EA035528B1 - Гены устойчивости к гербицидам и способы их применения - Google Patents
Гены устойчивости к гербицидам и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA035528B1 EA035528B1 EA201790841A EA201790841A EA035528B1 EA 035528 B1 EA035528 B1 EA 035528B1 EA 201790841 A EA201790841 A EA 201790841A EA 201790841 A EA201790841 A EA 201790841A EA 035528 B1 EA035528 B1 EA 035528B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- mon
- herbicides
- plant
- dna molecule
- herbicide
- Prior art date
Links
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 title claims abstract description 271
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 125
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 250
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 122
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 85
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 50
- -1 pyridinyloxy Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 45
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 44
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 402
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 85
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 76
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- CGVPQHIRIGIDLE-UHFFFAOYSA-N 3-(2-aminooxyphenyl)propanoic acid Chemical compound NOC1=CC=CC=C1CCC(O)=O CGVPQHIRIGIDLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108010051842 Advanced Oxidation Protein Products Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 245
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 243
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 133
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 70
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 67
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 64
- 101000830742 Homo sapiens Tryptophan 5-hydroxylase 1 Proteins 0.000 description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 48
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 47
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 44
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 43
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 42
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 36
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 34
- 239000005609 Quizalofop-P Substances 0.000 description 33
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 33
- ABOOPXYCKNFDNJ-SNVBAGLBSA-N quizalofop-P Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CN=C(C=C(Cl)C=C2)C2=N1 ABOOPXYCKNFDNJ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 33
- 101710117580 (R)-phenoxypropionate/alpha-ketoglutarate-dioxygenase Proteins 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 30
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 28
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 26
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 22
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 20
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 20
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 17
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 16
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 16
- REEQLXCGVXDJSQ-UHFFFAOYSA-N trichlopyr Chemical compound OC(=O)COC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl REEQLXCGVXDJSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 14
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 14
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 14
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 14
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 13
- 239000005627 Triclopyr Substances 0.000 description 13
- ABOOPXYCKNFDNJ-UHFFFAOYSA-N 2-{4-[(6-chloroquinoxalin-2-yl)oxy]phenoxy}propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CN=C(C=C(Cl)C=C2)C2=N1 ABOOPXYCKNFDNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- IUQJDHJVPLLKFL-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetate;dimethylazanium Chemical compound CNC.OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl IUQJDHJVPLLKFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000005558 Fluroxypyr Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- MEFQWPUMEMWTJP-UHFFFAOYSA-N fluroxypyr Chemical compound NC1=C(Cl)C(F)=NC(OCC(O)=O)=C1Cl MEFQWPUMEMWTJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[3-chloro-5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC=C(C(F)(F)F)C=C1Cl GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- MPPOHAUSNPTFAJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[(6-chloro-1,3-benzoxazol-2-yl)oxy]phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC2=CC=C(Cl)C=C2O1 MPPOHAUSNPTFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 6
- 241001292337 Sphingobium herbicidovorans Species 0.000 description 6
- OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-dione Chemical compound O=C1CCCCC1=O OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- WNTGYJSOUMFZEP-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1C WNTGYJSOUMFZEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 4
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 4
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- OSUHJPCHFDQAIT-GFCCVEGCSA-N quizalofop-P-ethyl Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(=O)OCC)=CC=C1OC1=CN=C(C=C(Cl)C=C2)C2=N1 OSUHJPCHFDQAIT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=N1 YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 3
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009526 moderate injury Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 101710128758 (S)-phenoxypropionate/alpha-ketoglutarate-dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- HFZWRUODUSTPEG-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl HFZWRUODUSTPEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LLWADFLAOKUBDR-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-4-chlorophenoxybutyric acid Chemical compound CC1=CC(Cl)=CC=C1OCCCC(O)=O LLWADFLAOKUBDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 239000005575 MCPB Substances 0.000 description 2
- 101150039283 MCPB gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- OLZQTUCTGLHFTQ-UHFFFAOYSA-N octan-2-yl 2-(4-amino-3,5-dichloro-6-fluoropyridin-2-yl)oxyacetate Chemical compound CCCCCCC(C)OC(=O)COC1=NC(F)=C(Cl)C(N)=C1Cl OLZQTUCTGLHFTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- MPPOHAUSNPTFAJ-SECBINFHSA-N (2r)-2-[4-[(6-chloro-1,3-benzoxazol-2-yl)oxy]phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC2=CC=C(Cl)C=C2O1 MPPOHAUSNPTFAJ-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- ADDQHLREJDZPMT-AWEZNQCLSA-N (S)-metamifop Chemical compound O=C([C@@H](OC=1C=CC(OC=2OC3=CC(Cl)=CC=C3N=2)=CC=1)C)N(C)C1=CC=CC=C1F ADDQHLREJDZPMT-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 10,10-dioxo-2-[4-(N-phenylanilino)phenyl]thioxanthen-9-one Chemical compound O=C1c2ccccc2S(=O)(=O)c2ccc(cc12)-c1ccc(cc1)N(c1ccccc1)c1ccccc1 FGRBYDKOBBBPOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002794 2,4-DB Substances 0.000 description 1
- BDQWWOHKFDSADC-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dichloro-3-methylphenoxy)-n-phenylpropanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC(=O)C(C)OC1=CC=C(Cl)C(C)=C1Cl BDQWWOHKFDSADC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZHCENGPTKEIGP-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl MZHCENGPTKEIGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2,4-dichlorophenoxy)phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000000383 Alpha-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenase FTO Human genes 0.000 description 1
- 108010016119 Alpha-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenase FTO Proteins 0.000 description 1
- 239000005468 Aminopyralid Substances 0.000 description 1
- 101000768857 Arabidopsis thaliana 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 239000005498 Clodinafop Substances 0.000 description 1
- 239000005500 Clopyralid Substances 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 239000005506 Diclofop Substances 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- 101100117236 Drosophila melanogaster speck gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000005513 Fenoxaprop-P Substances 0.000 description 1
- 239000005530 Fluazifop-P Substances 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 108010063907 Glutathione Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100036442 Glutathione reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091006054 His-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101100056487 Petunia hybrida EPSPS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005595 Picloram Substances 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- NIXXQNOQHKNPEJ-UHFFFAOYSA-N aminopyralid Chemical compound NC1=CC(Cl)=NC(C(O)=O)=C1Cl NIXXQNOQHKNPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- YUIKUTLBPMDDNQ-MRVPVSSYSA-N clodinafop Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC=C(Cl)C=C1F YUIKUTLBPMDDNQ-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- HUBANNPOLNYSAD-UHFFFAOYSA-N clopyralid Chemical compound OC(=O)C1=NC(Cl)=CC=C1Cl HUBANNPOLNYSAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000036253 epinasty Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- YUVKUEAFAVKILW-SECBINFHSA-N fluazifop-P Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=N1 YUVKUEAFAVKILW-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- RZSCFTDHFNHMOR-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-difluorophenyl)-2-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]pyridine-3-carboxamide;1,1-dimethyl-3-(4-propan-2-ylphenyl)urea Chemical compound CC(C)C1=CC=C(NC(=O)N(C)C)C=C1.FC1=CC(F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CN=C1OC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 RZSCFTDHFNHMOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N picloram Chemical compound NC1=C(Cl)C(Cl)=NC(C(O)=O)=C1Cl NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 208000018655 severe necrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/10—Seeds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/08—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a chloroplast localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
- C12Y114/11033—DNA oxidative demethylase (1.14.11.33)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Protection Of Plants (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
В изобретении предлагаются полипептиды и рекомбинантные молекулы ДНК, полезные для придания устойчивости к гербицидам на основе АОФП, гербицидам на основе феноксикислот и гербицидам на основе пиридинилоксикислот, и также устойчивые к гербицидам трансгенные растения, семена, клетки и части растений, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, а также способы их применения.
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/064343, поданной 15 октября 2014 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
Включение перечня последовательностей
Перечень последовательностей, который содержится в файле под названием MONS378WO_ST25, который имеет размер 118,364 байт (измерено в MS-WINDOWS) и который был создан 25 сентября 2015 г., подается в данном документе в электронной форме и включен в данный документ посредством ссылки.
Уровень техники Область изобретения
Настоящее изобретение в целом относится к области биотехнологии. Более конкретно изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, кодирующим ферменты, которые вызывают разрушение гербицидов. Изобретение также относится к трансгенным растениям, частям, семенам, клеткам и частям растений, содержащим рекомбинантные молекулы ДНК, а также способам их применения.
Описание уровня техники
В производстве сельскохозяйственных культур часто используется трансгенные признаки, созданные с помощью способов биотехнологии. Г етерологичный ген, также известный как трансген, вводится в растение для получения трансгенного признака. Экспрессия трансгена в растении дает желаемый признак, такой как устойчивость к гербициду, по всему растению. Примеры трансгенных признаков устойчивости к гербицидам включают устойчивость к глифосату, устойчивость к глюфосинату и устойчивость к дикамба. С увеличением количества видов сорняков, резистентных к наиболее часто применяемым гербицидам, в поле необходимы новые признаки устойчивости к гербицидам. Гербициды, представляющие особый интерес, являют собой гербициды на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербициды на основе феноксикислот и гербициды на основе пиридинилоксикислот. Гербициды на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербициды на основе феноксикислот и гербициды на основе пиридинилоксикислот обеспечивают контроль над спектром устойчивых к глифосату сорняков, тем самым делая признак, придающий устойчивость к этим гербицидам, особенно полезным в системе растениеводства в сочетании с другим признаком(ами) устойчивости к гербициду(дам).
Штамм МН Sphingobium herbicidovorans, выделенный из образца грунта, разрушающего дихлоропроп, был идентифицирован как способный расщеплять эфирные связи различных фиеноксиалкановых кислот и гербицидов, используя их в качестве единственного источника углерода и энергии для роста (НРЕ Kohler, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) 23:336-340). Катаболизм гербицидов осуществляют две различные энантиоселективные α-кетоглутаратзависимые диоксигеназы, RdpA (R-дихлорпропдиоксигеназа) и SdpA (S-дихлорпропдиоксигеназа). (A. Westendorf, et al., Microbiological Research (2002) 157:317-322; Westendorf, et al., Acta Biotechnologica (2003) 23(1):3-17). RdpA был изолирован из Sphingobium herbicidovorans (номер доступа ГенБанка AF516752 (ДНК) и ААМ90965 (белок)) и Delftia acidovorans (номер доступа ГенБанка NG_036924 (ДНК) и YP_009083283 (белок)) (ТА Mueller, et al., Applied and Environmental Microbiology (2004) 70 (10):6066-6075). Чтобы придать культурам устойчивость к гербицидам для трансформации растений были использованы гены RdpA и SdpA (T.R. Wright, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, (2010) 107 (47):20240-5). Повышение активности фермента RdpA с применением технологий белковой инженерии с целью создания белка для использования в трансгенных растениях, позволило бы повысить нормы применения гербицидов, таким образом улучшив безопасность трансгенных культур и меры борьбы с сорняками.
Краткое описание сущности изобретения
В изобретении предложен полипептид, который имеет по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52. В одном варианте реализации изобретения полипептид имеет оксигеназную активность против по меньшей мере одного гербицида, выбранного из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
В изобретении предложена рекомбинантная молекула ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который имеет по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 и 53-59. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантная молекула ДНК кодирует полипептид с оксигеназной активностью против по меньшей мере одного гербицида, выбранного из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантная молекула ДНК функционально связана с гетерологичным промотором, который функционирует в растительной клетке. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантная молекула ДНК функционально связана с молекулой ДНК, кодирующей транзитный пептид хлоро- 1 035528 пласта, функция которого заключается в локализации функционально связанного полипептида внутри клетки.
В изобретении предложена ДНК-конструкция, содержащая гетерологичный промотор, который функционирует в растительной клетке и функционально связан с рекомбинантной молекулой ДНК, кодирующей полипептид, который имеет по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52. В одном варианте реализации изобретения рекомбинантная молекула ДНК функционально связана с молекулой ДНК, кодирующей транзитный пептид хлоропласта, функция которого заключается в локализации функционально связанного полипептида внутри клетки. В другом варианте реализации изобретения рекомбинантная молекула ДНК кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52, и экспрессия полипептида в трансгенном растении придает растению устойчивость к гербицидам. В другом варианте реализации изобретения ДНК-конструкция присутствует в геноме трансгенного растения.
В изобретении предложено трансгенное растение, семя, клетка или часть растения, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который имеет по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52. В одном варианте реализации изобретения трансгенное растение, семя, клетка или часть растения содержит трансгенный признак устойчивости по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот. В другом варианте реализации изобретения трансгенное растение, семя, клетка или часть растения содержит ДНКконструкцию согласно данному изобретению. В другом варианте реализации изобретения трансгенное растение, семя, клетка или часть растения содержит полипептид согласно данному изобретению.
В изобретении предложен способ придания растению, семени, клетке или части растения устойчивости к гербицидам, включающий экспрессию полипептида согласного изобретению в растении, семени, клетке или части растения. В одном варианте реализации изобретения, способ придания устойчивости к гербицидам применяется к трансгенному растению, семени, клетке или части растения, что содержат трансгенный признак, содержащие рекомбинантную молекулу ДНК согласно изобретению. В одном варианте реализации изобретения способ придания устойчивости к гербицидам применяется с гербицидом, выбранным из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
В изобретении предложен способ трансформации растения, включающий введение ДНКконструкции согласно изобретению в растительную клетку и регенерацию из нее растения, которое содержит ДНК-конструкцию и которое устойчиво по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот. В одном варианте реализации изобретения способ трансформации растения включает скрещивание регенерированного растения с самим собой или со вторым растением и сбор семян гибрида.
В изобретении предложен способ контроля сорняков в области произрастания растений путем воздействия на область произрастания растений, содержащую трансгенное растение или семя согласно изобретению, по меньшей мере одним гербицидом, выбранным из группы, состоящей из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот, при этом трансгенное растение или семя устойчиво к гербициду.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - контрольные и MON-HT55 (SEQ ID NO: 11) трансгенные растения кукурузы после обработки квизалофопом-П. На фиг. 1А проиллюстрированы контрольные и трансгенные растения кукурузы, которые либо необработанны, либо обработанных 1X квизалофопом-П (0,08 фунта д.в./акр). На фиг. 1Б проиллюстрированы гибридные контрольные растения кукурузы F1, a на фиг. 1В проиллюстрированы гибридные трансгенные растения кукурузы MON-HT55 F1. Растения выращивали при дневных/ночных температурах, равных (1) 20°С/20°С, (2) 28°С/20°С или (3) 38°С/30°С перед опрыскиванием 2Х квизалофопом-П.
Фиг. 2 - графики, показывающие зависимость активности сконструированных белков от температуры. На фиг. 2А проиллюстрирована активность фермента RdpA MON-HT55 (SEQ ID NO: 11) и фермента RdpA дикого типа при тестировании с применением квизалофопа-П в качестве субстрата. На фиг. 2Б проиллюстрирована активность RdpA MON-HT1 (SEQ ID NO: 14), MON-HT2 (SEQ ID NO: 18), MONHT7 (SEQ ID NO: 34), MON-HT8 (SEQ ID NO: 37) и RdpA дикого типа при тестировании с применением квизалофопа-П в качестве субстрата. На фиг. 2В проиллюстрирована активность RdpA MON-HT1, MONHT2, MON-HT7, MON-HT8 и RdpA дикого типа при тестировании с применением 2,4-D в качестве субстрата. Данные нормированы к активности каждого белка при 25°С.
Фиг. 3 - белковая последовательность RdpA дикого типа (SEQ ID NO: 60) с иллюстративными по- 2 035528 ложениями аминокислот, пригодными для белковой инженерии, которые обозначены квадратами.
Фиг. 4 - средняя оценка травматизма после применения 2Х квизалофопа-П (0,16 фунта д.в./акр) (4А, 4Б и 4В) или 4Х 2,4-D (4 фунта д.в./акр) (4Г и 4Д) к F1 гибридным растениям кукурузы (инбредные гомозиготные R1 экспрессирующие MON-HT x MON89034), экспрессирующим MON-HT55 (SEQ ID NO:11), MON-HT1 (SEQ ID NO:14), MON-HT2 (SEQ ID NO:18), MON-HT3 NO:22), MON-HT4 (SEQ ID NO:25), MON-HT7 (SEQ ID NO:34) или к F1 гибридному контролю (NK603 x MON89034). Данные, полученные на растениях, адаптированных к дневным и ночным температурам, установленным на уровне 20°С (20°С/20°С) перед нанесением 2Х квизалофопа-П (фиг. 4А) или 4Х 2,4-D (фиг. 4Г); на фиг. 4Б проиллюстрированы данные, полученные на растениях, адаптированных при дневной температуре 28°С и ночной температуре 20°С (28°С/20°С) перед нанесением 2Х квизалофопа-П; на фиг. 4В проиллюстрированы данные, полученные на растениях, акклиматизированных при дневной температуре 38°С и ночной температуре 30°С (38°С/30°С) перед нанесением 2Х квизалофопа-П (фиг. 4В) или 4Х 2,4-D (фиг. 4Д).
Фиг. 5А и 5Б - контрольные и трансгенные растения кукурузы, содержащие MON-HT2 (SEQ ID NO: 20, кодирующая SEQ ID NO: 18), с ТПХ или без ТПХ, где растения получали квизалофоп-П в 16Х нормах (1,28 фунта д.в./акр), примененных на V2, после чего следовало применение на V4, и фотографии, сделанные через 10-14 дней после применения квизалофопа-П.
Фиг. 6А-6Д - множественное выравнивание белковых последовательностей для RdpA дикого типа из S.herbicidovorans (SEQ ID NO: 60) и SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 4652 с консенсусной последовательностью (представленной в виде SEQ ID NO: 61), представленной в нижней части каждой из фиг. 6А, 6Б, 6В, 6Г, 6Д.
Краткое описание последовательностей
SEQ ID NO: 1-3 представляют собой последовательности MON-HT51: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 4-6 представляют собой последовательности MON-HT52: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 7-8 представляют собой последовательности MON-HT53: аминокислотную последовательность и полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами.
SEQ ID NO: 9-10 представляют собой последовательности MON-HT54: аминокислотную последовательность и полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами.
SEQ ID NO: 11-13 представляют собой последовательности MON-HT55: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 14-17 представляют собой последовательности MON-HT1: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами двудольных.
SEQ ID NO: 18-21 представляют собой последовательности MON-HT2: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами двудольных.
SEQ ID NO: 22-24 представляют собой последовательности MON-HT3: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 25-27 представляют собой последовательности MON-HT4: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 28-30 представляют собой последовательности MON-HT5: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 31-33 представляют собой последовательности MON-HT6: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 34-36 представляют собой последовательности MON-HT7: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 37-39 представляют собой последовательности MON-HT8: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 40-42 представляют собой последовательности MON-HT9: аминокислотную последовательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 43-45 представляют собой последовательности MON-HT10: аминокислотную последо- 3 035528 вательность, полинуклеотидную последовательность с бактериальными кодонами и оптимизированную полинуклеотидную последовательность с кодонами однодольных.
SEQ ID NO: 46-52 представляют собой аминокислотные последовательности MON-HT11, MONHT13, MON-HT14, MON-HT15, Μονή™, MON-HT17 и MON-HT18.
SEQ ID NO: 53-59 представляют собой полинуклеотидные последовательности MON-HT11, MONHT13, MON-HT14, MON-HT15, MON-HT16, MON-HT17 и MON-HT18 с оптимизированным кодонами двудольных.
SEQ ID NO: 60 представляет собой аминокислотную последовательность для RdpA дикого типа из Sphingobium herbicidovorans.
