JP7344933B2 - 植物における除草剤耐容性のための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年8月3日に出願された米国仮特許出願第62/200,428号
の優先権の利益を主張し、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
69.4KB(MS-WINDOWSでの計測)の2016年7月27日に作成された
MONS383WO_ST25.txtという名称のファイルに含まれた配列表は、電子
申請により本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、プロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼを阻害する除草剤への耐容性をもたらす酵素をコードする
、組み換えDNA分子に関する。
農業作物生産ではしばしば、バイオテクノロジーの方法を用いて作られたトランスジェ
ニック形質が利用される。異種遺伝子(導入遺伝子としても知られる)は、トランスジェ
ニック形質を生成するために植物に導入することができる。植物での導入遺伝子の発現に
より、植物に除草剤耐容性などの形質が付与される。トランスジェニック除草剤耐容性形
質の例としては、グリホサート耐容性、グルホシネート耐容性、及びジカンバ耐容性が挙
げられる。一般的に使用されている除草剤への耐性を有する雑草種の増加に伴い、新たな
除草剤耐容性形質が当技術分野で必要とされている。特に目的となる除草剤としては、プ
ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPO)を阻害する除草剤(PPO除草剤と称さ
れる)が挙げられる。PPO除草剤は様々な除草剤耐性雑草の防除を提供するため、これ
らの除草剤への耐容性を付与する形質は、1つ以上の他の除草剤耐容性(複数可)と組み
合わせた栽培体系においてとりわけ有用になる。
能し、プロトポルフィリノーゲンIXをプロトポルフィリンIXに変換する。プロトポル
フィリンIX生成の後、クロロフィル及びヘム生合成経路は異なる金属イオン(ヘムは鉄
、クロロフィルはマグネシウム)を取り込んで分岐する。この経路のセグメントは原核生
物及び真核生物にまたがって保存されており、原核生物及び真核生物にまたがって見いだ
される多くのPPO酵素は比較的類似している。一部の原核生物(例えば、ラン藻類)は
この経路をクロロフィル及びヘム生成に使用し、一方他の原核生物(例えば、Esche
richia coli)はこの経路をヘム生成に使用する。
ゼ(「iPPO」)が単離されている。構造に基づくと、次に挙げる、少なくとも3種の
異なるPPO酵素のサブクラスが存在すると考えられている:HemY(Hansson
and Hederstedt,“Cloning and characteriz
ation of the Bacillus subtilis hemEHY ge
ne cluster,which encodes protoheme IX bi
osynthetic enzymes”Journal of Bacteriolo
gy 174(24):8081-8093(1992))、HemG(Sasarma
n,et al.,“Mapping of a new hem gene in E
scherichia coli K12”Microbiology 113:297
-303(1979))、及びHemJ(Boynton,et al.,“Disco
very of a gene involved in a third bacte
rial protoporphyrinogen oxidase activity
through comparative genomic analysis an
d functional complementation”Applied and
Environmental Microbiology 77(14):4795-
4801(2011))。本発明は、HemGファミリーのメンバーである新規の組み換
えiPPOを提供する。20年にわたる研究及びこれまでに同定されたiPPOの数にも
かかわらず、組み換えiPPOを含むトランスジェニック作物植物はまだ商品化されてい
ない。強力な雑草防除プラットフォームは、部分的には、除草剤耐容性形質パッケージの
継続的な開発に依存している。そのため、iPPOを同定し利用してトランスジェニック
作物形質を創生することは農業の進歩を意味する。
少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能に
連結した異種プロモーターを含む組み換えDNA分子であって、当該ポリペプチドが除草
剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、組み換えDNA分子を
提供する。ある特定の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号1~20の中から選
択されるポリペプチドに対し、少なくとも約85%の配列同一性、少なくとも約90%の
配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくと
も97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列
同一性を有し、かつ除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する
。一部の実施形態では、核酸配列が配列番号22~63からなる群から選択される組み換
えDNA分子が提供される。特定の実施形態では、当該組み換えDNA分子は、配列番号
1~20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。その
ため、本発明により、配列番号1~20の中から選択される全長のアミノ酸配列に対する
少なくとも85%の配列同一性を備える組み換えポリペプチドであって、除草剤不感受性
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、組み換えポリペプチドが提供され
る。
ーは、本発明のポリペプチド配列、例えば配列番号1~20から選択されるポリペプチド
配列に対し、少なくとも85%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
に、作用可能に連結しており、当該ポリペプチドは除草剤不感受性プロトポルフィリノー
ゲンオキシダーゼ活性を有する。得られたこのようなDNA分子は、当該ポリペプチドを
細胞内に局在化するように機能する標的配列をさらに含むことができる。
を提供する。一実施形態では、このようなDNAコンストラクトは、本発明の核酸配列へ
の作用可能な連結において、当該ポリペプチドを細胞内に局在化するように機能する標的
配列を含む。当該DNA分子は、トランスジェニック植物、種子、または細胞のゲノム中
に存在し得る。ある特定の実施形態では、当該ポリペプチドは、細胞、植物、種子、また
は植物部分に除草剤耐容性を付与する。
チドを含むトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分が提供される。そのた
め、当該トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、少なくとも1種のP
PO除草剤への除草剤耐容性を備え、すなわちそれを示す。一部の実施形態では、当該ト
ランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分は、追加のトランスジェニック除草
剤耐容性形質を備える。
方法であって、当該植物、種子、細胞、または植物部分において本発明の組み換えポリペ
プチドを異種発現させることを含む、方法が提供される。当該方法における一部の実施形
態では、当該植物、種子、細胞、または植物部分は、当該組み換えポリペプチドによって
付与されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を備える。一部の実施形態では、
当該除草剤耐容性は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリ
コフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフ
ェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メチル、オキサジアルギ
ル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、及びS-3100か
らなる群から選択される、少なくとも1種のPPO除草剤に対するものである。
を植物細胞に導入するステップと、b)そこから当該組み換えDNA分子を含むトランス
ジェニック植物を再生するステップと、を含む方法に関する。当該方法は、少なくとも1
種のPPO除草剤に耐容性である植物を選択するステップをさらに含む。また、当該方法
は、再生された植物を自らと、または第2の植物と交配させ、この交配種から種子を収集
するステップもさらに含むことができる。
ンスジェニック植物または種子を含む植物生長区域を少なくとも1種のPPO除草剤に接
触させることを含み、トランスジェニック植物または種子が当該PPO除草剤に耐容性で
あり、かつ雑草が植物生長区域において防除される、方法が提供される。
クレオチド配列を同定する方法であって、a)ネイティブE.ColiのPPO酵素の遺
伝子ノックアウトを有するE.coli株を、候補となる除草剤耐容性タンパク質をコー
ドする組み換えDNA分子を含む細菌発現ベクターを用いて形質転換することと、b)当
該形質転換されたE.coliを、ヘムフリー細菌培地を用いて増殖させることであって
、当該細菌培地を用いた増殖が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタ
ンパク質を同定する、増殖させることと、を含む方法も提供される。
有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を同定する方法であって、a)ネイティ
ブE.ColiのPPO酵素の遺伝子ノックアウトを有するE.coli株を、組み換え
タンパク質をコードする組み換えDNA分子を含む細菌発現ベクターを用いて形質転換す
ることと、b)当該形質転換されたE.coliを、少なくとも1種のPPO除草剤を含
有する細菌培地を用いて増殖させることであって、細菌の増殖が、除草剤不感受性プロト
ポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するタンパク質を同定する、増殖させることと
、を含む方法が提供される。
a)本発明の組み換えDNA分子を植物細胞において発現させることと、b)PPO除草
剤への耐容性を示す植物細胞を同定することと、を含む方法に関する。
)本発明の組み換えDNA分子をHemGを欠いた細菌細胞において発現させることであ
って、当該細菌細胞が、PPO除草剤の存在下のヘムフリー細菌培地中で増殖する、発現
させることと、b)PPO除草剤への耐容性を示す細菌細胞を同定することと、を含む方
法を提供する。
の植物を生成する方法であって、a)本発明の組み換えDNA分子を含む植物を取得する
ことと、b)トランスジェニック植物を、当該少なくとも1種の他の除草剤への耐容性を
備えた第2の植物と交配させることと、c)PPO除草剤及び当該少なくとも1種の他の
除草剤への耐容性を備えた当該交配種から得られた後代植物を選択することと、を含む方
法を提供し、本発明の別の態様である。
、a)作物生長環境において、例えば本発明のDNA分子を含むことにより、PPO除草
剤への耐容性を備え、かつ少なくとも1種の他の除草剤への耐容性を備える、本発明の植
物を栽培することと、b)PPO除草剤及び少なくとも1種の他の除草剤を当該作物生長
環境に施用することであって、当該作物植物が当該PPO除草剤及び当該少なくとも1種
の他の除草剤に耐容性である、施用することと、を含む方法も提供する。当該方法のある
特定の実施形態では、当該PPO除草剤は、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクト
フェン、フルオログリコフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、ア
ザフェニジン、カルフェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メ
チル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル
、及びS-3100からなる群から選択される。当該方法における一部の実施形態では、
当該少なくとも1種の他の除草剤は、ACCアーゼ阻害剤、ALS阻害剤、EPSPS阻
害剤、合成オーキシン、光合成阻害剤、グルタミン合成阻害剤、HPPD阻害剤、PPO
阻害剤、及び長鎖脂肪酸阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態では、ACC
アーゼ阻害剤は、アリールオキシフェノキシプロピオネートまたはシクロヘキサンジオン
であり、ALS阻害剤は、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、
またはトリアゾリノンであり、EPSPS阻害剤は、グリホサートであり、合成オーキシ
ンは、フェノキシ除草剤、安息香酸、カルボン酸、またはセミカルバゾンであり、光合成
