с опухолью. Также в настоящем изобретении предлагается способ уменьшения объема опухоли у субъекта, нуждающегося в таком уменьшении опухоли (например, у субъекта с опухолью, такой как опухоль, экспрессирующая CD47), включающий в себя введение субъекту эффективного количества анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, которое специфично связывается с CD47 человека.
В конкретном аспекте в настоящем изобретении предлагается способ ингибирования роста или пролиферации злокачественных клеток, включающий в себя осуществление контакта эффективного количества анти-CD47-антитела, описанного в настоящей публикации, которое специфично связывается с CD47 человека, со злокачественными клетками. Также в настоящем изобретении предлагается способ ингибирования роста или пролиферации злокачественных клеток у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании (например, у субъекта со злокачественными клетками, такими как злокачественные клетки, экспрессирующие CD47), включающий в себя введение субъекту эффективного количества анти-CD47антитела, описанного в настоящей публикации, которое специфично связывается с CD47 человека.
- 38 037654
5.4.1 Диагностические применения
В одном аспекте анти-CD47-антитела, описанные в настоящей публикации, и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с ECD CD47 человека, можно применять для диагностических целей, чтобы выявить, диагностировать или контролировать состояние, описанное в настоящей публикации, (например, состояние, в которое вовлечен CD47 и/или аномальная передача сигнала CD47 и/или аномальная экспрессии CD47), такое как злокачественная опухоль (например, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка, рак легкого или меланома). В конкретных вариантах анти-CD47антитела, описанные в настоящей публикации, или их антигенсвязывающие фрагменты, применимые для диагностических целей, метят Способы, предлагаемые в настоящем изобретении для диагностических целей, чтобы выявить, диагностировать или контролировать состояние, описанное в настоящей публикации, могут представлять собой способы in vitro, способы in situ или способы ex vivo. Способы, предлагаемые в настоящем изобретении для диагностических целей, чтобы выявить, диагностировать или контролировать состояние, описанное в настоящей публикации, могут представлять собой способы in vivo.
В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагаются способы выявления состояния, описанного в настоящей публикации, такого как злокачественная опухоль, включающие в себя: (а) анализ экспрессии CD47 в образце от субъекта с использованием одного или нескольких антител, описанных в настоящей публикации, или их антигенсвязывающих фрагментов; и (b) сравнение уровня экспрессии CD47 с контрольным уровнем, например, с уровнями в образцах нормальных тканей (например, от пациента, не имеющего состояния, описанного в настоящей публикации, или от того же самого пациента до появления состояния), при этом повышение или снижение анализируемого уровня экспрессии CD47 по сравнению с контрольным уровнем экспрессии CD47 является показателем состояния, описанного в настоящей публикации.
В некоторых вариантах в настоящем изобретении предлагаются способы выявления злокачественной опухоли, экспрессирующей CD47 (например, сверхэкспрессирующей CD47), включающие в себя: (а) анализ экспрессии CD47 в образце от субъекта с использованием одного или нескольких антител, описанных в настоящей публикации, или их антигенсвязывающих фрагментов; и (b) сравнение уровня экспрессии CD47 с контрольным уровнем, например, уровнями в нормальных образцах (например, от пациента, не имеющего злокачественной опухоли, пациента, имеющего злокачественную опухоль, которая не сверхэкспрессирует CD47, или от того же самого пациента до появления злокачественной опухоли). В конкретных аспектах повышение или снижение анализируемого уровня экспрессии CD47 по сравнению с контрольным уровнем экспрессии CD47 является показателем злокачественной опухоли, экспрессирующей CD47.
В конкретном варианте в настоящем изобретении предлагается способ диагностики злокачественной опухоли, экспрессирующей CD47, у пациента, при этом способ включает в себя стадии:
(a) осуществления контакта биологического образца от пациента с одним или несколькими антителами, описанными в настоящей публикации, или их антигенсвязывающими фрагментами;
(b) выявления связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с CD47, чтобы определить уровень белка CD47 в биологическом образце от пациента; и (c) сравнения уровня белка CD47 со стандартным уровнем белка CD47.
В конкретном варианте в настоящем изобретении предлагается способ контролирования уровня белка CD47 во время лечения CD47-экспрессирующей злокачественной опухоли у пациента, при этом способ включает в себя стадии:
(a) осуществления контакта биологического образца от пациента с одним или несколькими антителами, описанными в настоящей публикации, или их антигенсвязывающими фрагментами;
(b) выявления связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с CD47, чтобы определить уровень белка CD47 в биологическом образце от пациента; и (c) сравнения уровня белка CD47 со стандартным уровнем белка CD47.
Любой образец (например, образец жидкости тела или ткани) от субъекта можно использовать в диагностических способах, предлагаемых в настоящем изобретении. Не ограничивающие примеры образцов, которые можно применять в диагностических способах, предлагаемых в настоящем изобретении, включают образец сыворотки, образец плазмы, образец ткани, образец мочи, образец опухоли и образец кала.
Антитела, описанные в настоящей публикации, можно применять для анализа уровней CD47 в биологическом образце с использованием классических иммуногистологических способов, которые описаны в настоящей публикации или известны специалистам в данной области (например, смотри Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; и Jalkanen et al. , 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096). Другие основанные на антителах способы, применимые для выявления экспрессии генов белков, включают иммуноанализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (РИА). Подходящие метки для анализа на основе антител известны в данной области и включают ферментные метки, такие как, глюкозооксидаза; радиоактивные изотопы, такие как йод (125I, 121I), углерод (14C), сера (35S), тритий (3H), индий (121In) и технеций (99Tc); люминесцентные метки, такие как люминол; и флуоресцирующие метки, такие как флуоресцеин и родамин, и биотин.
- 39 037654
В одном варианте контролирование состояния, описанного в настоящей публикации (например, состояние, в которое вовлечен CD47 и/или аномальная передача сигнала CD47 и/или аномальная экспрессия CD47), такого как злокачественная опухоль, осуществляют, повторяя способ диагностики в течение определенного периода времени после начальной диагностики.
Присутствие меченых молекул можно выявить у субъекта с использованием способов, известных в данной области для сканирования in vivo. Специалисты смогут определить подходящий способ выявления конкретной метки. Способы и устройства, которые можно применять в диагностических способах согласно изобретению, включают без ограничения компьютерную томографию (КТ), сканирование всего организма, такое как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), магнитно-резонансная томография (МРТ) и сонография.
6. Примеры
В настоящем разделе (т.е. разделе 6) предлагаются примеры для иллюстрации, но не для ограничения.
6.1. Пример 1. Бесклеточная (БК) продукция антител.
Наблюдали неэффективную сборку тяжелых и легких цепей анти-CD47-антител АВ6.12 при коэкспрессии в бесклеточной (БК) системе. Один из способов улучшения такого процесса включает предварительное добавление подвергнутой фолдингу легкой цепи в реакционную смесь с тяжелой цепью. В другом способе модификация каркасной последовательности тяжелой цепи неожиданно приводила к более эффективной сборке и коэкспрессии тяжелой и легкой цепей анти-CD47-антител в БК-системе. Характеристика таких анти-CD47-антител с модификациями каркасных последовательностей тяжелой цепи описана более подробно ниже.
Продукция в небольшом масштабе.
Бесклеточные экстракты со сверхэкспрессией DsbC (2X DsbC) размораживали до комнатной температуры и инкубировали с 50 мкМ йодацетамида в течение 30 мин. Реакции в бесклеточной системе осуществляли при 30°С в течение периода времени до 10 ч в смесях, содержащих 30% (об./об.) обработанного йодацетамидом экстракта, 8 мМ глутамата магния, 10 мМ глутамата аммония, 130 мМ глутамата калия, 35 мМ пирувата натрия, 1,2 мМ AMP, 0,86 мМ каждого из GMP, UMP и СМР, 2 мМ аминокислот в случае всех 19 аминокислот, за исключением тирозина, который добавляли до концентрации 0,5 мМ, 4 мМ оксалата натрия, 1 мМ путресцина, 1,5 мМ спермидина, 15 мМ фосфата калия, 100 нМ Т7 RNAP и 2 мМ окисленного (GSSG) глутатиона. Концентрации плазмиды тяжелой цепи и плазмиды легкой цепи в реакционных смесях составляли 7,5 мкг/мл и 2,5 мкг/мл, соответственно. Чтобы пометить синтезируемый белок 14С, в реакционную смесь также добавляли 3,33% (об./об.) 1-[U-14C]-лейцина (300 мккюри/ммоль; GE Life Sciences, Piscataway, NJ) . В данном эксперименте экспрессировали следующие тяжелые цепи (НС), спаренные с одной и той же легкой цепью (LC), SEQ ID NO: 13.
