JP7118047B2 - 植物における遺伝子発現のための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年7月29日出願の米国仮出願第62/368,840号の利益を主張し、当該文献は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
コンピューター可読形態の配列リストが、電子申請によって本出願と共に提出され、参照によってその全体が本出願に援用される。配列リストは、MONS397WO_ST25という名称のファイルに含まれており、このファイルは、サイズが330キロバイト(オペレーティングシステムMS Windowsで測定)であり、2017年7月26日に作成されたものである。
本発明は、一般に、農業、植物バイオテクノロジー、及び分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、トランスジェニック植物における組換えタンパク質発現のための組成物、及びその使用方法に関する。
農作物の生産では、分子生物学の方法を使用して創出されたトランスジェニック形質を含めて、改変されたゲノムを有する作物が利用されることが多い。例えば、異種遺伝子は、導入遺伝子としても知られており、植物ゲノムに導入することができる。植物において導入遺伝子が発現すると、その植物に対して除草剤耐性または害虫防除などの形質が付与される。植物における導入遺伝子の良好な発現は、異種遺伝子発現要素を利用することによって達成され得る。このことの1つ例は、組換えタンパク質に輸送ペプチドを機能可能なように連結して使用することでその組換えタンパク質を細胞内に局在化させ、それによってタンパク質の発現または機能の増進を達成することである。したがって、植物細胞内に組換えタンパク質を効率的に局在化させる能力を有する新規の輸送ペプチドが必要とされている。
配列番号1~2及び配列番号236は、Arabidopsis thalianaのアルビノ及びペールグリーン(APG6)輸送ペプチドのアミノ酸配列である。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、遺伝子操作の結果であり、ヒトの介入によって創出された非天然のDNA、タンパク質、細胞、種子、または生物を指す。「組換えDNA分子」は、天然に生じることがなく、それ故に、ヒトの介入の結果であるDNA分子であり、こうしたDNA分子は、互いに異種の少なくとも2つのDNA配列の組み合わせから構成されるDNA分子などである。組換えDNA分子の例は、本発明の除草剤耐性タンパク質(配列番号100~119、配列番号163~182、及び配列番号224~228からなる群から選択される配列を含むプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼなど)をコードするDNA分子に機能可能なように連結された、本発明の輸送ペプチド(配列番号4~49及び配列番号236~266からなる群から選択される配列を含む輸送ペプチドなど)をコードする本明細書で提供されるDNA分子である。「組換えタンパク質」は、天然に生じることがなく、ヒトの介入の結果として生じるタンパク質である。組換えタンパク質の例は、本発明の除草剤耐性タンパク質(例えば、配列番号100~119、配列番号163~182、及び配列番号224~228からなる群から選択される配列を含むプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ)などの異種タンパク質に機能可能なように連結された本発明の輸送ペプチド(配列番号4~49及び配列番号236~266からなる群から選択される配列を含む輸送ペプチドなど)を含む本明細書で提供されるタンパク質である。組換え細胞、組換え種子、または組換え生物は、トランスジェニックまたは異種のDNAまたはタンパク質を含む細胞、種子、または生物であり、こうしたものは、例えば、本発明の異種DNA分子または異種タンパク質を含むトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック種子、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物部分である。
本発明の態様には、本発明によって提供される組換えDNA分子を含むトランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物組織、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック種子が含まれる。組換えDNA分子を含むこうした細胞、組織、植物、及び種子は、1つまたは複数のPPO除草剤(複数可)に対する耐性を示し、任意選択で、1つまたは複数の追加の除草剤(複数可)に対する耐性を示す。
一連の植物配列データベースから新規の輸送ペプチドを探し当てた。隠れマルコフモデル(HMM)、Pfamデータベース、及び基本的局所アライメント検索ツール(BLAST)などの、生物情報学的な方法及びツールを使用することで、植物細胞の葉緑体及びミトコンドリアに局在化することが知られるタンパク質(プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及び熱ショックタンパク質など)をコードすると予測される数千のEST及びゲノム配列を同定した。その後、こうした配列を解析し、輸送ペプチドをコードする配列を同定した。数千の推定輸送ペプチド配列を同定し、予測される効率及び比較配列多様性について評価した。こうしたことを行うことによって、植物細胞においてクローニング及び試験するために60の特有の輸送ペプチドを選択し、これらのいくつかについては変異体を作出した(本明細書では「_var」と示される)。表2は、それぞれの輸送ペプチド及びその変異体のタンパク質及びヌクレオチド配列に対応する配列番号を示す。
