UA125280C2 - Ген стійкості до гербіцидів і спосіб його застосування - Google Patents
Ген стійкості до гербіцидів і спосіб його застосування Download PDFInfo
- Publication number
- UA125280C2 UA125280C2 UAA201704604A UAA201704604A UA125280C2 UA 125280 C2 UA125280 C2 UA 125280C2 UA A201704604 A UAA201704604 A UA A201704604A UA A201704604 A UAA201704604 A UA A201704604A UA 125280 C2 UA125280 C2 UA 125280C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- plant
- mom
- herbicides
- plants
- herbicide
- Prior art date
Links
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 title claims abstract description 233
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 230
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 121
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 40
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 39
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 26
- -1 pyridinyloxy Chemical group 0.000 claims abstract description 26
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 408
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 224
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 100
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 30
- ABOOPXYCKNFDNJ-UHFFFAOYSA-N 2-{4-[(6-chloroquinoxalin-2-yl)oxy]phenoxy}propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CN=C(C=C(Cl)C=C2)C2=N1 ABOOPXYCKNFDNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 2
- 241001214257 Mene Species 0.000 claims description 2
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101100316808 Arabidopsis thaliana VHA-E1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 claims 1
- 102100021807 ER degradation-enhancing alpha-mannosidase-like protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 240000006829 Ficus sundaica Species 0.000 claims 1
- 238000001982 He+-excited Auger electron spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 101000895701 Homo sapiens ER degradation-enhancing alpha-mannosidase-like protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000087799 Koma Species 0.000 claims 1
- 241000840267 Moma Species 0.000 claims 1
- 241001206439 Motya Species 0.000 claims 1
- 101100453251 Penicillium janthinellum janM gene Proteins 0.000 claims 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 claims 1
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 claims 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 claims 1
- 241001343083 Tonna Species 0.000 claims 1
- 101150009898 VATE gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000289690 Xenarthra Species 0.000 claims 1
- 244000145841 kine Species 0.000 claims 1
- 229920000767 polyaniline Polymers 0.000 claims 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims 1
- CGVPQHIRIGIDLE-UHFFFAOYSA-N 3-(2-aminooxyphenyl)propanoic acid Chemical compound NOC1=CC=CC=C1CCC(O)=O CGVPQHIRIGIDLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108010051842 Advanced Oxidation Protein Products Proteins 0.000 abstract 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 123
- ABOOPXYCKNFDNJ-SNVBAGLBSA-N quizalofop-P Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CN=C(C=C(Cl)C=C2)C2=N1 ABOOPXYCKNFDNJ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 98
- 239000005609 Quizalofop-P Substances 0.000 description 96
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 68
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 64
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 48
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 48
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 46
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 41
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 41
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 39
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 38
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 33
- 108091033319 polynucleotide Chemical group 0.000 description 31
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 31
- 239000002157 polynucleotide Chemical group 0.000 description 31
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 28
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 27
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 27
- 229920006344 thermoplastic copolyester Polymers 0.000 description 27
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 20
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 19
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 19
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 19
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 19
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 18
- 241000102542 Kara Species 0.000 description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 15
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 15
- 239000005558 Fluroxypyr Substances 0.000 description 13
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 13
- MEFQWPUMEMWTJP-UHFFFAOYSA-N fluroxypyr Chemical compound NC1=C(Cl)C(F)=NC(OCC(O)=O)=C1Cl MEFQWPUMEMWTJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000005627 Triclopyr Substances 0.000 description 11
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 11
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 11
- REEQLXCGVXDJSQ-UHFFFAOYSA-N trichlopyr Chemical compound OC(=O)COC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl REEQLXCGVXDJSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 6
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N cyclohexane-1,2-dione Chemical compound O=C1CCCCC1=O OILAIQUEIWYQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 5
- GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[3-chloro-5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC=C(C(F)(F)F)C=C1Cl GOCUAJYOYBLQRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 2-(4-{[5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy}phenoxy)propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=N1 YUVKUEAFAVKILW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100116570 Caenorhabditis elegans cup-2 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- 101100116572 Drosophila melanogaster Der-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 4
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 4
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MPPOHAUSNPTFAJ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[(6-chloro-1,3-benzoxazol-2-yl)oxy]phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC2=CC=C(Cl)C=C2O1 MPPOHAUSNPTFAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 241000211181 Manta Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 3
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-LDRANXPESA-N methoprene Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)C\C=C\C(\C)=C\C(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-LDRANXPESA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009526 moderate injury Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 230000008654 plant damage Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- MZHCENGPTKEIGP-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl MZHCENGPTKEIGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WNTGYJSOUMFZEP-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1C WNTGYJSOUMFZEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 241000258241 Mantis Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- MPPOHAUSNPTFAJ-SECBINFHSA-N (2r)-2-[4-[(6-chloro-1,3-benzoxazol-2-yl)oxy]phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC2=CC=C(Cl)C=C2O1 MPPOHAUSNPTFAJ-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- ADDQHLREJDZPMT-AWEZNQCLSA-N (S)-metamifop Chemical compound O=C([C@@H](OC=1C=CC(OC=2OC3=CC(Cl)=CC=C3N=2)=CC=1)C)N(C)C1=CC=CC=C1F ADDQHLREJDZPMT-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 1
- BDQWWOHKFDSADC-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dichloro-3-methylphenoxy)-n-phenylpropanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC(=O)C(C)OC1=CC=C(Cl)C(C)=C1Cl BDQWWOHKFDSADC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2,4-dichlorophenoxy)phenoxy]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OOLBCHYXZDXLDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000000383 Alpha-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenase FTO Human genes 0.000 description 1
- 108010016119 Alpha-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenase FTO Proteins 0.000 description 1
- 239000005468 Aminopyralid Substances 0.000 description 1
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 235000017399 Caesalpinia tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007681 Catha edulis Species 0.000 description 1
- 235000006696 Catha edulis Nutrition 0.000 description 1
- 241000839426 Chlamydia virus Chp1 Species 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 239000005498 Clodinafop Substances 0.000 description 1
- 239000005500 Clopyralid Substances 0.000 description 1
- 235000017788 Cydonia oblonga Nutrition 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 239000005506 Diclofop Substances 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241001522296 Erithacus rubecula Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004230 Fast Yellow AB Substances 0.000 description 1
- 239000005513 Fenoxaprop-P Substances 0.000 description 1
- WHWHBAUZDPEHEM-UHFFFAOYSA-N Fenthiaprop Chemical compound C1=CC(OC(C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC2=CC=C(Cl)C=C2S1 WHWHBAUZDPEHEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006424 Flood reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005530 Fluazifop-P Substances 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 108010063907 Glutathione Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100036442 Glutathione reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000654674 Homo sapiens Semaphorin-6A Proteins 0.000 description 1
- ANFHKXSOSRDDRQ-UHFFFAOYSA-N Isoxapyrifop Chemical compound C1CCON1C(=O)C(C)OC(C=C1)=CC=C1OC1=NC=C(Cl)C=C1Cl ANFHKXSOSRDDRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150104182 MOB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000150100 Margo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100107555 Mus musculus Aarsd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001611408 Nebo Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000950458 Oxandra laurifolia Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 239000005595 Picloram Substances 0.000 description 1
- 239000005600 Propaquizafop Substances 0.000 description 1
- 101001047739 Rattus norvegicus Lamina-associated polypeptide 2, isoform beta Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 102100032795 Semaphorin-6A Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000388430 Tara Species 0.000 description 1
- 241001424341 Tara spinosa Species 0.000 description 1
- 206010057040 Temperature intolerance Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241001199012 Usta Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- NIXXQNOQHKNPEJ-UHFFFAOYSA-N aminopyralid Chemical compound NC1=CC(Cl)=NC(C(O)=O)=C1Cl NIXXQNOQHKNPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- YUIKUTLBPMDDNQ-MRVPVSSYSA-N clodinafop Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=NC=C(Cl)C=C1F YUIKUTLBPMDDNQ-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- HUBANNPOLNYSAD-UHFFFAOYSA-N clopyralid Chemical compound OC(=O)C1=NC(Cl)=CC=C1Cl HUBANNPOLNYSAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003366 endpoint assay Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036253 epinasty Effects 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- YUVKUEAFAVKILW-SECBINFHSA-N fluazifop-P Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(O)=O)=CC=C1OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=N1 YUVKUEAFAVKILW-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008543 heat sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 101150115538 nero gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N picloram Chemical compound NC1=C(Cl)C(Cl)=NC(C(O)=O)=C1Cl NQQVFXUMIDALNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- FROBCXTULYFHEJ-OAHLLOKOSA-N propaquizafop Chemical compound C1=CC(O[C@H](C)C(=O)OCCON=C(C)C)=CC=C1OC1=CN=C(C=C(Cl)C=C2)C2=N1 FROBCXTULYFHEJ-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006432 protein unfolding Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 208000018655 severe necrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/10—Seeds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/08—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a chloroplast localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
- C12Y114/11033—DNA oxidative demethylase (1.14.11.33)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Protection Of Plants (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Винахід стосується рекомбінантної молекули ДНК для надання стійкості до гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот, і також стійких до гербіцидів трансгенних рослин, насіння, клітин і частин рослин, які містять рекомбінантні молекули ДНК, а також способів їх застосування.
Description
(54) ГЕН СТІЙКОСТІ ДО ГЕРБІЦИДІВ І СПОСІБ ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ (57) Реферат:
Винахід стосується рекомбінантної молекули ДНК для надання стійкості до гербіцидів на основі
АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот, і також стійких до гербіцидів трансгенних рослин, насіння, клітин і частин рослин, які містять рекомбінантні молекули ДНК, а також способів їх застосування.
ПЕРЕХРЕСНІ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕННІ ЗАЯВКИ
ІО00О1| Справжня заявка заявляє пріоритет попередньої заявки на патент США Моб2/064343, яка була подана 15 жовтня 2014 року, і яка включена в цей документ в повному обсязі шляхом посилання.
ВКЛЮЧЕННЯ ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
0002) Перелік послідовностей, який міститься у файлі під назвою "ШОМ5378УМО 5125", який має розмір 118,364 байт (вимірено в М5-УМІМООМУ5), і який був створений 25 вересня 2015 року, подається в цьому документі в електронній формі і включений в цей документ шляхом посилання.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Галузь винаходу
ІО0ОЗІ Винахід в цілому, як правило, відноситься до галузі біотехнології. Більш конкретно, винахід пов'язаний з рекомбінантними молекулами ДНК, які кодують ферменти, що викликають руйнування гербіцидів. Винахід також відноситься до трансгенних рослин, частин, насіння, клітин і частин рослин, які містять рекомбінантні молекули ДНК, а також способів їх застосування.
Опис рівня техніки
Ї0004| У виробництві сільськогосподарських культур часто використовується трансгенні ознаки, створені з допомогою способів біотехнології. Гетерологічний ген, також відомий як трансген, вводиться в рослину для отримання трансгенної ознаки. Експресія трансгена в рослині дає бажану ознаку, таку як стійкість до гербіциду, по всій рослині. Приклади трансгенних ознак стійкості до гербіцидів включають стійкість до гліфосату, стійкість до глюфосинату, і стійкість до дікамба. Зі збільшенням кількості видів бур'янів, резистентних до найбільш часто вживаних гербіцидів, у полі стали необхідними нові ознаки стійкості до гербіцидів. Гербіциди, які представляють особливий інтерес, являють собою гербіциди на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі піридинілоксикислот. Гербіциди на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі піридинілоксикислот забезпечують контроль над спектром стійких до гліфосату бур'янів, тим самим роблячи ознаку, яка надає стійкість до цих
Зо гербіцидів, особливо корисною в системі рослинництва в поєднанні з іншою ознакою(-ами) стійкості до гербіциду(-дів).
Ї0005| Штам МН б5рНіпдобішт Негбрісідомогапе, виділений зі зразка грунту, що руйнує дихлоропроп, був ідентифікований як здатний розщеплювати ефірні зв'язки різних феноксиалканових кислот і гербіцидів, використовуючи їх як єдине джерело вуглецю та енергії для росту (НРЕ КопПіег, Уоигпаї ої Іпдивігіа! Місгоріоюду 5 Віоїесппоїоду (1999) 23: 336-340).
Катаболізм гербіцидів здійснюють дві різні енантіоселективні альфа-кетоглутаратзалежні диоксигенази, КарА (К-дихлорпропдиоксигеназа) і зарА (5-дихлорпропдиоксигеназа). (А
Мезієпаої, еї аї., Містобіоіодісаї Незеагсп (2002) 157: 317-322; МУевіепаої, еї аї., Асіа
Віотесппоіодіса (2003) 23 (1): 3-17). КарА був ізольований з 5рпіпдобіит Негбісідомогапе (номер доступу Генбанку АБ516752 (ДНК) і ААМ90965 (білок)) і ЮОеШіа асідомогап5 (номер доступу
Генбанку МО 036924 (ДНК) і ХР. 009083283 (білок)) (ТА Миеїгег, єї а!., Арріїєд апа Епмігоптепіаї
Місторіоїоду (2004) 70 (10):6066-6075.) Для того, щод надати культурам стійкість до гербіцидів для трансформації рослин були використані гени КараА і зарА (ТЕ Умгідні, єї а!., Ргосеєдіпдв ої
Ше Маїйопа! Асадету ої Зсіепсе5 БА, (2010) 107 (47)20240-5). Підвищення активності ферменту КараА із застосуванням технологій білкової інженерії для того, щоб створити білок для використання в трансгенних рослинах, дозволило б підвищити норми застосування гербіцидів, таким чином покращивши безпеку трансгенних культур і заходи боротьби з бур'янами.
КОРОТКИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
ЇО0О6| У винаході запропонований поліпептид, який має щонайменше близько 92 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з
ЗЕО ІЮО МО-1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 і 46-52. В одному варіанті реалізації винаходу, поліпептид має оксигеназну активність проти щонайменше одного гербіциду, вибраного з групи, що складається з гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
Ї0О007| У винаході запропонована рекомбінантна молекула ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який має щонайменше близько 92 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ
МО-1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 і 46-52. В одному варіанті реалізації винаходу, рекомбінантна молекула ДНК містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що 60 складається з ЗЕО ІЮ МО:2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30,
32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45, і 53-59. В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантна молекула ДНК кодує поліпептид з оксигеназною активністю проти щонайменше одного гербіциду, вибраного з групи, що складається з гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантна молекула ДНК функціонально з'єднана з гетерологічним промотором, функціональним в рослинній клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантна молекула ДНК функціонально з'єднана з молекулою ДНК, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, функція якого полягає в локалізації функціонально-з'єднаного поліпептиду всередині клітини.
ЇО00О8| У винаході запропонована ДНК-конструкція, яка містить гетерологічний промотор, функціональний в рослинній клітині, який функціонально-з'єднаний з рекомбінантною молекулою ДНК, яка кодує поліпептид, який має щонайменше близько 92 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ
МО-:1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, і 46-52. В одному варіанті реалізації винаходу, рекомбінантна молекула ДНК функціонально з'єднана з молекулою ДНК, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, функція якого полягає в локалізації функціонально- з'єднананого поліпептиду всередині клітини. В іншому варіанті реалізації винаходу, рекомбінантна молекула ДНК кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО-1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, і 46-52, і експресія поліпептиду в трансгенній рослині надає рослині стійкість до гербіцидів. В іншому варіанті реалізації винаходу, ДНК-конструкція присутня в геномі трансгенної рослини.
ЇО009| У винаході запропонована трансгенна рослина, насінина, клітина, або частина рослини, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який має щонайменше близько 9295 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, і 46-52. В одному варіанті реалізації винаходу, трансгенна рослина, насінина, клітина або частина рослини містить трансгенну ознаку стійкості до щонайменше одного гербіциду, вибраного з групи, що складається з гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі
Зо піридинілоксикислот. В іншому варіанті реалізації винаходу, трансгенна рослина, насінина, клітина або частина рослини містить ДНК-конструкцію згідно цього винаходу. В іншому варіанті реалізації винаходу, трансгенна рослина, насінина, клітина або частина рослини містить поліпептид згідно цього винаходу.
Ї0О010| У винаході запропонований спосіб надання рослині, насінині, клітині, або частині рослини стійкості до гербіцидів, що включає експресію поліпептиду згідно цього винаходу в рослині, насінині, клітині або частині рослини. В одному варіанті реалізації винаходу, спосіб надання стійкості до гербіцидів застосовується до трансгенної рослини, насінини, клітини або частини рослини, що містять трансгенну ознаку, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК згідно цього винаходу. В одному варіанті реалізації винаходу, спосіб надання стійкості до гербіцидів застосовується з гербіцидом, обраним із групи, що складається з гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот. 0011 У винаході запропонований спосіб трансформації рослини, який включає введення
ДНК-конструкції згідно цього винаходу в рослинну клітину і регенерацію з неї рослини, яка містить ДНК-конструкцію, і яка стійка до щонайменше одного гербіциду, обраного з групи на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот. В одному варіанті реалізації винаходу, спосіб трансформації рослини включає схрещування регенерованої рослини з самою собою або з другою рослиною, і збір насіння з гібрида. 00121 У винаході запропонований спосіб контролю бур'янів на ділянці вирощування рослин, шляхом впливу на ділянку вирощування рослин, що містить трансгенні рослини або насіння згідно цього винаходу, щонайменше одним гербіцидом, обраним з групи, що складається з гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот, при цьому трансгенна рослина або насінина є стійкою до гербіциду.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
0013) Фіг. 1. Контрольні і МОМ-НТ5Ь5 (5ЕО ІО МО:11) трансгенні рослин кукурудзи після обробки квізалофопом-П. На Фіг. 1А проілюстровані контрольні і трансгенні рослини кукурудзи які або необроблені, або оброблені 1Х квізалофопа-П (0,08 фунта д.р./акр). На Фіг. 1Б бо проілюстровані гібридні контрольні рослини кукурудзи НЕ1, а на Фіг. 18 проілюстровані гібридні трансгенні рослини кукурудзи МОМ-НТ55 Е1ї. Рослини вирощували при денних/нічних температурах рівних (1) 20 "С/20 "С, (2) 28 "С/20 "С, або (3) 38 "С/30 "С перед обприскуванням 2Х квізалофопа-П. 0014) Фіг. 2. Графіки, які показують залежну від температури активність сконструйованих білків. На фіг. 2А проілюстровані активність ферменту Карі МОМ-НТ5Ь5 (5ЕО ІЮО МО:11) і ферменту КарА дикого типу при тестуванні із застосуванням квізалофопа-П в якості субстрату.
На Фіг. 2Б проілюстровані активність Кард МОМ-НТІ1 (5ЕО 10 МО:14), МОМ-НТ2 (5ЕО ІЮ МО:18),
МОМ-НТ2 (5ЕО І МО:34), МОМ-НТ2 (5ЕО І МО:37) і КарА дикого типу при тестуванні із застосуванням квізалофопа-П в якості субстрату. На Фіг. 28 проілюстровані активність КарА
МОМ-НТІ, МОМ-НТ2г, МОМ-НТ7, МОМ-НТВ і КкарА дикого типу при тестуванні із застосуванням 2,4-О0 в якості субстрату. Дані нормовані до активності кожного білка при 251760. 0015) Фіг. 3. Білкова послідовність КарА дикого типу (ЗЕО ІЮ МО:60) з ілюстративними положеннями амінокислот, придатними для білкової інженерії, які позначені квадратами. 0016) Фіг. 4. Середня оцінка пошкодження після застосування 2Х квізалофопа-П (0,16 фунта д.р./акр) (4А, 4Б і 48) або 4Х 2,4-О0 (4 фунта д.р./акр) (4Г і 4Д) до Е1 гібридних рослин кукурудзи (інбредні гомозиготні КІ експресуючі МОМ-НТ х МОМ89034), які експресують МОМ-
НТ55 (ЗЕО ІЮ МО:11), МОМ-НТІ (5ЕО І МО:14), МОМ-НТ2 (5ЕО ІЮ МО:18), МОМ-НТЗ (5ЕО 10
МО:22), МОМ-НТА (5ЕО І МО:25), МОМ-НТ7 (5ЕО ІО МО:34) або Е1 гібридного контролю (МКбОЗ х МОМ89034). Дані, отримані на рослинах, адаптованих до денних і нічних температур, встановлених на рівні 20 "С (20 | С/20 "С) перед нанесенням 2Х квізалофопа-П (Фіг. 4А) або 4Х 2,А-О (Фіг. АГ); На Фіг. 4Б проілюстровані дані, отримані на рослинах, адаптованих при денній температурі 28 "С і нічній температурі 20 "С (28 "С/20 "С) перед нанесенням 2Х квізалофопа-П; на Фіг. 4В проілюстровані дані, отримані на рослинах, акліматизованих при денній температурі 38 "С і нічний температурі 30 "С (38 "С /30 "С) перед нанесенням 2Х квізалофопа-П (Фіг. 4В) або
АХ 2,А-О (Фіг. 4Д). 00171 Фіг. 5. 5А і 5Б: Контрольні та трансгенні рослини кукурудзи, які містять МОМ-НТ2 (5ЕО
ІО МО:20, що кодує ЗЕО ІО МО':18), з ТПХ або без ТПХ, де рослини отримували квізалофоп-П в 16Х нормі (1,28 фунта д.р./акр), застосованій на М2, після чого вона була застосована на МА, і фотографії, зроблені через 10-14 днів після застосування квізалофопа-П.
Зо 0018) Фіг. бА - Фіг. 6Д. Множинне вирівнювання білкових послідовностей для КарА дикого типу з 5. пегбісідомогапе (5ЕО ІЮО МО:60) ії 5ЕО ІЮ МО, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 і 46-52 з консенсусною послідовністю (представленою у вигляді ЗЕО ІЮ МО:61), представленою в нижній частині кожної з Фіг. бА, 6Б, 68, 6Г, бД.
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ї0019| 5ЕО 10 МО:1-3 є послідовностями МОМ-НТ51: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних. 0020 5ЕО 10 МО:4-6 є послідовностями МОМ-НТ52: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність 3 Кодонами однодольних.
І0021| 5ЕО 10 МО:7-8 є послідовностями МОМ-НТ5ЬЗ3: амінокислотна послідовність і полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами.
І0022| 5ЕО 10 МОс9-10 є послідовностями МОМ-НТ5Б4: амінокислотна послідовність і полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами.
І0023| 5ЕО 10 МО:11-13 є послідовностями МОМ-НТ55: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних. 0024 5ЕО 10 МО:14-17 є послідовностями МОМ-НТІ: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кодонами дводольних.
І0025| 5ЕО 10 МО:18-21 є послідовностями МОМ-НТ2: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами дводольних. 0026 5ЕО 10 МО:22-24 є послідовностями МОМ-НТЗ: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних. 0027 5ЕО 10 МО: 25-27 є послідовностями МОМ-НТ4: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних.
0028 5ЕО 10 МО: 28-30 є послідовностями МОМ-НТ5: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних.
І0029| 5ЕО 10 МО:31-33 є послідовностями МОМ-НТб: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних. 0030 5ЕО 10 МО:34-36 є послідовностями МОМ-НТ7: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних.
Ї0О31| 5ЕО 10 МО:37-39 є послідовностями МОМ-НТВ8: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних.
І0032| 5ЕО 10 МО:40-42 є послідовностями МОМ-НТУ: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність 3 КоОодонами однодольних.
Ї0ОЗ33| 5ЕО 10 МО:43-45 є послідовностями МОМ-НТІ10: амінокислотна послідовність, полінуклеотидна послідовність з бактеріальними кодонами і оптимізована полінуклеотидна послідовність з кКодонами однодольних. 00341 5ЕО 10 МО:46-52 є амінокислотними послідовностями МОМ-НТІТ1, МОМ-НТ13, МОМ-
НТІ14, МОМ-НТІ15, МОМ-НТ16, МОМ-НТ17 і МОМ-НТ18.
І0035| 5ЕО 10 МО:53-59 є полінуклеотидними послідовностями МОМ-НТІ11, МОМ-НТ13,
МОМ-НТІ14, МОМ-НТ15, МОМ-НТ16, МОМ-НТІ17 і МОМ-НТ18 з оптимізованим кодонами дводольних. 0036) ЗЕО І МО:60 є амінокислотною послідовністю для КарА дикого типу з 5рпіпдорійт
Пегрісідомогапв.
Ї0037| БЕО ІЮ МО:61 є консенсусною послідовністю фіг. бА - Фіг. бД.
ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
І0ООЗ8)| Наступні визначення та способи запропоновані для того, щоб краще визначити цей винахід і направити середнього фахівця в цій галузі техніки в практичному підході за цим винаходом. Якщо не вказано інше, терміни слід розуміти відповідно до звичайного застосування середніми фахівцями в цій галузі техніки.
ЇОО39| Винахід усуває обмеження попереднього рівня техніки шляхом надання нових, сконструйованих білків, які називаються в цьому документі біль»ами МОМ-НТ, і рекомбінантних молекул ДНК, які їх кодують, а також композицій і способів їх застосування. Біло МОМ-НТ є оксигеназами, які можуть інактивувати гербіциди на основі арілоксифеноксипропіонату (АХОФП), гербіциди на основі феноксикислот і гербіциди на основі піридинілоксикислот. Термін "інактивація гербіциду", який застосовується в цьому документі, означає, що гербіцид більше не володіє гербіцидною активністю проти рослини. Білии МОМ-НТ виявляють нову субстратну селективність, корисну ферментативну кінетику і збільшену стабільність ферменту при підвищеній температурі. Трансгенні рослини, які експресують білок МОМ-НТ, демонструють поліпшену стійкість до впливу гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
Сконструйовані білки і рекомбінантні молекули ДНК
Ї00401 У винаході запропоновані нові сконструйовані білки і рекомбінантні молекули ДНК, які їх кодують. Термін "сконструйований", який застосовується в цьому документі, відноситься до штучної ДНК, білка або організму, які зазвичай не зустрічаються в природі і які були створені шляхом людського втручання. "Сконструйований білок" є білком, поліпептидна послідовність якого була задумана і створена в лабораторії із застосуванням одного або кількох методів білкової інженерії, таких як дизайн білка з використанням сайт-спрямованого мутагенезу і спрямованої еволюції із застосуванням випадкового мутагенезу і перетасування ДНК.
Наприклад, сконструйований білок може мати одну або більше делецій, вставок або замін відносно послідовності, яка кодує білок дикого типу, і кожна делеція, інсерція або заміна може складатися з однієї або більше амінокислоти. Приклади сконструйованих білків представлені в цьому документі як ЗЕО ІЮ МО, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 і 46-52.
Ї00411| Сконструйовані білки, запропоновані в цьому винаході, є ферментами, які володіють оксигеназною активністю. Як застосовується в цьому документі, термін "оксигеназна активність" означає здатність окислювати субстрат шляхом перенесення оксигену з молекулярного кисню на субстрат, побічний продукт або інтермедіат. Оксигеназна активність сконструйованих білків, запропонованих у винаході, може інактивувати один або більше з гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
Ї0042| Як застосовується в цьому документі, термін "дикий тип" позначає той, що зустрічається в природі. Як застосовується в цьому документі, "молекула ДНК дикого типу", "поліпептид дикого типу" або "білок дикого типу" є молекулою ДНК, поліпептидом або білком, які зустрічаються в природі, тобто молекулою ДНК, поліпептидом або білком, що раніше існувала(- ав) в природі. Варіант поліпептиду, білка або молекули ДНК дикого типу може бути корисним для порівняння зі сконструйованим білком або геном. Прикладом білка дикого типу, придатного для порівняння із сконструйованими білками, запропонованими в цьому винаході, є фермент
КаЯарА з штаму МН 5ЗрпПіпдобішт егбісідомогапе. Прикладом молекули ДНК дикого типу, придатної для порівняння з рекомбінантними молекулами ДНК, запропонованими в цьому винаході, є ген КарА з штаму МН 5рпіпадобішт Негрісідомогапво. Варіант білка або молекули ДНК дикого типу може бути корисним в якості контролю в експерименті. 0043) Як застосовується в цьому документі, термін "контроль" означає експериментальний контроль, призначений для цілей порівняння. Наприклад, контрольна рослина в аналізі трансгенних рослин є рослиною того ж типу, що й експериментальна рослина (досліджувана рослина), але не містить трансгенної вставки, рекомбінантної молекули ДНК або ДНК- конструкції експериментальної рослини. Прикладом контрольної рослини, придатної для порівняння з трансгенними рослинами кукурудзи є нетрансгенна кукурудза І Н244 (патент США
Мо 6252148), і з трансгенними рослинами сої є нетрансгенна соя АЗ555 (патент США Мо 7700846).
Ї0044| Як застосовується в цьому документі, термін "рекомбінантний" відноситься до штучної ДНК, поліпептиду або білка, який(-а) є результатом генної інженерії і як такий(-а) зазвичай не зустрічається в природі, і який(-а) був створений внаслідок втручання людини. "Рекомбінантна молекула ДНК" є молекулою ДНК, що містить послідовність ДНК, яка не зустрічається в природному середовищі, і як така є результатом втручання людини, наприклад, молекула ДНК, яка кодує сконструйований білок. Іншим прикладом є молекула ДНК, що складається з комбінації, щонайменше, двох молекул ДНК, гетерологічних одна одній, така як кодуюча білок молекула ДНК, ії функціонально-з'єднаний гетерологічний промотор. Прикладом
Зо рекомбінантних молекули ДНК є молекула ДНК, яка містить щонайменше одну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО:2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 і 53-59. "Рекомбінантний поліпептид" або "рекомбінантний білок" є поліпептидом або білком, який містить амінокислотну послідовність, яка не зустрічається в природному середовищі, і як така є результатом втручання людини, наприклад, сконструйований білок. 00451 Термін "трансген" відноситься до молекули ДНК, яка штучно вбудовується в геном організму в результаті втручання людини, наприклад, способами трансформації рослин. Як застосовується в цьому документі, термін "трансгенний" означає такий, що містить трансген, наприклад, "трансгенна рослина" відноситься до рослини, котра містить трансген в її геномі, а "гтрансгенна ознака" відноситься до характеристики або фенотипу, яка(-ї) передається або забезпечується наявністю трансгена, що вбудований в геном рослини. В результаті такої геномної зміни трансгенні рослини є чимось таким, що сильно відрізняється від спорідненої рослини дикого типу, а трансгенна ознака є ознакою, яка не зустрічається в природному середовищі в рослині дикого типу. Трансгенні рослини, згідно цього винаходу, містять рекомбінантну молекулу ДНК і сконструйовані білки, запропоновані у винаході.
Ї0046| Як застосовується в цьому документі, термін "гетерологічний" відноситься до взаємозв'язку між двома або більше об'єктами, отриманими з різних джерел і, таким чином, як правило, не пов'язаними в природі. Наприклад, білок-кодуюча рекомбінантна молекула ДНК є гетерологічною по відношенню до функціонально-з'єднаного промотору, якщо така комбінація зазвичай не зустрічається в природі. Крім того, конкретна рекомбінантна молекула ДНК може бути гетерологічною по відношенню до клітини або організму, в який вона вбудована, коли вона не буде зустрічатися в природному середовищі в цій конкретній клітині або організмі.
Ї0047| Як застосовується в цьому документі, термін "молекула ДНК, що кодує білок" або "молекула ДНК, що кодує поліпептид" відноситься до молекули ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок або поліпептид. "Білок-кодуюча послідовність" або "поліпептид- кодуча послідовність" означає послідовність ДНК, яка кодує білок або поліпептид. "Послідовність" означає послідовне розташування нуклеотидів або амінокислот. Межі білок- кодуючої послідовності або поліпептид-кодуючої послідовності зазвичай визначаються стартовим кодоном трансляції на 5'-кінці і стоп-кодоном трансляції на 3'-кінці. Білок-кодуюча 60 молекула або поліпептид-кодуюча молекула може містити послідовність ДНК, яка кодує білкову або поліпептидну послідовність. Як застосовується в цьому документі, термін "експресія трансгена", "експресування трансгена", "експресія білка", "експресія поліпептиду", "експресування білка" і "експресування поліпептиду" означає продукування білка або поліпептиду в процесі транскрипції молекули ДНК в матричну РНК (мРНК) і трансляції мРНК в поліпептидні ланцюги, які можуть бути в кінцевому рахунку згорнуті в білки. Білок-кодуюча молекула ДНК або поліпептид-кодуюча молекула ДНК, може бути функціонально-з'єднана з гетерологічним промотором в ДНК-конструкції, для застосування в експресії білка або поліпептиду в клітині, трансформованій рекомбінантною молекулою ДНК. Як застосовується в цьому документі, термін "функціонально-з'єднаний" означає дві молекули ДНК, пов'язані таким чином, що одна молекула може впливати на функцію іншої. Функціонально-з'єднані молекули
ДНК можуть бути частиною однієї безперервної молекули і можуть бути чи не бути суміжними.
Наприклад, промотор є функціонально-з'єднаним з білок-кюодуючою молекулою ДНК, або поліпептид-кодуючою молекулою ДНК, в ДНК-конструкції, де дві молекули ДНК розташовані таким чином, що промотор може впливати на експресію трансгена. 0048) Як застосовується в цьому документі, "ДНК-конструкція" є рекомбінантною молекулою
ДНК, яка містить дві або більше гетерологічні послідовності ДНК. Конструкції ДНК є корисними для експресії трансгена, і можуть бути включені в вектори і плазміди. Конструкції ДНК можуть бути застосовані в векторах з метою трансформації, що представляє собою введення гетерологічної ДНК в клітину-господаря, для отримання трансгенних рослин і клітин, і як такі можуть також міститись в пластидній ДНК або геномній ДНК трансгенних рослини, насінини, клітини або частини рослини. Як застосовується в цьому документі, термін "вектор" означає будь-яку рекомбінантну молекулу ДНК, яка може бути застосована для трансформації рослини.
Рекомбінантні молекули ДНК, як зазначено в переліку послідовностей, можуть бути, наприклад, вбудовані у вектор як частина конструкції, що має рекомбінантну молекулу ДНК, функціонально- з'єднану з промотором, який функціонує в рослині для керування експресією сконструйованого білка, закодованого рекомбінантною молекулою ДНК. Способи конструювання ДНК-конструкцій і векторів добре відомі в цій галузі техніки. Компоненти ДНК-конструкції або вектора, що містить
ДНК-конструкцію, зазвичай включають, але не обмежуються лише цими, одне або декілька з наступних: відповідний промотор для експресії функціонально-з'єднаної ДНК, функціонально-
Зо з'єднану білок-кодуючу молекулу ДНК і 3'-нетрансльовану область (3-ОТК). Промотори, придатні для реалізації цього винаходу, включають промотори, які функціонують в рослині для експресії функціонально-з'єднаного полінуклеотиду. Такі промотори є різноманітними і добре відомі в цій галузі техніки, і включають ті, які є індуцибельними, вірусними, синтетичними, конститутивним, тимчасово-регульованими, просторово-регульованими і/або просторово- тимчасово регульованими. Додаткові необов'язкові компоненти включають, але не обмежуються цими, один або кілька наступних елементів: 5'-ЮОТЕ, енхансер, лідер, цис-діючий елемент, інтрон, транзитні пептиди хлоропласта (ТПХ) і один або кілька маркерних трансгенів для селекції. 0049) ДНК-конструкції згідно цього винаходу можуть містити молекулу ТИХ, функціонально з'єднану з білок-кодуючими молекулами ДНК, запропонованими в цьому винаході. ТПХ, придатний для реалізації цього винаходу, включає той, який функціонує сприяючи локалізації сконструйованої білкової молекули всередині клітини. Сприяючи локалізації білка всередині клітини, ТПХ може збільшити накопичення сконструйованого білка, захистити його від протеолітичної деградації, підвищити рівень стійкості до гербіцидів і тим самим знизити рівні пошкоджень після застосування гербіцидів. Молекули ТПХ, для застосування в цьому винаході, є відомими в цій галузі техніки і включають, але не обмежуються цими: Агарідорзів ІНаійапа
ЕРБРЗ ТХП (Кіее есеї аї., 1987), Рейшпіа пубгіда ЕРЗР5 ТПХ (аейпПа-Сіорра єї а!ї., 1986), сигнальну послідовність сар-т7 кукурудзи (ВескКег еї аї!., 1992; РСТ УМО 97/41228) і сигнальну послідовність глутатіонредуктази гороху (Стеїззеп евї аї!., 1991; РСТ МО 97/41228).
Ї0О50О| Рекомбінантні молекули ДНК, згідно цього винаходу, можуть бути синтезовані і модифіковані способами, відомими в цій галузі техніки, повністю або частково, особливо там, де бажано надати послідовності, які придатні для маніпуляцій з ДНК (такі як сайти впізнавання рестриктаз або сайти клонування на основі рекомбінації), послідовності, кращі по відношенню до рослини (використання кодонів рослин або консенсусних послідовностей Козак) або послідовності, придатні для конструювання ДНК-конструкції (такі як спейсерні або лінкерні послідовності). Винахід включає рекомбінантні молекули ДНК і сконструйовані білки, які мають щонайменше близько 80 95 (відсоток) ідентичності послідовності, близько 85 95 ідентичності послідовності, близько 9095 ідентичності послідовності, близько 9195 ідентичності послідовності, близько 9295 ідентичності послідовності, близько 9395 ідентичності 60 послідовності, близько 9495 ідентичності послідовності, близько 9595 ідентичності послідовності, близько 9695 ідентичності послідовності, близько 9795 ідентичності послідовності, близько 9895 ідентичності послідовності і близько 99595 ідентичності послідовності з будь-якою з рекомбінантних молекул ДНК або сконструйованих білкових послідовностей, запропонованих в цьому документі, наприклад, з рекомбінантною молекулою
ДНК, яка містить послідовність, вибрані з групи, що складається з: 5ЕО ІЮ МО:2, 3, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24,26, 27,29, 30, 32, 33, 35, 36, 38, 39, 41, 42, 44, 45 і 53-59.
