EA031471B1 - Антитела, направленные на m-csf - Google Patents

Abstract

Данное раскрытие, в общем, относится к антителам или фрагментам антител, которые специфически связываются с M-CSF. В частности, раскрыты антитела и фрагменты антител, которые связываются с M-CSF и которые предотвращают связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC, составляющей 10 пМ или менее. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, векторам и клеткам-хозяевам, способным экспрессировать антитела данного изобретения или их фрагменты, фармацевтическим композициям, содержащим антитела или их фрагменты, и применениям указанных антител или их фрагментов и композиций для лечения определенных заболеваний.

Description

Настоящее изобретение предлагает новые антитела и фрагменты антител, которые превосходят по своим качествам антитела к M-CSF, известные в области техники. В частности, антитела и фрагменты антител настоящего изобретения специфически связываются с M-CSF и предотвращают связывание MCSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, равной 10 пМ или менее, в количественном анализе ингибирования связывания рецептора, при этом конечная концентрация M-CSF при анализе составляла 12,5 пМ. Кроме того, данные антитела проявляют функциональные свойства, которые весьма желательны для клинической разработки и которые до этого не наблюдались.

Краткое описание изобретения

Настоящее раскрытие предлагает антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с человеческим M-CSF. Настоящее раскрытие также предлагает антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с человеческим M-CSF с определенным(ой) сродством (аффинностью), например сродством, равным 30 пМ или менее. Настоящее раскрытие также предлагает антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с M-CSF и которые предотвращают связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, равной 10 пМ или менее. Настоящее раскрытие также предлагает антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с M-CSF, и где указанное антитело или фрагмент антитела способен предотвращать связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC50, равной 10 пМ или менее в количественном анализе ингибирования связывания рецептора, при этом конечная концентрация M-CSF при анализе составляла 12,5 пМ.

Настоящее раскрытие также предлагает специфические антитела или фрагменты антител, как определено аминокислотными последовательностями шести CDR областей. Настоящее раскрытие также предлагает специфические антитела или фрагменты антител, как определено аминокислотными последовательностями вариабельной тяжелой цепи и вариабельной легкой цепи.

Настоящее раскрытие также предлагает специфические антитела или фрагменты антител, которые конкурируют со специфическими антителами или фрагментами антител, раскрываемыми здесь. Настоящее раскрытие также предлагает специфические антитела или фрагменты антител, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и специфические антитела или фрагменты антител, раскрываемые здесь.

Настоящее раскрытие также предлагает применение выделенного антитела или фрагмента антитела настоящего изобретения в медицине.

Настоящее раскрытие также предлагает способы лечения пациентов, страдающих от расстройства, такого как воспалительное заболевание, путем введения указанному пациенту эффективного количества антител или фрагментов антител настоящего изобретения.

Настоящее раскрытие также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую выделенное антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее раскрытие также предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения.

Настоящее раскрытие также предлагает вектор, включающий нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или фрагмент антитела настоящего изобретения.

Настоящее раскрытие также предлагает клетку-хозяин, содержащую вектор или нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела или фрагмент антитела настоящего изобретения.

На чертеже продемонстрирована способность M-CSF-специфических антител настоящего изобретения блокировать биологическую активность мембраносвязанной изоформы M-CSF при количественном анализе, в котором пролиферацию клеток М-NFS-60 индуцировали, используя клетки СНО, стабильно экспрессирующие человеческий мембраносвязанный M-CSF. С повышением концентрации антител все M-CSF-специфичные иммуноглобулины эффективно ингибируют пролиферацию. В отличие от

- 1 031471 этого, MOR03207, которое специфично против лизоцима, не смогло остановить пролиферацию.

Подробное описание

Термин выделенный относится к соединению, которое в основном не содержит других клеточных материалов и/или химикатов. Если такое соединение представляет собой антитело или фрагмент антитела, то термин выделенный относится к антителу или фрагменту антитела, которое также не смешано с другими антителами или частицами антигенов, имеющими другие антигенные специфичности.

Термин антитело в данном контексте включает целые антитела. Встречающееся в природе антитело представляет собой белок, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (в сокращенном виде здесь обозначается как VH) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из определенных СН доменов (например, СН1, СН2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (в сокращенном виде здесь обозначается как VL) и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена CL. Участки VH и VL можно далее подразделить на участки гипервариабельности, называемые гипервариабельными участками (CDR), перемежающиеся с участками, которые являются более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждый из VH и VL составлен из трех CDR и четырех FR, размещенных в направлении от аминного конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Константные участки антител могут служить посредниками при связывании иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Антитела могут быть любого изотипа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), подкласса или представлять собой их модифицированный вариант (например, IgG1 LALA). Антитела могут происходить от любых видов, быть химерными, гуманизированными или человеческими.

Термины вариабельный участок тяжелой цепи CDR1 и H-CDR1 используются взаимозаменяемо, также как и термины вариабельный участок тяжелой цепи CDR2 и H-CDR2, термины вариабельный участок тяжелой цепи CDR3 и H-CDR3, термины вариабельный участок легкой цепи CDR1 и L-CDR1; термины вариабельный участок легкой цепи CDR2 и L-CDR2 и термины вариабельный участок легкой цепи CDR3 и L-CDR3 фрагмента антитела.

Связывание антигена может происходить посредством фрагментов, фрагментов антитела, антигенсвязывающих фрагментов интактного антитела. В данном документе оба термина используются взаимозаменяемо. Примеры связывающих фрагментов антитела, охватываемых термином фрагмент антитела, включают фрагмент Fab - одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; фрагмент F(ab)₂ - двухвалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком на шарнирном участке; фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; фрагмент (dAb) антитела с единичным доменом (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; и выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR).

Фрагмент одинарной цепи (scFv) представляет собой одну белковую цепочку, в которой участки VL и VH спариваются с образованием одновалентной молекулы (известную как одинарная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Несмотря на то, что два домена VL и VH кодируются разными генами, их можно объединять, используя рекомбинантные способы, с помощью искусственного пептидного линкера, который позволяет им превращаться в одну белковую цепочку. Такие одноцепочечные антитела включают один или несколько связывающих антиген фрагментов. Эти фрагменты антител получают, используя традиционные методики, известные специалистам в данной области, и фрагменты проверяют с точки зрения их полезности так же, как и интактные антитела. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предоставляет фрагменты антител, где указанный фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из Fab, F(ab₂)', F(ab)₂' и scFV.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает антитела или фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела является биспецифическим. В некоторых аспектах антитело или фрагмент антитела представляет собой биспецифический каркас, полученный из антитела, где указанный биспецифический каркас, полученный из антитела, выбирают из группы, состоящей из биспецифического scFv - четырехвалентного биспецифического антитела, перекрестно-связанного Fab или биспецифического IgG.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает антитело или фрагмент антитела, где указанное антитело или фрагмент антитела выбирают из группы, состоящей из антител с единичными доменами, максител, минител, интрател, диател, триател, тетрател, v-NAR, антител верблюда, анкиринов, доменных антител, липокалинов, малых модульных иммуно-фармацевтических препаратов, максител, белка А и аффилинов.