SEQ ID NO: 61 представляет собой консенсусную последовательность фиг. 6А-6Д.
Подробное описание сущности изобретения
Следующие определения и способы предложены для того, чтобы лучше определить настоящее изобретение и направить среднего специалиста в данной области техники в практическом подходе по настоящему изобретению. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с обычным применением средними специалистами в данной области техники.
Изобретение устраняет ограничения предшествующего уровня техники путем предоставления новых, сконструированных белков, называемых в данном документе белками MON-HT, и рекомбинантных молекул ДНК, которые их кодируют, а также композиций и способов их применения. Белки MON-HT представляют собой оксигеназы, которые могут инактивировать гербициды на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербициды на основе феноксикислот и гербициды на основе пиридинилоксикислот. Применяемый в данном документе термин инактивация гербицида означает, что гербицид больше не обладает гербицидной активностью против растения. Белки MON-HT проявляют новую субстратную селективность, полезную ферментативную кинетику и большую стабильность фермента при повышенной температуре. Трансгенные растения, экспрессирующие белок MON-HT, демонстрируют более высокую устойчивость к воздействию гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
Сконструированные белки и рекомбинантные молекулы ДНК.
В изобретении предложены новые сконструированные белки и рекомбинантные молекулы ДНК, которые их кодируют. Применяемый в данном документе термин сконструированный относится к искусственным ДНК, белку или организму, которые обычно не встречаются в природе и которые были созданы путем человеческого вмешательства. Сконструированный белок представляет собой белок, полипептидная последовательность которого была задумана и создана в лаборатории с применением одного или нескольких методов белковой инженерии, таких как дизайн белка с использованием сайтнаправленного мутагенеза и направленной эволюции с применением случайного мутагенеза и перетасовки ДНК. Например, сконструированный белок может иметь одну или более делеций, вставок или замещений относительно кодирующей последовательности белка дикого типа, и каждая делеция, инсерция или замена может состоять из одной или более аминокислот. Примеры сконструированных белков представлены в данном документе как SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52.
Сконструированные белки, предложенные в настоящем изобретении, представляют собой ферменты, которые обладают оксигеназной активностью. Как применяется в данном документе, термин оксигеназная активность означает способность окислять субстрат путем переноса оксигена из молекулярного кислорода на субстрат, побочный продукт или промежуточный продукт. Оксигеназная активность сконструированных белков, предложенных в изобретении, может инактивировать один или более из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
Как применяется в настоящем документе, термин дикий тип означает естественно встречающийся. Как применяется в настоящем документе, молекула ДНК дикого типа, полипептид дикого типа или белок дикого типа представляет собой естественно встречающуюся молекулу ДНК, полипептид или белок, т.е. молекулу ДНК, полипептид или белок, ранее существовавший в природе. Вариант полипептида, белка или молекулы ДНК дикого типа может быть полезным для сравнения с сконструированным белком или геном. Примером белка дикого типа, пригодного для сравнения с сконструированными белками, предложенными в настоящем изобретении, является фермент RdpA из штамма МН Sphingobium herbicidovorans. Примером молекулы ДНК дикого типа, пригодной для сравнения с рекомбинантными молекулами ДНК, предложенными в настоящем изобретением, является ген RdpA из штамма МН Sphingobium herbicidovorans. Вариант белка или молекулы ДНК дикого типа может быть полезным в качестве контроля в эксперименте.
Как применяется в данном документе, термин контроль означает экспериментальный контроль, предназначенный для целей сравнения. Например, контрольное растение в анализе трансгенных растений представляет собой растение того же типа, что и экспериментальное растение (тестируемое растение), но не содержит трансгенной вставки, рекомбинантной молекулы ДНК или ДНК-конструкции экспериментального растения. Примером контрольного растения, пригодного для сравнения с трансгенными растениями кукурузы, является нетрансгенная кукуруза LH244 (патент США № 6252148), и с транс- 4 035528 генными растениями сои является нетрансгенная соя А3555 (патент США № 7700846).
Как применяется в настоящем документе, термин рекомбинантный относится к искусственным ДНК, полипептиду или белку, который(ая) является результатом генной инженерии и как таковой(ая) обычно не встречается в природе, и который(ая) был создан в результате вмешательства человека. Рекомбинантная молекула ДНК представляет собой молекулу ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая не встречается в естественной среде, и как таковая является результатом вмешательства человека, например молекула ДНК, которая кодирует сконструированный белок. Другим примером является молекула ДНК, состоящая из комбинации по меньшей мере двух молекул ДНК, гетерологичных друг другу, таких как кодирующая белок молекула ДНК и функционально связанный гетерологичный промотор. Примером рекомбинантной молекулы ДНК является молекула ДНК, содержащая по меньшей мере одну последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 и 53-59. Рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок представляет собой полипептид или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая не встречается в естественной среде и как таковая является результатом вмешательства человека, например, сконструированный белок.
Термин трансген относится к молекуле ДНК, искусственно встраиваемой в геном организма в результате вмешательства человека, например, способами трансформации растений. Как применяется в настоящем документе, термин трансгенный означает содержащий трансген, например, трансгенное растение относится к растению, содержащему трансген в его геноме, а трансгенный признак относится к характеристике или фенотипу, который(ая) передается или обеспечивается наличием трансгена, что встроен в геном растения. В результате такого геномного изменения трансгенное растение является чемто сильно отличающимся от родственного растения дикого типа, а трансгенный признак является признаком, не встречающимся в естественной среде в растении дикого типа. Трансгенные растения, согласно данному изобретению, содержат рекомбинантную молекулу ДНК и сконструированные белки, предложенные в изобретении.
Как применяется в настоящем документе, термин гетерологичный относится к взаимосвязи между двумя или более вещами, которые получены из разных источников и, таким образом, обычно не связанны в природе. Например, белок-кодирующая рекомбинантная молекула ДНК является гетерологичной по отношению к функционально связанному промотору, если такая комбинация обычно не встречается в природе. Кроме того, конкретная рекомбинантная молекула ДНК может быть гетерологичной по отношению к клетке или организму, в который она вставлена, когда она не будет встречаться в естественной среде в этой конкретной клетке или организме.
Как применяется в настоящем документе, термин молекула ДНК, кодирующая белок или молекула ДНК, кодирующая полипептид относится к молекуле ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок или полипептид. Белок-кодирующая последовательность или полипептид-кодирующая последовательность означает последовательность ДНК, которая кодирует белок или полипептид. Последовательность означает последовательное расположение нуклеотидов или аминокислот. Границы белок-кодирующей последовательности или полипептид-кодирующей последовательности обычно определяются стартовым кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Белок-кодирующая молекула или полипептид-кодирующая молекула может содержать последовательность ДНК, кодирующую белковую или полипептидную последовательность. Как применяется в настоящем документе, термин экспрессия трансгена, экспрессирование трансгена, экспрессия белка, экспрессия полипептида, экспрессирование белка и экспрессирование полипептида означает продуцирование белка или полипептида в процессе транскрипции молекулы ДНК в матричную РНК (мРНК) и трансляции мРНК в полипептидные цепи, которые могут быть в конечном счете свернуты в белки. Белок-кодирующая молекула ДНК или полипептид-кодирующая молекула ДНК, может быть функционально связана с гетерологичным промотором в ДНК-конструкции, для применения в экспрессии белка или полипептида в клетке, трансформированной рекомбинантной молекулой ДНК. Как применяется в настоящем документе, термин функционально связанный означает две молекулы ДНК, связанные таким образом, что одна молекула может влиять на функцию другой. Функционально-связанные молекулы ДНК могут быть частью одной непрерывной молекулы и могут быть или не быть смежными. Например, промотор функционально связан с белок-кодирующей молекулой ДНК или полипептидкодирующей молекулой ДНК в ДНК-конструкции, где две молекулы ДНК расположены таким образом, что промотор может влиять на экспрессию трансгена.
Как применяется в настоящем документе, ДНК-конструкция представляет собой рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую две или более гетерологичных последовательности ДНК. Конструкции ДНК полезны для экспрессии трансгена и могут быть включены в векторы и плазмиды. Конструкции ДНК могут быть применены в векторах с целью трансформации, что представляет собой введение гетерологичной ДНК в клетку-хозяина для получения трансгенных растений и клеток, и как таковые могут также содержаться в пластидной ДНК или геномной ДНК трансгенных растения, семени, клетки или части растения. Как применяется в настоящем документе, термин вектор означает любую рекомбинантную молекулу ДНК, которая может быть применена для трансформации растения. Рекомбинантные
- 5 035528 молекулы ДНК, как указано в перечне последовательностей, могут быть, например, вставлены в вектор как часть конструкции, имеющей рекомбинантную молекулу ДНК, функционально связанную с промотором, который функционирует в растении для управления экспрессией сконструированного белка, кодируемого рекомбинантной молекулой ДНК. Способы конструирования ДНК-конструкций и векторов хорошо известны в данной области техники. Компоненты ДНК-конструкции или вектора, содержащего ДНК-конструкцию, обычно включают, но не ограничиваются ими, одно или несколько из следующих: подходящий промотор для экспрессии функционально связанной ДНК, функционально связанную белоккодирующую молекулу ДНК и 3'-нетранслируемый участок (3'-UTR). Промоторы, пригодные для осуществления настоящего изобретения, включают промоторы, которые функционируют в растении для экспрессии функционально связанного полинуклеотида. Такие промоторы разнообразны и хорошо известны в данной области и включают те, которые являются индуцибельными, вирусными, синтетическими, конститутивными, временно регулируемыми, пространственно-регулируемыми и/или пространственновременно регулируемыми. Дополнительные необязательные компоненты включают, но не ограничиваются ими, один или несколько следующих элементов: 5'-UTR, энхансер, лидер, цис-действующий элемент, интрон, транзитные пептиды хлоропласта (ТПХ) и один или несколько маркерных трансгенов для селекции.
ДНК-конструкции согласно данному изобретению могут содержать молекулу ТПХ, функционально связанную с белок-кодирующими молекулами ДНК, предложенными в данном изобретении. ТПХ, пригодный для осуществления настоящего изобретения, включает тот, функционирование которого способствует локализации сконструированной белковой молекулы внутри клетки. Способствуя локализации белка внутри клетки, ТПХ может увеличить накопление сконструированного белка, защитить его от протеолитической деградации, повысить уровень устойчивости к гербицидам и тем самым снизить степень повреждений после применения гербицидов. Молекулы ТПХ для применения в настоящем изобретении известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, Arabidopsis thaliana EPSPS ТХП (Klee et al., 1987), Petunia hybrida EPSPS ТПХ (della-Cioppa et al., 1986), сигнальную последовательность cab-m7 кукурузы (Becker et al., 1992; PCT WO 97/41228) и сигнальную последовательность глутатионредуктазы гороха (Creissen et al., 1991; PCT WO 97/41228).
Рекомбинантные молекулы ДНК, согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и модифицированы способами, известными в данной области техники, полностью или частично, особенно там, где желательно предоставить последовательности, пригодные для манипуляций с ДНК (такие как сайты узнавания рестриктаз или сайты клонирования на основе рекомбинации), предпочтительные по отношению к растению последовательности (использование кодонов растений или консенсусных последовательностей Козак) или последовательности, пригодные для конструирования ДНК-конструкции (такие как спейсерные или линкерные последовательности). Данное изобретение включает рекомбинантные молекулы ДНК и сконструированные белки, имеющие по меньшей мере около 80% идентичности последовательности, около 85% идентичности последовательности, около 90% идентичности последовательности, около 91% идентичности последовательности, около 92% идентичности последовательности, около 93% идентичности последовательности, около 94% идентичности последовательности, около 95% идентичности последовательности, около 96% идентичности последовательности, около 97% идентичности последовательности, около 98% идентичности последовательности и около 99% идентичности последовательности с любой из рекомбинантных молекул ДНК или сконструированных белковых последовательностей, предложенных в настоящем документе, например с рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 и 53-59. Как применяется в настоящем документе, термин процент идентичности последовательности или % идентичности последовательности относится к проценту идентичных нуклеотидов или аминокислот в эталонной (запрос) линейной полинуклеотидной или полипептидной последовательности (или ее комплементарной цепи) по сравнению с тестовой (субъект) последовательностью (или ее комплементарной цепью), когда две последовательности оптимально выровнены (с соответствующими нуклеотидными или аминокислотными вставками, делециями или пробелами, составляющими менее 20% эталонной последовательности в окне сравнения). Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания окна сравнения хорошо известно специалистам в данной области техники и может быть выполнено с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, алгоритм выравнивания гомологии Нидлмана и Вунша, способ поиска схожести Пирсона и Липмана, а также с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, которые доступны в составе пакета программного обеспечения Sequence Analysis GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Сан-Диего, Калифорния), MEGAlign (DNAStar, Inc.,1228 S.Park St., Мэдисон, Висконсин 53715), и MUSCLE (версия 3.6) (rC Edgar, Nucleic Acids Research (2004) 32(5): 1792-1797) со стандартными параметрами. Доля идентичности для выровненных сегментов тестовой последовательности и эталонной последовательности представляет собой количество идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, деленное на общее количество компонентов в сегменте эталонной последовательности, т.е. всю эталонную последовательность или меньшую определенную
- 6 035528 часть эталонной последовательности. Процент идентичности последовательности представлен как доля идентичности, умноженная на 100. Сравнение одной или более последовательностей может производиться с полноразмерной последовательностью или ее частью или более длинной последовательностью.
Сконструированные белки могут быть получены путем изменения (т.е. модификации) белка дикого типа, чтобы продуцировать новый белок с новой комбинацией полезных белковых характеристик, таких как измененные Vmax, Km, субстратная специфичность, селективность по субстрату и стабильность белка. В белке, в определенных аминокислотных позициях, могут быть сделаны модификации, и может быть обнаружена аминокислотная замена на другую аминокислоту в этой позиции в природе (т.е. в белке дикого типа). Иллюстративные аминокислотные позиции относительно последовательности белка RdpA дикого типа (SEQ ID NO: 60), полезные для белковой инженерии, изображены на фиг. 3. На фиг. 6А, 6Б, 6В, 6Г, 6Д проиллюстрировано множественное выравнивание последовательности RdpA дикого типа и сконструированных белковых последовательностей SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52.
Сконструированный белок может быть сконструирован таким образом, чтобы иметь по меньшей мере около 92% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52, и содержать по меньшей мере одну из этих аминокислотных мутаций. Таким образом, сконструированные белки, предложенные в изобретении, предусматривают новый белок с одной или несколькими измененными белковыми характеристиками относительно белка дикого типа, обнаруженного в природе. В одном варианте реализации изобретения сконструированный белок имеет измененные белковые характеристики, такие как улучшенная или пониженная активность по отношению к одному или нескольким гербицидам, или улучшенная стабильность белка по сравнению с аналогичным белком дикого типа, или любую комбинацию таких характеристик. В одном варианте реализации изобретения в изобретении предложен сконструированный белок и рекомбинантная молекула ДНК, которая кодирует этот белок, имеющий по меньшей мере около 80% идентичность последовательности, около 85% идентичность последовательности, около 90% идентичность последовательности, около 91% идентичность последовательности, около 92% идентичность последовательности, около 93% идентичность последовательности, около 94% идентичность последовательности, около 95% идентичность последовательности, около 96% идентичность последовательности, около 97% идентичность последовательности, около 98% идентичность последовательности и около 99% идентичность последовательности с любой сконструированной последовательностью белка, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 и 46-52. Аминокислотные мутации могут быть произведены в виде одиночной замены аминокислоты в белке или в сочетании с одной или несколькими другими мутациями, такими как одна или несколько других аминокислотных замен, делеций или вставок. Мутации могут быть произведены, как описано здесь или любым другим способом, известным специалистам в данной области техники.
Трансгенные растения.
Аспект изобретения включает трансгенные растительные клетки, трансгенные растительные ткани, трансгенные растения и трансгенные семена, которые содержат рекомбинантные молекулы ДНК и сконструированные белки, предложенные в изобретении. Эти клетки, ткани, растения и семена, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК и сконструированные белки, демонстрируют гербицидную устойчивость к одному или нескольким гербицидам на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидам на основе феноксикислот и гербицидам на основе пиридинилоксикислот.
Подходящие способы трансформации клеток растения-хозяина для применения с настоящим изобретением включают практически любой способ, с помощью которого ДНК может быть введена в клетку (например, когда конструкция рекомбинантной ДНК стабильно интегрируется в растительную хромосому) и который хорошо известен в данной области техники. Иллюстративным и широко применяемым способом введения рекомбинантной ДНК-конструкции в растения является агробактериальная система трансформации, которая хорошо известна специалистам в данной области техники. Трансгенные растения могут быть регенерированы из трансформированной растительной клетки с помощью способов растительной клеточной культуры. Трансгенное растение, гомозиготное по трансгену (т.е. имеет две аллельные копии трансгена), может быть получено путем самоопыления (самооплодотворение) трансгенного растения, которое содержит единственный аллель трансгена, например, путем самоопыления растение R0, для получения R1 семян. Одна четверть полученных R1 семян будет гомозиготной по трансгену. Растения, выращенные из прорастающих R1 семян, могут быть проверены на зиготность, как правило, с применением анализа SNP, секвенирования ДНК или анализа термической амплификации, который позволяет различать гетерозиготы и гомозиготы и называется анализом зиготности.
Растения, семена, части растений, растительные ткани и клетки, предложенные в изобретении, проявляют гербицидную устойчивость к одному или нескольким гербицидам на основе АОФП, гербицидам на основе феноксикислотным и гербицидам на основе пиридинилоксильных кислот. Гербициды на основе АОФП воздействуют на ацетилкоэнзим А карбоксилазу растения (АККаза), которая является частью биосинтетического пути жирных кислот. Травяные растения чувствительны к этим гербицидам, потому что они содержат гербицид-чувствительную АККазу в их пластидах и цитозоле. Гербициды на основе
- 7 035528
АОФП хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны. Примеры гербицидов на основе АОФП включают, но не ограничиваются ими, клодинафоп, цигалофоп, диклофоп, феноксапроп, феноксапроп-П, фентиапроп, флуазифоп, флуазифоп-П, галоксифоп, изоксапирифоп, метамифоп, пропаквизафоп, квизалофоп, квизалофоп-П и трифоп. Гербициды на основе феноксикислот и пиридинилоксикислот представляют собой синтетические ауксины, подобные растительному гормону индолуксусной кислоте (ГУК). Широколиственные растения чувствительны к этим гербицидам, которые вызывают быстрый, неконтролируемый рост, в конечном счете убивая растение. Примеры гербицидов на основе феноксикислот включают, но не ограничиваются ими, 2,4-D; 2,4-DB; кломепроп; дихлорпроп; денопроп; МХФУ; МХФБ и мекопроп. Примеры гербицидов на основе пиридинилоксикислот включают, но не ограничиваются ими, триклопир; флуроксипир; аминопиралид, клопиралид и пиклорам.