Як застосовується в цьому документі, термін "відсоток ідентичності послідовності" або «905 ідентичності послідовності" відноситься до відсотка ідентичних нуклеотидів або амінокислот в еталонної ("запит") лінійній полінуклеотидній або поліпептидній послідовності (або її комплементарному ланцюгу) в порівнянні з тестовою ("суб'єкт") послідовністю (або її комплементарним ланцюгом), коли дві послідовності оптимально вирівняні (з відповідними нуклеотидними або амінокислотними вставками, делеціями або пробілами, які складають менше 20 відсотків еталонної послідовності у вікні порівняння). Оптимальне вирівнювання послідовностей для вирівнювання вікна порівняння є добре відомим фахівцям в цій галузі техніки і може бути виконане за допомогою таких інструментів, як алгоритм локальної гомології
Сміта і Уотермана, алгоритм вирівнювання гомології Нидлман і Вунша, спосіб пошуку схожості
Пірсона та Ліпмана, а також за допомогою комп'ютеризованих реалізацій цих алгоритмів, таких як САР, ВЕ5ТРЇТ, РА5ТА і ТЕА5ТА, які доступні в складі пакету програмного забезпечення зедцепсе Апаїузії сСОФ Умізсопзіп РасКадеф (Ассеїгув Іпс., Сан-Дієго, Каліфорнія), МЕ САЇїЇдп (ОМАЗІаг, Іпс., 1 228 5.Рагк 51., Медісон, Вісконсін 53715), і МОЗСІ Е (версія 3.6) (КС Еадаг,
Мисієїс Асід5 Незеагсп (2004) 32 (5): 1792-1797) зі стандартними параметрами. "Частка ідентичності" для вирівняних сегментів тестової послідовності і еталонної послідовності являє собою кількість ідентичних компонентів, які є загальними для двох вирівняних послідовностей, поділена на загальну кількість компонентів в сегменті еталонної послідовності, тобто всю еталонну послідовність або меншу певну частину еталонної послідовності. Відсоток ідентичності послідовності представлений як частка ідентичності, помножена на 100.
Порівняння однієї або більше послідовностей може проводиться з повнорозмірною послідовністю або її частиною, або довшою послідовністю.
Ї0051| Сконструйовані білки можуть бути отримані шляхом зміни (тобто модифікації) білка
З0 дикого типу, щоб продукувати новий білок з новою комбінацією корисних білкових характеристик, таких як змінені Мтах, Кт, субстратна специфічність, селективність по субстрату і стабільність білка. У білку, в певних амінокислотних позиціях, можуть бути зроблені модифікації, ії може бути виявлена амінокислотна заміна на іншу амінокислоту в цій позиції в природі (тобто в білку дикого типу). Ілюстративні амінокислотні позиції відносно послідовності білка КарА дикого типу (ЗЕО ІЮО МО: 60), які корисні для білкової інженерії, зображені на Фіг. 3.
Фіг. 6А, 6Б, 68, 6Г, 6Д ілюструють множинне вирівнювання послідовності КарА дикого типу і сконструйованих білкових послідовностей 5ЕО ІЮ МО, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 ії 46-52. Сконструйований білок може бути сконструйований таким чином, щоб мати щонайменше близько 9295 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 1, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43 і 46-52, і містити щонайменше одну з цих амінокислотних мутацій. Таким чином, сконструйовані білки, запропоновані у винаході, передбачають новий білок з однією або декількома зміненими білковими характеристиками відносно білка дикого типу, виявленого в природі. В одному варіанті реалізації винаходу, сконструйований білок має змінені білкові характеристики, такі як поліпшена або знижена активність по відношенню до одного або кількох гербіцидів, або поліпшена стабільність білка, в порівнянні з аналогічним білком дикого типу, або будь-яку комбінацію таких характеристик. В одному варіанті реалізації винаходу, у винаході запропонований сконструйований білок, і рекомбінантна молекула ДНК, яка кодує цей білок, який має щонайменше близько 80 95 ідентичності послідовності, близько 85 95 ідентичності послідовності, близько 9095 ідентичності послідовності, близько 9195 ідентичності послідовності, близько 9295 ідентичності послідовності, близько 9395 ідентичності послідовності, близько 9495 ідентичності послідовності, близько 9595 ідентичності послідовності, близько 9695 ідентичності послідовності, близько 9795 ідентичності послідовності, близько 9895 ідентичності послідовності і близько 99595 ідентичності послідовності з будь-якою сконструйованою послідовністю білка, обраною з групи, що складається з: ЗЕО ІЮО МО, 4, 7, 9, 11, 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, ії 46-52.
Амінокислотні мутації можуть бути зроблені у вигляді одиночної заміни амінокислоти в білку, або в поєднанні з однією або декількома іншими мутаціями, такими як одна або кілька інших амінокислотних замін, делецій або вставок. Мутації можуть бути зроблені, як описано тут, або бо будь-яким іншим способом, відомим фахівцям в цій галузі техніки.
Трансгенні рослини 0052) Аспект винаходу включає трансгенні рослинні клітини, трансгенні рослинні тканини, трансгенні рослини і трансгенне насіння, які містять рекомбінантні молекули ДНК і сконструйовані білки, запропоновані у цьому винаході. Ці клітини, тканини, рослини і насіння, які містять рекомбінантні молекули ДНК і сконструйовані білки, демонструють гербіцидну стійкість до одного або кількох гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислоти і гербіцидів на основі піридинілоксикислот. 0053 Відповідні способи трансформації клітин рослини-господаря для застосування з цим винаходом включають практично будь-який спосіб, за допомогою якого ДНК може бути введена в клітину (наприклад, коли конструкція рекомбінантної ДНК стабільно інтегрується в рослинну хромосому) і який добре відомий в цій галузі техніки. |Ілюстративним і широко застосовуваним способом введення рекомбінантної ДНК-конструкції в рослину є система агробактеріальної трансформації, яка добре відома фахівцям в цій галузі техніки. Трансгенні рослини можуть бути регенеровані з трансформованої рослинної клітини за допомогою способів рослинної клітинної культури. Трансгенна рослина, гомозиготна за трансгеном (тобто має дві алельні копії трансгена), може бути отримана шляхом самозапилення (самозапліднення) трансгенної рослини, яка містить єдиний алель трансгена, наприклад, шляхом самозапилення рослини КО, для отримання Кі! насіння. Одна чверть отриманого КІ! насіння буде гомозиготним за трансгеном. Рослини, вирощені з пророщеного К1! насіння, можуть бути перевірені на зиготність, як правило, із застосуванням аналізу ЗІР, секвенування ДНК або аналізу термічної ампліфікації, який дозволяє розрізняти гетерозиготи і гомозиготи, і який ще називають аналізом зиготності. 0054) Рослини, насіння, частини рослин, рослинні тканини і клітини, запропоновані у цьому винаході, виявляють гербіцидну стійкість до одного або кількох гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот. Гербіциди на основі АЛОФП впливають на ацетилкоензим А карбоксилазу рослини (АККаза), яка є частиною біосинтетичного шляху жирних кислот. Трав'яні рослини є чутливими до цих гербіцидів тому, що вони містять гербіцид-чутливу АККазу в їх пластидах і цитозолі. Гербіциди на основі АОФП є добре відомими в цій галузі техніки і є комерційно доступними. Приклади гербіцидів на основі
Зо АОФП включають, але не обмежуються цими: клодінафоп, цігалофоп, діклофоп, феноксапроп, феноксапроп-П, фентіапроп, флуазіфоп, флуазіфоп-П, галоксіфоп, ізоксапіріфоп, метаміфоп, пропаквізафоп, квізалофоп, квізалофоп-П і тріфоп. Гербіциди на основі феноксикислот і піридинілоксикислот є синтетичними ауксинами, які подібні до рослинного гормону індолоцтової кислоти (ОК). Широколисті рослини є чутливими до цих гербіцидів, які викликають швидкий, неконтрольований ріст, який в кінцевому рахунку вбиває рослину. Приклади гербіцидів на основі феноксикислот включають, але не обмежуються цими: 2,4-0; 2,4-ОВ; кломепроп; дихлорпроп; денопроп; метилхлорфенолоцтова кислота (МХФО); метилхлорфенолбутанова кистлота (МХФБ) і мекопроп. Приклади гербіцидів на основі піридинілоксикислот включають, але не обмежуються цими: триклопір; флуроксипір; амінопіралід, клопіралід і піклорам. 0055) Гербіциди можна наносити на ділянку вирощування рослин, що містить рослини і насіння, запропоновані в цьому винаходу, як спосіб боротьби з бур'янами. Рослини і насіння, запропоновані в цьому винаході, містять ознаку стійкості до гербіцидів, і як такі є стійкими до застосування одного або декількох гербіцидів на основі АОФП, або гербіцидів на основі феноксикислот, або гербіцидів на основі піридинілоксикислот. Може бути рекомендовано застосування гербіциду в комерційній нормі (1Х), або в будь-якій її частині, або в будь-який її кратності, такій як в два рази більше ніж рекомендована комерційна норма (2Х). Норми гербіцидів можуть бути виражені у вигляді кислотного еквівалента на фунт на акр (фунт к.е./акр) або фунт діючої речовини на акр (фунт д.р./акр). Застосування гербіциду включає щонайменше один гербіцид, вибраний з групи, що складається з гербіцидів на основі АОФП і гербіцидів на основі феноксикислот, і гербіцидів на основі піридинілоксикислот. Ділянка вирощування рослин може містити або не містити бур'яни під час застосування гербіцидів. Гербіцидно-ефективна доза гербіцидів на основі АЛОФП, що застосовуються в боротьбі з бур'янами, повинна становити від 0,01 фунта д.р./акр до 16 фунтів д.р./(акр впродовж вегетаційного періоду. Наприклад, 1Х норма квізалофопа-П дорівнюватиме 0,08 фунта д.р./акр. Гербіцидно-ефективна доза гербіцидів на основі феноксикислот, що застосовуються в боротьбі з бур'янами, повинна становити від 0,01 фунта к.е./акр до 16 фунтів к.е./акр впродовж вегетаційного періоду.
Наприклад, норма 1Х 2,4-О становитиме близько від 0,75 фунта к.е./акр до 1,0 фунта к.е./акр.
Гербіцидно-ефективна доза гербіцидів на основі піридинілоксикислот, що застосовуються в боротьбі з бур'янами, повинна становити від 0,01 фунта к.е./акр до 16 фунтів к.е./"акр впродовж вегетаційного періоду. Наприклад, 1Х норма флуроксипіра повинна становити від 0,13 до 0,48 фунта к.е./акр. 0056) Застосування гербіцидів може бути послідовним або гербіцид може бути змішаний в цистерні з одним, двома або комбінацією декількох гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот, гербіцидів на основі піридинілоксикислот, або будь-яким іншим сумісним гербіцидом. Багаторазове застосування одного гербіциду, або двох або більше гербіцидів, в комбінації або окремо, може бути використано впродовж вегетаційного періоду на ділянках, які містять трансгенні рослини згідно цього винаходу, для боротьби з широким спектром дводольних бур'янів, однодольних бур'янів або тих і тих, наприклад, два застосування (таких як застосування перед посадкою рослин і застосування після появи сходів, або застосування перед появою сходів і застосування після появи сходів), або три застосування (такі як застосування перед посадкою рослин, застосування перед появою сходів і застосування після появи сходів, або застосування перед появою сходів і два застосування після появи сходів).
Ї00О57| Як застосовується в цьому документі, "стійкість" або "стійкість до гербіциду" означає здатність рослини, насіння, рослинної тканини, частини рослини або клітини протистояти токсичному впливу одного або декількох гербіцидів. Стійкість до гербіциду рослини, насіння, рослинної тканини, частини рослини або клітини можна виміряти, порівнюючи рослину, насіння, рослинну тканину, частину рослини або клітину з відповідним контролем. Наприклад, стійкість до гербіцидів може бути виміряна або оцінена шляхом застосування гербіциду до рослини, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК, що кодує білок, здатний надавати стійкість до гербіциду (досліджувана рослина), і до рослини, яка не містить рекомбінантної молекули ДНК, що кодує білок, здатний надавати стійкість до гербіциду (контрольна рослина), а потім порівняти пошкодження двох рослин, при цьому на стійкість до гербіциду досліджуваної рослини вказує зменшення кількості пошкоджень у порівнянні з кількістю пошкоджень контрольної рослини.
Гербіцид-стійка рослина, насіння, рослинна тканина, частина рослини або клітина виявляє зменшену відповідь на токсичні ефекти гербіциду в порівнянні з контрольною рослиною, насінням, рослинною тканиною, частиною рослини або клітиною. Як застосовується в цьому документі, термін "ознака стійкості до гербіциду" є трансгенною ознакою, що надає рослині поліпшену стійкість до гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу або контрольною
Зо рослиною. 0058) Трансгенні рослини, потомство, насіння, рослинні клітини і частини рослин згідно цього винаходу можуть також містити одну або більше додаткових трансгенних ознак. Додаткові трансгенні ознаки можуть бути внесені шляхом схрещування рослини, яка містить трансген, який містить рекомбінантні молекули ДНК, запропоновані у цьому винаході, з іншою рослиною, яка містить додаткову трансгенну ознаку (ознаки). Як застосовується в цьому документі, термін "схрещування" означає розмноження двох окремих рослин для отримання потомства рослин.
Таким чином, дві трансгенні рослини можуть бути схрещені для отримання потомства, яке містить трансгенні ознаки. Як застосовується в цьому документі, термін "потомство" позначає потомство будь-якого покоління батьківської рослини, і трансгенне потомство містить ДНК- конструкцію, запропоновану в цьому винаході, успадковану, щонайменше, від однієї батьківської рослини. В альтернативному варіанті, додаткова трансгенна ознака(-и) може бути введена шляхом спільної трансформації ДНК-конструкції для цієї додаткової трансгенної ознаки(-ак) з конструкцією ДНК, яка містить рекомбінантні молекули ДНК, запропоновані у винаході (наприклад, з усіма ДНК-конструкціями, представленими як частина того ж вектора, застосованого для трансформації рослин) або шляхом введення додаткової ознаки (ознак) в трансгенну рослину, що містить ДНК-конструкцію, запропоновану у винаході, або навпаки (наприклад, застосовуючи будь-який з способів трансформації рослин до трансгенних рослин або рослинної клітини). Такі додаткові трансгенні ознаки включають, але не обмежуються цими: підвищену резистентність до комах, підвищену ефективність використання води, підвищену врожайність, підвищену стійкість до посухи, підвищена якість насіння, поліпшені поживні якості, виробництво насіння гібрида, і стійкість до гербіцидів, при цьому ознака вимірюється відносно рослини дикого типу або контрольної рослини. Такі додаткові трансгенні ознаки відомі фахівцям в цій галузі техніки; наприклад, перелік таких ознак надається Службою інспекції здоров'я тварин і рослин (АРНІ5) Міністерства сільського господарства США (О5бА), і вони можуть бути знайдені на їх веб-сайті за адресою: м/млиу.арпі5.и5да.дом. 0059) Трансгенні рослини і потомство, які містять трансгенну ознаку, запропоновані в цьому винаході, можуть бути використані з будь-якими способами схрещування, які широко відомі в цій галузі техніки. У лініях рослин, які містять дві або більше трансгенні ознаки, трансгенні ознаки можуть бути незалежно сегрегуючими, зчепленими або комбінацією обох в лініях бо рослин, які містять три або більше трансгенних ознаки. Розглядається також зворотне схрещування з батьківською рослиною, і схрещування з нетрансгенною рослиною, а також вегетативне розмноження. Описи способів схрещування, які зазвичай застосовуються для різних ознак і культур, добре відомі фахівцям в галузі техніки. Для підтвердження присутності трансгенас-ів) в конкретній рослині або насінині може бути виконано безліч аналізів. Такі аналізи включають, наприклад, молекулярно-біологічні аналізи, такі як Саузерн і Нозерн блотинг, ПЛР та секвенування ДНК; біохімічні аналізи, такі як виявлення присутності білкового продукту, наприклад, імунологічними способами (ЕПІБА і Вестерн-блот) або за допомогою ферментативної функції; аналізи частини рослини, такі як аналіз листя або коріння; а також аналіз фенотипу всієї рослини. 0060) Інтрогресія трансгенної ознаки в генотип рослини досягається в результаті процесу конверсії зворотного схрещування. Рослинний генотип, в який була інтрогресована трансгенна ознака, можна назвати перетвореним за допомогою зворотнього схрещування генотипом, лінією, інбредом або гібридом. Подібним же чином, генотип рослини, позбавлений бажаної трансгенної ознаки, може бути названий непретвореним генотипом, лінією, інбредом або гібридом. 0061) Як застосовується в цьому документі, термін "що містить" означає "що включає, але не обмежується цим".
ПРИКЛАДИ
00621 Наступні приклади включені для демонстрації бажаних варіантів реалізації винаходу.
Фахівцям в галузі техніки повинно бути зрозуміло, що методи, розкриті в наступних нижче прикладах, є методами, які виявлені винахідниками, що добре функціонують при практичній реалізації винаходу, і тому можуть розглядатися як бажані способи для його практичної реалізації. Проте, в контексті даного винаходу, фахівцям в цій галузі техніки повинно бути зрозуміло, що в конкретних розкритих варіантах реалізації винаходу може бути зроблена велика кількість змін, проте при цьому буде отримано схожий або аналогічний результат, без відступу від концепції, сутності та обсягу винаходу. Більш конкретно, буде очевидно, що деякі речовини, які є як хімічно, так ії фізіологічно спорідненими, можуть бути замінені описаними тут речовинами з тим же або подібним результатом. Всі подібні аналогічні заміни і модифікації, очевидні для фахівців в цій галузі техніки, вважаються такими, що знаходяться в межах суті,
Зо обсягу і концепції винаходу, як визначено формулою винаходу яка додається.
Приклад 1: Первісне конструювання білків та аналіз ферментів 0063 Нові, сконструйовані білки і рекомбінантні молекули ДНК, що кодують ці білки, були задумані і створені в лабораторії із застосуванням технологій білкової інженерії. Сконструйовані білки є ферментами, які мають оксигеназну активність і сконструйовані таким чином, щоб вони володіли зміненими здатностями до інактивації гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот, або обох по відношенню до білка дикого типу. 00641 Були відібрані шістнадцять відомих білків з оксигеназною активністю, і вони були застосовані для створення консенсусного вирівнювання послідовностей гомологів. Це було використано в поєднанні зі структурно-орієнтованими аналізами для формування раціональних стратегій розробки. З цих аналізів для мутагенезу були відібрані п'ять областей, кожна довжиною від 13 до 21 амінокислоти, які в цьому документі називаються "островами". Мутації в кожному з цих регіонів були створені із застосуванням методів, відомих фахівцям в цій галузі техніки, таких як аланін-скануюче мутування; гомологічне скануюче мутування; Рго/сЗіІу скануюче мутування; обмін областями або мутування; і комбінації цих різних методів (див., М Гептапп апа М У/уз5, Ситепі Оріпіоп іп Віоїесппоіоду (2001) 12 (4):371-375; В Мап деп Вигу апа ман
ЕївіпКк, Сцтепі Оріпіоп іп Віоїесппоіоду (2002) 13 (4):333-337; і ММеїв5 єї аї., Ргос Маї! Асай зЗсі
ИБА (2000) 97 (16):8950-8954). Застосовуючи ці способи, було отримано понад 1200 унікальних сконструйованих білків і рекомбінантних молекул ДНК, які їх кодують, для подальшого аналізу і характеристики. Через велику кількість сконструйованих білків, отриманих для тестування, і необхідності тестування і порівняння ферментативної активності кожного білка, були розроблені високопродуктивні бактеріальна експресія білка і система аналізу ферментів, для швидкого аналізу з використанням неочищених бактеріальних екстрактів.
І0065| Експресія бактеріального білка з високою продуктивністю була досягнута шляхом синтезу рекомбінантної молекули ДНК, яка кодує кожний сконструйований білок, і її клонування в бактеріальний вектор експресії з С-кінцевою гістидиновою міткою (Ніз-міткою), функціонально- з'єднаною з рекомбінантною молекулою ДНК. Вектори застосовували для трансформації
ЕзсПегісніа соїї (Е.соїї), та індукували бактеріальну експресію сконструйованих білків. Нічні культури Е. сої вирощували в 9б-лункових планшетах, і культури центрифугували для осадження бактерій. Бактеріальний осад лізували додаванням 100 мкл лізуючої суміші (10 мл бо реагенту для екстракції бактеріальних білків (В-РЕКФ) ЇЇ (Ріегсе ВіоїесппоЇІоду, НКосісога, ЇЇ;
78260); 10 мкл лізоциму (10 мкг/мл кінцева концентрація; І узхо7уте Атегісап Віоапа/|уїсаї, Натік,
Массачусетс; каталожний номер АВО11780-00005); і 40 мкл Веплопазе?б Мисієазе (100 одиниць/мл кінцева концентрація, Момадеп, Дармштадт, Німеччина; каталожний номер 71206- 3)) в кожну лунку. Планшети струшували, потім інкубували впродовж 30 хв при 4 "С. 400 мкл буфера МОРЗ (рН 6,57) додавали в кожну лунку і дебрис осаджували центрифугуванням.
Супернатант лізату обережно видаляли і застосовували в якості неочищеного бактеріального екстракту для подальшого ферментативного аналізу.
Ї0О6б6| Високопродуктивний аналіз ферментативного розкладання гербіциду(-ів) був розроблений для аналізу ферментативної активності сконструйованих білків по відношенню до різних гербіцидів із застосуванням неочищеного бактеріального екстракту. Оксигеназну активність сконструйованого білка (тобто його ферментативну активність) вимірювали за допомогою колориметричного аналізу кінцевої точки, застосовуючи детектування фенольних продуктів шляхом вимірювання оптичного поглинання при 510 нм з 4-аміноантипірину і фериціаніду калію. Цей аналіз був заснований на аналізі, описаному в РГиКотогі апа Нашзіпдег,
Уоита! ої Віоіодісаї Спетівігу (1993) 268 (32):24311-24317. Ферментативні реакції були проаналізовані в 9б-лункових планшетах із загальним обсягом 150 мкл, які містили: 20 мМ
МОРБ рН 6,75, 50-200 мкм МН4Ре5оО4, 50-200 мкМ аскорбата натрію, 1 мМ альфа- кетоглутарата (ак), 10 мкл клітинного лізату ЕЕ. соЇї, що містить експресований сконструйований білок, і субстрат (або гербіцид на основі АОФП, або гербіцид на основі феноксикислоти). Після ініціювання реакції з субстратом, планшет інкубували при різних температурах впродовж різних періодів часу і "гасили" (зупиняли) додаванням ЕОТА до кінцевої концентрації 6,25 мМ або додаванням 15 мкл буфера з рН 10 (50 мМ борної кислоти, 50 мМ
КСІ) з подальшим додаванням 15 мкл 0,2 95 4-аміноантипірину і 15 мкл 0,8 95 фериціаніду калію.
Вимірювання абсорбції проводили на стандартному лабораторному спектрометрі. Аналізи масштабували в міру необхідності для збільшення продуктивності. Стандартні криві були отримані із застосуванням очищеного білка або стандартів продукту.
ЇОО67| Застосовуючи цю високопродуктивну систему бактеріальної експресії білка і ферментативного аналізу, була виміряна активність близько 1200 сконструйованих білків відносно активності обраного білка дикого типу, КарА. В аналізі із застосуванням 96-лункових
Зо планшетів, було З контролі (неочищений бактеріальний екстракт без сконструйованого білка) і З позитивних контролі (неочищений бактеріальний екстракт з білком дикого типу). Було виміряно поглинання лунок і розраховували активність білка із застосуванням такої формули: дтивність-| (Абсорбція Абсорбціянт ) х100 (Абсорбціяхт - Абсорбціяєт ) де Активність . активність зразка, Абсорбція . поглинання зразка, Абсорбціямт . поглинання лунок, які містять екстракт з Е. соЇїї, що експресує фермент дикого типу, і
Абсорбцівет є поглинанням лунок, які містять екстракт з Е. соїї без сконструйованого білка.
Активність для кожного унікального сконструйованого білка виміряна в двох повторах і наводилася як середнє з двох вимірів. (0068) Грунтуючись на результатах високопродуктивної системи ферментативного аналізу, було відібрано близько 545 унікальних сконструйованих білків для подальшого аналізу зі застосуванням очищеного сконструйованого білка. У попередньому аналізі сконструйованого очищеного білка, неочищені бактеріальні експресуючі лізати готували, застосовуючи
ОШІАСЕМО МІ-МТА Адагозе (Оіадеп, Валенсія, Каліфорнія, каталожний номер 30230) слідуючи протоколу виробника.
Ї0069| Очищені сконструйовані білки аналізували із застосуванням аналізу ферментативної деградації гербіцидів, описаного в цьому Прикладі 1, із застосуванням в якості субстрату квізалофопа - гербіциду на основі АОФП. Результати аналізу очищених сконструйованих білків в значній мірі підтвердили результати високопродуктивного ферментативного аналізу.
Результати аналізу для семи з близько 545 сконструйованих білків наведені в Таблиці 1, при цьому ферментативна активність виражається як активність зразка відносно активності ферменту КарА дикого типу (розрахована, як описано в цьому Прикладі 1). Дані з цих аналізів дали несподіваний результат, який полягає в тому, що комбінації специфічних мутацій проявляли себе значно краще, ніж інші варіанти, і показали, що ферментативна активність сконструйованих білків може бути значно змінена.
Таблиця 1 повтору 1-2-3 1-2-5 1-3-4 2-3-4 2-3-5 2-4-5 3-4-5 8 17777771 1385 | щЩщБкБ | щ((М | 14075 | ( 74111065 | щк | ЮщЩщБМ | пз | її 51777711 1005 | щБХ | ЮК | 15058 |... 1771 76 1 | 24 | /! лет | її
Ї0070| Застосовуючи інформацію, отриману з перших аналізів, потім була виконана білкова інженерія, як описано раніше, для отримання додаткових сконструйованих білків, які були протестовані як описано в цьому Прикладі 1. Результати високопродуктивного ферментативного аналізу із застосуванням квізалофопа-П в якості субстрату для п'яти з цих додатково сконструйованих білків наведені в Таблиці 2.
Таблиця 2
Середня
ЗЕОІЮ МО МОМ-НТ Повтор 1 Повтор 2 Повтор З активність квізалофопа-П 7.79 | моМм-нтьє | 131,85 | 149,77 | 13056 | 137,59 ол | момнть5 | лів48 | 9979. | -:хК | л09из
Ї0071| Визначення додаткових білкових характеристик, таких як Кт, Мптах і аналіз структури кристалів, було виконано із застосуванням п'яти сконструйованих білків з Таблиці 2. Для цього детального аналізу очищений білок готували наступним чином: 2 мл нічних культур Е. соїї, що експресують трансген, який кодує цей білок МОМ-НТ, застосовували для інокуляції 500 мл середовища і вирощували при 37 "С впродовж 4 годин з подальшим культивуванням при 15 7 впродовж близько 36 годин. Потім 250 мл з 500 мл бактеріальної культури осаджували центрифугуванням і ресуспендували в 25 мл буфера для екстракції (20 мМ Тріс, рН 7,8, 300 мМ
Масі, 5 мМ бета-меркаптоетанол (БМЕ), 20 мМ імідазол (РійКа/Зідта-Аїагіс!, Сент-Луїс,
Міссурі), 125 одиниць/мл бензонази і 10К одиниць/мл лізоциму (Момадеп, Дармштадт,
Німеччина). Суспензію клітин пропускали через дезінтегратор клітин один раз при 20000 рб5і, а потім цей клітинний лізат очищували центрифугуванням при 35000 х уд впродовж 20 хв при 4 "С.
Надосадову рідину, яка містила розчинні Ніз-мічені білки, застосовували для очищення білка.
Для цієї очистки, супернатант вносили в 1 мл колонку НіхТгар'"м ЕЕ (МісКе! Зерпагозе) (СЕ
Неайсаге, Піскатауей, Нью-Джерсі) із застосуванням системи АКтТахргез55"м (ЗЕ Неайсаге,
Піскатауей, Нью-Джерсі) у відповідності зі стандартним протоколом виробника. Буфер для промивання складався з: 20 мМ Ттгі5 рН 7,8, 300 мМ масі, 20 мм імідазолу і 5мМ БМЕ. Склад буфера для елюції був такий самий, як і буфера для промивання, за винятком 500 мМ імідазолу. Елюат з нікелевої колонки знесолювали на тонкій колонці Оціск Зріп Ргоївіп зЗерпадех а-25 (Восне Арріїєд Зсієпсе, Іпаіапароїї5, ІМ) слідуючи протоколу виробника. Елюйований білок був у буфері, що складається з: 20 мМ Ттгі5 рН 7,8, 50 мМ Масі і 5 мМ БМЕ. Чистоту екстракту білка оцінювали за допомогою аналізу 5О5-РАСЕ. Концентрацію білка визначали за допомогою
Зо аналізу Бредфорда із застосуванням барвника-реагенту Віо-ВКай Ртгоїєїп Авзау (Віогаай,
Геркулес, Каліфорнія, каталожний номер 500-0006).
Ї0072| Очищений білок для п'яти сконструйованих білків аналізували із застосуванням ферментативного аналізу, описаного в цьому Прикладі 1, але з чотирма різними гербіцидами на основі АОФП в якості субстратів: квізалофопу-П, галоксіфопу, феноксапропу і флуазіфопу.
Стандартні криві отримували із застосуванням 2,4-дихлорфенолу (2,4-ЮСР), який використовували для отримання загальної стандартної фенольної кривої. Кількість фенолу, виробленого при аналізі за допомогою сконструйованих білків, розраховували на основі цієї стандартної кривої. Контрольні зразки представляли собою зразки з очищеним ферментом дикого типу, зразки без ферменту і зразки без субстрату. Вимірювання ферментативної кінетики п'яти сконструйованих білків проводили із застосуванням 0, 20, 40, 80, 160, 320, 640 або 1280
МКМ гербіцидів квізалофопа-П, галоксіропа, феноксапропа або флуазіфопа. У Таблиці З показані Кт і Мтах (виражені як відносні величини), виміряні для п'яти білків з чотирма субстратами - гербіцидами на основі АОФП. Білкові характеристики цих п'яти сконструйованих білків з кожним з чотирьох гербіцидів на основі АЛОФП в якості субстратів продемонстрували, що ферментативна активність, а саме Кт і Мтах, сконструйованих білків може бути значно змінена за допомогою білкової інженерії.
Таблиця З
ДЕ те Нет т ЕЕ НТК ТОН моМм-нтьз | 690 | 95 | 290 | 64 | лі00 / 640 | 10 | 40
Приклад 2: Експресія сконструйованих білків в кукурудзі
Ї0073| Були сконструйовані вектори для трансформації рослин, кожен з яких містив рекомбінантну молекулу ДНК, яка кодує один з трьох сконструйованих білків, з білок-кодуючою послідовністю, оптимізованою для експресії в однодольних, МОМ-НТЬІ (5ЕО ІЮ МО:3), МОМ-
НТб2 (5ЕО ІЮО МО:6), ії МОМ-НТ5Ь5 (5ЕО ІЮ МО:13). Вектори були створені із застосуванням різних комбінацій промотора, лідера, інтрона і З'ОТЕ, і з, і без ТПХ, функціонально-з'єднананого з білок-кодуючою послідовністю. Також в вектори була включена друга касета ДНК, яка містить послідовність, що кодує ср4-ЕРБР5Б, яка повинна застосовуватися в трансгенних рослинах для стійкості до гліфосату. Незрілі ембріони кукурудзи ((Н244) трансформували цими векторами із застосуванням Адгобасієгішт Штіїтасієпе і стандартних способів, відомих в цій галузі техніки.
Регенеровані КО трансгенні проростки вирощували в теплиці і обприскували близько на стадії зростання М2-У4 квізалофопом-П в обсязі 0,04 або 0,08 фунта д.р./акр (А5зиге "м ІІ, ЕІ ОбиРопу), що складають 0,5Х і 1Х норми, відповідно. Зразки листя застосовували для ідентифікації трансгенних рослин з єдиною копією трансгенної ДНК-вставки (тобто одиничні трансформанти).
Рослини КО, які містили лише одну копію і пройшли тестування обприскуванням або 0,5Х, або
ІЇХ квізалофопа-П, були самозапилені для отримання насіння К1. За допомогою конструкцій, які містили МОМ-НТ52, не було отримано трансформантів. Був регенерований лише один одиничний трансформант, після трансформації конструкцією, яка містила МОМ-НТ5І1 з ТПХ, і конструкцією, яка містила МОМ-НТ51 без ТПХ. Було виконано трансформацію двома парами векторів, які містили МОМ-НТ55, причому кожна пара відрізнялася лише тим, що містила ТПХ або не містила ТПХ.
Зо 00741 Рослини КІ, які експресували МОМ-НТ5Б5 з функціонально-з'єднаним ТПХ і без нього, вирощували в теплиці, а гербіцид квізалофоп-П застосовували на стадії росту М2 в нормі 0,08 фунта к.е./акр (1Х). Рослини оцінювали на наявність пошкоджень через одинадцять днів після обробки. Рослини К1 сегрегували за ознакою в типовому співвідношенні за Менделем, і була помічена очікувана кількість (725 95) нульових сегрегантів (рослин-нащадків, які не містять трансгенних ознак), які не вижили після гербіцидної обробки. Всі трансгенні рослини КІ, які експресували МОМ-НТ55 з функціонально-з'єднаним ТПХ, за винятком тих, які представляли собою поодинокі трансформанти, показали лише незначну хлоротичну пляму на наймолодших відкритих листах після застосування квізалофопа-П. Для цих рослин після застосування гербіциду не було зареєстровано жодних пошкоджень, що перевищують 595. Також, необроблені трансгенні рослини не відрізнялися фенотипічно від необроблених контрольних рослин. Фіг. ТА ілюструє контрольні рослини І Н244 і трансгенні рослини, які містять МОМ-НТЬ5 (ЗЕО ІО МО:13) через 18 днів після нанесення квізалофопа-П. 0075 Для оцінки ефекту застосування ТХП, використаного щоб направити сконструйований білок до хлоропластів рослинних клітин, порівнювали трансгенні рослини, які містять трансгенну вставку з ТПХ і без ТПХ, функціонально-з'єднану з білок-кодуючою послідовністю. Рослини, які містять ТПХ, функціонально-з'єднаний з білок-кодуючою послідовністю, продемонстрували кращу витримку по відношенню до квізалофопа-П в порівнянні з рослинами без ТПХ. При тестуванні К1 в теплиці, що описане в цьому Прикладі 2, більшість трансгенних рослин, які містили ТПХ, функціонально-з'єднаний з білок-кодуючою послідовністю, продемонстрували повну стійкість до квізалофопа-П. Рослини, які не містили ТПХ, функціонально-з'єднананий з білок-кодуючою послідовністю, продемонстрували стійкість до квізалофопа-П, але мали фенотип з деякими помірними ушкодженнями. Ці результати продемонстрували, що використання ТПХ для того, щоб направити сконструйований білок до хлоропластів рослинних клітин, підсилює стійкість трансформованої рослини до квізалофопа-П. Даний несподіваний результат був перевірений ще раз в польових випробуваннях ефективності ознаки у рослин К1,
Б які містили або МОМ-НТ51 з або без ТПХ, функціонально-з'єднананий з білок-кодуючою послідовністю, або МОМ-НТ5Ь5 з або без ТПХ, функціонально-з'єднанний з білок-кюодуючою послідовністю. Дані рослини К1 були одиничними трансформантами, але все ще сегрегували. В цьому польовому випробуванні насіння висівали в полі і обробляли наступним чином: 2Х (0,16 фунта д.р./акр) квізалофопа-П перед посівом, 2Х (0,14 фунта д.р./акр) галоксіфопа на стадії росту М4, потім 2Х квізалофоп-П на стадії росту М8. Більш високий відсоток рослин, які містили
ТПХ, функціонально-з'єднаний з білок-кодуючою послідовністю, виживав при обробках квізалофопом-П і галоксіфопом, і такі рослини мали більш низькі оцінки пошкоджень в порівнянні з рослинами, які не містили ТПХ, функціонально-з'єднаний з білок-кодуючою послідовністю. Дані наведені в Таблиці 4. Це підтвердило несподіваний висновок про те, що
ТПХ, функціонально з'єднаний з білок-кодуючою послідовністю, забезпечує більш високу стійкість рослин до застосування гербіцидів для сконструйованих білків.
Таблиця 4 ек нені)
Білок тих пошкодження трансформанти й гербіцидом
Ї0076| Польові випробування ефективності інбредних ознак проводилися для оцінки стійкості до гербіцидів на основі АОФП і чутливості до гербіцидів на основі циклогександіонів (ЦГД) на інбредному фоні. Інбредні рослини К2 отримували шляхом самозапилення гомозиготної трансгенної рослини КІ і збору насіння. Інбредні рослини К2, що містили МОМ-
НТ55 з або без ТПХ, або МОМ-НТ51 з ТПХ, оцінювали в двох польових локаціях. Гербіцидна обробка являла собою обробку 2Х квізалофопа-П 0,16 фунта д.р./акр, застосованого ППП (після посадки, але до проростання), після чого застосовували квізалофоп-П 0,16 фунта д.р./акр на стадії росту М4, потім застосовували квізалофоп-П 0,16 фунта д.р./акр на стадії росту М8.