生物情報学的な方法及び新規の除草剤細菌スクリーニング系を使用し、PPO除草剤に対する耐性を有する新規の微生物HemGプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ及び微生物HemYプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを微生物配列データベースから同定した。このスクリーニング系では、PPO除草剤を含むLB液体培地においてhemGノックアウトE.coli株の増殖アッセイを実施することで、酵素のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を確認し、PPO除草剤に非感受性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを同定した。簡潔に記載すると、推定プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを含む細菌発現ベクターでhemGノックアウトE.coli株を形質転換し、LB液体培地において培養した。5つの異なるPPO除草剤(アシフルオルフェン(1mM)、フルミオキサジン(0.5mM)、ラクトフェン(0.5mM)、ホメサフェン(1mM)、及びS-3100(100マイクロM))(3つの異なるPPO化学サブクラスに相当する)のうちの1つを精製結晶形態で培地に添加した。組換えタンパク質を発現させ、E.coliの増殖速度を測定した。PPO除草剤の存在下及び非存在下における異なる変異体の増殖曲線(OD600)を0~24時間の選択時点で測定した。PPO除草剤の存在下でLB培地において形質転換hemGノックアウトE.coli株が増殖することによって、そのE.coliの形質転換に使用した遺伝子が除草剤耐性プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードすることが示された。ウォーターヘムプ(waterhemp)(WH)プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ(配列番号120)は、5つすべてのPPO除草剤に対して感受性であり、これを発現するhemGノックアウトE.coli株を対照として使用することで、それぞれの除草剤について、感受性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼと耐性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼとをアッセイで区別可能なことを確認した。
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに機能可能なように連結された輸送ペプチドのPPO除草剤耐性を植物プロトプラストにおいて試験した。輸送ペプチドに機能可能なように連結されたH_N90プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする組換えDNA分子を含む植物形質転換ベクターを構築した。その後、このベクターを使用して植物プロトプラストを形質転換し、形質転換した植物プロトプラストの、PPO除草剤に対する感受性を評価した。
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに機能可能なように連結された輸送ペプチドのPPO除草剤耐性をトランスジェニックダイズ植物において試験した。双子葉植物での発現が最適化され、輸送ペプチドに機能可能なように連結されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする組換えDNA分子を含むDNAコンストラクトを含めて植物形質転換ベクターを構築した。その後、この植物形質転換ベクターをダイズの形質転換に使用し、植物を再生させ、PPO除草剤に対するその感度を評価した。
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに機能可能なように連結された輸送ペプチドのPPO除草剤耐性をトランスジェニックトウモロコシ植物において試験した。単子葉植物での発現が最適化され、輸送ペプチドに機能可能なように連結されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする組換えDNA分子を含むDNAコンストラクトを含めて植物形質転換ベクターを構築した。その後、この植物形質転換ベクターをトウモロコシの形質転換に使用し、PPO除草剤に対する再生植物の感受性を評価した。
プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに機能可能なように連結された輸送ペプチドのPPO除草剤耐性をトランスジェニックワタ植物において試験した。双子葉植物での発現が最適化され、輸送ペプチドに機能可能なように連結されたプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする組換えDNA分子を含むDNAコンストラクトを含めて植物形質転換ベクターを構築した。その後、この植物形質転換ベクターをワタの形質転換に使用し、PPO除草剤に対する再生植物の感受性を評価した。
Claims (33)