阻害剤は、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、またはウレア
であり、グルタミン合成阻害剤は、グルホシネートであり、HPPD阻害剤は、イソオキ
サゾール、ピラゾロン、またはトリケトンであり、PPO阻害剤は、ジフェニルエーテル
、N-フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、またはピリミジンジオンであり、
または長鎖脂肪酸阻害剤は、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、またはピラゾー
ルである。
配列番号1は、H_N90のアミノ酸配列である。
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(NCBI GenBank受託番号WP_02
1498199)である。
する開始メチオニンを欠いたアミノ酸配列である。
rculatus(ヒユモドキ)からの野生型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼで
ある。
レオチド配列であり、E.coliの発現用にコドン最適化されている。
レオチド配列であり、双子葉類の発現用にコドン最適化されている。
クレオチド配列であり、双子葉類の発現用にコドン最適化されている。
ド変異体である。
オチド配列である。
レオチド配列であり、単子葉類の発現用にコドン最適化されている。
以下の説明及び定義は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する指針と
するために、提供される。別段の記載がない限り、用語は、関連技術分野の当業者による
従来的な使用法に従って理解するものとする。
)をコードする組み換えDNA分子及びタンパク質を提供する。例えば本発明は、一実施
形態において、細胞及び植物において発現させるための微生物由来のiPPOをコードす
るベクター及び発現カセットを提供する。また、PPO除草剤に耐容性の細胞及び植物を
生成する方法も提供される。本発明はさらに、iPPOを取得及び改良するためのタンパ
ク質工学及び生物情報学ツールを使用するための方法及び組成物を提供する。
書で使用される「組み換え」という用語は、遺伝子操作の結果物であり、そのため通常天
然には見いだされないと考えられる非天然のDNA、タンパク質、細胞、種子、または生
物を指す。「組み換えDNA分子」とは、天然に存在せず、そのためヒトによる介入の結
果であるDNA配列を含むDNA分子、例えば、互いに異種である少なくとも2つのDN
A分子からなるDNA分子である。組み換えDNA分子の例に、本明細書で提供される、
異種の調節エレメントまたは他のエレメント(例えば、異種プロモーター)に作用可能に
連結した除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするDNA分子
がある。「組み換えタンパク質」は、天然に存在せず、そのためヒトによる介入の結果で
あるアミノ酸配列(例えば、遺伝子操作されたタンパク質またはキメラタンパク質)を含
むタンパク質である。組み換え細胞、種子、または生物とは、組み換えDNA分子を含み
、そのため植物の形質転換の結果として生成されたトランスジェニックDNA、例えばト
ランスジェニック細胞、種子、植物、または植物部分、を含む細胞、種子、または生物で
ある。
えられ、そのためヒトによる介入の適用が必要となる、非天然のDNA、タンパク質、ま
たは生物を作成することを指す。遺伝子操作は、分子生物学、タンパク質生化学、細菌形
質転換、及び植物形質転換などのバイオテクノロジー技法の1つ以上を用いて、実験室で
考案され作成された、遺伝子操作DNA、タンパク質、または生物を生成するために使用
することができる。例えば、遺伝子操作は、遺伝子クローニング、DNAライゲーション
、及びDNA合成などの分子生物学技法のうちの1つ以上を用いて、互いに異種である少
なくとも2つのDNA分子を含むキメラ遺伝子を作成するために使用することができる。
キメラ遺伝子は、作用可能に連結した2つ以上の異種DNA分子、例えば、遺伝子発現エ
レメントに作用可能に連結したタンパク質コード配列、例えば、輸送ペプチドコード配列
または異種プロモーター、からなることができる。遺伝子操作は、部位特異的変異誘発を
用いたタンパク質設計、ならびにランダム変異誘発及びDNAシャッフリングを用いた定
向進化などの、タンパク質工学技法のうちの1つ以上を用いて自らのポリペプチド配列が
作成された遺伝子操作タンパク質を作成するために、使用することができる。遺伝子操作
タンパク質は、野生型タンパク質のコード配列との比較で1つ以上の欠失、挿入、または
置換を有することができ、各欠失、挿入、または置換は、1つ以上のアミノ酸からなるこ
とができる。別の実施形態では、遺伝子操作タンパク質は、輸送ペプチドに作用可能に連
結した酵素などの、作用可能に連結した2つの異種ペプチドからなることができる。
ゼ(PPO)が、1種以上のPPO除草剤(複数可)の存在下で、自らの酵素活性の少な
くとも一部を維持する能力を意味する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活
性は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば酵素アッセイにより測定することができる
。酵素アッセイでは、1種以上のPPO除草剤(複数可)の存在下で、プロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼ産物生成量またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ基質消費
量を、蛍光、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、または質量分析(MS)を介し
て測定する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活性を測定するアッセイの別
の例に、本明細書に記載の増殖アッセイなどの細菌アッセイがある。この細菌アッセイに
より、組み換えプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの発現を、これをしなければPP
O活性を欠いている細菌細胞に行い、このノックアウト表現型に対する組み換えプロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼの補完能力を測定する。除草剤不感受性は、特定の除草剤
への完全なまたは部分的な不感受性とすることができ、そして特定のPPO除草剤への耐
容性パーセント(%)または不感受性として表現することができる。本明細書で使用され
る「除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ」または「iPPO」とは、
1種以上のPPO除草剤(複数可)の存在下での除草剤不感受性を示す。
が不可能な程度に、または機能的HemGを含む他のアイソジェニック系統との比較でヘ
ム不在下の増殖が検出可能に損なわれるようにHemG活性を欠いた、生物または生物の
細胞(例えば、E.coli)を意味する。例えばE.coliのhemGノックアウト
株は、当技術分野の知識を考慮して、例えばE.coliのhemG配列(Ecogen
e受託番号EG11485、Sasarman et al.,”Nucleotide
sequence of the hemG gene involved in t
he protoporphyrinogen oxidase activity o
f Escherichia coli K12”Can J Microbiol 3
9:1155-1161,1993)を考慮して、調製することができる。
により、人工的に生物のゲノムに組み込まれたDNA分子を指す。本明細書で使用される
「トランスジェニック」という用語は導入遺伝子を含むことを意味し、例えば「トランス
ジェニック植物」とは、そのゲノム中に導入遺伝子を含む植物を指し、「トランスジェニ
ック形質」とは、植物ゲノムに組み込まれた導入遺伝子の存在により伝達または付与され
る特徴または表現型を指す。このようなゲノム改変のため、トランスジェニック植物は関
連する野生型植物とは明確に異なる植物であり、トランスジェニック形質は、関連野生型
植物には天然に見いだされない形質である。本発明のトランスジェニック植物は、本明細
書により提供される組み換えDNA分子及び遺伝子操作タンパク質を含む。
には関連しない2つ以上のアイテム間の関係を指す。例えば、タンパク質コード組み換え
DNA分子は、作用可能に連結したプロモーターに対し、このような組み合わせが通常天
然には見いだされない場合は、当該プロモーターに対し異種である。加えて、特定の組み
換えDNA分子は、自らが挿入された細胞、種子、または生物に対し、この挿入がこれら
特定の細胞、種子、または生物において天然には生じないと考えられる場合、これらに対
し異種であり得る。
いる他の分子から、少なくとも部分的に分離することを指す。一実施形態において、「単
離」という用語は、DNA分子が天然状態では通常隣接している核酸から分離することを
指す。例えば、ある細菌中に天然に存在するタンパク質をコードするDNA分子は、当該
タンパク質をコードする当該DNA分子が天然に見いだされる細菌のDNA内にない場合
には、単離DNA分子であると考えられる。したがって、例えば組み換えDNAまたは植
物形質転換技法の結果として、天然には関連しないと考えられる1つ以上の他のDNA分
子(複数可)に融合または作用可能に連結したDNA分子は、本明細書では単離している
とみなされる。このような分子は、宿主細胞の染色体に統合されている場合であっても、
他のDNA分子と共に核酸溶液中に存在する場合であっても、単離しているとみなされる
。
ードするヌクレオチド配列を含むDNA分子を指す。「タンパク質コード配列」とは、タ
ンパク質をコードするDNA配列を意味する。「配列」とは、ヌクレオチドまたはアミノ
酸の連続した配置を意味する。タンパク質コード配列の境界は、5’末端にある翻訳開始
コドン及び3’末端にある翻訳停止コドンによって決定することができる。タンパク質コ
ード分子は、タンパク質配列をコードするDNA配列を含むことができる。本明細書で使
用される「導入遺伝子発現」、「導入遺伝子を発現する」、「タンパク質発現」、及び「
タンパク質を発現する」とは、DNA分子をメッセンジャーRNA(mRNA)に転写し
、mRNAを最終的にはタンパク質にフォールディングされるポリペプチド鎖に翻訳する
プロセスを通じた、タンパク質の生成を意味する。タンパク質コードDNA分子は、組み
換えDNA分子で形質転換された細胞においてタンパク質を発現するために使用するDN
Aコンストラクト中の異種プロモーターに、作用可能に連結され得る。本明細書で使用さ
れる「作用可能に連結した」とは、2つのDNA分子の一方が他方の機能に影響を及ぼし
得るような様式で連結していることを意味する。作用可能に連結したDNA分子は、単一
の近接する分子の一部であってもよく、また隣接していてもしていなくてもよい。例えば
、プロモーターが、DNAコンストラクト中のタンパク質コードDNA分子と作用可能に
連結している場合において、これら2つのDNA分子は、プロモーターが導入遺伝子の発
現に影響を及ぼすことができるように配置されている。
含む組み換えDNA分子である。DNAコンストラクトは導入遺伝子発現に有用であり、
これはベクター及びプラスミドに含まれ得る。DNAコンストラクトは、形質転換(異種
DNAを宿主細胞に導入すること)の目的でベクターで使用してトランスジェニック植物
及び細胞を生成することができ、そのためトランスジェニック植物、種子、細胞、または
植物部分の色素体DNAまたはゲノムDNAに含めることもできる。本明細書で使用され
る「ベクター」とは、細菌または植物形質転換の目的で使用され得る任意の組み換えDN
A分子を意味する。配列表に記載される組み換えDNA分子は、例えば、コンストラクト
の一部としてベクターに挿入することができ、この組み換えDNA分子を有するコンスト
ラクトは、植物において、組み換えDNA分子によりコードされる遺伝子操作タンパク質
の発現に影響を及ぼすように機能する遺伝子発現エレメントに対し、作用可能に連結して
いる。組み換えDNAコンストラクト及び植物形質転換ベクターを作製及び使用するため
の、DNA分子の操作に有用な一般的方法は、当技術分野において周知であり、例えば、
MR Green and J Sambrook,“Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual”(Fourth Edition)I
SBN:978-1-936113-42-2,Cold Spring Harbor
Laboratory Press,NY(2012)を含めた手引き書及び実験マニ
ュアルに詳細に記載されている。DNAコンストラクトまたはDNAコンストラクトを含
むベクターの構成成分には、転写可能なDNA配列に作用可能に連結した1つ以上の遺伝
子発現エレメントが含まれ、例えば以下のようなものである:作用可能に連結したDNA
を発現させるためのプロモーター、作用可能に連結したタンパク質コードDNA分子、及
び作用可能に連結した3’非翻訳領域(UTR)。本発明の実施に有用な遺伝子発現エレ
メントとしては、限定するものではないが、以下のタイプのエレメントのうちの1つ以上
が挙げられる:プロモーター、5’UTR、エンハンサー、リーダー、cis作用性エレ
メント、イントロン、標的配列、3’UTR、及び1つ以上の選択可能なマーカー導入遺