Дослідні ділянки були оцінені по пошкодженню посівів через 7-10 днів після застосування гербіцидів, за шкалою 0-100, при цьому нульове значення позначало відсутність травм, а 100 позначало повну загибель посівів. Всі дані були піддані дисперсійному аналізу дисперсії і
Зо середнього, розділених при НДР (найменша достовірна різниця) (0,05). Більшість інбредних рослин КІ! не мали пошкоджень, підтверджуючи те, що і МОМ-НТ55 і МОМ-НТ5Т, з або без ТПХ, забезпечують стійкість кукурудзи до квізалофопа-П. Для перевірки чутливості до гербіцидів на основі ЦГД, які бажані для застосування до самосівного контролю, рослини обробляли 1Х нормою клефодіума (0,25 фунта д.р./акр) на стадії росту М8. Самосівний контроль із застосуванням норми 1Х клефодіума був на 100 95 ефективний для всіх трансгенних рослин, які пройшли тестування. Польові випробування ефективності ознак гібридів проводилися для оцінки стійкості до гербіцидів на основі АОФП і чутливості до гербіцидів на основі циклогександіонів (ЦГД) на гібридному фоні. Е17 гібридні рослини отримували шляхом схрещування інбредних рослини К1 з нетрансгенною рослиною, і збором насіння. Отримані в результаті рослини НЕ1, які містили МОМ-НТ5Ь5 (5ЕО ІЮ МО:13) з або без ТИХ, або МОМ-НТ51 (ЗЕО ІО МО:3) без ТПХ, були оцінені в шести польових локаціях. Польові випробування ефективності гібридних ознак проводилися в шести місцях при різних умовах навколишнього середовища, включаючи тепле приміщення і посухи під час польового сезону. Це дозволило оцінити сконструйований білок в кукурудзі в умовах високої температури і водного стресу. Дані представлені в Таблиці 5. Первісне пошкодження від застосування 2Х квізалофопа-П було вище бажаного (210 96 пошкоджень) через 7-10 днів після застосування. Рослини в кінцевому рахунку змогли подолати пошкодження шляхом подальшого росту, при цьому, як правило, спостерігалося менше травм від застосування гербіциду на стадії росту М8 в порівнянні з застосуванням на стадії росту М4. Також було помічено надмірне пошкодження, коли квізалофоп-П застосовувався дуже рано (наприклад, на стадії росту МЕ-М2)
Таблиця 5
СЯ НЕЯСНІ Йенні
Білок тих й трансформантів обприскування обприскування о омоМНнтТь» | Немає 7777/7977 1777711 46,87777171717111111 7880 007 7| Відкриття того, що гібридні рослини, які експресували сконструйовані біли МОМ-НТ55 або МОМ-НТ5Ї1, були чутливими до застосування квізалофопа-П при вирощуванні в польових умовах за високої температури, було підтверджено із застосуванням аналізу на основі рослин.
Аналіз на основі рослин був розроблений для перевірки стійкості гібридів Е1 до квізалофопа-П в кліматичних камерах перед польовим тестуванням. Аналіз був розроблений із застосуванням гібридів ЕТ, що містять події трансформації кукурудзи МКбОЗ (патент США Мо8273959) х
МОМ89034 (патент США Ме8581047) і гібридів ЕТ, що містять МОМ-НТ55 х МОМ89034. Насіння гібридів Е1 пророщували в кліматичній камері впродовж 1 тижня, і потім переміщували в одну з трьох різних кліматичних камер для акліматизації впродовж двох днів при денних/нічних температурах 20 7С/20 С, 28 70/20 С і 38 "С/30 "С до застосування 2Х (0,16 фунта д.р./акр) квізалофопа-П. Як і очікувалося, рослини, які містили МОМ-НТ55, при всіх режимах температур були серйозно пошкоджені обробкою 2Х квізалофопа-П (Фіг. 1Б). Трансгенні рослини, які містили МОМ-НТ5Ь5, показали хорошу стійкість до обробки 2Х нормою квізалофопа-П при акліматизації до денних/нічних температур 20 "С/20 "С або 28 7С/20 "С, але проявили значну чутливість при акліматизації до денних/нічних температур 38 "С/30 "С (Фіг. 18). Це підтвердило, що аналіз на основі рослин може бути застосований для скринінгу білків в рослинах в кліматичній камері за температуро-чутливою активністю.
Ї0078| Дані показують, що сконструйовані білки можуть бути експресовані в трансгенних рослинах для того, щоб надати стійкість до гербіцидів, і що необроблені трансгенні рослини не відрізняються фенотипічно від необроблених контрольних рослин. Ці дані також підтвердили, що експресія сконструйованих білків в рослинах дозволила застосовувати гербіциди на основі
ЦГД для самосівних контрольних рослин. Несподівано, дані показали, що застосування ТПХ для спрямування до хлоропластів сконструйованого білка посилює ознаку стійкості до гербіцидів, і що стійкість до гербіцидів, що забезпечується сконструйованими білками, є чутливою до температури, зменшуючись в умовах високої температури.
Зо Приклад 3: Оптимізація сконструйованих білків 0079 Відкриття того, що гібридні рослини, які експресували сконструйовані біли МОМ-НТ55 або МОМ-НТ51, були чутливими до обробки квізалофопом-П при вирощуванні в польових умовах за високої температури, було несподіваним і надало додаткові білкові характеристики, які можна було змінювати в процесі конструювання білка. Були розроблені нова серія ферментативних аналізів іп мійго і аналіз ферментативної активності на основі рослин для тестування білків на чутливість до високих температур. 0080 Для створення сконструйованих білків, оптимізованих для роботи при більш високих температурах, аналіз білкових мотивів, використаний в перших двох циклах конструювання білка, був об'єднаний з даними кристалічної структури для декількох сконструйованих білків. Це використовувалося, щоб ініціювати додаткові раунди мутагенезу, виконані, як описано раніше, і таким чином було отримано близько 1400 додаткових сконструйованих білків. Вони були об'єднані з близько 1200 сконструйованими білками, описаними в Прикладі 1, в цілому склавши близько 2600 сконструйованих білків для скринінгу за допомогою нового тесту чутливості до температури, для ідентифікації білків, оптимізованих для роботи при більш високих температурах.
ІЇ0081| Щоб проаналізувати активність цих сконструйованих білків при більш високих температурах, ферментативний аналіз іп міто в Прикладі 1 був модифікований для того, щоб точно визначити умови попереднього нагрівання всіх компонентів аналізу до бажаної температури впродовж 5 хвилин перед об'єднанням компонентів, і потім підтримувати реакцію при бажаній температурі під час проходження реакції. Для нормування результатів аналізу, як субстрат для реакції застосовували квізалофоп-П, і активність ферменту була нормована на основі 25 "С зчитувань. Застосовуючи ці параметри, розраховували температуру, при якій активність ферменту становила половину від максимальної (Ті). Було розраховано, що Ті/» для
МОМ-НТ55 становить 29 "С, а для КарА дикого типу Ті» становить 38 "С (фіг. 2А). 0082) Через велику кількість варіантів тестування застосовувався п'ятиступінчастий процес скринінгу. Таблиця 6 показує приблизну кількість варіантів, протестованих в різних скринінгах.
Таблиця 6 авт Дін сконструйовані білки 0083) Перший скринінг проводили із застосуванням близько 2600 сконструйованих білків, і застосовували високопродуктивну систему бактеріальної експресії білка і аналізу ферментів з неочищеними бактеріальними лізатами, як описано в Прикладі 1, але модифікували, щоб проводити при бажаних температурах 25 С і 40 "С з розвитком фарбування після гасіння при 2570. Після цього скринінгу було відібрано і пропущено до наступного етапу близько 1250 сконструйованих білків. Другий скринінг був аналогічним, але включав білкове нормування за зразками. Після цього скринінгу було відібрано і пропущено до наступного етапу 94 сконструйованих білка. У третьому скринінгу застосовували очищений білок з аналізом ферментативної деградації гербіциду, як описано в Прикладі 1, але він був модифікований для проведення при бажаних температурах 25 С і 40 "С з розвитком забарвлення після гасіння, виконаного при 25 "С. Після цього скринінгу було відібрано і пропущено до наступного етапу 47 сконструйованих білка. Четвертий скринінг проводили із застосуванням очищеного білка, нормували концентрації білка, і скринінг включав квізалофоп-П і (для підмножини варіантів білків) 2,4-О в якості субстратів з аналізом кінцевої точки при 23 "С і 40 "С. Після цього скринінгу було відібрано і пропущено до наступного етапу 13 сконструйованих білків.
Ї0084| Для п'ятого скринінгу, для кожного з одинадцяти сконструйованих білків був отриманий і очищений рекомбінантний білок для поглибленого біохімічного аналізу. Даний біохімічний аналіз включав: (1) кінетичний аналіз (Мтах і Кт), (2) аналіз активності в діапазоні температур, (3) аналіз плавлення білка, (4) активність на додаткових гербіцидах на основі
АОФП і (5) мас-спектрометричний аналіз на пептидах для підтвердження ідентичності. Біохімічні аналізи також проводили з очищеним рекомбінантним білком дикого типу і білом МОМ-НТ55 для порівняння. Для кінетичного аналізу проводили аналіз без кінцевих точок при 23 "С із застосуванням або квізалофопа-П, або 2,4-О в якості субстрату. Рекомбінантні білки для цих
Зо аналізів отримували в бактеріях і очищували із застосуванням мітки 6-Ні5, причепленої до С- кінця білка. Результати кінетичного аналізу із застосуванням або квізалофопа-П, або 2,4-О в якості субстрату представлені для десяти сконструйованих білків, білка дикого типу і білка
МОМ-НТ55 в Таблиці 7 (стандартна помилка показана в дужках). Мпах виражається як питома активність, мкМ гербіцидний продукт мг фермент-1 хв-1; Кт, виражена в мМ гербіцидного субстрату. МОВ вказує на те, що ферментативна активність може виявлятися при більш високих концентраціях гербіциду, але активність при тестованих концентраціях була недостатньо сильною, щоб забезпечити належну кінетичну характеристику. Для МОМ-НТ55 низькі рівні активності (Мітах) з 2,4-Ю в якості субстрату приводили до низької достовірності наданого значення. МОМ-НТ7 має Мтах з квізалофопом-П, яке на 40 95 більше, ніж для ферменту дикого типу, і Мтах для 2,4-О0, яке становить лише половину від такого ферменту дикого типу. МОМ-
НТІ має Мтах для квізалофопа-П, яке становить половину від такого ферменту дикого типу, і
Мтах для 2,4-О, яке в 9,5 раз вище ніж таке ферменту дикого типу. Диференціація білкової кінетики для МОМ-НТІ1 і МОМ-НТ7 була несподіваною, оскільки між МОМ-НТІ1 ії МОМ-НТ7 було всього чотири амінокислотних відмінності. Зокрема, МОМ-НТІ має наступні амінокислоти в зазначеній позиції: І82; Е105; Т112; ї М273, і МОМ-НТ7 має наступні амінокислоти в зазначеній позиції: І. 82; М105; 5112; і А273.
Таблиця 7
Квізалофоп Квізалофоп 2,А-0 2,4-0 0085) Була детально проаналізована ферментативна активність в діапазоні температур для
МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТ7 ії МОМ-НТВ8. Ці аналізи виконували, як описано вище. Як субстрат для цих реакцій застосовували квізалофоп-П або 2,4-О, і активність була нормована на основі активності ферменту дикого типу при 25 "С. Отримані криві активності представлені на Фіг. 2Б (з квізалофопом-П в якості субстрату), і на Фіг. 28 (з 2,4-О в якості субстрату).
Застосовуючи квізалофоп-П в якості субстрату, МОМ-НТ55 виявився найбільш чутливим до температури, з Ті/» 29 "С. Фермент дикого типу мав Т1/2 38 "С. МОМ-НТІ1 і МОМ-НТВ були менш чутливі до температури, ніж фермент дикого типу з Ту» 42 "С ії 41 "С, відповідно, тоді як фермент дикого типу при цих температурах був на 90 95 неактивний. МОМ-НТ2 і МОМ-НТ7 були значно менш чутливими до температури з Ті» 46 "С і 47 "С, відповідно, тоді як фермент дикого типу при цих температурах був повністю неактивний. Коли в якості субстрату застосовували 2,4-
О, фермент дикого типу мав Ті» 36 "С. МОМ-НТ2, МОМ-НТ7 і МОМ-НТВ8 були трохи більш чутливі до температури з більш низьким Ті», ніж фермент дикого типу. МОМ-НТІ був трохи менш чутливий до температури, при Ті; близько на 1 "С вище, ніж фермент дикого типу.
Ї0О86| Був також проведений аналіз плавлення білка. Для визначення плавлення білка очищений фермент додавали в 9б-лункові планшети для мікротитрування в стандартному буфері для зберігання (30 мМ Ттгі5 рН 7,5, 150 мМ Масі) з або без 50 мкМ Ге2 чі 1,0 мМ ако.
Білкове розгортання потім детектували за допомогою помаранчевого барвника білкового гелю 5УРВОФ (Іпмігодеп "М каталожний номер 56651, І їе Тесппоодіе5, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) на приладі Кеаі/ (Штпе-РСК ВіокКай СЕХОУб'м (ВіокКай, Геркулес, Каліфорнія) зі зчитуванням, виконаними від 10 "С до 95 "С з кроком 0,5 "С. Т/2 (тут температура, при якій розгорталось 50 95 білка) показана в Таблиці 8. Фермент дикого типу продемонстрував стабілізацію за допомогою 50 мкМ Ге2 з і 1,0 мм ако. Навпаки, 50 мкМ Рез ч-- і 1,0 мМ акс мало впливали на стабільність будь-якого з сконструйованих білків. МОМ-НТ5Ь5, МОМ-НТЗ, МОМ-НТАі, МОМ-НТв, і МОМ-НТ1О мали температури плавлення в діапазоні від 41 "С до 48 "С, які були нижче температури плавлення ферменту дикого типу. МОМ-НТІ, МОМ-НТ2г, МОМ-НТ5, МОМ-НТ7, МОМ-НТВ, і МОМ-
НТУ мали температури плавлення між 58 "С і 67 "С, які від 8 "С до 17 "С вище ніж ферменту
Зо дикого типу. Для МОМ-НТ7 і МОМ-НТІ, різниця в точці плавлення становила 11 "С в буфері без
Ее2 «я і акс, і 8 С в буфері з Ре2 - і ако. Це було несподівано, оскільки між цими двома ферментами було всього чотири амінокислотних відмінності. Ці дані по точці плавлення ферментів підтверджують, що для сконструйованих білків була оптимізована білкова стабільність при більш високих температурах. Ці дані також відповідають результатам аналізу ферментативної активності білків, що проводиться при різних температурах.
Таблиця 8
Таблиця 8
І0087| Ферментативну активність варіантів біле»а МОМ-НТ з галоксіфопом, феноксапропом, флуазіфопом і дихлорпропом в якості субстратів визначали із застосуванням аналізу ферментативної активності, виконаного при 23"С з очищеним ферментом. Активність реєстрували як максимальну активність у відсотках від активності ферменту дикого типу, яка була встановлена на рівні 100 95. Дані представлені в Таблиці 9. МОМ-НТ55, МОМ-НТЗ, МОМ-
НТ4і, МОМ-НТ»5, і МОМ-НТО мали максимальні активності для всіх чотирьох субстратів, які були менші або рівні максимальній активності ферменту дикого типу з тим же самим субстратом. При використанні галоксіропа як субстрата, МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТ7 ії МОМ-НТІТО мали максимальну активність, яка була вище, ніж активність ферменту дикого типу. При застосуванні фенаксопропа як субстрата, МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТб6, МОМ-НТ7, МОМ-НТВ і МОМ-НТ1О мали максимальну активність, яка була вище, ніж активність ферменту дикого типу. При використанні флуазіфопа як субстрат, МОМ-НТ2 і МОМ-НТ7 мали максимальну активність, яка була вище, ніж активність ферменту дикого типу. При застосуванні фенаксопропа як субстрата,
МОМ-НТІ, МОМ-НТ7 і МОМ-НТВ мали максимальну активність, яка була вище, ніж активність ферменту дикого типу.
Таблиця 9 о МмОМ-НІЗ(ЗЕОМО:22) | 67 | 8 щЩ | 60 | ло мМОМ-НТВ(ЗЕОІ0МО37) | 99 | 106 | (Бо 771717777с7о6б 0088) Ферментативна ідентичність була підтверджена за допомогою мас-спектроскопії. Для цього аналізу очищений білок розділяли в гелі РАСЕ і фарбували. Потім пофарбовані смужки вирізали, сушили і розщеплювали за допомогою трипсину згідно зі стандартними протоколами.
Розщеплені трипсином білкові препарати розділяли на Юіопох ОНіМакю 3000 К5іІСпапо ІС зузет (ТПпепто зсіепіййс, Саннівейл, Каліфорнія) із застосуванням колонки Тпегто Зсіепійіс м
АОЦАБІЇ тм 0-18 дамеїїп'"Мм (зцага в стандартних умовах і впорскували для аналізу М5-М5 із застосуванням мас-спектрометра Тпегто Зсіепійс"мМ 0) Ехасіїметм Нургій Оцаадгироїе-Огбйгар (Тпепто Зсіепіййс, Саннівейл, Каліфорнія).
Ї0089| Щоб оптимізувати білки для підвищення активності в присутності гербіцидів на основі феноксикислот, було виконано обчислювальне білкове конструювання на кристалічній структурі для декількох сконструйованих білків. Це використовували для ініціації додаткових циклів
Зо мутагенезу, які виконували, як описано вище, але із застосуванням бактеріальної послідовності
ЗЕО ІЮ МО:15, яка кодує білкову послідовність МОМ-НТІ (ЗЕО ІО МО:14), в якості початкової послідовності. Було створено близько 472 додаткових сконструйованих білків. Вони були об'єднані з близько 2600 сконструйованими білками, описаними в Прикладі 1 і Таблиці 6, всього близько 3072 сконструйованих білків для ідентифікації білків, оптимізованих для роботи в присутності 2,4-0. Перший скринінг нових варіантів проводили із застосуванням високопродуктивної (ВПС) системи бактеріальної експресії білка і аналізу ферментів з неочищеними бактеріальними лізатами, як описано в Прикладі 1, але модифікували, щоб проводити при бажаних температурах 25 "С і 40 "С з розвитком фарбування після гасіння при 2576. Після цього високопродуктивного скринінгу було відібрано 34 сконструйованих білків і їх було передано до наступного етапу скринінгу з білюювим нормуванням по всім зразкам. Після цього скринінгу, 12 сконструйованих білків були відібрані і пропущені до наступного етапу скринінгу з очищеним білком, проаналізовані з застосуванням аналізу ферментативної деградації гербіцидів, як описано в Прикладі 1. Ферментативну термостабільність аналізували за допомогою аналізу обмеженого плавлення білків. Після цього скринінгу було відібрано і передано до наступного етапу рослинного тестування 7 сконструйованих білків. Були відібрані три варіанти ферментів для детальної характеристики із застосуванням очищеного білка, при цьому концентрації білка були нормовані, і скринінг включав субстрати квізалофоп-П і 2,4-О, а також додаткові гербіциди, представлені в Таблиці 10 та Таблиці 12, а також характеристики плавлення білків.
ЇО090І Кінетичний аналіз із застосуванням аналізу без кінцевих точок проводили при 23 "С із застосуванням або квізалофопа-П, або 2,4-Ю0 в якості субстрату, як описано вище для очищеного білка ферменту дикого типу, МОМ-НТІ, МОМ-НТІ13, МОМ-НТІ15 і МОМ-НТ17. Дані демонструють значне і несподіване підвищення ферментативної активності МОМ-НТ13, МОМ-
НТІ15 ії МОМ-НТ17 по відношенню як до ферменту КарА дикого типу, так і до ферменту МОМ-
НТІ при тестуванні із застосуванням 2,4-Ю в якості субстрату. Зокрема, всі три варіанти показали близько 2,5-3-кратне збільшення активності (Мттах) відносно МОМ-НТ1.
Ферментативна активність варіантів МОМ-НТІ1І3, МОМ-НТ15 і МОМ-НТ17 з квізалофопом як субстратом була близько аналогічна активності МОМ-НТІ1. Див. Таблицю 10.
Таблиця 10 пн ЕТ т Я ет» по 0091 Аналіз плавлення білка проводили, як описано вище. Температури плавлення МОМ-
НТІ13, МОМ-НТ15 і МОМ-НТ17 були близькі до температури плавлення МОМ-НТІ з Ті» в буфері
Зо в діапазоні 55-58 "С, і з Ті» в буфері з Ре?2 - і акс в діапазоні 60-62 "С. Ці дані показують, що варіанти МОМ-НТІ1З3, МОМ-НТ15 ії МОМ-НТІ17 мають схожу ферментативну термостабільність у порівнянні з МОМ-НТ1. Ці дані по точці плавлення ферментативних варіантів підтверджують, що для сконструйованих білків була оптимізована білкова стабільність при більш високих температурах. Див. Таблицю 11.
Таблиця 11 11111101 ТемператураплавленняЄ Й - о ОМОМ-НТ5(ЗЕОюЮ МОЯ9) | -: У 55. 7777777 17771717171717171717171716017с7сСсСсСс20
І0092| Ферментативну активність варіантів білела МОМ-НТ з триклопіром, флуроксипіром,
МХФО, МСРВ, мекопропом в якості субстратів визначали із застосуванням аналізу ферментативної активності, виконаного при 23"С, з очищеним ферментом. Активність реєстрували як максимальну активність у відсотках від активності ферменту дикого типу КарА, яка була встановлена на рівні 100 95. Дані представлені в Таблиці 12. Для кожного з проаналізованих білків (МОМ-НТІ, МОМ-НТІ13, МОМ-НТ15 і МОМ-НТ17) з гербіцидами триклопір і флуроксипір в якості субстрату, виявлялася активність, особливо в сконструйованих варіантах, але активність не була досить сильною для кількісної оцінки. Для кожного з протестованих білків (МОМ-НТІ, МОМ-НТ13, МОМ-НТ15 і МОМ-НТ17) не було виявлено активності з гербіцидом
МСОСРВ в якості субстрату. Ферментативна активність з мекопропом в якості субстрату була зниженою для кожного з варіантів МОМ-НТІ, МОМ-НТ13, МОМ-НТ15 і МОМ-НТ17 в порівнянні з ферментом дикого типу КарА. Несподіваним результатом було те, що ферментативна активність з МХФО в якості субстрату була близько в 6 разів вище для МОМ-НТІ і близько в 10 разів вище для МОМ-НТ13, МОМ-НТ15 і МОМ-НТ17 в порівнянні з ферментом дикого типу КараА.
Див. Таблицю 12.
Таблиця 12 11111111 Мекопряп////// | /////// МхФоСсСсСсС0 о мМОМ-НТ(ЗЕОІЮ моля) 77/63 |7711142 | 600 | 721 оМОМ-НТІЗ(ЗЕОІ0МО47) | 37 | 92 2 2 ющ| 1800 | 68
Приклад 4: Експресія оптимізованих сконструйованих білків в кукурудзі
Ї0093| Десять унікальних сконструйованих білків, оптимізованих для роботи при більш високих температурах, були відібрані для трансформації кукурудзи та аналізу в рослинах. Були отримані ДНК-конструкції для експресії цих сконструйованих білків із застосуванням кодонів, оптимізованих для експресії в злаках, із застосуванням способів, відомих фахівцям в цій галузі техніки. Енхансери, промотори, лідери, інтрони, ТПХ і З'ЮТК випробовувалися в різних комбінаціях із сконструйованими більами в даних ДНК-конструкціях. ДНК-конструкції застосовували для трансформації незрілих зародків кукурудзи (І Н244) за допомогою даних векторів, використовуючи Аагорасієтішт Шппіїасієпе і стандартні способи, відомі в цій галузі техніки. Регенеровані КО трансгенні проростки вирощували в теплиці. 00941 Трансгенні рослини кукурудзи КО піддавали скринінгу з обробкою квізалофопом-П (2Х) плюс 2,4-0 (2Х) через 7-10 днів з подальшою пересадкою в горщики (як правило, відповідала стадії росту М3-М4). На основі всіх протестованих конструктів були отримані рослини, які містять одиничну копію трансгенної вставки, які пройшли КО скринінг. Рослини КО були самозапилені для того, щоб отримати гомозиготне насіння КІ, і також використовували КО як особин чоловічої статі, для схрещування з інбредними рослинами, що містять трансгенну вставку кукурудзи МОМ89034, для отримання насіння сегрегуючого гібрида Е1, для проведення польових випробувань ефективності.
Зо Ї0095| Польове дослідження ефективності проводилося з сегрегуючими Е1 гібридними рослинами, з 50 95 гомозигот і 50 95 нульових за трансгенном рослин. Стійкість до квізалофопа-
П (2Х) плюс 2,4-0О (2Х) оцінювалася із застосуванням двох схем обробки гербіцидами: (1) квізалофоп-П (А55иге І) в нормі 0,16 фунта д.р./акр (2Х) плюс 0,25 95 об./об. неіонної поверхнево-активної речовини (НІПАВ), які наносяться на стадії росту МЕ-М2, після чого слідує така ж обробка на стадії росту МА, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8, і 2) 2,4-0 амін 2 фунта к.е./акр (2Х) плюс квізалофоп-П 0,04 фунта д.р./акр (0,5Х) плюс 0,25 95 об./об.
НІПАВ, що наносяться на стадії росту МЕ-М2, з подальшою обробкою 2,4-О аміну в нормі 2 фунта к.е./акр (2Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, які наносяться на стадії росту М4, після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8. 50 95 рослин, які були нульовими за трансгеном, були видалені після першої обробки квізалофопом-П на стадії росту МЕ-М2. Ділянки були візуально оцінені через 10-14 днів після обробки за рівнем пошкоджень посівів в діапазоні від О до 100, при цьому "0" - відсутність пошкоджень, а "100" було повним знищенням посівів.
Таблиця 13 демонструє середній показник ушкоджень на етапах росту МА і М8 для обох схем розпилювання. Оцінка пошкоджень «10 95 розглядалася як дуже хороша стійкість, а оцінка пошкоджень «2095 розглядалася як хороша стійкість. Відсоткова оцінка ушкоджень із застосуванням 2 х 2,4-О на стадії росту М8 варіювала від 40 95 до мінімуму - 0. Аналогічним чином, процентна оцінка ушкоджень із застосуванням 2Х квізалофопа-П на стадії росту У8 коливалася від 9095 до мінімуму - 0. Відмінності в оцінці пошкоджень між рослинами, які експресують один і той же білок, ймовірно, пов'язані з відмінностями в дизайні конструкції або місцезнаходженні вставки трансгена. Ці дані підтвердили, що рослини, які експресують сконструйовані білки, проявили стійкість до обробки гербіцидами 2,4-О і квізалофопом при 2Х нормах.
Таблиця 13 ть відсоток ть відсоток до відсоток до відсоток
Білок пр пошкоджень на пошкоджень на пошкоджень на |пошкоджень на стадії Уя стадії У8 стадії МА 2,4-О | стадії М8 2,4-0
Квізалофоп Квізалофоп " " о омомНнт | в | 75 | 875 | 70 | тю мом НнІа | А | 0 | 0 | 20 | з47
Мом НнТа | Немає | (0... .ЮюЮюЮЙйо 5 ю «КЗ| 20 | з375 мом НнТа | в | 1167 | 1167 | 1056 | 15393 мом НнІЯ | А | 61 | 0 | 223 | 123 о мМоМНнІ | А | 68 | 17 | 272 | 174
МОМ НнІЄ | А | 8 | 17 | 27 | 127 о мМоМмНнТВ | Немає | 85.2 БКМХМ| 9 | 0 | 0 о момнІВ | в | 917 | 893 | 125 | 1167 о омМОоМНнИо | А | 0 | 0 | 28 | 3833 0096) Був застосований аналіз ферментативної активності на основі рослин для визначення теплової чутливості, щоб визначити вплив підвищених ростових температур на стійкість трансгенних рослин до гербіцидів, що містять оптимізовані сконструйовані білки. Для перевірки на стійкість до квізалофопа-П при підвищених ростових температурах, насіння Е1 гібрида кукурудзи (отриманого шляхом схрещування гомозиготної рослини КІ, яка експресує один з білків МОМ-НТ, з інбредною трансгенною рослиною кукурудзи МОМ89034), пророщували в кліматичній камері впродовж 10 днів при денній температурі 28 "С і нічній температурі 20 "С при 50 95 вологості. Через 10 днів рослини переносили для акліматизації впродовж З днів при одному з трьох різних денних і нічних температурних режимів: (1) денна та нічна температури встановлені на 20 "С; (2) денна температура 28 С ії нічна температура 20 "С; або (3) денна температура 38 "С і нічна температура 30 "С. Після закінчення акліматизаційного періоду рослини зазвичай знаходилися на стадії росту М4 і обприскувались 2Х квізалофопа-П. Через 10 днів після обробки, пошкодження рослини оцінювалися за шкалою від 1 до 5, в якій "0" - не спостерігалося видимих пошкоджень, "1" - хлоротична плямистість, "2" - хлоротичні смуги, "3" - розриви листя, "4"- рослини з чахлим ростом і/або скрученими листям, а« 5" - мертві рослини або не спостерігалося росту. Результати представлені на Фіг. 4. Е1 гібридні рослини кукурудзи, які експресують МОМ-НТ55, показали хорошу стійкість (оцінка ушкоджень близько 2) до обробки розпиленням, коли денна/нічна температури становили 20 "С/20 "С (Фіг. 4А) або 28 7С/207С (Фіг. 4Б) відносно гібридних контрольних рослин Е1 (трансформанти кукурудзи МКбОЗ Х
МОМ89034) (оцінка ушкоджень - 5). Коли денні/нічні температури становили 38 "С/30 "с, гібридні контрольні рослини ЕТ мали оцінку пошкоджень рівну п'яти, гібридні рослини ЕТ, які експресували МОМ-НТ55, мали середній коефіцієнт ушкоджень три, і гібридні рослини Н1, які експресували МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТЗ, МОМ-НТА або МОМ-НТ7 мали оцінку пошкоджень « 1 (Фіг. 48). Сконструйовані білки, оптимізовані для роботи при більш високих температурах, забезпечували стійкість до гербіцидів на основі АОФП, коли рослини, які експресували дані сконструйовані білки, піддавалися впливу високих температур.
Зо Ї0097| Для перевірки на стійкість до 2,4-О при підвищених ростових температурах, гібридні рослини ЕТ отримували шляхом схрещування рослини КІ, що містить МОМ-НТІ, МОМ-НТ2,
МОМ-НТЗ, МОМ-НТА4, МОМ-НТ7 або МОМ-НТ55, з інбредною рослиною, яка містить трансгенну вставку кукурудзи МОМ89034. Гібридні рослини Е1Ї вирощували в теплиці впродовж одного тижня при мінімальній температурі 20 "С і максимальній температурі 28 "С, при вологості від 50 до 80 95. Через 1 тиждень, рослини переносили для акліматизації впродовж трьох днів при одному з двох різних денних і нічних температурних режимів: (1) денна та нічна температури встановлені на 20 С, або (2) денна температура 38 "С і нічна температура 30 "С. Після закінчення акліматизаційного періоду рослини зазвичай знаходилися на стадії росту МА і обприскувались 4Х 2,4-Ю аміном. Через 10 днів після обробки, пошкодження рослин оцінювалися з використанням шкали ушкоджень від 0 до 100, при цьому "0" - не було пошкоджень, а "100" - мертва рослина. Коли рослини були акліматизовані при денних/нічних температурах 20 7С/20 "С до нанесення 4Х 2,4-О аміну, рослини Е1, які містили МОМ-НТ1,
МОМ-НТ2г, МОМ-НТЗ, МОМ-НТА, МОМ-НТ7 або МОМ-НТ55, мали середні показники пошкоджень -10 до, а контрольні рослини мали середні показники пошкоджень менше 20 95 (Фіг. 4Г). Коли рослини були акліматизовані при денних/нічних температурах 38 "С/30 "С перед нанесенням 4Х 2,4-О0 аміну, рослини НЕ1, які містили МОМ-НТА4 або МОМ-НТ7, мали середні оцінки пошкоджень «2095, рослини Е17, які містили МОМ-НТІ, МОМ-НТ2 або МОМ-НТЗ, мали середні оцінки пошкоджень менше 10 95 (Фіг. 4Д), а контрольні рослини і рослини, що включають МОМ-НТ5Ь5 Е1 рослини, мали середні оцінки пошкоджень рівні 50 95 (Фіг. 4Д). Ці результати показали, що сконструйовані білки, оптимізовані для роботи при більш високих температурах, забезпечували стійкість до гербіциду 2,4-О, коли рослини, які експресують ці сконструйовані білки, піддавалися впливу високих температур.
Ї0098| Окремі польові випробування ефективності ознак для квізалофопа-П і 2,4-0 проводилися в двох локаціях, кожне з гібридними трансгенними рослинами Е1, отриманими шляхом схрещування інбредної рослини, яка містила трансгенну вставку кукурудзи МОМ89034, з рослиною КІ, яка містила МОМ-НТ5Б5 (з ТИПХ) МОМ-НТІ (з або без ТПХ), МОМ-НТаЗ (з або без
ТПХ), МОМ-НТЗ (з ТИХ), МОМ-НТА (з ТПХ), МОМ-НТЗ5 (з ТПХ), МОМ-НТВв (з ТПХ), або МОМ-НТ7 (з ТПХ). Трансгенні гібридні рослини Е1, які містили одиничні трансгенні вставки кукурудзи,
МКбОЗ х МОМ89034, застосовували для порівняння, в якості контролю.
Ї0099| У польовому випробуванні ефективності стійкості до квізалофопа-П і чутливості до клефодіуму, застосовувалася одна з чотирьох обробок гербіцидом: (1) квізалофоп-П (Авзиге ІЇ)
Зо 0,32 фунта д.р./акр (4Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що наносяться на стадії росту МЕ-М2, після чого слідує така ж обробка на стадії росту МА, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту
М8; (2) квізалофоп-П 0,64 фунта д.р./акр (8Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, які наносяться на стадіях росту від МЕ до М2, після чого слідує така ж обробка на стадії росту М4, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8; (3) квізалофоп-П 1,28 фунта д.р./акр (16Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що наносяться на стадіях росту від МЕ до М2, після чого слідує така ж обробка на стадії росту МА, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8; або (4) клефодіум 0,25 фунта д.р./акр (1Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що наносяться на стадії росту М8. Ділянки були візуально оцінені через 10-14 днів після обробки за рівнем пошкоджень посівів в діапазоні від 0 до 100, при цьому "0" - відсутність пошкоджень, а "100" було повним знищенням посівів. В
Таблицях 14 та 15 показані середні оцінки пошкоджень після застосування гербіцидів на стадії росту М4 або М8, відповідно.
ЇО0О100)| Рослини, які містили МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТЗ, МОМ-НТаі, МОМ-НТ5, МОМ-
НТб або МОМ-НТ7 (всі функціонально з'єднані з ТПХ) показали дуже хорошу стійкість до квізалофопа-П з оцінками ушкоджень менше 15 95 при всіх нормах застосування, і як на стадії росту М4, так на стадії М8. Рослини, які містили МОМ-НТ55, який функціонально-з'єднаний з
ТПХ, показали від помірної до поганої стійкості з оцінками пошкоджень від 0,8 95 до 78,8 95.
Оцінки пошкоджень для контрольних рослин після застосування квізалофопа-П склали 99,5 95.
Ці результати показують, що рослини, які містили МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТЗ, МОМ-НТА,
МОМ-НТ5, МОМ-НТб або МОМ-НТ7, функціонально з'єднані з ТПХ, володіють дуже хорошою стійкістю до серійної обробки квізалофопом-П.
ЇО0О101| Рослини, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ2 з функціонально-з'єднаним ТПХ, мали кращу стійкість до квізалофопа-П, ніж рослини, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ2 без функціонально-з'єднаного ТПХ. Рослини, які містили МОМ-НТІ1 з функціонально-з'єднаним ТПХ, мали оцінки пошкоджень від 0 до 5,595 при всіх обробках квізалофопом-П, в порівнянні з оцінками пошкоджень від 3,3 95 до 18,8 95 рослин, які містили МОМ-НТІ без функціонально- з'єднаного ТПХ. Рослини, які містили МОМ-НТ2 з функціонально-з'єднаним ТПХ, мали оцінки пошкоджень від 1,595 до 1095 при всіх обробках квізалофопом-П, в порівнянні з оцінками пошкоджень від 16,3 95 до 82,5 95 рослин, які містили МОМ-НТ2 без функціонально-з'єднаного
ТПХ. На Фіг. 5 показані рослини, які містили МОМ-НТ2 з функціонально-з'єднаним з ТПХ (Фіг. бо БА), і рослини, які містили МОМ-НТ2 без ТПХ (Фіг. 5Б), через 10-14 днів після застосування квізалофопа-П (обробка 3) 1,28 фунта д.р./акр (16Х) плюс 0,2595 о0об./о0б. НІПАВ, які застосовувались на стадіях росту від МЕ до М2, після чого слідувала така ж обробка на стадії росту М4, і після чого слідувала така ж обробка на стадії росту М8. Контрольні рослини не виживали, рослини, які містили МОМ-НТ2 без ТПХ, мали від помірної до поганої стійкості, а рослини, які містили МОМ-НТ2, функціонально-з'єднаний ТПХ, мали сильну стійкість до обробки квізалофопом-П. Ці результати підтвердили, що застосування функціонально-з'єднаного ТПХ значно покращує стійкість до квізалофопа-П. 00102) Всі трансгенні рослини мали оцінки пошкоджень вище 90 95 при обробці 1Х нормою клефодіума (0,25 фунта д.р./акр), що застосовувався на стадії росту М8, демонструючи застосування цього гербіциду до самосівного контролю з трансгенними рослинами, які містили сконструйовані білки. 00103) У польовому випробуванні ефективності стійкості до 2,4-О, застосовувалася одна з чотирьох обробок гербіцидом: (1) 2,4-О-амін 2 фунта к.е./акр (2Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що застосовуються на стадіях від МЕ до М2, і потім на МА, і потім на М8; (2) 2,4-Ю-амін 4 фунта к.е./акр (4Х) плюс 0,25 95 об./об. НІПАВ, що застосовуються на стадіях від МЕ до М2, і потім на
М4, і потім на М8; (3) 2,4-Ю0О-амін 8 фунтів к.е/акр 8Х) плюс 0,2595 об./06б. НІПАВ, що застосовуються на стадіях від МЕ до М2, і потім на МА, і потім на М8 кукурудзи; або (4) 2,4-О-амін 16 фунтів к.е./акр (16Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що застосовуються на стадіях від МЕ до М2, і потім на МА, і потім на У8. Ділянки були візуально оцінені, як зазначено вище. В Таблицях 14 та 15 показані середні оцінки пошкоджень після застосування гербіцидів на стадії росту М4 або М8, відповідно. 00104) Рослини, які містили МОМ-НТІ, МОМ-НТ2 або МОМ-НТЄ (всі функціонально з'єднані з ТПХ), показали дуже хорошу стійкість до 2,4-О, з оцінками пошкоджень менше 10 95 і менше 17 95 при всіх нормах обробки на стадіях росту МА і М8, відповідно. Рослини, які містили МОМ-
НТЗ, МОМ-НТА або МОМ-НТ5 або МОМ-НТ7 (всі функціонально з'єднані з ТПХ), показали дуже хорошу стійкість до 2,4-О, з оцінками ушкоджень менше 20 95 і менше 22 95 при всіх нормах обробки на стадіях росту МА і М8, відповідно. Рослини, які містили МОМ-НТ55, з функціонально- з'єднаним ТПХ, показали від помірної до поганої стійкості з оцінками пошкоджень від 7,595 до 66 95. Оцінки пошкоджень для контрольних рослин після застосування 2,4-О складали від 40 95
Ко) до 82,2 95. Ці результати показують, що рослини, які містять МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТЗ,
МОМ-НТАі, МОМ-НТ5, МОМ-НТЄ або МОМ-НТ7, добре переносять серійну обробку 2,4-0.