Термин моноклональное антитело, как используется в данном контексте, относится к получению молекул антитела одного молекулярного состава. Состав моноклонального антитела демонстрирует уни

- 2 031471 кальный сайт связывания, имеющий уникальную специфичность связывания и сродство (аффинность) к определенным эпитопам. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает моноклональные антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с M-CSF. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает поликлональные антитела или фрагменты антител, которые специфически связываются с M-CSF.

В некотором аспекте данное раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое перекрестно реагирует с M-CSF макака-крабоеда. В некотором аспекте данное раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое перекрестно реагирует с M-CSF мыши. В некотором аспекте данное раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое перекрестно реагирует с M-CSF крысы. В некотором аспекте данное раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое перекрестно реагирует с M-CSF макака-крабоеда, и/или мыши, и/или крысы.

Предполагается, что термин человеческое антитело, как используется в данном контексте, включает антитела, имеющие вариабельные участки, на которых как каркасные, так и CDR участки происходят из последовательностей, имеющих человеческую природу. В данном контексте человеческое антитело включает вариабельные участки тяжелой или легкой цепи или полноразмерные тяжелые или легкие цепи. В определенных случаях по своей аминокислотной последовательности человеческое антитело может быть по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, или по меньшей мере на 95%, или даже по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентично аминокислотной последовательности, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Таким образом, указанное человеческое антитело можно получать, основываясь на технологических платформах, которые включают антитела, полученные из генов зародышевой линии человека, либо полученных ПЦР-амплификацией VH/VL репертуара выделенного из В-клеток, либо созданных путем синтеза. Технологические платформы включают подходы, основанные на библиотеках, включающих гены иммуноглобулина человека, представленные на фагах, рибосомах или дрожжах. Соответствующие технологии представления стандартно используются в научном сообществе. Кроме того, иммунизация трансгенной мыши, несущей в себе репертуар человеческого иммуноглобулина, представляет собой другой подход для создания человеческих антител к антигену, представляющему интерес. Антитела или их фрагменты, выбранные из библиотеки антител, основанной на концепции MorphoSys HuCAL® (Knappik et al., (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86), считаются полностью человеческими.

Гуманизированное антитело представляет собой антитело, которое сохраняет реакционную способность нечеловеческого антитела, но в то же время вызывает меньшую иммунную реакцию у людей. Этого можно добиться, например, путем сохранения нечеловеческих CDR участков и замены оставшихся частей антитела их человеческими аналогами (а именно, константного участка, а также каркасной части вариабельного участка). См., например, Morrison et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855; Morrison and Oi (1988) Adv. Immunol., 44:65-92; Verhoeyen et al. (1988) Science, 239:1534-1536; Padlan, Molec (1991) Immun., 28:489-498; и Padlan, Molec (1994) Immun., 31:169-217. Другие примеры технологий человеческого конструирования включают, но не ограничиваются этим, технологию Xoma, раскрытую в публикации US 5766886.

Термин химерное антитело представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константный участок или его часть изменен, заменен или замещен таким образом, чтобы антигенсвязывающий сайт (вариабельный участок) был соединен с константным участком другого или измененного класса, эффекторной функциональной группы и/или вида, или совершенно другой молекулой, которая придает новые свойства химерному антителу, например, ферментом, гормоном, фактором роста, лекарством и т.п.; или (b) вариабельный участок или его часть изменен, заменен или замещен вариабельным участком, имеющим другую или измененную специфичность к антигену. Например, мышиный антиген может быть модифицирован путем замены его константного участка на константный участок из человеческого иммуноглобулина. Благодаря замене на человеческий константный участок химерное антитело может сохранять свою специфичность в отношении распознавания антигена, но при этом иметь сниженные антигенные свойства в человеке по сравнению с исходным мышиным антителом.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает человеческие антитела и фрагменты антител, которые специфически связываются с M-CSF. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает гуманизированные антитела и фрагменты антител, которые специфически связываются с M-CSF. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает химерные антитела и фрагменты антител, которые специфически связываются с M-CSF. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает антитела, содержащие константный участок человеческой тяжелой цепи и константный участок человеческой легкой цепи.

Термин изотип относится к классу антител (например, IgM, IgE, IgG, такому как IgG1 или IgG4), обусловленному генами константного участка тяжелой цепи. Изотип также включает модифицированные версии одного из этих классов, где модификации были произведены с целью изменить функцию Fcучастка, например, для усиления или снижения эффекторной функции или связывания с Fc-рецепторами. Например, IgG1 LALA представляет собой модифицированную версию IgG изотипа, имеющую значительно сниженные эффекторные функции. Определенные замены аминокислот снижают сродство связы

- 3 031471 вания с Fc yRl-рецеитором по сравнению с этими свойствами неизмененного антитела. IgG1 LALA описано в публикации патентной заявки США № 08/479752 (SCOTGEN BIOPHARMACEUTICALS INC.), которая включена сюда во всей своей полноте ссылкой. В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия антигенсвязывающие частицы представляют собой антитела и относятся к типу IgG, IgM, IgA, IGE или IgD. В конкретных вариантах осуществления антитела относятся к типу IgG. В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия антитела относятся к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В конкретных вариантах осуществления антитела относятся к подтипу IgG1 или IgG4. В других конкретных вариантах осуществления антитела относятся к подтипу IgG1 или IgG1 LALA.

В определенных конкретных вариантах осуществления настоящего раскрытия антитела относятся к молчащему изотипу. Термин молчащий изотип относится к любому иммуноглобулину с пониженной эффекторной функцией. Поэтому в определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия антитело относится к подтипу IgG1, который имеет эффекторную функцию, которая снижена по сравнению с подтипом IgG1 дикого типа. Определенные мутации особенно пригодны для придания пониженной эффекторной функции. Например, подтип IgG1 LALA представляет собой типичный молчащий изотип. С антителами настоящего раскрытия также можно использовать другие молчащие варианты изотипа IgG1. Одним особенно предпочтительным примером является изотип IgG1, в котором находится мутация D265A. В этом варианте IgG1 аминокислота - аспарагиновая кислота в положении 265 (нумерация в соответствии с указателем ЕС; см. http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html) заменена на остаток аланина. Поэтому в некоторых аспектах антитела настоящего раскрытия представляют собой антитела молчащего подтипа IgG1. В альтернативном аспекте антитела настоящего раскрытия представляют собой антитела мутантного подтипа IgG1, которые имеют сниженную эффекторную функцию по сравнению с подтипом IgG1 дикого типа. В альтернативном аспекте антитела настоящего раскрытия представляют собой антитела подтипа IgG1, которые несут в себе мутацию D265A. В альтернативном аспекте антитела настоящего раскрытия представляют собой антитела подтипа IgG1, где аспарагиновая кислота в положении 265 заменена на остаток аланина. В альтернативном аспекте антитела настоящего раскрытия представляют собой антитела, в которых аспарагиновая кислота в положении 265 (нумерация в соответствии с указателем ЕС) заменена на остаток аланина. Подтипы IgG2 и IgG4 также известны как молчащие изотипы.

Термин сродство (аффинность) в данном контексте относится к силе взаимодействия между антигенсвязывающей частицей, как, например, моноклональным антителом, и антигеном в одной области антигенной детерминанты. В пределах каждой области антигенной детерминанты вариабельный участок плеча антигена взаимодействует с антигеном в многочисленных сайтах посредством слабых нековалентных сил; чем больше взаимодействий, тем сильнее сродство.