伝子。
子に作用可能に連結し、それにより組み換えタンパク質分子の発現を駆動するプロモータ
ーを含むことができる。本発明の実施に有用なプロモーターとしては、細胞において作用
可能に連結したポリヌクレオチドの発現のために機能するもの、例えば細菌プロモーター
または植物プロモーターが挙げられる。植物プロモーターは様々でありかつ当技術分野に
おいて周知であり、例えば、誘導性、ウイルス性、合成型、常在型、時間的制御型、空間
的制御型、及び/または空間時間的制御型のものが挙げられる。
不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド分子をコード
する異種核酸に作用可能に連結した標的配列を含み、これにより標的配列は、このポリペ
プチド分子の細胞内局在化を促進する。標的配列は、シグナル配列、標的ペプチド、局在
化配列、及び輸送ペプチドとして当技術分野で知られている。標的配列の例に、葉緑体輸
送ペプチド(CTP)、ミトコンドリア標的配列(MTS)、または葉緑体及びミトコン
ドリア二重標的ペプチドがある。タンパク質の細胞内局在化を促進することにより、標的
配列は組み換えタンパク質の蓄積を増大させ、当該タンパク質をタンパク質分解から保護
し、かつ/または除草剤耐容性のレベルを強化し、これにより、除草剤施用後のトランス
ジェニック細胞、種子、または生物の損傷レベルを低減することができる。
公知であり、以下に限定するものではないが、Arabidopsis thalian
a EPSPS CTP(Klee et al.,Mol Gen Genet.21
0:437-442,1987)、Petunia hybrida EPSPS CT
P(della-Cioppa et al.,PNAS 83:6873-6877,
1986)、トウモロコシcab-m7シグナル配列(Becker et al.,P
lant Mol Biol.20:49-60,1992、PCT WO97/412
28)、ミトコンドリアのプレ配列(例えば、Silva Filho et al.,
Plant Mol Biol 30:769-780,1996)、及びエンドウのグ
ルタチオンレダクターゼシグナル配列(Creissen et al.,Plant
J.8:167-175,1995、PCT WO97/41228)が挙げられる。
または組み換えに基づくクローニング部位)、植物に好ましい配列(例えば、植物コドン
使用またはKozakコンセンサス配列)、またはDNAコンストラクト設計に有用な配
列(例えば、スペーサーまたはリンカー配列)を提供することが望ましい場合に、当技術
分野で公知の方法により、完全にまたは部分的に、合成及び修飾することができる。本発
明には、本明細書で提供される組み換えDNA分子またはポリペプチド配列のいずれかに
対し、少なくとも70%の配列同一性、少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85
%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、少なくとも95%の配列同一性、少な
くとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同
一性、及び少なくとも99%の配列同一性を有し、かつ除草剤不感受性プロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼ活性を有する組み換えDNA分子及び遺伝子操作タンパク質が含ま
れる。本明細書で使用される「配列同一性パーセント」または「配列同一性%」という用
語は、試験(「サブジェクト」)配列(またはその相補鎖)と比較した参照(「クエリー
」)配列(またはその相補鎖)の、これら2つの配列が最適に整列された(比較ウィンド
ウにわたって参照配列の合計20%未満となる適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入
、欠失、またはギャップを伴う)場合における、直鎖状ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド配列中の同一なヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指す。比較ウィンド
ウを整列するための配列の最適な整列化は当業者に周知であり、Smith及びWate
rmanのローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunschのホ
モロジー整列化アルゴリズム、Pearson及びLipmanの類似法の研究などのツ
ールにより、ならびに、GCG(登録商標)Wisconsin Package(登録
商標)(Accelrys Inc.,San Diego,CA)の配列分析ソフトウ
ェアパッケージの一部として利用可能なGAP、BESTFIT、FASTA、及びTF
ASTA、MEGAlign(DNAStar Inc.,1228 S.Park S
t.,Madison,WI 53715)、及びMUSCLE(バージョン3.6)(
Edgar,“MUSCLE:multiple sequence alignmen
t with high accuracy and high throughput
”Nucleic Acids Research 32(5):1792-7(200
4))などのコンピューターによるこれらのアルゴリズムの実行により、例えばデフォル
トのパラメーターを用いて、行うことができる。試験配列及び参照配列の整列セグメント
に関する「同一性率(identity fraction)」は、整列された参照配列
セグメント部分において、すなわち参照配列全体または参照配列の定義された小部分にお
いて、2つの整列配列が共有する同一な構成成分の数を構成成分の総数で割ったものであ
る。配列同一性パーセントは、同一性率に100を掛けたものとして表される。1つ以上
の配列の比較は、全長配列またはその一部に対してでも、より長い配列に対してでもよい
。
)、修飾された特徴(複数可)、例えば、中でも、葉緑体またはミトコンドリアに対する
標的化のような特定の細胞局在化パターン、または有用なタンパク質の特徴の新規組み合
わせ(例えば、改変されたVmax、Km、Ki、IC50)、基質特異性、阻害剤/除
草剤特異性、基質選択性、細胞中の他の構成成分(例えばパートナータンパク質または膜
)と相互作用する能力、及びタンパク質の安定性、を有する新規のタンパク質を生成する
ことにより、行われ得る。修飾は、タンパク質における特定のアミノ酸位置で行うことが
でき、天然には(すなわち、野生型タンパク質では)その位置で見いだされるアミノ酸を
別のアミノ酸で置換することであり得る。したがって、本発明で提供される遺伝子操作タ
ンパク質は、天然に見いだされる同様のタンパク質と比較して1つ以上の改変タンパク質
の特徴を有する新規のタンパク質を提供する。本発明の一実施形態において、遺伝子操作
タンパク質は、改変タンパク質の特徴、例えば同様の野生型タンパク質と比較して1種以
上の除草剤への感受性低下をもたらす特徴、または、当該遺伝子操作タンパク質を発現す
るトランスジェニック植物に1種以上の除草剤への除草剤耐容性を付与するための改良さ
れた能力をもたらす特徴を有する。一実施形態において、本発明は、遺伝子操作タンパク
質と、それをコードする組み換えDNA分子であって、表1から選択される少なくとも1
つのアミノ酸置換を含み、配列番号1~20を含むがこれに限定されない本明細書で提供
される遺伝子操作タンパク質配列のいずれかに対し、少なくとも約70%の配列同一性、
約80%の配列同一性、約85%の配列同一性、約90%の配列同一性、約95%の配列
同一性、約96%の配列同一性、約97%の配列同一性、約98%の配列同一性、及び約
99%の配列同一性を有する、組み換えDNA分子とを提供する。アミノ酸の突然変異は
、タンパク質中の単一のアミノ酸置換として、または1つ以上の他の突然変異(複数可)
との組み合わせで、例えば、1つ以上の他のアミノ酸置換(複数可)、欠失、または付加
との組み合わせで、行われ得る。突然変異は、当業者に知られている任意の方法により行
うことができる。
表1:アミノ酸置換
バージョンを意味する。「野生型DNA分子」または「野生型タンパク質」は、当該DN
A分子またはタンパク質の天然に存在するバージョン、すなわち、天然に既に存在する当
該DNA分子またはタンパク質のバージョンである。本発明により提供される遺伝子操作
タンパク質との比較に有用な野生型タンパク質の例に、Arabidopsis tha
liana由来のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼがある。「野生型植物」とは、
トランスジェニック植物と同じタイプの非トランスジェニック植物であり、そのため、除
草剤耐容性形質を備えるトランスジェニック植物とは遺伝的に異なる。トランスジェニッ
クトウモロコシ植物との比較に有用な野生型植物の例に、非トランスジェニックLH24
4トウモロコシ(ATCC寄託番号PTA-1173)及び01DKD2近交系トウモロ
コシ(I294213)(ATCC寄託番号PTA-7859)がある。トランスジェニ
ックダイズ植物についての例示的な比較系統としては、非トランスジェニックA3555
ダイズ(ATCC寄託番号PTA-10207)が考えられ、トランスジェニックワタ植
物についての例示的な比較系統としては、非トランスジェニックCoker130(Pl
ant Variety Protection Number8900252)が考え
られる。
本発明の一態様には、本発明により提供される組み換えDNA分子及び遺伝子操作タン
パク質を含むトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織、トランスジェ
ニック植物、及びトランスジェニック種子が含まれる。当該組み換えDNA分子及び遺伝
子操作タンパク質を含むこれらの細胞、組織、植物、及び種子は、1種以上のPPO除草
剤(複数可)への除草剤耐容性、及び任意選択により1種以上の追加の除草剤(複数可)
への耐容性を示す。
とができる(例えば、組み換えDNAコンストラクトを安定的に植物染色体に統合させる
)ほぼ全ての方法が含まれ、形質転換方法は当技術分野において周知である。組み換えD
NAコンストラクトを植物に導入するための、例示的でありかつ広く利用されている方法
はAgrobacterium形質転換系であり、これは当業者によく知られている。組
み換えDNAコンストラクトを植物に導入するための、別の例示的な方法は、部位特異的
統合の方法による所定の部位の植物ゲノムへの組み換えDNAコンストラクト挿入である
。部位特異的統合は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、亜鉛フィンガーヌ
クレアーゼ、遺伝子操作もしくはネイティブなメガヌクレアーゼ、TALE-エンドヌク
レアーゼ、またはRNA誘導型エンドヌクレアーゼ(例えば、CRISPR/Cas9系
)により、遂行することができる。トランスジェニック植物は、植物細胞培養の方法によ
り、形質転換植物細胞から再生することができる。導入遺伝子に対してホモ接合性(すな
わち、導入遺伝子の2つの対立形質コピー)であるトランスジェニック植物は、単一の導
入遺伝子対立形質を自らと共に含有するトランスジェニック植物、例えばR0植物を自家
受粉(同系交配)させてR1種子を生成させることにより、取得することができる。生成
したR1種子の4分の1が当該導入遺伝子にホモ接合性となる。発芽R1種子から生育し
た植物は、SNPアッセイ、DNAシークエンシング、または熱による増幅アッセイを用
いて接合状態を試験することができる。接合状態アッセイと呼ばれるこの試験により、ヘ
テロ接合体とホモ接合体との区別が可能になる。
ィリノーゲンIXの脱水素を触媒して、ヘム及びクロロフィルの前駆体であるプロトポル
フィリンIXを形成する、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(PPO)の酵素活性
を標的とし阻害する、化学物質である。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの阻害に
より反応性酸素種が形成され、結果として細胞膜の破壊、最終的には感受性を有する細胞
の死がもたらされる。PPO除草剤は当技術分野において周知であり、市販されている。
PPO除草剤の例としては、以下に限定するものではないが、ジフェニルエーテル(例え
ば、アシフルオルフェン、その塩及びエステル、アクロニフェン、ビフェノックス、その
塩及びエステル、エトキシフェン、その塩及びエステル、フルオロニトロフェン、フリル
オキシフェン、ハロサフェン、クロメトキシフェン、フルオログリコフェン、その塩及び
エステル、ラクトフェン、その塩及びエステル、オキシフルオルフェン、ならびにホメサ
フェン、その塩及びエステル)、チアジアゾール(例えば、フルチアセット-メチル及び
チジアジミン)、ピリミジンジオンまたはフェニルウラシル(例えば、ベンズフェンジゾ
ン、ブタフェナシル、エチル[3-2-クロロ-4-フルオロ-5-(1-メチル-6-
トリフルオロメチル-2,4-ジオキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピリミジン-3
-イル)フェノキシ]-2-ピリジルオキシ]アセテート(CAS登録番号353292
-31-6及び本明細書での呼称はS-3100)、フルプロパシル、サフルフェナシル
、及びチアフェナシル)、フェニルピラゾール(例えば、フルアゾラート、ピラフルフェ