ЇО0О105) Рослини, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ2 з функціонально-з'єднаним ТПХ, в цілому, як правило, не показали помітних відмінностей в стійкості до 2,4-О у порівнянні з рослинами, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ2, без функціонально-з'єднаного ТПХ, як було видно з обробки квізалофопом-П. Рослини, які містили МОМ-НТІ з функціонально-з'єднаним
ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 0 до 16,3 95 при всіх обробках 2,4-0, в порівнянні з оцінками пошкоджень від 0 до 13,8 95 рослин, які містили МОМ-НТІ1, без функціонально-з'єднаного ТПХ.
Рослини, які містили МОМ-НТ2 з функціонально-з'єднаним ТПХ, мали оцінки пошкоджень від 1,3 95 до 15 95 при всіх обробках 2,4-0, в порівнянні з оцінками пошкоджень від 1,3 95 до 21,3 95 рослин, які містили МОМ-НТ2 без функціонально-з'єднаного ТПХ. Проте дана різниця була помітна після обробки рослин 2,4-О на стадії росту М4, що містили МОМ-НТ2 з функціонально- з'єднаним ТПХ (4,5 9о-ва оцінка пошкоджень при 8Х, і 7,5 95 при 16Х) в порівнянні з рослинами без ТПХ (13,75 95 оцінка пошкоджень при 8Х, і 21,25 95 при 16Х).
Таблиця 14 росту М4 2,А-0 24-00 24-00 2,А-0 Квізалофоп|Квізалофоп|Квізалофоп о нТьБ | 125 | 300 | 488 | 525 | 80 | 188 | 488 моОМм-нтьБ| 138 | 313 | 450 | 613 | 60 | 100 | 213 немає немає немає немає
МоМнт даних | даних даних | дах | 0609669
МОМ-НТ1 (немає 5,6 12,5 5,6 11,3 18,8 тТпПХ)
Таблиця 14
Стадія 2х 4х вх 16бх 4х вх 16бх росту М4 2,А-0 24-00 24-00 2,А-0 Квізалофоп|Квізалофоп|Квізалофоп мом-нтт) 00 | 00 | 50 | 6з | 00 | 08 | 45
МОМ-НтТ2 (немає 1,3 2,5 13,8 21,3 42,5 76,3 82,5
ТПХ) мом-Нта) 13 | 00 | 45 | 75 | 75 | 08 | оо мом-нтз) 3,8 | 63 | 88 | 113 | 08 | 00 | 43 мом-нт.! 00 | 73 | 88 | 188 | 28 | 33 | 158
МОМ-НТЬ мом-нтє! 00 | 20 | 58 | 88 | 00 | їз | 28 мом-нт| 73 | 73 | 58 | 125 | 08 | їз | зз3
Таблиця 15 росту Клефодіум|! 2,4-0 2,4-0 2,4-0 2,А-Ю0 КвізалофопКвізалофопіКвізалофоп
МОМ-
МОМ-
МОМ-
МОМ-
МОМ-
МОМ- немає немає немає немає
МОМ-
МОМ-НТ1 (немає 94,5 2,5 4,0 8,68 13,8 3,3 7,5 16,3
ТПХ)
МОМ-Нт
МмОМ-НтТ2 (немає 92,0 5,0 8,6 13,8 25,0 16,3 52,5 77,5
ТИХ
МОМм-Нта мом-нтзІ 945 | 55 | 55 | 1193 | 138 | 25 | 20 | 60 мом-нте 945 / 20 | 88 | 125 | 213 | 33 | 33 | 80 мом-нть; 920 / 33 | 40 | 100 | 213 | 25 | 00 | 80
МОМм-НТв мом-нт7| 9303 | 20 | 28 | 93 | 200 | 15 | 08 | 55
Приклад 5: Оцінка впливу хлоропласт-націлюючих пептидів на експресію оптимізованих сконструйованих білків в кукурудзі
ЇО0О10О6| Для оцінки різних хлоропласт-націлюючих пептидів (ХНП), були сконструйовані вектори для трансформації рослин, кожний з яких містив рекомбінантну молекулу ДНК, оптимізовану для експресії в однодольних, що кодує МОМ-НТІ (ЗЕО 10 МО:16), МОМ-НТ2 (З5ЕО
ІО МО:20), ії МОМ-НТ8 (ЗЕО ІЮ МО:39), МОМ-НТО (5ЕБЕО ІЮ МО:42), або МОМ-НТІ1О (5ЕО І
МО:45). Вектори були створені із застосуванням тієї ж комбінації промотора, лідер, інтрона і 3'-
ТЕ, але з одним з трьох окремих ТПХ (А, В або С) або без ТПХ, функціонально-з'єднаного з білок-кодуючою послідовністю. Див. Таблицю 16. ДНК-конструкції застосовували для трансформації незрілих зародків кукурудзи (ГН244) з використанням Адгобасієтгійт Шштігасієепз і стандартних способів, відомих в цій галузі техніки. Регенеровані КО трансгенні проростки вирощували в теплиці. Рослини КО самозапилювали, щоб отримати К1 гомозиготне насіння.
Рослини КО також використовували в якості особин чоловічої статі, для схрещування з інбредними рослинами, які містили трансгенну вставку кукурудзи МОМ89034, щоб отримати насіння сегрегуючого гібрида Е1, для проведення польових випробувань ефективності.
Ї00107| Польові випробування ефективності окремих ознак для квізалофопа-П і 2,4-0 проводилися в двох локаціях, кожне з гомозиготними інбредними трансгенними рослинами (покоління К2 або К4). У цих польових випробуваннях застосовувалася одна з двох обробок гербіцидом: (1) квізалофоп-П (Авзиге ІЇ) в нормі 0,16 фунта д.р./акр (2Х) плюс 0,25 95 об./об. неіонної поверхнево-активної речовини (НІПАВ), які наносяться на стадії росту МА, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8; або 2) 2,4-О амін 2 фунта к.е./акр (2Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що наносяться на стадії росту М4, після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8. Оцінки пошкоджень (відсоток пошкоджень посівів на стадії росту МА (ПППМ4) або М8 (ПППМ8)) були проведені через 10-14 днів після обробок на стадіях М4 і М8. Помилка була розрахована з використанням НДР (0,05). Результати показали, що дані рослини мали стійкість до 2Х серійних обробок або квізалофопом-П, або 2,4-О з оцінкою пошкоджень нижче 10 95 після обробок на стадіях МА і М8. Див. Таблицю 16.
Таблиця 16
НДР (0,05) - 1,45) НДР (0,05) - 2,2 ІНДР (0,05) - 0,95) НДР (0,05) - 1,6 оМОоМНт | А ЇЇ 70 | 2125 | 0 | 25 можн! в ЇЇ 0 | 175 | 0 | 1725 омомнТт! с 77770 | 175 | 725 | 125 омОоМм-нтІ |немаєтИх| 07777 Ї77117125 | 70 | ще мона | А | (о 7/7 7875. | 0875 | 1725 можна | в |! 0 2 / 0 | 0 | 25 можна | с 0 ЇЇ 5 щ2 | 0 1 125 омоМм-нт2 |немаєтих| ї25 | 35 | 0 | 25 омоМНнІВ| А ЇЇ 0 125 | 7775 | 1725 омомнТІВ| в | 075 | 25 | 0 | 1725 моні! с; 7770 | 125 | 7125 | 0 мом нт! А ЇЇ 0 ЇЇ щфф0 | 875 | 1725 омомНнло|Ї А ЇЇ 0 /! 0 ЇЇ 0 | 725 00108) Зразки листя збирали з рослин, які містили трансгенні касети, які кідують МОМ-НТІ1,
МОМ-НТ2 ії МОМ-НТВ, з послідовностями ТІПХ і без них, щоб визначити експресію мРНК, транскрибовану з трансгенної касети, яка кодує сконструйовані білки. Аналіз ОцапідепефФ проводили на екстрактах листя для визначення експресії мРНК трансгенної касети. Для цих аналізів зонд був до загальної послідовності 3-0ТК, присутньої в кожній експресуючій касеті, яка використовувалась для отримання трансгенних рослин. Відносну експресію розраховували за допомогою нормування за генами домашнього господарства кукурудзи. Зразки листя збирали з кожної з восьми рослин для кожної конфігурації конструкції, що була використана для отримання трансгенних рослин, і дані відносної експресії МРНК представляли собою середнє за вісьмома зразками з стандартною помилкою.
Ї0О0109| Рослини, які містили трансгенну конструкцію, яка кодує або МОМ-НТІ (5ЕО ІО
Зо МО:14), або МОМ-НТ2 (5ЕО ІО МО:18), мали більш високу відносну експресію трансгенної мРНК для конструкцій, що містять або "А", або "В" ТПХ, ніж для конструкцій без ТПХ або з "С" ТПХ.
Рослини, які містили трансгенну конструкцію, яка кодує МОМ-НТВЇ (5ЕО ІЮ МО:37), мали аналогічну високу відносну експресію трансгенної мРНК для конструкцій, які містять будь-який з трьох ТПХ (А, В або С). Див. Таблицю 17.
Таблиця 17 експресії мон ЇЇ 77777в 77777775 | 4 щ(-б3
Таблиця 17 експресії мом НнТ? | А 7777 | 77717696 17111711 066с1щС п ТтеТти х ПРИ ПО З ЗОН ПОН Я С НН ОН Ж У моні | 77 в г ющЩ Б | (Б 762 | 046 о КонтрольїНг44 | Немає | 000 | .-..юЮЙН ие 00071
ЇО0О110| Окремі польові випробування ефективності ознаки для скринінгу під тиском квізалофопа-П і 2,4-О проводилися в одній локації з трансгенними гібридними рослинами Н1, отриманими шляхом схрещування інбредної рослини, яка містить трансгенну вставку кукурудзи
МОМ89034, з рослиною КІ, яка містила МОМ-НТІ, МОМ-НТ2, МОМ-НТВ8, МОМ-НТе ії МОМ-НТ1ТО з і без функціонально-з'єднаних послідовностей ТПХ. Трансгенні гібридні рослини Е1, які містили одиничні трансгенні вставки кукурудзи, МКбОЗ х МОМ89034, застосовували для порівняння, в якості контролю.
ЇОО111| У польовому випробуванні ефективності стійкості до квізалофопа-П, застосовувалася одна з трьох обробок гербіцидом: (1) квізалофоп-П (Ав5зиге І) 0,32 фунта д.р./акр (4Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що наносяться на стадії росту МЕ-М2, після чого слідує така ж обробка на стадії росту МА4, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8; (2) квізалофоп-П 0,64 фунта д.р./акр (8Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що наносяться на стадіях росту МЕ-М2, після чого слідує така ж обробка на стадії росту М4, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8; (3) квізалофоп-П 1,28 фунта д.р./акр (16Х) плюс 0,25 95 об./об.
НІПАВ, що наносяться на стадії росту МЕ-М2, після чого слідує така ж обробка на стадії росту
М4, і після чого слідує така ж обробка на стадії росту М8. Ділянки були візуально оцінені, як зазначено вище. У таблиці 18 наведені середні оцінки пошкоджень після застосування гербіцидів на стадіях росту М4 (ПППМ4) або М8 (ПППМв8) відповідно. Оцінки пошкоджень для контрольних рослин після застосування квізалофопа-П склали 10095. Помилка була розрахована з використанням НДР (0,05).
Таблиця 18 77711101 | 4Хквізалофоп Пп | 8Хквізалофоп-П | 16Хквізалофоп-П
МОМ-Нт пппм4 ппПппУв пппм4 ппПпПмМ8 пппм4 ппПппУв варіант ТИХ НДР (0,05) | НДР (0,05) | НДР (0,05) | НДР (0,05) | НДР (0,05) | НДР (0,05) - 1,92 -2,3 - 4,7 - 5,3 - 5,0 - 5,4
МОМ НТ А ЇЇ 0 | 75 | 25 | 710 | 5 | 15 момНнт в | 25 | 5 | 25 | 75 | 25 | 20 момНнт! со 0 | 5 | 25 | 710 | 5 | го мом нта! А ЇЇ 0 | 5 | 25 | 75 | 5 | 15 момНнТа! в | 0 | 5 | 0 | 710 | 0 | го мом НнТа! со 0 | 54 | 5 | 7125 | 125 | го /
ОмМОоМНТВ! А | 15 | 15 | 375 | 35 | 60 | 50 / момнТВ! В | 5 | 75 | 325 | 35 | 275 | 30 омомНнТЯ, А ЇЇ 0 | 5 | 25 | 15 | 75 | 20 / моМ-нтоЇ А ЇЇ 0 | 5 | 25 | л0 | 5 | 2 00112) Рослини, які містили МОМ-НТІ з будь-яким з трьох функціонально-з'єднаних ТПХ (А,
В або С), мали більш високу стійкість до квізалофопа-П, ніж рослини, які містили МОМ-НТІ1 без функціонально-з'єднаного ТПХ. Рослини, які містили МОМ-НТІ з функціонально-з'єднаним "А"
ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 0 до 15 95 при всіх застосуваннях квізалофопа-П. Рослини, які містили МОМ-НТІ1 з функціонально-з'єднаним "В" ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 2,5 до 20 95 при всіх застосуваннях квізалофопа-П. Рослини, які містили МОМ-НТІ з функціонально- з'єднаним "С" ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 095 до 2095 при всіх застосуваннях квізалофопа-П в порівнянні з рослинами, які містили МОМ-НТІ, без функціонально-з'єднаного
ТПХ, які мали оцінку пошкоджень від 2,5 95 до 37,5 95 при всіх застосуваннях квізалофопа-П.
ЇО0О113) Рослини, які містили МОМ-НТЗ2 з будь-яким з трьох функціонально-з'єднаних ТПХ (А,
В або С), мали більш високу стійкість до квізалофопа-П, ніж рослини, які містили МОМ-НТ2 без функціонально-з'єднаного ТПХ. Рослини, які містили МОМ-НТ2 з функціонально-з'єднаним "А"
ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 0 до 15 95 при всіх застосуваннях квізалофопа-П. Рослини, які містили МОМ-НТ2 з функціонально-з'єднаним "В" ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 0 до 20 95 при всіх застосуваннях квізалофопа-П. Рослини, які містили МОМ-НТ2 з функціонально- з'єднаним "С" ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 095 до 2095 при всіх застосуваннях квізалофопа-П в порівнянні з рослинами, які містили МОМ-НТ2, без функціонально-з'єднаного
ТПХ, які мали оцінку пошкоджень від 35 9о до 70 Фо при всіх застосуваннях квізалофопа-П. 00114) Рослини, які містили МОМ-НТВ8 з функціонально-з'єднаним "А" або "В" ТПХ, мали кращу стійкість до квізалофопа-П, ніж рослини, які містили МОМ-НТВ8 без функціонально- з'єднаного "С" ТПХ. Рослини, які містили МОМ-НТВ8 з функціонально-з'єднаним "А" ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 1595 до 6095 при всіх застосуваннях квізалофопа-П. Рослини, які містили МОМ-НТВ з функціонально-з'єднаним "В" ТПХ, мали оцінку пошкоджень від 5 95 до 35 95 при всіх застосуваннях квізалофопа-П в порівнянні з рослинами, які містили МОМ-НТВ, без функціонально-з'єднаного "С" ТПХ, які мали оцінку пошкоджень від 45 95 до 8595 при всіх застосуваннях квізалофопа-П.
ЇО0115) Рослини, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ2 з будь-яким з трьох функціонально- з'єднаних ТПХ, і рослини, які містили МОМ-НТОУ або МОМ-НТ10 з функціонально-з'єднаним "А"
ТПХ, мали кращу стійкість до квізалофопа-П, ніж рослини, які містили МОМ-НТВ з будь-яким з трьох функціонально-з'єднаних ТПХ. Рослини, які містили МОМ-НТО або МОМ-НТІО з функціонально-з'єднаним "А" ТПХ, мали стійкість до квізалофопа-П при всіх обробках, що було можна порівняти з рослинами, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ2, з будь-яким з трьох
Зо функціонально-з'єднаних ТПХ. При найвищій нормі обробки (16Х) квізалофопом, рослини, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ?2 з функціонально-з'єднаним "А" ТПХ, мали дещо вищу стійкість, ніж рослини, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТЗ2 з функціонально-з'єднаним "В" або "С" ТПХ. 00116) У польовому випробуванні ефективності ознаки на стійкість до 2,4-О застосовували три обробки гербіцидом: (1) 2,4-Ю-амін 4 фунта к.е./акр (4Х) плюс 0,25 95 об./06б. НІПАВ, що застосовуються на МЕ-М2, і потім на Ма, і потім на М8; (2) 2,4-О-амін 8 фунтів к.е./акр (8Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що застосовуються на МЕ-М2, і потім на М4, і потім на М8 кукурудзи; (3) 2,4-ЮО-амін 16 фунтів к.е./акр (16Х) плюс 0,25 95 об./06. НІПАВ, що застосовуються на МЕ-М2, і потім на МА, і потім на М8. Ділянки були візуально оцінені, як зазначено вище.
Ї0О0117| У Таблиці 19 наведені середні оцінки пошкоджень кукурудзи після застосування гербіциду 2,4-О на стадіях росту МА (ПППМ4) або М8 (ПППМ8) відповідно. Оцінки пошкоджень для контрольних рослин після застосування 2,4-О складали від 80 95 до 96,25 95. При найвищій нормі 2,4-О0 (16х), яка застосовувалась впродовж У8, рослини, які містили МОМ-НТІ або МОМ-
НТ2, функціонально-з'єднаний з будь-яким з трьох ТПХ (А, В або С), мали кращу стійкість в порівнянні з рослинами, які містили МОМ-НТІ або МОМ-НТ2, без функціонально-з'єднаного
ТПХ. Рослини, які містили МОМ-НТІ, МОМ-НТ2 або МОМ-НТ8 з або без функціонально- з'єднаного ТПХ, мали кращу стійкість до 2,4-О у всіх застосуваннях, ніж рослини, які містили або
МОМ-НТУ або МОМ-НТІ10 без функціонально-з'єднаного ТПХ "А". В діапазоні застосувань 2,4-0, відносний рейтинг стійкості був наступним: рослини, які містили МОМ-НТІ, мають кращу стійкість, ніж рослини, які містили МОМ-НТ2, які, в свою чергу, мали кращу стійкість, ніж рослини, які містили МОМ-НТВ8. Відповідно до даних випробування тиску квізалофопа-П, рослини, які містили МОМ-НТІ, МОМ-НТ2 або МОМ-НТВ, функціонально-з'єднані з "А" ТПХ, продемонстрували невелику математичну, але не статистично значущу перевагу над "В" і "С" транзитним пептидом. Помилка була розрахована з використанням НДР (0,05).
Таблиця 19 111111 4ях24о | 8Х24о | 16х24040
Вста і ін в ій і ій - 3,4 - 3,33 -921 - 3,5 - 3,4 - 3,5
Юштоль| Чемее | во вет | ває | 950676 0овво5 момНнт! в ЇЇ 5 | 5 | 5 | 70 | ло | 15 / мом НнТа! в | 5 | 5 | 5 | 70 | ло | 25 / момнІВ! В | 5 | 75 | 70 | 275 | ло | го омоМНнТЯ) А | 175 | 55 | 25 | 75 | 45 | 90 омоМ-ло| А | 325 | 7 | 55 | 875 | 45 | 90
Приклад 6. Експресія оптимізованих сконструйованих білків в сої
ЇО0118| Два сконструйованих білки були відібрані для аналізу в трансгенній сої. Були отримані ДНК-конструкції для експресії МОМ-НТІ (5ЕО ІЮО МО:14) і МОМ-НТ2 (5ЕО ІО МО:18) із застосуванням кодонів, оптимізованих для експресії в дводольних, із застосуванням способів, відомих фахівцям в цій галузі техніки. Енхансери, промотори, лідери, інтрони, ТПХ і З'ОТК в різних комбінаціях були функціонально-з'єднані з сконструйованими білками в цих ДНК- конструкціях. ДНК-конструкції застосовували для трансформації сої з використанням
Адгорасієгійт Кштіасієпв і стандартних способів, відомих в цій галузі техніки. Регенеровані КО трансгенні проростки вирощували в теплиці. Близько через 9 тижнів після трансформації, на стадії 1-2 потрійних листа були ідентифіковані поодинокі КО-трансформанти, і їх обприскували гербіцидом 2,4-О в нормі 0,5Х (0,375 фунта к.е./акр), 2Х (1,5 фунта к.е./акр) або 4Х (3,0 фунта к.е./акр). Близько через 2 тижні після застосування гербіцидів рослини були оцінені за ступенем пошкодження гербіцидом за шкалою від 1 до 3, де 1 - незначне пошкодження або повна відсутність пошкоджень («20 96), 2 хх помірні пошкодження (20-50 905) і З - важкі ушкодження (550 Об). 00119) Рослини сої КО, які містили кожну з конструкцій, продемонстрували стійкість до 2,4-0 з незначними або відсутніми пошкодженнями («2095 пошкоджень), або помірними пошкодженнями (20-50 95). Дані наведені в Таблиці 20. Це вказує на те, що сконструйовані білки
МОМ-НТІ ї МОМ-НТ2 можуть давати стійкість до 2,4-О в рослинах сої.
Таблиця 20 "ранофор" Трансфор- Трансфор- Трансфор- . манти з пошко-|манти з пошко-Іманти з пошко-
Білок ТПХ |норма 2,4-О| одиничною копією дженнями дженнями дженнями трансгена «20 95 20-50 96 »50 95 омом-Ннт Немає! 05Х | 130 | 120 | 70 | 0 омоМм-Ннт|НемаєЇ! 2Х 36 | 6 | 3 !/! 0 омоМНнтІЇ Так | 2Х | 136 | л0ї | 3 | 0 омом-Ннта|Немає! 05Х | 22 2 Щ | 3 | 719 !/ 0 омомНнт)! так | 4х | "1 ЇЇ 5 | 6 ! 0 00120) Додаткові п'ять сконструйованих білків, оптимізованих для розщеплення 2,4-О потім були відібрані для аналізу в трансгенній сої. Для експресії МОМ-НТІ1З (5ЕО ІЮ МО 47), МОМ-
НТІ4 (З5ЕО ІЮ МО:48), МОМ-НТ15 (5ЕО 10 МО:49), МОМ-НТ17 (ЗЕО ІО МО:51) і МОМ-НТ18 (ЗЕО
ІЮ МО:52) були створені ДНК-конструкції, з кодонами, оптимізованими для експресії в дводольних. Функціонально-з'єднані елементи експресії (промотор, лідер, інтрон, ТПХ і З'ОТК) були ідентичні у всіх конструкціях. Зразки листків були взяті з паростків КО, і рослини з одиночної копією трансгена були ідентифіковані із застосуванням ПЛР-аналізу. Коли рослини
КО з одиничною копією трансгена мали близько 2-3 потрійних листа, їх обробляли або 1,5 фунта к.е./акр (2 Х), або 3,0 фунта к.е./акр (4Х) 2,4-Д. Через сім днів після нанесення гербіциду, рослини оцінювали за пошкодженнями гербіцидом в залежності від відсоткової площі рослини, яка показала ушкодження, як зазначено вище.
ІЇ0О0121| При нормі нанесення 2Х, рослини сої, які містили будь-який з шести варіантів МОМ-
НТ (МОМ-НТІ, МОМ-НТ1З3, МОМ-НТІ14, МОМ-НТІ15, МОМ-НТ17 ї МОМ-НТ18) продемонстрували відмінну стійкість до обробки 2,4-О, про що свідчать всі, крім двох, рослини з єдиною копією трансгена, що мають оцінку пошкоджень менше 20 905; ці два трансформанти (один з МОМ-НТ13, і один з МОМ-НТ18) мали оцінку пошкоджень 20-30 о. При 4Х нормі, з одинадцяти рослин з єдиною копією трансгена, які містили МОМ-НТІ, у п'яти рослин оцінка ушкоджень склала «20 95, а у шести рослин оцінка ушкоджень склала 20-50 96. З одинадцяти рослин з єдиною копією трансгена, які містили МОМ-НТ13, десять рослин мали оцінку пошкоджень «20 95 і одна рослина мали оцінку пошкоджень 20-50 956. З восьми рослин з єдиною копією трансгена, які містили
МОМ-НТІ1Т4, шість рослин мали оцінку пошкоджень «2095, одна рослина мала оцінку пошкоджень 20-50 95, і одна рослина мала оцінку пошкоджень 250 95. З семи рослин з єдиною копією трансгена, які містили МОМ-НТІ15, п'ять рослин мали оцінку пошкоджень «20 95, одна рослина мала оцінку пошкоджень 20-50 90, і одна рослина мали оцінку пошкоджень 250 90. З одинадцяти рослин з єдиною копією трансгена, які містили МОМ-НТ17, всі одинадцять мали оцінку пошкоджень «20 95. З дванадцяти рослин з єдиною копією трансгена, які містили МОМ-
НТТІ8, дев'ять рослин мали оцінку пошкоджень «20 95 і три рослини мали оцінку пошкоджень 20- 50 95. Ці результати показують, що рослини сої, які містять МОМ-НТІ (5ЕО 10 МО:14), МОМ-
НТІЗ (ЗЕО ІЮ МО: 47), МОМ-НТ14 (5ЕО 10 МО:48), МОМ-НТІ15 (5ЕО І МО:49), МОМ-НТ17 (5ЗЕО
ІО МО: 51), або МОМ-НТ18 (ЗЕО ІО МО:52) мають стійкість до 2,4-О при нормі обробки 4Х. Крім того, це демонструє, що рослини сої, які містять МОМ-НТ1З (5ЕО ІО МО 47), МОМ-НТ14 (5ЕО ІЮ
МО: 48), МОМ-НТ15 (ЗЕО ІЮ МО:49), МОМ-НТ17 (5ЕО ІЮО МО:51), або МОМ-НТ18 (ЗЕО І МО:52)
Зо мають поліпшену стійкість до 2,4-О при нормі застосування 4Х в порівнянні з МОМ-НТІ1 (ЗЕО ІЮ
МО:14). Виходячи з відсотка рослин з єдиною копією трансгена, з оцінкою ушкоджень менше 20 95, рослини сої, які містять або МОМ-НТІ13, або МОМ-НТ17, мають кращу стійкість до 2,4-0, що застосовується в 4Х нормі, в порівнянні з рослинами сої, які містять МОМ-НТІ, МОМ-НТ14,
МОМ-НТІ15 або МОМ-НТІ18. Див. Таблицю 21.
Таблиця 21
Трансфор- | Трансфор- | Трансфор- | Трансфор- манти з манти з манти з манти з
МОМ-НТ ЗЕО ІО МО | норма 2,4-О0 | одиничною пошко- пошко- пошко- копією дженнями дженнями дженнями трансгена «20 Фо 20-50 Фо »50 9о омоМмНнТ 147 | 2х | 712 | 712 | - | - омоМ-нтІЗ 47 | 2х | 13 | 712 | 1 її - омоМ-нтЯя 48 | 2 | 9 | 9 ЇЇ - |! - омоМм-нт) 49 | 2 | 5 | 5 | - |! - омМОоМ-НнтІЙ | 51 | 2х | 712 | 712 | - | - омоМнтВ) 52. | 2 | 12 | "мч її 1 її - омомнт 14 | 4 | чп 1 5 1 6 1 - омоМм-нтЗ 47 | 4 | "п | ло Її 1 її - омоМ-нтЯя 48 | 4 | 8 | 6 | 1 |! 1 омоМмнтЙ! 51 | 4 | "чиї - 1 - омом-нтв| 522 | 4 | 712 | 9 | з | -
Приклад 7. Стійкість до синтетичних ауксинів-гербіцидів рлуроксипіру, триклопіру Її МХФО 00122) Визначали стійкість кукурудзи і рослин сої, які містять МОМ-НТІ, до обробки 2,4-0, флуроксипіром, триклопіром і МХФО. Насіння Е1 гібридів кукурудзи трьох унікальних трансформантів, які містили МОМ-НТІ з "А" ТПХ, ї насіння сої К2, було посаджене в горщики.
Насіння гібридної кукурудзи, які містили МКбОЗ х МОМ89034, і ту ж саму соєву зародкову плазму, яка застосовувалася для трансформації рослин, використовували в якості контролю.
Рослини вирощували в теплиці, і для кожної обробки використовували чотири рослини. Рослини обприскували гербіцидом в кліматичній камері, коли рослини були висотою 6-8 дюймів (соя) і 10-12 дюймів (кукурудза), потім переносили в теплицю, запрограмовану для підтримки оптимальних умов росту. 00123) Для сої, використовували норму застосування гербіциду 2Х кожного з наступних компонентів: (1) 2,4-О амін 4 (1680 галонів к.е./гектар) (2) триклопір (840 галонів к.е./гектар,
САКІГОМФ); (3) флуроксипір (840 галонів к.е./гектар, біагапе?Ф); або (4) МХФО (галонів к.е./гектар, 1680). Після застосування триклопіра, флуроксипіра або МХФО, основною симптоматикою на сої був важкий некроз і епінастія. Оцінки візуальних пошкоджень рослин були зроблені для всіх обробок за шкалою оцінки від 0 95 до 100 95, де 0 95 - це рослини, еквівалентні необробленому контролю, і 100 95 - це рослини, які були повністю мертві. Всі оцінки були зроблені через сім днів після обробки. Всі три трансформанти сої МОМ-НТ1 продемонстрували хорошу стійкість до 2,4-О аміну (2,4-0), в середньому з менш ніж 7 96 пошкоджень посівів в порівнянні з контрольною групою, з 90-97 96 пошкодження посівів. Жоден трансформант сої не продемонстрував стійкості до триклопіру або флуроксипіру, при цьому оцінки пошкоджень у всіх трьох випадках в середньому становили 81-97 Фо посівів в порівнянні з контрольною групою, з 91 96 пошкоджень посівів. Один з трьох трансформантів сої продемонстрував низький рівень стійкості до МФХУ із середньою оцінкою ушкоджень 72 95, тоді як два інших трансформанти мали пошкодження посівів - 90 95 в порівнянні з контрольною групою з 90 96 пошкоджень. Див.
Таблицю 22.
Таблиця 22 2Х норма к.е./ гектар) |Трансформант 1|Трансформант 2|Трансформант З й 1 |2абамін| 71680 45 | 65 | 53 | 900 2 | триклопр | 840. | 813 | 900 2 щ | 900 | 9 4 | мхФо | л680 | 900 2 2 щ| 900 2 | 725 | 900 (5 | Контролі | 0 | 00 | 00 | 00 | 00
І00124| Для кукурудзи, використовували норму застосування гербіциду 4Х кожного з наступних компонентів: (1) 2,4-О амін 4 (3360 галонів к.е./гектар) (2) триклопір (1680 галонів к.е./гектар, САКГОМФ); (3) флуроксипір (1680 галонів к.е./гектар, Зіагапе?Ф); або (4) МХФО (галонів к.е./гектар, 3360). Після обробки кукурудзи триклопіром, флуроксипіром або МХФО, основною симптоматикою було вилягання. Всіх три трансформанти кукурудзи МОМ-НТІ1 показали хорошу стійкість до 2,4-О аміну (2,4-0), в середньому з менш ніж 15 95 пошкоджень
Зо посівів в порівнянні з контрольною групою, з 43 906 пошкоджень посівів. Три трансформанти кукурудзи МОМ-НТІ, швидше за все, демонструють деяку низьку стійкість до триклопіру з ушкодженнями посівів в середньому рівними 26-37 905 в порівнянні з контрольною групою, з 47 90 пошкоджень посівів. Три трансформанти кукурудзи МОМ-НТІ, швидше за все, демонструють деяку низьку стійкість до рлуроксипіру з ушкодженнями посівів в середньому рівними 20-21 95 в порівнянні з контрольною групою, з 55 о пошкоджень посівів. Два трансформанти кукурудзи
МОМ-НТІ продемонстрували хорошу стійкість до МХФО із середнім пошкодженням посівів рівним менше ніж 6 95 в порівнянні з контрольною групою, з 31 96 пошкоджень посівів. Третій трансформант кукурудзи МОМ-НТІ мав середню оцінку пошкоджень рівну 20 95. Див. Таблицю 23. Ці результати низької стійкості до траклопіру і флуроксипіру, і хорошою стійкості до МХФО узгоджуються з ферментативними даними іп міго з очищеним ферментом МОМ-НТ1.
Зо
Таблиця 23 4Х норма Середнє пошкодження 95 посівів кукурудзи для 4 зразків
Обробки! Геобіци нащо МОМ-НТ1 МОМ-НТ1 МОМ-НТ1
Р роіцид Трансформант | Трансформант | Трансформант | І Н2г44 к.е./гектар) 4 2 З 3360 1680 флуроксипір| 1680
МХФО 3360 | Контволі | 0 | 00 2 | 00 | 00 | оо
ПЕРЕЛІК ЛОСЛІДОВНОСТЕЙ
5130» Мопгато Тесппоову ЦО «1202 ГЕНИ СТІЙКОСТІ ДО ГЕРБІЦИДІВ Ї СПОСОБИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ «0: МОМУЗУВУО «150». 35 52064343 «151» 2414- ЦІВ «БИ» БІ «170» Рагепцв версія 3,5 «з 1 «112 295 «2122» РКТ «13» ЦШучна послідовність ки» каз» Рекомеїманті «00» 1
Мекнів Аа Аізівц бег ро ви бек бів Ага Ре сін Ага Пе Ав 1 5 10 15
Ма! сів Ро ец Тео уві цей Оу Ав бів Не Те Оу Уві Ар 270 25 зо їеи Але Зв Бгто (во Заг Ахр заг Тк Тур Яза сія Не ви Ар Аа 35 40 45 вве Ні ТВе Туг ів Уві Не Тук Рае Ре» бів Аз Не Те ди 50 55 бо сі сій Ніє Не Аз пе бег Ат Аг Рпе Зх го Уа! Ар то Уа 7 75 що
Рта ан ви ух бек Пе бів су Тут Рговів Має бі ММ Ме Ат ве що 95
Ага ЗАВ Ап ЯМ бег Бу Ага ма) Не БУ Аєр Ар тр Ні Те : зо 135 іїю
А«р баг бег РВЕ С ец Акр дів Рго Рез Аз Ар Уві Уа) Ме Аге дів 115 20 175
Не Ар Мат Рто Щі Ні СУ у дою ТНК Оу Рів ви Зак Ме! Туг 130 135 3534
Ті АВ тує Азр Аа вн бек Ар су ен у» бух ви Не без ЗУ ах 150 155 160
Ге деп Уві Мі Ніх Зег діа ТНг Ате Уві РНе Сік бегі ви Тук вів 155 о 175
Ма сів Ако В бив Ре бог Аа Ве ех Уві їуз Ма Ме Ар ма 180 185 190
Аа Акр У Ар Агв бів Тве ма! Ні Рг і ви Уа ма! Тиг Ніро 1935 200 205
Оу бетоіуАгтщіув су івцу тус ма Ази сій Ма тує Сух Сів Ате 210 215 220
Не сію бу Меєбег си Гук ін Зег біч Різ ївецї ву Зег ЕВе Ге 255 230 23 240
Біне АВ НІ Аа Тог бує Рго Сі Не Тв Сук Ага Ма! Атв Тер ув 245 250 255
Кух Азр бів Майіви Уві Тер Ар деп це Сує Тв Ме Ні Туг Ай 250 268 а
Ме Авт Азо Тут Ні Ну Сів Те Агв Пе ем Ні Аг Те Ту Май 275 280 285
ЗУ су Малі Аге Рго Аа Аг аа 255
«2102 2 «211» 906 «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Рекомбінант «4005 2 асан саствісссс ссілсссав сво вавснсагсеисеирві ссарссвсїв 60 ассввсніссінеесиссяв ваїсассвес вісвассідс ксвансскст сарсвасанє 120 ассідназсе завіссісра сесвіесас аспассавв сайтам ісссввЕссяд 180
Есваїсасса асвзасанса саїсвсєсмс авссвясястісенссссві сеаісссвів 940 сесствсїса арадсаїсва зеякінсса карнірсава вагсвссвсвазвссває 300 вазарсекес вівікагїсве раївасіве сасассраса рсансиссіввасвсвося 360 ссвиссЕссв вніватеся сисраїсвас вівсссварс вікесресва сассвві 420 сікавсатвії асассрсвіа гратрорсів гснраїгриссівавеваазсі сзісарсвдя 480
Ццевасеїав (ЕСсасавсис сасесеівів псеВсісЕсСісассавесссанвассяя 50 сесисарса зсассарсвї сазвніваєн насвісрсан аіїрискассрірааассвів БОЮ сасссссіве (Ентрасеса гссреясарсевссясаври сстиасві раассаритс 650 1зНеЕссавсесвіскавие саїнаюсваа аазназався аассксяствавснетв 770
Інесесене свасааааєс везайсассівссисвінсесірраарав ярассадніє 780
СВ ТВВЕ асазсетвтв сасратесасіатвсосаца асвастасся івессадаєс 840 гсроайцтрс аїсясавссас и сирвірисрівсвсосве сисвссаіса їсвссаїсаї 90 сасізв Зоб «210» З «211 888 «за» ДНК «х21532 Цмучна послідовність «й» «233» Рекомбінант «400» З асасвссв а странсссвспнарссар срспсварс всвісресві всарссвсв БО зссвнскінс садесвсра ваїсассряс вина ссіва динанссве Тавсвасіє 120 ассршався зда ісва сисспссвсаспассван пасасп сссаддасан о 180 всасасра згразсарся свісрсстс срсвранрі сере ссавіврвасссавіс 740 ссксцсна аніссисяа знесіасссі вареінсаза саїссесск сеаресюває 300
Ваассевиз ема сивсдайве сасвсдастссавспесісваїняїссті ЗБ ссавсавсся існідаївся дяссвісває вішссвеавсасвесннснаїаснриціс 429 срдіссаі зсасноца свасвсісп іствагрросісаздаваєтсвісвисюва 480 сісавівтев ссасєтвнс дасссріріс Піврегсрсісізісвноснсвнавіане 540 свспсарса зсассіссвт разннісате васвіннсовя вівнавасая дезнасні 500 сасссвсісв свцчасіса состенвісс весна ВЕ асвЕввассаввів 8560 тасисавсказннаркЕ п аіварідар аавновіссв арссвстнсссавосіє 793 псесисаге ссассзарсо срадисассівссвсвіссесввазвав вваїсанехє 780 ствтвівев зсзасвісте сассатвсас асрссаіся аерастатса ввіснавес ВА
СЕНС Не зісесасває ВЕН ивсрЕє Вірараєсів ссовеіва ВЕ «ох 4 «112 793 «2152 РАТ «13» Штучна послідовність «40» «223» Рекомбінані «4002 8
Мей Ніх Ав Аа ви бег лова бег Сіп Аг Рре бів Ага В Аза 1 5 16 15
Ма біп Рг бец Тік бу уз еим СУ діа бів Не Тве Оу Уа Ар о 25 Зо іви Ат ой Рго ви Авр Ахр ват Тит ТЗ Ай бів Не бен Абе дів в 40 45
Ре Ніз Те Тук Сіп Ма! Не тує РН Рго С1у бів Аа Не ТИ? Аби ба вів іп біп Не Аа Не 5ег Аке Аге РНЄ Фу Рго Уа! Авр Рго ай 65 70 75 80
Рго їев Ше Цух зей Пе бів бу Ту Рго бів Мав Мекіе Ат 85 90 05
Дек бім Аа Ахп сі бег Оу Аге Ма! Це біу др Ар Тер Нів Твг 100 305 1
Дер Зег Тг Ре ву Дер Ав Рго Рго Дів із Уа! Уа! Меї Аге Аа 115 27 125
Недарма! Рко бів МНів Біу СІх Азр Ту Оу пев бек Ме Тує цо 135 мо
Тнг Ав Туг Азр Аа Тен бег А5р бу сви ух Гу Гем Не Заг Сіу 145 150 155 160
Гей Азл. Уві Ма! Ніз Зег Аа Твг ге Узі Ре бу Зег Тец Туг віп 165 1У0 175
Аа біт Ахп Аге Аге Рпе бег Акп Ті бе Уа! ув Уа! Ме Абр Уві 180 185 уз
Ар Аа Сіу Ахр Аг Сію Не Уа! Ні Рго ви Ма! ма! Тих Нів Вго 195 200 205 сім 5ег Оу Аг (ух Су ги Туг Уа! Аза Со Уа! Туг Суз біп Ат 710 215 220
Не бі сіу Меї бег Си у бю 5ег ЗШ Ргоіецівц зегРНеіви 225 230 235 240
Ре Аз Ні Аза Ту (ух Рго іш Рне Тнг Сух Дтв Ма! Аг Тгр Ту 245 250 255 уз Азр сп Майї ен Уаї Тер Ар Ахп Се Су ТІ Ме Ні Тут Аа 250 255 270
Че Ап А5р Ту Ні БУ бій Те Дер Пе і еи Ні Аве ТВ Те Уві 275 280 285 су Маг Ате Рго діа Аг 7290 295 «230» 5 «211» 906
«а172 ДНК 813» Штучна послідовність «02 «223» Рекомбінану «00» 5
Вінсатрстр сасівісссссснсесва св варс са ссвовиї ссавссвиЕ 50 ассексвісстівнисисска ваїсаєсввсвирассінсвсванссве срасвасавс 190 зссірнаасе завіссісна срсвосзс асассавв сама сссвяссав 180 всваїсасса зсвазсадса натснестісексокесвсітсрессссне сватсссвін 240 сессвсісв авзисайсна викорасдсса сзррівсвва їваїссиссв свавносвас З00 казансрннс Вівінаїсви (Веівастне сасассваса всаєсмостдеасвсвсся ЗБ сснессиссв вит вяіЕся сясваісвасвівсссванс вірвсвисва сассрени 429 срансаци зсассвсвій іввінсвст і срратрвесіваавзазсі даєерсво: 450
Нразедізе нсасзисвс сесвсяідтя МоБесісрстістассаресссяназосвя 540 свснсавса асассадсві сазрніваєв носвісвасе сеевснассвіваавсовм:й 500 сасесее свнідассса освексанс виссевсваве вссбмасні ваассанвіс 550 тайессзесвсаїсвавни сацтавсвая зааназанся зассрствсьнавстнося 750 тервсесатя свасавзасс вваансасс ішссяорівс всіввазказ вдассаввіс 780 сід воо зсвассівтв сасватесасінвссвца зсваассяєвиссаваєс Яд.