Термин специфически/специфично связывает(ся) [c] антиген[антигеном] относится к реакции связывания, которую можно обнаружить в присутствии антигена в неоднородной популяции белков и других биологических соединений. Поэтому фразы распознающее антиген и специфичный для(к) антигена(у) используются взаимозаменяемо в данном документе с термином специфично связывается с антигеном. Специфическое связывание антигенсвязывающей частицы, как, например, моноклонального антитела, с антигеном можно обнаружить с помощью различных установившихся способов, известных в области техники и включающих ИФА (ELISA), FACS, вестерн-блот-анализ, иммуноблот-анализ, MSDанализ, BIAcore и SET. В настоящем раскрытии предполагается, что антигенсвязывающая частица является специфичной для антигена, если антигенсвязывающая частица проявляет способность к связыванию к специфичному антителу по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз выше, чем фон. Поэтому фон определяется как антигенсвязывающая частица, о которой известно, что она не обладает специфичностью в отношении выбранных антигенов, или сравнением со связыванием с безотносительным антигеном. Антигеном для предложенных антител или фрагментов антител настоящего изобретения является M-CSF.

Полноразмерный предшественник человеческого M-CSF (также известный как CSF-1 или макрофагальный колониестимулирующий фактор) имеет в длину 554 аминокислот. Аминокислотная последовательность предшественника человеческого M-CSF показана в SEQ ID NO: 1 (источник: Uniprot, человеческий M-CSF P09603).

SEQ ID NO: 1 (полноразмерный предшественник человеческого M-CSF):

- 4 031471

MTAPGAAGRCPPTTWLGSLLLLVCLLASRSITEEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDS

QMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQEL

SLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCN

NSFAECSSQDVVTKPDCNCLYPKAIPSSDPASVSPHQPLAPSMAPVAGLTWEDSEG

TEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPRSTCQSFEPPETPVVKDSTIGGSPQPRPSV

GAFNPGMEDILDSAMGTNWVPEEASGEASEIPVPQGTELSPSRPGGGSMQTEPAR

PSNFLSASSPLPASAKGQQPADVTGTALPRVGPVRPTGQDWNHTPQKTDHPSALL

RDPPEPGSPRISSLRPQGLSNPSTLSAQPQLSRSHSSGSVLPLGELEGRRSTRDRR

SPAEPEGGPASEGAARPLPRFNSVPLTDTGHERQSEGSFSPQLQESVFHLLVPSVIL

VLLAVGGLLFYRWRRRSHQEPQRADSPLEQPEGSPLTQDDRQVELPV

Три разные внеклеточные изоформы M-CSF экспрессируются вследствие сплайсинга и посттрансляционных модификаций: секретированный гликозилированный M-CSF (sgM-CSF), секретированный протеогликан M-CSF (spM-CSF) и поверхностно-клеточный M-CSF (csM-CSF).

Особенно преобладающей изоформой в человеческой сыворотке является sgM-CSF, который образуется путем расщепления предшественника M-CSF в положении 255. Аминокислотная последовательность человеческого sgM-CSF показана в SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2 (человеческий секретированный гликозилированный M-CSF (фрагмент 33-255 последовательности SEQ 1)):

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLV

QDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLE

KVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDWTKPDCNCLYPKAIPSSDPAS

VSPHQPLAPSMAPVAGLTWEDSEGTEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPR

Человеческий секретированный протеогликан M-CSF имеет в длину 456 аминокислот. Аминокислотная последовательность spM-CSF показана в SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 3 (человеческий секретированный протеогликан M-CSF):

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLV

QDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLE KVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDWTKPDCNCLYPKAIPSSDPAS

VSPHQPLAPSMAPVAGLTWEDSEGTEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPRSTCQ

SFEPPETPVVKDSTIGGSPQPRPSVGAFNPGMEDILDSAMGTNWVPEEASGEASEI

PVPQGTELSPSRPGGGSMQTEPARPSNFLSASSPLPASAKGQQPADVTGTALPRV

GPVRPTGQDWNHTPQKTDHPSALLRDPPEPGSPRISSLRPQGLSNPSTLSAQPQLS

RSHSSGSVLPLGELEGRRSTRDRRSPAEPEGGPASEGAARPLPRFNSVPLTDTGH

ERQSEGS

Человеческий поверхностноклеточный M-CSF образуется путем альтернативного сплайсинга и имеет в длину 256 аминокислот. Аминокислотная последовательность csM-CSF показана в SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 4 (человеческий поверхностноклеточный M-CSF):

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMED

TMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNL

LDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQGHERQSEGSSSPQLQESVFHLLVPSVILVLLAVGGLLFYR

WRRRSHQEPQRADSPLEQPEGSPLTQDDRQVELPV

Все 3 изоформы M-CSF могут связываться с рецептором M-CSF и являются биологически активными. Общей чертой трех изоформ является N-концевой связывающийся с рецептором домен (rbdMCSF), аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 5 (человеческий связывающийся с рецептором домен M-CSF (фрагмент 33-190)):

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLV

QDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLE

KVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDVVTKPDCN

Антитела и фрагменты антител настоящего изобретения также связываются с М-CSF макаковкрабоедов (Масаса fascicularis), которых часто используют в лабораторной практике при проведении доклинических исследований. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих секретируемый гликопротеин M-CSF макака-крабоеда, клонировали с использованием стандартной методики ПЦР из цДНК макакакрабоеда, приготовленной из тканей молочной железы или поджелудочной железы. Последовательность sgM-CSF макака-крабоеда показана в SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 6 (sgM-CSF макака-крабоеда):

- 5 031471

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSCQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLV QDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLE KVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDWTKPDCNCLYPKAIPSSDPAS VSPHQPLAPSMAPMAGLTWDDSEGTEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPR

Рецептор человеческого M-CSF (также известный как M-CSFR или CSF1R) имеет в длину 972 аминокислот. Аминокислотная последовательность человеческого M-CSFR показана в SEQ ID NO: 7 (источник: Uniprot, человеческий M-CSFR P07333).