№ образца IgG Описание НС SEQ ID NO: Название антитела
1 IgGl исходное 2 IgGl-исходное
2 IgGl 5 мутаций 7 IgGl-5m
3 IgGl 13 мутаций 5 IgGl-13m
4 IgGl аллотип Z 13 мутаций аллотип 6 Z или 13+2 мутации IgGl-13mZ
5 IgG4P исходное 3 IgG4P-исходное
6 IgG4P 5 мутаций 9 IgG4P-5m
7 IgG4P 13 мутаций 8 IgG4P-13m
8 IgG4PE исходное 4 1д64РЕ-исходное
9 IgG4PE 5 мутаций 11 IgG4PE-5m
10 IgG4PE 13 мутаций 10 IgG4PE-13m
Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих описанные выше последовательности тяжелых цепей приведены в SEQ ID NO: 23, 26, 27, 24, 28, 29, 25, 32 и 31, соответственно.
В случае не восстанавливающего SDS-ПААГ смешивали 4 мкл образца, 8 мкл деионизованной воды (DI Н2О) и 4 мкл 4Х буфера LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) перед загрузкой на гель. В случае восстанавливающего геля смешивали 4 мкл образца, 1 мкл 1 М DTT, 7 мкл DI Н2О и 4 мкл 4Х буфера LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) и нагревали при 70°С в течение 5 мин. Образцы анализировали, используя 4~12% бис-трис-SDS-ПААГ-гели (Invitrogen, Carlsbad, CA) согласно рекомендациям производителя. Гели сушили и анализировали авторадиографически, используя Storm 840 Phospholmager примерно после 16часовой экспозиции.
Авторадиография показана на фиг. 1А.
- 40 037654
Данные показывают, что титры БК-экспрессии IgG1, IgG4P и IgG4PE значительно улучшались при конструировании 5 мутаций и 13 мутаций в последовательностях их НС. Титры приведены на фиг. 1В.
Продукция в увеличенном масштабе -IgG1-варианты.
Осуществляли БК-продукцию в увеличенном масштабе IgG1-вариантов антител, таких как IgG1-5m и IgG1-13mZ, и их очистку. Условия для увеличенного масштаба более подробно описаны в таблицах (например, таблицах 3-6) ниже. Оба варианта были получены по существу одним и тем же способом; наиболее значимое различие имело место в температуре реакции. IgG1-5m экспрессировали при 25°С, и IgG1-13mZ получали при 30°С. В случае IgG1-13mZ наблюдали сходные результаты при 25°С и 30°С, а в случае IgG1-5m наблюдали более высокий титр при 25°С по сравнению с 30°С. Небольшие различия в периодах времени реакций между двумя вариантами являются просто результатом составления удобного графика и вероятно не оказывает никакого значимого влияния на процесс. Для вариантов использовали разные экстракты, основываясь на доступности экстрактов, но не на основе конкретных требований к экстрактам. Предполагается, что любой экстракт со сверхэкспрессией DsbC будет работать сходным образом в отношении таких продуктов.
Экспрессия IgG1-13mZ (IgG1, каркас VH1-18, 13+2 мутаций) в увеличенном масштабе.
Бесклеточный экстракт S30 обрабатывали 50 мкМ йодацетамидом (IAM) в течение 30 мин при комнатной температуре. После такой обработки экстракт объединяли с реагентами, указанными в табл. 3, и переносили в биореактор (Dci-BioLafitte Evo Bioreactor, максимальный рабочий объем 10 л). Настройки биореактора устанавливали, как указано в таблице 4. После 6 часов протекания реакции в реакционную смесь дополнительно добавляли 5 мМ (конечная концентрация) окисленный глутатион. Окисленный глутатион готовили в виде 250 мМ маточного раствора с рН, который корректировали до уровня от 7 до 8 перед добавлением в реактор. Реакцию проводили в течение 15 часов, затем переносили для дальнейшей обработки.
Таблица 3. Компоненты бесклеточной реакционной смеси
Реагент Конечная концентрация в БК реакционной смеси
АМР 1,2 мМ
GMP 0,86 мМ
UMP 0,86 мМ
СМР 0,86 мМ
Фосфат натрия 15 мМ
19 аминокислот (за исключением тирозина) 2 мМ каждого
Щавелевая кислота 4 мМ
Путресцин 1 мМ
Спермидин 1,5 мМ
Глутамат аммония 10 мМ
Глутамат калия 130 мМ
Глутамат магния 8 мМ
Тирозин 1 мМ
Пируват 35 мМ
Окисленный глутатион 2 мМ
РНК-полимераза бактериофага Т7 0,02 г/л
Плазмида, кодирующая белок легкой цепи 2,5 мг/л
Плазмида, кодирующая белок тяжелой цепи 7,5 мг/л
Cipro 1 мг/л
Плюроник-R 31R1 0,005% (об./об.)
IAM-обработанный экстракт Е. coli штамма SBDG028 30% (об./об.)
- 41 037654
Таблица 4. Контрольные установки биореактора (объем реакционной смеси 5 л)
Параметр Заданная величина
Температура 30°С
pH не контролируется
Поток воздуха (барботажное устройство) 1,5 ст. л/мин
DO (растворенный кислород) 100% насыщение воздухом
Встряхивание 200-400 об./мин, как необходимо для контроля РО (первичный каскад DO)
Поток кислорода (барботажное устройство) 0-2 ст. л/мин, как необходимо для контроля DO (вторичный каскад DO)
Экспрессия анти-CD47-антитела IgG1-5m (IgG1, каркас VH1-18, 5 мутаций) в увеличенном масштабе.
Бесклеточный экстракт S30 обрабатывали 50 мкМ йодацетамидом (IAM) в течение 30 мин при комнатной температуре. После такой обработки экстракт объединяли с реагентами, указанными в табл. 5, и переносили в биореактор (Sartorius Biostat Q Bioreactor, максимальный рабочий объем 500 мл). Настройки биореактора устанавливали, как указано в таблице 6. После 5,5 часов протекания реакции в реакционную смесь дополнительно добавляли 5 мМ (конечная концентрация) окисленный глутатион. Окисленный глутатион готовили в виде 250 мМ маточного раствора с рН, который корректировали до уровня от 7 до 8 перед добавлением в реактор. Реакцию проводили в течение 15,7 ч, затем переносили для дальнейшей обработки.
Таблица 5. Компоненты бесклеточной реакционной смеси
Реагент Конечная концентрация в БК реакционной смеси
АМР 1,2 мМ
GMP 0,86 мМ
UMP 0,86 мМ
СМР 0,86 мМ
Фосфат натрия 15 мМ
19 аминокислот (за исключением тирозина) 2 мМ каждого
Щавелевая кислота 4 мМ
Путресцин 1 мМ
Спермидин 1,5 мМ
Глутамат аммония 10 мМ
Глутамат калия 130 мМ
Глутамат магния 8 мМ
Тирозин 1 мМ
Пируват 35 мМ
Окисленный глутатион 2 мМ
РНК-полимераза бактериофага Т7 0,02 г/л
Плазмида, кодирующая белок легкой цепи 2,5 мг/л
Плазмида, кодирующая белок тяжелой цепи 7,5 мг/л
Cipro 1 мг/л
Плюрооник-R 31R1 0,005% (об./об.)
IAM-обработанный экстракт SBDG031 Е. coll штамма 30% (об./об.)