ン及びピラフルフェン-エチル)、オキサジアゾール(例えば、オキサジアルギル及びオ
キサジアゾン)、トリアゾリノン(例えば、アザフェニジン、ベンカルバゾン、カルフェ
ントラゾン、その塩及びエステル、及びスルフェントラゾン)、オキサゾリジンジオン(
例えば、ペントキサゾン)、N-フェニルフタルイミド(例えば、シニドン-エチル、フ
ルミクロラック、フルミクロラック-ペンチル、及びフルミオキサジン)、ベンゾオキサ
ジノン誘導体(例えば、1,5-ジメチル-6-チオキソ-3-(2,2,7-トリフル
オロ-3,4-ジヒドロ-3-オキソ-4-プロパ-2-イニル-2H-1,4-ベンゾ
オキサジン-6-イル)-1,3,5-トリアジナン-2,4-ジオン)、フルフェンピ
ル及びフルフェンピル-エチル、ピラクロニル、ならびにプロフルアゾールが挙げられる
。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及び本発明による細胞、種子、植物、及び植物
部分は、1種以上のPPO除草剤(複数可)への除草剤耐容性を示す。
植物生長区域に施用することができる。本発明により提供される植物及び種子は除草剤耐
容性を備え、そのため1種以上のPPO除草剤の施用に対し耐容性である。除草剤の施用
は、商業的推奨比率(recommended commercial rate)(1
X)またはこの任意の分数または倍数、例えば商業的推奨比率の2倍(2X)、とするこ
とができる。除草剤の比率は、除草剤及び製剤に応じて、ポンド酸当量/エーカー(lb
ae/acre)またはグラム酸当量/ヘクタール(g ae/ha)またはポンド活
性成分/エーカー(lb ai/エーカー)またはグラム活性成分/ヘクタール(g a
i/ha)として表現することができる。除草剤の施用は、少なくとも1種のPPO除草
剤を含む。植物生長区域は、除草剤施用の時点で雑草植物を含んでも含まなくてもよい。
区域内の雑草防除に使用するためのPPO除草剤(複数可)の除草剤的有効用量は、生長
期にわたりラベル比率(複数可)の約0.1X~約30Xの範囲からなることができる。
いくつかの例示的なPPO除草剤の1Xラベル比率を表2に示す。1エーカーは2.47
105ヘクタールに相当し、1ポンドは453.592グラムに相当する。除草剤比率は
、ヤード・ポンド法とメートル法との間で以下のように変換することができる:(lb
ai/ac)×1.12=(kg ai/ha)及び(kg ai/ha)×0.89=
(lb ai/ac)。
表2:例示的なPPO除草剤
任意の他の適合性除草剤を、経時的に混合してもタンク混合してもよい。生長期にわたり
、様々な双子葉雑草、単子葉雑草、または両方の防除を行うために、本発明のトランスジ
ェニック植物を含む区域に対し、1種の除草剤または2種以上の除草剤(組み合わせまた
は単独で)の複数回施用を使用してもよく、例えば、2回施用(例えば、植え付け前の施
用及び発芽後の施用、または発芽前の施用及び発芽後の施用)、または3回施用(例えば
、植え付け前の施用、発芽前の施用、及び発芽後の施用、または発芽前の施用及び発芽後
の2回施用)を行うことができる。
効果に耐える植物、種子、または細胞の能力を意味する。除草剤耐容性作物は生長を継続
することができ、施用化学物質の存在による影響を受けない、または影響を最小限にとど
める。本明細書で使用される「除草剤耐容性形質」とは、野生型植物と比較して改良され
た除草剤耐容を植物に付与するトランスジェニック形質である。本発明の除草剤耐容性形
質で生成され得る想定植物としては、例えば、中でも、ダイズ(例えば、Glycine
max)、コーン(トウモロコシ)、ワタ(Gossypium sp.)、及びキャ
ノーラなどの作物植物を含めた任意の植物が挙げられ得る。
の追加の形質を含有してもよい。追加の形質は、本発明により提供される組み換えDNA
分子を含む導入遺伝子を含有する植物を、1種以上の追加の形質(複数可)を含有する別
の植物と交配させることにより、導入することができる。本明細書で使用される「交配」
とは、後代植物を生成するために2つの個別の植物を交配することを意味する。したがっ
て、2つの植物を交配させて各植物からの望ましい形質を含有する後代を生成することが
できる。本明細書で使用される「後代」とは、親植物の任意の世代の子孫を意味し、トラ
ンスジェニック後代は、本発明により提供されかつ少なくとも1つの親植物から受け継が
れるDNAコンストラクトを含む。追加の形質(複数可)の導入も、この追加のトランス
ジェニック形質(複数可)のためのDNAコンストラクトを、本発明により提供される組
み換えDNA分子を含むDNAコンストラクトで(例えば、植物形質転換に使用される同
じベクターの一部として存在する全てのDNAコンストラクトで)同時形質転換すること
により、または追加の形質(複数可)を本明細書で提供されるDNAコンストラクトを含
むトランスジェニック植物に挿入するかまたはその逆により(例えば、トランスジェニッ
ク植物または植物細胞に対し、植物形質転換またはゲノム編集のいずれかの方法を用いて
)、行うことができる。このような追加の形質としては、以下に限定するものではないが
、昆虫耐性の増加、水使用効率の増加、収率性能の上昇、乾燥耐性の増加、種子の質の上
昇、栄養の質の改良、ハイブリッド種子生成、及び除草剤耐容性(当該形質が野生型植物
に対し計測される)が挙げられる。例示的な追加の除草剤耐容性形質としては、1種以上
の除草剤、例えば、中でも、ACCアーゼ阻害剤(例えば、アリールオキシフェノキシプ
ロピオネート及びシクロヘキサンジオン)、ALS阻害剤(例えば、スルホニルウレア、
イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、及びトリアゾリノン)、EPSPS阻害剤(例
えば、グリホサート)、合成オーキシン(例えば、フェノキシ、安息香酸、カルボン酸、
セミカルバゾン)、光合成阻害剤(例えば、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベン
ゾチアジアゾール、及びウレア)、グルタミン合成阻害剤(例えば、グルホシネート)、
HPPD阻害剤(例えば、イソオキサゾール、ピラゾロン、及びトリケトン)、PPO阻
害剤(例えば、ジフェニルエーテル、N-フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン
、及びピリミジンジオン)、及び長鎖脂肪酸阻害剤(例えば、クロロアセトアミド、オキ
シアセトアミド、及びピラゾール)、へのトランスジェニックまたは非トランスジェニッ
ク耐容性が挙げられ得る。例示的な昆虫耐性形質としては、中でも、Lepidopte
ra、Coleoptera、Hemiptera、及びHomoptera各目のうち
の1つ以上の昆虫メンバーに対する耐性が挙げられ得る。このような追加の形質は当業者
によく知られており、例えば、このようなトランスジェニック形質のリストが米国農務省
(USDA)の動植物検疫局(APHIS)により提供されている。
うな細胞をトランスジェニック植物に再生させる前または後の当該ポリヌクレオチドまた
はそのコードされた酵素活性の存在のために選択され得る。したがって、このようなポリ
ヌクレオチドを含むトランスジェニック植物は、例えば、当該ポリヌクレオチドまたはコ
ードされた酵素活性を含む、かつ/または別のアイソジェニック対照植物との比較で改変
された形質を示すトランスジェニック植物を同定することにより、選択され得る。このよ
うな形質は、例えば、PPO除草剤への耐容性であり得る。
び後代は、当技術分野において公知である任意の交配方法を用いて使用することができる
。2種以上のトランスジェニック形質を備える植物系統において、これらのトランスジェ
ニック形質は、独立して分離していても連結していてもよく、3種以上の形質を備える植
物系統においては両方の組み合わせであってもよい。親植物との戻し交配及び非トランス
ジェニック植物との異系交配も栄養繁殖であるために考慮されている。異なる形質及び作
物に使用される交配方法の説明は、当業者によく知られている。特定の植物または種子に
おける導入遺伝子(複数可)の存在を確認するために、様々なアッセイが行われ得る。こ
のようなアッセイとしては、例えば、分子生物学的アッセイ(例えば、サザンブロッティ
ング及びノーザンブロッティング、PCR、及びDNAシークエンシング)、生化学的ア
ッセイ(例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)による、または酵
素機能によるタンパク質産物の存在の検出)、植物部分アッセイ(例えば、葉または根の
アッセイ)が挙げられ、また、全植物の表現型の分析によっても行われる。
結果として達成される。トランスジェニック形質が遺伝子移入された植物遺伝子型は、戻
し交配変換遺伝子型、系統、近交系、または交雑系と呼ぶことができる。同様に、望まし
いトランスジェニック形質を欠いた植物遺伝子型は、未変換遺伝子型、系統、近交系、ま
たは交雑系と呼ぶことができる。
となく変更、変形形態、及び同等の実施形態が可能であることは明らかなものとなる。さ
らに、本開示における実施例は非限定的な例として提供されることを理解されたい。
施例に開示されている技法が、発明者によって発見された、本発明の実施で十分に機能す
るための技法を代表するものであり、したがってこの技法が本発明を実施するための好ま
しい様式を構成するものとみなされ得ることを、理解するはずである。ただし、当業者は
、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことが可能であ
り、それでも依然として本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、類似または
同様の結果が得られ得ることも理解するはずである。より具体的には、化学的かつ生理学
的に関連するある特定の薬剤は、本明細書に記載の薬剤に置き換えられ得、同じまたは同
様の結果が達成され得ることが明白となろう。当業者に対して明白な、このような同様の
代用及び変更は全て、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲及び概念内に
あるものとみなされる。
生物情報学的方法及び新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ細菌スクリーニン
グ系を用いて、微生物配列データベースから新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼを同定した。微生物配列データベースの生物情報学的分析のための開始配列として、E
.coli HemG(配列番号4)の配列を使用した。生物情報学的分析により、多様
な細菌供与源からHemG PPOファミリーの33種の新規の推定プロトポルフィリノ
ーゲンオキシダーゼが同定された。系統樹マッピングを使用してこれらの推定HemG
PPO酵素をコードする配列を比較し、これらが比較的多様であることを見いだした。系
統樹上の個々のユニークなクラスターメンバーの表示により、この33種からなる群から
さらなる分析用に10種を選択した。
だされるいかなるレアなコドンも排除するようE.coli発現用に最適化した。次に、
10種のHemG PPO酵素のE.coli最適化コード配列を細菌発現ベクターにク
ローニングした。ヒユモドキ(Amaranthus tuberculatus)に天
然に見いだされる除草剤感受性PPO酵素を、PPO機能及び除草剤感受性の両方につい
ての対照として使用するために、細菌発現ベクターにクローニングした(「WH」と称し
、配列番号21として示す、GenBank受託番号ABD52326、Patzold
t,et al.“A codon deletion confers resist
ance to herbicides inhibiting protoporph
yrinogen oxidase”Proceedings of the Nati
onal Academy of Science USA.103(33):1232
9-12334(2006))。ヒユモドキPPO酵素は、HemGファミリーメンバー
ではない。E.coliに天然に見いだされるHemG PPO酵素を、PPO活性の対
照として及び除草剤感受性のアッセイに使用するため細菌発現ベクターにクローニングし
た(H_N10と称し、配列番号4として示す)。
ことで機能的PPO酵素であることを確認するために、プロトポルフィリノーゲンオキシ
ダーゼ細菌スクリーニング系を作成した。このスクリーニング系では、E.coli P
PO酵素(配列番号4)遺伝子ノックアウトを含有するE.coli株に機能的レスキュ
ーアッセイを使用した。利用したhemGノックアウトE.coli株がヘムフリー細菌
培地(例えば、LB培地)上で示す増殖は非常に最小限だったが、遊離ヘムを補充した場
合、または活性組み換えプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをE.coliに発現さ
せた場合には増殖が回復した。したがって、タンパク質のプロトポルフィリノーゲンオキ
シダーゼ活性を迅速かつ容易にアッセイするために、hemGノックアウトE.coli
株を組み換えタンパク質発現で使用することができた。
oli HemG PPO酵素、及びヒユモドキPPO酵素をコードする遺伝子を含有す
る細菌発現ベクターで形質転換した。次に細菌を、ヘムフリー細菌培地であるLB培地プ
レート上に縞状に並べた。組み換えPPO酵素の発現によりE.coliの増殖がレスキ
ューされ、LBプレート上での増殖がもたらされた。形質転換hemGノックアウトE.