SEQ ID NO: 7 (человеческий M-CSFR): MGPGVLLLLLVATAWHGQGIPVIEPSVPELVVKPGATVTLRCVGNGSVEWDGPPSP

HWTLYSDGSSSILSTNNATFQNTGTYRCTEPGDPLGGSAAIHLYVKDPARPWNVLA QEVWFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRVRGRPLMRHTNYSFSPWHGFTIHRAK FIQSQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQKVIPGPPALTLVPAELVRIRGEAAQIVCSA SSVDVNFDVFLQHNNTKLAIPQQSDFHNNRYQKVLTLNLDQVDFQHAGNYSCVASN VQGKHSTSMFFRVVESAYLNLSSEQNLIQEVTVGEGLNLKVMVEAYPGLQGFNWTY LGPFSDHQPEPKLANATTKDTYRHTFTLSLPRLKPSEAGRYSFLARNPGGWRALTF ELTLRYPPEVSVIWTFINGSGTLLCAASGYPQPNVTWLQCSGHTDRCDEAQVLQVW DDPYPEVLSQEPFHKVTVQSLLTVETLEHNQTYECRAHNSVGSGSWAFIPISAGAHT HPPDEFLFTPWVACMSIMALLLLLLLLLLYKYKQKPKYQVRWKIIESYEGNSYTFIDP TQLPYNEKWEFPRNNLQFGKTLGAGAFGKWEATAFGLGKEDAVLKVAVKMLKSTA HADEKEALMSELKIMSHLGQHENIVNLLGACTHGGPVLVITEYCCYGDLLNFLRRKA EAMLGPSLSPGQDPEGGVDYKNIHLEKKYVRRDSGFSSQGVDTYVEMRPVSTSSN DSFSEQDLDKEDGRPLELRDLLHFSSQVAQGMAFLASKNCIHRDVAARNVLLTNGH VAKIGDFGLARDIMNDSNYIVKGNARLPVKWMAPESIFDCVYTVQSDVWSYGILLWE IFSLGLNPYPGILVNSKFYKLVKDGYQMAQPAFAPKNIYSIMQACWALEPTHRPTFQ QICSFLQEQAQEDRRERDYTNLPSSSRSGGSGSSSSELEEESSSEHLTCCEQGDIA QPLLQPNNYQFC

Антитела и фрагменты антител настоящего изобретения также предотвращают связывание M-CSF макака-крабоеда с рецептором M-CSF макака-крабоеда.

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на человеческий M-CSF или специфически связывается с ним. В альтернативных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на или специфически связывается с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 1.

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на M-CSF макака-крабоеда или специфически связывается с ним. В альтернативных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на или специфически связывается с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 6.

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на человеческий M-CSF или специфически связывается с ним, и которое предотвращает связывание человеческого M-CSF с рецептором человеческого M-CSF. В альтернативных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на или специфически связывается с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 1, и которое предотвращает связывание полипептида, кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 1, с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 7.

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на M-CSF макака-крабоеда или специфически связывается с ним, и которое предотвращает связывание M-CSF макака-крабоеда с рецептором M-CSF макака-крабоеда. В альтернативных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на или специфически связывается с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 6 и которое предотвращает связывание полипептида, кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 6, с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 7. В альтернативных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое направлено на или специфически связывается с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 6 и которое предотвращает связывание полипептида, кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 6, с рецептором M-CSF макака-крабоеда.

- 6 031471

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое связывается с секретированным гликозилированным M-CSF, секретированным протеогликаном M-CSF и поверхностно-клеточным M-CSF. В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое связывается со всеми изоформами человеческого М-CSF. В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое связывается с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2, с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 3, и с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 4.

В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое связывается с N-концевым связывающимся с рецептором доменом M-CSF. В определенных аспектах настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или фрагменту антитела, которое связывается с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 5.

Термины полипептид и белок здесь используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру из аминокислотных остатков. Данные термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также к встречающимся в природе аминокислотным полимерам и неприродному аминокислотному полимеру. Если не указано иное, определенная полипептидная последовательность также косвенно охватывает его консервативно модифицированные варианты.

Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо с термином полинуклеотид и относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в либо однонитчатой, либо двунитчатой форме. Термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки основной цепи или связи, которые являются синтетическими, природными и не встречающимися в природе, которые обладают связывающими свойствами, сходными со свойствами эталонной нуклеиновой кислоты, и которые метаболизируются аналогично эталонным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, без ограничения, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 1-О-метилрибонуклеотиды, пептидонуклеиновые кислоты (ПНК или PNA). Если не указано иное, определенная последовательность нуклеиновой кислоты также косвенно охватывает их консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденного кодона) и комплементарные последовательности, а также явно указанную последовательность. В частности, как подробно описано ниже, замены вырожденного кодона можно осуществлять путем вырождения последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов замещается на остатки из смешанных оснований и/или дезоксиинозина (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; и Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения, которые специфически связываются с M-CSF. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела, приведенного в табл. 1. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела, приведенного в табл. 2.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения, которые специфически связываются с M-CSF. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела, приведенного в табл. 1. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела, приведенного в табл. 2.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает клетку-хозяин, содержащую вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения. В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает клетку-хозяин, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения.

Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) относится к клетке, в которую введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что такие термины предназначены обозначать не только определенную клетку-субъект, но и потомство от такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомственное производное фактически может быть неидентичным родительской клетке, но по-прежнему подпадать под определение клетки-хозяин в данном контексте.

Термин вектор относится к молекуле полинуклеотида, способной транспортировать другой полинуклеотид, к которому она присоединена. Один тип вектора представляет собой плазмиду, что означает круглую петлю из двунитчатой ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Определенные векторы способны к автономной репликации в клеткехозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное начало репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы

- 7 031471 млекопитающих) могут встраиваться в геном клетки-хозяин при введении в клетку-хозяин и, таким образом, реплицируются совместно с геномом хозяина. Кроме того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначают в настоящем описании как рекомбинантные векторы экспрессии (или просто векторы экспрессии). Как правило, векторы экспрессии для применения в способах рекомбинантных ДНК часто имеют форму плазмид. В настоящем описании плазмида и вектор могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее широко применяемую форму вектора. Однако предполагается, что данное раскрытие включает такие другие формы векторов экспрессии, как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы).

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагмент антитела, который специфически связывается с M-CSF и который предотвращает связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, равной 10 пМ или менее. В другом аспекте указанные выделенные антитела или фрагмент антитела предотвращает связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, равной 20 пМ или менее, IC₅₀, равной 5,5 пМ или менее, или IC₅₀, равной 5 пМ или менее.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF, и где указанное антитело или фрагмент антитела способно предотвращать связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, равной 10 пМ или менее, в количественном анализе ингибирования связывания рецептора, при этом конечная концентрация M-CSF в исследовании составляла 12,5 пМ.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF, и где указанное антитело или фрагмент антитела способно предотвращать связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, равной 10 пМ или менее, в количественном анализе ингибирования связывания рецептора, содержащем M-CSF в конечной концентрации, равной 0,66 пМ, и рецептор M-CSF в конечной концентрации, равной 2 пМ.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF, и где указанное антитело или фрагмент антитела способно предотвращать связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, равной 10 пМ или менее, в количественном анализе ингибирования связывания рецептора, как описано в примере 5.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF и которое способно предотвращать связывание MCSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, которая по меньшей мере вдвое ниже, чем IC₅₀ любого одного из известных из уровня техники антител HeRX1-10G1 и 8.10.3F. В альтернативе указанные выделенные антитела или фрагмент антитела предотвращает связывание M-CSF с рецептором M-CSF при IC₅₀, которая по меньшей мере в три раза ниже, чем IC50 любого одного из известных из уровня техники антител HeRX110G1 и 8.10.3F.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF при ЕС₅₀, равной 10 пМ или менее, согласно результатам количественного анализа FACS. В альтернативных аспектах указанные выделенные антитела или фрагменты антител специфически связываются с M-CSF при ЕС₅₀, равной 15 пМ или менее, согласно результатам количественного анализа FACS, или при ЕС₅₀, равной 5 пМ или менее, согласно результатам количественного анализа FACS.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF при ЕС50, которая по меньшей мере вдвое ниже, чем ЕС₅₀ любого одного из известных из уровня техники антител HeRX1-10G1 и 8.10.3F, согласно результатам количественного анализа FACS.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагмент антитела, который специфически связывается с M-CSF и который предотвращает индуцированную M-CSF пролиферацию при IC50, равной 10 пМ или менее. В альтернативных аспектах указанные выделенные антитела или фрагменты антител предотвращают индуцированную M-CSF пролиферацию при IC50, равной 20 пМ или менее, при IC₅₀, равной 15 пМ или менее, или при IC₅₀, равной 5 пМ или менее.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF и которое предотвращает индуцированную M-CSF пролиферацию при IC₅₀, которая по меньшей мере вдвое ниже, чем IC₅₀ любого одного из известных из уровня техники антител HeRX1-10G1 и 8.10.3F.