- 42 037654
Таблица 6. Контрольные установки биореактора (объем реакционной смеси 0,5 л)
Параметр Заданная величина
Температура 25°С
pH не контролируется
Поток воздуха (барботажное устройство) 0,25 ст. л/мин
DO (растворенный кислород) 80% насыщение воздухом
Встряхивание 200-400 об./мин, как необходимо для контроля РО (первичный каскад DO)
Поток кислорода (барботажное устройство) 0-1 ст. л/мин, как необходимо для контроля DO (вторичный каскад DO)
6.2. Пример 2. Анализ Biacore связывания CD47.
Материал и способы.
Иммобилизация: поверхности, покрытые антителом против Fc человека (АНС) готовили посредством аминного связывания моноклонального мышиного антитела против Fc IgG человека (входящего в состав набора для улавливания антител человека Biacore, GE Life Sciences, № в каталоге BR-1008-39) с поверхностью сенсорного чипа Biacore CM5. Рабочий буфер для процесса иммобилизации представлял собой буфер HBS-EP+ (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% об./об. Р-20 в качестве поверхностно-активного вещества). Следующие процессы осуществляли во всех четырех проточных ячейках, чтобы получить поверхности, с которыми через амин связано антитело против Fc IgG человека. Поверхность чипа СМ5 активировали инъекцией смеси 1:1 (об./об.) 400 мМ EDC и 100 мМ NHS в течение 7 мин с расходом 10 мкл/мин. После такой обработки антитело против IgG человека разбавляли до 25 мкг/мл в 10 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, и инъецировали на все проточные ячейки со скоростью потока 10 мкг/мин в течение 7 мин. Затем инъецировали этаноламин со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 7 мин, чтобы блокировать все поверхности. Такой способ приводил к уровням иммобилизации ~1000011000 условных единиц на сенсорный чип.
Кинетические анализы: для кинетических анализов анти-CD47-антитела улавливали на поверхностях, покрытых антителами против Fc человека (подготовка поверхностей описана выше). Для улавливания антител с использованием Fc человека антитела разбавляли до 10 мкг/мл в рабочем буфере HBS-EP+. Варианты антител иммобилизовали пропусканием через проточную ячейку 2, 3 или 4 со скоростью потока 10 мкл/мин в течение 12 с. Аналит (антиген CD47 человека) разбавляли в рабочем буфере, создавая серийные разведения с разведениями в 2 раза, чтобы получить концентрации 3,125, 6,25, 12,5, 25 и 50 нМ. После улавливания анти-CD47-антител в проточные ячейки инъецировали аналит CD47 в течение 180 секунд (3 мин) со скоростью 50 мкл/мин и наблюдали диссоциацию комплекса в течение 900 с (15 мин). Также пропускали контрольные буферы и использовали для сравнения данных связывания аналита со стандартом перед подгонкой. Поверхности, покрытые анти-Fc человека регенерировали, используя две 30-секундные инъекции 3М MgCl2 с расходом 30 мкл/мин между отдельными циклами связывания аналита.
Анализ кинетических данных: Экспериментальные результаты для данного взаимодействия антитело-антиген подгоняли с помощью модели связывания 1:1 с использованием параметров глобального Rmax, глобальной ka (ассоциация) , глобальной kd (диссоциация) и константы RI (показатель преломления объемной среды). Активность фракции (% активности лиганда) определяли с использованием следующей формулы, чтобы вычислить взаимосвязь между теоретическим Rmax (Rmax теор.) и экспериментальным Rmax (Rmax эксп.). В формуле стехиометрия представляет случаи взаимодействия между антителом и антигеном, например, когда антитело является лигандом, каждое плечо антитела может взаимодействовать с антигеном, таким образом стехиометрия равна 2.
/MW аналит А
Итахтеор = уровень лиганда лиганд стехиометрия /Rmax эксп.\ % активности лиганда = ----------X 100 (Rmax теор.)
Результаты: анализ Biacore показал, что все три варианта анти-CD47-антитела с 5 мутациями (независимо от изотипа) имеют сходные скорости диссоциации и аффинности, при этом активность фракции (% активности лиганда) составлял около 38%. Также аффинность в случае вариантов антител с 5 мута- 43 037654 циями хорошо соответствовала аффинности исходного антитела. Данные суммированы в таблице (табл.
7) ниже.
Таблица 7. Суммарные данные анализа Biacore
Количество мутаций Антиген Лиганд ka (1/Mkd сек) (1/сек) KD (M) Rrnax (RU) Chi2 (RU2) активность лиганда, %
CD47 IgGl-5m 6,36E+05 2,60E-03 4,09E- 09 123,4 1, 83 37,4
PGRTV 5 мутаций CD47 IgG4P - 5m 7,04E+052,54E-03 3,60E- 09 106,5 1,86 38,2
CD47 IgG4PE - 5m 5,94E+05 2,54E-03 4,27E- 09 115,4 2,5 39,2
Контрольное антитело CD47 Ahth-CD47 БК- контроль 7,32E+05 2,31E-03 3,16E- 09 99, 68 1,36 39,4
Данные для вариантов анти-CD47-антитела 13m (с 13 мутациями) и 13mZ (с 13 мутациями и аллотипом Z IgG1) показали очень быструю скорость диссоциации, и анализ кинетических параметров не привел к достоверной подгонке на основе модели связывания 1:1.
На фиг. 2А-2Е изображены отдельные сенсограммы для вариантов антител IgG1-5m (фиг. 2А), IgG1-13m (фиг. 2В), IgG1-13mZ (фиг. 2С) , IgG4P-5m (фиг. 2D) и IgG4PE-5m (фиг. 2E); и на фиг. 2F изображена сенсограмма контрольного анти-CD47-антитела.
6.3. Пример 3. Прямой анализ связывания CD47-клеток.
Чтобы получить кривые связывания образцы вариантов титровали 1:2 в FACS-буфере (PBS, 2% FCS), начиная с высокой концентрации ~66 нМ для каждого образца. 0,1х106 клеток CCRF-EM высевали в 96-луночный планшет и инкубировали в 50 мкл буфера FACS, содержащего указанную концентрацию образца вариантов, в течение 1 часа на льду. Затем клетки промывали 150 мкл буфера FACS и инкубировали в 50 мкл буфера FACS, содержащего второе антитело (антитело против IgG человека-РЕ, Jackson ImmunoResearch), разбавленное 1:100, в течение 1 ч на льду. Затем клетки промывали буфером FACS и фиксировали в 2% PFA для получения данных с использованием проточного цитометра LSR II, DB (BD Biosciences, San Jose, CA). Проточно-цитометрический анализ осуществляли, используя компьютерную программу FloJo, версию 9.6.4. Чтобы получить кривые титрования и Kd, средние значения интенсивности флуоресценции (MFI) откладывали на графике против концентрации (нМ). Значения Kd вычисляли с использованием Prism 6, нелинейного регрессионного анализа подгонки кривых, специфичного для одного сайта связывания, с использованием углового коэффициента Хилла.
Результаты: Все полученные в СНО и в БК-системе моноклональные анти-CD47-антитела имели эквивалентные Kd связывания на поверхности клеток CCRF-CEM, которые являются Т-лимфобластными клетками человека (АТСС® CCL-119™). Вычисленные значения Kd (нМ) представлены в таблице ниже (табл. 8).
Таблица 8
анти-СО47-мАт Kd (нМ)
IgGl-исходное-СНО 0, 18
IgGl-исходное-БК 0, 14
IgGl-13m-BK 0, 15
IgGl-13mZ-BK 0,21
IgGl-5m-BK 0, 12
1д64Р-исходное-СНО 0, 18
IgG4P-5m-BK 0, 14
1дС4РЕ-исходное-СНО 0,21
IgG4PE-5m-BK 0, 14
B6H12, mu анти-hu CD47 ~16, 0
6.4. Пример 4. Анализ фагоцитоза.