Гербициды можно наносить на участок произрастания растений, содержащий растения и семена, предложенные в изобретении, в качестве способа борьбы с сорняками. Растения и семена, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат признак устойчивости к гербицидам и как таковые являются устойчивыми к применению одного или нескольких гербицидов на основе АОФП, или гербицидов на основе феноксикислот, или гербицидов на основе пиридинилоксиловых кислот. Может быть рекомендовано применение гербицида в коммерческой норме (1X), или в любой ее части, или в любой ее кратности, такой как в два раза больше, чем рекомендуемая коммерческая норма (2Х). Нормы гербицидов могут быть выражены в виде кислотного эквивалента на фунт на акр (фунт к.э./акр) или фунта действующего вещества на акр (фунта д.в./акр). Применение гербицида включает по меньшей мере один гербицид, выбранный из группы, состоящей из гербицидов на основе АОФП и гербицидов на основе феноксикислот, и гербицидов на основе пиридинилоксикислот. Участок произрастания растений может содержать или не содержать сорняки во время применения гербицидов. Гербицидно-эффективная доза гербицидов на основе АОФП, применяемых в борьбе с сорняками, должна составлять от 0,01 до 16 фунтов д.в./акр в течение вегетационного периода. Например, 1X норма квизалофопа-П будет равна 0,08 фунта д.в./акр. Гербицидно-эффективная доза гербицидов на основе феноксикислот, применяемых в борьбе с сорняками, должна составлять от 0,01 до 16 фунтов к.э./акр в течение вегетационного периода. Например, норма 1X 2,4-D будет составлять примерно от 0,75 до 1,0 фунта к.э./акр. Гербицидно-эффективная доза гербицидов на основе пиридинолоксикислот, применяемых в борьбе с сорняками, должна составлять от 0,01 до 16 фунтов к.э./акр в течение вегетационного периода. Например, 1X норма флуроксипира должна составлять от 0,13 до 048 фунта к.э./акр.
Применение гербицидов может быть последовательным или гербицид может быть смешан в цистерне с одним, двумя или комбинацией нескольких гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот, гербицидов на основе пиридинилоксикислот или любым другим совместимым гербицидом. Многократное применение одного гербицида, или двух, или более гербицидов, в комбинации или отдельно, может быть использовано в течение вегетационного периода на участках, содержащих трансгенные растения согласно изобретению, для борьбы с широким спектром двудольных сорняков, однодольных сорняков или тех и других, например, два применения (таких как применение перед посадкой растений и применение после появления всходов или применение перед появлением всходов и применение после появления всходов), или три применения (такие как применения перед посадкой растений, применения перед появлением всходов и применение после появления всходов, или применение перед появлением всходов и два применения после появления всходов).
Как применяется в настоящем документе, устойчивость или устойчивость к гербициду означает способность растения, семени, растительной ткани, части растения или клетки противостоять токсическому воздействию одного или нескольких гербицидов. Устойчивость к гербициду растения, семян, растительной ткани, части растения или клетки можно измерить, сравнивая растение, семена, растительную ткань, часть растения или клетку с подходящим контролем. Например, устойчивость к гербицидам может быть измерена или оценена путем применения гербицида к растению, содержащему рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать устойчивость к гербициду (тестируемое растение), и к растению, не содержащему рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, способный придавать устойчивость к гербициду (контрольное растение), а затем сравнить повреждение двух растений, при этом на устойчивость к гербициду тестируемого растения указывает уменьшение количества повреждений по сравнению с количеством повреждений контрольного растения. Гербицидоустойчивое растение, семя, растительная ткань, часть растения или клетка проявляет уменьшенный ответ на токсические эффекты гербицида по сравнению с контрольным растением, семенем, растительной тканью, частью растения или клеткой. Как применяется в настоящем документе, термин признак устойчивости к гербициду представляет собой трансгенный признак, придающий растению улучшенную устойчивость к гербициду по сравнению с растением дикого типа или контрольным растением.
Трансгенные растения, потомство, семена, растительные клетки и части растений согласно данному изобретению могут также содержать один или более дополнительных трансгенных признаков. Дополнительные трансгенные признаки могут быть внесены путем скрещивания растения, содержащего трансген, содержащий рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в изобретении, с другим растением, содержащим дополнительный трансгенный признак (признаки). Как применяется в данном документе, термин
- 8 035528 скрещивание означает размножение двух отдельных растений для получения потомства растений. Таким образом, два трансгенных растения могут быть скрещены для получения потомства, которое содержит трансгенные признаки. Как применяется в настоящем документе, термин потомство означает потомство любого поколения родительского растения, и трансгенное потомство содержит ДНКконструкцию, предложенную в данном изобретении, унаследованную по меньшей мере от одного родительского растения. В альтернативном варианте дополнительный трансгенный признак(и) может быть введен путем совместной трансформации ДНК-конструкции для этого дополнительного трансгенного признака(ов) с конструкцией ДНК, содержащей рекомбинантные молекулы ДНК, предложенные в изобретении (например, со всеми ДНК-конструкциями, представленными как часть того же вектора, примененного для трансформации растений) или путем введения дополнительного признака(признаков) в трансгенное растение, содержащее ДНК-конструкцию, предложенную в изобретении, или наоборот (например, применяя любой из способов трансформации растений к трансгенному растению или растительной клетке). Такие дополнительные трансгенные признаки включают, но не ограничиваются ими, повышенную резистентность к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную устойчивость к засухе, повышенное качество семян, улучшенные питательные качества, производство семян гибрида и устойчивость к гербицидам, при этом признак измеряется относительно растения дикого типа или контрольного растения. Такие дополнительные трансгенные признаки известны специалистам в данной области техники; например, перечень таких признаков предоставляется Службой инспекции здоровья животных и растений (APHIS) Министерства сельского хозяйства США (USDA), и они могут быть найдены на их веб-сайте по адресу: www.aphis.usda.gov.
Трансгенные растения и потомство, которые содержат трансгенный признак, предложенный в данном изобретении, могут быть использованы с любыми способами скрещивания, которые широко известны в данной области техники. В линиях растений, содержащих два или более трансгенных признака, трансгенные признаки могут быть независимо сегрегирующими, сцепленными или комбинацией обоих в линиях растений, содержащих три или более трансгенных признака. Рассматривается также обратное скрещивание с родительским растением и скрещивание с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Описания способов скрещивания, которые обычно применяются для различных признаков и культур, хорошо известны специалистам в данной области техники. Для подтверждения присутствия трансгена(ов) в конкретном растении или семени может быть выполнено множество анализов. Такие анализы включают, например, молекулярно-биологические анализы, такие как Саузерн- и Нозернблотинги, ПЦР и секвенирование ДНК; биохимические анализы, такие как обнаружение присутствия белкового продукта, например, иммунологическими способами (ELISA и Вестерн-блоты) или с помощью ферментной функции; анализы части растения, такие как анализ листьев или корней; а также анализ фенотипа всего растения.
Интрогрессия трансгенного признака в генотип растения достигается в результате процесса конверсии обратного скрещивания. Растительный генотип, в который был интрогрессирован трансгенный признак, можно назвать преобразованным с помощью обратного скрещивания генотипом, линией, инбредом или гибридом. Подобным же образом генотип растения, лишенный желаемого трансгенного признака, может быть назван непреобразованным генотипом, линией, инбредом или гибридом.
Как применяется в настоящем документе, термин содержащий означает включающий, но не ограничивающийся этим.
Примеры
Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов реализации изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методы, раскрытые в следующих ниже примерах, представляют собой методы, обнаруженные изобретателями, которые хорошо функционируют при практической реализации изобретения, и поэтому могут рассматриваться как предпочтительные способы для его практической реализации. Однако в контексте данного изобретения, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в конкретных раскрытых вариантах реализации изобретения могут быть сделаны многие изменения, однако при этом будет получен схожий или аналогичный результат, без отступления от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые вещества, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены описанными здесь веществами с тем же или сходным результатом. Все подобные аналогичные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.
Пример 1. Первоначальное конструирование белков и анализ ферментов.
Новые, сконструированные белки и рекомбинантные молекулы ДНК, кодирующие эти белки, были задуманы и созданы в лаборатории с применением технологий белковой инженерии. Сконструированные белки представляют собой ферменты, которые обладают оксигеназной активностью и сконструированы таким образом, чтобы они обладали измененными способностями к инактивации гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или обоих по отношению к белку дикого типа.
- 9 035528
Были отобраны шестнадцать известных белков с оксигеназной активностью, и они были применены для создания консенсусного выравнивания последовательностей гомологов. Это было использовано в сочетании со структурно-ориентированными анализами для формирования рациональных стратегий разработки. Из этих анализов для мутагенеза были отобраны пять областей, каждая длиной от 13 до 21 аминокислоты, называемые в данном документе островами. Мутации в каждом из этих регионов были созданы с применением методов, известных специалистам в данной области техники, таких как аланинсканирующие мутирование; гомологически сканирующее мутирование; Pro/Gly сканирующее мутирование; обмен областями или мутирование; и комбинации этих различных методов (см., М. Lehmann and M. Wyss, Current Opinion in Biotechnology (2001) 12(4):371-375; В. Van den Burg and VGH Eijsink, Current Opinion in Biotechnology (2002) 13(4):333-337; и Weiss et al., Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97(16):89508954). Применяя эти способы, было получено более 1200 уникальных сконструированных белков и рекомбинантных молекул ДНК, которые их кодируют, для дальнейшего анализа и характеристики. Из-за большого количества сконструированных белков, полученных для тестирования, и необходимости тестирования и сравнения ферментативной активности каждого белка, были разработаны высокопроизводительные бактериальная экспрессия белка и система анализа ферментов для быстрого анализа с использованием неочищенных бактериальных экстрактов.
Экспрессия бактериального белка с высокой производительностью была достигнута путем синтеза рекомбинантной молекулы ДНК, кодирующей каждый сконструированный белок, и ее клонирования в бактериальный вектор экспрессии с С-концевой гистидиновой меткой (His-меткой), функционально связанной с рекомбинантной молекулой ДНК. Векторы применяли для трансформации Escherichia coli (Е. coli) и индуцировали бактериальную экспрессию сконструированных белков. Ночные культуры Е. coli выращивали в 96-луночных планшетах и культуры центрифугировали для осаждения бактерий. Бактериальный осадок лизировали добавлением 100 мкл лизирующей смеси (10 мл реагента для экстракции бактериальных белков (B-PER®) II (Pierce Biotechnology, Rockford, IL;78260); 10 мкл лизоцима (10 мкг/мл конечная концентрация; Lysozyme American Bioanalytical, Натик, Массачусетс; каталожный номер АВ011780-00005); и 40 мкл Benzonase® Nuclease (100 ед./мл конечная концентрация, Novagen, Дармштадт, Германия; каталожный номер 71206-3)) в каждую лунку. Планшеты встряхивали, затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С. 400 мкл буфера MOPS (pH 6,57) добавляли в каждую лунку и дебрис осаждали центрифугированием. Супернатант лизата осторожно удаляли и применяли в качестве неочищенного бактериального экстракта для последующего ферментативного анализа.
Высокопроизводительный анализ ферментативного разложения гербицида(ов) был разработан для анализа ферментативной активности сконструированных белков по отношению к различным гербицидам с применением неочищенного бактериального экстракта. Оксигеназную активность сконструированного белка (т.е. его ферментативную активность) измеряли с помощью колориметрического анализа конечной точки, применяя детектирование фенольных продуктов путем измерения оптического поглощения при 510 нм 4-аминоантипирина и феррицианида калия. Этот анализ был основан на анализе, описанном в Fukomori and Hausinger, Journal of Biological Chemistry (1993) 268 (32):24311-24317. Ферментативные реакции анализировали в 96-луночных планшетах с общим объемом 150 мкл, которые содержали 20 мМ MOPS рН 6,75, 50-200 мкМ NH4FeSO4, 50-200 мкМ аскорбата натрия, 1 мМ α-кетоглутарата (aKG), 10 мкл клеточного лизата Е. coli, содержащего экспрессированный сконструированный белок, и субстрат (либо гербицид на основе АОФП, или гербицид на основе феноксикислоты). После инициирования реакции с субстратом планшет инкубировали при различных температурах в течение различных периодов времени и гасили (останавливали) добавлением EDTA до конечной концентрации 6,25 мМ или добавлением 15 мкл буфера с рН 10 (50 мМ борной кислоты, 50 мМ KCl) с последующим добавлением 15 мкл 0,2% 4-аминоантипирина и 15 мкл 0,8% феррицианида калия. Измерения абсорбции проводили на стандартном лабораторном спектрометре. Анализы масштабировали по мере необходимости для увеличения производительности.
Стандартные кривые были получены с применением очищенного белка или стандартов продукта.
Применяя эту высокопроизводительную систему бактериальной экспрессии белка и ферментативного анализа, была измерена активность приблизительно 1200 сконструированных белков относительно активности выбранного белка дикого типа, RdpA. В анализе с применением 96-луночных планшетов было 3 контроля (неочищенный бактериальный экстракт без сконструированного белка) и 3 положительных контроля (неочищенный бактериальный экстракт с белком дикого типа). Измеряли поглощение лунок и рассчитывали активность белка с применением следующей формулы:
ί ζ Абсорбц ия! — Абсорбция^ } \
Активности = I ------------------------------- 1x10 0
Абсорбция^ — АбСОрбЦИЯ^ЕТ ) / где Активности - активность образца, Абсорбции - поглощение образца, Абсорбция^ - поглощение ячеек, содержащих экстракт из Е. coli, экспрессирующих фермент дикого типа, и А6сор6циярЕТ представляет собой поглощение ячеек, содержащих экстракт из Е. coli без сконструированного белка. Активность для каждого уникального сконструированного белка измерена в двух повторениях и приводится как среднее из двух измерений.
- 10 035528
Основываясь на результатах высокопроизводительной системы ферментативного анализа, было отобрано около 545 уникальных сконструированных белков для дальнейшего анализа с применением очищенного сконструированного белка. В предварительном анализе сконструированного очищенного белка неочищенные бактериальные экспрессирующие лизаты готовили с применением QUIAGEN® Ni-NTA Agarose (Qiagen, Валенсия, Калифорния, каталожный номер 30230), следуя протоколу производителя.
Очищенные сконструированные белки анализировали с применением анализа ферментативной деградации гербицидов, описанного в этом примере 1, используя в качестве субстрата квизалофопа - гербицид на основе АОФП. Результаты анализа очищенных сконструированных белков в значительной степени подтвердили результаты высокопроизводительного ферментативного анализа. Результаты анализа для семи из около 545 сконструированных белков приведены в табл. 1, при этом ферментативная активность выражается как активность образца относительно активности фермента RdpA дикого типа (рассчитанная, как описано в данном примере 1). Данные этих анализов предоставили удивительный результат, заключающийся в том, что комбинации специфических мутаций проявляли себя значительно лучше, чем другие варианты, и показали, что ферментативная активность сконструированных белков может быть значительно изменена.
Таблица 1
| Репликацион -ный номер | «Остров » 1-2-3 | «Остров » 1-2-5 | «Остров » 1-3-4 | «Остров » 2-3-4 | «Остров» 2-3-5 | «Остро в» 24-5 | «Остро в» 3-4-5 |
| 1 | -5, 94 | -4, 14 | -4,86 | -2,84 | 138,99 | 48, 12 | 4, 06 |
| 2 | -3,54 | -2, 64 | -3, 9 | -0, 05 | 117,67 | 48, 84 | 5, 56 |
| 3 | -3, 85 | 140,75 | |||||
| 4 | -0, 65 | 113,77 | |||||
| 5 | -0, 05 | 150,58 | |||||
| 6 | 2,14 | 141,27 |
Применяя информацию, полученную из первых анализов, затем была выполнена белковая инженерия, как описано ранее, для получения дополнительных сконструированных белков, которые были протестированы, как описано в данном примере 1. Результаты высокопродуктивного ферментативного анализа с применением квизалофопа-П в качестве субстрата для пяти из этих дополнительно сконструированных белков приведены в табл. 2.
Таблица 2
| SEQ ID NO | MON-HT | Повтор 1 | Повтор 2 | Повтор 3 | Средняя активность квизалофопа-П |
| 1 | MON-HT51 | 117,02 | 124,87 | 110,17 | 117,35 |
| 4 | MON-HT52 | 92,17 | 54,46 | 89, 75 | 78,79 |
| 7 | MON-HT53 | 105,34 | 105,31 | 106,13 | 105,60 |
| 9 | MON-HT54 | 131,85 | 149,77 | 130,56 | 137,39 |
| 11 | MON-HT55 | 118,48 | 99,79 | 109,13 |
Определение дополнительных белковых характеристик, таких как Km, Vmax и анализ структуры кристаллов, выполняли с применением пяти сконструированных белков из табл. 2. Для этого подробного анализа очищенный белок подготавливали следующим образом: 2 мл ночных культур Е. coli, экспрессирующих трансген, который кодирует данный белок MON-HT, применяли для инокуляции 500 мл среды и выращивали при 37°С в течение 4 ч с последующим культивированием при 15°С в течение около 36 ч. Затем 250 мл из 500 мл бактериальной культуры осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 25 мл буфера для экстракции (20 мМ Трис, рН 7,8, 300 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанол (БМЕ), 20 мМ имидазола (Fluka/Sigma- Aldrich, Сент-Луис, Миссури), 125 ед./мл бензоназы и 10 К ед./мл лизоцима (Novagen, Дармштадт, Германия). Суспензию клеток пропускали через дезинтегратор клеток один раз при 20000 psi, a затем этот клеточный лизат очищали центрифугированием при 35000xg в течение 20 мин при 4°С. Надосадочную жидкость, содержащую растворимые His-меченые белки, применяли для очистки белка. Для этой очистки супернатант вносили в 1 мл колонку HisTrap™ FF (Nickel Sepharose) (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси) с применением системы AKTaxpress™ (GE Healthcare, Пискатауэй, Нью-Джерси) в соответствии со стандартным протоколом производителя. Буфер для промывки состоял из 20 мМ Tris рН 7,8, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазола и 5 мМ БМЕ. Состав элюирующего буфера был
- 11 035528 таким же, как и промывочного буфера, за исключением 500 мМ имидазола. Элюат из никелевой колонки обессоливали на тонкой колонке Quick Spin Protein Sephadex G-25 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), следуя протоколу производителя. Элюированный белок был в буфере, состоящем из 20 мМ Tris рН 7,8, 50 мМ NaCl и 5 мМ БМЕ. Чистоту экстракта белка оценивали с помощью анализа SDS-PAGE. Концентрацию белка определяли с помощью анализа Брэдфорда с применением красителя-реагента Bio-Rad Protein Assay (Biorad, Геркулес, Калифорния, каталожный номер 500-0006).
Очищенный белок для пяти сконструированных белков анализировали с применением ферментативного анализа, описанного в данном примере 1, но с четырьмя различными гербицидами на основе АОФП в качестве субстратов: квизалофоп-П, галоксифоп, феноксапроп и флуазифоп. Стандартные кривые получали с применением 2,4-дихлорфенола (2,4-DCP), который использовали для получения общей стандартной фенольной кривой. Количество фенола, производимого при анализе сконструированными белками, рассчитывали на основе этой стандартной кривой. Контрольные образцы представляли собой образцы с очищенным ферментом дикого типа, образцы без фермента и образцы без субстрата. Измерения ферментативной кинетики пяти сконструированных белков проводили с применением 0, 20, 40, 80, 160, 320, 640 или 1280 мкМ гербицидов квизалофопа-П, галоксифопа, феноксапропа или флюозифопа. В табл. 3 показаны Km и Vmax (выраженные как относительные величины), измеренные для пяти белков с четырьмя субстратами - гербицидами на основе АОФП. Белковые характеристики этих пяти сконструированных белков с каждым из четырех гербицидов на основе АОФП в качестве субстратов продемонстрировали, что ферментативная активность, а именно Km и Vmax, сконструированных белков может быть значительно изменена с помощью белковой инженерии.