- 異種除草剤耐性タンパク質をコードするDNA配列に機能可能なように連結された、輸送ペプチドをコードするDNA配列を含む組換えDNA分子であって、前記輸送ペプチドが、配列番号21、26、41、239、241、257、262、および265からなる群から選択される配列に対して少なくとも97パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記異種除草剤耐性タンパク質が、除草剤に非感受性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有し、かつ配列番号110、配列番号100、配列番号117又は配列番号118のアミノ酸配列に対して少なくとも97パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換えDNA分子。
- 前記異種除草剤耐性タンパク質が、配列番号110、配列番号100、配列番号117又は配列番号118の配列に対して少なくとも98パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 輸送ペプチドをコードする前記DNA配列が、配列番号71、76、91、272、270、288、293、および296からなる群から選択される配列に対して少なくとも97パーセントの同一性を有する核酸配列を含む、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 異種除草剤耐性タンパク質をコードする前記DNA配列が、配列番号121、配列番号141、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号153及び配列番号228からなる群から選択される配列に対して少なくとも97パーセントの同一性を有する核酸配列を含む、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 輸送ペプチドをコードする前記DNA配列に機能可能なように連結された異種プロモーターをさらに含む、請求項1に記載の組換えDNA分子。
- 異種プロモーターに機能可能なように連結された、請求項1に記載のDNA分子を含む、DNAコンストラクト。
- 前記異種除草剤耐性タンパク質が、除草剤に非感受性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有する、請求項6に記載のDNAコンストラクト。
- 前記異種除草剤耐性タンパク質が、配列番号110、配列番号100、配列番号117又は配列番号118のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のDNAコンストラクト。
- 前記DNAコンストラクトが、トランスジェニック植物、トランスジェニック種子、またはトランスジェニック細胞のゲノムに存在する、請求項6に記載のDNAコンストラクト。
- 請求項1に記載の組換えDNA分子を含む、トランスジェニック植物、トランスジェニック種子、またはトランスジェニック細胞。
- 前記植物、種子、または細胞が、少なくとも1つのPPO除草剤に対する耐性を有する、請求項10に記載のトランスジェニック植物、トランスジェニック種子、またはトランスジェニック細胞。
- 前記PPO除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、及びS-3100からなる群から選択される、請求項11に記載のトランスジェニック植物、トランスジェニック種子、またはトランスジェニック細胞。
- 前記トランスジェニック植物、トランスジェニック種子、またはトランスジェニック細胞が、少なくとも第2の除草剤に対する耐性を有する、請求項10に記載のトランスジェニック植物、トランスジェニック種子、またはトランスジェニック細胞。
- a)配列番号21、26、41、239、241、257、262、および265からなる群から選択される配列に対して少なくとも95パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む輸送ペプチドと、
b)除草剤に非感受性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有し、かつ配列番号110、配列番号100、配列番号117又は配列番号118のアミノ酸配列に対して少なくとも97パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、異種除草剤耐性タンパク質と、
が機能可能なように連結されて含まれる、組換えタンパク質。 - 請求項14に記載の組換えタンパク質を含む、トランスジェニック植物、トランスジェニック種子、またはトランスジェニック細胞。
- a)請求項1に記載の組換えDNA分子で植物細胞を形質転換する段階と、
b)前記DNA分子を含む除草剤耐性植物をそこから再生させる段階と、
を含む、除草剤耐性植物の作出方法。 - 1つまたは複数の子孫植物を作出するために、再生植物と、それ自体または第2の植物と、を交配させる段階をさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記異種除草剤耐性タンパク質が、配列番号110、配列番号100、配列番号117又は配列番号118のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1つのPPO除草剤に対する耐性を有する子孫植物を選択する段階をさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記PPO除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、及びS-3100からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 除草剤耐性のトランスジェニック植物またはトランスジェニック種子の作出方法であって、除草剤耐性のトランスジェニック植物またはトランスジェニック種子を作出するために、請求項1に記載の組換えDNA分子を含む植物と、それ自体または第2の植物と、を交配させることを含む、前記方法。