Получение макрофагов человека: мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяли из лейкоцитарной пленки (белого слоя между эритроцитами и плазмой в порции цельной крови после откручивания на центрифуге), полученной из центра переливания крови Stanford (Palo Alto, CA, USA). Лейкоцитарные пленки разбавляли в PBS в 2 раза и наслаивали на 15 мл NycoPrep 1,077 (AxisShield, Dundee, Scotland) в пробирках Leucosep объемом 50 мл (Greiner Bio One, Monroe, NC, USA) и цен- 44 037654 трифугировали при 1000 х g в течение 20 мин. РВМС собирали из промежуточного слоя, промывали 35 мл PBS и центрифугировали при 250xg в течение 5 мин. Имеющиеся в виде примеси эритроциты лизировали, используя 10 мл лизирующего буфера ACK (Lonza, Allendale, NJ, USA), в течение 2 мин, и клетки разбавляли 40 мл PBS и пропускали через 40 мкм клеточное сито (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Клетки центрифугировали при 250xg в течение 5 мин и ресуспендировали в 30 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS, 2 мМ глутамина и пенициллин-стрептомицин. РВМС подсчитывали и культивировали в концентрации 5x106 клеток/мл в среде RPMI в течение ночи. На следующий день CD14-позтивные моноциты выделяли с помощью CD14-микрошарики (Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA), используя AutoMacs Pro, и культивировали в среде RPMI, содержащей 50 нг/мл M-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), в течение 5-7 суток, чтобы получить дифференцированные макрофаги. Клетки замораживали в среде для замораживания культур выделенных клеток (Life Technologies, Grand Island, NY, USA).
Измерение активности фагоцитоза: Замороженные или свежие макрофаги человека культивировали в течение ночи в 96-луночных планшетах (20000 клеток в 0,1 мл среды RPMI с добавлением 50 нг/мл MCSF). На следующий день среду заменяли 50 мкл среды RPMI без M-CSF после одной промывки. CD47позитивные клетки CCRF-CEM (ATCC, Manassas, VA, USA), высеянные при плотности 1,5х106 клеток/мл, метили, используя 10 мкМ CellTrace Oregon Green 488 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), в течение 30 мин и промывали 3 раза средой RPMI. Меченые клетки CCRF-CEM (80000 клеток в 50 мкл) и анти-CD47-антитела в 50 мкл среды RPMI добавляли к макрофагам. Анти-CD47-антитела тестировали при конечной концентрации от 4 нг/мл до 10 мкг/мл. Чашки кратковременно центрифугировали и инкубировали при 37°С в течение 3 ч. Макрофаги промывали 3 раза в PBS, чтобы извлечь клетки CCRF-CEM, и открепляли, используя 50 мкл аккутазы (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), при 37°С в течение 10 минут. Макрофаги собирали, промывали один раз буфером для промывки FACS (PBS, содержащий 0,2% FBS) и красили, используя анти-CD14-АРС, в течение 15 минут. Клетки два раза промывали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 мин. Клетки анализировали проточной цитометрией, чтобы определить фагоцитарный индекс (% CD14-позитивных клеток, которые мечены Oregon Green). Данные анализировали с использованием GraphPad Prism, чтобы получить кривые зависимости доза-ответ и значения полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС50) с использованием нелинейного регрессионного анализа с переменным наклоном (4 параметра).
Результаты. Фагоцитарную активность наблюдали в случае всех вариантов IgG1 (БК и СНО), и IgG4P и IgG4PE только из СНО. Значения ЕС50 приведены в таблице ниже (табл. 9).
Таблица 9
Варианты анти-СО47 ЕС5о (нМ)
IgGl IgGl-исходное-СНО 0, 3
IgGl-исходное-БК 0, 5
IgGl-5m-BK (R&D) 0, 6
IgGl-5m-BK (PD) 0, 3
IgG4P 1д64Р-исходное-СНО 0, 5
1д64Р-исходное-БК Не определяли
IgG4P-5m-BK Не определяли
IgG4PE IgG4РЕ-исходное-СНО 0,7
IgG4РЕ-исходное-БК Не определяли
IgG4PE-5m-BK Не определяли
6.5. Пример 5. Анализ гемагглютинации.
Опубликованные исследования свидетельствуют о том, что некоторые анти-CD47-антитела могут вызывать гемагглютинацию эритроцитов человека (RBC). Поэтому были осуществлены анализы гемагглютинации, чтобы охарактеризовать способность анти-CD47-антител стимулировать агглютинацию RBC.
RBC человека получали из Innovative Research (№ в каталоге IPLA-WB3). RBC человека (2 мл) промывали в 10 мл 1x dPBS (pH 7,4) и центрифугировали в течение 10 мин при 500g (1500 об/мин). Надосадок аспирировали и RBC человека дважды промывали, ресуспендировали в 8 мл 1x dPBS для получения 20% раствора RBC. Разбавление в случае антитела (кролика) против RBC человека (Rockland Immunochemicals Inc., № в каталоге 109-4139, партия 27233), позитивного контроля, было 1:64 с серийными разведениями 1:3 (10х). Исходная концентрация в случае образцов составляла 1000 нМ с серийными разведениями 1:3 (10х). Титрование каждого антитела осуществляли пипеткой (50 мкл) во все лунки 96луночного планшета с U-образным дном. Раствор RBC (50 мкл 20% раствора RBC) добавляли во все лунки планшета, и планшет инкубировали при 37°С в течение по меньшей мере от 1,5 до 12 ч (примеча- 45 037654 ние: не наблюдали видимых различий в результатах, полученных в случае 1,5 ч и в течение ночи). Антитело (кролика) против RBC человека и МСА911 (мышиное антитело против CD47 человека (клон BRIC
126, Abnova)) служили в качестве позитивных контролей. Анализы визуализировали сверху планшета.
Негативные (отсутствие гемагглютинации) результаты были видны в виде интактных красных пятен, тогда как позитивные (гемагглютинация) результаты выглядели в виде растекшегося красной массы.
Результаты: только позитивные контроли (антитело кролика против RBC человека и МСА911 (мышиное антитело против CD47 человека)) приводили к гемагглютинации. Ни моноклональные антиCD47-антитела, экспрессированные в СНО, ни моноклональные анти-CD47-антитела антитела, экспрессированные в бесклеточной (БК)-системе, включая IgG1-исходное, IgG4P-исходное, IgG4PE-исходное, IgG1-13mZ-БК, IgG1-13m-БК, IgG1-5m-БК, IgG4P-5m-БК, IgG4PE-5m-БК, не приводили к гемагглютинации.
6.6. Пример 6. ELISA связывания C1Q.
Способ: 96-луночные планшеты для ELISA с высокой эффективностью связывания белков (MaxSorp Nunc) покрывали в течение ночи при 4°С образцами вариантов анти-CD47-антитела, разбавленными в 0,05 М натрий-бикарбонатном буфере (рН 9). Образцы разводили при высокой концентрации 133,4 нМ (20 мкг/мл) и титровали 1:2, получая кривую разведения по 11 точкам. Планшеты три раза промывали PBS, 0,05% твин-20 и блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре разбавителем для ELISA (0,1 М NAPO4, 0,1 М NaCl, 0,1% желатин, 0,05% твин-20, 0,05% ProClin300). Затем планшеты снова три раза промывали и инкубировали в течение двух часов при комнатной температуре с 2 мкг/мл C1q человека (AbD Serotec 2221-5504, исходный раствор 1 мг/мл), разбавленного в разбавителе для ELISA. Затем планшеты три раза промывали и инкубировали с антителом овцы против C1q человека-HRP (AbD Serotec 2221-5004P), разбавленным 1:200 в разбавителе для ELISA, в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы выявить связанный C1q. Затем планшеты три раза промывали, затем добавляли 100 мкл раствора ТМВ. Реакцию гасили добавлением 100 мкл 1 М фосфорной кислоты и планшет считывали при 450 нМ. Графики данных строили с использованием Prism6 в виде кривой нелинейной регрессии: log (ингибитор) против ответа - переменный наклон (четыре параметра).
Результаты: IgG1-QN1-CHO проявляет активность в анализе ELISA C1Q, тогда как IgG4P, IgG4PE, и scFv моноклональные анти-CD47-антитела не проявляют активности (NA) в анализе ELISA C1Q. Значения ЕС50 приведены в таблице ниже (табл. 10).