сисанстис зесвсассає веісриінес В(БСвсссвЕ сисессвісв сассаїсаї 300 сасав Ов «2102 6 2112 888 «212» ДНК. «135 Штучна послідовність «Я» «ДИЗ» Рекомбінант «Ох б аждсасвссв Ясівадссснспавссяк свспснавсисаісвссві ксавссвосв 50 зссввсрірсізивсрсез ваїсассевє в рассіяа виизиссвстірасрастсс 120 всспрразся аваїсссва свсспссзсаспассзая нагластсссарвасав 180 нсінісасвра зсравсавса весно сіно нарвііснирссавівеаєссавіс 40 ссвсшена арістаїсва звистасосі равемсвза атсрогю сваввєнавє -З0Ю
Базіссрика вени ве свасане сасесівастссасснес ска 350 ссавдсаисся їсвідатся виссвісрає ВЕвссвваве зскесвесна ізсвявінс 40 сінссагві есастнсма свасвсн и сна ссісварвавсі сабсзрсява 80 сісавівіве сс сіре васссрівіє смвесісис Тссарвис всанавсвня 50 сеспсавса асассіссві рааветсає насрівнаєв свинанасаю ванни 600
А сасесксїсе їсеНасіса сссірвя с риссвіаани ВІСІ асеі ревесавнів ББО тТастисанс вванравев га тревівав павнаріссв зрос сінет сао 0750
Персесасе ссассвансс свавіїсаєс ірсовсвіссвоюнааваа враїсваріє 780 севірівовЕ асазсеєсїр сассятнсає севссвіса аїдасізіса с врісааасс 840 сВваНсНе аісксисвас вес десвес ківадассів ссоввіна 888 «ВМ У е211з 295 «ай» РАТ «313» Штучна послідовність «а» «283» Рекомбінант «ЩО 7
Ме Ні Дів Діаз ви бог вго ей Зег ой Аге Не ов Атв Не Аа 1 5 19 15.
УВІ бій Рго Бей ТАг Оу Май еу у Аа сти Не Твесіу Уа Ар 8 30 іви Атв бід Ргоїен бех Дер бег Таг Тер.Абп бій Пе Гей хр Аа
Ао 45 вне Ніл Тут біт Уа! Не Тут Рве Ро СНУ біо Аа Пе Ті дея що 5 во зів бів Ні Не Ав Не бег Ага Аге Ре Су Роз Уві Ар Рто Уві 7 75 за
Ргбіенівв і ує заг Не бів Оу Тує Рг бін Уа СА Ме Не Аг 85 ча 95
Ага і Аа Дяп Спо Зег Сіу Ага Уві Це у Ар АБО Тв Ні Зет що 105 110
Дер'явг Тік Ре їви Авр Ав Роз го Аа Дів Ма! Уві Ма Ага Ав ме 120 125
Не Аєр Маг Рго бій Ні БУ Я Ар Те оіу Ре ев ес Ме Тує 135 135 140
Тв Аа Туг А5р Дів Те 5ег хв у ви ух Куз Мен Ме бег слу 145 150 155 150
Тео Ап Ма! Уаі Ні зег Ав ТВг Аге Уві! РНеніу 5ех Ме Тут бій 165 МО 175
АВ іп Авп Аг Аг ве Зег Ап Те Зег зі тує Уа ме Ахр уд 380 185 то
Дер Аа ЗУ Ар Аге бів Тпг Маі Ні Рую во Узі Маг тве Ні Ро 155 200 295 "біу ек Су Аге ух Бім ви Тук уві Ази ія Уа Туг Суз бій А 230 215 2
Пе сів СВ Мегзег і ух Бі зей Рі івм ер жек ве Св 325. 30 55 743
Ре Аа Ніх Аа ТП іув го ім рве Те Су Ага Уа! Ав Тер вух 545 що 255 мух Авр бій узі ви уві Тр д5о Ап гей Суз Те Ме НІ: Туг лів 2650 255 270
Пе да йхр Туг НЕ У сів Тве дер Пе без Мів Аг ТАг Тв Уві 275 280 285
ОІЖ Оу Маг Ате Рго Аіз Дтв 298 295 «2105 8 ейії» 06 сві» ДНЕ «213» Штучна послідовність
«0» ка23» Рекомбінант ка» 8 відсаівств сасідісссс ссмМ'сссаи сесія нерсвсвіснснрі ссавсевсія 60 ассвисрісстврисиссва датассевсвісвассис вена садедасяюс 1920 зсседазсв заасстова сис ссвсасцвосари сага тоссвнесав 1850 рсдаєсасса асрзасврса саісростс авескрсвсі свв ссосрі сяаієссюв 40 ссссірсїса аравсвісна зЕеЕтаісса карні нсана вагсвссясваарєсаасє 300 рзазрсинис віра сеВ ви трасіви сасавсваса ксассмісстявасвсасся БО севрссвссе реградся сиснаєрваесвінсссварс агрисвдсва сассв 0 490
СІЙЗВсЯЇКі «сассвсвій КатвсвсіВ свв е сс івеанзаасі нагсзисвви 80
Невасеізи ідсасвисвссасясвірів сере сісесісіассанвсссараяссви ЗО сесисарсз асзссансв саареіане васвісвасе сеевснасснівааассвів 600 сасосссіри ввівасоса СссвЕесавс писсрсааря носівізсрі разссаквіє ББО хапросавсясиісварви сеідавнсеза взарзазвси засерорствронсцести 720 тНесисаіх срасазазсс ввазісасстрссворівє ЕсЕнсараз рвассаниіс 780 сідвістрре асавсствдів сасратрсас тагрссана асрасіасса врЕєсаваєс Я
СЕС стрє вісвсассас ВВС ес кішсроосве средосвіса їсвссяйєсяє 900 сасізе 906 «2105 9 «21 295. «фі» РАТ «2132 Штучна послідовність «220» «З33» Рекомбінантї «005 5 мМекнів Аа ліз ев бек Рів бе бій Аге пе Ом Аге Це Ав 1 5 10 15
Уа бів го їею ТНеОУ Ма рез СУ Аа Со ів ТВ СУ УГА 70 25 30 ен Ат бій Різ їв бер Азробех ТВг Тероави Сів Пе іеца5о Аа ча 45
Вне Ніє тнє Туг бій Ма! Не Туг Не Рго біу бів Дів Пе тат Аби во 55 БО
Со о Нів Пе Аа Не бег Абе Ате РНе Я Рто Уві Ар го Ма! 70 75 80
Рга з етец ух Чек Пе Вій Бу Туг Ро бін Уаі біп Ме йе Аг: 85 90 95
Аг біш діа Аєп сів бег Су Ат Ма! ец СПУ Ахр.дер Тер. Нів Те що 105 це
Ар Хег Те Рне їеи дер дів Рго Рго Аа діа Уа Маї Месдге лів 115 1:20 125
Не Ар Маг Рго бів Ні Су бу Ар Тпг ОХ Ре сви ес Ме Туг 130 135 1430
Те Аа ТугАвр Ав Се бег Ар у Сец ух ув те Пе бе Сбіу 145 150 155 160
Гец Аби Ма Маї Ніє Зак Дів Те Ага Уві Рае Сіу зег ач Тук ій 65 178 175
Ав бій Авт Авх Ав Ре бег Ав ТІ 5ег Ма! уз Уві Меє Дер Ма! 180 185 ї5о
Аа Азрв Су Авр.Атв Біо Тк Уві Ні Рто ви Уві Узі Те НЕ ге 195 200 205 бі бек Біу Апе у Оу Сем Туг Ма! Доп бів Узі Тує Сух Сіп Ат 210 215. 290
Не бін ЗУ Меї баг Со ух си бЗет ОЇ Рго бец ви бег Ре 1еу 235 230 235 9240
Ре Ав НВ. Аа ТР Туз Рго Сію Ре Тег Суб Аге МУаї Агв Тер ух 245 250 755
Ку Авр сій Маї Ма! Маї Тур Азр Аза ви Су Ті Ме Ні Тук Аа 260 265 270
Не Авп Ар Тут Ніє Сіу Зп Твк Аге Це Те Ні Аге Те Тег Ма! 275 280 85 віх ау МагАгке Рго Ада Ав 290 295 «2102 10 «72112 905 «2122 ДНК «2132 Штучна послідовність «230» «223» Рекомбінант «8002 10 асдсаївсів сасівієссс ссісісссав сист рарсвсаісесврі ссавссвсія 80 ассинсвісс вевовссва каісассрес вісвассівс всранссисі срасвасадс 120 ж еразсназяісстоваснсвиссасаспассардісастаніїсссдвосви 180
Всезісяоса зсказсаися сеТсвосне адссвЕсвст тсвЕссссві сраіссов 40 сссстдес арарсвісна зрвитаїсса варотнсара гдаїссвсгр свазессввє 300
Кавансевис ВІВІЕСтвне натнастве сасассваса всасотест красвсаєсв 360 сорвосснссв сЕетваїнся свсиатсває шінсссвадс зівисянсва сассрвИМ 420 єінавсаївтасассевсвіатватсиств сревіркссівазназисьвесзвсвви 80
Мозасшав всасаисяссиснсвівів Псярсісвсістассанрсссавааєсив Я сЕсисарся асзссарсв сзавстраї хаснісвсие вінрсрассріразассвтв БОЮ кассоссіве їврінассса госвовсавс виссовсазви востніасві доаассанвіс БО занессавсвсаісрзнне саідарсраз ааздаварсв азссвсідес варсномв 720 хи ЕсЕсаф срасавааєс нвазісасстрсснсвівс ис ивавнав внассавитс 780
ВВС Не зсвассівів сасрафнсвсізівссайа асвасассвізвссяваєт 80 срознсве зісвснесас веісввінисвінсвсссви грсвосвіса їсвссаєсяї 900 кадає ще «210» 11 хі» 795 кіс» ВТ «213». Штучна послідовність
«Зй3х Рекомбінант «002 11
МЕеї Нів Аа Ав ївиу Чет Ро ви ее іп Аге Ре сів Аге Не Аа і 5 10 15
Ма! біп Рго беи ТЯ Оу Уа во Су Ав бів Ве ТНг СУ Уа Агр
Кін 25 зо і еши Аг ій Ре ви Ар Авр бек ТА Тго Ав си Пе сви Ар діа 4 45
Рне Ні Те Тут бів Уві Пе тує Ре Рео бу біб Аа Не тн Ази 50 іш бів Ні Не Ав бе бог лев ге ве Су Роз Ма! Авр рго Май 55 70 75 50
Рготевїец ух Бек Не бів Сіу Туб ра бін Уві біл Мей Пе Аге 85 ав З5
Агр.-бів Дів Азп Си бег Оу Агр ма! Пе бу Сім Ах Тер Ні ТЕ 100 105 110
Азр зве Тв РНе ів Ар Аа рив йто Ав Аа Уві Узі Меї Тут Аа ії 120 ТЗ
Це ОВ ве Рго Рго Тут Оу у дер Тк ву Рае Твг Заг Мектує
О 135 140
Тік Ав Тгр бо ТВг ев 5ег го Тег Ма бів Дів Тк Пе бів 5; 145 150 155. 160 іес Авт узі Ма! ніх Заг Ді ТЕ Ауе Уві Ре сіу баг Сей Ту Зв 165 170 175
Ав сій Ав Аг Аг Не хек Аза Те бех Узі ух Узі Мег Ар Ма їва 185 190
Ар дів БУ Ар Атв и Те Магніх Роз бе магма Твен: Рга 195 200 205 бів Ті біу Аг ув Оу Цеи Тує Ма! Аби бій уві Ту Сує Ов Асе мо 215 220
Не ців Су Ме его і у Со ех Сн Ру ер бе 56 РНе ев 225 230 235 250
РНе Ада Ніх Аа ТНу бух Ро бів РвеТвг Сух Ага Ма! Агте Тр бів 245 250 255
ВН Азо Уа ів У Тв Ар аа ем Сук тв бів НІ тує Дів
ВО зо 70
Уа Рг АщИ Гук Дів у ув вне АХ Туг ви Ве АТ ТУ ТВ У
ОК СНУ УНН Аг Б Вів Аг за 55 «й «из В «її ДНК «їз Цнучна послідовність «Ох кає Рекомбінані «ещК» 15 звівспвсв свідо свссве ве вавс са всввЕссавесвВ ОБО шерЕсвнсіон ис кН ос кра оси снав Ес срасвасвне ЛУ зи иказсв ас а сксвиссвсвснассаре това єн ісссвюсств 380
Водах я зсначеаеса сИМНес Мо знос всво свв ве свНосря косив занос вЕВЕННОСа пава сава как сво м вавносває 300
Кавеавсввес іа наяв сясассввса довести асесвеск ЗБ ссвессвссе Віва Трскзавкаа ай сссссві атвесвасва сасосіій 20 асевесаїді асассвсвія ввардасеств сдсссасса гдсарессає саісназвив 480
Чпразсесавтрсасаксвс сани и свое іассарне ссвнаассви 540: сесйсавса асассарсві сваввінаїр насвісрасв сровсдасск вавассви 500 сасесестви іврівассса (ссвоваасе пресесааре вссівтасві вазссарніс 650
Тамрссавсронсварни сиіварсвая ззадланись авссяствст раясмев 790
СМ всрсацш срасазавссвовасасстівссяснівснсресавва аврснаїіис 780 сіврістнви зсазсстртв сасисарсас агвссвтас ссдасаснсявисвявійс 840 сЕсассіва срсесассас все с вівсесссви сисвосаісв ісассвісаї 900 сасізЕ аб «Оз 13 «115 888 «гі» ДНК «213х Штучна послідовність «йо» «323» Рекомбінант «00» 13 аісасвссв спствзисос вспанссаи сросмсравс всагсессві ясавссвстю 60 весеесніяставесиства раїсассвис ни рассіве кррарссисі їщасдас 120 зсєідязасе анабсісвя єроспссасасцассвзар Ваістаєт сссавяасав 180 ясівісасна зсязасадса сагсвестс едсреарві срерссартррасссавіс 540 сере аністаєсна верста ссст ваврідсаза сваїссрсси сревесвазс За вавієсввра при асо срараасівк сзсастдасі ссасспсстсвясвско ЗБ ссарсавсся світа сессаарнав аїсссвесст асвисевсня сасвсМме 420 ассіссвірі зсасіяспе нранасссп істссрассалтясаздссассаісванева 480 сісазівтве сосасістяс васосвівіс НЕ СТСВС ста сявес всвнанявЕ 5АВ скспсарса асасессві ваарніса?тв каскідеаси ссдранасав вкадасівіс 500 сассевея свнастса сен авасс вЕсскізаве нісівтасве вазссави 660 їасівісакс вази нави аїнаніван зарнаніссв аессвс ст саней 0750
Неовенсася ссассванос свартєассідссвсвіссяствесазда виесвасвіс 780 сірнівівеЕ асвассісія свсссарсасівсвссвівссирасіінссвнеаавис 840 семассва сссвсаєавс яви весно вІдавасств сссеиріва ВВЕ киіїйх їй «аз 755 «Аз РАТ «Кіз» Цітучна послідовність «230»
«223» Рекомбінанї «00» 14
Ме ніх Авіа Ав без ТВ го бео Те Ахо ух Тут Ага Ре Пе Або 1 5 зо 15
Уві біп Рез ве Те Су Маг бевоу Ага Сію Пе Ттлксіу МагАзр за 25 30 іви Агв бій Рез їви АхрАва бек ТВ Бр Ази Б Не їви Дер Аа 38 40) 45 вве Нів Тне Тут бів Маг Не Тук ве Рго біб бій Аа Не Те Аза
БО бів Сів Ні Пе діа пе Зак Аув Аге РНе Су Бгто Уві Азр Рго Уві
Бе о 75 80
Вго Пе Га ух 5еу Не бів у Тугрго бід маг біп Ме Не Аге: 85 чо 95
Аг сів Дів Ази Оу бех 5ег Ага РНе Це С0У хр дяо Тгр Ні ТВе і1ю 105 їі
Дхр бег Тнт Ре гу Авр дів го Рго Аа Дів Уві Узі Меї Аг дія це 35 ї2У
Че бін Марго Сію Туг бі бу Ар ТАг Оу РНе ге Хот Меї Тут 130 135 мо
Бег Аа Тер бів Тег Тву бе Ро Пе Ме сій Аа Те Пе и у
БЮ. 155 160
Геи Ав Уа! Уаї Ні ет Ав ТА» цу Уа! Рпе бі 5егїеи Тут бів 165 173 175
Дів Тег Ав Тгр Аге Ре ет Дхп Пи 5ег Ма! уз Ма! Мех Дер Ма! їі850 185 1950
Авр Ав Су Авр Агр біш Тв Узі НЕ Ро бео Уві Ма Те Ні Рго 195 200. 505 мата Аг Ат Аа ео Ту Суб Або бів Ма ТугСух біл і ух 210 215 229
Не сій сіу Меї Ті Авр Аз Фін бег ув Зегівц ец бій Ре гу 225 230 235 240 тує Вів Ні Аа Те ув ве Азр Ре Тве Суг Агр Ма! Авд Тир їду» зе 50 55 уз Аа сій Ма їви Уа Тер Авр Ап їеч Сух ТП Ме Ні Аге Ада 250 265 27а
Маї Рго Авр Тут Аа Бу цу РНе дв Тук теу Те Ага Те Те Ма 278 280; 285
Аа су Ар ух то бег Аг 295. х10» 15 «йи3ї» 906 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «20» «Й23» Векомбінант «Оз 15 авсасвсве сістраєссс вснассвас зааіассві (саїсрасні їсавссвсїв 60 зосенпгтаввінсіда заїсассяве вп раєсіясніваассестякасваєст 120 зесідниасе вазісстрра сист ссасасстассаве паїсінесссвнвєсавю 180 всваєсасса асизасанса саїснсв с ісісвсвст сені ссвні с васосве 0240 «евамсеса вно агора зрицасссе навіс ва рагсрвіси сяварсваає 300 вааставссвиманве т васвайее сасосснаст ссасспсстреаснсвсся 350 ссарсійсве Мрінацсв нсайрав и ссрраасасирірнсва сассявцмс 420 сірїссаїі ассівсне явавасесід іссосрасса сесанестассацевавві 80) сівався не всасієсие зассзаавів Нсврсавссіргассависаассваєтщя 540 свспсвиса ясаб ав дяаавіва вза серисваїсвіравасітв 6500 сасссрстевівигааста сссвимассвесснісвія систе савссовеіа БО: тайносава азайсвзреє сашасткає нсанавісна зас ссавіств 750 таїдавсаєв ссаставан ідантасх свід ви ввваава вваїсаврів 780 сіні неЕ ВізаЇсівів гасне Сас сисесовіассрайарссвесяавій 840 сесіаїбва сесрсасвас артсрсдено дасааассті сісвссаїса ссвісаїсаї 300 сачав 906 кі» 15 «ії» 888. «217» ДНК «Еі3» ЦШітузна поспідовніств ка кій32 Векомфінант «Оз 16 відсесвсве сесікастостістсассазсаавін сис пава нсавссвстюв БО асарвснісс сирів сздавойасанисківна іс риезиссісісваівасанс 120 зспрезаєявнаїссікоз сессбісасассійєсазнікзісіасй іссреивісза 380
Есаїсасіа всравсвисв саїсвсенс гсссвссеет сви сосіві дев свЕіН 240 соні аа арарівісвя квесіаісса ваветрсава вм асрисв сварвскаас 300 канавсякссивисасве аваасви сасасова с ссасспсствнасвсіссв 350 ссівссЕсов днів їнав зистаїсваз ревесннані вівканніва сасавясцє 490 скіссабфігасаневссв явавасасістсросівсна всаанствс саїсвавввс НО
Наазсрірвссасісвис васнаценіс сверісас івсівссавеснаставмнне 540 сяспсісва асассався! ванавіває дасвіввася ссреаваїав ададасівя БОЮ сасесассв вівасвса сссівмнасе дразвисися сасєеасів савссавнів 560 засірссара зраїссярео авівзсевасесенавісва зріст само 720
Тасезвсаєв ссаєсааий сваспсасс рев ісвЕінвазнва ввассавяіє 80 сівдівІвне асвассірів сассаідсає сисвосвісс садасіасвсірврааайс 830 звагассіва сссесассас свіжрсвкиа васаздесві сЕсЕМеа яв «30» 17 «11» 88 «ій» ДНК 13» Шзучна послідовність «0» «223» Рекомбінант
«щюх 17 відсзєдсяи снідзсасс п рассеанс заніаіснвіісаівасвіїсазссасіс ВО асавеситвсісевсисава вайзссвна віниассіва дивадссст арасвасісс 120 воеіниаасе арзихісва сиосійісас вссівссвав йаісасн ісстррасяав 150 нсявісассз зсварсеввса гасвосснсісваневеикісврассивканаірсаві 240 ссвансіся заїссамра пив зісе ракрінксарз ірацнарвсв акааиссавс 00 кавіссісає вин смави срасрайри сеасасараса ядсасст ост ідасвсісс 350 сСБЕСіІВССВ БЕН аірся сясаятанає відссеваві асеесвесва ассреймс 420 сівгснви ассідсві: вкадасесісісасєвасва гЕсааросес сайнравкві ЯВО сіавасніви Повсісавстіастаавніс свиаввіс і ассзнисквсвзайся 540 авррвіїсаніа всзссаете! раарвіхаїв рагвірваск с інварасав ранаснив 50) свіссвои си аруїзсаса сссівізаєтввасвсзвав сна савссвзяни 650 тасткссарва акаіссавре авівасіваєї всвиаріста арісссівсі ісавнссює 7280
Таснаасасе ссассаавії скасіісвсі івісеіві с вів явавав ввассварвія 780 сісвінівер вівасстр сассатрсас срарсарізс савасіясрссрваванє 840 сесізістса сссксастає адівнєсрва васзавсста нссусіна 88 «830» 15 «2112 295 ках АТ «аж» Цітучна послідовність «230» «дй3» Рекомійнант «ВО» 18
Ме Ні Дів Аівівц Небо ве Те Абп бук Туг Ага не Це дор 1 5 10 15 чаї сій вро бе тв іх Ма цей (Ну Лів ві Пе лве СПУ Уві Абр «0 о 30 зви ваги бін Ресїви Або Ахо Зеє Ту Тв Ахп Бі Пе їви Азов Ав до 45
Рв Ні ТВЕ Тут Ср маг Не Тук ве В по Бу си Аа Це ТВг Ав во сів бів Ні« По Аа пе багате Аг пе Ох Ро Уа Ар Рго ві йо 7 75 о
Роз іви ев Сус дер Не іш іх Тут Ре ма сій Ме Це Аг 85 За Зх
Аг он Лів Авв бін Заг 5ег Ахр Уві Не Су Ар Авр Тур Ні бег за 155 на
Авр-леє Те не це Азр Аа Рга го дів Ав Ма! Маї Ме Ате Ав 115 що 125
Пе біш Ма! Робін Тує Оу Оу Ар ТВК ОТ Ре їви ет Ме Туг 130 135 140
Зег Аз Ттр На ТВг ви ет Ра Те Мей бій Авіа Те Не з у м 150 155 1650 іек Аза Уа! Уа Ні бек Аа Тиг ух Уві ве бу Бек теми Туг бій 165 179 їх
Дів ТврРАха Тр Ат РН бвг Аза ТНг бе Уві уз Уві Ме Абр Уві 150 185 190
АЮ АВ ОБ Авр Ато І Те уз Ні Рез іви Мага ТВ в: рев 1958 200 205
Маг Те оїу дев Аге Ав ви Туг Су Авп біп маї Ту бух іп їух 2 15 820.