- 植物または細胞における異種除草剤耐性タンパク質の発現方法であって、前記方法が、請求項1に記載の組換えDNA分子を含む植物または細胞を成長させることを含み、前記成長の結果、前記異種除草剤耐性タンパク質が発現する、前記方法。
- 植物成長区域における雑草成長の管理方法または阻止方法であって、前記方法が、請求項11に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック種子を含む植物成長区域に対して少なくとも1つのPPO除草剤を有効量で適用することを含み、前記トランスジェニック植物またはトランスジェニック種子が、前記PPO除草剤に対する耐性を有する、前記方法。
- 前記PPO除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、及びS-3100からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- 除草剤耐性雑草の成長管理方法であって、前記方法が、
a)植物成長区域における請求項11に記載の植物または種子の栽培と、
b)前記植物成長区域に対するPPO除草剤及び少なくとも1つの他の除草剤の適用と、を含み、前記植物または種子が、前記PPO除草剤及び前記少なくとも1つの他の除草
剤に対する耐性を有する、前記方法。 - 前記PPO除草剤が、アシフルオルフェン、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェン-エチル、オキシフルオルフェン、フルミオキサジン、アザフェニジン、カルフェントラゾン-エチル、スルフェントラゾン、フルチアセット-メチル、オキサジアルギル、オキサジアゾン、ピラフルフェン-エチル、サフルフェナシル、及びS-3100からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの他の除草剤が、ACCase阻害剤、ALS阻害剤、EPSPS阻害剤、合成オーキシン、光合成阻害剤、グルタミン合成酵素阻害剤、HPPD阻害剤、PPO阻害剤、及び長鎖脂肪酸阻害剤からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記ACCase阻害剤が、アリールオキシフェノキシプロピオン酸もしくはシクロヘキサンジオンであり、前記ALS阻害剤が、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、もしくはトリアゾリノンであり、前記EPSPS阻害剤が、グリホサートであり、前記合成オーキシンが、フェノキシ除草剤、安息香酸、カルボン酸、もしくはセミカルバゾンであり、前記光合成阻害剤が、トリアジン、トリアジノン、ニトリル、ベンゾチアジアゾール、もしくは尿素であり、前記グルタミン合成酵素阻害剤が、グルホシネートであり、前記HPPD阻害剤が、イソキサゾール、ピラゾロン、もしくはトリケトンであり、前記PPO阻害剤が、ジフェニルエーテル、N-フェニルフタルイミド、アリールトリアジノン、もしくはピリミジンジオンであり、または前記長鎖脂肪酸阻害剤が、クロロアセトアミド、オキシアセトアミド、もしくはピラゾールである、請求項27に記載の方法。
- 異種除草剤耐性タンパク質をコードするDNA配列に機能可能なように連結された、輸送ペプチドをコードするDNA配列を含む組換えDNA分子であって、前記輸送ペプチドが、配列番号21、26、41、239、241、257、262、および265からなる群から選択される配列に対して少なくとも95パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記異種除草剤耐性タンパク質が、除草剤に非感受性のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を有し、かつ配列番号110、配列番号100、配列番号117又は配列番号118のアミノ酸配列に対して少なくとも95パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記組換えDNA分子。
- 前記異種除草剤耐性タンパク質が、配列番号110、配列番号100、配列番号117又は配列番号118の配列に対して少なくとも97パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の組換えDNA分子。
- 輸送ペプチドをコードする前記DNA配列が、配列番号71、76、91、272、270、288、293、および296からなる群から選択される配列に対して少なくとも95パーセントの同一性を有する核酸配列を含む、請求項29に記載の組換えDNA分子。
- 異種除草剤耐性タンパク質をコードする前記DNA配列が、配列番号121、配列番号141、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号153及び配列番号228からなる群から選択される配列に対して少なくとも95パーセントの同一性を有する核酸配列を含む、請求項29に記載の組換えDNA分子。
- 輸送ペプチドをコードする前記DNA配列に機能可能なように連結された異種プロモーターをさらに含む、請求項29に記載の組換えDNA分子。
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