Таблица 10
Образец EC5o (hM)
IgGl-исходное-СНО 3, 6
IgGl-исходное-БК NA
IgGl-13mZ-EK NA
IgGl-13m-EK NA
IgGl-5m-EK NA
1д64Р-исходное-СНО NA
1д64Р-исходное-БК NA
IgG4P-5m-BK NA
Ahth-CD47 B6H12 scFv NA
1д64РЕ-исходное-СНО NA
IgG4PE-исходное-EK NA
IgG4PE-5m-EK NA
6.7. Пример 7. Анализ зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC).
Способы: CD47-экспрессирующие линии клеток (Raji и/или CCRF) собирали и ресуспендировали в буфере CDC (RPMI 1640, L-глутамин (100х маточный раствор) и 1% БСА) в концентрации 0,3 миллиона клеток в миллилитре. Затем клетки высевали по 10000 клеток на лунку в 96-луночный планшет для культуры ткани с белыми лунками (Falcon) и инкубировали с образцами вариантов анти-CD47-антитела в конечной концентрации 10 мкг/мл в буфере CDC при 37°С в течение 1 ч. Центрифужные фильтры (микроцентрифужные пробирки Costar SpinX) использовали для удаления остаточных загрязнителей. Затем добавляли сыворотку кролика (7,5%) или человека (30%) в конечной концентрации 2,5% и 10%, соответственно, и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Сыворотку разбавляли буфером для анализа CDC. Затем измеряли гибель клеток с использованием набора Cell Tox Glot (Promega G292) и следуя инструкциям производителя. Планшеты считывали на считывающем устройстве для планшетов Envision luminescent (программа Luminescent 96 well full area) и вычисляли CDC-активность в процентах в виде (обработанные клетки-спонтанные клетки)/(общий лизис-спонтанный лизис)*100.
Результаты: CDC-активность наблюдали в случае антител Bric 126, анти-CD20-IgG1-антител и ан- 46 037654 ти-CD20-IgG4-антител, тогда как CDC-активность не наблюдали (NA) ни при каких других антителах.
Значения ЕС50 приведены в таблице ниже (табл. 11).
Таблица 11
Название ЕС50 (нМ)
CD20 IgGl 0,21
BRIC 126 (анти-СБ47- антитело) 0,0014
В6Н12 (анти-СБ47- антитело) NA
IgGl-исходное-СНО NA
1д64Р-исходное-СНО NA
IgG4РЕ-исходное-СНО NA
IgGl-исходное-БК NA
IgGl-5m-BK NA
IgGl-13m-BK NA
IgGl-13mZ-EK NA
1д64Р-исходное-БК NA
IgG4P-5m-BK NA
Контрольный изотип IgGl NA
Контрольный изотип IgG4 NA
1д64РЕ-исходное-БК NA
IgG4PE-5m-BK NA
6.8. Пример 8. Анализ зависимой от антител цитотоксичности (ADCC).
Способы: РВС получали из лейкоцитарной пленки. Лейкоцитарные пленки разбавляли в PBS в 2 раза и наслаивали на 15 мл NycoPrep 1,077 (Axis-Shield, Dundee, Scotland) в пробирках Leucosep объемом 50 мл (Greiner Bio One, Monroe, NC, USA) и центрифугировали при 1000 x g в течение 20 мин. РВМС собирали из промежуточного слоя и промывали 35 мл PBS и центрифугировали при 250xg в течение 5 мин. Имеющиеся в виде примеси эритроциты лизировали, используя 10 мл лизирующего буфера АСК (Lonza, Allendale, NJ, USA), в течение 2 мин, и клетки разбавляли 40 мл PBS и пропускали через 40 мкм клеточное сито (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Клетки центрифугировали при 250xg в течение 5 мин и ресуспендировали в 30 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS, 2 мМ глутамина и пенициллинстрептомицин. 10000 клеток CCRF-CEM или SKBR3 культивировали совместно с 300000 РВМС в каждой лунке в 96-луночном полипропиленовом планшете с U-образным дном. РВМС получали из лейкоцитарной пленки человека, полученной из центра переливания крови Stanford. Трехкратные разведения образцов вариантов добавляли в каждую лунку в двух повторах, начиная с наибольшей концентрации 22,2 нМ, и инкубировали при 37°С в течение 3 ч. Затем клетки лизировали в 50 мкл реагента Glo, следуя инструкциям производителя. Планшеты считывали на считывающем устройстве для планшетов Envision luminescent (программа Luminescent 96 well full area). Активность ADCC в процентах вычисляли в виде (обработанные клетки - спонтанные клетки)/(общий лизис спонтанный лизис)*100.
Результаты: ADCC-активность наблюдали в случае антител трастузумаба (СНО) и исходного IgG1CHO, которые оба были экспрессированы в клетках СНО; тогда как ADCC-активность не наблюдали (NA) ни при каком другом тестированном анти-CD47-антителе (экспрессированных в клетках СНО или экспрессированных в БК-системе). Значения ЕС50 приведены в таблице ниже (табл. 12).
- 47 037654
6.9. Пример 9. Анализ с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (анализ термостабильности).
Способ: Дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) осуществляли на приборе для капиллярной ДСК GE VP. Анализ проводили при температуре 20-100°С с изменением нагрева 60°С/ч. Режим обратной связи был отключен, и использовали период фильтрации 10 с. Период термостатирования перед сканированием был установлен на 5 мин. Все образца тестировали в концентрации 1 мг/мл в следующем буфере: 50 мМ L-гистидин, 150 мМ NaCl, 2% трегалоза, рН 6,0.
Результаты: С использованием ДСК анализировали три разных конструкции анти-CD47-IgG1антитела:
1) IgG1-13mZ;
2) IgG1-13m;
3) IgG1-5m.
В частности, интерес представлял переход в расплавленное состояние Fab-домена (ТМ2), учитывая что три антитела отличались только по остаткам, локализованным в Fab-домене. Как показывают данные на фиг. 3А, наблюдалось хорошее согласованное разворачивание при переходе Fab в случае всех трех конструкций, при этом IgG1-5m имел самую высокую ТМ2.
В таблице ниже (табл. 13) суммированы температуры переходов для трех разных переходов всех трех анти-CD47-IgG1-конструкций. Как можно видеть, могут наблюдаться только минорные (<1,0°С) различия в ТМ для переходов СН2 (ТМ1) и СН3 (ТМ3). Однако ТМ2 IgG1-5m свидетельствует о стабилизации с температурой на 1,5°С выше по сравнению с другими вариантами.
Таблица 13
Вариант ТМ1 [°C] TM2 [°C] ТМЗ [°C]
IgGl-13mZ 62,0 75, 3 81,8
IgGl-13m 62,5 75, 3 82,5
IgGl-5m 62,2 76, 6 82,8
В частности, IgG1-5m проявляет удивительно улучшенную термостабильность по сравнению с полученным в культуре клеток СНО эталонным стандартом IgG4PE (CHO IgG4PE) (фиг. 3В). Как можно видеть, все термоиндуцированные переходы в случае материала СНО IgG4PE лежат ниже 75°С, тогда как IgG1-5m в значительной степени стабилизирован и денатурирует при более высоких температурах, за исключением домена СН2 при 62,2°С.
Чтобы увидеть, может ли термостабилизация, наблюдаемая в контексте IgG1, также распространяется на остов IgG4, с использованием ДСК сравнивали три следующих варианта анти-CD47-IgG4:
1) IgG4PE-5m;
2) IgG4P-5m;
3) IgG4PE CHO.
Как видно на термограмме, представленной на фиг. 3С, плавление Fab-области в контексте IgG4P и IgG4PE улучшается на 9°С при введении 5-мутаций по сравнению с эталонным материалом IgG4PE CHO.
Полученные результаты, вместе взятые, показывают, что термостабилизация Fab-домена может быть достигнута введением выбранных мутаций. Так как область Fab остается неизменной в остовах IgG1 и IgG4, повышение термостабильности по-видимому распространяется с одного остова на другой, что свидетельствует о том, что это также может быть справедливым и в отношении других изотипов IgG1.