Таблица 3
| квизалофоп-П | Галоксифоп | Феноксапроп | Флюозифоп | |||||
| Кт (мкМ) | Vmax | Кт (мкМ) | Vmax | Кт (мкМ) | Vmax | Кт (мкМ) | Vmax | |
| MON-HT51 | 570 | 120 | 250 | 48 | 870 | 180 | 4, 0 | 12 |
| MON-HT52 | 420 | 39 | 280 | 45 | 490 | 420 | 14 | 43 |
| MON-HT53 | 690 | 95 | 290 | 64 | 1100 | 640 | 1, 0 | 40 |
| MON-HT54 | 560 | 32 | 380 | 40 | 2100 | 630 | ND | ND |
| MON-HT55 | 250 | 320 | 450 | 190 | 200 | 450 | 50 | 320 |
Пример 2. Экспрессия сконструированных белков в кукурузе.
Были сконструированы векторы для трансформации растений, каждый из которых содержал рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую один из трех сконструированных белков, с белок-кодирующей последовательностью, оптимизированной для экспрессии в однодольных, MON-HT51 (SEQ ID NO: 3), MON-HT52 (SEQ ID NO: 6) и MON-HT55 (SEQ ID NO: 13). Векторы были созданы с применением различных комбинации промотора, лидера, интрона и 3'-UTR, с и без ТПХ, функционально связанного с белок-кодирующей последовательностью. Также в векторы была включена вторая кассета ДНК, содержащая кодирующую последовательность cp4-EPSPS, которая должна применяться в трансгенных растениях для устойчивости к глифосату. Незрелые кукурузные (LH244) эмбрионы трансформировали этими векторами с применением Agrobacterium tumifaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные проростки выращивали в теплице и опрыскивали примерно на стадии роста V2-V4 квизалофопом-П в объеме 0,04 или 0,08 фунта д.в./акр (Assure™ II, E.I. DuPont), представляющие 0,5Х и 1X нормы соответственно. Образцы листьев применяли для идентификации трансгенных растений с единственной копией трансгенной ДНК-вставки (т.е. единичные трансформанты). Растения R0, которые содержали только одну копию и прошли тестирование опрыскиванием либо 0,5Х, либо 1X квизалофопа-П, были самоопылены для получения семян R1. С помощью конструкций, содержащих MON-HT52, не были получены трансформанты. Был регенерирован только один единичный трансформант, после трансформации конструкцией, содержащей MON-HT51 с ТПХ, и конструкцией, содержащей MON-HT51 без ТПХ. Трансформирование проводили двумя парами векторов, которые содержали MON-HT55, причем каждая пара отличалась только тем, что содержала ТПХ или не содержала ТПХ.
Растения R1, экспрессирующие MON-HT55 с функционально связанным ТПХ и без него, выращивали в теплице, а гербицид квизалофоп-П применяли на стадии роста V2 в норме 0,08 фунта к.э./акр (1X). Растения оценивали на наличие повреждений через одиннадцать дней после обработки. Растения R1 сегрегировали по признаку в типичном соотношении по Менделю, и было замечено ожидаемое количество (~25%) нулевых сегрегантов (растений-потомков, не содержащих трансгенных признаков), которые не выжили после гербицидной обработки. Все трансгенные растения R1, экспрессирующие MONHT55 с функционально связанным ТПХ, за исключением тех, которые представляли собой единичные трансформанты, показали только незначительное хлоротическое пятнышко на самых молодых открытых листьях после применения квизалофопа-П. Для этих растений после применения гербицида не было за- 12 035528 регистрировано никаких повреждений, превышающих 5%. Также необработанные трансгенные растения не отличались фенотипически от необработанных контрольных растений. Фиг. 1А иллюстрирует контрольные растения LH244 и трансгенные растения, содержащие MON-HT55 (SEQ ID NO: 13) через 18 дней после нанесения квизалофопа-П.
Для оценки эффекта применения ТХП, которые использовали для направления сконструированного белока к хлоропласту растительных клеток, сравнивали трансгенные растения, содержащие трансгенную вставку с ТПХ и без ТПХ, функционально связанную с белок-кодирующей последовательностью. Растения, содержащие ТПХ, функционально связанные с белок-кодирующей последовательностью, продемонстрировали лучшую переносимость по отношению к квизалофоп-П по сравнению с растениями без ТПХ. При тестировании R1 в теплице, описанном в данном примере 2, большинство трансгенных растений, содержащих ТПХ, функционально связанных с белок-кодирующей последовательностью, продемонстрировали полную устойчивость к квизалофопу-П. Растения, не содержащие ТПХ, функционально связанные с белок-кодирующей последовательностью, продемонстрировали устойчивость к квизалофопу-П, но имели фенотипы с некоторыми умеренными повреждениями. Данные результаты продемонстрировали, что использование ТПХ, чтобы направить сконструированный белок к хлоропласту растительных клеток, усиливает устойчивость трансформированного растения к квизалофопу-П. Данный неожиданный результат был перепроверен в полевых испытаниях эффективности признака у растений R1, содержащих либо MON-HT51 с или без ТПХ, функционально связанных с белок-кодирующей последовательностью, либо MON-HT55 с или без ТПХ, функционально связанных с белок-кодирующей последовательностью. Данные растения R1 были единичными трансформантами, но все еще сегригировали. В данном полевом испытании семена высевали в поле и обрабатывали следующим образом: 2Х (0,16 фунта д.в./акр) квизалофопа-П перед посевом, 2Х (0,14 фунта д.в./акр) галоксифопа на стадии роста V4, затем 2Х квизалофопа-П на стадии роста V8. Более высокий процент растений, содержащих ТПХ, функционально связанных с белок-кодирующей последовательностью, выживал при обработках квизалофопом-П и галоксифопом, и такие растения имели более низкие оценки повреждений по сравнению с растениями, не содержащими ТПХ, функционально связанными с белок-кодирующей последовательностью. Данные приведены в табл. 4. Это подтвердило неожиданный вывод о том, что ТПХ, функционально связанные с белок-кодирующей последовательностью, обеспечивают более высокую устойчивость растений к применению гербицидов для сконструированных белков.
Таблица 4
| Белок | ТПХ | Уникальные трансформанты | Средний % повреждение гербицидом |
| MON-HT51 | Нет | 1 | 95% |
| MON-HT51 | Да | 1 | 35% |
| MON-HT55 | Нет | 12 | 49% |
| MON-HT55 | Да | 3 | 25% |
| MON-HT55 | Нет | 2 | 90% |
| MON-HT55 | Да | 7 | 24% |
Полевые испытания эффективности инбредных признаков проводились для оценки устойчивости к гербицидам на основе АОФП и чувствительности к гербицидам на основе циклогександионов (ЦГД) на инбредном фоне. Инбредные растения R2 получали путем самоопыления гомозиготного трансгенного растения R1 и сбора семян. Инбредные растения R2, содержащие MON-HT55 с или без ТПХ или MONHT51 с ТПХ, оценивали в двух полевых локациях. Гербицидная обработка представляла собой обработку 2Х квизалофопом-П в 0,16 фунта д.в./акр, примененного НЛП (после посадки, но до прорастания), после чего применяли квизалофоп-П в 0,16 фунта д.в./акр на стадии роста V4, затем применяли квизалофоп-П в 0,16 фунта д.в./акр на стадии роста V8. Опытные участки оценивали по повреждению посевов через 7-10 дней после применения гербицидов по шкале 0-100, при этом нулевое значение обозначало отсутствие травм, а 100 обозначало полную гибель посевов. Все данные были подвергнуты дисперсионному анализу дисперсии и среднего, разделенных при НДР (наименьшая достоверная разница) (0,05). Большинство инбредных растений R1 не имели повреждений, подтверждая то, что и MON-HT55 и MON-HT51, с или без ТПХ, обеспечивают устойчивость кукурузе к квизалофопу-П. Для проверки чувствительности к гербицидам на основе ЦГД, которые желательны для применения к самосевному контролю, растения обрабатывали 1X нормой клефодиума (0,25 фунта д.в./акр) на стадии роста V8. Самосевный контроль с применением нормы 1X клефодиума был на 100% эффективен для всех трансгенных растений, прошедших тестирование. Полевые испытания эффективности признаков гибридов проводились для оценки устойчивости к гербицидам на основе АОФП и чувствительности к гербицидам на основе циклогександионов
- 13 035528 (ЦГД) на гибридном фоне. F1 гибридные растения получали путем скрещивания инбредного растения R1 с нетрансгенным растением и сбором семян. Полученные в результате растения F1, содержащие MONHT55 (SEQ ID NO: 13) с или без ТПХ или MON-HT51 (SEQ ID NO: 3) без ТПХ, оценивали в шести полевых локациях. Полевые испытания эффективности гибридных признаков проводились в шести местах при различных условиях окружающей среды, включая условия высокой температуры и засухи во время полевого сезона. Это позволило оценить сконструированный белок в кукурузе в условиях высокой температуры и водного стресса. Данные представлены в табл. 5. Первоначальное повреждение от применений 2Х квизалофопа-П было выше желаемого (>10% повреждений) через 7-10 дней после применения. Растения в конечном итоге смогли преодолеть повреждения путем дальнейшего роста, при этом, как правило, наблюдалось меньше травм от применения гербицида на стадии роста V8 по сравнению с применением на стадии роста V4. Также отмечалось чрезмерное повреждение, когда квизалофоп-П применялся очень рано (например, на стадии роста VE-V2).
Таблица 5
| Белок | ТПХ | Оценено уникальных трансформантов | % травмы после V4 опрыскивания | % травмы после V8 опрыскивания |
| MON-HT51 | Да | 4 | 51,8 | 33,3 |
| MON-HT55 | Нет | 9 | 46,8 | 78, 8 |
| MON-HT55 | Да | 17 | 42,6-48,3 | 14,2-38,8 |
Открытие того, что гибридные растения, экспрессирующие сконструированные белки MON-HT55 или MON-HT51, были чувствительными к применению квизалофопа-П при выращивании в полевых условиях при высокой температуре, было подтверждено с применением анализа на основе растений. Анализ на основе растений был разработан для проверки устойчивости гибридов F1 к квизалофопу-П в климатических камерах перед полевым тестированием. Анализ был разработан с применением гибридов F1, содержащих события трансформации кукурузы NK603 (патент США № 8273959) х MON89034 (патент США № 8581047) и гибридов F1, содержащих MON-HT55 х MON89034. Семена гибридов F1 проращивали в климатической камере в течение 1 недели и затем перемещали в одну из трех различных климатических камер для акклиматизации в течение двух дней при дневных/ночных температурах 20°С/20°С, 28 °С/20°С и 38°С/30°С до применения 2Х (0,16 фунта д.в./акр) квизалофопа-П. Как и ожидалось, растения, не содержащие MON-HT55 при всех режимах температур, были серьезно повреждены обработкой 2Х квизалофопом-П (фиг. 1Б). Трансгенные растения, содержащие MON-HT55, показали хорошую устойчивость к обработке 2Х квизалофопом-П при акклиматизации к дневным/ночным температурам 20°С/20°С или 28°С/20°С, но проявили значительную чувствительность при акклиматизации к дневным/ночным температурам 38°С/30°С (фиг. 1В). Это подтвердило, что анализ на основе растений может быть применен для скрининга белков в растениях в климатической камере по температуро-чувствительной активности.
Данные демонстрируют, что сконструированные белки могут быть экспрессированы в трансгенных растениях для сообщения устойчивости к гербицидам, и что необработанные трансгенные растения не отличаются фенотипически от необработанных контрольных растений. Эти данные также подтвердили, что экспрессия сконструированных белков в растениях позволила применять гербициды на основе ЦГД для самосевных контрольных растений. Неожиданно, данные показали, что применение ТПХ для направления к хлоропластам сконструированного белка усиливает признак устойчивости к гербицидам, и что устойчивость к гербицидам, обеспечиваемая сконструированными белками, является чувствительной к температуре, уменьшаясь в условиях высокой температуры.
Пример 3. Оптимизация сконструированных белков.
Открытие того, что гибридные растения, экспрессирующие сконструированные белки MON-HT55 или MON-HT51, были чувствительны к обработке квизалофопом-П при выращивании в полевых условиях при высокой температуре, было неожиданным и предоставило дополнительные белковые характеристики, которые можно было изменять в процессе конструирования белка. Была разработана новая серия ферментативных анализов in vitro и анализ ферментативной активности на основе растений для тестирования белков на чувствительность к высоким температурам.
Для создания сконструированных белков, оптимизированных для работы при более высоких температурах, анализ белковых мотивов, использованный в первых двух циклах конструирования белка, был объединен с данными кристаллической структуры для нескольких сконструированных белков. Это использовалось, чтобы инициировать дополнительные раунды мутагенеза, выполненные, как описано ранее, и таким образом было получено около 14 00 дополнительных сконструированных белков. Они были объединены с примерно 1200 сконструированными белками, описанными в примере 1, в общей сложности составив около 2600 сконструированных белков для скрининга с помощью нового теста чувствительности к температуре для идентификации белков, оптимизированных для работы при более высоких
- 14 035528 температурах.
Чтобы проанализировать активность этих сконструированных белков при более высоких температурах, ферментативный анализ in vitro в примере 1 был модифицирован для того, чтобы точно определить условия предварительного нагревания всех компонентов анализа до желаемой температуры в течение 5 мин перед объединением компонентов и затем поддерживать реакцию при желаемой температуре во время прохождения реакции. Для нормирования результатов анализа в качестве субстрата для реакции применяли квизалофоп-П, и активность фермента была нормирована на основании 25°С считываний. Применяя эти параметры, рассчитывали температуру, при которой активность фермента составляла половину от максимальной (T1/2). Было рассчитано, что T1/2 для MON-HT55 составляет 29°С, а для RdpA дикого типа Т1/2 составляет 38°С (фиг. 2А).
Из-за большого количества вариантов тестирования применялся пятиступенчатый процесс скрининга. Табл. 6 показывает примерное количество вариантов, протестированных в различных скринингах.
Таблица 6
| Протестированные сконструированные белки | |
| Первый скрининг | -2600 |
| Второй скрининг | -1250 |
| Третий скрининг | 94 |
| Четвертый скрининг | 47 |
| Пятый скрининг | 11 |
Первый скрининг проводили с применением примерно 2600 сконструированных белков и применяли высокопродуктивную систему бактериальной экспрессии белка и анализа ферментов с неочищенными бактериальными лизатами, как описано в примере 1, но модифицировали для проведения при желаемых температурах 25 и 40°С с развитием окрашивания после гашения при 25°С. После данного скрининга было отобрано и допущено к следующему этапу около 1250 сконструированных белков. Второй скрининг был аналогичным, но включал белковое нормирование по образцам. После данного скрининга было отобрано и пропущено к следующему этапу 94 сконструированных белка. В третьем скрининге применяли очищенный белок с анализом ферментативной деградации гербицида, как описано в примере 1, но он был модифицирован для проведения при желаемых температурах 25°С и 40°С с развитием окраски после гашения, выполненной при 25°С. После данного скрининга было отобрано и пропущено к следующему этапу 47 сконструированных белков. Четвертый скрининг проводили с применением очищенного белка, нормировали концентрации белка, а скрининг включал квизалофоп-П и (для подмножества вариантов белков) 2,4-D в качестве субстратов с анализом конечной точки при 23 и 40°С.
После данного скрининга было отобрано и пропущено к следующему этапу 13 сконструированных белков.
Для пятого скрининга для каждого из одиннадцати сконструированных белков получали и очищали рекомбинантный белок для углубленного биохимического анализа. Данный биохимический анализ включал: (1) кинетический анализ (Vmax и Km), (2) анализ активности в диапазоне температур, (3) анализ плавления белка, (4) активность на дополнительных гербицидах на основе АОФП и (5) массспектрометрический анализ на пептидах для подтверждения идентичности. Биохимические анализы также проводили с очищенным рекомбинантным белком дикого типа и белком MON-HT55 для сравнения. Для кинетического анализа проводили анализ без конечных точек при 23°С с применением либо квизалофопа-П, либо 2,4-D в качестве субстрата. Рекомбинантные белки для данных анализов получали в бактериях и очищали с применением метки 6-His, прицепленной к С-концу белка. Результаты кинетического анализа с применением либо квизалофопа-П, либо 2,4-D в качестве субстрата представлены для десяти сконструированных белков, белка дикого типа и белка MON-HT55 в табл. 7 (стандартная ошибка показана в скобках). Vmax выражается как удельная активность, мкМ, гербицидный продукт, мг, фермент-1, мин-1; Km, выраженная в мМ гербицидного субстрата. NDB указывает на то, что ферментативная активность может проявляться при более высоких концентрациях гербицида, но активность при тестируемых концентрациях была недостаточно сильной, чтобы обеспечить надлежащую кинетическую характеристику. Для MON-HT55 низкие уровни активности (Vmax) с 2,4-D в качестве субстрата приводили к низкой достоверности предоставляемого значения. MON-HT7 имеет Vmax с квизалофопом-П, которое на 40% больше, чем для фермента дикого типа, и Vmax для 2,4-D, которое составляет лишь половину от такового фермента дикого типа. MON-HT1 имеет Vmax для квизалофопа-П, которое составляет половину от такового фермента дикого типа, и Vmax для 2,4-D, которое в 9,5 раз выше, чем таковое фермента дикого типа. Дифференциация белковой кинетики для MON-HT1 и MON-HT7 была неожиданной, поскольку между MON-HT1 и MON-HT7 было всего четыре аминокислотных различия. В частности, MON-HT1 имеет следующие аминокислоты в указанной позиции: I82; F105; Т112 и V273, и MON-HT7 имеет следующие аминокислоты в указанной позиции: L82; V105; S112 и А273.
- 15 035528
Таблица 7
| Белок | Vmax Квизалофоп | Km Квизалофоп | Vmax 2,4-D | Km 2,4-D |
| MON-HT55 (SEQ ID NO:11) | 0,44 (-0, 04) | 0,32 (-0, 07) | 0,03 (- 0, 02) | 0,69 (- 0, 66) |
| MON-HT1 (SEQ ID NO:14) | 0,76 (-0, 04) | 0,17 (-0,03) | 0,95 (- 0, 03) | 0, 03 (0,00) |
| MON-HT2 (SEQ ID NO:18) | 1,41 (-0,11) | 0,41 (-0,06) | 0,23 (- 0, 01) | 0,04 (- 0, 01) |
| MON-НТЗ (SEQ ID NO:22) | 0,77 (-0, 04) | 0,38 (-0, 05) | 0,10 (- 0, 01) | 0,27 (- 0, 06) |
| MON-HT4 (SEQ ID NO:25) | 0,30 (-0, 02) | 0,24 (-0, 05) | NDB | NDB |
| MON-HT5 (SEQ ID NO:28) | 0,57 (-0, 03) | 0,17 (-0,03) | NDB | NDB |
| MON-HT6 (SEQ ID NO:31) | 0,39 (-0, 03) | 0,10 (-0,03) | NDB | NDB |
| MON-HT7 (SEQ ID NO:34) | 1,94 (-0,12) | 0,33 (-0, 05) | 0,04 (- 0, 01) | 0,06 (- 0, 04) |
| MON-HT8 (SEQ ID NO:37) | 0,46 (-0, 02) | 0,11 (-0,02) | 0,11 (- 0, 01) | 0,14 (- 0, 05) |
| MON-HT9 (SEQ ID NO:40) | 0,53 (-0, 02) | 0,10 (-0,01) | NDB | NDB |
| MON-HT10 (SEQ ID NO:43) | 0,78 (-0, 05) | 0,13 (-0,03) | NDB | NDB |
| RdpA дикого типа | 1,38 (-0, 06) | 0,27 (-0, 03) | 0,10 (- 0, 01) | 0,03 (- 0, 01) |
Была подробно проанализирована ферментативная активность в диапазоне температур для MONHT1, MON-HT2, MON-HT7 и MON-HT8. Данные анализы проводили, как описано выше. В качестве субстрата для данных реакций применяли квизалофоп-П или 2,4-D, и активность была нормирована на основе активности фермента дикого типа при 25°С. Полученные кривые активности представлены на фиг. 2Б (с квизалофопом-П в качестве субстрата), и на фиг. 2В (с 2,4-D в качестве субстрата). В случае применяя квизалофоп-П в качестве субстрата, MON-HT55 оказался наиболее чувствительным к температуре, с Т1/2 29°С. Фермент дикого типа имел Т1/2 38°С. MON-HT1 и MON-HT8 были менее чувствительны к температуре, чем фермент дикого типа с Т1/2 42 и 41°С соответственно, тогда как фермент дикого типа при этих температурах был на 90% неактивен. MON-HT2 и MON-HT7 были значительно менее чувствительны к температуре с Т1/2 46 и 47°С соответственно, тогда как фермент дикого типа при этих температурах был полностью неактивен. Когда в качестве субстрата применяли 2,4-D, фермент дикого типа имел T1/2 36°С. MON-HT2, MON-HT7 и MON-HT8 были немного более чувствительны к температуре с более низким Т1/2, чем фермент дикого типа. MON-HT1 был немного менее чувствителен к температуре при T1/2 примерно на 1°С выше, чем фермент дикого типа.