Не бій бу Ме Тпг Ар АВ Си Зегіух заг іви це сій Рнеївео 235 230 з3я 240
Тут бю Ніх Лів Те Сух не Авр. Бе Тне Суз Ага Ма! Аге Тер Ку 245 50 255 ув Азр. бів Ма їв Уві Ттр Ар Авл во Су Ту Мегніє Ате діа
БО 258 2
Аа Рго Дер Тут Дів СПУ Су Ре Аге Тугбец ТРУ Ага Твен У! 275 280 285
Аа віх А5ріух Рго ет ге 295 «105 18 хи1і» З06 «832» ДНК «13» Штучна послідовність «0» «3» Рекомоінанх «Ох ІЗ аідсаснсве ссівассос вп ассавс аваізосд м сатсрасві бсаяссро БО зссряеівн и тавиксіва ааісассвит Еітрасствс відвассвсірвасивои 129 ассфвеВвася зааісстка секс ссасасстассяне Че асесесвевісяк 180 дскаксасса асрзасзиса сагсвсвнс і сісрісесі свиїссвріїрасссряй 240 сере сісз зайсіаска вен асссю ваввисаня Траіссвіся сивавсваас 300 дазіставсс вне еснамвия сасансвасі ссасспсст ввасвсвсся 50 ссавстсав фінанси Ста еаа ЕН сгркнакасвнінесна сассявтмс 420 сдссаії сіє есни виааасоств ссесвасса грсереєтаєсямневавий 380 сідзасвнни нсастосис зассвазнів МерЕсавесівіассзнесавссвасви 540 свсисевса асаставінс вазаніват: ваїрівва в савиоряісн вавасівін БО сасосЕсеЕ евізастса сосни аес десни сеспиаст сазссавита Вб танессара авайсавнви сацасідаЕ всаварісва звісістяст ссавнієд 0770 гаівзрсасв ссасізаай ТВА Осі Гсорівісс ни резназа сваїсзарія 780
СВО ВНЕ агзаїсівів тасичсвсас СеСвосЕсВс стра Наїссвисаваці о сверантва свсесасрас арісЕсЕрЕк дасавнссі сісвесаіса ссаісатсає 900 сайає 906 «Х0» 20 «й43ї» ВВЕ. «2125 ДНК «т132 Штучна послідовність «их «2335 Рекомбінант «Ах 20 айсасисвв проста ісоссває завіс аївзстесанссвсе 60 зсависвіссіснвінсава ванасаресківкаісівснниванссісєснабвасвиє 120 зспеваа звзіссівва свсстосасесстзссвавінаєтасм ісствнісва 180 всівєсаєста асрарсавса саіснсвісісосросвеє свист врассскнів 540 ссвсаднза ававівісна пеестяісса дане всава їзатасввсяи сварисваяає 300 ваварсярсс невіра ве арафасіде сасссваб ссасспсст ввасвоїссю 380 ссиссвосЕ нрав К ЗЕ асвая він ссеваві зіва віва сасарвємМс 420 сітосаїрі всарівотв врзкасасіссвссзсиз інсазрстассвіснаавяс 480
Мзазсвіне їссаспсвяснасязявніс синів ідіассарястасіаайни 540 свемства асассавсит резадінаце насвінвасв снвавастзв вана 90 сасссасіся (сріввсвса Соствігасе визавесвсв сасбтасія свассаєвів ББО тасбссака авабсавив аавасвинсесвнансва ас всвайсс 720 тзсдаксася ссассавани сваснсасетвосввнієс ви твваанза ввмссваріс 780 сІВЕірне зсвассідів Гассаішсас срояссвссссвдастесяствунавайс ВО аврагассп ра сссвсассассвівнсенка расазиссві свсвика ва «310 31 х21ї» ВВ «2і2» ДНК «213ж Штучна послідовність
«Ох «23» Рекомбінант «АЮ аірсасисви ссспасіссввнасравсавиіафесіісанрасрінсвиссвсє 5 аснедідтасісркансова дасаснира інет свснавссвє сваїнас 15) зсаїнсаасваваіссінка сесписсаєс ясМатсзав Кайластп іссадазсва 180
Бесаїсаєсз асварсзаса сакйснсрі тс ісвовісвиі ВЕН сінс нас 040 сорсцссісв арісваїсвя виБИ асо даавЯсава нвісвров сравосіваї 300 карігаєосс відйвісвя ша івалри сасісряаса різсансстскасвсасся 350 ссвЕссвсЗЕ Певне и ВЕС ва Вірссивеі зскетеніКо сасіневИс 420 сівігааєЕєасцтвса нранасссі авіспсаєста сзарсвас свісравррв ВО севасвНеїрсапезистастзавіа Певно ссійагсаврсвасзавствя 540 сЕЕнсавса згзссадівє завиті ЕВа і: ства насви вваваснкіс 600 сВссстони ерісясвов сссавієнса версвісраа сесНнте саісвивів БО ізсціисаиз арайсварн ан вассваїрсвезнісса нисзсн асани 920 ізсрварсаєк ботан сванісвсв сс рірс все вианесвавв СВО сЕНІВЯВ асвасі вір свссазсає сиресансісссвасіасвсвевсвавіс ВЯО сенат спісвсзсазс івісясінва висааесосї ссср я
«ЗО» Зх «91ї1х 295 «В12з РН «13» Штучна послідовність «ай» «ТЗ» Рецомбінант «800 2 «Ме Ніє Аіз Ав це: бек ро їец бог ІМ Аг Не Ов Аге Не Аа 1 5 нев; 15
Уаї бів Рко бе Тк біу Уа дез СУ Ав Си Пе твг Оу Уа Ар 0 25 30 їси Аг а Рте ви Азр хр бБег ТНг тр Аби бів Це бе Ар Аа
БІ 45 вве Ні Тит Тут и Уа ее Тук Ве Рго Су Вій Аа ПЕ ТАРА
Зо 5 о ів бій Ніє Пе із Рне Хех Ате Аге Ре біу го Узі Авр Рг ма! 70 ту 80
Рус бец бен іуєбек Це бів Су Тук Во Зв Уві біп Меї Це Аге 85 90 95
Ат бін Аа Ап сін Зег Су Ате Ма! Не віу Авр-Аєрв Тер Ні ТА 105 цо
Ар бе Тк РИе її ец Ахр Аа Рго Рго Ав Аз Хаї Ма! Ме Тує Дів 115 150 125 мух Сік Майї Рго Рго Тут Оу біу Абр Тогіеи Ре Аа 5ех Ме Тух 130 і35 140
ТАК Ав Тер-Бів Тр Тео бег Рго Тиг Меї сіп Аа Тег Не бів су 145 150 155 160 і еши Ав Уві Ма! Ніб бег Аа Тит Агв Ма! вне бу 5ег Тен Туєейй 165 1 175
Ав бій Авп Агр Аге Ріє Зег Абп Твг бег ма) уз Уві Меє Азр Ма! 180 185 то
Аер Аа бі Ар Аг Св ТНг Уві Ні Рго ви ма! Ма! Те Ні Рго 195 200 205 іш те Су Агв бує ФУ бео Туг Уа! дей ОІВ Уа! Туг Су бій Ате 210 715 220
Це біс сіх Меї зек ОН ух Сб бе Сів Рео їжи сен ет РБа ви 225 230 235. 280
РНе АБ Ні: Аа ТАН ух Рго ів вне Те Суб Аг Ма АТ ТО СПА 545 350 255 біц Зіу іп Уві і ец Уві Тгр Ар Авп ів Су Те т НІ: Ре Дів
Б 255 270
Уа го Азр Тут Ав біу ух вне Аг Туг ем ТВ Ате ТВгстве май 7 2ва 285
Оу бу Уа Аг бго Аа Ат 280 295 «2102 73 «йїї» 06 «212х ДНК «2132 Штучна послідовність «ад» «283» Рексмбінант «ДО» 93 аіфсзсровя сНлрнроссвемнавссав снійсизас ніаісвсявіїсавссясв 60 асистанс іва заїсассврі вн язссівсвідавссдсіняаснасня 90 зсствразск заніссіврасрсннссає вссіассзки вісасИпи сссввийсар 180 коваїсасса асовасанся сатсрсв мс СЕС тсрвіссяштрасссвнЙ 0 тоесівстси вагтаїсва авемасссе разріїсава ваїссрісв сезаесвває 300 кваізсівнє ЕН абре п тасвасіде сасассвасі стассмеседевсвевесв ЗБ ссарсіясзв Мріваїрія систазавав втрссносагасрицесна сасссвис 0 920 ясвіссатві зсеоссеств квавасосів сссснясса с всавнсіассайразаві 480 сідзасе не всасісснсавсісвів и Нересісссіізссадевсасаравссві 540 сесисавса ясасізаєвтвазвіва в вана тв сервиса ваності 600 сасссвсіви шріаасіса сссревааст десеюазар ссср сзассарція 860 тапессарс іа давви сатваріран зааравісвк врссяствст сісаііє О790 ун Есасаєв ссайзнасс аванс насі інссвівіссянкесязнаневносярвнія 780 свіаТве мав гасвсавсас псрссвіассіванаессвесзаві 8 сясатшвка сесесасває авісреєрев віссвосств сосдесяса ссаїсассяй 00 сао ов «ах 24 «вії» ВЯВ «123» ДНК «13 Штучна послідовність «220»
«233» рРекомбінант «дод» а вівсасесня сссгвістостстресссав сво псренсясасвсреї ссарссвса БО асевеінісс ЕЕисесвца ааісассвва вп даїстрадарарссміврасвасавє 120 ассідсааси здаісстсва вссмірасасагассвар Чассасі їсссрессва 180 кссаєсасва зсравсався сабсвсви т авссеваня ПевсссввЕ щаїссевй. 40 «есісвсИа авісвайра кеЕйассса ваветвсава (Баіссвосв сравессває 300 каатеннс есатаря сезсранее сатасиваса дсзсспіст срасрсїсст ЗО «свиссисан свіввіріа сесваарцає Вівссвост асвесрЕсваїасссяме 4 жсвісрафї асасвесстя врарасистс авсесиасса Тисванссасвабававввї 80 «взвівіви ссасіссвс насисвені; Мсррнарссісзссареснсававсара 540 севисісва асасассаді сааритраєв паски аін ссрвакаісвівазасем 6500 сасесаснЕ ірнісасссо гссадардаси кявавиавас васінасяі равссаяетя 6БО тасівссаве вас веВ свідіссває зарваравіюв авссанцествавсиста 0720
Певсисасе саасізавсссвавіїсаси івссесвісстасвисвава вряссаавії 780 серістнне аізасирід сасасадсає МсвсрвИс ссрайасяссввааавіс 840 сЕсіВістса сасесассас Ивевавис БИСВТСССЕ сЕсеВтва ва
«10 25 «її» 295 «йі2» РЕ «233» Штучна вослідовність «Й» «283» Веномбінант «4005 75
Ме Ніх Аа Дів ви ТВ Рез тав ТпгАет ух Ту? Дек Ріе Не ло ї 5 10 15 уві дій Рез сер ТНгОЇУ Уайен ім Ага Сію Не Тнг СУ Маї Абр ій Ага Су Рго цец Авр Авр бег ТА Ттр Ав бін Пе їеи Ахр Ав до «5
РНе Ні ТЕ Туг За Ма Не тує Аве го Бе Ав Пе Ве Аби 5о Б во бішобів Ні Не діз Рне бе ати Ат ре ЗУ Рго Уа Ахр Рго Ма! 70 5 во
Рго бец ви ух 5ег Пе і БУ тує Рго сі Уа бій ме Не АгеЕ 85 0 5
Аге ів дів Аби Сі ет ТУ Аве Май Пе ну кр Адр Тер Ні ТВг 100 05 о
Дер зеє Тит пе ги Дер-Ава Рго Рго Аа Аа Уві Уаї Мей Тук Дів 115 120 125
Ав іш Уа Ро го Тук ЗК Оу Ар ТИР Оу Рне ви баг Ме Туг 130 135 130
Тве Ав тва ТВг ів бег бро Те Мессі Аа Тк Це 09 у 135 155 155 150 іви Аєп уві Ма! Ні ет Аа ТВ Ато Уа не бі Бегіви Тух Сів 1655 мо т
Ав бів Ази Аге Ага Туг Зег Авп Тнг бег Узі ух Уа! Меє Або Ма! 180 185 190
Ахр Аа су Азр Аге Сів ТНе Узі Ні буочен узі Уві бег Ні го 155 200 205
Маї тн сте Ас Ат Аз Тео тук Сує Аа бів Уаї Туг Суб оп Аге 310 215 220
Не біб Сіу Меє Тая Ар Аа Сів бегіує баг ви се ба Рреїеи ей. 230 5 24
Тут 9ію Ні Ав ТА бух "Не Ар Ре. Ти Сує Ага Ма! Ат Тер Гу 245 250 7255 ух Аби Сі Уві Кеш ма тр зі Ап ец Сух її Мек нів Аге діа 80 255 27
Марго Ар Туг Аа Оу Гук Ре те Тук йо Твг Ате Те Не Ма! 275 280 З85
Аза біу Ахр Бух Рго баг АтЕ 290 295 «Зх 56 «112 906 «125 ДНК «213» Штучна послідовність ках «232 Ренамбнант «005 26 абксасисев сієїрасссе дсНяссвас азагассні ісяісвасніїсаросвств БО асервівни таввівстна звісассви! ДИ дасстяс вівзассвстрнасвастст 120 астферзасе ванославасвсиссасассассанн паці сссвввіва 180 всЕВієзсса зсраасавсв саісвср ис (сВЕСеСТ Тсишіссвн гвасссвЕИ 240 ссвсвесз ааїсізісна зрецасесв взавісара расссвісв снавискаає 300 разісвис вір нчанре васвацюе сасассваст ссассисетявасвсвсся 350 ссавствсан Мріраєвга сестовінаа вісссвссет асреієнсна сассвиіс 420 сіртосаїнї асассрсйв реаваєсстр (ссссрасся исаресіассайеаанні 480 сідаасв не тисасієскс аассовівте Мсвисавосідассарвсасавазосяї 540 сесіасарса асаставів! рааавівате васвієнасе савесваєсе вевасівів 600 сассевствн рвіаістса сссирстаєс весовтеріе сествтастр савесарвта БО бТайвссзвснізнрання саїнасіраї нсзравісаа аз(стствєєссаацієш 720
Татеавсасе ссастазан трас касі ессвтвіссяесазаза еваїсвавія 780
СЕЕТаТЕеЕ атазаісівія (есвацсассисносвіассіванацссянсавації 840 сесайра сесрсесвасавісисивве асазасст стсрссаєса ссаїсаїсяї /-900 сасав 906 «Ж» 27 «и» 888 «219» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «8232. Рекомбінант
«400» 27 вірсаєвств скствасієє асісасааає авртассвие єсвєсваснє нсавссвств а зссерсвіст вені всева ваїсассвис кіднаспесярварссвсі враірасанс 120 асиеезасе зевісстра вон ссасастассзарі'дацацієссяриссав 80 десачасва аскансарся сайсрсвс арісввавнє свист ввасссвий 240 ссествсва зеавізісва вивсіассси нзаціасава рансвсся свзарсвває 300 вавісснеяс вавівасри сера сасасоваса всасямссі сваснсвсся 350 сс КСсВсіВ снів авіа сесасярває нідссасссі асенсвнане гасяввацс 420
Спссватвї асасврсаєв вварасасіє Істбсвасса ідсварсяас ааварявс 480
Нразсвідв шсасіссвс сасваиввіє Порясавсс ісіассвареєсараассяє 540 сквтасесса асаставсве вазавідате васвівдає секвсвассв враваєстій 600 сатоснтар Чябварсса сесеБІвасЕ нессвасвих сисівіас я сзассзняїс 850 тайдосарс всаїсвярере садассває ксрввнісвз заніс ссзацеки 720 тасвадсаск ссасваави сраспсасстівссевк нс естввазнаа кваїсаавтв 780 савнецве асавсскте сасіатесвс арвисвс свиастаівствосававіс 840 синассіта сссурнассас ГВтвЕсЕКес васавессва нсавава 888 «Ж» 98 «91ї» 295
«91223 КТ «213» Цітучна послідовність «ах «43» Рекомбінант «ах 38 ек нів діа Аа їх ТвЕ бло о Те деп іує Буг Атв РМ Це Дер 1 5 30 15 ма бій Ріхіви Тне іх айви бу Ав Си Пе Тв Іу Маг Авр 75 за
Гечу Ати Зо бто цес Дер. Аєр зе ТНг Тр. Ап ОЇ Це ей Ар Аз
Рне Ні ТАг Тук бів Ма! Не Тук РНе Рго пу бій Аз Не Тит Абе що 55 50 сів о Ні Це Аа Рне бег Аг Аге РНе Су Рго Ма! Ахр Рго Ма! 70 75 во
Рта їв гені укбеє Не бід Оу Тує Ро ЗБЕ Уа Меєйе Аг; 85 чо 95
Ат еіц діа Акп Сів Заг ім Ахв Ма! Пессіу Ар Ахр Тео Ні ТВ 100 05 о
Акрег ТЕРве ден Ар Ав Бгто Ро дів Ав Уаі Ма! Мех Ат Ай 115 120 125
Не ім Маї го бів Туб Бу ЗУ Ар Твг бу Ре во бе Ме Ту 130 135 1450 ег діа Тгр бів Тег бен баг Рго Тит Меєбіп Аїа Тит Це бів Оу 145 150 155 1650
Гец Ап ма Ма! Ніє чек Аа Ту Су Ма! Ре Ох Заг ви Тут бій 165 то 175
Аа Твг Аза Тер Ав Ве 5ег Аз Ге бет Ма іує Узі Меї Авр Уві 150 185 1530 дер Ав Ну Ар Агв Би ТНе Манів Рго ей Узі Маг тиг Ні Рго 195 що 05
Уа тес Аг Ате лізі ву Тут Суз Аби бів Уві Тут Сув бій ув 230 215 220
Не су Ме Тнг Ар діа бід Зегі ух зегівніви іп Рів їви , 225 230 235 740
Тут бін Ніз Аа Тв і у5 Рре Авр Ре Тит Сує Агя Уві Ат Тр ув 245 250. 755 іуз Ар Оп Ма ец а! Тер Ар Ап сем бух ТВг Мех Ніз Аг Аа 250 255 270
Уві Рг Азр Тут діа СХ бух не Ате Тук Цец Так Ате Ти Те Уа ся 280 285
Ав Зх Акр ух Ро бе Лід 290 295 «ЙО» 25. «ії» 906 хід» ДНК «і3» Штучна послідовність «80» кааа» Рекомбінант «00» 79 аішсасисяк сествасссс Вспасєвас завсассві г сасснасніісарссями БО
ВОсЯНК Ні авртвстра авісвссярі ви вассінсвіравосрсі днасвастсі МО ассідезасв авотосірна сВсВйссас асстассави Мастаси сссвевісає 180 кскаїсасса асввасвися саїсрерисе Нисвісист овріссвистрасосрийи 240 севсцесісв авістаєсва пев асссв дзартсара (сагссвся стависяває 300 вазісевісвівнамне т васвайне сасассваст ссассисствваснсясся 350 «савствезае Еге са мсаа в свва т асвиівесва сассвнне 420 сівіссяц ас есне вванасссів їссссрасся гвсавестаєсамеаавнї 480 евасийя нсасіссвс зассававі: Мевисаессівассадеєвассаастви За сесисанса зсаставіву равзніратє асан савриснасесваваєтій 500 сиссснсіве евевасіса сссвимасс Ессвісв ін сина саассарнся 850
Тайресава зазисавве саївасіваєвсадавісва засіскс ссання о
Заїрансасу ссаставай (вана і(вссвідієссвирвазаав яваісвадія 780 сові еє пав вів асватрсассвовссассіванарвссввсазамі 850 «ес айва сисисасвас адіскснвне дасазассу сісрссаїсв ссаїсяєсаї 900 сацає З06 «ах ЗО «а» 888 «ій ДНК «2132 Штучна послідовність «аа» «23» Рекомфінант «00» 30 яевсасесви сесіваєтсє місассває вартезісвсє Несвасві всавосрст 60 асаресяіссісввінсада нацасонис ніна сінс вка Ессісісвавасавс 150 аспрезае арессінна свои сасавлассзавіваі вс іссвввісва 180 всгвісасіз зсварсарса саїсеснистессеросвоі ісЕвосствЕ внасссвоїв СЮ седсяза навісна нрЕстаїсса рарнінсава рабасвиси срянисваас 300 квварсрессдеріваннк аянвасее сасассяві ссасспсстввасрссв ЗО
ССС ою трете Ес Вісказ інссррані тканеві сасовнсйс 520 селссвіві зсанессу нканасасістсвосасва всазисіассаісдзавис НО
Мазасетве ссествис васизавніс сренісаг рбзссарисвасіванне 5
СЕС сіска асассарсьв! павасінанц касетявася ссрраватав дана 500 сасссасіся ісвінасеса есте асе вевависясв сесістаств сазссвевів БО застссава акесссавик засн аслвис вовна вісва ЗЕКссств всавйссМ 720 заскарсася ссассазній срасіїсасс восвиюісс він изарза реассяаніс БО се ВЕе асазествтє ассатнсас сеедесвісс сврастасвстррвавайс 840 знаєзсства сссуєассис сере сврка васазносві СВСКНра Ка «іО» 31 «11» 295 «2195 РАТ «ЯЗ» Шиучна послідовність
«293» Векомбінант «а» 33
Ме: Ні Ага діа Гец бег Ро їв ес сів у Туг Аге РНе Не Ахр і 5 10 15
Уа! бів Ргоїеи Тіт у Уві сен Оу Ав 9 Пе Тнт біх Уа Тег
І 25 Зо
Кей Аге бі Рго ей Ахр Ар Ав Тв тир Ав ою Не ві Абр Ай 35 4а 45 рве Нік ТВ Тук Сип Ма! Не Тут ве Рго Бі Сів Аа Не Те Азп
БО ім ів НК Пе Афа Ре бвт Ага йти епе у го Уа Ар еко Уа 655 70 75 КЗ)
Рго ви еціує бег Не Оіш ОМ Ту Рго Сім Уа біп Меї бе Аге 85 о 95
Ат бін Лія Азо біо бег Су Ап Уа! Це Су Абр Азр Тгр Ні: Те що 105 по
Авр бек Те рве сеч Ар Аа го вто Ав Аа магма! Местує дів 115 156 125
Ате бів Узі Рго-Рго Туг Оу Зіу Азр Те су Ре во бе Має Тут о 135 140
Зег Аз Тео Ар. Так бе бег др Те Ме су Аа Тк Це Яцу Бу 145 о ІЇ55 15)
Геч Азп Маг Уві! Ніз бег Аа Тв Аго Уа! РНе су баг еи Туг бів 165 КЗ) 375
Аа сій Ази Ай АгЕ РПє бек Аа Те Бек уві ув ма Ме Авр Уа! 180 185 190
Азр вій біх Ар Аг бін не Уа Ніз го бе ма! Уа Заг Ні; Ро 195 200 205
Уа твг слу Ага Де Мало туг'Сув Ахп бів аї Ту Сух бів Дтд 230 із 223
Ме сію бу Мет Ар АЇВ іш бег ух бро бе ес бій не Це 225 30. 235 240
Тук бів Ніз АЇв Тв Агр Ре дев РНа Тнг Су Ат Ма Ат Тер ух 245 5 755 ув дер біп а іви Ма! тто Азр деп уви Сух Те Ме Ні Ага Аа 250 255 270
Ма! Рео Ахр Туг діа біу у Ре Ате Туг ем ТНе Агв Тох ТВе Уві 275 280 285
Ав біх Ар ку Рго бег Ат 530 295 «2102 35 «21і» 806 «ай» ДНК «213» Штучна послідовністі «220» «223» Рекомбінант кад» 32 ашсасрсве сплравсссненавссав аазіассвісісаїсвасвіїсанссров 60 ассри(ви і сарнінсіва заєсассняі виасостясвіваассвстврасвасаас 190 востеаасе вавіссірва сесвіїссас ассіаєсави Майстас є сссеннісав 180 веваїсасса аскаасаєса свісрові с ісісвісвсі ісвріссв ірасосеві 240 севсінсіса заїстаєсвра аввітассся взарісвва срассвісв севарсваає 300 важсрністенанцня асрайня сасассвасіссассносівнасесясся 360 ссарсідевв НАСТІ сис аа ви ссессні асврівисня сассовцйс 420 сссВіеаа есе вкасассств сснасасса (бавадстас сяйсаавні ЯВО свасвне всаіссвс васссвівін ісвесяносірізссаресасараассві 80 еестгавса асасіарівї ваяавтває ваїнівнато свиксвассв івана 500 сасссвсіви нота сосни зссвосевіснін сво мас саассаввіа БО тайресавс віз варве саірасіваї ксвнарісва вассаєйтрої ссаайістя (730 ївіравеаси ссасСМИ І ЕНЕЙ сі гессвіві с: ВНоравиаа невісвявіа 780 сірштатенЕ віавіствів засвассас свсвссвівсстванавссявсавані ВО чясамйрасисесасрзс ав всвнри иавсазасти сісрссаца ся 000 сайзЕ БІ «аю 33 «з4і1з 585 «315» ДНК «313» Штучна послідовність «каз «223» Раекомбінант «ах 33 відсвонсся госісістсе ст арссав завіс ісаісвасріссвиосрийє БО все свівсірексисва вагазсврвт нірассства вирарссвс вяасвасаає 120 асйекаася авасмва свсспосасаспасааи Мзіасп ссірнасна 180 вквайаска аідансянса сафскортіс соснові сере ссарі свасссввів 940 ссвстасісв звіссаїсна вярвізсеса вазніссара г рассснісн інавдисваас 300 вакіссвксс виніс (све спасрайее сасассвасі сізсемсстасисяс 300 серессвсвв двісаїніа срсссксван нтЕссіссст асвеонЕсна асвивене 420 сісавізці асісївсайв резсасосіз адорасасса аверссассабнвавні 480 сезасрісвтвсасіскис засзсвадіс псяезісає сассазає зсадаяісяє 540 сис сісва асассісве! тааврірази васрідват; свеиірасав рвазасснй БО саопсіви ввістснса (ссвиМаси нвзсвссвси сел тасів савсеарвів 6560 тасірісаза дрісказея заїдасаваі есрананса вассинастєсавносє 70 іаідазсаср сазсзакві свасисазссівссневіїс нав вааваа вваїсаанія 780 ставі ерЕ зсвассвле сассаіївсас серессвірссрвасаюстіррвазайс 80 свнасства косвсасевзс сеісвсикна васвавссві сваденва 858 хай» За «ам» 295. «212» РТ «3432 Штучна послідовність «йо
«723» Рекомбінант «002 33
Мах Ніх Аа Дів ер ТВ Резівц ТЕ ди ух Тут Аг гне Не дер 1 5 19 15
Узі вів го ву Ту ма во Су АБЗ Не Те Оу Уа! дев 2 25 Зо йеи Аг о го ви Ар Ар Зег Те Тер Ав бе Бе ер Ма 30 45
Рнезе Те тує ія Уа Не Ту Ме Бгто сну бів Аа ВХ ТВе Ас а 55 5 сш и Ні Це Аа Рене бек Атв Атя Ре у Рго Ма Ар Рто Уа йо ув 75 во
Рго ен ев уз Зег Не Бім біж Туг Бгто бів Уві бів Меї Пе Аг; 85 ЗИ З5
АЕС Аа Ази СИ Бек Оу дв Уа) Не СУ Ав Ар Тк Ні Хід що 105 вна
Дер зет Пн вве Гей Ар. Аа Рг их лі Аа Уа уві Ме Аго дз 115 ї2а 5
Це с уві Росі Тук у у АБО ТВе ОВУ Не ей бе Меї Тут 130 135 150 щег Ав То о ВР ви ве Рго ТВ Ме ов Дів Тве Петя Сіу 145 150 їі 150 іви Аза Уа чаї Ніх бах Аа ТВг ух У Ре Су бак еи Тує Вів 155 ІЗ ІВ
Аа Тве Аба Тер Аг РВе бег Ах Тв бег уві Гує Ма Маг Аве ма! ї186 185 150
Авр Ав СУ Азов Агв Вів Те уд НЕ Ре ве уві Уві Те нів ро 195 зо рі
Маг Ті єу Агв Агя Ав ви Туг Суз Або ій Ма! Туг Сук бів і ук ща 215 220
Неасія у Ме тнг лев Аа бів бек ух зегіввівц бів вв ев 225 23 т ве
ТУ? Ні Аа ТК ух Ре Ар Ре Те Сух Ату Уа! Агв Ттр ух 255 ра 255
(ук Ак і Уа Ге маг То Акр Аби ви Сух Те Меї Нів Аг Зее 7 265 а
Марго Аер ук ліз у рух Ре Аг тує ін Ту Ар Р ТВ ма 275 ва 785
Діану Ар ух Рев бве АТ 250 235 «2305 За к2ії» Зб «12» ДНК «213»: Штучна послідовність «вах -айЯх Рекоменану «Нюх 35 вівсзсясер ство ссс яса освас завіса і сасваовіісвессною 50 ассенвіні танвідсіра заїтассвві вира вінавссисі красна 12 амжівнвасв ва ссрва срсвисхвсявнсвие аістасії сссвкрісав 180
Есебакассзаснзасанса саісдскисіісвісвсі совіссвніівеесереи 0350 ссвсвсса заїсівісвз аввйасссв нази свна наніс сваарсваве 300 вазвісіврісвікизнЕх нзсвайсв свсвснвасіссассєстннасвовося ЗО коВБСвсаЕ Пиво всі наз м ссркаві синів касове 20
СЕС ВСТСТБСИ В вряавессів іссесвасса зсув ассанвазвні ЯВО сефавскнвіксасісскс зассаавнія Псерисавсс інізссарисвассваєни 540 сяспсавса зсасторінт нава ва вінва саввсенки карася БЮ сассовстня еВіаасса сосни асснвссвісвін систніасів сазссяввія 650 ти вссара заайсадне саївасіда? рсавравієва затії дс ссванєю 72 івберсаср ссасіваВ Наст твссвіос вва еаісазвта 780 снаги візаві і аспасясгнсарсюас с рананесвесзазні 840 сялайтваснсисвсвасввіствори язсавасст севесаїса ссання Ю санад ОБ «2102 36 «21 885 «в12» ди «813 Цітучна послідовність «ИаОх «Зх Рекомбінант «00» ЗВ аіясасяске сесінастостсвсвссває варіа сві оссрасвсвсавосися 60 зсависвсіснитвсяра ванасависвіврисівсвенавссст сви насярс 170 асист раса свсеМмісвсассівссвавіраісіасн іосввоісва 150 дсїзісиса зсрадсвика сао тоссяссирк сви ссои ризсоссввіЕ 580 «оЕсівіїва зазна їсра Коостатссе акрів сава кв іаскЕск сваряквавс 303 варзисввесверівавн авацесів сасвссрайі сс квас З серссвесн нор аїнзи зВсізіснза віссвваві іно инвіва сасприсіє 420 щеіссвіві всавіностю вивнасасісісрссісря ішсвавсассвсвавнес ЗВО фізазсвівд іссасісвес васваваніс Повені асініассавнс расами 580
ЕС Ясви всеопаневі данавіраін васвівяаси ссярзовізк акаде 600 тзессаски свіраєрса ссівієася везаршсвся сесістасік салосаявів ББО ізспдосвез авасзниК ника сннасковисовіс ка ввів сан Од ізСкважсвск ссассаані срассєвссірссвуніс вів азнев ннассзавій ВИ стввівідЕк асавстиін тассВідсве сесгссвісс сенасізсвс киева зЕжасле сссвсвссвс свя свива нзсазяссні срсни ша яв «а30х 47 «831» 755 «Дій» РАТ кеі3» Штучна гпосвпіданність «ах «аа» Рекомбінант
«00» 37
Мене дія Аа бе ТВ го іец 1 да (ук тує бга РО Че Ар 1 5 10 15
Уа! СВІ Рто ви Тег Оу Майви Оу Дів Сі Не тве Су Уві Азр 28 75 БВ зей Аг б рго Тен Азр Ар бе Тву Тгр Аква Об Не во Ар Ав що 45 вне Ні Так Гук ій Уа Не Тут ВНе вро Су бів Аа Не тв Ав
Кв, 55 Бо
Щи бів Нів Пе Ав Не 5ег Аг Аг Аве Сіу йго Уві Азо вго Уві ка 7о 75 ва
Рез Не без іфух бег Не іо у Ту Рго бін Ма! бій Маг Це ге 85 а 35
АР ОВ Аа Ап бід бек Оу Аго ма! Це Су Авр Ар то НЕ ТВ зва 125 о
Ар бог Тве ВНеїви Азо Аа Рго Рго Дів Аа ма Мазі Ме Аг дів
Мем Уаі Рго бів Туг бік Зіу Ахр Те ОХ РНе ба бег Ме Туг 130 135 КО ее Ав тр оц Те бео бег Рго Тіт Месбіп аа Тік Не сін су 150 155 150
Мей два Узі Уві Нік бех Аа Ту Гуз Уа ее Су багіви Тує іп 1855 170 важ
АВ Те Аза Пр АС Ре За Аа ТП Бех Уа ух Уві Ме Аза а зво 185 з15о
Азр Аа су Авр Абе тю Тиг Уві Ніз Рго їв Ма Уа! ТВе Нів Рго 195 200 ОБ
Уа те ОК Ате Ага Дія се Ту Суб Асп сій Ма! Тут Сук СІЙ Туз 210 215 220
Не бів сі Мет Тв Ар Аа Сім бек ух Бех ей ву і Ре ев
В 23 235 2430
Туг ої Ніх Дів Тве Сух пе Акр.Рве ТагСуз Ате Уві Ате Терїух 245 250 255
Щує Аервій Ма! це ма! Ткр Ар Ав ем Сух Те МекНІіВ Ага баг 260 2658 270
Ма! Рго Ахр Туг Су Ап Аз рве Агя Тугіев ТПУ Аги Те ТЕН Уа яв 250 а діа сіу Абр суб Рго Заг Ат 250 295 «йо» 8 «її» 06 «515» ДНК «яї3» Штучна послідовність «ой «23» Беномеінант «М З звішсасвсряи сетиаосссвемассавс засн ісасвасдіїсавссвсв бо зссевіКИ зді ства авісастирі винассівсвіваассястврасдас 120 асстназсв ава!сттярда срок ссасзсстассевя Паїтастп сссвевісвя 180 ксваїсасса аскаасавса сагснсяйс сорісвсі ісеяніссвнібрасосрві: ЗО севайсіса ааієтаєва зрийасссе язарисадяа аісвісрсязаровває 300 вавсдЕс я пайне касванрве сасаєсваст ссассісі двясвсвсся ЗБО ссавсвсав Нреденсв роста иаа вгссвдааї асевівкова сассвдінс 420 ссср мЕ квасі с соссиВесв рсавосіас сайравврї 480 сфзасене ївсасіссвс яассвавннія Мсврсаросірдассадяснассвасвк 540 сестісарса асасізрів: двзавівати вамтяваїн сарясваісв іванасіів 0500 гасссвсіне с ретазсіта сере асс рисові встав савссаврита БО зайдссада везНисадеи саїдвсіває всанавісва аа ссванеюв 720 івідарсасе ссасіззай іа нмасісшосвівієсонрряазая краісвадії 80 сівжіасгвня візайствтв іасвавсас свсзнорівссіванас ве савівснм: 840 тес іва сесисасває авісвсенее насазавссі ствссвісв ссатовіся? 00 «ай КІ «АВ» 39 «211 Б8Я «212» ДНК «813» Штучна послідовність «ах «223» Рекомбінант «НЕ» За афсзсвсви сествастсс сісаосває вавіаісво Маїснасві сарі 50 асаввсвксс тсувівсаре вамасарнє вівеаісінсвенавосісі скаідасавс 120 зеневазвів аваісствев срестмсасвссіассвав раса іссднвісва 80 кегаїсасів асвавсаесаи свісвсвн с тоссессво ство вивсссвнів ЗО севацназ ававівссва вристаїсся какрінсвва раїаснесв скавверавс /-З00
Бавансвисс киМінаїсне яваснасівя сасассвай ссазссместввасистсся 3650 сстрссвсся Вікар авсаїсняа ківссвеве вірварніряа сасевясне 420 сісссаїві асавівосін квавасасістодесівсна їксванстає сарани 580
Мазасеіве іссасіскес васеварціє Псеенісаг івіассареесвасазняе 540
СЕС СІСва асзссавсві вававіває касеінвасе ссеванатвн анарасівів 500 сасесастсв свіносеса осів масиивавирсиси сасіссаств свассаввія БО тасінссяра араїссавео зайвасвнас вснварісва авісссви саней 790 тасвавсасв ссарсязни сеасисассінссиенісс ввівказиза вдасславіс 780
СЕР е зсаассівіг тассаївсас срсгссвісс сврасіасвв свасвсснис 840. врвізесрасссесассас свівисвниа васвавсові сисрара ва «210» 40 «31їх 595 «2122 РАТ ехі3» Штучна послідовність «90 «223» Рекомбінант «ЗО» да
Ме Ні діа Дів с ец Те го (го Тк Азп ух Тут Агро еле Пе Ар 1 5 10 15
Уа! біп го бец тТнг Оу Маг ви Су Аа бій Не Те ЗУ Уа Ар 20 25 за іей Аг бій Ргоїеи Абр Азр бе вт тр Ахп бід Неїви Ахр Аа 35 40 435
РВе Ні Тв Тут бів Ма іе Тук ЕНе то Аа сік сіл Пе Те Ази 50 55 бо
Сів бій Ніє Це бег Ре бе Ауд Аги рве Оу Рго Уа! Авр Рго Ма! 55 70 75 ко
Ргоіецівнімв ет Це Со су Туг Рго Сів Маг біл Меї Не Аг 85 90 95
Атге біс Аза Ап Ти Зег Бу Ага Не їй СУ Дер Аєр Тр Ні Тг 100 103 зо
Азр бак ТНг РВеїги Ахр Аїв Рго Рго Дів Аіа Уа! Уа! Ме дге діз 115 120 125
Це сів Уві Рго бів Туг Су Су Азр ТВ бу Ре ви хат Меї Туг 135 140
Зет Ада Тир Авр Тит Геу б5ег Ахр ТВ? Ме Гуз Аіа ТНт Пе біо Сіу 145 150 155 160 йви Ап Ма! Уві Ні бег Аа Тит Аг Уві Ре Оу бе ву Тут бів 165 170 175
Аа біп Астпі Тер Аге РНе ет Аха ТВг Баг ма! Був Ма! Меї Авр Ма 180 185 130
Аер Аа Сіу Ар Ав сш Твг Ма! Ні Рго ве Уві Уві 5ег Нів Ро 195 200 205
Ма! Те ОМ Ат дев Ада ви Тук Су Ахп Сіл Уа! Туг Сух Сіп Аге 210 215 а
Не спи Сіу Меї Ті Ар Ав Січ Зег ух Суз ів ви біп Рне Гео 225 230 235 740
Тук Сі Ні Аа Твг Цу5 Ре Ахр Ре Тіт Суз Аге Уа! Ате Тгр Гуз 245 250 255
Гуз Ар біг ча Геи Уа! Тго Ар Ап і ви Сух ТВг Меї Ні Агв Аз 260 265 270
Марго Аве Тут Аа іх ух ЕВе Аг Туг бе) Те Ате ТНК Тв Уві 275 КО 285
Аз Я Ар Агр Рго-АЇВ АТ во 295 «310» 8 «вії 06 «2125 ДиК «213» Штучна послідовність «7205 «ийже Пекомбінант «002 41 ацсасескя сістрасссс ВС ассває вадіассвн ісаісвасві їсавесвк 60 аССЕЕННИМ гарне сіне заісяссвві Вівасствс вівеассвст краса 120 аствназсн зазесека сисвйссає стіна ни Месстасн сссвесксав І8О сакзісвоса зсразсанси айс ее рісВСт іс ссввідасссрнй 240 сові свазніаєва акемасссв ваави сова каіссвісв сваврсваас 300 наасіввісяссвни насканев сосассрастссассбостерогрсвсся ЗО осенсівсав Ненафвсв всі рза виссдеваї асевірасвз сассвениє 420 ссса в адсцемо прасасссія їссезсаєса рааавсівссайваавниі 480 седаасві в сасіссясзасссвівін с існроонесініассаносасоюзаєіни 543 громовисв сосні ні казана кас ива в сависван и вана БО касове ританіса ссскрчассвессвіснія СЕС ти свассвявія БИ занос вена е сита св ксзванісва вн есінсі оса ЯЕ 750 ізівздезси ссзаза иа восрідее в Еназавасваваніа У кідЕСзЦене зіаЗелеів вс аінсассвовосівсс ан: свисваВи МО «ШЕТИКНЕе сосксасває ЗВСнКвнве пассвосст ссснеснієа со 0 санав ЗЕ «и» яз «і» ща хаїйх ДНК «а» Цітуави песни дОоВНість хау» «аа» Режомбінане «НК а аісвсвсев сспвагрес внесок занести все 5
Вимір ея каісчссвнс ВИК вона ків акрею ХО несрвавси вес ве івесосас вс зссвав вам іа сссовеєва 180 сараісвсва аграрссвса сві авізисва тсивісвю совіссввів 26 седсгсов зе ване ре зссся Канева дам свіна ввазноюває З вадісавесс іа сінви сеаснастре сатасввас ссалійсстарасисвссії 350 ссввквосе в ісвірад еВсізниза вівссвнарі зсвесвесно їзсснеаМме 420
Се асіссвосів ниасасисістсарасассаз дазнессвсвасанаввяс 480 свЕвасвнНЕ Всасіссис аасваваніа Нсекяісівіассаовисасввавстви 540 син йсадіа всасварсві дазарісвів васиівеасе стреєвасав рравасівй 600 сасссвикв сви тссса сесівісц врісросвия соспіасін сваєсарвнів 560 асівісансвс ване в саівасевас сідав е аніс ссавнеме 720 їаскансаси скасвазеи свамісаєв івссвекіссвВірдзаравнезссааюів 780 сівнівівки асаасснів сзсреїдсас свевсінісстрвацасвссиваавнійс 840 срнассіса ссзразсває зап росврі касанаєсся срядеана яв «йо» 83 кеїіх 2595 «бі» РЕТ «213» Штучна послідовність «ай» «За» Бекомбінант «щю» 43
Мех Ніз Аз дів бен Ту го Кев ТА Авт ув Тує Дер вве Не Дер 1 5 10 15
Уа бій Рто їв Суб Оу Май цем Ту Аа 510 Не Тл Оу Уа дор. 75 зо
Іеи Атв бі Рго 12 Ахр Абр бет ТНе Тер Ази Сід Не ей Ахр дів
Рне Ні ТАг Туг Сіп Уа Пе Тут Ре Рго Су Сіп Дів Це Те Ап 50 бів біп Ніз Ве Аа Рве 5ег Ате Аге пе Су Рго Уа! Азр Рго Ма 65 7а 25 8
Вгоїеціеніух Заг Не бів бу Тут Рго Сів Уві Сів Має Це Агв 85 о 95
Ате Сів дів Ап су баг Оу АгеЕ Че Ген Сіу Абр Ар Тер Ні Тег 100 105 10
Авр бег Тр РНе ей Азр Аа Ро Рго Аа Аа гі Ма! Меї Ате Аа 115 120 125
Неси Маї Рто біб Тує су бі Абр Тек Оу пе ви 5ег Меї Туг 130 135 140 ває Аа Тер Абр г ез бех Ар Так Мет ух Ада ве Це бів іх 345 152 155 160
Ген Азп Ма! ма! із Заг Дія Ті Ага Ма! Рне Су бег се Тут бій 155 120 ь діа біп Ап Тур Аге РБе бе Ап Тв бег Уві ух Уаі Меї Азр Уа! 150 185 1930 дер Аа бі Ахр Аге бі Те Уві Ні Рго без Уві Узі 5ек Ніз Рго 135 200 205
Уа Тс Су Ав Ате Ліз бе Туг Сух Азп оба Ма! Тує Сух Сбіп Аге 1 215 229
Не сю у Меї Тіт Азр Аа Бій Зег ух Сух Гец Цец бів Ре ге 225 230 235 280
Тут Сів Ні Аів Те Гу Ре Ар Ре ТНе Суз Ага Маї Аге Тр (у5 745 250 255 ух Ар сій Уа еи Ма) Тер Дер Ав гео Су Ту Меї Ніх Ге Айа 250 255 2470
Уаі Рго Ар Туг Аб5р Оу 1у5 Ре Аг Тугіви Ту Агро Те Тв Ма 275 280 285
Аа су Абр ух Рго Баг Ат 795 295 «2310» 44 «211» 906 «212» ДНК «2132 Штучна послідовність «00» «223» Ракомебінант «4002 4 аїдсасясяе сістдасссс всмассааєс заатассді зсабсвасвіїсавссвств 60 тЕснНіН М тадвінсіва ааісассрят видассвсеінзассвсввасврасісї о асстяназся зазіссівуа свсвтссас асстассаня патстасі сссвивісав 189 всваїсасса аскзасавса сатерсв с ісісрісесі гсрвіссрвівасссввМ 240 ссксівсіса ааїсівісна вевйасссе язарісавваїнаїссвіснсивавсвязс З00
Кааісіввіє віаїсстви васвасве сесассваст ссассмссіврвасвевсся 3650 ссаксіясак Нрівраєвси (ВсіанНеаа впіссеиваї зсреівнсва сассввійс 420 свіссаві ас все ввасасоствіссдасасса шававстассаневаадеї 480 сіявасвкр гдсасісєсьс засссрівів Пеевсавссівіассарисасерааєстря 540 сесисанса асастаріві аа ва: вана сарусвассніравасівія 600 сасссестре гррівістса сссивиасс виссрісвін сесівіасів сваєсавніа 660
Ів ассавс візивареи сасвасіраї всарарісаа заїрсосірсіссвзайнстю 720
Таїравсасе ссаставац вай ас свсснівіссемнразаварраїсаавія 780 сІВВІЗІНВе зізаісівія гасваєвсас сіввссюас с твацасрасрисазації Я4О свсізвінмра срсисасває авіснсррве васааасстї сісросаіса ссаісвісвї 300 сацає Об «910» 45 «2115 888 к212» ДНК «2132 Штучна послідовність «220» «223» Рекомбінант «00» 45 аївсасесяя сісїсасасс ксїсасавас зартассвстісацвасві всарссясів 60
ТрІрисВісс евсвсара вагсасврес ВірКагсісс нсраносістнрасвасарс 120 ассекааси зазгссівва ївсніссзсаснассзавівзістзсн ісссрраєва 1380
Ессаєсасіа асвардсавса саісистИсІсасрисрст ісресссері знаїссрвів 240 серстасіса звісавіва арЕсіаіссе ранрірсааа грайсрсся сраанствас ЗО наварсярвс нсаіаствеи срасрасіре свізсівасі ссаост ес сратвстсса 360 ссанссвсев ЕНН Ївсе (Вссаїсяза вИссосрарі агдвівнсва сасрявійс 0 сдісайв: асіссвсне везгасасія страсасва рааристассвіснавявс 480 сівавідісв їссасартвстасесесвін сдрсїсасівтассавесесавааствя 540 завкйсарса асассарірі сзавЕтдаів насе сірванасав двазасівів 500 саїссісце еБістссса гссавіасс веранваває сасістастя савссевей БбО іастрссарс ясаїсвавня сетрассва?ї всвванісна звіріствн асадйсмЕ 720
Часвавсаси срасивави сраспсасе вссвивівс нівнаанаа врассавн 80 «евісвее асазісіств сасватрсас сісрссв нс ссвастасва свосазаєйс 840 задаєзсива сссявасвас арізяснена даїзавссй сескнра 85 «Ці 46 «21ї» 595 «212х РЕТ «2132 Шнучна послідовність «Д80х «2232 Рекомбінант «ВО» 45
Мет нів Ав Аа Ге Тег Рго ец ТВг деп бух Тут Аке Ре Пе Азр 1 5 10 15
Ма! бій ргоїео Ті біу Майїви Су Аа бін Пе Те су Уві Абр 20 25 ЕТ, і ви Аг м бго ем Акр Ар ес ТВ Тер Ап бів Не Гео Ар дів 35 40 45
Аве Ні Ти Туг бій Уаї Не Тк Ре Рго су бів Ав Це Ту Ап
Ба ів бів Ні; Не дів Ре баг АгЕ Аге РНе Оу Рго Уві Ахр го Уа 55 70 75 яо
Рго еїецііув бек Це сів Оу Туберуо Ов Уві сій Ме Пе Ав 85 що 95
Агв Ов Ав Асп біц бат бег Аги Тук Не віх Ар Ар Тер Ні: Аа 100 105 1
Ар Бет Таг Риє Газ Або Аа Рто Рго Аа Аз Уа Уві Ме Аге Ав
М 120 125
Нео Магбго вію Туг бу бу Азр Тек бу Ре їви бег Меї Туг 130 135 140 ет Аа Тр и ТАг р еи бегбго Ту МеСоївй Ада Трх Пе СПО БУ 145 150 155 150
Ї ви деп Маї Уа! Ні ет Дід Туз Ма! ЕБе біу Заг їеи Тук дій 165 170 175
Аа ТР Ази Ттр Аге г пе бег Ази Тпт баг Узі гу Уа! Ме Ар Ма! 180 185 150
Ар Аа Су Ар Аго біо Ті Маї Ні Рео ба магма! ТА Нів бо 195 290 205 ма! Твг Бу Аг Але Аа Тени Тут Суз Ав бів Ма! Тут Суб бій 1у5 210 7із 220
Пе сів бу Мет Тв Азр Аве Си бегіузбегіеціво Сіл Ре їв 225 230 235 240
Тук сін Нів Аіз Тк ух ре Або пе ТАг Сух Ате Уві Атв Тер ух 245 750 255 у Ахр Оп Уа! бе Ма! Тер Азр Ап Се Суз ТВ Меї Ні Аге Аа 655 о
Уа! Рго Азр Тут Дід ОМ ух Не Аге Тут бе ТВ Аєрв ТВ тНг Ма! 275 280 285
Аа бік Ар ух Рго заг Ат 250 25 «2102 47 «й1їх 795 «212» РЕТ «13» Цнучна послідовність «22х «223» Рекамбінант «00» 47 мех Ніз Ав Аа і еи нг буре Те Аби Гуз Туг Атв Ре Пе Ар 1 5 10 15
Уві сій Ргоїеи Тк су Уа і ео бі Аню Це ТВк віу Ма! ер 2 25 30 їей Арк и го без Азр Азов Зег ТВе Тер Асп з Пе ей Абр дів 340 45 вне Ніз Тит Тут Сів Уві Це Туг Не Рго сту іп Аа Пе Твг Абп 5 ва ім ніх Це Аа Ре хег Ат Агя Ре ОВ Рго Мар Азр Рго Уві 70 75 во
Рго Пе ви ух баг Пе бід Бу Ту Рго Но Ма! бів Меє Пе Ат 85 за За
Ате бін Ав Ап од 5ег бе Ате Туг Це су Ар Ахр тр Ні Аа 100 105 110
Або 5ех ТПг Рпеїеи Ар Ав го Рго Ав Ліва Маг ма Меї Атге Дів в 120 125
Не бій Ма Рго сів Тук СІу Су Авр Тве сіу РНе Гео хеє Ме Туг 0 135 140 бег Аїв То Сів ТВе ви 5ег бго Тін Меп Ав тах Не сів біу 155 150 155 150 іевАза мама! Ні 5ег Ав Тв бух Ма! пе БВ 5еківи Тує СТА 165 ПО 175
Ав. ТА Аби Тр Ауе Ре баг Оу Те беу Уві Туз Ма Ме Ар Уві 150 185 що
Ар Аа Су Ар Ага іс Тік Уві НЕ Ру ен Уві Ма! Тв Нії Рг 195 20 205
Узі Твт біу Аг Аге Аа цео Туг Сух деп бій Ма! Туєс Су Сій Гук 210 із га
Пе бій сіу МеєТне Ар Ада Січ бег ув бегіви зви Сів РНв їв 235 ра 335 А тує бім Ніз Аа ТНе біп бе Ар вве Тне Су Агр Уві Ав Тер уз 48 250 255 уз Авр сій майец Ма! Тер Ахр.Абі бе Суз Тег Мені Ате Лів 260 255 270
Уа го Або Тук Ада ЗК уз пе Аге Тук цей ТВ Аге Так Тег Уві 7 ТВО 85
Ав бір Ахріух Рго Зег Ат 290 295 «з102 48 «й» 995. х219т РВТ ж13» Штучна послідовність «Ве: «йй3» Рекомбінант «Ой» 48
Меї Ніх діа Дів цей Те Рез бе Тв Ази у Туг Аге Ніх Пе Ар 1 5 вк 15 щі бій го бе Те у Уві ев Оу Айаоіц Не ТвгОїуУ Ма! Дер за ра КІВ!