6.10. Пример 10. Фармакокинетические свойства анти-CD47-антител.
Способы: анти-CD47-антитела IgG4-PE CHO, IgG1-БК и IgG1-5m-БК вводили мышам в виде болюсной внутривенной инъекции в дозах на уровне 3,0, 3,0 и 2,5 мг/кг, соответственно. Образцы плазмы собирали в выбранных временных точках до 28 суток (672 ч) после введения дозы и определяли концентрацию соответствующего белка в иммуноанализе. Затем определяли фармакокинетические свойства с
- 48 037654 использованием подходя без учета компартментов с использованием WinNonlin v 5.3, Phoenix 64 (Certara, CA). AUC вычисляли, используя линейное правило трапеций для восходящей части кривой и логарифмическое правило трапеций для нисходящей части. Конечное время полужизни определяли на основании регрессии log концентрации в плазме относительно времени. Количество точек, используемых для регрессии определяли в результате визуального просмотра данных, при этом использовали минимум три конечных временных точки. Начальный объем распределения вычисляли на основании дозы/концентрации в плазме, экстраполированной к нулевому времени. Все другие параметры вычисляли в WinNonlin с использованием стандартных способов.
Результаты: фармакокинетика в случае IgG4-PE CHO, IgG1-БК и IgG1-5m-БК была сходной. Кли ренс является низким, что приводит к относительно длительному времени полужизни, несмотря на то, что объемы распределения также являются небольшими, обычными для таких типов соединений. Начальный объем распределения был приблизительно равен объему крови, хотя объемы распределения на основании площади и в стационарном состоянии составляли приблизительно половину от внеклеточной воды.
Конъюг ат Со (мкг/м П AUClast (мкг*ча AUC« (мкг*ча Конечн ое ti/2 С1 (мл/ч ас/кг Начальны й V vz (мл/к vss (мл/к
с/мл) с/мл) (час) ) (мл/кг) г) г)
IgG4- РЕ СНО 76, 13 10063 11391 218,8 0,26 39,40627 873 83,2 80
IgGl- БК 64,9 7009 7368 165 0,41 46,22496 148 96, 9 100,8
IgGl 48,8 7021 7789 193,1 0,32 51,22950 89,4 92,4
6.11. Пример 11. Противоопухолевая активность in vivo.
Противоопухолевую активность анти-CD47-антител, полученных в бесклеточной системе, тестировали in vivo с применением модели ксенотрансплантатов опухолей, используя линию клеток миеломы человека RPMI8226.
Способы: мышам NOD/SCID подкожно инъецировали клетки RPMI 8226. Затем мышей обрабатывали контрольным наполнителем, hIgG4 или БК-анти-CD47-антителами, такими как анти-CD47 IgG1-5m, которые вводили (qwx3) в дозе 1 мг/кг, 0,3 мг/кг или 0,1 мг/кг. Контролировали объем опухолей.
Результаты: на фиг. 5 изображен график зависимости объема опухолей от времени (дни после инокуляции опухолей). БК-анти-CD47 IgG1-Sm-антитело позволяло достигать уменьшения объема опухоли (TVR) на 83% при дозе 1 мг/кг и TVR 50% при дозе 0,3 мг/кг. Процент мышей без опухолей в конце составлял 25% (2/8) в случае дозы 1 мг/кг БК-анти-CD47 IgG1-5m-антитела.
Все публикации (например, публикации или патенты или заявки на выдачу патентов), цитированные в настоящем описании, включены в настоящую публикацию в виде ссылки в полном объеме и для всех целей в такой же степени, как и в том случае, если бы специально и по отдельности было указано, что каждая отдельная публикация (например, публикация или патент или заявка на выдачу патентов) включена в виде ссылки в полном объеме для всех целей.
Другие варианты входя в объем следующей далее формулы изобретения.

Claims (23)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с CD47, содержащее по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из S228P и L235E согласно нумерации EU в константном домене в пределах шарнирной области для предотвращения или снижения обмена цепями, и где антитело при получении с использованием бесклеточной системы дает более высокий титр экспрессируемых антител или выход по сравнению с исходным антителом, получаемым с использованием бесклеточной системы, содержит:
    (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность: X1QX2QLVQSGAEVKKX3GX4SVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQX5LEWMGWIDPDQGDTEYAQ KX6QX7RVTX8TX9DX10SX11STAYMELX12SLRSX13DTAX14YYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV (SEQ ID NO:20), где X1 представляет собой М или в положении X1 аминокислота отсутствует, X2 представляет собой М или V, X3 представляет собой Р, X4 представляет собой S или А, X5 представляет собой А или G, X6 представляет собой F или L, X7 представляет собой G, X8 представляет собой I или М, X9 представляет собой R или Т, X10 представляет собой R или Т, X11 представляет собой Т, X12 представляет
    - 49 037654 собой R, X13 представляет собой Е или D и X14 представляет собой V; и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, содержащую аминокислотные последовательности KASQDIHRYLS (SEQ ID NO:17), RANRLVS (SEQ ID NO: 18) и LQYDEFPYT (SEQ ID NO:19), соответственно, где антитело содержит одну или несколько модификаций в каркасном домене вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с родительским анти-CD47 антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 2, 3 или 4.
  2. 2. Моноклональное антитело, которое специфически связывается с CD47 человека, где антитело, если получено с использованием бесклеточной системы, дает более высокий титр экспрессии антитела или выход по сравнению с родительским антителом, полученным с использованием бесклеточной системы, содержит:
    (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность: X1QX2QLVQSGAEVKKX3GX4SVKVSCKASGFNIKDYYLHWVRQAPGQX5LEWMGWIDPDQGDTEYAQ KX6QX7RVTX8TX9DX10SX11STAYMELX12SLRSX13DTAX14YYCNAAYGSSSYPMDYWGQGTTVTV (SEQ ID NO:20), где X1 представляет собой М или в положении X1 аминокислота отсутствует, X2 представляет собой М или V, X3 представляет собой Р, X4 представляет собой S или А, X5 представляет А или G, X6 представляет собой F или L, X7 представляет собой G, X8 представляет собой I или М, X9 представляет собой R или Т, X10 представляет собой R или Т, Xn представляет собой Т, X12 представляет собой R, X13 представляет собой Е или D, и X14 представляет собой V; и (ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, содержащую аминокислотные последовательности KASQDIHRYLS (SEQ ID NO:17), RANRLVS (SEQ ID NO: 18) и LQYDEFPYT (SEQ ID NO:19), соответственно, где антитело содержит одну или несколько модификаций в каркасном домене вариабельной области тяжелой цепи по сравнению с родительским анти-CD47 антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 2, 3 или 4.
  3. 3. Антитело по п.1 или 2, в котором VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21.
  4. 4. Антитело по п.1 или 2, в котором VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22.
  5. 5. Антитело по п.1 или 2, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.
  6. 6. Антитело по п.1 или 2, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.
  7. 7. Антитело по п.1 или 2, которое содержит VH в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7.
  8. 8. Антитело по п.1 или 2, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.
  9. 9. Антитело по п.1 или 2, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9.
  10. 10. Антитело по п.1 или 2, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.
  11. 11. Антитело по п.1 или 2, в котором тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11.
  12. 12. Антитело по любому из пп.1-11, которое при экспрессии с использованием бесклеточной системы проявляет более низкую аффинность связывания или не связывается с FcyR по сравнению с экспрессией с использованием клеток СНО.
  13. 13. Антитело по любому из пп.1-11, которое содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO: 13 без аминокислоты М на N-конце.
  14. 14. Антитело по п.1 или 2, где X1 представляет собой М или в положении X1 отсутствует аминокислота, X2 представляет собой М, X3 представляет собой Р, X4 представляет собой S, X5 представляет собой G, X6 представляет собой F, X7 представляет собой G, X8 представляет собой I, X9 представляет собой R, X10 представляет собой R, X11 представляет собой Т, X12 представляет собой R, X13 представляет собой Е и X14 представляет собой V.