Был также проведен анализ плавления белка. Для определения плавления белка очищенный фермент добавляли в 96-луночные планшеты для микротитрования в стандартном буфере для хранения (30 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl) с или без 50 мкМ Fe2+ и 1,0 мМ aKG. Протеиновое развертывание затем детектировали с помощью оранжевого красителя белкового геля SYPRO® (Invitrogen™ каталожный номер S6651, Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) на приборе Real time-PCR BioRad CFX96™ (BioRad, Геркулес, Калифорния) со считываниями, выполненными от 10 до 95°С с шагом 0,5°С. T1/2 (здесь температура, при которой разворачивалось 50% белка) показаны в табл. 8. Фермент дикого типа продемонстрировал стабилизацию с помощью 50 мкМ Fe2+ и 1,0 мМ aKG. Напротив, 50 мкМ Fe2+ и 1,0 мМ aKG мало влияли на стабильность любого из сконструированных белков. MON-HT55, MON-НТЗ, MONHT4, MON-HT6 и MON-HT10 имели температуры плавления в диапазоне от 41 до 48°С, которые были ниже температуры плавления фермента дикого типа. MON-HT1, MON-HT2, MON-HT5, MON-HT7, MON-HT8 и MON-HT9 имели температуры плавления между 58 и 67°С, которые от 8 до 17°С выше чем фермента дикого типа. Для MON-HT7 и MON-HT1 разница в точке плавления составляла 11°С в буфере
- 16 035528 без Fe2+ и aKG и 8°С в буфере с Fe2+ и aKG. Это было неожиданно, поскольку между этими двумя ферментами было всего четыре аминокислотных различия. Эти данные по точке плавления ферментов подтверждают, что для сконструированных белков была оптимизирована белковая стабильность при более высоких температурах. Эти данные также соответствуют результатам анализа ферментативной активности белков, проводимого при разных температурах.
Таблица 8
| Белок | Буфер | Буфер плюс Fe2+ и aKG |
| MON-HT55 (SEQ ID NO:11) | 41°C | 41°C |
| MON-HT1 (SEQ ID NO:14) | 56°C | 59°C |
| MON-HT2 (SEQ ID NO:18) | 55°C | 58°C |
| MON-HT3 (SEQ ID NO:22) | 4 6°C | 48°C |
| MON-HT4 (SEQ ID NO:25) | 43°C | 44°C |
| MON-HT5 (SEQ ID NO:28) | 60°C | 61°C |
| MON-HT6 (SEQ ID NO:31) | 44°C | 44°C |
| MON-HT7 (SEQ ID NO:34) | 67°C | 67°C |
| MON-HT8 (SEQ ID NO:37) | 61°C | 61°C |
| MON-HT9 (SEQ ID NO:40) | 61°C | 60°C |
| MON-HTIO (SEQ ID NO:43) | 44°C | 44°C |
| RdpA дикого типа | 42°C | 50°C |
Ферментативную активность вариантов белка MON-HT с галоксифопом, феноксапропом, флуазифопом и дихлорпропом в качестве субстратов определяли с применением анализа ферментативной активности, проводимого при 23°С с очищенным ферментом. Активность регистрировали как максимальную активность в процентах от активности фермента дикого типа, которая была установлена на уровне 100%. Данные представлены в табл. 9.
MON-HT55, MON-HT3, MON-HT4, MON-HT5, и MON-HT9 имел максимальные активности для всех четырех субстратов, которые были меньше или равны максимальной активности фермента дикого типа с тем же самым субстратом. При использовании галоксифопа в качестве субстрата, MON-HT1, MON-HT2, MON-HT7 и MON-HT10 имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа. При применении фенаксопропа в качестве субстрата, MON-HT1, MONHT2, MON-HT6, MON-HT7, MON-HT8 и MON-НТ^ имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа. При использовании флюзифопа в качестве субстрата, MON-HT2 и MON-HT7 имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа. При применении дихлорпопа в качестве субстрата, MON-HT1, MON-HT7 и MON-HT8 имели максимальную активность, которая была выше, чем активность фермента дикого типа.
- 17 035528
Таблица 9
| Белок | Галоксифоп | Феноксапроп | Флюозифоп | Дихлорпроп |
| MON-HT55 (SEQ ID NO:11) | 58 | 34 | 38 | 31 |
| MON-HT1 (SEQ ID NO:14) | 134 | 175 | 67 | 175 |
| MON-HT2 (SEQ ID NO :18) | 142 | 121 | 124 | 92 |
| MON-HT3 (SEQ ID NO:22) | 67 | 83 | 60 | 100 |
| MON-HT4 (SEQ ID NO:25) | 49 | 53 | 52 | 39 |
| MON-HT5 (SEQ ID NO :2 8) | 100 | 92 | 46 | 36 |
| MON-HT6 (SEQ ID NO:31) | 75 | 333 | 47 | 37 |
| MON-HT7 (SEQ ID NO:34) | 193 | 210 | 161 | 210 |
| MON-HT8 (SEQ ID NO:37) | 99 | 106 | 50 | 106 |
| MON-HT9 (SEQ ID NO :4 0) | 91 | 67 | 41 | 19 |
| MON-HT10 (SEQ ID NO:43) | 124 | 233 | 48 | 29 |
| RdpA дикого типа | 100 | 100 | 100 | 100 |
Ферментативная идентичность была подтверждена с помощью масс-спектроскопии. Для этого анализа очищенный белок разделяли на геле PAGE и окрашивали. Затем окрашенные полоски вырезали, сушили и расщепляли с помощью трипсина согласно стандартным протоколам. Расщепленные трипсином белковые препараты разделяли на Dionox UltiMat® 3000 RSLCnano LC System (Thermo Scientific, Саннивейл, Калифорния) с применением колонки Thermo Scientific™ AQUASIL™ C-18 Javelin™ Guard в стандартных условиях и впрыскивали для анализа MS-MS с применением масс-спектрометра Thermo Scientific™ Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Scientific, Саннивейл, Калифорния).
Чтобы оптимизировать белки для повышения активности в присутствии гербицидов на основе феноксикислот, было выполнено вычислительное белковое конструирование на кристаллической структуре для нескольких сконструированных белков. Это использовали для инициации дополнительных циклов мутагенеза, выполняемых, как описано ранее, но с применением бактериальной последовательности SEQ ID NO: 15, кодирующей белковую последовательность MON-HT1 (SEQ ID NO: 14), в качестве начальной последовательности. Было произведено около 472 дополнительных сконструированных белков. Они были объединены с примерно 2600 сконструированными белками, описанными в примере 1 и табл. 6, всего около 3072 сконструированных белков для идентификации белков, оптимизированных для работы в присутствии 2,4-D. Первый скрининг новых вариантов проводили с применением высокопроизводительной (ВПС) системы бактериальной экспрессии белка и анализа ферментов с неочищенными бактериальными лизатами, как описано в примере 1, но модифицировали для проведения при желаемых температурах 25 и 40°С с развитием окрашивания после гашения при 25°С. После этого высокопроизводительного скрининга было отобрано 34 сконструированных белка и допущено к следующему этапу скрининга с белковым нормированием по всем образцам. После данного скрининга 12 сконструированных белков были отобраны и допущены к следующему этапу скрининга с очищенным белком, проанализированные с применением анализа ферментативной деградации гербицидов, как описано в примере 1. Ферментативную термостабильность анализировали с помощью анализа ограниченного плавления белков. После данного скрининга было отобрано и допущено к следующему этапу растительного тестирования 7 сконструированных белков. Были отобраны три варианта ферментов для детальной характеристики с применением очищенного белка, при этом концентрации белка были нормированы, и скрининг включал субстраты квизалофоп-П и 2,4-D, а также дополнительные гербициды, представленные в табл. 10 и 12, а также
- 18 035528 характеристики плавление белков.
Кинетический анализ с применением анализа без конечных точек проводили при 23°С с применением либо квизалофопа-П, либо 2,4-D в качестве субстрата, как описано выше для очищенного белка фермента дикого типа, MON-HT1, MON-HT13, MON-HT15 и MON-HT17. Данные демонстрируют значительное и неожиданное повышение ферментативной активности MON-HT13, MON-HT15 и MONHT17 по отношению как к ферменту RdpA дикого типа, так и к ферменту MON-HT1 при тестировании с применением 2,4-D в качестве субстрата. В частности, все три варианта показали примерно 2,5-3-кратное увеличение активности (Vmax) относительно MON-HT1. Ферментативная активность вариантов MONHT13, MON-HT15 и MON-HT17 с квизалофопом в качестве субстрата была примерно аналогична активности MON-HT1. См. табл. 10.
Таблица 10
| Квизалофоп | 2,4-D | |||
| Белок | Vmax | Km | Vmax | Km |
| RdpA дикого типа | 2,76 (0,11) | 0, 09 (0,013) | 0,25 (0,01) | 0, 13 (0,017) |
| MON-HT1 (SEQ ID NO:14) | 1, 62 (0,05) | 0, 12 (0,012) | 1,17 (0,01) | 0, 03 (0,002) |
| MON-HT13 (SEQ ID NO:47) | 1,51 (0,05) | 0, 12 (0,013) | 3,38 (0,05) | 0, 08 (0,004) |
| MON-HT15 (SEQ ID NO :4 9) | 1,52 (0,06) | 0, 12 (0,017) | 3,53 (0,04) | 0, 07 (0,004) |
| MON-HT17 (SEQ ID NO:51) | 1,53 (0,05) | 0, 14 (0,014) | 2,91 (0,04) | 0, 07 (0,004) |
Анализ плавления белка проводили, как описано выше. Температуры плавления MON-HT13, MONHT15 и MON-HT17 были близки к температуре плавления MON-HT1 с T1/2 в буфере в диапазоне 5558°С, и с T1/2 в буфере с Fe2+ и aKG в диапазоне 60-62°С. Эти данные показывают, что варианты MONHT13, MON-HT15 и MON-HT17 имеют похожую ферментативную термостабильность по сравнению с MON-HT1. Эти данные по точке плавления ферментативных вариантов подтверждают, что для сконструированных белков была оптимизирована белковая стабильность при более высоких температурах. См. табл. 11.
Таблица 11
| Температура плавления °C | ||
| Белок | Буфер | Буфер плюс Ее2+ и aKG |
| RdpA дикого типа | 43 | 53 |
| MON-HT1 (SEQ ID NO:14) | 58 | 62 |
| MON-HT13 (SEQ ID NO:47) | 57 | 62 |
| MON-HT15 (SEQ ID NO:49) | 55 | 60 |
| MON-HT17 (SEQ ID NO:51) | 57 | 61 |
Ферментативную активность вариантов белка MON-HT с триклопиром, флуроксипиром, МХФУ, МСРВ, мекопропом в качестве субстратов определяли с применением анализа ферментативной активности, проводимого при 23°С, с очищенным ферментом. Активность регистрировали как максимальную активность в процентах от активности фермента дикого типа RdpA, которая была установлена на уровне 100%. Данные представлены в табл. 12. Для каждого из проанализированных белков (MON-HT1, MONHT13, MON-HT15 и MON-HT17) с гербицидами триклопир и флуроксипир в качестве субстрата обнаруживалась активность, особенно в сконструированных вариантах, но активность не была достаточно сильной для количественной оценки. Для каждого из протестированных белков (MON-HT1, MON-HT13, MON-HT15 и MON-HT17) не было обнаружено активности с гербицидом МСРВ в качестве субстрата. Ферментативная активность с мекопропом в качестве субстрата была сниженной для каждого из вариантов MON-HT1, Mon-НПЗ, MON-HT15 и MON-HT17 по сравнению с ферментом дикого типа RdpA. Неожиданным результатом было то, что ферментативная активность с МХФУ в качестве субстрата была примерно в 6 раз выше для MON-HT1 и примерно в 10 раз выше для MON-HT13, MON-HT15 и MONHT17 по сравнению с ферментом дикого типа RdpA. См. табл. 12.
- 19 035528
Таблица 12
| Мекопроп | МХФУ | |||
| Белок | Vmax | Km | Vmax | Km |
| RdpA дикого типа | 100 | 100 | 100 | 100 |
| MON-HT1 (SEQ ID NO:14) | 63 | 142 | 600 | 21 |
| MON-HT13 (SEQ ID NO:47) | 37 | 92 | 1800 | 68 |
| MON-HT15 (SEQ ID NO:49) | 25 | 57 | 1300 | 59 |
| MON-HT17 (SEQ ID NO:51) | 27 | 65 | 1400 | 62 |
Пример 4. Экспрессия оптимизированных сконструированных белков в кукурузе.
Десять уникальных сконструированных белков, оптимизированных для работы при более высоких температурах, были отобраны для трансформации кукурузы и анализа в растениях. Были получены ДНКконструкции для экспрессии этих сконструированных белков с применением кодонов, оптимизированных для экспрессии в злаках, с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Энхансеры, промоторы, лидеры, интроны, ТПХ и 3'-UTR испытывались в различных комбинациях с сконструированными белками в данных ДНК-конструкциях. ДНК-конструкции применяли для трансформации незрелых эмбрионов кукурузы (LH244) с помощью данных векторов, используя Agrobacterium tumifaciens и стандартные способы, известные в данной области техники. Регенерированные R0 транс генные проростки выращивали в теплице.
Трансгенные растения кукурузы R0 подвергали скринингу с обработкой квизалофопом-П (2Х) плюс 2,4-D (2X) через 7-10 дней с последующей пересадкой в горшки (как правило, соответствует стадии роста V3-V4). На основе всех протестированных конструктов были получены растения, содержащие единичную копию трансгенной вставки, которые прошли R0 скрининг. Растения R0 были самоопылены для того, чтобы произвести гомозиготные семена R1, и также использовали R0 в качестве особей мужского пола для скрещивания с инбредными растениями, содержащими трансгенную вставку кукурузы MON89034, для получения семян сегрегирующего гибрида F1, для проведения полевых испытаний эффективности.
Полевое исследование эффективности проводилось с сегрегирующими F1 гибридными растениями, с 50% гемизигот и 50% нулевых по трансгену растений. Устойчивость к квизалофопу-П (2Х) плюс 2,4-D (2X) оценивалась с применением двух схем обработки гербицидами: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,16 фунта д.в./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. неионного поверхностно-активного вещества (НИПАВ), наносимых на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8, и 2) 2,4-D амин при 2 фунта к.э./акр (2Х) плюс квизалофоп-П при 0,04 фунта д.в./акр (0,5Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимых на стадии роста VE-V2, с последующей обработкой 2,4-D амина при 2 фунта к.э./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимых на стадии роста V4, после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. 50% растений, которые были нулевыми по трансгену, были удалены после первой обработки квизалофопом-П на стадии роста VE-V2. Участки были визуально оценены через 10-14 дней после обработки по уровню повреждений посевов в масштабе от 0 до 100, при этом 0 - отсутствие повреждений, а 100 являлось полным уничтожением посевов. Табл. 13 демонстрирует средний показатель повреждений на этапах роста V4 и V8 для обеих схем распыления. Оценка повреждений <10% рассматривалась как очень хорошая устойчивость, а оценка повреждений <20% рассматривалась как хорошая устойчивость. Процентная оценка повреждений с применением 2Х 2,4-D на стадии роста V8 варьировала от 40% до минимума 0. Аналогичным образом, процентная оценка повреждений с применением 2Х квизалофопа-Р на стадии роста V8 колебалась от 90% до минимума 0. Различия в оценке повреждений между растениями, экспрессирующими один и тот же белок, вероятно, связаны с различиями в дизайне конструкции или местонахождении вставки трансгена. Эти данные подтвердили, что растения, экспрессирующие сконструированные белки, проявили устойчивость к обработке гербицидами 2,4-D и квизалофопом при 2Х нормах.
- 20 035528
Таблица 13
| Белок | ТПХ | % процент повреждени й на стадии V4 Квизалофоп | % процент повреждений на стадии V8 Квизалофоп | % процент повреждений на стадии V4 2,4-D | % процент повреждений на стадии V8 2,4-D |
| MON-HT1 | A | 8,33 | 8,33 | 7,5 | 5,83 |
| MON-HT1 | Нет | 7,14 | 7,86 | 12,86 | 10,71 |
| MON-HT1 | В | 7,5 | 8.75 | 10 | 10 |
| MON-HT1 | С | 0, 45 | 0,91 | 14,09 | 11,36 |
| MON-HT2 | A | 0 | 0 | 20 | 34,17 |
| MON-HT2 | Нет | 0 | 0 | 20 | 33,75 |
| MON-HT2 | В | 11, 67 | 11,67 | 10,56 | 13,33 |
| MON-HT2 | С | 14,33 | 14,33 | 12 | 12 |
| MON-HT3 | А | 1, 6 | 0,5 | 21,7 | 9,2 |
| MON-HT4 | А | 6, 1 | 0 | 22,3 | 12,3 |
| MON-HT5 | А | 6, 8 | 1,7 | 27,2 | 17,4 |
| MON-HT6 | А | 8 | 1,7 | 27 | 12,7 |
| MON-HT7 | А | 31,2 | 5 | 21, 6 | 16, 6 |
| MON-HT8 | А | 1,25 | 1,25 | 10 | 10 |
| MON-HT8 | Нет | 85 | 90 | 0 | 0 |
| MON-HT8 | В | 9, 17 | 8,33 | 12,5 | 11,67 |
| MON-HT8 | С | 30 | 32,5 | 20 | 21,25 |
| MON-HT9 | А | 5 | 5 | 20 | 40 |
| MON-HT10 | А | 0 | 0 | 28 | 38,33 |
| MON- | А+нет | 6, 67 | 5,56 | 20,56 | 18,89 |
| HT3+MON- HT1 | |||||
| MON- HT 4+MON- HT8 | А+нет | 11,25 | 11,88 | 9,38 | 4,38 |
Был применен анализ ферментативной активности на основе растений для определения тепловой чувствительности, чтобы определить влияния повышенных ростовых температур на устойчивость к гербицидам трансгенных растений, содержащих оптимизированные сконструированные белки. Для проверки на устойчивость к квизалофопу-П при повышенных ростовых температурах (полученного путем скрещивания гомозиготного растения R1, экспрессирующего один из белков MON-HT, с инбредным трансгенным растением кукурузы MON89034), семена F1 гибрида кукурузы проращивали в климатической камере в течение 10 дней при дневной температуре 28°С и ночной температуре 20°С при 50% влажности. Через 10 дней растения переносили для акклиматизации в течение 3 дней при одном из трех разных дневных и ночных температурных режимов: (1) дневная и ночная температуры установлены на 20°С; (2) дневная температура 28°С и ночная температура 20°С или (3) дневная температура 38°С и ночная температура 30°С. По окончании акклиматизационного периода растения обычно находились на стадии роста V4 и опрыскивались 2Х квизалофопом-П. Через 10 дней после обработки повреждения растения оценивались по шкале от 1 до 5, в которой 0 - не наблюдалось видимых повреждений, 1 - хлоротическая пятнистость, 2 - хлоротические полосы, 3 - разрывы листьев, 4 - растения с чахлым ростом и/или скрученными листьями, а 5 -мертвые растения или не наблюдалось роста. Результаты представлены на фиг. 4. F1 гибридные растения кукурузы, экспрессирующие MON-HT55, показали хорошую устойчивость (оценка повреждений около 2) к обработке распылением, когда дневная/ночная температуры составляли 20°С/20°С (фиг. 4А) или 28°С/20°С (фиг. 4Б) относительно гибридных контрольных растений F1 (трансформанты кукурузы NK603 X MON89034) (оценка повреждений - 5). Когда дневные/ночные температуры составляли 38°С/30°С, оценка повреждений гибридных контрольных растений F1 равнялась пяти, гибридные растения F1, экспрессирующие MON-HT55, имели средний коэффициент повреждений три, и гибридные растения F1, экспрессирующие MON-HT1, MON-HT2, MON-HT3, MON-HT4 или MON-HT7 имели оценку повреждений <1 (фиг. 4В). Сконструированные белки, оптимизированные для работы при более высоких температурах, обеспечивали устойчивость к гербицидам на основе АОФП,
- 21 035528 когда растения, экспрессирующие данные сконструированные белки, подвергались воздействию высоких температур.