coli株がLBプレート上で増殖したことにより、タンパク質配列がプロトポルフィリ
ノーゲンオキシダーゼとして機能したことが示された。このアッセイにおいて、10種の
HemG PPO酵素(配列番号1~10)及びヒユモドキPPO酵素(配列番号21)
は、形質転換hemGノックアウトE.coli株の増殖を回復することができたため、
よってこれらのPPO活性が確認された。PPO酵素のタンパク質配列を整列化したもの
をコンセンサス位置と共に図1に示す。このアッセイを使用して、多数の新規タンパク質
または遺伝子操作タンパク質をスクリーニングしてプロトポルフィリノーゲンオキシダー
ゼ活性の確認及び測定を行うことができる。
除草剤細菌スクリーニング系を用いて、PPO除草剤に耐性である新規のプロトポルフ
ィリノーゲンオキシダーゼを同定した。このスクリーニング系は、PPO除草剤に感受性
でないプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを同定するために、PPO除草剤を含むL
B液体培地におけるhemGノックアウトE.coli株の増殖アッセイを使用した。
ダーゼ活性を含有する細菌発現ベクターで形質転換し、LB液体培地中で培養した。3つ
の種々のPPO化学サブクラスを代表する5種の種々のPPO除草剤(アシフルオルフェ
ン(1mM)、フルミオキサジン(0.5mM)、ラクトフェン(0.5mM)、ホメサ
フェン(1mM)、及びS-3100(100μM))のうちの1種の精製結晶形態を、
培地に添加した。組み換えタンパク質を発現させ、E.coliの増殖速度を測定した。
これら種々の変異体の増殖曲線(OD600)を、PPO除草剤の存在下及び非存在下で
、0時間~24時間の選択された時点において測定した。PPO除草剤存在下でLB培地
中の形質転換hemGノックアウトE.coli株が増殖したことにより、E.coli
の形質転換に使用した遺伝子が除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(
iPPO)をコードすることが示された。
剤への不感受性を試験した。配列番号1~配列番号10として示される10種のプロトポ
ルフィリノーゲンオキシダーゼは全て、PPO除草剤の存在下でLB培地中のhemGノ
ックアウトE.coli株に正常な増殖速度を付与することが見いだされ、これにより、
これらのタンパク質が除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(iPPO
)であることが示された(図2)。ヒユモドキPPO(配列番号21)を発現するhem
GノックアウトE.coli株は5種全ての除草剤に感受性であり、これにより、当該ア
ッセイが、各除草剤について感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと不感受性プ
ロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとを区別できることが確認された。このアッセイを
用いて、多数の新規タンパク質または遺伝子操作タンパク質をスクリーニングして、PP
O除草剤(複数可)の存在下でのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を確認する
ことができる。
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素的キャラクタリゼーションを行って、各
PPO酵素基質の結合親和性(Km)及びPPO除草剤への感受性(IC50)を測定し
た。ヒユモドキ、ダイズ、及びトウモロコシからの野生型植物PPO酵素を使用して、微
生物HemGプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(配列番号1~配列番号10として
示される)との比較を行った。
ロコシ、Zea mays)、及び広げた先端葉(ヒユモドキ、Amaranthus
tuberculata)から、概してGrossmann et al.により説明さ
れる手順(“The Herbicide Saflufenacil(Kixor(T
M))is a New Inhibitor of Protoporphyrino
gen IX Oxidase Activity”Weed Science,58(
1):1-9(2010))により、白色体及び葉緑体を調製した。ダイズ(A3555
)及びトウモロコシ(LH244)の種子を、水の入ったビーカー中の2枚の湿った発芽
紙(Anchor Paper Company,Saint Paul,Minnes
ota,USA)の間に挟み、8~10日の連続暗期で置いた。ヒユモドキ植物を温室で
30日間生育した。組織を収集し、湿ったペーパータオルの間に挟み、乳鉢及び乳棒を用
いて液体窒素中で細かい粉末になるまで粉砕した。均質化緩衝液(50mMトリス-HC
l、pH7.4、500mMスクロース、1mM EDTA、1mM塩化マグネシウム、
及び2g/リットルウシ血清アルブミン)を凍った粉末に4:1(ml均質化緩衝液:g
新鮮重組織)で添加し、激しく攪拌し、予め湿らせた4層のMiracloth(商標)
(Merck-Millipore,Darmstadt,Germany)で濾過した
。濾過液を9299gで5分間遠心処理した。沈渣を均質化緩衝液に再懸濁させ、150
gで2分間遠心処理した。上清溶液を4000gで15分間遠心処理した。全遠心処理ス
テップを4℃で実施した。沈渣(インタクトなプラスミド画分)を15mMトリス-HC
l(pH7.4)、2mM EDTA及び20%(v/v)グリセリンに再懸濁させ、-
80℃でアリコートにして保管した。プラスミド調製物中の総タンパク質量を、ウシ血清
アルブミンを基準として、Bradford法(MM Bradford,“A rap
id and sensitive method for the quantita
tion of microgram quantities of protein
utility the principle of protein-dye bin
ding”Analytical Biochemistry,72:248-254(
1976))により測定した。
た。終夜培養物からの細菌細胞を使用して20mlの新鮮培地に接種した。これらの培養
物を20℃でおよそ48時間増殖させ、高密度培養物にした。遠心処理により細菌細胞を
収集し、酵素アッセイを実施するまで細胞沈渣を-80℃で保管した。凍った細菌沈渣を
抽出懸濁液(50mMトリス-HCl、pH7.6、1mM EDTA&1mM MgC
l2)に再懸濁させ、超音波処理(Sonics VibraCell(商標),New
town,CT USA)にかけ、氷浴中で30秒を3サイクル、サイクル間に1分の休
止期間をおいて行った。破砕細胞を200gで4℃にて2分間遠心処理し、上清溶液を抽
出懸濁液で希釈した後、PPO酵素アッセイに使用した。Bradford(1976)
の方法により、ウシ血清アルブミンを基準として総タンパク質量を測定した。
of Protoporphyrinogen Oxidase Activity”i
n Current Protocols in Toxicology(1999)8
.5.1-8.5.13,John Wiley & Sons,Inc.)の通りに、
市販のプロトポルフィリンをナトリウム水銀アマルガムで還元することにより、プロトポ
ルフィリノーゲンIX(プロトゲン)を合成した。プロトポルフィリン(Proto)を
20%エタノール中0.01Nの水酸化カリウムに添加し、溶解するまで暗中で攪拌した
(約40分)。Oリングを収容するねじ蓋を有する2mlポリプロピレンバイアルに体積
0.8mlを入れ、約1g(スパチュラチップ1杯分、油除去)のナトリウム水銀アマル
ガム(製品番号451908,Sigma-Aldrich,St.Louis,Mis
souri,油浸下で保管)を添加した。直ちにチューブに蓋をし、ボルテックスミキサ
ーで激しく攪拌し、約30秒ごとに蓋を緩めることによりベントし、溶液がUV光下で赤
色に蛍光発光しなくなるまでこれを行った(約5分)。反応バイアルをアルゴンでフラッ
シュし、軽く遠心処理して、残存するナトリウムアマルガムをペレットにした。上清溶液
を直ちに0.1M DTT及び0.5Mトリス-HCl、pH7.5の溶液で1:1(v
/v)希釈し、バイアルをアルゴンでフラッシュした。得られた溶液をより少量のアリコ
ートに分割して0.5mlポリプロピレン蓋付きチューブに入れ、アリコートを添加した
直後にチューブをアルゴンでフラッシュした。蓋付きチューブをアルミホイルで覆い、-
80℃で保管した。酵素アッセイ用にプロトゲンアリコートを解凍し、氷上で覆った状態
で保管し、同日に使用した。調製物中のプロトゲン濃度を、出発材料におけるProto
濃度から、蛍光HPLCにより測定される最終プロトゲン溶液におけるProto濃度(
典型的には出発材料の約1%)を減算する(Matsumoto et al,“Por
phyrin Intermediate Involved in Herbicid
al Action of delta-Aminolevulinic Acid o
n Duckweed(Lemna paucicostata Hegelm.)”P
esticide Biochem.and Phys.48:214-221(199
4)により説明される方法)ことにより算出した(いずれのサンプルにも顕著な不純物が
ないものと想定)。これらの条件下で調整し保管したプロトゲンは、少なくとも6ヶ月間
安定であった。
smann.et al.(2010)による説明の通りに測定した。10マイクロリッ
トルの、植物プラスミド抽出物(総タンパク質量40μg)または細菌抽出物(種々の細
菌抽出物について総タンパク質量16~35μg)のいずれかを、アッセイ緩衝液(10
0mM トリス-HCl、pH7.4、5mM DTT、1mM EDTA及び0.08
5%(v/v)Tween80)に添加した。S-3100(「SYN-523」として
も知られる。例えば米国特許公開第US20100062941A1号)を、アセトン中
で調製した100Xストック溶液からの2マイクロリットル体積として添加した。分析グ
レードS-3100は、Sumitomo Chemical Companyにより提
供された。全アッセイを、1%(v/v)アセトンの最終濃度で実行した。抽出物(プラ
スミドまたは細菌のもの)、緩衝液、及びS-3100を30℃(植物抽出物)または3
7℃(細菌抽出物)で5分間インキュベートしてから2マイクロリットルのプロトゲンを
添加し、当該アッセイを開始した。全アッセイを、96ウェル黒色ポリスチレンマイクロ
タイタープレート(Costar(登録商標)3925,Corning,Inc.,C
orning,New York)中で200マイクロリットルの最終体積で行った。プ