Іва Аг бів Ргю ев Авр Азо бег Тв ТВ Аза Об Ме ви Ахр Ав
З 0 45 рве Ні5 ТНг Туг бій Уві Не Туг Рне рго у Вів Аа Не ТВ хв за а ща
Ой бія ніх Пе Аа Ре баг Аге Агя Ре сну го Уві Аврорто Ма!
Ба 70 75 о го Пе бен ух Зах Пе бій ЗМ Тук Рг бів Ма! Фів Мет Це Ат я 90 з5
Адтв бів Аа Аби Со бек Бек Ате Тух Це Біу Аво Абр Тер Ні Діва що 385 це дере ТНг Не їво Ар Дід Рко рго Аз Аа уві уз Ме Ат Ай 115 120 195 песо ма бу о Гук Оу ОБУ Ав ПОБУ не іви ет Ме тує 130 їз 140
Зег Аа Терон Тв во бег го Тв Ма бій Аа Тл Не бів Зх 145 150 155 їва іеиАха ув! Маї Ніх 5ех Аа ТВгіу5 Ма ббе біу бог ви Туг вій 165 пло 175
А тв Ав Тер Аге Ро Бек бух Твг ет Ма уз а має Ар Уві 180 185 190
Авр Аа Бу Ахр Ага Со Тема! Нів Ртолїео Уві Маї Те Ні» Рео 195. о 205 ма! Тег бу АгпеоАге Ав цео Ту Суб Авл Вів Уві Тут Су Бій ух 210 215 220
Не бів у Ме ТВг Ахр Аа сін хе ух Бог рен ву бій не ївн 225 230 235 240
Тук іш ніх дів ТА біля Рпе дер ле ТНК Суз Агр Уві Ага Тер ув 785 з5а 255 (ув Азр.біп Уві їец Уві Тгр Азр Ах без Сух тт Ме Ніє Ага ів 250 2855 370
Ма! Рго дер Туг Аа СТУ ух Рве дер Тук ев ТВедив Тв Тв ма 275 зва 255
Аа Зх Авр уз Рго Бек Аге 230 295 «М» 3 «зії» 295 «2322 РЕТ «213» Штучна послідовність «220» «223» Рекомійнант «4002 45
Меї Нік Аза Дів їси Тк Рго Гец Те Аво уз Тує Аг 5 Не Абр 1 5 КО 15 мага из ів тпсоіх ув ец су Аг о Не ТОМ Уві Ах за ів Ат бій Рез іє Авр Акр бес ТАК Тер Азп сін Не ву Ар Ав бі нів ТТ ту» бій Уві Це Тут ее Рео у Си Ав Це ТРК Ай 5а о
Фю Вій Ніз Не Ав Ре зег Ага АгЕ РВе Су Вго Уві Ар Рто Уві 70 75 о бго Не Бе ув Зак Пе бін Оу Тук Ро бів Уві ов Мегіє Аг 85 50 95
АТО АВ Ап Оу 5ег 5 Аг Туг Пе Оу Або Ар Тер Ні дів 00 195 КУН)
Ар Бе ПЕ Рпетви Азр АВ реко Рг Аа Лів Магуві Мет Ат Ав 115 120 125
Пе бі аї Ро ів тує у Зіу хр Те Ву РВе ви Заг Местуг 139 135 о баг Аа Тр Сі ТАг ви бег Рго Дів Меє біп Лів Те Пе сти Сіу 145 150 155 180 їжу Аєп ча Уа Ні бег Ма Чи бує уві рве іх Зег сез Ту дій 165 І70 75
Аа ТнгАвп гр Ага рве бег Ах ТВ бек Уві ух Ма! Меї Ав Уа! ї80 їд85 190
Ахо Аа Су Аер Ап и Те Уа! Ні: га ев Уві ма! Те Ні Ро 195 200 ов
Уві Тиг Сім Аге Аге Аа ви Тут Суб Ахп.біп Пе Туг Суз бів ух 210 215 220
Не сіп Су Меє ТТН Ар Дів Си 5ет Цує бег Гей ги бів Рпеївио 225 230 235 740
Тукг си Ніз Аа ТВ бій Ре Ахо Ре Ту Сух Ага Уа Аги Тер ух 245 250 255
Ку А5р біп Уві Се Ма! Ттр Ар Ап бен Су Тру Ме Ні Аг Аа
ЗО 255 273
Уа! Ро Ар Тут Аа Оу бує ВНе Аге Туг бец ТВ Аг Тр Ток Ма 275 280 285
Дів біУ Абр уз Рг бог АТ 29а 285 «2102 50 «211» 295 «17 РВТ «2132 Штучна послідовність «20» «2232 Рекомбінант «до» 50
Меї Ніх діа Аіа їви Тит Рго їв Ту деп бух Тут Ар Рів Пе дер 1 5 10 15
Ма! біп Рг С еи Тр Бу Ма ей оіу Аїв ім Пе Те СПУ Ма! Азр 20 25 30
Кеш Аге бін Ре еи Азр Ахо бег ТНг Тгр Аза бів Це ен Азр Аа 35 40 45
РБе ніх Та тує іп ма! Не Тує Ре вто Су бів Аз Це Ту Аа зо Бо сім вів Ні Не Аа пе 5ег Агр Атр Ре Оу Ро Уа! Або Рго Уа 70 75 о
Рго Неси уз 5ег Пе Сім «у Тує Рго Сім маг біп Мет Не Агр 85 до 5
Ат и Аза Азп біо Заг 5ег Аге Тук Пе Бу Ар Ар гр Ні5 діа 100 105 110 дзр5аг Тнг Ре ен Ар Аз Рго Рго діа Ав Уа! Маї Має Аге Ав 115 120 125
Пе бій Уа! Рго сію Тук СНУ Оу Абр Тіт Оу РНе се 5ег Ме Туг 130 5 140
Заг Аа Тер Ттвгіве Заг буо ТВ Ме З Аз ТВг Не Сів Бу 145 150 155 150 іга А5п Уві уві Ніх Зег Айва ТВгіуз Ма! Ре пу дес їец Тук Вів 155 170 75 дів ТИР Ав Тр Ате Не бе Ап ТП бета 1у Уа Моє Ахр уві 188 185 1 дер Аа Су Ав Агр сл Те Уа! Ні Вт ен ув ува ТвЕ Ні Рго 135 200 205 матку Аг Ага Дів іо Туг Сує Ази ій Це Туг Су бів іх
Іо 715 223
Це біп Віу Меї Тве Ахр дів Зб Хегіує Зегіввіви бій пев «30 235 80
Ту бій нНіз Ав Тве Бі Ре Авр Ре ТВк Су Аги Уві АтЕ Тр уз іу5 Ар бів Уві фев Уві Тгр Ар Аха гей Сух Твг Ма НВ Ате дів
Ба 255 270
Уві го Авр Ту лів Сік ух Во Агр Туг їв Тне Ат Ток ТИ» Ма! 75 280 55 діз СК Авріїу» Рг бе Ат 250 295 «М 5 «1ї» 255 «1» РЕТ «213» Штучна послідовність «Зх «23» Рекоюбінант «ню ЗІ
Мен Аа Ав се Те Руо бен Ті Ай бух Тут Агя Ре Не Ар і 5 12 15
Ма! біп Резівги Тв Сік Уві бен у Аа Сів Не ТНг Ох Уві Азр 2 28 50 без Ага бій Рі ев Ар Азр ее ТВ ТероАял бів Не ев Ар Віз у 45
Рра Ні Тк Туг біл уві Це Тук Ра ко Оу бів Дія Не Тит Авп ща що БО ів бін Ні5 Пе дія Ре бек ге Аг РНе біу Роз уві Ав его Май 655 70 75 5 рив Пе ви уз бег Це бів СУ Ту Рго бід Магсій Ме Не Аге 85 Зо 95
Агр сів Ай Ах и бе заг Ате Тук Не Біу Ахр Ар Тер. Ніх дів 100 105 по
Азрбег ТВ вве іви бр дів Рго Рго Лідія Ма! Уві Ме Ак Ав 125
Не бін Уві Рес-бію Ту ОК ОМ Ази Те Оу вАвіви Зег Ме Тут
ІЗ 135 їх
Зег Аіз ТЕв бій Тир Еви беє Рго Тк Мей бів Ав Тве Пе Ов у 145 ї50 158 155 ій Аа Уві майні Зег Аа Тпкіує Уа! РНе біу бек ви тує Обів 155 170 175
Діва ТВг Асі Тер Аго Рве бе Асо Ти Зеє Уві цуз Уві Мої дор Уві 180 ї85 та дер Ав ФУ Азр-Атв Бо ТУ ма Ні со бе магма Тв НЕ Рго 135 КІ 705 ма таке оїу Аге Ате Ав Се Тук Сух Ап бій Уа! Тує Суб бів ух іо 215 РИ
Не бів Су Меєтнг Абр Аз Си бег ух баг цец іви бій Ре 1еу 255 230 235 240
Туг Зв Ніє Аїя Тв дій Рне Ар. Рне ТТН Сує Аге Ма! Аге Тер Гух 345 250 255 ух АДхр бів Уві Ген Уві Тер Ав асп і ви Сує Тіт Мей Ні Ага Ах 80 255 270
Ме Ро Ар ТугАЇа СНУ Му вне Аки Туг Гео Те Ага Те Те Мат 275 280 785
Ав іх Ар бух Рго Зет Ате 290 295 «5105 57 «21ї» 295 «2132 РТ «е1Ях Штучна послідовність «3йх «йаЗ» Реномбінант
«005 5
Ме Ніз Дів дія Сея Тег го гей Тв Ап сує Ту Аге Нік Пе Акр 1 З юю 15 узі бій ро ву Ті оіу Мві кец у Ав бів Пе ТВиОіК Уві дер за а. 30 бен Агр бів Рез беи Азр АБр зе Тв Тр Авт бін Не їеу Ар вів 35 ча 45 рве Ні ТВе тує ой Уа іе Туга Рео З бів Аа а Ту Дей 650 сів бів Ні Пе Абе Ра зек Ага Ат: ЕНе біуУ рт Узі Ар то Ма 55 70 75 що
Рго йе Ге уз бег Пе Біцну Тух Рго Сів Уві біп Меє Пе дя 85 ча 95
Ат о Ав Ас ов; бе За Аге Тут Не БІУ Ар Акр Тер. Ні Дія 100 305 о
Авр бек Те пе ви Ар Аа Раз Ро Аіз діа Уа Ма! Ме Ага Аа 115 120 155
Ше бів Ма! го біц Туб ОК су Абр Те БА; Рне те бек Ме Туг 130 135 140 бек іа Тероїв Тр ьец Зак йго Три МмМеє бів Аз Те Не сх у 155 1650
Гей Ап уді ма! Ні заг Аа Та ух Уа! Рене су бек їев Ту бів 165 120 175
Ав тт Аки Тер Аг Не беу Ап Тк ов Уві сух Ма! Ме Азр' ма! 150 155 153
Ар ді СУ дер Ага ів Тр уаї Ніх бто ен уві Уа Так Ні то 135 290 за5 ма! Тве іу Аг Аг Аз бен Тук Су Ап Зіп Ма! Ту" Су вів ух 210 215 250
Пе бів су Ме тне Ар Аз бін бек ух бегівц 160 Сів РНеїви 225 23 235 4
Ту бів Ні АВ Ле бів Рне дер вне Тит Сує Ав Узі АгЕ Тур Був 259 2558 ує Ар бів Ма їец Маі Ттр Ар Асп їез Сух Ту Маг Ні Ате Аз «50 255 ал
Ма вто дер Тут Аа Їх бу Ре Ав ТА ьо ТВ Ага Тр ТА чаї 275 280 285
Ада Су Ар ух Рго ЗВГ АгЕ 290 295 «105 53 «21ї» 888 «ай» ДНК «13» Цнучна послідовність «2202 «223» Ренсмбінант «дах 53 зівсасесвя СИтрасасс іВрассаає азвіпісяріісатсрасріісавссасіє 50 асаврерівсіскрсесара дацассдра юн асстра врвавсосп звасваєтс 350 асбрезаєв аваісстсва свесійсасасцассзав Нзіасн іссіднасяв 180
Ескаїсасся зскавсввся сайеесис свакванві (сввассввї здаїссввй (020 ссавіїсєса заїссвітна вив чЧаїссс ванвідсава даМавасвараавссавс 300 вавіссісас вутасатави срасвамри сасисаваси ссвссйсстівасвстс ЗБО ссввсівссв деп аївси сесамараи ВіЕссвеве асвисрисвя ассвеіс 450 сізісваїі айсівсвір новиасисісісосаасра снсазрссає самраввя! 480 сізвасріюв Мезсісзис іасіззнвіс п сврезавіс іассарвсрасраайд ОО звяМмсвнта зсассавів! назниідвів натрірвасе сіркарасви рророєввй 500 саїссасісвавнасиса сс асі прясвсвеза сесітасесаассаррій 80 тасідссава якаїссавия засдасіваї ясвваріста адісссівстісаатсстс 720 тасвавсасе ссассваай свастсастівтсвіямснетрсавнеа внвссавдія 780 сісвівівее зіаассеме сассагвсає сквесартає сараєтаєвс сввраавис 840 сЕстаїстса соснова аніриссвва васвадоств весвсва "ВАВ «102 «211» 888 «212х ДНК «13» Цнучна послідовність каоО»
«23» Рекомбінант
«НК» А вівсасесея Стр асасстійнассвас варізссвикісаїснасніїсваєсаєс бо всарвсвіяс (срнсисана ваймассвра віра свв крвадсесм адаснасіє 120 зенеразе; арасісва сросмісасассіассази Мастасчостввасая -І8О вскаісасса зсрарсанса сайросисісаснронні ісррассвві акаїссаві 240 ссавнеїса заіссацна вина (соссвовніксава ванараєнаваанссазс 300 вавіссікаснеасасаре сизсвайря сасксараса всасснестівасвросї 350 сеВЕстросв ВВ атвся срсваєаяве ківссвваві асрисевсва тассвацс 820 сісжні асістисми кранасдсісісяссавсва їясаакссассайвааввї 80 ствазснівя НСЗесаис тасіаарніс Менрмаріс іассаквсвасрзацев о зевисаків каассаріші каавніва ваінвасе севавасан вакасве 500 саїссастсн ТанчЧасаса состдівасі врасесавав сема свассаввій 560 таствесара зкагссарни зарано ясинавіста зрісостясі сао 720 басвазсаси ссарссаві срасусастівісвівАсревідраарза внассвавів 780 сісріВінНЕ гаасстне сассаєнсассдарсавіассевастасрссврряавіс 80 среївісіса сссреєнтаєсзвірессина васварсоса несвциа ВАВ «102 55 к211» 888 «2192 ДНК «13» Штучна послідовність «ах сядах Рекомбінант «АЮ» 55 зесасясев співасвес бівассває азиіагсвнсвівісвасніїсвасовею БО асарнсненстснисесава вабосснва всрнасстра крланссстм араскастсс 320 аспдезаси зкафсісва свосісасассізссаве Пафйсасціссреазсан 180
Есваїсасса асрадсзиса сайросмсісзареавеі свв ссвнт авасаві 40 ссвансіса заїссайва вен агссс дев исара айврасраразнссває 300 карісстсасиртасатаве сврасранне сасвсаваса дсасемсстіваснстсі Зо ссВЕс Си ТвЕПатеся сесавізеве Вірссвваві асенсвисватаєсвимМе 450 сіаїсовіні асстисаїн кязнасисісісвосвасва всазнсосяссвиряаннї 4ВО стазасвіви Мсасісвес (асіварріс Мсвязавіс Чассареснасявання 540 авийсавін вазссарір! внарнінає; ватвіняаси сіеванасантравасенія 600 саіссасев ізвцасяса сссідевастввасвсаряя сосонасрсавосарий 560 тастресава зевтссавве заївасіваї дсвкавнта аріссстрсєїсванесіс 720 тасваасасв ссасссвай сврасп сс трісвіЕнс евіввазрвавнассварій УВО
СЕСБІВІВНЕ зіазсстне сассаєвсассварсктаєсавастасвсстриевавис 840 сясівістса сесисастає аВтнкссЕва васазнесва досеєтиа ява «ЗО» 56 «її» 888 «12» ДНК «213» Штучна послідовність «200»
«223» Рекомбінант «0» 56 афсесисвя спідасаєс (ткассазс зарізісевс згаїсврасвіїсСвассасіє 60
ЗсакВсЕгвс сеесисаве ваЧассява вінрассіна вевавссставаснасісє 120 асидезася аваїсстсва спос сасассассави Маістаснісствасав 180 вскаїсасса асеансанса сайжссисісаврварвііскрассявіавайсав 240 ссаацсіса заїссайра вини аісссвавнідсакаїнаНаваснанзанссвас З навіссісас єдіасатаре сврасва ре сасрсаваса всассмостідасястсс 360 ссвясівесв вра сисаатіанаи відссвеве! асевсевсратаєсввс 420 сіаїсваївї асссівсагв ввавасвсісісассзис а інсвадосає саМваарні 480 сіваасрвіре Нсасісяесіасізавніс Псркааріс іфассаряскасвавійвв 540 авнйнсавіа зсассавінї дазреїтнаїн раїріряасе сірравасан еванасрній 600 свіссасісе гав асаса сесіріаасі реасисарар сосіасе сзассавай 580 часідссара зраіссаряв авівасідас рсевавіста арісссівссісвайост 750 тасвавсася ссасссазіє срасітсаєт ірісвін с Евівразнаа нрассазитв 780 сісрівтввЕ атзассмме сассаїрсас срарсаніас сараєстасвс сврнаваййс 840 сесіаїсіса ссорсастає артрессрра расадроста рссрства ЗВ
«2102 57 «АТї» ВАВ «Ди ДНК «2332. Штучна послідовність «20 «223» Ранамбінант «АДО» 57 асвсясесви СПтрасасс пірассвас варіан ісвіснасвіїсвоссвс 80 всависяциє свесровва ваййассрва рірвасства грнавосси здасвасісс 320 аспвизася адаїсссства сисспісисасстассазе Маїтаст сстввасаю З всваїсассз асревсозиса сайрееснсісварерявріорвассві араєсаві 240 ссвайсісв азжєсанва вин асссвавнівсввавойанасвадаанссває 300 дашісстсвс керасзіавв скасиаи ке сасеєвнаса досзсспесі бився 350 ссвисівссв винесе сЕсСааїанав вірссяваві зсвнсресра (зссррінє 450 списав астьсацвкарасвсісісвссаагсда с всваресаєсвмваави Я стазасвівв неасісадсізстзавніс Нерваавіс Пізссвирсвасвавинв 540 завЕнсавіз асассадін: веарві вав вевікрася стрравасяе ввавасиві 600 саїссассе авиазсаса ссстріваєвнасесарав сссцайисвассадай 50 івсессара аржессавиЕ заграсівах всевавіса арісссівд ст ісавцссіс 730
Івскавсасе ссассосавії свасисасі піст ритевавкоа врассвавів 8 ситет ов азссНів сассаїдсас сеавсавіяс сврастасяссвевавайс 840 сестціса сссясасіає здінесснна васварсстая вссрецна Ве «міх 58 «115 БВ «212х ДНК ей1ї3» Штучна послідовність
ЕД
«щі3» Рекомбінант «ВЦОз ЩА аівсаснсре співасасс рассазс авіа сврі ггайсвасвітсвассасіє 50 зсзвнсвінсісвисесаря вий ассяра віднассіна дива авасрясісє 120 земвиваск анввісстора сист трас ясствссвая Матіас іссбювсяю 380 есвзісвсса ясрянсянся сачясіс ісваррареі ісврассврівраїссвя 0 ссзанска виссайва вдейасссданрівсава рн анаси знайиссває 300 даркссісас евіасвізер свасванеек сасвсакиса рсасоцестівасвої 350 ссрЕСівссв (НЕ всв сисавіавир аінссвизні асврсвисва ассввіи 420 сіаїсваівіаскласев вварасесістісассвасда нсаздссассамраввяї 480 сіваасиве Псасісавс (асінареіс срразріс Мізссавис васдавйвя 540 звЕссавія асассав'вт внавнтват вас вівнзсв ств енасан вкарасввія 8500 саїссасісв гавйвсаса сосірізасі врасксввар сесіасів сваєсвней 650 їасідссава зявіссавиє заїраєтва! всевавіста зрісссівстїсзанесіє 7950 тасвазсася ссасссвай свасисаст (свв кетрезаваз Евассвавій 780 сісвінтряе візассіе сассаївсає срарсавіассвдастасессвенавайс 840 сиЕстантсв сссксзсвс арівнеснеа васазесста восвсіва 8 «ох 5 ке» Я «2122 ДНК «213» Штучна послідовність «22» «223» Рекомбінант «або 59 авсасиске с дасасс Пінассацс ааріаісвис Вівісрасвкісзассаєс 60 асаписвівсісяворсара ванассвка віка ссіра двнавсссі адасвасісс 120 зсідвваси сватостово сесст и сас зостассави Нанлас іссівнасаю 180 нораїсаєся аскавсанса сацрссіїстісварнавніссввассвиї араїссавиИ 240 ссавця авіссаНеа врЕмаїссс раретрсаваїванМанаси аваавссавс 300 ваБІСсісас ветасаівве сеасиайве сасесараса всасспссірасвссь 360 ссивСессВ ВВ Нсе сесааіанар вівссинані зсрисвисва ассввійс 420 севісавідк зсіствсатв крарасистс ісассаасра всванссас самнавяні 480 стваасвівр йсасісвистасізаниіс сич ніс м ассовисвасвавняв 540 арицсадіа асассаріст разрвіват и наді асв Срранасав сварасврів 6500 каіссасн авнасаса ссснівасс ввасьсарак сенат сазссавнії БО 1аєїЕссава аижіссарви яаїрасіва: всввавів аріссостест їсвацее 720 тасезасзсв ссасссаан сеасисаст ііі еВіноварва венссваші 780 сісвівіяни аізас не сассаїрсас срарсаріассврасесрссвеваванс я сястайніса сссрсаласавтовссвва даславсса весвства 88 «415 50 «1ї2 295 х»1955 ЕТ «213» Зрйіввобійт пегвісніохогап» «ЦЮ» 5
Меї Ніз Аіа Ав (еп Зех Рг Кви 5ег бів Аге РНе ім Аг Не Дів ї 5 и, 15 ма бів Бгто бе ТРОЇ» Уві еш Оу Аіз и Пе ТНЕУ Уві Азр 5 За ї2у Аг оіи Рео во Ар Авр бек Те Тер Азії біз Це Цен Аво Дів
35 40 45
Рне Ні ТВу Тує бів Ма Це Ту Рне Рго бу біроАіа Ме ТВу дей 50 бім бір Ніх Не дія Ра баг Аге Аг Ре бу Рез Ма Ар Ро Маї 55 т: 75 80
Вто цен Сец ув 5ет Це іш ОХ Тут Рго Си Уві бій Ме пе Аг 85 І 85
Ага ін Аа Ап Оіш 5ег БІУ Агр Уві! Це БІу Дер Авр Тер Нів ТВг 100 105 110
Ар бег г Рпе Бей Ар. Ада Рго Рго Аз діа Уа Маї Мет Ага Ав 115 120 125
Це Ар Уві Рго ОО НІВ Су бу Азр Тнг Оу Рпє Гео баг Ме тує 130 135 140
Твг Аа Тер. Бі Тег рев зегРго Тік Ме бів дів тн Пе бір ої 5 150 155 160
І ев Авп Уві Маі Ні ер Аа ТЕН? Аг Уві Рне біу Зегіви Тух бій 1655 179: 175
Аа біп Аеп Атв Ате пе Зет Або ТАг Зег Уа уз Уві Меї Атр ма і180 185 1959
Аве Ав СОІУ Аз р Ат Сім ТАе Ма! Ніз Рго Ге Уві Ма! ТНе Ніє Ро 195 200 205
СУ ет СУ Ага ух бік ец Тут Уа! деп бій Ма! Тут Су біп Аке 210 215 220
Не Сі сйу Ме Тк Ар Ав біб баг Ку Вго ви Ге бів РНе ве 225 230 235 20
Туг Си Нів Аз ТВ? Ага РНе Авр Рве Тв Суз Дей Ма! Ате Тер цу 245 250 255 іу5 Ахр біп уаііец Ма Тгр Ар Азпі ен Суз Таг Ме Ні Аге Аа
БО 255 270
Ма! вго Авр Тук Аа Сіу Гу Рне Ага Туг Те Те Агр ТА Твг ма! 278 80 285
СІу М Ма! Аге Рго Аа Ат 290 295 «210» 51
«211» 295 «21» ЕТ «213» Штучна послідовність хІа0х ей» каонсенсусна послідавністіх «20» «аЛАх відкинна особливіств «дав (БІВ «В4Зх Хав може бути будь-якою амінокислютою вка зустрічається з природі «Та «271» відмінна особливість «ййах 916 кийа» Хва може бути будь-якою амінокислюотою яна зустрічається в природі «40 «23» відмінна особливість «23ах ПОВ «83» Хва може бути будь-якою амінокислотою яка зустрічається я природі «2202 «хлаії» ВІДУНННА ОСОБЛИВІСТЬ «рух (ЗД каа32. Тік може бути Сує «Де» «231» ВІДМІННА ОСОБЛИЩСТЬ «222» (3232 «25 Ар може бути ТВг «вх
«221». ВІДМІННА ОСОБЛИВІСТЬ «225» (38). ЗВ) «223» Авр мате Бути баг «220х «221» ВІДМІННА ОСОБЛИВІСТЬ «202» 401,40) «223» Зег може бути Ази «290» «22їх ВІДМІННА ОСОБЛИВІСТЬ «2222 і59).459) «233» біуможе бути Мід «ах «221» ВІДМІННА ОСОБЛИВІСТЬ «оз (БД «223х Ав маже бути біп «220» «221» ВІДМІННА ОСОБЛИВІСТЬ «22» (БУМ Б) «223» Ні може бути бій «ей» «221» ВІДМІННА ОСОБЛИВІСТЬ «222» 591,69) «2785» Ав може бути заг «320» «221» ВІДМІННА ОСОБЛИВІСТЬ «223» (82.83) «223» Хаз може бути будь-якою амінокиєлотою яка зустрічається в природі
«ВО «ах» ВОЗАВІННЯ СКС. ам ПМ ЕІ «ал» ква вина бути будь-якою амінокустссв яка зистрнається в пров «а» «аїх ВІДМЕННЯ ССС МЕН «За» ПОВ лиж» Хна ми бути Верде авінен асо яка зе аетькя в прерії «ЯК» «Хі» ВІДМІННА СССОЛИВИЯЬ еижжж ЕН. ІН «АЖЯ» Ше акне Буте Це «Зі» ВІДМЕННЯ ОСОБЛИВІСТЬ «Жах СЕМА НОВІ «ЖЕЗх йо зехное бен «МА «гаїв ВІДНННА ССО БЛИВЕСТЬ «кава» са «ТУ» Во зеане бути й
БУК Кк ей ВИБЯННА СОСНА «232» ВІЗ НІЛ «ФІ» Мая денег Яитя Буде двзінекнелетеа вия вуста чаеться а хуниреде ах «Ейіх ВІДМЕННЯ ССОВБЛИВІСТЬ «жа» ПАХ еЖЯ3» Тло букм беж
«Лаки ВІЛВНННЯ ССОБУЧЕКТВ «ай» ПІТИ «ТЗ» беж може буун тує «Ме «і ВІДВІОННА ССС ЧОСТІ «ЖЯх Не маке буть пт ог це
Кох «Кай» ВІВ ННЯ ССО «33» ВІЛОБЕКВ «ВМ» Си ява кт Ав «ВЖЕ сяхіх ВДВ НЯ УТИНТЬ «ЯКІ ЗАЛІ «а М ване болтах Не «Ех «аїж ВІДВИННА ТО ЛИСТЬ ейаае ПЗВ «Аа В наве були Й пз «і ВДВ ССО НЕНУТ «аа» ПЗ. ех Тегамнне йучн НЕ «де «Ві ВДМІННа СКОБ ИВЕТЬ «важ» (ЕВ ОЇ
«ей» Біомед їв «ВІ» «ЗУБ» ВІДВЧННЯА СХОБЛИВАСТВ «тая» АХ Л «АИав Бе мож бути ТЯ ак аа «А «а ЗК АВЕВ «33» ЖеВ може буте будь макси ака зустрічається я приводі «Я» ВДВНННА ООМОЛИВНТЬ. «адже ЯТІ «Аа» Тур еанне бути Туг
КЕ
«ай» ВІДБЧННА ССОБЛИНОСТЬ «Я ЗИ 1883 «Зх Хв вкажи ня Гедючамаих ак інехнствн не тест Мріаеться В Кан
ЗЕ жав ЩДУНННА СОС БЛЯВТЬ «аж ПАЗА ВЕ «Же Тв каре Були Мій «ВИ «КЕ» ЛУЧНИХ СОКІВ «ай ПАЗА «ДИН Же веж: Муте Рудно звозян яка зуекрееться х природі «КД» «аю ВІДВННЯ ОСИ
«аа» ПАЗИ «ЯЗ» Тіт каспвкюв бути бу де КІВ хай» ВІДВЕННА ХХІ хеаав ІЯНО «АЗ» Ме: може бут їв; «яхїх БДВІЕНА НОСИ ВИТ «ай Ха лих бутя буд аку ян я а Зустреається В пана яияй КОСОВІ «Я» Від ве Бути іх «ай ВІДЛІК СНУ НСТЬ «Іа ВАЛ ОВ «ДУ» г виумое Куря бе: холі» ВІДМІНА ССПЕЛЬВІСТЬ «пах ПНЯ «ЖЖ Ве жна бух» фах «аа «ВЖіх ВЕЗМІНЧА СЕСБИНВНТЬ «ах ГП «ВУ Хна же бети буденне змінам нсткнио не зусптичасться в зрад:
БКс
«их» ВЕНИ ССБТ яки ЗЕМ АХАВЕ ек» Хаз венна Мт Будасжану аванс вене яна вустррєеться в кр роді «Ех «ах» ВІДВУННА СКСБОМНТЬ «дае ПОВЕ
ЖИ» Хв знане беяв бедневковох авевнени ств ВН: ЗУ ЄтрМкяться: В. ЗНО ді «а» ЕДМІВНА СОБОЛЬ «ай» Я «Ей» Ріва а бут ТК «ау» БД СЕХКОЛИВВСТВ «Вже Пав ее аж Вуж рнхве Шут КЕ «А чив НОЗВНЕВНА СЕАНСУ. «дах Па О3 «ВИХ» Вау вон бен Ма «30 «айжх ВЕДМІННЯ СООМЕТ хау» Пе 35 я ВЕ вика ув яр «Те «аж ВДЕ СС НН. жах ПЕН. АНЯ «Дж Як озна вт ЯаЕ
«жі БІАЯБННА ХВСОБКЛЕВСТЬ «ай БАЗИ. ЕМ
ЖЖ Ха вежа ММ Знав ев ЗНЕККИ НС нка ЗК ТЕН В ЕЕ кад «ай ВІДНО ССБТ «Же ВЗЯВ «ЯЗ ТВЕ акнве Бут ет
ЕК
«Яке ВІДЗНА ССБТ кенях ОЗ «а» Жва зиснее Ме Беррі ке ВВА сн еНевано нм Вулюкматьом б вину «ЕЕ «аж ВІ ННЯ СОЗБЛЯВЕТЬ «аж» ТЯ «дих Кай зе БУТЯ Вище НЕК ВМО СЕН яна ЗУСТОекться В прод «ай МВА ее ОЗ вне бек БЕ «Ех «ах» ВІДНЯ СКС ЧВТЬ «КЯя» СИХ ЛИЖ «МИ Жак закувнє Хорта Верозненнотке вав ся НК Зусетривтаня В. гео неуої «ЕЛЕ» ВІДВЕННА БОС СТЬ «Вау» СІВБИ
ЖЖ ВВ вагаваж: СНИ ПДМ КНОВЄ ВУ ВО ЗК ІК З пою
«Едіх
АВ ВД ННЯ СКЗ БЛІН. «ай З «ЖЖ» Зб он сен Як «аа» ВБИВ САН ВВКх «аа» Ве мере ут (5 «Ед «йаїх ВІДЗАННЯ ССО БЛЯВТЬ хоЖ» БВ пив бує йух «ах
АЖ» ВЕДУНННА ССЗ БЕН ВСЮ «Ва ПІБ
КА» (ух везе бен СИ «аа» хажах ВБІВНА ССОБИОНВИТЬ: «аа ЗБ хай» Хва мона БУ Кудечаенаке ВМІНЕ НЯ; на зуються в коневі
Сея жИшу» ВЕДЕ КОСИ В жди ІВ «ДЯ» би ве Були ве «ДАЕ» «аку» ВДБИННА ОСОБЛИВЕ «ааах да
«ах Ток мое Берт Кб «кава (ЯЗ «Я» хе ване миля Мі «аа» ВІДВНННЯ СКМ кевш КЕ. АВ «КУ Жава визжн Їмуте Куди злі нн: миио ех явя УусТ ВТК І пр хжаяя ВЕДВИННА ССО КМНОТВ
Хе МЕНЕ ВК бут Б зКаЦе «хВЕ» ВІДБИННА ПК БЛюВЕСТЬ калюж ГАЗІ «ЯЖЯх Здам б Не хЕдех МІН СТЬ СТЬ «аж МНК «ЖЖ із море Бут іп
ЗВ КУ
«аж ВН Я СПОТИ ВНС «Я» і мих Кене КВ
БУК: еАЖЕх ВІЕМІННЯ ССОБЛЯВЕТТЬ
«айаз СВІ. (58
ТАЗ» йвмаще бузя Ду «ЖИ «ІЕЕ» ВІДВЕННА СКС» «Ева» ІБК Ла «Ха» о якими бета вер как яїйї» ВІДЖУННА ССОВБЛЬВЕТЬ «са з БЕБІ. ЯЗ! «а Ве вихее бури Сп
ЗАД: «ЖЕ» ВІДВЕННА СМТ кеди» УБИВ «ЖЯЯ» Жва мае тн будь яникі захнизенстовн ння уустріаакться В паиунхді «ех» «351» ВІДВЕННА СО ЛУВЕТЬ
УА Я МЕЧ
«ЯЗ» дів заанне бут За еайї» ВІДАНННА ССБТ «23» УЗ ВІ ява чі зано бита іх ак ее «21іх відмЕнНна ОСОБЛИВІСТЬ «из ВІВ «Я» Вер не Срує Авт ие хай ВИДБІННа ССОБАНВИТЬ «аа» ДУ)
АЖ» Вів ана бути ар ох СК аг Ні «ВЕ «ак» ВІДАВ СЛЕБЛЬНСТЬ «ДВ» ГРВІ «Хв Бу винна бути бкв «ДК «ай ВІДМІННА КВТ «ФІН» СІЯЬЗ ТІ «де фух внав бути АВ ага не
БЕ
«Ех ВІДВМУННА КВТ дна» СІНО ЯВ; яка й фун вре бут КУ «Як ВІДВЕННА СКСБВСТЬ «тах ХК етйЯе Тук акме бути Не «ах каші ВІДВЯННА ПЕДЗЕЛЬВІСТЬ «аа» МЕЛЕНІ «ЖИВ ТВ відо бух НЕ «А хажіх ВІДМЕНя ССТКЛИВІСТ» «НУ» МКК ЩО «аМЯК Ма ване Бут КРОлЯ НЕО ДВК МН У те ка Зистрчаеться х приреді
«щі» ВЕДЕННА МОЖНА» «ай Б ЯВ «ее Маз внюми кт Кун: земне а УСТЯ В пе ІкаКЕ ей ВЕДБНННА СОСБЛИВСТ
Кай 19 «ЖЖ» Май винна Бути Буді аміноиневенно ве зустрчасться я лоно вія Ні: Бі бів ви Же Мо із» Жах каз бах Хаз жо жжа в жа
УВО реє де УВК» Уві ув ет ЕК Ве Те Х М ена іде ЗЕ Рн ем вх хе Бак ТВ ту вин УНІ Не фенх аеро вів ие м Ве Гук БМ ЯК Бе тує Бе Бе СВ; Ве Ай ЗВ ТАК ве
УББ НЬ Ве Аа Рене бек вне ее Вч СНУ Вч єв! дер бу Уві ща а ТЕ що
Виахаа ія у; ме Ще Не сУВе Мет бу) Ва Б не Ян Ве Ав ка 583 же ан із Же Каз га Хаа Пе і вер ва Бо нів хая
ЗКК! ще ЦО ворог ТП вве квнх Вр Зв Дчча ВУю ів ія Мав ван дев Вів 115 їй 35
Ме ів ві вне ін Бук Ву ва Те сх Рок че заг Я тує я, 335 КЕТІ
Ха бів Тех Ка Кое іє бег Яка З Вів Жов Абе Пе ів Ва і; 85 і 15 Я ще вав жі У Ні Зак я ТЕ кан ма Б се бе Кене Сеє ВИ з Ж 15
Вже Ха й аз ЕР бак дк Трх бе Ма ех Май ве Я а!