Для проверки на устойчивость к 2,4-D при повышенных ростовых температурах гибридные растения F1 получали путем скрещивания растения R1, содержащего MON-HT1, MON-HT2, MON-HT3, MONHT4, MON-HT7 или MON-HT55 с инбредным растением, содержащим трансгенную вставку кукурузы MON89034. Гибридные растения F1 выращивали в теплице в течение одной недели при минимальной температуре 20°С и максимальной температуре 28°С при влажности от 50 до 80%. Через 1 неделю растения переносили для акклиматизации в течение трех дней при одном из двух разных дневных и ночных температурных режимов: (1) дневная и ночная температуры установлены на 20°С или (2) дневная температура 38°С и ночная температура 30°С. По окончании акклиматизационного периода растения обычно находились на стадии роста V4 и опрыскивались 4Х 2,4-D амином. Через 10 дней после обработки повреждения растений оценивались с использованием шкалы повреждений от 0 до 100, при этом 0 - не было повреждений, а 100 - мертвое растение. Когда растения были акклиматизированы при дневных/ночных температурах 20°С/20°С до нанесения 4Х 2,4-D амина, растения F1, содержащие MON-HT1, MON-HT2, MON-HT3, MON-HT4, MON-HT7 или MON-HT55, имели средние показатели повреждений <10%, а контрольные растения имели средние показатели повреждений менее 20% (фиг. 4Г). Когда растения были акклиматизированы при дневных/ночных температурах 38°С/30°С перед нанесением 4Х 2,4D амина, растения F1, содержащие MON-HT4 или MON-HT7, имели средние оценки повреждений <20%, растения F1, содержащие MON-HT1, MON-HT2 или MON-HT3, имели средние оценки повреждений менее 10% (фиг. 4Д), а контрольные растения и растения, включающие MON-HT55 F1 растения, имели средние оценки повреждений, равные 50% (фиг. 4Д). Эти результаты показали, что сконструированные белки, оптимизированные для работы при более высоких температурах, обеспечивали устойчивость к гербициду 2,4-D, когда растения, экспрессирующие эти сконструированные белки, подвергались воздействию высоких температур.
Отдельные полевые испытания эффективности признаков для квизалофопа-П и 2,4-D проводились в двух локациях, каждое с гибридными трансгенными растениями F1, полученными путем скрещивания инбредного растения, содержащего трансгенную вставку кукурузы MON89034, с растением R1, содержащим MON-HT55 (с ТПХ) MON-HT1 (с или без ТПХ), MON-HT2 (с или без ТПХ), MON-HT3 (с ТПХ), MON-HT4 (с ТПХ), MON-HT5 (с ТПХ) , MON -НТ6 (с ТПХ) или MON-HT7 (с ТПХ). Трансгенные гибридные растения F1, содержащие единичные трансгенные вставки кукурузы, NK603 х MON89034, применяли для сравнения, в качестве контроля.
В полевом испытании эффективности устойчивости к квизалофопу-П и чувствительности к клефодиуму, применялась одна из четырех обработок гербицидом: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,32 фунта д.в./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4, после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; (2) квизалофоп-П при 0,64 фунта д.в./акр (8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадиях роста от VE до V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4 и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; (3) квизалофоп-П при 1,28 фунта д.в./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадиях роста от VE до V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4 и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; или (4) клефодиум при 0,25 фунта д.в./акр (1X) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста V8. Участки были визуально оценены через 1014 дней после обработки по уровню повреждений посевов в масштабе от 0 до 100, при этом 0 - отсутствие повреждений, а 100 являлось полным уничтожением посевов. В табл. 14 и 15 показаны средние оценки повреждений после применения гербицидов на стадии роста V4 или V8 соответственно.
Растения, содержащие MON-HT1, MON-HT2, MON-HT3, MON-HT4, MON-HT5, MON-HT6 или MON-HT7 (все функционально связанные с ТПХ), показали очень хорошую устойчивость к квизалофопу-П с оценками повреждений менее 15% при всех нормах применения и как на стадии роста V4, так на стадии V8. Растения, содержащие MON-HT55, функционально связанный с ТПХ, показали от умеренной до плохой устойчивости с оценками повреждений от 0,8 до 78,8%. Оценки повреждений для контрольных растений после применения квизалофопа-П составили 99,5%. Эти результаты показывают, что растения, содержащие MON-HT1, MON-HT2, MON-HT3, MON-HT4, MON-HT5, MON-HT6 или MON-HT7, функционально связанные с ТПХ, обладают очень хорошей устойчивостью к серийной обработке квизалофопом-П.
Растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с функционально связанным ТПХ, имели лучшую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие MON-HT1 с функционально связанным ТПХ, имели оценки повреждений от 0 до 5,5% при всех обработках квизалофопом-П по сравнению с оценками повреждений от 3,3 до 18,8% растений, содержащих MON-HT1 без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие MON-HT2 с функционально связанным ТПХ, имели оценки повреждений от 1,5 до 10% при всех обработках квизалофопом-П по сравнению оценками повреждений от 16,3 до 82,5% растений, содержащих MON-HT2 без функционально связанного ТПХ. На фиг. 5 показаны растения, содержащие MONHT2, функционально связанный с ТПХ (фиг. 5А), и растения, содержащие MON-HT2 без ТПХ (фиг. 5Б),
- 22 035528 через 10-14 дней после применения квизалофопа-П (обработка 3) при 1,28 фунта д.в./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях роста от VE до V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4 и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. Контрольные растения не выживали, растения, содержащие MON-HT2 без ТПХ, обладали устойчивостью от умеренной до плохой, а растения, содержащие MON-HT2, функционально связанный с ТПХ, показали сильную устойчивость к обработке квизалофопом-П. Данные результаты подтвердили, что применение функционально связанного ТПХ значительно улучшает устойчивость к квизалофопу-П.
Все трансгенные растения имели оценки повреждений выше 90% при обработке 1X нормой клефодиума (0,25 фунта д.в./акр), применяемого на стадии роста V8, демонстрируя применение данного гербицида к самосевному контролю с трансгенными растениями, содержащими сконструированные белки.
В полевом испытании эффективности устойчивости к 2,4-D применялась одна из четырех обработок гербицидом: (1) 2,4-О-амин при 2 фунтах к.э./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, затем на V4 и затем на V8; (2) 2,4-О-амин при 4 фунтах к.э./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, затем на V4 и затем на V8; (3) 2,4-1)-амин при 8 фунтах к.э/акр 8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, затем на V4 и затем на V8 кукурузы; или (4) 2,4-О-амин при 16 фунтах к.э./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на стадиях от VE до V2, затем на V4 и затем на V8. Участки были визуально оценены, как указано выше. В табл. 14 и 15 показаны средние оценки повреждений после применения гербицидов на стадии роста V4 или V8 соответственно.
Растения, содержащие MON-HT1, MON-HT2 или MON-HT6 (все функционально связанные с ТПХ), показали очень хорошую устойчивость к 2,4-D с оценками повреждений менее 10% и менее 17% при всех нормах обработки на стадиях роста V4 и V8 соответственно. Растения, содержащие MON-HT3, MON-HT4, MON-HT5 или MON-HT7 (все функционально связанные с ТПХ), показали хорошую устойчивость к 2,4-D с оценками повреждений менее 20% и менее 22% при всех нормах обработки на стадиях роста V4 и V8 соответственно. Растения, содержащие MON-HT55, функционально связанный с ТПХ, показали от умеренной до плохой устойчивости с оценками повреждений от 7,5 до 66%. Оценки повреждений для контрольных растений после применения 2,4-D составляли от 40 до 82,2%. Данные результаты показывают, что растения, содержащие MON-HT1, MON-HT2, MON-HT3, MON-HT4, MON-HT5, MONHT6 или MON-R^, хорошо переносят серийную обработку 2,4-D.
Растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с функционально связанным ТПХ, в целом не показали заметных различий в устойчивости к 2,4-D по сравнению с растениями, содержащими MON-HT1 или MON-HT2, без функционально связанного ТПХ, как было видно из обработки квизалофопом-П. Растения, содержащие MON-HT1 с функционально связанным ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 16,3% при всех обработках 2,4-D по сравнению с оценками повреждений от 0 до 13,8% растений, содержащих МОЫ-НТ1, без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие ΜΟΝ-1ΓΓ2 с функционально связанным ТПХ, имели оценку повреждений от 1,3 до 15% при всех обработках 2,4-D по сравнению с оценками повреждений от 1,3 до 21,3% растений, содержащих MON-HT2, без функционально связанного ТПХ. Однако данная разница была заметна после обработки растений 2,4-D на стадии роста V4, содержащих MON-HT2 с функционально связанным ТПХ (4,5%-ная оценка повреждений при 8Х, и 7,5% при 16Х) по сравнению с растениями без ТПХ (13,75% оценка повреждений при 8Х и 21,25% при 16Х).
Таблица 14
| Стадия роста V4 | 2х 2,4-D | 4х 2,4-D | 8х 2,4-D | 16х 2,4-D | 4х Квизало фоп | 8х Квизало фоп | 16х Квизало фоп |
| Контро ль | 52,5 | 64,4 | 73,8 | 74,7 | 99,5 | 99, 5 | 99, 5 |
| MON- НТ55 | 30,0 | 41,3 | 43,8 | 66, 3 | 37,5 | 67,5 | 77,5 |
| MON- НТ55 | 20,0 | 23, 1 | 50,0 | 55,0 | 12,5 | 43, 8 | 62,5 |
| MON- НТ55 | 15,0 | 30, 0 | 58,8 | 53, 8 | 2,0 | 7,5 | 20, 0 |
| MON- НТ55 | 12,5 | 30, 0 | 48,8 | 52,5 | 8,0 | 18,8 | 48, 8 |
| MON- | 13,8 | 31,3 | 45,0 | 61,3 | 6,0 | 10, 0 | 21,3 |
- 23 035528
| НТ55 | |||||||
| MON- НТ55 | нет данных | нет данных | нет данных | нет данных | 0,8 | 13, 8 | 16, 3 |
| MON- HT55 | 7,5 | 22,5 | 53,8 | 63, 8 | 5,5 | 12,5 | 13, 8 |
| MON- НТ 1 (нет ТПХ) | 0, 0 | 0, 0 | 5,8 | 12,5 | 5,8 | 11, 3 | 18,8 |
| MON- НТ 1 | 0, 0 | 0, 0 | 5,0 | 6, 3 | 0,0 | 0, 8 | 4,5 |
| MON- НТ 2 (нет ТПХ) | 1,3 | 2,5 | 13,8 | 21,3 | 42,5 | 76, 3 | 82,5 |
| MON- НТ2 | 1,3 | 0, 0 | 4,5 | 7,5 | 1,5 | 0, 8 | 10, 0 |
| MON- НТЗ | 3, 8 | 6, 3 | 8,8 | 11,3 | 0,8 | 0, 0 | 4,3 |
| MON- НТ4 | 0, 0 | 1,3 | 8,8 | 18,8 | 2,8 | 3,3 | 13, 8 |
| MON- НТ5 | 2,5 | 2,5 | 7,5 | 17,5 | 1,3 | 4,5 | 4,5 |
| MON- НТ6 | 0, 0 | 2,0 | 5,8 | 8, 8 | 0,0 | 1,3 | 2,8 |
| MON- НТ7 | 1,3 | 1,3 | 5,8 | 12,5 | 0,8 | 1,3 | 3,3 |
Таблица 15
| Стадия | 1х | 2х | 4х | 8х | 16х | 4х | 8х | 16х |
| роста | Клефоди | 2,4- | 2,4- | 2,4- | 2,4- | Квизало | Квизало | Квизало |
| V8 | ум | D | D | D | D | фоп | фоп | фоп |
| Контрол ь | 93,6 | 40,0 | 52,8 | 64,1 | 82,2 | 99, 5 | 99,5 | 99, 5 |
| MON- НТ55 | 93,3 | 16,3 | 28,8 | 36, 3 | 55,0 | 25,0 | 45,0 | 78,8 |
| MON- НТ55 | 93,3 | 14,4 | 20,0 | 39, 4 | 56,9 | 10, 0 | 31,3 | 41, 3 |
| MON- | 93,3 | 11,3 | 16,3 | 30, 0 | 47,5 | 3, 8 | 3,8 | 16, 3 |
- 24 035528
| НТ55 | ||||||||
| MON- НТ55 | 93,3 | 11,3 | 20,0 | 35,0 | 47,5 | 3, 8 | 20,0 | 38,8 |
| MON- НТ55 | 94,5 | 15,0 | 18,8 | 33, 8 | 57,5 | 4,3 | 5,0 | 18,8 |
| MON- НТ55 | 93,3 | нет дан- ных | нет дан- ных | нет дан ных | нет дан- ных | 2,5 | 6,3 | 18,8 |
| MON- НТ55 | 94,5 | 12,5 | 13,8 | 36, 3 | 52,5 | 2,0 | 5,5 | 11, 8 |
| MON-HT1 (нет ТПХ) | 94,5 | 2,5 | 4,0 | 8,8 | 13, 8 | 3,3 | 7,5 | 16, 3 |
| MON-HT1 | 93,3 | 1, 3 | 1,5 | 8.3 | 16, 3 | 2,0 | 2,0 | 5,5 |
| MON-HT2 (нет ТПХ) | 92,0 | 5, 0 | 8, 8 | 13, 8 | 25,0 | 16, 3 | 52,5 | 77,5 |
| MON-HT2 | 93,3 | 2,5 | 3,3 | 10, 0 | 15,0 | 2,5 | 3,8 | 4, 8 |
| MON-HT3 | 94,5 | 5,5 | 5,5 | 11,3 | 13, 8 | 2,5 | 2,0 | 6, 0 |
| MON-HT4 | 94,5 | 2, 0 | 8, 8 | 12,5 | 21,3 | 3,3 | 3,3 | 8,0 |
| MON-HT5 | 92,0 | 3, 3 | 4,0 | 10, 0 | 21,3 | 2,5 | 0,0 | 8,0 |
| MON-HT6 | 93,3 | 6, 3 | 4,3 | 11,3 | 12,5 | 1,3 | 2,0 | 5,0 |
| MON-HT7 | 93,3 | 2, 0 | 2,8 | 9,3 | 20, 0 | 1,5 | 0,8 | 5,5 |
Пример 5. Оценка влияния хлоропласт-нацеливающих пептидов на экспрессию оптимизированных сконструированных белков в кукурузе.
Для оценки различных хлоропласт-нацеливающих пептидов (ТПХ), были сконструированы векторы для трансформации растений, каждый из которых содержал рекомбинантную молекулу ДНК, оптимизированную для экспрессии в однодольных, и кодирующую MON-HT1 (SEQ ID NO: 16), MON-HT2 (SEQ ID NO: 20), MON-HT8 (SEQ ID NO: 39), MON-HT9 (SEQ ID NO: 42) или Mon-НПО (SEQ ID NO: 45). Векторы были созданы с применением той же комбинации промотора, лидера, интрона и 3'-UTR, но с одним из трех отдельных ТПХ (А, В или С) или без ТПХ, функционально связанного с белоккодирующей последовательностью. См. табл. 16. ДНК-конструкции применяли для трансформации незрелых эмбрионов кукурузы (LH244) с использованием Agrobacterium tumifaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные проростки выращивали в теплице. Растения R0 самоопыляли, чтобы получить R1 гомозиготные семена. Растения R0 также использовали в качестве особей мужского пола для скрещивания с инбредными растениями, содержащими трансгенную вставку кукурузы MON89034, чтобы получить семена сегрегирующего гибрида F1 для проведения полевых испытаний эффективности.
Полевые испытания эффективности отдельных признаков для квазилифопа-П и 2,4-D проводились в двух локациях, каждое с гомозиготными инбредными трансгенными растениями (поколения R2 или R4). В этих полевых испытаниях применялась одна из двух обработок гербицидом: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,16 фунта д.в./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. неионного поверхностно-активного вещества (НИПАВ), наносимых на стадии роста V4, после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; или (2) 2,4-D амин при 2 фунта к.э./акр (2Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимых на стадии роста V4, после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. Оценки повреждений (процент повреждений посевов на стадии роста V4 (ПППV4) или V8 (ПППV8)) были проведены через 10-14 дней после обработок на стадиях V4 и V8. Ошибка была рассчитана с использованием НДР (0,05). Результаты показали, что данные растения имели устойчивость к 2Х серийным обработкам либо квизалофопом-П, либо 2,4-D с оценкой повреждений ниже 10% после обработок на стадиях V4 и V8. См. табл. 16.
- 25 035528
Таблица 16
| 2Х квизалофоп-П | 2Х 2,4-D | ||||
| Белок | ТПХ | ΠΠΠΥ4 НДР (0, 05)=1,45 | πππνδ НДР (0,05)=2,2 | ПППУ4 НДР (0,05)= 0, 95 | πππνδ НДР (0,05)= 1, 6 |
| MON-HT1 | А | 0 | 2,125 | 0 | 2,5 |
| MON-HT1 | В | 0 | 1,75 | 0 | 1,25 |
| MON-HT1 | С | 0 | 1,75 | 1,25 | 1,25 |
| MON-HT1 | нет ТПХ | 0 | 1,25 | 0 | 1,25 |
| MON-HT2 | А | 0 | 1,875 | 0, 875 | 1,25 |
| MON-HT2 | В | 0 | 0 | 0 | 2,5 |
| MON-HT2 | С | 0 | 2 | 0 | 1,25 |
| MON-HT2 | нет ТПХ | 1,25 | 3,5 | 0 | 2,5 |
| MON-HT8 | А | 0 | 1,25 | 1,75 | 1,25 |
| MON-HT8 | В | 0,75 | 2,5 | 0 | 1,25 |
| MON-HT8 | С | 0 | 1,25 | 1,25 | 0 |
| MON-HT9 | А | 0 | 0 | 3,75 | 1,25 |
| MON- НТ10 | А | 0 | 0 | 0 | 1,25 |
Образцы листьев собирали с растении, содержащих трансгенные кассеты, кодирующие MON-HT1, MON-HT2 и MON-HT8 с последовательностями ТПХ и без них, чтобы определить экспрессию мРНК, транскрибированную из трансгенной кассеты, кодирующей сконструированные белки. Анализ Quantigene® проводили на экстрактах листьев для определения экспрессии мРНК трансгенной кассеты. Для этих анализов зонд был к общей последовательности 3'-UTR, присутствующей в каждой экспрессирующей кассете, используемой для получения трансгенных растений. Относительную экспрессию рассчитывали с помощью нормирования по генам домашнего хозяйства кукурузы. Образцы листьев собирали с каждого из восьми растений для каждой конфигурации конструкции, применяемой для получения трансгенных растений, а данные относительной экспрессии мРНК представляли собой среднее по восьми образцам со стандартной ошибкой.