  15. 15. Антитело по п.1, где антитело содержит VH в пределах аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7.
  16. 16. Антитело по п.1, где X1 представляет собой М или в положении X1 отсутствует аминокислота, X2 представляет собой М, X3 представляет собой Р, X4 представляет собой S, X5 представляет собой А, X6 представляет собой F, X7 представляет собой G, X8 представляет собой I, X9 представляет собой R, X10 представляет собой R, X11 представляет собой Т, X12 представляет собой R, X13 представляет собой Е и X14 представляет собой V.
  17. 17. Конъюгат, содержащий антитело по любому из пп.1-16, которое конъюгировано с меткой или токсином.
    - 50 037654
  18. 18. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей CD47, содержащая терапевтически эффективное количество анти-CD47-антитела по любому из пп.1-17 или его антигенсвязывающего фрагмента, и фармацевтически приемлемый носитель.
  19. 19. Способ лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей CD47, который включает введение анти-CD47-антитела по любому из пп.1-16 пациенту, в количестве, достаточном для лечения злокачественной опухоли.
  20. 20. Способ облегчения симптома злокачественной опухоли, экспрессирующей CD47, который включает введение анти-CD47-антитела по любому из пп.1-16 пациенту, в количестве, достаточном для облечения одного или нескольких симптомов злокачественной опухоли.
  21. 21. Способ по любому из пп.19-20, в котором злокачественная опухоль является гематологической злокачественной опухолью.
  22. 22. Способ по любому из пп.19-20, в котором злокачественная опухоль является солидным раком.
  23. 23. Способ по любому из пп.19-22, в котором злокачественная опухоль представляет собой множественную миелому, неходжкинскую лимфому, острый миелоидный лейкоз (AML), рак молочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак/карциному легкого, гепатоклеточную карциному (НСС), саркому или рак головы и шеи.
EA201791485A 2014-12-30 2015-12-28 Анти-cd47-антитела и их применения EA037654B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462098291P 2014-12-30 2014-12-30
PCT/US2015/067642 WO2016109415A1 (en) 2014-12-30 2015-12-28 Anti-cd47 antibodies and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791485A1 EA201791485A1 (ru) 2018-02-28
EA037654B1 true EA037654B1 (ru) 2021-04-27

Family

ID=56284963

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201791485A EA037654B1 (ru) 2014-12-30 2015-12-28 Анти-cd47-антитела и их применения

Country Status (17)

Country Link
US (2) US10870699B2 (ru)
EP (1) EP3240569A4 (ru)
JP (2) JP6850255B2 (ru)
KR (1) KR102489471B1 (ru)
CN (1) CN107530421B (ru)
AU (1) AU2015374301B2 (ru)
BR (1) BR112017014258A2 (ru)
CA (1) CA2972604C (ru)
CL (1) CL2017001736A1 (ru)
CO (1) CO2017007673A2 (ru)
EA (1) EA037654B1 (ru)
EC (1) ECSP17041865A (ru)
HK (1) HK1245154A1 (ru)
MX (1) MX2017008819A (ru)
SG (2) SG11201705310TA (ru)
WO (1) WO2016109415A1 (ru)
ZA (1) ZA201704467B (ru)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530421B (zh) 2014-12-30 2021-07-20 细胞基因公司 抗cd47抗体及其用途
CN114316067A (zh) * 2015-05-04 2022-04-12 皮里斯制药有限公司 抗癌融合多肽
AR108975A1 (es) * 2016-07-06 2018-10-17 Celgene Corp Anticuerpos con baja inmunogenicidad y sus usos
MX2019003563A (es) 2016-09-29 2019-08-12 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Construcciones de inmunoglobulina heterodimericas y metodos de preparacion de las mismas.
PE20190975A1 (es) 2016-10-20 2019-07-09 I Mab Novela cd47 anticuerpos monoclonales y sus usos
EP3534965A4 (en) 2016-11-03 2020-06-24 Trillium Therapeutics Inc. IMPROVEMENTS IN CD47 BLOCKADERAPY THROUGH HDAC INHIBITORS
WO2018089508A2 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Ablexis, Llc Anti-cd47 antibodies
JP7031810B2 (ja) 2016-11-18 2022-03-08 ベイジン・ハンミ・ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッド 抗ｐｄ－１／抗ｈｅｒ２天然抗体構造形態のヘテロダイマー系二重特異性抗体及びその製造方法
JP7117311B2 (ja) * 2017-01-26 2022-08-12 ゼットリップ ホールディング リミテッド Ｃｄ４７抗原結合単位およびその使用
WO2018152033A1 (en) * 2017-02-14 2018-08-23 Promab Biotechnologies, Inc. Cd47-car-t cells
MX2019011624A (es) 2017-03-27 2019-12-05 Celgene Corp Metodos y composiciones para la reduccion de la inmunogenicidad.
AU2018252193A1 (en) 2017-04-14 2019-10-17 Tallac Therapeutics, Inc. Immunomodulating polynucleotides, antibody conjugates thereof, and methods of their use
EP3661965A4 (en) * 2017-08-02 2022-07-13 Phanes Therapeutics, Inc. ANTI-CD47 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019034895A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Ultrahuman Four Limited LIAISON AGENTS
EP3541941A4 (en) * 2017-11-10 2019-12-25 I-Mab Biopharma US Limited FUSION PROTEINS CONTAINING ANTI-CD47 ANTIBODIES AND CYTOKINES
MA51208A (fr) 2017-12-01 2020-10-07 Seattle Genetics Inc Anticorps (masqués) contre cd47 et leurs utilisations pour le traîtement du cancer
CN111615521A (zh) * 2017-12-04 2020-09-01 北京韩美药品有限公司 抗pd-l1/抗cd47天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
US20210070855A1 (en) * 2018-01-24 2021-03-11 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Anti-cd47 antibodies that do not cause significant red blood cell agllutination
WO2019153200A1 (zh) 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
GB201804860D0 (en) * 2018-03-27 2018-05-09 Ultrahuman Two Ltd CD47 Binding agents
CN110577597B (zh) * 2018-06-11 2021-10-22 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体
US11634490B2 (en) 2018-06-15 2023-04-25 Accurus Biosciences, Inc. Blocking antibodies against CD47 and methods of use thereof
CN112601544A (zh) * 2018-07-05 2021-04-02 三钰生物科技股份有限公司 人类抗cd47抗体及其用途
CN110872348B (zh) * 2018-09-03 2021-09-03 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗cd47单克隆抗体及其应用
WO2020088580A1 (en) * 2018-10-31 2020-05-07 I-Mab Biopharma Co., Ltd. Novel cd47 antibodies and methods of using same
CN112969719B (zh) * 2019-03-06 2022-11-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 双功能融合蛋白及其医药用途
TW202104260A (zh) * 2019-04-05 2021-02-01 美商西建公司 腫瘤選擇性結合ｃｄ４７之抗體之工程
MA56119A (fr) 2019-06-07 2022-04-13 Alx Oncology Inc Procédés et réactifs pour réduire les interférences de médicaments se liant au cd47 dans des dosages sérologiques
CN114761041A (zh) 2019-07-16 2022-07-15 吉利德科学公司 Hiv疫苗及其制备和使用方法
TW202124450A (zh) 2019-10-18 2021-07-01 美商四十七股份有限公司 用於治療骨髓發育不良症候群及急性骨髓白血病之組合療法
US20220403023A1 (en) * 2019-10-25 2022-12-22 WuXi Biologics Ireland Limited Novel anti-cd47 antibodies and uses thereof
JP2022552748A (ja) 2019-10-31 2022-12-19 フォーティ セブン， インコーポレイテッド 抗ｃｄ４７及び抗ｃｄ２０による血液癌の治療
WO2021130638A1 (en) 2019-12-24 2021-07-01 Carna Biosciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
WO2021163064A2 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies and fusion proteins that bind to ccr8 and uses thereof
AU2021226023A1 (en) 2020-02-28 2022-09-15 Tallac Therapeutics, Inc. Transglutaminase-mediated conjugation
WO2021262765A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Tsp-1 inhibitors for the treatment of aged, atrophied or dystrophied muscle
KR20230069187A (ko) * 2020-09-14 2023-05-18 서트로 바이오파마, 인크. 무세포 단백질 합성 시스템을 이용한 항체의 대량 생산 방법
KR20230083300A (ko) 2020-10-07 2023-06-09 셀진 코포레이션 림프계 악성 신생물 병태의 이중특이성 항체 치료
JP2023552375A (ja) 2020-12-06 2023-12-15 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド 血清学的アッセイにおいてｃｄ４７に結合する薬物の干渉を低減するための多量体