Термин KD в данном контексте относится к константе диссоциации, которую получают из соотношения Kd к Ka (т.е. Kd/Ka) и которая выражается в виде молярной концентрации (М). Значения KD для антигенсвязывающей частицы, как, например, моноклонального антитела, можно определять, используя хорошо известные в уровне техники способы. Способами определения KD антигенсвязывающей частицы, как, например, моноклонального антитела, являются SET (равновесное титрование в растворе) или поверхностный плазмонный резонанс с использованием биосерсорной системы, такой как система Biacore®. Константа скорости диссоциации (KD) (koff/kon) антител настоящего изобре

- 8 031471 тения обычно составляет менее чем 5х10^-2 М, менее чем 10^-2 М, менее чем 5х10'³ М,менее чем 10^-3 М, менее чем 5х10^-4 М, менее чем 10^-4 М, менее чем 5х10^-5 М, менее чем 10^-5 М, менее чем 5х10^-6 М, менее чем 10 М, менее чем 5х10 М, менее чем 10 М, менее чем 5х10 М, менее чем 10 М, менее чем 5х10 М, менее чем 10^-9 М, менее чем 5х10^-10 М, менее чем 10^-10 М, менее чем 5х10^-11 М, менее чем 10^-11 М, менее

12 13 13 14 чем 5х10 М, менее чем 10 М, менее чем 5х10 М, менее чем 10 М, менее чем 5х10 М, менее чем 10^-14 М, менее чем 5х10^-15 М или менее чем 10^-15 М или меньше.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенное антитело или фрагмент антитела, специфичное к M-CSF, где указанное антитело или фрагмент антитела связывается с M-CSF, с константой диссоциации (KD), равной менее чем 1х 10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1, 10⁹ M^-1, 10¹⁰ M^-1, 10¹¹ M^-1, 10¹² M^-1 или 10¹³ M^-1.

Термин ЕС₅₀ в данном контексте относится к концентрации антитела или фрагмента антитела, которые вызывают ответную реакцию в ходе количественного анализа, величина которой находится посредине между нулевым и максимальным уровнями. Он, таким образом, представляет собой концентрацию антител, при которой наблюдается 50% от максимального эффекта.

Термин IC₅₀ в данном контексте относится к концентрации ингибитора (например, антитела или фрагмента антитела), которые останавливают ответную реакцию в ходе количественного анализа посредине между нулевым и максимальным уровнями. Он представляет собой концентрацию антител, которая уменьшает данную ответную реакцию на 50%.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 8, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 9, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 10, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 11, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 12, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 13.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 18, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 19, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 20, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 21, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 22, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 23.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 28, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 29, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 30, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 31, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 32, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 33.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 38, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 39, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 40, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 41, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 42, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 43.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 48, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 49, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 50, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 51, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 52, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 53.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 58, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 59, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 60, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 61, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 62, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 63.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 68, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 69, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 70, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 71, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 72, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 73.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 78, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 79, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 80, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 81, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 82, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 83.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 88, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 89, участок HCDR3 последовательности

- 9 031471

SEQ ID NO: 90, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 91, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 92, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 93.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 98, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 99, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 100, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 101, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 102, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 103.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 108, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 109, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 110, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 111, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 112, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 113.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 14 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO:

15.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 24 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 25.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 34 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 35.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO.: 44 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO.: 45.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 54 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 55.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 64 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 65.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 74 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 75.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 84 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 85.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 94 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 95.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 104 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 105.

В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает выделенные антитела и фрагменты антител, где указанное антитело или фрагмент антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 114 и вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 115.

В некоторых аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагменты антител, которые конкурируют с антителами, особо раскрываемыми здесь и предназначенными для связывания с M-CSF. В других аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагменты антител, которые конкурируют с антителами, особо раскрываемыми здесь и предназначенными для связывания с человеческим M-CSF. В других аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагменты антител, которые конкурируют с антителами, особо раскрываемыми здесь и предна

- 10 031471 значенными для связывания с полипептидом, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 1.

Термин конкурирует или перекрестно конкурирует относится к антителу или фрагменту антитела, который разделяет способность к связыванию со специфическим участком антигена. В настоящем раскрытии антитело или фрагмент антитела, способное перекрестно конкурировать, может вмешиваться в связывание другого антитела или фрагмента антитела к M-CSF в условиях стандартного анализа конкурентного связывания. Такое антитело способно, согласно неограничивающей теории, связываться с одним и тем же или родственным или близлежащим (например, сходным по своему строению или находящимся в пространственной близости) эпитопом на M-CSF. Можно проводить исследования перекрестного конкурирования с целью нахождения антител, которые конкурентно связываются одно с другим, например антител, конкурирующих в отношении связывания с антигеном. Способность или степень, с которой антитело или фрагмент антитела может вмешиваться в связывание другого антитела или фрагмента антитела с M-CSF, и, таким образом, можно ли сказать, что оно перекрестно конкурирует в соответствии с данным изобретением, можно определить, используя стандартный анализ конкурентного связывания. Перекрестное конкурирование можно наблюдать, если антитело А уменьшает связывание антитела В по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, особенно по меньшей мере на 70% и более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наоборот по сравнению с положительным контрольным экспериментом, в котором одно из указанных антител не используется. Как будет понятно специалисту в данной области, конкуренцию можно оценить при различных условиях анализа. В одном подходящем количественном анализе используется технология Biacore (например, если использовать прибор BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Sweden)), который может измерять степень взаимодействия, используя технологию поверхностного плазмонного резонанса. Другой количественный анализ для измерения перекрестной конкуренции использует подход, основанный на ELISA. Кроме того, процесс с высокой пропускной способностью для биннинга антител, основанный на их перекрестной конкуренции, описан в международной патентной заявке № WO 2003/48731. Перекрестное конкурирование можно наблюдать, если исследуемое антитело уменьшает связывание одного из антител на 60% или более, особенно на 70% или более и более предпочтительно на 80% или более, и если одно из антител уменьшает связывание указанного антитела с M-CSF на 60% или более, особенно на 70% или более и более предпочтительно на 80% или более.

В определенном аспекте данное раскрытие относится к антителу или фрагменту антитела, специфичному к M-CSF, которое перекрестно конкурирует с антителом, описанным в табл. 1. В определенном аспекте данное раскрытие относится к антителу или фрагменту антитела, специфичному к M-CSF, которое перекрестно конкурирует с антителом, описанным в табл. 2.