ロトゲンを全てのウェルに添加後(IC50測定については3μM、Km測定については
可変)、プレートを30℃(植物抽出物)または37℃(細菌抽出物)でインキュベート
してからデータ収集を開始した。30℃(植物抽出物)または37℃(細菌抽出物)にお
ける経時的な蛍光を、励起波長及び発光波長をそれぞれ405mm及び630mmにして
、SpectraMax(登録商標)M5マルチモードマイクロプレートリーダー(Mo
lecular Devices,Sunnyvale,California)におい
て測定した。熱失活した(100℃で5分)抽出物をアッセイ混合物に添加することによ
り、アッセイブランクを実行した。
性をKmとして測定した。評価対象の各PPOについての見かけ上のKm値を、Soft
Pro(登録商標)動力学ソフトウェアパッケージ(Molecular Device
s,Sunnyvale,California)を用いて直角双曲線の曲線適合を用い
て算出した。PPO除草剤S-3100への酵素活性感受性を、防除活性の50%阻害を
もたらす濃度(IC50)として測定した。評価対象の各PPOに対するS-3100の
IC50値を、S-3100濃度対PPO活性の片対数プロットから図式的に求めた。
微生物HemG PPO酵素(配列番号1~配列番号10)についてのKmは0.3uM
~2.0uMの範囲であり、類似していることが見いだされた。試験した3種の植物PP
O酵素は、それぞれIC50値が0.009、0.004、及び0.003uMであり、
S-3100に感受性であった。これに対し、細菌供与源からのPPO酵素(配列番号1
~配列番号10)は、IC50値が100uM超であり、S-3100に不感受性であっ
た。データを表3に示す。
表3.植物または微生物の供与源から精製した酵素のPPO酵素活性
タンパク質最適化を使用して、新規のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素特
性を改良または変更した。1つ以上のタンパク質工学の方法を使用して酵素を最適化する
。タンパク質工学手法の非限定的な例としては、アラニンスキャニング変異導入、相同性
スキャニング変異導入、Pro/Glyスキャニング変異導入、領域のスワップまたは変
異導入、及びこれらの様々な技法の組み合わせが挙げられる(M Lehmann an
d M Wyss,Current Opinion in Biotechnolog
y 12(4):371-375(2001)、B Van den Burg and
VGH Eijsink,Current Opinion in Biotechn
ology 13(4):333-337(2002)、及びWeiss et al.
,Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 97(16):8950-8954(2000)を参照)。
遺伝子操作プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするDNA配列を合成し、細
菌発現ベクターにクローニングする。このベクターは、実施例1に記載の初期高スループ
ット細菌レスキュースクリーニングのため、hemGノックアウトE.coli株の形質
転換に使用する。hemGノックアウトE.coli株をレスキューする遺伝子操作プロ
トポルフィリノーゲンオキシダーゼについては、実施例2に記載の細菌増殖アッセイを用
いて、1種以上のPPO除草剤(複数可)への感受性をスクリーニングする。代替方法と
して、PPO除草剤を含む、及び含まない培地に形質転換hemGノックアウトE.co
li株を蒔く。PPO除草剤への耐容性を示す遺伝子操作変異体を細菌発現系において発
現させ、実施例3に記載の連続的蛍光定量アッセイにより精製されたタンパク質を用いて
詳細な生化学的キャラクタリゼーションを行う。植物形質転換ベクターへのクローニング
、植物形質転換、及び植物体への試験のために、PPO除草剤に不感受性の遺伝子操作変
異体を選択する。
微生物HemG PPO酵素をトランスジェニックトウモロコシ植物において発現させ
、このトランスジェニック植物のPPO除草剤耐容性を分析した。配列番号1~20とし
て示される微生物HemG PPO酵素のうちの1つをコードする組み換えDNA分子を
含む植物形質転換ベクターを構築した。PPO酵素をコードするDNA配列には、5’末
端にメチオニンのコドンが含まれ得、これは開始コドンとして一般に知られるが、あるい
はこのコドンを除去して、輸送ペプチド配列がコード配列の5’末端に作用可能に連結す
るように促すことができる。アミノ末端にメチオニンを含有するPPO酵素タンパク質配
列の例は、配列番号1~10として提供される。アミノ末端にメチオニンを含まないPP
O酵素タンパク質配列の例は、配列番号11~20として提供される。植物形質転換のた
め、推定PPO酵素をコードするヌクレオチド配列を双子葉類または単子葉類の発現用に
コドン最適化した。表4に、タンパク質に対応する配列番号及び形質転換ベクターにおけ
る微生物HemG PPO酵素のヌクレオチド配列を示す。
表4.PPO変異体に対応する配列番号
モーター+リーダー+イントロンの組み合わせ、2つの異なる標的ペプチド(TP)配列
、及び2つの異なる3’UTR配列を用いて4種の植物形質転換ベクターを作成した。植
物形質転換コンストラクトは、注釈付きコンストラクト1、6、11、及び16であった
。トウモロコシ植物体試験のために、Agrobacterium tumefacie
ns及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、未熟なトウモロコシ(LH244)胚
を形質転換した。
転換コンストラクト6及び16を用いて、トランスジェニックトウモロコシ植物を生成し
た。R0植物から葉のサンプルを収集し、PCRによりスクリーニングして当該植物ゲノ
ムに挿入した導入遺伝子のコピー数を求めた。単一のコピーを含有する植物(シングルコ
ピー)に同系交配及び異系交配を行って、今後の試験用にそれぞれR1及びF1種子を生
じさせた。複数のコピーを含む植物(マルチコピー)に対し、以下のように噴霧を行った
。(1)およそV5生長段階に5g/haのS-3100、次におよそV7生長段階に1
0g/haのS-3100、施用合計として15g/haのS-3100、または(2)
およそV5生長段階に10g/haのS-3100。損傷の平均パーセンテージを、0~
100の尺度で0が損傷なし、100が完全な作物の枯死として、各バッチにつき最終処
理から7日後に評価した。噴霧を行った非トランスジェニックLH244トウモロコシを
対照として使用したが、これは合計15g/haのS-3100で処理した場合(処理1
)に平均43.3%の損傷を示し、合計10g/haのS-3100で処理した場合(処
理2)に平均26.7%の損傷を示した。HemGH_N10(配列番号4)を発現する
トランスジェニックトウモロコシ植物は、当該対照植物よりも性能が優れており、合計1
5g/haのS-3100で処理した場合(処理1)に平均28.9%の損傷、合計10
g/haのS-3100で処理した場合(処理2)に平均24.2%の損傷であった。デ
ータを表5に示す。
表5:トランスジェニックトウモロコシの除草剤耐容性I
60(配列番号3)、H_N110(配列番号10)、及びH_N40(配列番号6)を
コードする遺伝子を含有する、それぞれ植物形質転換コンストラクト6、20、21、2
2、及び23を用いて、トランスジェニックトウモロコシ植物を生成した。これら5種の
コンストラクトは、同じプロモーター+リーダー+イントロンの組み合わせ、2種の異な
る標的ペプチド(TP)配列、及び同じ3’UTR配列を有した。葉のサンプルをR0植
物から採取し、PCRにより分析して導入遺伝子のコピー数を求めた。コンストラクト当
たり最大12のユニークな事象のためのシングルコピー植物をポットに移植し、同系交配
及び異系交配を行って、今後の試験用にそれぞれR1及びF1種子を生じさせた。マルチ
コピー植物及び余分なシングルコピー植物に対し、およそV5生長段階に40グラム/h
aのS-3100を噴霧し、処理から7日後に損傷評定を行った。各PPO酵素を発現す
る全植物の損傷平均パーセント(%)及び耐容性が高い(10%損傷未満)とみなされた
植物の数を記録した。各植物は、ユニークなシングルコピーまたはマルチコピーの形質転
換体である。H_N10(配列番号4)を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物
は、全体の平均損傷が39.5%であり、試験を行った139の植物から31の耐容性が
高い植物を生成した。H_N60(配列番号3)を発現するトランスジェニックトウモロ
コシ植物は、全体の平均損傷が55.8%であり、試験を行った86の植物から19の耐
容性が高い植物を生成した。H_N90(配列番号1)を発現するトランスジェニックト
ウモロコシ植物は、全体の平均損傷が31.4%と最も低く、試験を行った99の植物か
ら44の耐容性が高い植物を生成した。H_N40(配列番号6)を発現するトランスジ
ェニックトウモロコシ植物は、全体の平均損傷が47.0%であり、試験を行った98の
植物から53の耐容性が高い植物を生成し、最も高い割合で耐容性が高い植物を生成した
。H_N110(配列番号10)を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物は、平
均損傷は43.0%であったが、いかなる耐容性が高い植物も生成しなかった。データを
表6に示す。
表6:トランスジェニックトウモロコシの除草剤耐容性II
HemG PPO酵素H_N90(配列番号1)、H_N10(配列番号4)、H_N6
0(配列番号3)、H_N40(配列番号6)、及びH_N110(配列番号10)が、
トランスジェニック植物において発現させた場合に損傷率の低減をもたらし、よって作物
にPPO除草剤への耐容性を付与したことである。
るシングルコピーR0植物の異系交配から生成したトランスジェニックF1植物の除草剤
耐容性を、温室で試験した。当該植物に対し、V3生長段階に40グラム/haのS-3
100で処理し、処理から7日後に損傷評定を行った。コンストラクト6構成においてH
_N10(配列番号4)を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物では、18事象
のうち13事象で耐容性の高い植物(10%以下の損傷)がもたらされたが、コンストラ
クト16構成ではどの事象でも耐容性の高い植物がもたらされなかった。
N10(配列番号4)を発現するシングルコピーR0植物の異系交配から生成したトラン
スジェニックF1植物の除草剤耐容性を、野外で試験した。このF1集団は分離集団(5
0%ヘミ接合50%欠損)であり、損傷評定の前にトランスジェニック植物の選択を行わ
なかった。トランスジェニック植物から非トランスジェニック植物を識別することは困難