WO2022135460A1 (zh) * 2020-12-23 2022-06-30 广东菲鹏制药股份有限公司 一种靶向cd47的抗体及其应用
JP2024503396A (ja) 2021-01-08 2024-01-25 北京韓美薬品有限公司 Ｃｄ４７と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント
EP4304633A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Mendus B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
US20220389104A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-08 Ose Immunotherapeutics Method for Treating CD127-Positive Cancers by Administering an Anti-CD127 Agent
EP4359389A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
CA3222277A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
KR20240005901A (ko) 2021-06-23 2024-01-12 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
CA3222439A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
CA3234909A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
WO2023077030A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
US20230242508A1 (en) 2021-12-22 2023-08-03 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
US20240124412A1 (en) 2021-12-22 2024-04-18 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
US20230373950A1 (en) 2022-03-17 2023-11-23 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
WO2023183817A1 (en) 2022-03-24 2023-09-28 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
TW202345901A (zh) 2022-04-05 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
US20230374036A1 (en) 2022-04-21 2023-11-23 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
KR20240003755A (ko) * 2022-06-29 2024-01-09 고려대학교 산학협력단 인간 FcγRs 결합력이 제거된 당화 Fc 변이체들
WO2024006929A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
US20240010714A1 (en) * 2022-07-10 2024-01-11 Mbrace Therapeutics, Inc. Cell-free methods of recombinant antibody production
WO2024015741A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
WO2024124107A2 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Pfizer Inc. Cd47 blocking agent and anti-cd20 / anti-cd3 bispecific antibody combination therapy
WO2024121777A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Pfizer Inc. Cd47 blocking agent and anti-bcma / anti-cd3 bispecific antibody combination therapy
WO2024137852A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090060924A1 (en) * 2007-03-20 2009-03-05 Andrew Ihor Korytko Anti-sclerostin antibodies
WO2011004847A1 (ja) * 2009-07-07 2011-01-13 一般財団法人化学及血清療法研究所 新規ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体
US20130195867A1 (en) * 2007-01-09 2013-08-01 Curevac Gmbh Rna-coded antibody
US20130224188A1 (en) * 2012-02-06 2013-08-29 Inhibrx Llc CD47 Antibodies and Methods of Use Thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994004678A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Casterman Cecile Immunoglobulins devoid of light chains
ES2162863T3 (es) 1993-04-29 2002-01-16 Unilever Nv Produccion de anticuerpos o fragmentos (funcionalizados) de los mismos derivados de inmunoglobulinas de cadena pesada de camelidae.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
ATE440111T1 (de) 1999-11-29 2009-09-15 Bac Ip B V Immobilisierte antigenbindende moleküle aus einer domäne
EP2298809A3 (en) 2001-07-12 2012-02-15 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
EP2111869A1 (en) 2008-04-23 2009-10-28 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Compositions and methods to enhance the immune system
US8758750B2 (en) 2009-09-15 2014-06-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synergistic anti-CD47 therapy for hematologic cancers
BR112013031762A2 (pt) * 2011-06-16 2016-09-13 Novartis Ag proteínas solúveis para utilização como terapêuticos
DK2804617T3 (da) * 2012-01-17 2020-08-10 Univ Leland Stanford Junior Højaffine sirp-alpha-reagenser
US20140140989A1 (en) 2012-02-06 2014-05-22 Inhibrx Llc Non-Platelet Depleting and Non-Red Blood Cell Depleting CD47 Antibodies and Methods of Use Thereof
SG10201706383XA (en) * 2013-02-06 2017-09-28 Inhibrx Lp Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
US10190145B2 (en) * 2013-04-19 2019-01-29 Sutro Biopharma, Inc. Expression of biologically active proteins in a bacterial cell-free synthesis system using bacterial cells transformed to exhibit elevated levels of chaperone expression
CN107530421B (zh) 2014-12-30 2021-07-20 细胞基因公司 抗cd47抗体及其用途
UA126146C2 (uk) 2015-09-18 2022-08-25 Арч Онколоджі, Інк. Терапевтичне антитіло до cd47
GB2558131B (en) 2015-09-21 2021-05-19 Surface Oncology Inc Anti-CD47 antibodies and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130195867A1 (en) * 2007-01-09 2013-08-01 Curevac Gmbh Rna-coded antibody
US20090060924A1 (en) * 2007-03-20 2009-03-05 Andrew Ihor Korytko Anti-sclerostin antibodies
WO2011004847A1 (ja) * 2009-07-07 2011-01-13 一般財団法人化学及血清療法研究所 新規ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体
US20130224188A1 (en) * 2012-02-06 2013-08-29 Inhibrx Llc CD47 Antibodies and Methods of Use Thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YIN et al. Aglycosylated antibodies and antibody fragments produced in a scalable in vitro transcription-translation system. 01 March 2012 (01.03.2012). MAbs Volume 4 Issue 2 pp 217-225. page 218 col 1 para 3. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3240569A1 (en) 2017-11-08
CL2017001736A1 (es) 2018-03-16
CN107530421A (zh) 2018-01-02
KR20170100652A (ko) 2017-09-04
US11787860B2 (en) 2023-10-17
JP6850255B2 (ja) 2021-03-31
CA2972604C (en) 2023-07-04
EA201791485A1 (ru) 2018-02-28
US20210054070A1 (en) 2021-02-25
US20170369572A1 (en) 2017-12-28
JP2021048858A (ja) 2021-04-01
KR102489471B1 (ko) 2023-01-18
AU2015374301B2 (en) 2021-02-11
EP3240569A4 (en) 2018-05-30
BR112017014258A2 (pt) 2018-03-06
CN107530421B (zh) 2021-07-20
SG10202007176TA (en) 2020-08-28
CA2972604A1 (en) 2016-07-07
ECSP17041865A (es) 2017-08-31
JP2018506964A (ja) 2018-03-15
HK1245154A1 (zh) 2018-08-24
SG11201705310TA (en) 2017-07-28
AU2015374301A1 (en) 2017-07-20
WO2016109415A1 (en) 2016-07-07
CO2017007673A2 (es) 2018-01-05
ZA201704467B (en) 2019-09-25
US10870699B2 (en) 2020-12-22
MX2017008819A (es) 2018-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11787860B2 (en) Anti-CD47 antibodies and uses thereof
US20220380479A1 (en) Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof
KR20160023721A (ko) 감소되거나 침묵화된 효과기 기능을 갖는 이종다량체
AU2017292752B2 (en) Antibodies with low immunogenicity and uses thereof
CA3057841A1 (en) Methods and compositions for reduction of immunogenicity
US20220372161A1 (en) Antibodies against the poliovirus receptor (pvr) and uses thereof
CA3219672A1 (en) Anti-cea and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
US11981745B2 (en) Anti-mesothelin antigen-binding molecules and uses thereof
US20240209113A1 (en) Anti-gpc3 and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
US20240132593A1 (en) Anti-vista antibodies and uses thereof
NZ733261A (en) Anti-cd47 antibodies and uses thereof
EA045980B1 (ru) Антитела против рецептора полиовируса (pvr) и их применение
WO2024044675A1 (en) Methods of cancer treatment using anti-pd1 antibodies in combination with anti-tim3 antibodies
EA043164B1 (ru) Способы и композиции для снижения иммуногенности
EA041917B1 (ru) Антитела с низкой иммуногенностью и их применения