В определенном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, перекрестно конкурирующий с антителом, описанным в табл. 1, снижает связывание одного из антител, описанных в табл. 1, с M-CSF по меньшей мере на 50, 60, 70, 80 или 90% по результатам количественного анализа перекрестной конкуренции, основанного на ELISA. В определенном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела, перекрестно конкурирующий с антителом, описанным в табл. 2 снижает связывание одного из антител, описанных в табл. 2, с M-CSF по меньшей мере на 50, 60, 70, 80 или 90% по результатам количественного анализа перекрестной конкуренции, основанного на ELISA.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагменты антител, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и антитела, специально раскрываемые здесь. В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагменты антител, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и антитела, описанные в табл. 1. В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает выделенные антитела или фрагменты антител, которые связываются с тем же самым эпитопом, что и антитела, описанные в табл. 2.

Термин эпитоп включает любой белковый участок, который специфически распознается иммуноглобулином или рецептором Т-клетки, или другим образом взаимодействует с молекулой. В общем случае эпитопы представляют собой химически активные поверхностные скопления молекул, таких как боковые цепи аминокислот или углеводов или сахаров, и в общем могут иметь специфические свойства 3-мерных структур, а также определенные свойства, связанные с наличием электрического заряда. Как понятно специалисту в данной области, практически все, с чем антитело может специфически связываться, может представлять собой эпитоп.

В определенном аспекте настоящее раскрытие имеет отношение к антителу или фрагменту антитела к M-CSF, которое взаимодействует (например, путем связывания, стабилизации, пространственного распределения) с тем же самым эпитопом, что и антитела, описанные в табл. 1. В определенном аспекте данное раскрытие имеет отношение к антителу или фрагменту антитела к M-CSF, которое взаимодействует (например, путем связывания, стабилизации, пространственного распределения) с тем же самым эпитопом, что и антитела, описанные в табл. 2.

В определенном аспекте настоящее раскрытие имеет отношение к антителу или фрагменту антитела для применения в медицине.

В определенном аспекте настоящее раскрытие предлагает фармацевтическую композицию, содержащую выделенное антитело или фрагмент антитела, которое направлено на или связывается с M-CSF, и

- 11 031471 фармацевтически приемлемый носитель. В определенных аспектах настоящее раскрытие также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую выделенное антитело или фрагмент антитела настоящего раскрытия и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления выделенное антитело или фрагмент антитела раскрыто здесь для применения в качестве лекарственного средства.

Композиции настоящего изобретения предпочтительно представляют собой фармацевтические композиции, содержащие выделенное антитело или фрагмент антитела, которое направлено на или связывается с M-CSF, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество, для лечения расстройств воспалительного характера. Такие носители, разбавители или вспомогательные вещества хорошо известны в данной области техники, специалист в данной области сможет найти составы и пути введения, которые наиболее подходят для лечения субъекта с использованием антител к M-CSF или фрагментов антител данного изобретения.

В определенных аспектах настоящее раскрытие предлагает способ лечения или профилактики расстройств воспалительного характера у субъекта, включающее стадию введения субъекту эффективного количества антитела или фрагмента антитела, которое направлено на или связывается с M-CSF. В некоторых аспектах указанный субъект представляет собой человека. В альтернативных аспектах указанный субъект представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

Введение и лечение/обработка в применении к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости относится к осуществлению контакта экзогенного фармацевтического препарата, лечебного препарата, диагностического средства или композиции с животным, человеком, экспериментальным субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Введение и лечение/обработка может относиться, например, к лечебным, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, если жидкость находится в контакте с клеткой. Введение и лечение/обработка также означают in vitro и ex vivo обработки, например, клетки, с использованием реагента, диагностического средства, связывающего препарата или с использованием другой клетки. Лечение/обработка в применении к человеку, ветеринарному или исследуемому субъекту относится к терапевтическому лечению, профилактическим или предупреждающим мерам, к исследовательским и диагностическим применениям. Лечение/обработка в применении к человеку, ветеринарному или исследуемому субъекту или клетке, ткани или органу охватывает осуществление контакта средства с субъектом-животным, клеткой, тканью, физиологическим отделом или физиологической жидкостью. Обработка клетки также охватывает случаи, когда осуществляется контакт средства с PILR, например, в жидкой фазе или коллоидной фазе, но также и случаи, когда агонист или антагонист не содержит клетку или рецептор.

Термин субъект включает человека и животных, отличных от человека. Животные, отличные от человека, включают всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, отличные от человека, овца, собака, корова, куры, амфибии и рептилии. За исключение специально оговоренных случаев, термины пациент или субъект используются здесь взаимозаменяемо.

В другом аспекте данное раскрытие предлагает антитело или фрагмент антитела, специфичное к MCSF, содержащее 6 CDR любого антитела, приведенного в табл. 1. В другом аспекте данное раскрытие предлагает антитело или фрагмент антитела, специфичное к M-CSF, содержащее 6 CDR любого антитела, приведенного в табл. 2.

В другом аспекте данное раскрытие предлагает антитело или фрагмент антитела, специфичное к MCSF, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи любого антитела, приведенного в табл. 1. В другом аспекте данное раскрытие предлагает антитело или фрагмент антитела, специфичное к M-CSF, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи любого антитела, приведенного в табл. 2.

В другом аспекте данное раскрытие предлагает антитело или фрагмент антитела, специфичное к MCSF, кодируемое любой из нуклеиновых кислот, приведенных в табл. 1. В другом аспекте данное раскрытие предлагает антитело или фрагмент антитела, специфичное к M-CSF, кодируемое любой из нуклеиновых кислот, приведенных в табл. 2. В другом варианте осуществления настоящее раскрытие предлагает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, приведенную в табл. 1. В другом варианте осуществления настоящее раскрытие предлагает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, приведенную в табл. 2. В другом варианте осуществления настоящее раскрытие предлагает выделенную клетку-хозяин, содержащую вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, приведенную в табл. 1. В другом варианте осуществления настоящее раскрытие предлагает выделенную клетку-хозяин, содержащую вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, приведенную в табл. 2. В дополнительном варианте осуществления указанная выделенная клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего.

Примеры

Пример 1. Получение Fab-фрагментов и антител, специфичных к M-CSF.

С целью отбора антител, специфически связывающихся с M-CSF, использовали доступную в продаже библиотеку фагового дисплея - библиотеку MorphoSys HuCAL PLATINUM®. Указанная библиоте

- 12 031471 ка антител основана на концепции HuCAL® (Knappik et al., (2000) J. Mol. Biol. 296:57-86) и использует технологию CysDisplay® для представления Fab на поверхности фага (WO 2001/05950, принадлежащая Lohning). Однако любые другие доступные библиотеки антител будут пригодны для идентификации антител к M-CSF.

Для выявления специфичных к M-CSF антител использовались различные стратегии панорамирования. Каждая стратегия панорамирования включала по меньшей мере 3 индивидуальных цикла панорамирования в отношении связывающегося с рецептором домена человеческого M-CSF (rbdM-CSF), последовательность которого приведена в SEQ ID NO: 5.

Идентифицированным выделенным связующим позволяли созреть, подвергали перестройке и/или создавали зародышевую линию с целью повышения сродства и/или функциональности изначальных лидирующих молекул. Несколько сотен связующих прошли скрининг и исследовались с целью определения их функциональности.