であるため、このような集団に対する全体の平均損傷評定は、均質なトランスジェニック
集団よりも高くなることが予想される。トライアルは2箇所の場所で行い、コンストラク
ト当たり2回の反復試験及び3通りの処理を行った。非トランスジェニック植物を陰性対
照として使用した。除草剤施用処理は、以下の通りである:処理1は、V2、次にV4、
次にV8で0.036lb ai/エーカーのS-3100を施用、処理2は、V2、次
にV4、次にV8で0.072lb ai/エーカーのS-3100を施用、処理3は、
V2、次にV4、次にV8で0.144lb ai/エーカーのS-3100を施用。作
物損傷パーセント評定を、処理から5~7日後のV2生長段階(CIPV2)及びV4生
長段階(CIPV4)で評価した(エラーV2及びエラーV4は最小有意差(LSD)の
半分である)。両方の場所における作物損傷評定を合わせた。全ての非トランスジェニッ
ク植物及びコンストラクト16を用いて事象を生じさせた植物は、3通りの処理のそれぞ
れについて、V2及びV4両方における除草剤施用後に94.6から99.5%の間の損
傷を示した。コンストラクト6を用いて事象を生じさせた植物は、V2の除草剤施用後に
30%~50%の損傷を示すにとどまり、V4の除草剤施用後には損傷を示さなかった。
データを表7に示す。
表7.H_N10(配列番号4)を含有するF1トウモロコシの野外トライアルにおける
有効性
、微生物HemG PPO酵素H_N10(配列番号4)が、トランスジェニック植物に
おいて発現させた場合に損傷率の低減をもたらし、よって作物にPPO除草剤への耐容性
を付与したことである。
微生物HemG PPO酵素をトランスジェニックダイズ植物において発現させ、この
トランスジェニック植物のPPO除草剤耐容性を分析した。H_N10(配列番号4及び
配列番号13)、H_N20(配列番号12)、H_N30(配列番号14)、H_N4
0(配列番号15)、H_N50(配列番号16)、H_N90(配列番号11、18、
19)、及びH_N100(配列番号17、20)として示される微生物HemG PP
O酵素のうちの1つをコードする組み換えDNA分子を含む、植物形質転換ベクターを構
築した。
用いて、切除胚(A3555)を形質転換コンストラクト1及び11で形質転換した。形
質転換コンストラクト1及び11は、同じプロモーター+リーダー+イントロンの組み合
わせ、同じ3’UTR配列、同じ微生物HemG PPOのH_N10(配列番号4)を
有したが、標的ペプチド(TP)配列は相違していた。再生したR0トランスジェニック
苗を温室で生育した。コンストラクト11から生成される20のシングルコピーR0ダイ
ズ事象を代表し、かつ微生物PPO酵素H_N10(配列番号4)を発現する植物に、2
10g/haのフルミオキサジン(Valor(登録商標)、Valent U.S.A
. Corporation,Walnut Creek CA)を噴霧した。十分に発
育した3枚の三出葉を有するV3発育段階に当該除草剤を噴霧し、損傷評定を処理から8
日後に評価した。耐容性が高い(15%以下の損傷)とみなされた植物のパーセンテージ
を記録した。210g/haのフルミオキサジン施用後、非トランスジェニックダイズ対
照植物は平均損傷が30%であり、耐容性の高い植物は存在しなかった。微生物PPO酵
素H_N10(配列番号4)を発現するダイズ植物は、平均損傷評定が22%であり、試
験した植物の9%が当該除草剤への耐容性が高かった。
物PPO酵素H_N10(配列番号4)を発現する植物に、5g/haのS-3100を
噴霧した。十分に発育した3枚の三出葉を有するV3発育段階に当該除草剤を噴霧し、損
傷評定を処理から8日後に行った。耐容性が高い(25%以下の損傷)とみなされた植物
のパーセンテージを記録した。S-3100(5g/ha)の施用後、非トランスジェニ
ックダイズ対照植物は平均損傷が60%であり、耐容性の高い植物は存在しなかった。微
生物PPO酵素H_N10(配列番号4)を発現するダイズ植物は、平均損傷評定が47
%であり、試験した植物の30%が当該除草剤への耐容性が高かった。
用率のうちの1つにて噴霧した:処理1は、V4、次にR1で5グラム ai/haのS
-3100を施用、処理2は、V4、次にR1で10グラム ai/haのS-3100
を施用、処理3は、V4、次にR1で30グラム ai/haのS-3100を施用。V
2における作物損傷パーセント(CIPV2)評定を処理から10日後に評価した。非ト
ランスジェニック植物は平均損傷評定が89%~100%であり、R1生長段階における
評定に使用することができなかった。コンストラクト1から生成し、かつ微生物PPO酵
素H_N10(配列番号4)を発現する植物は、損傷評定が3%~15.7%の範囲だっ
た。データを表8に示す。
表8:温室におけるR1ダイズのS-3100有効性スクリーニング
植物における多数のコンストラクトの除草剤耐容性を、早期の形質転換苗の組織で評価し
た。これにより、コンストラクト構成及びPPO酵素をより速く大量にスクリーニングす
ることが可能になった。
号12)、H_N30(配列番号14)、H_N40(配列番号15)、H_N50(配
列番号16)、H_N90(配列番号11、18、19)、及びH_N100(配列番号
17、20)をコードする遺伝子を37種の異なる標的ペプチドに作用可能に連結させ、
ベース植物形質転換ベクターにクローニングした。これにより、遺伝子発現に同じプロモ
ーター及び3’UTRエレメントを用いて7種の異なるHemG PPO酵素と37種の
異なる標的ペプチドとの並列比較が可能になった。A.tumefaciens及び当技
術分野で公知の標準的方法を用いて、これらの植物形質転換コンストラクトをダイズの切
除胚(生殖質A3555)の形質転換に使用した。400個の外植片を各コンストラクト
に接種し、その結果コンストラクト当たり12個の容器になった。無菌のPPO除草剤溶
液を除草剤耐容性試験に使用した。除草剤溶液は、クロップオイル濃縮液(5.0mL)
及び495mLの脱イオン水中0.3gのS-3100からなった。これを0.45ミク
ロンのNalgene(登録商標)Rapid-Flow(商標)組織培養フィルターユ
ニット及び無界面活性剤セルロースアセテートメンブレンフィルターユニット(VWR,
Radnor,PA,USA)で濾過した。得られた無菌溶液を適用前に振とうした。
無菌のPPO除草剤溶液を2回噴霧した。次に、処理した苗を容器に密閉し、各日噴霧後
に少なくとも15時間の光曝露を4日間受けさせた。S-3100施用後の4日目の終わ
りに、処理した苗を撮影し、緑色呈色(緑色呈色は、光退色した組織との比較で健康な光
合成植物組織を表す)対ダメージの視覚的尺度によりスコア化した。スコア値は、0が低
い耐容性、高ダメージ、低い緑色呈色、1がいくらかの耐容性、平均的ダメージ、中程度
の緑色呈色、2が良好な耐容性、低ダメージ、高い緑色呈色であった。各コンストラクト
のスコアを表9に提示する。n.d.は、分析が行われなかったことを示す。当該結果は
、この高スループットスクリーニングにおいて、複数のコンストラクトがPPO除草剤へ
の耐容性をもたらしたことを示す。
表9.除草剤耐容性についての高スループットダイズスクリーニング:呈色スコア
霧を行っていない容器の苗を、形質転換後およそ7週間時に移植し、R0植物として生育
した。0及び1の耐容性がないスコアに対応する苗も生育し、陰性対照にした。R0植物
を長日苗条件下(80°Fで18時間明期、次に74°Fで6時間暗期)でおよそ4週間
、温室で生育した。11週時に、上述のものと同じ除草剤溶液(0.3gのS-3100
)を2回、R0植物に噴霧した。処理から7日後に除草剤損傷評定を収集した。
プットスクリーニングで観察された低いパーセントの損傷評定スコアを裏付けるものだっ
た。30%以上の損傷評定は、非トランスジェニックダイズの損傷評定に相当する。いく
つかのコンストラクトは、除草剤施用に対する非常に良好な耐容性を示した点で際立って
いた。例えば、TP1においてPPO H_N90(配列番号11)を用いた場合はわず
か3%の損傷、PPO H_N30(配列番号14)またはH_N40(配列番号15)
を用いた場合はわずか5%の損傷、TP20においてPPO H_N90(配列番号11
)を用いた場合はわずか5%の損傷だった。これに対し、TP32においてPPO H_
N90(配列番号11)を用いた場合は50%の損傷スコアだった。データを表10に示
す。n.d.は、分析が行われなかったことを示す。
表10.R0トランスジェニックダイズの除草剤耐容性:パーセント損傷スコア
ciensによる植物形質転換ベクター及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、切
除胚(A3555)を形質転換する。再生したR0トランスジェニック苗を温室で生育し
、複数の群に分割する。これらの群に対し、群ごとに1種以上のPPO除草剤を噴霧して
除草剤耐容性を評価する。例えば、およそV2~V4生長段階のR0トランスジェニック
植物に対し、ラクトフェンを110g ai/ha(0.09lb ai/エーカー)ま
たは220g ai/ha(0.19lb ai/エーカー)の比率で噴霧する。処理か
ら1~14日後に植物の損傷を評価し、損傷スコアを記録する。トランスジェニックDN
A挿入のシングルコピーを有するトランスジェニック植物を同定するために葉のサンプル
を使用し、シングルコピーのみを含有し、かつ除草剤噴霧試験にパスするR0植物を同系
交配してR1種子を生成する。
のPPO除草剤を噴霧して除草剤耐容性を評価する。例えば、PPO除草剤のラクトフェ
ンを、発芽前に、及び/またはV2~V6生長段階に、200g ai/ha(0.19
lb ai/エーカー)の比率で施用する。処理から1~14日後に植物の損傷を評価し
、損傷スコアを記録する。噴霧を行わないトランスジェニック植物を、噴霧を行わない野
生型植物との表現型比較のために使用する。
植物を生じさせる。1箇所以上の野外の場所または温室アッセイでR2植物を評価する。
除草剤処理を施用し、除草剤施用から1~14日後にプロットまたは植物の作物損傷を0
~100の尺度(0が損傷なし、100が完全な作物の枯死)で評定する。
組み換えPPO酵素を発現するトランスジェニック植物における除草剤耐容性を迅速に
かつ最小限のダメージで評価するために、リーフディスクアッセイを使用した。コーン及
びダイズ植物から、幼若な完全に緑色の葉の組織をサンプル採取した。使い捨てのプラン
ジャー付き生検パンチ(Integra(登録商標)Miltex(登録商標),Inc
.,York,Pennsylvania)を用いて、葉のサンプルから直径4mmのリ
ーフディスクを5枚切り取り、これらのリーフディスクを蓋付き24ウェルポリスチレン
プレート中の1mlのインキュベート溶液(1mM MES、pH6.5、1% w/v
ショ糖、1%(v/v)アセトン)に入れた。除草剤耐容性分析のため、このインキュベ