Я Же їй варів в Ва вид Са Те а! Мів Как Це еВ А Не НЕ: чех її я а
Жви Те В; йев Ка Ха зе Тут Кох й ща Сі Уві Туг був В Ха
Ка зі КІ
Не Жов Не БАК ТЕ Мер ва Си бек я Мав Кві Біне СК Ран й
ЕК КЗ «35 КЕ
Тут Бе Нв ТЯ Те жвя Рів ав Мне Кб кує Вер Уа й бор ув зах т КЗ
Кея Вер і жа! ев У Хер Ар вия із Су ТУ М НО Ха АВ ве 255 КК
ВІ из Ар Тег Аа ве в Рене апа Гугіхви Пік бер вх Те хай
ЖИх з З
Жив Я Мав бува Вк бака де
КЕ 55.
Claims (1)
1. Рекомбінантна молекула ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, який має щонайменше 92 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:14, де поліпептид надає стійкість до гербіциду при експресії в трансгенній рослині, причому стійкість до гербіциду вибрана з групи, яка складається зі стійкості до гербіцидів на основі арилоксифеноксипропіонату (АОФП), гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
2. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, де нуклеотидну послідовність вибирають з групи, яка складається з БЕО ІЮО МО:15, 16 і 17.
3. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 1, де рекомбінантна молекула ДНК є функціонально з'єднаною з гетерологічним промотором, функціональним в рослинній клітині.
4. Рекомбінантна молекула ДНК за п. 3, де рекомбінантна молекула ДНК є додатково функціонально з'єднаною з молекулою ДНК, яка кодує транзитний пептид хлоропласта.
5. ДНК-конструкція, яка містить гетерологічний промотор, функціональний в рослинній клітині, де гетерологічний промотор функціонально з'єднаний з рекомбінантною молекулою ДНК за п. 1.
6. ДНК-конструкція за п. 5, яка додатково містить молекулу ДНК, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, де молекула ДНК, яка кодує транзитний пептид хлоропласта, функціонально з'єднана з рекомбінантним гетерологічним промотором.
7. ДНК-конструкція за п. 5, де ДНК-конструкція присутня в геномі трансгенної рослини.
8. Рослина, насінина, рослинна тканина, частина рослини або клітина, яка містить рекомбінантну молекулу ДНК за п. 1.
9. Рослина, насінина, рослинна тканина, частина рослини або клітина за п. 8, де рослина, насінина, рослинна тканина, частина рослини або клітина має стійкість до щонайменше одного гербіциду, вибраного з групи, що складається з гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
10. Рослина, насінина, рослинна тканина, частина рослини або клітина, яка містить ДНК- конструкцію за п. 5.
11. Рослина, насінина, рослинна тканина, частина рослини або клітина, яка містить поліпептид, який кодується рекомбінантною молекулою ДНК за п. 1.
12. Поліпептид, який має щонайменше 92 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю ЗЕ ІО МО:14, де поліпептид надає стійкість до гербіциду трансгенній рослині, причому стійкість до гербіциду вибрана з групи, яка складається зі стійкості до гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
13. Поліпептид за п. 12, де поліпептид має оксигеназну активність проти щонайменше одного гербіциду, вибраного з групи, яка складається з гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
14. Спосіб надання рослині, насінині, клітині або частині рослини стійкості до гербіциду, який включає стадію, на якій поліпептид за п. 12 експресують в зазначеній рослині, насінині, клітині або частині рослини, де стійкість до гербіциду вибрана з групи, яка складається зі стійкості до гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
15. Спосіб за п. 14, де вказана рослина, насінина, клітина або частина рослини містить ДНК- конструкцію за п. 5.
16. Спосіб за п. 14, де рослина, насінина, клітина або частина рослини мають стійкість до щонайменше одного гербіциду, вибраного з групи, яка складається з гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
17. Спосіб отримання стійкої до гербіцидів трансгенної рослини, який включає стадію, на якій трансформують рослинну клітину або тканину рекомбінантною молекулою ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: а) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:14; б) нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО:15, 16 і 17; і в) нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид, який має щонайменше 92 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО:14 і здатний надати трансгенній рослині стійкість до Зо гербіциду; і стадію, на якій регенерують трансгенну рослину, стійку до гербіцидів, з трансформованої рослинної клітини або тканини, де стійкість до гербіциду вибрана з групи, яка складається зі стійкості до гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
18. Спосіб за п. 17, де вказана трансгенна рослина, стійка до гербіцидів, має стійкість щонайменше до одного гербіциду, вибраного з групи, яка складається з гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот.
19. Спосіб боротьби з бур'янами на ділянці вирощування рослин, який включає: посадку рослини або насінини на ділянці вирощування рослин, де рослина або насінина містить рекомбінантну молекулу ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок, що має щонайменше 92 95 ідентичності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:14, де рослина або насінина є стійкою до щонайменше одного гербіциду, вибраного з групи, яка складається з гербіцидів на основі АОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот; контактування ділянки вирощування рослин і рослини або насінини із щонайменше одним гербіцидом, де щонайменше один гербіцид вибраний з групи, яка складається з гербіцидів на основі АЛОФП, гербіцидів на основі феноксикислот і гербіцидів на основі піридинілоксикислот; і оцінювання впливу гербіциду на рослину або насінину.
ОО М и и М нн шк де ов а ОО В ОЇ її Б з в. ВК у В МВ В не Анні АН ОН І и НК и і вх а ЕН ОО к- с НН М но нн Нербвовнені Квізвловвот Незброблен Квізапофов ноя ЗО МС Фіг ТА й й г нше00СССсфСССМСМСОо її НН с би я ни я п т ни. К а во а й, ий щас Ву ЗСУ Фіг 16 й БЕБІ а "ЗВАННЯ ПИЛИП ИН ПИЛИ М ППП ИН ИИИИ Аа и р НН КЕ НИ В и ЕН а й г п п х Ох г 1. г п с МППИТИИ КИ КО В ЯКО НК в НК НН НО НН с. . с кі ПК с Б 5 ООН о кн ге ВОМ ЗВО
Фіг. 1 Й ІГ. Як.
ше ни янняк-- БО Ю МОЛІ р | і І "Ь : І: ц З о х к І ї і. Е 40 р фун ж її х Бо Кх їх МІД у в ни я БО Температура реакції ГО)
Фіг. 2А
-- 550 Ю МОВ -- 6 5ЕО Ю КОЗА нан ЗО Ю МОЯ -- З ОО зе Нативна ІВ тн щ Я - 160 т В І 8 140 Дт рр Ж її З 4 ї шшшшшши чш - й ІВ я й 2 тк ще чай ки В й ! ї пи нини нн нн 1020 юЮ 05050 Температура реакції ГО
-к- 8ЕО Ю МОВ -к- 50 Ю МО: си БО Ю МОЯ нн ВЕО Ю МОЗ зи: Нативна
180. ря г «зд А-Ск- . дня З 100 Чак нк ФО0ОВО ря ще ВО шк Пн ння Шелл нини: нини щ Ку. Явка 010200 090 60 70 Температура реакції ГО
Фіг. 23 МНАЛІ. ОРІ. ЗОВРЕВТАМОРІ ТОМІ ОАЄ 1 ТОМ, ВЕРІ ООБІТНМЕ Г. ОАРНТУВМТУРРСОДТ ТМЕОНТАРЗВВЕСРУОРМА КО ТЕСУРЕУ ОМІВАЕАМЕ ЗСКМТОООННТОУ ТЕ СОАРРААУУМВА ТОМРЕНОСОТ СЕДЕМУТАЖЕ ТІ. ЗР ТМОАТ ТЕСЕМУНЗАТАМЕСВІ УОАОМНВЕ ОМ Т5УКУМОУВАСОНЕ ТУНРІЛАИТНАС БСКК ОЇ УМО УСОВТЕСМТО АЕБКРАЦОРИЕНАТАЕ ОР ТОКУКАККООМ УМОМІСТМНВАМАОУ АСКЕКУМ ТЕТ ТУССУВРАВ
Фіг. З
Квізалофоп й 207с/2076 ша НН тин 53041 ------4-Д-41 5 х 400 Ще 52002 2ЗК Х« ЛЮЄ «5 т ооо --А А А Я Я В ОЇ с. че в-д- о а ше Ше ее Ша я їх е ж ее й т я я я й
Фіг. ААд вих тн а . 287с/2076 В 200 Я--- ши І щ я вне | ---- Б ДГ на в 300 -- ЯН. -- ооо кіш ши ше о а 00 сте Пе вот я тяк я б ОКО СМ же З ОО ж Б Б ев ве ее
Фіг. 46
ХХ хи в ЗВИС/З0ис 900 пня г в а 900 -- нн щи о 100 й Вк за і | Я ще М ШЕ ї5- 000 4 ІА 1 с : ; х ке Б ж г ще ж ж ОЖ ж оОжЖ ОБ В ев є з З є 5 со сі с сю су їх і ко. те їх : уч бо й й я я
Фіг. 483 2-0 и 20иб/20ис Б 000 - Ж ще З во -7-------- 8 60,0 третя ФО 40) сн - 200 ШВЗ- -- ж ж Б ЖЕ Ж Ж г е- є є в є є хх сі ср се с сі я Я В Я Я ія
Фіг. АГ ват ЗВ" С/З0ис 2 1000 -- птн х 80.0 тр ї бо 0 7 ення пан Е 00 - -ї рі шненняя я Н. че - 8 Кк г " пе у НИ о Но Зоя З ще са в що що БОБ) ОБ ож; ши; У; ШТ
Фіг. АД
Кквізалофой ши ПОМ О КК ОККО ОК 0 о й
: о. о 5 Контроль ЕЗ МмОоМ-нТ2 яТХх ач Ех
Фіг. ЗА Квізалофоп : с о... с о МО З . Я с с. .
о. ; ; о. с с. . . . о. о с с .
п. мОом-нто Контроль ЕЗ без ТИХ
Фіг. 56 зко ою можо 0 МНААОЕА вовееТАМ АТМ БАЄТИСМВСНЕР ВОБТИМЕТ ВАЙНІВЗУ ТУР РОБАЧНКЕВНИКА то зго ї Мом Н ІБР ВОКЕР ІНД ТЕАТРУ АН ДЕЛІ ЩЕАРНТУ М МЕРА КЕНІЯ 7 БО Ю щОЯ щі А ЗЕ овЕЕК Мо МЕС ОК прак я имени т ЗО Ю ЩО? МНААЦВРІ БОВЕЕА ТАМОА М ТОМОСАЄ І ТЕО ЦАРІ ЗОБТАМЕ ЛАРНТ УСТ УР РОС, пе і Зк Ю що АНА ВІРНІ А ТСН СМ НЕ 1 ЗСБТАКЕ ТОЛАЕНТИОУ ТУР РОДИН ТМЕСНІАК, 70 БОЮ МОЛІ МАЛЕ ВОНРЕЯ ТАМ Т СМС ПТСМВ КЕР ОБТАНЕ ТЕДАЕНТУСМІ У ЕРЕДАНТКЕНІА 70 БОЮ Моа ЛАСТАХ ПРЕТЕМСАЕ ТОМ НЕРІ РОТИК ПЗАЕНТУСМТ УР РЕОАТТМЕЗНІАЄ, 70 РОЮ Мола МН М ТРНТМКУВЕЇ ще КТОУСАЕ ПТСУВ НЕРВОВІ НК ТЕПАЕНТ МОМ УРРСДАЕТМЕЦНІАЄ 70 5ЕО Ю МО МАМІ «РІ ЗОВРЕВАМОРІ ТОМ САТ ТСУВЬКЕРЦЛЮЄТИКЕ ГОТАЄНТИОМТ УЕАСОАТТМЕОНТАЄ, 70 9ЕО 1. МО:25 МНААЕТРІ ТАКУРЕ ТВИСРІ ТЕУЦСАЄ ПТОУВІНЕРЕВО СТИК ТЕОАЕНТУДУ ТУР РО ОАТТМЕДНІЯЄ, 70 ЗБОЮ Моя Мед тк ІМК МсАЕ АВК ВО ВЕ АЕН КУРЕНЯ о ЗБОЮ МОЗ: 00 МНААСВРІ ЗОКУВЕ ІОМОРІ ТОУЬСАЕТТОУТНЕРІПОМТИМЕ ТЕ САЕНТИСМТ УК РОДАТТМЕОНІЯЮ, 70 ЗБОЮ МОЯ 0 МАСТРОТНКУВЕ ЗУОРТСУЦОАК ТТ ОУДЬКЕРОЮВТ ЖЕ ПОАЕНТИСМТ УР РОСА ТТМЕКНІАЄ, 70 ЗБОЮ МО? 0 МААСТРЕТИКИЯР ІМОРЬТОУЦСАЄТ ТОНЕ РЕЛОБТАМЕ ТЕСАЕНТИСМТ ХР РОДАТ ТЕЮНТАЄ 70 ЗБОЮ МОМО 0 МНААСТРОТНКУВЕ МОР ТОУССАЄ ПОМОЕНЕРІ ЛОТА ПОАРНТУСМТ УР РИДОІ ТМЕОНІЕР 70 ЗБОЮ МОМ 0 ММЕТАСТМКУВКТОМОА, СОМ СА ТТОМОЕАЕРЕВЮВТ КЕ ШЖЕНТ СМТ РОДАТТНЕСНІАЄ 70 ЗБОЮ МОМБ 0 МНАЯСТРІ ТМКУВЕТОМОРІТОУЄСАЄ ТТЕМОЕКЕРЕОЮЄТИНЕЇ ДАЕНТУДИТЕРорЯ ПЕОНІАЄ 70 ЗБОЮ МОЖ? 0 МНААСТРЦОТМКУКЕ ДМОРСТСУ,САЄТТОМО ЕРИ ВОБТИМЕ АРНТУДТЕРСДАТТНЕДНТАЄ 70 50 Ю МОВ МНААСТРСТМКУВНІОМОВЕ ТОМІ БАК ТОМИ ЯЕ РІ ОЛОТИМЕ і ГА і ОМ ЕРОСАТТНЕШНТАК. 70 ЗБОЮ МОм МНААСТРСТАКУВНІОМОР ТОМ ОАЄ ТТОМОНЕРІООБТИМ ЩА СУТУЕРо, АК ПАК ЗБОЮ МОВО 0 МАМ ТЕОТКУВА ТОМ ГОМІСАКТТОМО, ЯЕРЦОЮВ МЕ; ПАН ГЕРОЇ! МЕСНІАК 70 ЗБОЮ МОБ 0 МНААСТРАТМКУВА ДОМ смс МЕН т Ї ЕДЕМ 79 ЗБОЮ МОБ МААЕТРАТМКУВНІ ВО ТОМ ВАВ ТОМО АЕРІЕ ПОСТАНЕ ПЛАЄНТИВУТУЕРАОАТМЕОНІА 70 Моноенсю 0 МНААФВО, «ПОРОМ ВКЕ ТОМ ВЕРЕНВ ТАНЕ ТОВАРНЕ ВА КЕОНІНА 70
Фіг. А оо Ю ож ЕД ВРОВНОВ КАТЕ КОМ ОВ ПАРКАН і 1 що н м і ПІК міння ЕЕ» корояНтееи па МИНА ТЛМЕЮ ве со в кон еНЕОВуеВ Кор е НЕК АК еВ, ЗАТВ ЗАРРААУЧМНА ПЕУВЕНОСВНСЮ, 140 ЗО 0 Мою 0 ВАВРОМІДАЬК ТЕ ВУРЕ КОМА АН ВОК СОНЕТ ОАЕИ ек в Не ББО ОО МО 00 БКВЕОРМ КРИ КПЕВУРЕКСМІННЕАНЕЗЕК о БТР вАКи КЕ РАСВ т чо ЗБОЮ МОЄ 0 ЗВКЕСРКЮР КО ТЕСТ ЕМ АНЕ АН З ВАЕ ТОЛЕАКТОЄТЬ, ПРЕАКА МЕЖ в тю «гаю МОВ ЗВЯРОКУДРМАІ КАТЕ тРЕМОМІВНЕ А ЕЕКЯМІСВОАНОМеТ, ДАТА ані и не «БО В йКкОо Ве МЕМ КВТЕ ОРЕ МОН ЯКЕ АКЕВОКЬ ТОООВНТОТЕЦ АР АН МЕН ЗСЮНО МО «еВ І МОВ Р М рег ете ЕЯКС АК оВМТо он ЗТ ПАРА ААИИМ КАТЕ ще 1 во о код 0 ВАВРОМДЬВИС ЕТРЕ ХМ ВВЕ ЖЕ КИ о ооАНТВТ А САРЕААА ОВ ЕУвИЮЄЬ ТЕ о зн; ШИ, СЕМ ее, АКЕЕК МОН інки РАКА пе 1 «о Ю МОм? СВОИ КА ОТРЕ МОНЕ, НЕ ЕОАХ а ОКТСВТИ як РАХУНКА УРЕ ЗЕ Й ! БІ ДО іван нн нен ан муж Як СД ін ве кон АННА в НВ ЗЕ) в ож? 0 ВКЕСРЮРКАЬС ТЕ ПРЕ КЕНЕ КОС Ю Кіа ХАЕС ЗБОЮ Ома 0 ОВВЕСРМЕМТЬКО Ес ТА ЕВАЕАНЕВЕВИ ОВО НАОЄТЕТАеРА МАВКА ТЕУРЕ ЮК о КО Ю Комо Енн о МІН АЕН Тон МЕБТРЕ САРА ВАВ АТЕ МЕ ТОСТИ 140 ро о ново 0 ЗВАКОРМ ше ПАЕЕЖЕУ КК СДОВН ТЕ НРеААУКА Пи Ю МОЗ ВАР, «ВПЕЗРЕ КОМІ АН ЕАНЕ За СрОВНИВВ ТИ РЕКАМАВКА ТЕМ Ковсенеує БЕВРСВИВВВ ЕК ТЕС ТУКА АН ВА. вва В ОКОМ ебеВ т но
Фіг. 66
Зою ово СМОЛА ЕН М ОВЕН КТ КАВУ ВДКЕ ВАР НИСВ Не ваюнт Кк хм лЕ ВКНН КАЖАвА т раною 2ю КОМ хе же Ем АНЯ «в в жк Іс АУВА УК КК І МАНЕХ РУК БМ ТАНК Я Я ЗИМА УНР зе е Є не й є й м ст щі КК в З ОКА УА АК МО, їж СК ТУНе У тех КВУ 2 ЗО в а ЕМО ВІК са хни Кф МАМ Ка дики я еф мен; пе у нет «КОЮ КО. МАЙНІ «РТ ЕСЕ КУКНЕА ТАМИ ЗУ ДЕН ЕМОМЬ ис НАУМІН "о ЄЕО Я Моя сМИБАНЕ ЗАТЕ ЕС НУ ЗАТОКОХ КИКтаКИ пово ї му | мо ов молю МН ДК ВКА З ВЕК мес АТМ. 70 Звоа нога ВМ КАНВА Я ВН КК АвЖЕЬНА МН! о 5) Ід вкла КК ік а КОНЯ КАТЯ ЧОМ З ЧК ТУЯ МЕ Б ІУНАЛАНИКЕ у ЗБОЮ МОВ МЕНЕ ОАЕ Мем: фін: СКАТ. Я їй УЙНРеГ й ОВ ЕД жара ей же фей НЕК ес у МАЯ ин й М я пута а: Зою ух жк ри нини м - ОК я КА 7 ся ре З а СК г дну й пухденкккурни еухвк ве в МІ ЕЕ І ОЕМ АІЕВК НЕАТКУ ЗОМ ТНАКЕОМТ БУКММО ПАСКЕТУНРЕУЄТНАМУЕ З зоною 0 СМЕНСВВКХ САНУ кн ев 2 оо ЖЖ янМ Порннни мене ие то ВОКОЖа 0 ІеМеАНЕТ РТАНЕКС АН ЯАТКУРВЯ, УДАТНИНЕ ЗМО УДКООНЕ ЕУНРАНЕНАМ шо бою МОЖ ПЕ нен МЕБЕМІЕУКА ВАС ТЧНРОЛИНИИ, 21 ща ше 005 ВАТЕ ЦО АТУРО МО ав ВИ. г щ мо ТК ц ї РТС ну З ЕЕ Й к с ПОМ МАСЮХ ЗУНР й КА В дос ГЕ ЗМК " УНАТКИ Ве УОАТАНАЕ ЗАТ УКУИЯ лена УНЕМЕ 21 ШИ м ОВ м ОККО ЯКЕ ЗБ о ва Дірка ВН як ЯК З ійня З НН Зб а В ВЕ В зі ря Я ЯКІ зи В З жийь жі й ння ях й Консвнеме БМВ ВУ ва ПКТ СБК НАУКОВЕ ТВОЯ 21о
Фіг. БВ шви и УЗ КК В ОКУ ЕК Уж екеу Ка УВО зко ново ВАК МННОЕНЕСТВАЕЕКИ АХ НЕРВ НЕЕ ПЕК Сс ННЯ НЯНИ зво воно 0 Вже ее ЕВ туносди м тА рії зю ВО МОМ 0 ДЕКО НДС ЕсЬеЕКЕ А пфАСТАН нн МА 2 ЗО ю МОУ 00 ВККСУ ВБЕКЕТРИ РАНКРЕЕ ТД АКТИ УМ МНН перо зо В Ю но оЕКОЇ У овІЕТ КЕЗЕРН КА АНАТКРЕК ТОКМАК СМ УМО С ТОННА м ЗЕ Ю що А й ання я ке ЕекуАНИ КА ЧУ ЕТТОНАМ МН сво шарі КЕ КК тю Зоб коня 0 ВЕК Дам ВАН Р ЕНАТКЕВА ОКУКАККОСУ М СТКНКАер я ЖЕ оно БО о Мотя 0 САНУ ДМ кВА ОК УЕНАТКЕВЕ ТЕНМАНККОЄМ СН С ТМННАЕОНАСКЕ 2 «ро МО СВКО, УМНОМУСЮВІЕ: БЕРН ГРАНАТОЮ ПЕРУНА СМ УАОВСТОНК АРІ 28 ЧО Ю Ноше підр кееЕЕлЕЯ 3 фтор УагВ НАСТІ окЕ сво й б не с х й Ів ті ЕНАТКЕ ВЕ ТИНУ КВ С ТУКА тво о б Моз СЕРА СМС ЕЧ ЕМО ЯКВНІ ЗЕ ЕНАТВ ПЕТСНувакк ють МИ СТАНИ 2 зорю два я Кк о ужнмо мим то ОО ДЕ КО СА ОО Ком З ТЕНТ В ОНИ Я ОВК ЖЕ ВОК: 5 В В МАСОК ем УК АПВ ВОК СВНЕМАТЬ це ЗДО ВОЗ, 0 ВАСКО СТАВ ДЕК ЕНАТКУ ДЕТЕКУКАККОС А УВК ТЬНАЄ МАЮ З 4 сою фо мире ни ДЕ ТЕЕМАНККОСМ УНК МНЕ АУРОМНСКИ 28о БОЮ момУ 0 СЕВАЛСНДИВЕ МАЕ НРУ КАТКЕОК СХ ПАНИ НОМ ГТ ІЬННАМСВУ МОНЕ ОВО оо жоче 0 НК ЕНАНОЮ ДМ Е КТК сАнкКОМ. МЕ ПТМНАМАВИАЄКЕ 280 ФО В во? АНА МО ОК ВМТ АЕН Я іх МЕВЕТЕКУКАККОВИ УКВ ТМ вушні Вени БОБ ноя 0 ВААС ОМВК ЕЕ НАТО ДЕТСКМННККОМ-я кі пн КЕ хо Зо Ю ноча РА уж є кі Зк ші я вк зу ще о кін Як х мне; тіНАлу жи зва ооною ПМ ЕК ня А пн МАВ зво КО Ю Моз й Кер мс вн нини пні» і зво 5 ШІ КЗ; СЕКА ке КІСБМЕВАСЕ ОР ОТ НА А ЕНН УТА ЧР Ж пиши мл т ки Ед Бі шу З То КЕ, Й пев в А 3. г В щ Кі : Коневвоую ВАД ВЕ С ен па МК ожобйоою: 280
Фіг. БЕ
ЗРО В НО Ех ТКИССУНАЯК 295 ЗО Б ши Ко їй ре 75 БО Ю Мою КИНЕ СА 26 БО вже 00 Кб ТАТУ УКИХ, 295 ЗО В ОА ОК М ик а Зою о 0 ОТТО з БОЮ Мошо 0 КМАГТИМЯРАН, оо ЗБОЮ МО 0 ВеЛюГТУАВЮЯ 295 ЗО Ю Ноов 0 КЛКГСЮКАК 285 БО ВО МОХИ КОЛЕГА Х У КО мое КУ ЕАТТУАОВКРЕН, 295 ЗО 0 МО, 0 ВИ ТАЛМАСЮЮТЯ 295 ЗБОЮ мома 0 КЛИН РИ 295 БЕ Ю Мо КИ яПТИВЯ 2 «ФО Ю МБ КОЛЕ Що ЕК т 295 ЗО В ЩО? КУП ТУАООМЯИ 295 єго б мож 0 КУКА 295 ЗБОЮ номо 0 БОЛЮЕГТУЄЮКАВЯ 295 ЗО МоБО 0 КИ ТАГМАТЮ КР 295 ЗО ДЮ МО КІВ цена Ка БО в ном» 0 ВКМ 295 Консвноує ВЕС НК зо
Фіг. 5Д
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462064343P | 2014-10-15 | 2014-10-15 | |
| PCT/US2015/053123 WO2016060843A1 (en) | 2014-10-15 | 2015-09-30 | Herbicide tolerance genes and methods of use thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA125280C2 true UA125280C2 (uk) | 2022-02-16 |
Family
ID=55747123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201704604A UA125280C2 (uk) | 2014-10-15 | 2015-09-30 | Ген стійкості до гербіцидів і спосіб його застосування |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US10023874B2 (uk) |
| EP (2) | EP3206481B1 (uk) |
| JP (2) | JP6938373B2 (uk) |
| KR (1) | KR102450075B1 (uk) |
| CN (2) | CN113528473A (uk) |
| AP (1) | AP2017009831A0 (uk) |
| AR (2) | AR102137A1 (uk) |
| AU (1) | AU2015333935B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017006910A2 (uk) |
| CA (1) | CA2963122A1 (uk) |
| CL (3) | CL2017000894A1 (uk) |
| CO (1) | CO2017003474A2 (uk) |
| DK (1) | DK3837970T3 (uk) |
| EA (1) | EA035528B1 (uk) |
| EC (1) | ECSP17022171A (uk) |
| ES (2) | ES2956861T3 (uk) |
| HR (1) | HRP20220569T1 (uk) |
| HU (1) | HUE058705T2 (uk) |
| MX (1) | MX368974B (uk) |
| PE (2) | PE20220012A1 (uk) |
| PH (1) | PH12017500695A1 (uk) |
| PL (1) | PL3206481T3 (uk) |
| PT (2) | PT3837970T (uk) |
| RS (1) | RS63232B1 (uk) |
| UA (1) | UA125280C2 (uk) |
| UY (1) | UY36337A (uk) |
| WO (1) | WO2016060843A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201701967B (uk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI2319932T2 (sl) * | 2004-04-30 | 2017-02-28 | Dow Agrosciences Llc | Nov gen z rezistenco na herbicide |
| PL1947926T3 (pl) | 2005-10-28 | 2015-08-31 | Dow Agrosciences Llc | Nowe geny odporności na herbicydy |
| EP3206481B1 (en) * | 2014-10-15 | 2022-03-09 | Monsanto Technology LLC | Herbicide tolerance genes and methods of use thereof |
| UA124660C2 (uk) | 2018-02-02 | 2021-10-20 | Монсанто Текнолоджі Елелсі | Об'єкт кукурудзи mon87429 і спосіб його використання |
| CN116694654A (zh) * | 2022-02-25 | 2023-09-05 | 青岛清原种子科学有限公司 | 除草剂耐受性基因及其使用方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR006928A1 (es) | 1996-05-01 | 1999-09-29 | Pioneer Hi Bred Int | Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas. |
| CN1360634A (zh) * | 1999-04-29 | 2002-07-24 | 辛甄塔有限公司 | 抗除草剂植物 |
| US6252148B1 (en) | 1999-12-06 | 2001-06-26 | Holden's Foundation Seeds Llc | Inbred corn line LH244 |
| BRPI0100752B1 (pt) | 2000-06-22 | 2015-10-13 | Monsanto Co | moléculas e pares de moléculas de dna, processos para detectar molécula de dna e para criar um traço tolerante a glifosato em plantas de milho, bem como kit de detecção de dna |
| SI2319932T2 (sl) * | 2004-04-30 | 2017-02-28 | Dow Agrosciences Llc | Nov gen z rezistenco na herbicide |
| EP2021476B1 (en) | 2006-05-26 | 2014-07-09 | Monsanto Technology, LLC | Corn plant and seed corresponding to transgenic event mon89034 and methods for detection and use thereof |
| US7700846B2 (en) | 2008-05-07 | 2010-04-20 | Monsanto Technology Llc | Soybean variety D5245143 |
| WO2011022470A1 (en) * | 2009-08-19 | 2011-02-24 | Dow Agrosciences Llc | Control of aad-1 monocot volunteers in fields of dicot crops |
| CN102573452B (zh) * | 2009-08-19 | 2015-07-22 | 陶氏益农公司 | Aad-1事件das-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定 |
| US8598413B2 (en) | 2009-08-19 | 2013-12-03 | Dow AgroSciecnes, LLC. | AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines, event-specific identification thereof, and methods of weed control involving AAD-1 |
| US8993837B2 (en) * | 2010-08-13 | 2015-03-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Chimeric promoters and methods of use |
| UY34014A (es) | 2011-04-15 | 2012-11-30 | Dow Agrosciences Llc | Genes sintéticos para expresar proteínas en células de maíz, construcciones, plantas transgénicas, métodos para controlar pestes y composiciones |
| US9540654B2 (en) | 2012-02-01 | 2017-01-10 | Dow Agrosciences Llc | Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides |
| EP3206481B1 (en) * | 2014-10-15 | 2022-03-09 | Monsanto Technology LLC | Herbicide tolerance genes and methods of use thereof |
-
2015
- 2015-09-30 EP EP15850754.1A patent/EP3206481B1/en active Active
- 2015-09-30 UA UAA201704604A patent/UA125280C2/uk unknown
- 2015-09-30 KR KR1020177012639A patent/KR102450075B1/ko active IP Right Grant
- 2015-09-30 WO PCT/US2015/053123 patent/WO2016060843A1/en active Application Filing
- 2015-09-30 EP EP20211532.5A patent/EP3837970B1/en active Active
- 2015-09-30 UY UY0001036337A patent/UY36337A/es active IP Right Grant
- 2015-09-30 AR ARP150103154A patent/AR102137A1/es unknown
- 2015-09-30 AU AU2015333935A patent/AU2015333935B2/en active Active
- 2015-09-30 ES ES20211532T patent/ES2956861T3/es active Active
- 2015-09-30 PE PE2021002214A patent/PE20220012A1/es unknown
- 2015-09-30 HU HUE15850754A patent/HUE058705T2/hu unknown
- 2015-09-30 MX MX2017004926A patent/MX368974B/es active IP Right Grant
- 2015-09-30 US US14/871,768 patent/US10023874B2/en active Active
- 2015-09-30 ES ES15850754T patent/ES2914178T3/es active Active
- 2015-09-30 PT PT202115325T patent/PT3837970T/pt unknown
- 2015-09-30 EA EA201790841A patent/EA035528B1/ru unknown
- 2015-09-30 HR HRP20220569TT patent/HRP20220569T1/hr unknown
- 2015-09-30 AP AP2017009831A patent/AP2017009831A0/en unknown
- 2015-09-30 PL PL15850754.1T patent/PL3206481T3/pl unknown
- 2015-09-30 CA CA2963122A patent/CA2963122A1/en active Pending
- 2015-09-30 CN CN202110790369.7A patent/CN113528473A/zh active Pending
- 2015-09-30 RS RS20220485A patent/RS63232B1/sr unknown
- 2015-09-30 DK DK20211532.5T patent/DK3837970T3/da active
- 2015-09-30 BR BR112017006910A patent/BR112017006910A2/pt active IP Right Grant
- 2015-09-30 CN CN201580055796.3A patent/CN106793761B/zh active Active
- 2015-09-30 PT PT158507541T patent/PT3206481T/pt unknown
- 2015-09-30 JP JP2017519668A patent/JP6938373B2/ja active Active
- 2015-09-30 PE PE2017000606A patent/PE20170941A1/es unknown
-
2017
- 2017-03-22 ZA ZA2017/01967A patent/ZA201701967B/en unknown
- 2017-04-10 CO CONC2017/0003474A patent/CO2017003474A2/es unknown
- 2017-04-11 EC ECIEPI201722171A patent/ECSP17022171A/es unknown
- 2017-04-11 CL CL2017000894A patent/CL2017000894A1/es unknown
- 2017-04-11 PH PH12017500695A patent/PH12017500695A1/en unknown
-
2018
- 2018-06-22 US US16/016,364 patent/US10900050B2/en active Active
- 2018-08-23 CL CL2018002407A patent/CL2018002407A1/es unknown
- 2018-08-23 CL CL2018002406A patent/CL2018002406A1/es unknown
-
2020
- 2020-09-28 AR ARP200102685A patent/AR120102A2/es unknown
-
2021
- 2021-01-15 US US17/150,604 patent/US11655480B2/en active Active
- 2021-06-08 JP JP2021096096A patent/JP7295163B2/ja active Active
-
2023
- 2023-04-14 US US18/301,106 patent/US20230416773A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7344933B2 (ja) | 植物における除草剤耐容性のための方法及び組成物 | |
| US11319551B2 (en) | Methods and compositions for PPO herbicide tolerance in plants | |
| ES2743420T3 (es) | Plantas de arroz que tienen tolerancia incrementada frente a herbicidas de imidazolinona | |
| TR201816453T4 (tr) | İmidazolinon herbisitlerine karşi direnci arttirilmiş buğday bitkileri. | |
| UA125280C2 (uk) | Ген стійкості до гербіцидів і спосіб його застосування | |
| UA120741C2 (uk) | Рослина з мутованою протопорфіриногеноксидазою | |
| UA121371C2 (uk) | Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу | |
| CN103266118B (zh) | 一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用 | |
| WO2023160362A1 (zh) | 除草剂耐受性基因及其使用方法 | |
| RU2797237C2 (ru) | Способы и композиции для ppo-гербицидной толерантности |