На исследовательском уровне был получен набор из 45 молекул-кандидатов, которые были охарактеризованы в следующих количественных анализах in vitro.

Связывание с M-CSF человека и макака-крабоеда в анализе ELISA.

Связывание со стабильно трансфицированными мембранным M-CSF клетками СНО и эндогенно экспрессирующими мембранный M-CSF клетками MDA-MB 231 (источник: АТСС, порядковый номер: НТВ-26).

Рейтинг риска развития разработки.

Функциональность согласно количественному анализу ингибирования рецептора (RIA) с использованием человеческого M-CSF.

Функциональность клетки M-NFS-60 (источник: АТСС, порядковый номер: CTL-1838) количественный анализ вариабельности с использованием человеческого M-CSF.

В целом было выявлено восемь лидирующих молекул, которые описаны ниже. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот вариабельных участков и CDR этих восьми связующих показаны в табл. 1.

Таблица 1

Название		Ид. № послед-ти:	Последовательность [аминокислотная] / [нуклеиновой кислоты]
Caline	HCDR1	Ид. № послед-ти: 8	SNSAAWN
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 9	RTYYRSKWKHEYAMSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 10	DRYYYSAFDY

- 13 031471

	LCDR1	Ид. № послед-ти: 11	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 12	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 13	ASYDERFTRV
	VH	Ид. № послед-ти: 14	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKHEYAMSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 15	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSW YQQHPGKAPKLMIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTA SLTISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVL GQ
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 16	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctg ag cctg acctg eg eg atttccgg eg atagtgtg agtag caatag eg c tgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctgggc cgtacctactaccgtagcaaatggaaacatgaatatgccatgagcgtgaaa agccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgcaac tgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgacc gttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgttag ctca
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 17	caaagcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccag agcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaatt ctgtttcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaattgatgatttac gctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaaa gcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaagacg aagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggcgg cggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Camille	HCDR1	Ид. № послед-ти: 18	TSSAAWN
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 19	RTYYRSKWKHEYAVSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 20	DRYYYSAFDY
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 21	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 22	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 23	ASYDERFTRV

- 14 031471

	VH	Ид. № послед-ти: 24	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGESVSTSSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKHEYAVSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 25	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSW YQQHPGKAPKLLIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTAS LTISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVLG Q
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 26	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctg ag cctg acctg eg eg atttccgg ag ag agtgtg ag cactagtagtg c tgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctgggc cgtacctactaccgtagcaaatggaaacatgaatatgccgtgagcgtgaaa agccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgcaac tgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgacc gttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgttag ctca
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 27	caaagcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccag agcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaac tctgtttcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaactgctgattta cgctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaa agcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaagac gaagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggcg gcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Celine	HCDR1	Ид. № послед-ти: 28	TSSAAWN
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 29	RTYYRSKWKHEYAVSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 30	DRYYYSAFDY
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 31	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 32	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 33	ASYDERFTRV
	VH	Ид. № послед-ти: 34	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSTSSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKHEYAVSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 35	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSW YQQHPGKAPKLIIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTAS LTISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVLG Q

- 15 031471

	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 36	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctgagcctgacctgcgcgatttccggagacagcgtgagtaccagtagtg ctgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctggg ccgtacctactaccgtagcaaatggaaacatgaatatgccgtgagcgtgaa aagccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgcaa ctgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgac cgttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgtta gctca
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 37	caaagcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccag agcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaac tctgtttcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaactgatcatcta cgctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaa agcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaagac gaagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggcg gcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Madeleine	HCDR1	Ид. № послед-ти: 38	SNSAAWN
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 39	RTYYRSKWKKEYAQSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 40	DRYYYSAFDY
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 41	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 42	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 43	ASYDERFTRV
	VH	Ид. № послед-ти: 44	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKKEYAQSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 45	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSW YQQHPGKAPKLMIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTA SLTISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVL GQ
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 46	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctgagcctgacctgcgcgatttccggagatagcgtgagcagtaactctgc tgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctgggc cgtacctactaccgtagcaaatggaaaaaagaatatgcccagagcgtgaa aagccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgcaa ctgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgac cgttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgtta gctca

- 16 031471

	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 47	caaagcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccag agcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaatt ctgtttcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaattgatgatttac gctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaaa gcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaagacg aagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggcgg cggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Maelle	HCDR1	Ид. № послед-ти: 48	TSSAAWN
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 49	RTYYRSKWKKEYAQSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 50	DRYYYSAFDY
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 51	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 52	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 53	ASYDERFTRV
	VH	Ид. № послед-ти: 54	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGESVSTSSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKKEYAQSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 55	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSW YQQHPGKAPKLIIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTAS LTISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVLG Q
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 56	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctgagcctgacctgcgcgatttccggagaaagcgtgagtaccagcagtg ctgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctggg ccgtacctactaccgtagcaaatggaaaaaagaatatgcccagagcgtga aaagccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgca actgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtga ccgttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgtt agetea
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 57	caaagcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccag agcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaac tctgtttcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaactgatcatcta cgctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaa agcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaagac gaagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggcg gcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Meriem	HCDR1	Ид. № послед-ти:	TSSAAWN

- 17 031471

		58
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 59	RTYYRSKWKKEYAQSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 60	DRYYYSAFDY
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 61	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 62	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 63	ASYDERFTRV
	VH	Ид. № послед-ти: 64	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSTSSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKKEYAQSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 65	QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSW YQQHPGKAPKLIIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTAS LTISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVLG Q
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 66	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctg ag cctg acctg eg eg atttccgg eg acag cgtg ag caccagtagtg ctgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctggg ccgtacctactaccgtagcaaatggaaaaaagaatatgcccagagcgtga aaagccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgca actgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtga ccgttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgtt agetea
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 67	caaagcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccag agcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaac tctgtttcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaactgatcatcta cgctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaa agcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaagac gaagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggcg gcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Satine	HCDR1	Ид. № послед-ти: 68	IYAMS
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 69	RIKSNADGGTTEYAAPVKG
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 70	MRYYSDLYFDP
	LCDR1	Ид. № послед-ти:	SGDKLGQKYVS