ート溶液にS-3100を添加し、最終濃度を1マイクロモルにした。真空濾過を適用し
、リーフディスクのプレートを室温(23~24℃)、1日の連続暗期でインキュベート
し、次に天井の蛍光及び白熱電球(520uE)の下で26~27℃で、1日(ダイズ)
または2日(コーン)の連続明期でインキュベートした。次に、リーフディスクの損傷を
、0(最も低い損傷)~4(最も高い損傷)の尺度で視覚的にスコア化した。スコアが低
いほどPPO除草剤への耐容性が良好であることを示す。
ンスジェニックトウモロコシ植物からのリーフディスクは、平均リーフディスクスコア0
.4に基づく顕著な除草剤耐容性を示した。この結果は、コンストラクト6で形質転換し
、かつPPO酵素H_N10(配列番号4)を発現する完全植物において観察されたPP
O除草剤耐容性と一致するものであった。コンストラクト1及びコンストラクト11を用
いた、かつPPO酵素H_N10(配列番号4)を発現するトランスジェニックダイズ植
物からのリーフディスクにより、コンストラクト1による植物が損傷評定ゼロで顕著な除
草剤耐容性であるのに対し、コンストラクト11による植物は損傷評定1.6、非トラン
スジェニック植物は損傷評定2.6であることが示された。
微生物HemG PPO酵素をトランスジェニックワタ植物において発現させ、このト
ランスジェニック植物のPPO除草剤耐容性を分析する。ワタにおいては、A.tume
faciens及び当技術分野で公知の標準的方法を用いて、これらのベクターで切除胚
(Coker130)を形質転換した。再生したR0トランスジェニック苗を温室で生育
し、複数の群に分割する。これらの群は、PPO除草剤(群当たり1種のPPO除草剤)
を噴霧して耐容性を評価するために使用する。例えば、およそ本葉2~4枚の生長段階の
R0トランスジェニック苗に対し、ラクトフェンを110g ai/ha(0.09lb
ai/エーカー)または220g ai/ha(0.19lb ai/エーカー)の比
率で噴霧する。処理から1~14日後に植物の損傷を評価し、損傷スコアを記録する。葉
のサンプルを使用して、トランスジェニック挿入のシングルコピーを有するトランスジェ
ニック植物を同定する。シングルコピーのみを含有し、かつ除草剤噴霧試験にパスするR
0植物を同系交配してR1種子を生成する。
のPPO除草剤を噴霧して除草剤耐容性を評価する。例えば、PPO除草剤のラクトフェ
ンを、発芽前に、及び/または本葉2枚から初花の段階に、200g ai/ha(0.
19lb ai/エーカー)(1X)の比率で施用する。処理から1~14日後に植物の
損傷を評価し、損傷スコアを記録する。噴霧を行わないトランスジェニック植物を、噴霧
を行わない野生型植物との表現型比較のために使用する。
植物を生じさせる。1箇所以上の野外の場所または温室アッセイでR2植物を評価する。
除草剤処理を施用し、除草剤施用から1~14日後にプロットまたは植物の作物損傷を0
~100の尺度(0が損傷なし、100が完全な作物の枯死)で評定する。
Claims (25)
- 配列番号6および15からなる群から選択されるポリペプチド配列に対し少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列に作用可能に連結した異種プロモーターを含む組み換えDNA分子であって、前記タンパク質が除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有し、前記異種プロモーターが植物細胞中で機能する、前記組み換えDNA分子。
- 前記核酸配列が、配列番号27、37、46および59からなる群から選択される、請求項1に記載の組み換えDNA分子。
- 前記タンパク質が、配列番号6および15からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組み換えDNA分子。
- 前記核酸配列が、作用可能に連結したタンパク質を細胞内に局在化するように機能する標的配列をコードするDNA分子に作用可能に連結している、請求項1に記載の組み換えDNA分子。
- 請求項1に記載の組み換えDNA分子を含む、DNAコンストラクト。
- 前記組み換えDNAが、前記タンパク質を細胞内に局在化するように機能する標的配列をコードする作用可能に連結したDNA分子を含む、請求項5に記載のDNAコンストラクト。
- 前記タンパク質が前記細胞に除草剤耐容性を付与する、請求項6に記載のDNAコンストラクト。
- トランスジェニック植物、種子、または細胞のゲノム中に存在する、請求項5に記載のDNAコンストラクト。
- 請求項1に記載の組み換えDNA分子で形質転換された、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
- 追加のトランスジェニック除草剤耐容性形質を備える、請求項9に記載のトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
- 少なくとも1種のPPO除草剤への除草剤耐容性を備えるものとして定義される、請求項9に記載のトランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
- 請求項9に記載の種子。
- 組み換えポリペプチドを含む、トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分であって、該組み換えポリペプチドが、配列番号6および15から選択される全長のアミノ酸配列に対する少なくとも90%の配列同一性を備え、該組み換えポリペプチドが、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、前記トランスジェニック植物、種子、細胞、または植物部分。
- 植物、種子、細胞、または植物部分に除草剤耐容性を付与する方法であって、組み換えポリペプチドを前記植物、種子、細胞、または植物部分において異種発現させることを含み、該組み換えポリペプチドが、配列番号6および15から選択される全長のアミノ酸配列に対する少なくとも90%の配列同一性を備え、該組み換えポリペプチドが、除草剤不感受性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、前記方法。
- 前記植物、種子、細胞、または植物部分が、前記組み換えポリペプチドによって付与されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を備える、請求項14に記載の方法。
- 前記除草剤耐容性が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、チアフェナシル、1,5-ジメチル-6-チオキソ-3-(2,2,7-トリフルオロ-3,4-ジヒドロ-3-オキソ-4-プロパ-2-イニル-2H-1,4-ベンゾオキサジン-6-イル)-1,3,5-トリアジナン-2,4-ジオン及びS-3100からなる群から選択される、少なくとも1種のPPO除草剤に対するものである、請求項14に記載の方法。
- 植物の形質転換方法であって、
a)請求項1に記載の組み換えDNA分子を植物細胞に導入するステップと、
b)そこから前記組み換えDNA分子を含む植物を再生するステップと、を含む前記方法。 - 少なくとも1種のPPO除草剤に耐容性である植物を選択するステップをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 再生された植物を自らと、または第2の植物と交配させ、交配種から種子を収集するステップをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 植物生長区域における雑草を防除する方法であって、請求項9に記載のトランスジェニック植物または種子を含む植物生長区域を少なくとも1種のPPO除草剤に接触させることを含み、前記トランスジェニック植物または種子が前記PPO除草剤に耐容性であり、かつ雑草が前記植物生長区域において防除される、前記方法。
- PPO除草剤及び少なくとも1種の他の除草剤に耐容性の植物を生成する方法であって、
a)請求項9に記載の植物を取得することと、
b)前記トランスジェニック植物を、前記少なくとも1種の他の除草剤への耐容性を備えた第2の植物と交配させることと、
c)PPO除草剤及び前記少なくとも1種の他の除草剤への耐容性を備えた前記交配から得られた後代植物を選択することと、を含む前記方法。 - 除草剤耐容性雑草の発生を低減する方法であって、
a)作物生長環境において請求項10に記載の植物を栽培することと、
b)PPO除草剤及び少なくとも1種の他の除草剤を前記作物生長環境に施用すること
を含み、但し、前記植物が前記PPO除草剤及び前記少なくとも1種の他の除草剤に耐容性である、前記方法。 - 前記PPO除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、チアフェナシル、1,5-ジメチル-6-チオキソ-3-(2,2,7-トリフルオロ-3,4-ジヒドロ-3-オキソ-4-プロパ-2-イニル-2H-1,4-ベンゾオキサジン-6-イル)-1,3,5-トリアジナン-2,4-ジオン及びS-3100からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の他の除草剤が、ACCアーゼ阻害剤、ALS阻害剤、EPSPS阻害剤、合成オーキシン、光合成阻害剤、グルタミン合成阻害剤、HPPD阻害剤、PPO阻害剤、及び長鎖脂肪酸阻害剤からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記ACCアーゼ阻害剤が、アリールオキシフェノキシプロピオネートまたはシクロヘキサンジオンであり、前記ALS阻害剤が、スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、またはトリアゾリノンであり、前記EPSPS阻害剤が、グリホサートであり、前記合成オーキシンが、フェノキシ除草剤、安息香酸、カルボン酸、またはセミカルバゾンであり、前記光合成阻害剤が、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、またはウレアであり、前記グルタミン合成阻害剤が、グルホシネートであり、前記HPPD阻害剤が、イソオキサゾール、ピラゾロン、またはトリケトンであり、前記PPO阻害剤が、ジフェニルエーテル、N-フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、またはピリミジンジオンであり、または前記長鎖脂肪酸阻害剤が、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、またはピラゾールである、請求項24に記載の方法。
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