Растения, содержащие трансгенную конструкцию, кодирующую либо MON-HT1 (SEQ ID NO: 14), либо MON-HT2 (SEQ ID NO: 18), имели более высокую относительную экспрессию трансгенной мРНК для конструкций, содержащих либо А, либо В ТПХ, чем для конструкций без ТПХ или с С ТПХ. Растения, содержащие трансгенную конструкцию, кодирующую MON-HT8 (SEQ ID NO: 37), имели аналогичную высокую относительную экспрессию трансгенной мРНК для конструкций, содержащих любой из трех ТПХ (А, В или С). См. табл. 17.
- 26 035528
Таблица 17
| MON-НТ вариант | ТПХ | Относительный уровень экспрессии | Стандартная ошибка |
| MON-HT1 | А | 7,80 | 1,20 |
| MON-HT1 | В | 5, 95 | 1, 63 |
| MON-HT1 | С | 3, 82 | 0,44 |
| MON-HT1 | нет ТПХ | 4,31 | 0, 68 |
| MON-HT2 | А | 6, 96 | 0, 66 |
| MON-HT2 | В | 6,16 | 0, 65 |
| MON-HT2 | С | 4,11 | 0,29 |
| MON-HT2 | нет ТПХ | 4, 66 | 0,45 |
| MON-HT8 | А | 8,06 | 0,48 |
| MON-HT8 | В | 7, 62 | 0,46 |
| MON-HT8 | С | 4,87 | 0,47 |
| Контроль LH244 | Нет | 0, 00 | 0, 00 |
Отдельные полевые испытания эффективности признака для скрининга под давлением квизалофопа-П и 2,4-D проводились в одной локации с трансгенными гибридными растениями F1, полученными путем скрещивания инбредного растения, содержащего трансгенную вставку кукурузы MON89034, с растением R1, содержащим MON-HT1, MON-HT2, MON-HT8, MON-HT9 и MON-HT10 с и без функционально связанных последовательностей ТПХ. Трансгенные гибридные растения F1, содержащие единичные трансгенные вставки кукурузы, NK603 х MON89034, применяли для сравнения в качестве контроля.
В полевом испытании эффективности устойчивости к квизалофопу-П применялась одна из трех обработок гербицидом: (1) квизалофоп-П (Assure II) при 0,32 фунта д.в./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4 и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; (2) квизалофоп-П при 0,64 фунта д.в./акр (8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадиях роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4 и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8; (3) квизалофоп-П при 1,28 фунта д.в./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, наносимые на стадии роста VE-V2, после чего следует такая же обработка на стадии роста V4 и после чего следует такая же обработка на стадии роста V8. Участки были визуально оценены, как указано выше. В табл. 18 приведены средние оценки повреждений после применения гербицидов на стадиях роста V4 (ПППВ4) или V8 (ПППВ8) соответственно. Оценки повреждений для контрольных растений после применения квизалофопа-П составили 100%. Ошибка была рассчитана с использованием НДР (0,05).
- 27 035528
Таблица 18
| 4Х квизалофоп-П | 8Х квизалофоп-П | 16Х квизалофоп- П | |||||
| MON-HT вариант | ТПХ | ПППУ4 НДР (0,05)= 1, 92 | ΠΠΠΥ8 НДР (0,05) =2,3 | ПППУ4 НДР (0,05)=4 , 7 | ΠΠΠΥ8 НДР (0,05) = 5,3 | ПППУ4 НДР (0,05)= 5,0 | ΠΠΠΥ8 НДР (0,05) = 5,4 |
| Нет | Нет | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| MON-HT1 | А | 0 | 7,5 | 2,5 | 10 | 5 | 15 |
| MON-HT1 | В | 2,5 | 5 | 2,5 | 7,5 | 2,5 | 20 |
| MON-HT1 | С | 0 | 5 | 2,5 | 10 | 5 | 20 |
| MON-HT1 | нет ТПХ | 2,5 | 10 | 10 | 22,5 | 22,5 | 37,5 |
| MON-HT2 | А | 0 | 5 | 2,5 | 7,5 | 5 | 15 |
| MON-HT2 | В | 0 | 5 | 0 | 10 | 0 | 20 |
| MON-HT2 | С | 0 | 5 | 5 | 12,5 | 12,5 | 20 |
| MON-HT2 | нет ТПХ | 35 | 45 | 50 | 37,5 | 70 | 55 |
| MON-HT8 | А | 15 | 15 | 37,5 | 35 | 60 | 50 |
| MON-HT8 | В | 5 | 7,5 | 32,5 | 35 | 27,5 | 30 |
| MON-HT8 | С | 55 | 45 | 75 | 55 | 85 | 72,5 |
| MON-HT9 | А | 0 | 5 | 2,5 | 15 | 7,5 | 20 |
| MON-HT10 | А | 0 | 5 | 2,5 | 10 | 5 | 21 |
Растения, содержащие MON-HT1 с любым из трех функционально связанных ТПХ (А, В или С), имели более высокую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие MON-HT1 без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие MON-HT1 с функционально связанным А ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 15% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MONHT1 с функционально связанным В ТПХ, имели оценку повреждений от 2,5 до 20% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT1 с функционально связанным С ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 20% при всех применениях квизалофопа-П по сравнению с растениями, содержащими MON-HT1 без функционально связанного ТПХ, которые имели оценку повреждений от 2,5 до 37,5% при всех применениях квизалофопа-П.
Растения, содержащие MON-HT2 с любым из трех функционально связанных ТПХ (А, В или С), имели более высокую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие MON-HT2 без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие MON-HT2 с функционально связанным А ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 15% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MONHT2 с функционально связанным В ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 20% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT2 с функционально связанным С ТПХ, имели оценку повреждений от 0 до 20% при всех применениях квизалофопа-П по сравнению с растениями, содержащими MON-HT2 без функционально связанного ТПХ, которые имели оценку повреждений от 35 до 70% при всех применениях квизалофопа-П.
Растения, содержащие MON-HT8 с функционально связанным А или В ТПХ, имели лучшую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие MON-HT8 с функционально связанным С ТПХ. Растения, содержащие MON-HT8 с функционально связанным А ТПХ, имели оценку повреждений от 15 до 60% при всех применениях квизалофопа-П. Растения, содержащие MON-HT8 с функционально связанным В ТПХ, имели оценку повреждений от 5 до 35% при всех применениях квизалофопа-П по сравнению с растениями, содержащими MON-HT8 с функционально связанным С ТПХ, которые имели оценку повреждений от 45 до 85% при всех применениях квизалофопа-П.
Растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с любым из трех функционально связанных ТПХ, и растения, содержащие MON-HT9 или MONOHT10 с функционально связанным А ТПХ, имели лучшую устойчивость к квизалофопу-П, чем растения, содержащие MON-HT8 с любым из трех функционально связанных ТПХ. Растения, содержащие MON-HT9 или MON-HT10 с функционально связанным А ТПХ, имели устойчивость к квизалофопу-П во всех обработках, что было сопоставимо с растениями, содержащими MON-HT1 или MON-HT2 с любым из трех функционально связанных ТПХ. При самой высокой норме обработке (16Х) квизалофопом, растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с функционально связанным А ТПХ, имели несколько более высокую устойчивость, чем растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2 с функционально связанным В или С ТПХ.
- 28 035528
В полевом испытании эффективности признака на устойчивость к 2,4-D применяли три обработки гербицидом: (1) 2,4-О-амин при 4 фунтах к.э./акр (4Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на VEV2, затем на V4 и затем на V8; (2) 2,4-О-амин при 8 фунтах к.э./акр (8Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на VE-V2, затем на V4 и затем на V8 кукурузы; (3) 2,4-О-амин при 16 фунтах к.э./акр (16Х) плюс 0,25% об./об. НИПАВ, применяемых на VE-V2, затем на V4 и затем на V8.Участки были визуально оценены, как указано выше.
В табл. 19 приведены средние оценки повреждений кукурузы после применения гербицида 2,4-D на стадиях роста V4 (ПППВ4) или V8 (ПППВ8) соответственно. Оценка повреждений для контрольных растений после применений 2,4-D составляла от 80 до 96,25%. При самой высокой норме 2,4-D 16х), применяемой в течении V8, растения, содержащие MON-HT1 или MON-HT2, функционально связанный с любым из трех ТПХ (А, В или С), имели лучшую устойчивость по сравнению с растениями, содержащими MON-HTI или MON-HT2, без функционально связанного ТПХ. Растения, содержащие MON-HT1, MONHT2 или MON-HT8 с или без функционально связанного ТПХ, имели лучшую устойчивость к 2,4-D во всех применениях, чем растения, содержащие или MON-HT9 или MON-HT10 без функционально связанного ТПХ А. В диапазоне применений 2,4-D относительный рейтинг устойчивости был следующим: растения, содержащие MON-HT1, имеют лучшую устойчивость, чем растения, содержащие MON-HT2, которые, в свою очередь, имели лучшую устойчивость, чем растения, содержащие MON-HT8. В соответствии с данными испытания давления квизалофопа-П растения, содержащие MON-HT1, MON-HT2 или MON-HT8, функционально связанные с А ТПХ, продемонстрировали небольшое математическое, но не статистически значимое преимущество над В и С транзитным пептидом. Ошибка была рассчитана с использованием НДР (0,05).
Таблица 19
| 4Х 2,4-D | 8Х 2,4-D | 16Х 2,4-D | |||||
| MON-HT вариан т | ТПХ | ПППУ4 НДР (0,05) = 3,4 | πππνδ НДР (0,05)= 3,33 | ΠΠΠΥ4 НДР (0,05) =2,1 | πππνδ НДР (0,05) = 3, 5 | ПППУ4 НДР (0,05) = 3,4 | πππνδ НДР (0,05) = 3,5 |
| Нет Контро ль | Нет | 80 | 88,75 | 82,5 | 95 | 87,5 | 96, 25 |
| MON- HTI | A | 5 | 5 | 5 | 10 | 7,5 | 15 |
| MON- HTI | В | 5 | 5 | 5 | 10 | 10 | 15 |
| MON- HTI | C | 5 | 5 | 5 | 10 | 10 | 17,5 |
| MON- HTI | нет ТИХ | 5 | 5 | 7,5 | 10 | 10 | 22,5 |
| MON- HT2 | A | 5 | 5 | 10 | 7,5 | 10 | 20 |
| MON- HT2 | В | 5 | 5 | 5 | 10 | 10 | 25 |
| MON- HT2 | С | 10 | 15 | 10 | 10 | 15 | 20 |
| MON- HT2 | нет ТПХ | 7,5 | 7,5 | 17,5 | 42,5 | 25 | 45 |
| MON- HT8 | А | 7,5 | 5 | 10 | 12,5 | 15 | 30 |
| MON- HT8 | В | 5 | 7,5 | 10 | 27,5 | 10 | 20 |
- 29 035528
| MON- НТ8 | С | 10 | 7,5 | 10 | 17,5 | 17,5 | 25 |
| MON- НТ9 | А | 17,5 | 55 | 25 | 75 | 45 | 90 |
| MON- Т10 | А | 32,5 | 70 | 55 | 87,5 | 45 | 90 |
Пример 6. Экспрессия оптимизированных сконструированных белков в сое.
Два сконструированных белка были отобраны для анализа в трансгенной сое. Были получены ДНКконструкции для экспрессии MON-HT1 (SEQ ID NO: 14) и MON-HT2 (SEQ ID NO: 18) с применением кодонов, оптимизированных для экспрессии в двудольных, с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Энхансеры, промоторы, лидеры, интроны, ТПХ и 3'-UTR в различных комбинациях были функционально связаны с сконструированными белками в данных ДНКконструкциях. ДНК-конструкции применяли для трансформации сои с использованием Agrobacterium tumifaciens и стандартных способов, известных в данной области техники. Регенерированные R0 трансгенные проростки выращивали в теплице. Примерно через 9 недель после трансформации на стадии 1-2 тройных листа были идентифицированы единичные R0-трансформанты, и их опрыскивали гербицидом 2,4-D в норме 0,5Х (0,375 фунта к.э./акр), 2Х (1,5 фунта к.э./акр) или 4Х (3,0 фунта к.э./акр). Примерно через 2 недели после применения гербицидов растения были оценены по степени повреждения гербицидом по шкале от 1 до 3, где 1 = незначительное или полное отсутствие повреждений (<20%), 2 = умеренные повреждения (20-50%) и 3 = тяжелые повреждения (>50%).
Растения сои R0, содержащие каждую из конструкций, проявили устойчивость к 2,4-D с незначительными или отсутствующими повреждениями (<20% повреждений) или умеренными повреждениями (20-50%). Данные приведены в табл. 20. Это указывает на то, что сконструированные белки MON-HT1 и MON-HT2 могут давать устойчивость к 2,4-D в растениях сои.
Таблица 20
| Белок | ТПХ | норма 2,4-D | Трансфер манты с единичной копией трансгена | Трансфор манты с повреж дениями <20% | Трансфор манты с повреж дениями 2050% | Трансфор манты с повреж дениями >50% |
| MON-HT1 | Нет | 0,5Х | 130 | 120 | 10 | 0 |
| MON-HT1 | Нет | 2Х | 36 | 6 | 30 | 0 |
| MON-HT1 | Да | 2Х | 136 | 101 | 35 | 0 |
| MON-HT2 | Нет | 0,5Х | 22 | 3 | 19 | 0 |
| MON-HT1 | Да | 4Х | 11 | 5 | 6 | 0 |
Дополнительные пять сконструированных белков, оптимизированных для расщепления 2,4-D, затем были отобраны для анализа в трансгенной сое. Для экспрессии MON-HT13 (SEQ ID NO: 47), MONHT14 (SEQ ID NO: 48), MON-HT15 (SEQ ID NO: 49), MON-HT17 (SEQ ID NO: 51) И MON-HT18 (SEQ ID NO: 52) создавали ДНК-конструкции с кодонами, оптимизированными для экспрессии в двудольных. Функционально связанные элементы экспрессии (промотор, лидер, интрон, ТПХ и 3'-UTR) были идентичны во всех конструкциях. Образцы листьев брали из ростков R0, и растения с одиночной копией трансгена идентифицировали с применением ПЦР-анализа. Когда растения R0 с единичной копией трансгена имели примерно 2-3 тройных листа, их обрабатывали либо 1,5 фунта к.э./акр (2Х), либо 3,0 фунта к.э./акр (4Х) 2,4-D. Через семь дней после нанесения гербицида растения оценивали по повреждениям гербицидом в зависимости от процентной площади растения, показывающей повреждение, как ука зано выше.
При норме нанесения 2Х растения сои, содержащие любой из шести вариантов MON-HT (MONHT1, MON-HT13, MON-HT14, MON-HT15, MON-HT17 и MON-HT18), продемонстрировали отличную устойчивость к обработке 2,4-D, о чем свидетельствуют все, кроме двух, растения с единственной копией трансгена, имеющие оценку повреждений менее 20%; эти два трансформанта (одно с MON-HT13 и одно с MON-HT18) имели оценку повреждений 20-30%. При 4Х норме из одиннадцати растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT1, у пяти растений оценка повреждений составила <20%, а у шести растений оценка повреждений составила 20-50%. Из одиннадцати растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT13, десять растений имели оценку повреждений <20% и одно растение имело оценку повреждений 20-50%. Из восьми растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT14, шесть растений имели оценку повреждений <20%, одно растение имело оценку повреждений 20-50% и одно растение имело оценку повреждений >50%. Из семи растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT15, пять растений имели оценку повреждений <20%, одно растение имело оценку повреждений 20-50% и одно растение имело оценку повреждений >50%. Из одинна
- 30 035528 дцати растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT17, все одиннадцать имели оценку повреждений <20%. Из двенадцати растений с единственной копией трансгена, содержащих MON-HT18, девять растений имели оценку повреждений <20% и три растения имели оценку повреждений 20-50%. Эти результаты показывают, что растения сои, содержащие MON-HT1 (SEQ ID NO: 14), MON-HT13 (SEQ ID NO: 47), MON-HT14 (SEQ ID NO: 48), MON-HT15 (SEQ ID NO: 49), MON-HT17 (SEQ ID NO: 51) или MON-HT18 (SEQ ID NO: 52), обладают устойчивостью к 2,4-D при норме обработки 4Х. Кроме того, это демонстрирует, что растения сои, содержащие MON-HT13 (SEQ ID NO: 47), MON-HT14 (SEQ ID NO: 48), MON-HT15 (SEQ ID NO: 49), MON-HT17 (SEQ ID NO: 51), или MON-HT18 (SEQ ID NO: 52), обладают улучшенной устойчивостью к 2,4-D при норме применения 4Х по сравнению с MON-HT1 (SEQ ID NO: 14). Исходя из процента растений с единственной копией трансгена с оценкой повреждений менее 20%, растения сои, содержащие либо MON-HT13, либо MON-HT17, имеют лучшую устойчивость к 2,4-D, применяемого в 4Х норме, по сравнению с растениями сои, содержащими MONHT1, MON-HT14, MON-HT15 или MON-HT18. См. табл. 21.
Таблица 21
| MON-HT | SEQ ID NO | норма 2,4-D | Трансфор манты с единичной копией трансгена | Трансфор манты с повреж дениями <20% | Трансфор манты с повреж дениями 2050% | Трансфор манты с повреж дениями >50% |
| MON-HT1 | 14 | 2Х | 12 | 12 | -- | -- |
| MON-HT13 | 47 | 2Х | 13 | 12 | 1 | -- |
| MON-HT14 | 48 | 2Х | 9 | 9 | — | — |
| MON-HT15 | 49 | 2Х | 5 | 5 | -- | -- |
| MON-HT17 | 51 | 2Х | 12 | 12 | -- | -- |
| MON-HT18 | 52 | 2Х | 12 | 11 | 1 | -- |
| MON-HT1 | 14 | 4Х | 11 | 5 | 6 | -- |
| MON-HT13 | 47 | 4Х | 11 | 10 | 1 | -- |
| MON-HT14 | 48 | 4Х | 8 | 6 | 1 | 1 |
| MON-HT15 | 49 | 4Х | 7 | 5 | 1 | 1 |
| MON-HT17 | 51 | 4Х | 11 | 11 | -- | -- |
| MON-HT18 | 52 | 4Х | 12 | 9 | 3 | -- |
Пример 7. Устойчивость к синтетическим ауксинам-гербицидам флюроксипиру, трайклопиру и МХФУ.
Определяли устойчивость кукурузы и растений сои, содержащих MON-HT1, к обработке 2,4-D, флюроксипиром, триклопиром и МХФУ. Семена F1 гибридов кукурузы трех уникальных трансформантов, содержащих MON-HT1 с А ТПХ, и семена сои R2 были посажены в горшки. Семена гибридной кукурузы, содержащие NK603 х MON89034, и ту же самую соевую зародышевую плазму, которая применялась для трансформации растений, использовали в качестве контроля. Растения выращивали в теплице, и для каждой обработки использовали четыре растения. Растения опрыскивали гербицидом в климатической камере, когда растения были высотой между 6-8 дюймами (соя) и 10-12 дюймами (кукуруза), затем переносили в теплицу, запрограммированную для поддержания оптимальных условий роста.
Для сои использовали норму применения гербицида 2Х каждого из последующих компонентов: (1) 2,4-D амин 4 (1680 талонов к.э./гектар) (2) триклопир (840 талонов к.э./гектар, GARLON®); (3) флуроксипир (840 талонов к.э./гектар, Starane®); или (4) МХФУ (талонов к.э./гектар 1680). После применения триклопира, флуроксипира или МПКТ, основной симптоматикой на сое был тяжелый некроз и эпинастия. Оценки визуальных повреждений растений были сделаны для всех обработок по шкале оценки от 0 до 100%, где 0% представляли растения, эквивалентные необработанному контролю, и 100% представляли растения, которые были полностью мертвы. Все оценки были сделаны через семь дней после обработки. Все три трансформанта сои MON-HT1 показали хорошую устойчивость к 2,4-D амину (2,4-D) в среднем с менее чем 7% повреждений посевов по сравнению с контрольной группой с 90-97% повреждений посевов. Ни один трансформант сои не продемонстрировал устойчивости к триклопиру или флюроксипиру, при этом оценки повреждений во всех трех случаях в среднем составляли 81-97% посевов по сравнению с контрольной группой с 91% повреждений посевов. Один из трех трансформантов сои продемонстрировал низкий уровень устойчивости к МФХУ со средней оценкой повреждений 72%, тогда как два других трансформанты имели повреждения посевов, равные 90% по сравнению с контрольной группой с 90% повреждений. См. табл. 22.
- 31 035528
Таблица 22
| Среднее повреждения % посевов сои для 4 образцов | ||||||
| Обработ ка | Гербицид | 2Х норма (галлон к. э . / гектар) | MON-HT1 Трансфор мант 1 | MON-HT1 Трансфо рмант 2 | MON-HT1 Трансфор мант 3 | Контро ль |
| 1 | 2,4-D амин | 1680 | 4,5 | 6, 5 | 5,3 | 90,0 |
| 2 | триклопир | 840 | 81,3 | 90,0 | 90,0 | 91,3 |
| 3 | флуроксипир | 840 | 96,3 | 93,8 | 97,5 | 91,3 |
| 4 | МХФУ | 1680 | 90,0 | 90,0 | 72,5 | 90,0 |
| 5 | Контроля | 0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
Для кукурузы использовали норму применения гербицида 4Х каждого из последующих компонентов: (1) 2,4-D амин 4 (3360 талонов к.э./гектар); (2) триклопир (1680 талонов к.э./гектар, GARLON®); (3) флуроксипир (1680 талонов к.э./гектар, Starane®); или (4) МХФУ (талонов к.э./гектар 3360). После обработки кукурузы триклопиром, флуроксипиром или МХФУ основной симптоматикой было полегание. Все три трансформанта кукурузы MON-HT1 показали хорошую устойчивость к 2,4-D амину (2,4-D) в среднем с менее чем 15% повреждений посевов по сравнению с контрольной группой с 43% повреждений посевов. Три трансформанта кукурузы MON-HT1, по-видимому, демонстрируют несколько низкую устойчивость к триклопиру с повреждениями посевов, в среднем равными 26-37% по сравнению с контрольной группой с 47% повреждений посевов. Три трансформанта кукурузы MON-HT1, по-видимому, демонстрируют несколько низкую устойчивость к флуроксипиру с повреждениями посевов, в среднем равными 20-21% по сравнению с контрольной группой с 55% повреждений посевов. Два трансформанта кукурузы MON-HT1 продемонстрировали хорошую устойчивость к МХФУ со средним повреждением посевов, равным менее чем 6% по сравнению с контрольной группой с 31% повреждением посевов. Третий трансформант кукурузы MON-HT1 имел среднюю оценку повреждений равную 20%. См. табл. 23. Эти результаты низкой устойчивости к триклопиру и флуроксипиру и хорошей устойчивости к МХФУ согласуются с ферментативными данными in vitro с очищенным ферментом MON-HT1.
Таблица 23
Среднее повреждения % посевов кукурузы для образцов
| Обработ ки | Гербицид | 4Х норма (галлон к. э . / гектар) | MON-HT1 Трансфор мант 1 | MON-HT1 Трансфор мант 2 | MON-HT1 Трансфор мант 3 | LH244 |
| 1 | 2,4-D амин | 3360 | 5,8 | 15, 0 | 5,3 | 43, 8 |
| 2 | триклопир | 1680 | 26,3 | 37,5 | 35,0 | 47,5 |
| 3 | флуроксипир | 1680 | 20,0 | 20, 0 | 21,3 | 55, 0 |
| 4 | МХФУ | 3360 | 3,8 | 5, 0 | 20,0 | 31,3 |
| 5 | Контроли | 0 | 0,0 | 0, 0 | 0, 0 | 0,0 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (29)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантная молекула ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 92% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 или 46-52, где указанный полипептид обладает оксигеназной активностью в отношении по меньшей мере одного гербицида, выбранного из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 2. Рекомбинантная молекула ДНК по п.1, отличающаяся тем, что нуклеотидную последовательность выбирают из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 или 53-59.
- 3. Рекомбинантная молекула ДНК по п.1, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула ДНК функционально связана с гетерологичным промотором, функциональным в растительной клетке.
- 4. Рекомбинантная молекула ДНК по п.3, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула ДНК дополнительно функционально связана с молекулой ДНК, кодирующей транзитный пептид хлоропласта.
- 5. ДНК-конструкция, содержащая гетерологичный промотор, функциональный в растительной клетке, функционально связанный с рекомбинантной молекулой ДНК по п.1.- 32 035528
- 6. ДНК-конструкция по п.5, дополнительно содержащая молекулу ДНК, кодирующую транзитный пептид хлоропласта, функционально связанную с рекомбинантной молекулой ДНК.
- 7. ДНК-конструкция по п.5, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14,18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 или 46-52.
- 8. ДНК-конструкция по п.5, отличающаяся тем, что ДНК-конструкция была введена в геном трансгенного растения.
- 9. Растение, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК по п.1, обладающее устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 10. Семя, содержащее рекомбинантную молекулу ДНК по п.1, обладающее устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 11. Растительная ткань, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК по п.1, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 12. Часть растения, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК по п.1, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 13. Клетка растения, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК по п.1, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 14. Растение, содержащее ДНК-конструкцию по п.5, где указанное растение обладает устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 15. Семя, содержащее ДНК-конструкцию по п.5, обладающее устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 16. Растительная ткань, содержащая ДНК-конструкцию по п.5, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 17. Часть растения, содержащая ДНК-конструкцию по п.5, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 18. Клетка растения, содержащая ДНК-конструкцию по п.5, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 19. Растение, содержащее полипептид, который кодируется рекомбинантной молекулой ДНК по п.1, обладающее устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 20. Семя, содержащее полипептид, который кодируется рекомбинантной молекулой ДНК по п.1, обладающее устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 21. Растительная ткань, содержащая полипептид, который кодируется рекомбинантной молекулой ДНК по п.1, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 22. Часть растения, содержащая полипептид, который кодируется рекомбинантной молекулой ДНК по п.1, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 23. Клетка растения, содержащая полипептид, который кодируется рекомбинантной молекулой ДНК по п.1, обладающая устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 24. Полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 92% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 или 46-52, где указанный полипептид обладает оксигеназной активностью в отношении по меньшей мере одного гербицида, выбранного из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 25. Способ придания растению, семени, клетке или части растения устойчивости к гербициду, включающий введение молекулы ДНК по п.1 в растение, семя, клетку или часть растения, где указанная устойчивость к гербициду включает устойчивость по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из- 33 035528 гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 26. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанное растение, семя, клетка или часть растения содержит ДНК-конструкцию по п.5.
- 27. Способ по п.25, отличающийся тем, что молекула ДНК придает растению, семени, клетке или части растения устойчивость по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе арилоксифеноксипропионата (АОФП), гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 28. Способ получения устойчивого к гербицидам трансгенного растения, включающий стадию, в которой трансформируют растительную клетку или ткань рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей иза) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 или 46-52;б) нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 или 53-59; ив) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 92% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 или 46-52, и способный придать трансгенному растению устойчивость к гербициду;и регенерацию трансгенного растения из трансформированной растительной клетки или ткани, где указанное трансгенное растение обладает устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот или гербицидов на основе пиридинилоксикислот.
- 29. Способ борьбы с сорняками на участке произрастания растений, включающий нанесение по меньшей мере одного гербицида, выбранного из гербицидов на основе АОФП, гербицидов на основе феноксикислот и гербицидов на основе пиридинилоксикислот, на указанный участок, содержащий растение или семя, обладающее рекомбинантной молекулой ДНК, нуклеотидная последовательность которой кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 92% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 или 46-52, причем растение или семя устойчиво по меньшей мере к одному указанному гербициду.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462064343P | 2014-10-15 | 2014-10-15 | |
| PCT/US2015/053123 WO2016060843A1 (en) | 2014-10-15 | 2015-09-30 | Herbicide tolerance genes and methods of use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201790841A1 EA201790841A1 (ru) | 2017-08-31 |
| EA035528B1 true EA035528B1 (ru) | 2020-06-30 |
Family
ID=55747123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790841A EA035528B1 (ru) | 2014-10-15 | 2015-09-30 | Гены устойчивости к гербицидам и способы их применения |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US10023874B2 (ru) |
| EP (2) | EP3206481B1 (ru) |
| JP (2) | JP6938373B2 (ru) |
| KR (1) | KR102450075B1 (ru) |
| CN (2) | CN113528473A (ru) |
| AP (1) | AP2017009831A0 (ru) |
| AR (2) | AR102137A1 (ru) |
| AU (1) | AU2015333935B2 (ru) |
| BR (1) | BR112017006910A2 (ru) |
| CA (1) | CA2963122A1 (ru) |
| CL (3) | CL2017000894A1 (ru) |
| CO (1) | CO2017003474A2 (ru) |
| DK (1) | DK3837970T3 (ru) |
| EA (1) | EA035528B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP17022171A (ru) |
| ES (2) | ES2956861T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20220569T1 (ru) |
| HU (1) | HUE058705T2 (ru) |
| MX (1) | MX368974B (ru) |
| PE (2) | PE20220012A1 (ru) |
| PH (1) | PH12017500695A1 (ru) |
| PL (1) | PL3206481T3 (ru) |
| PT (2) | PT3837970T (ru) |
| RS (1) | RS63232B1 (ru) |
| UA (1) | UA125280C2 (ru) |
| UY (1) | UY36337A (ru) |
| WO (1) | WO2016060843A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201701967B (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI2319932T2 (sl) * | 2004-04-30 | 2017-02-28 | Dow Agrosciences Llc | Nov gen z rezistenco na herbicide |
| PL1947926T3 (pl) | 2005-10-28 | 2015-08-31 | Dow Agrosciences Llc | Nowe geny odporności na herbicydy |
| EP3206481B1 (en) * | 2014-10-15 | 2022-03-09 | Monsanto Technology LLC | Herbicide tolerance genes and methods of use thereof |
| UA124660C2 (uk) | 2018-02-02 | 2021-10-20 | Монсанто Текнолоджі Елелсі | Об'єкт кукурудзи mon87429 і спосіб його використання |
| CN116694654A (zh) * | 2022-02-25 | 2023-09-05 | 青岛清原种子科学有限公司 | 除草剂耐受性基因及其使用方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005107437A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-17 | Dow Agrosciences Llc | Novel herbicide resistance genes |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR006928A1 (es) | 1996-05-01 | 1999-09-29 | Pioneer Hi Bred Int | Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas. |
| CN1360634A (zh) * | 1999-04-29 | 2002-07-24 | 辛甄塔有限公司 | 抗除草剂植物 |
| US6252148B1 (en) | 1999-12-06 | 2001-06-26 | Holden's Foundation Seeds Llc | Inbred corn line LH244 |
| BRPI0100752B1 (pt) | 2000-06-22 | 2015-10-13 | Monsanto Co | moléculas e pares de moléculas de dna, processos para detectar molécula de dna e para criar um traço tolerante a glifosato em plantas de milho, bem como kit de detecção de dna |
| EP2021476B1 (en) | 2006-05-26 | 2014-07-09 | Monsanto Technology, LLC | Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof |
| US7700846B2 (en) | 2008-05-07 | 2010-04-20 | Monsanto Technology Llc | Soybean variety D5245143 |
| WO2011022470A1 (en) * | 2009-08-19 | 2011-02-24 | Dow Agrosciences Llc | Control of aad-1 monocot volunteers in fields of dicot crops |
| CN102573452B (zh) * | 2009-08-19 | 2015-07-22 | 陶氏益农公司 | Aad-1事件das-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定 |
| US8598413B2 (en) | 2009-08-19 | 2013-12-03 | Dow AgroSciecnes, LLC. | AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines, event-specific identification thereof, and methods of weed control involving AAD-1 |
| US8993837B2 (en) * | 2010-08-13 | 2015-03-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Chimeric promoters and methods of use |
| UY34014A (es) | 2011-04-15 | 2012-11-30 | Dow Agrosciences Llc | Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones |
| US9540654B2 (en) | 2012-02-01 | 2017-01-10 | Dow Agrosciences Llc | Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides |
| EP3206481B1 (en) * | 2014-10-15 | 2022-03-09 | Monsanto Technology LLC | Herbicide tolerance genes and methods of use thereof |
-
2015
- 2015-09-30 EP EP15850754.1A patent/EP3206481B1/en active Active
- 2015-09-30 UA UAA201704604A patent/UA125280C2/uk unknown
- 2015-09-30 KR KR1020177012639A patent/KR102450075B1/ko active IP Right Grant
- 2015-09-30 WO PCT/US2015/053123 patent/WO2016060843A1/en active Application Filing
- 2015-09-30 EP EP20211532.5A patent/EP3837970B1/en active Active
- 2015-09-30 UY UY0001036337A patent/UY36337A/es active IP Right Grant
- 2015-09-30 AR ARP150103154A patent/AR102137A1/es unknown
- 2015-09-30 AU AU2015333935A patent/AU2015333935B2/en active Active
- 2015-09-30 ES ES20211532T patent/ES2956861T3/es active Active
- 2015-09-30 PE PE2021002214A patent/PE20220012A1/es unknown
- 2015-09-30 HU HUE15850754A patent/HUE058705T2/hu unknown
- 2015-09-30 MX MX2017004926A patent/MX368974B/es active IP Right Grant
- 2015-09-30 US US14/871,768 patent/US10023874B2/en active Active
- 2015-09-30 ES ES15850754T patent/ES2914178T3/es active Active
- 2015-09-30 PT PT202115325T patent/PT3837970T/pt unknown
- 2015-09-30 EA EA201790841A patent/EA035528B1/ru unknown
- 2015-09-30 HR HRP20220569TT patent/HRP20220569T1/hr unknown
- 2015-09-30 AP AP2017009831A patent/AP2017009831A0/en unknown
- 2015-09-30 PL PL15850754.1T patent/PL3206481T3/pl unknown
- 2015-09-30 CA CA2963122A patent/CA2963122A1/en active Pending
- 2015-09-30 CN CN202110790369.7A patent/CN113528473A/zh active Pending
- 2015-09-30 RS RS20220485A patent/RS63232B1/sr unknown
- 2015-09-30 DK DK20211532.5T patent/DK3837970T3/da active
- 2015-09-30 BR BR112017006910A patent/BR112017006910A2/pt active IP Right Grant
- 2015-09-30 CN CN201580055796.3A patent/CN106793761B/zh active Active
- 2015-09-30 PT PT158507541T patent/PT3206481T/pt unknown
- 2015-09-30 JP JP2017519668A patent/JP6938373B2/ja active Active
- 2015-09-30 PE PE2017000606A patent/PE20170941A1/es unknown
-
2017
- 2017-03-22 ZA ZA2017/01967A patent/ZA201701967B/en unknown
- 2017-04-10 CO CONC2017/0003474A patent/CO2017003474A2/es unknown
- 2017-04-11 EC ECIEPI201722171A patent/ECSP17022171A/es unknown
- 2017-04-11 CL CL2017000894A patent/CL2017000894A1/es unknown
- 2017-04-11 PH PH12017500695A patent/PH12017500695A1/en unknown
-
2018
- 2018-06-22 US US16/016,364 patent/US10900050B2/en active Active
- 2018-08-23 CL CL2018002407A patent/CL2018002407A1/es unknown
- 2018-08-23 CL CL2018002406A patent/CL2018002406A1/es unknown
-
2020
- 2020-09-28 AR ARP200102685A patent/AR120102A2/es unknown
-
2021
- 2021-01-15 US US17/150,604 patent/US11655480B2/en active Active
- 2021-06-08 JP JP2021096096A patent/JP7295163B2/ja active Active
-
2023
- 2023-04-14 US US18/301,106 patent/US20230416773A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005107437A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-17 | Dow Agrosciences Llc | Novel herbicide resistance genes |
| US20110124503A1 (en) * | 2004-04-30 | 2011-05-26 | Dow Agrosciences Llc | Novel herbicide resistance genes |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MULLER, T.A. et al. Genetic Analysis Of Phenoxyalkanoic Acid Degradation In Sphingomonas herbicidovorans MH. Appl Environ Microbiol. October 2004, Vol. 70, No. 10; pages 6066-6075; DOI: 10.1120/ACM.70.10.0000-0075.2004 * |
| SCHLEINITZ, K.M. et al. Localization And Characterization Of Two Novel Genes Encoding Stereospecific Dioxygenases Catalyzing 2-(2,4-Dichlorophenoxy)Propionate Cleavage In Delftia Acidovorans MC1. Appl Environ Microbiol. September 2004, Vol. 70, No. 9; pages 5357-5365; first Genbank reference, pages 1-2; second Genbank Supplement, pages 1-4; DOI: 10.1128/AEM.70.9.5357-5365.2004 * |
| WRIGHT, T.R. et al. Robust Crop Resistance To Broadleaf And Grass Herbicides Provided By Aryloxyalkanoate Dioxygenase Transgenes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 23 November 2010, Vol. 107, No. 47; pages 20240-20245; DOI: 10.1073/pnas.1013154107 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7344933B2 (ja) | 植物における除草剤耐容性のための方法及び組成物 | |
| EP2451946B1 (en) | Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use | |
| US11655480B2 (en) | Herbicide tolerance genes and methods of use thereof | |
| CA2995275C (en) | Methods and compositions for herbicide tolerance in plants | |
| CA2686835C (en) | Novel herbicide resistance genes | |
| JP7118047B2 (ja) | 植物における遺伝子発現のための方法及び組成物 | |
| TR201816453T4 (tr) | İmidazolinon herbisitlerine karşi direnci arttirilmiş buğday bitkileri. | |
| Yang et al. | Modifying Myxococcus xanthus protoporphyrinogen oxidase to plant codon usage and high level of oxyfluorfen resistance in transgenic rice | |
| WO2023160362A1 (zh) | 除草剂耐受性基因及其使用方法 | |
| RU2797237C2 (ru) | Способы и композиции для ppo-гербицидной толерантности | |
| WO2023150754A2 (en) | Triketone dioxygenase variants for herbicide tolerance | |
| EA046522B1 (ru) | Растения, имеющие повышенную толерантность к гербицидам |