- 18 031471

		71
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 72	QDRKRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 73	QTWTHLQWV
	VH	Ид. № послед-ти: 74	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWV RQAPGKGLEWVGRIKSNADGGTTEYAAPVKGRFTISR DDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARMRYYSDLYFDP WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 75	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGQKYVSWYQ QKPGQSPVLVISQDRKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCQTWTHLQWVFGGGTKLTVLGQ
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 76	gaagtgcagctggtggaaagcggcggtggcctggtgaaaccaggcggca g cctg eg cctg ag etg eg ccg ccag egg ettea cctttag catctacg ctatg agctgggtgcgccaggccccgggcaaaggtctggaatgggtgggccgtat caaatctaacgctgacggtggtactactgaatatgccgccccagtgaaagg ccgctttaccattagccgcgatgatagcaaaaacaccctgtatctgcaaatg aacagcctgaaaaccgaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtatgcgtt actactctgacctgtacttcgatccgtggggtcaaggcaccctggtgactgtct egage
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 77	agctatgaactgacccagccgccgagcgttagcgttagcccaggccagac cgccagcattacctgtagcggcgacaaactggggcaaaaatacgtgtcctg gtatcagcagaaaccgggccagagcccggtgctggttatcagtcaggatcg taaacgcccgagcggcattccagaacgctttagcggcagcaacagcggc aacaccgccaccctgaccattagcggcacccaggccgaagacgaagcc gattattactgccagacttggacccacctgcaatgggtgtttggcggcggtac caagctgaccgtgctgggccag
Servane	HCDR1	Ид. № послед-ти: 78	TYAIS
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 79	FIKSKHNSGTTEYAAPVKG
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 80	MRYYSDLYFDP
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 81	SGDKLGQKYVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 82	QDRKRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 83	QTWTHLQWV
	VH	Ид. № послед-ти: 84	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAISWV RQAPGKGLEWVGFIKSKHNSGTTEYAAPVKGRFTISR DDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARMRYYSDLYFDP
			WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 85	SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGQKYVSWYQ QKPGQSPVLVISQDRKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SGTQAEDEADYYCQTWTHLQWVFGGGTKLTVLGQ
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 86	gaagtgcaattggtggaaagcggcggtggcctggtgaaaccaggcggca g cctg eg cctg ag etg eg ccg cctccg g attca cctttt eta ett a eg ctat ct c ttgggtgcgccaggccccgggcaaaggtctcgagtgggtgggcttcatcaa atctaaacataactctggtactactgaatatgccgccccagtgaaaggccgc tttaccattagccgcgatgattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacag cctgaaaaccgaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtatgcgttactact ctgacctgtacttcgatccgtggggtcaaggcaccctggtgactgtctcgagc
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 87	agctatgaactgacccagccgccgagcgttagcgttagcccaggccagac cgccagcattacctgtagcggcgacaaactggggcaaaaatacgtgtcctg gtatcagcagaaaccgggccagagcccggtgctggttatcagtcaggatcg taaacgcccgagcggcattccagaacgctttagcggcagcaacagcggc aacaccgccaccctgaccattagcggcacccaggccgaagacgaagcc gattattactgccagacttggacccacctgcaatgggtgtttggcggcggtac caag etg accgtg etg gg ccag

Антитела Caline, Camille и Celine являются производными родительского антитела Blanche. Антитела Madeleine, Maelle и Meriem являются производными родительского антитела Laurine. Антитела Sat- 19 031471 ine and Servane являются производными родительского антитела Romaine. Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот вариабельных участков и CDR родительских антител показаны в табл. 2.

Таблица 2

Название		Ид. № послед-ти:	Последовательность [аминокислотная] / [нуклеиновой кислоты]
Blanche	HCDR1	Ид. № послед-ти: 88	SNSAAWN
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 89	RTYYRSKWKHEYAMSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 90	DRYYYSAFDY

	LCDR1	Ид. № послед-ти: 91	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 92	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 93	ASYDERFTRV
	VH	Ид. № послед-ти: 94	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKHEYAMSVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 95	DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSWY QQHPGKAPKLMIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASL TISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVLGQ
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 96	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctgagcctgacctgcgcgatttccggagatagcgtgagcagtaactctgc tgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctgggc cgtacctactaccgtagcaaatggaaacatgaatatgccatgagcgtgaaa agccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgcaac tgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgacc gttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgttag ctca
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 97	gatatcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccaga gcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaact ctgtgtcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaactgatgatcta cgctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaaa agcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaagac gaagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggcg gcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Laurine	HCDR1	Ид. № послед-ти: 98	SNSAAWN
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 99	RTYYRSKWKKEYAQSVKS
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 100	DRYYYSAFDY
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 101	TGTSSDVGGYNSVS
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 102	AVSNRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 103	ASYDERFTRV
	VH	Ид. № послед-ти:	QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWKKEYAQSVKSRITIN

- 20 031471

		104	PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDRYYYSAFDY WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 105	DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNSVSWY QQHPGKAPKLMIYAVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASL TISGLQAEDEADYYCASYDERFTRVFGGGTKLTVLGQ
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 106	caggtgcaattgcagcagagcggtccgggcctggtgaaaccgagccaga ccctgagcctgacctgcgcgatttccggagatagcgtgagcagtaactctgc tgcttggaactggattcgtcagagcccgagccgtggcctcgagtggctgggc cgtacctactaccgtagcaaatggaaaaaagaatatgcccagagcgtgaa aagccgcattaccattaacccggatacttcgaaaaaccagtttagcctgcaa ctgaacagcgtgaccccggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtgac cgttactactactctgctttcgattactggggccaaggcaccctggtgactgtta gctca
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 107	Gatatcgcgctgacccagccggcgagcgtgagcggtagcccgggccag agcattaccattagctgcaccggcaccagcagcgatgtgggcggttacaac tctgtgtcttggtaccagcagcatccgggcaaggcgccgaaactgatgatct acgctgtttctaaccgtccgagcggcgtgagcaaccgttttagcggatccaa aagcggcaacaccgcgagcctgaccattagcggcctgcaagcggaaga cgaagcggattattactgcgcttcttacgacgaacgtttcactcgtgtgtttggc ggcggcacgaagttaaccgtcctaggtcag
Romaine	HCDR1	Ид. № послед-ти: 108	IYAMS
	HCDR2	Ид. № послед-ти: 109	RIKSNADGGTTEYAAPVKG
	HCDR3	Ид. № послед-ти: 110	MRYYSDLYFDP
	LCDR1	Ид. № послед-ти: 111	SGDAIGSKYVH
	LCDR2	Ид. № послед-ти: 112	KDNKRPS
	LCDR3	Ид. № послед-ти: 113	QTATVSSYWWV
	VH	Ид. № послед-ти: 114	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWV RQAPGKGLEWVGRIKSNADGGTTEYAAPVKGRFTISR DDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARMRYYSDLYFDP WGQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 115	DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDAIGSKYVHWYQQ KPGQAPVLVISKDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCQTATVSSYWWVFGGGTKLTVLGQ
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 116	caggtgcaattggtggaaagcggcggtggcctggtgaaaccaggcggca g cctg eg cctg ag etg eg ccg cctccgg attcaccttttctatctacg etatgte ttgggtgcgccaggccccgggcaaaggtctcgagtgggtgggccgtatcaa atctaacgctgacggtggtactactgaatatgccgccccagtgaaaggccg ctttaccattagccgcgatgattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaaca gcctgaaaaccgaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtatgcgttactac tctgacctgtacttcgatccgtggggccaaggcaccctggtgactgttagctc a
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 117	gatatcgaactgacccagccgccgagcgtgagcgtgagcccgggccaga ccgcgagcattacctgtagcggcgatgctatcggttctaaatacgttcattggt accagcagaaaccgggccaggcgccggtgctggtgatctctaaagacaa caaacgtccgagcggcatcccggaacgttttagcggatccaacagcggca acaccgcgaccctgaccattagcggcacccaggcggaagacgaagcgg attattactgccagactgctactgtttcttcttactggtgggtgtttggcggcggc acgaagttaaccgtcctaggtcag

Пример 2. Определение свойств и контрольных показателей специфичных к M-CSF антител.

Восемь предпочтительных антител, специфичных к M-CSF, были подробно охарактеризованы, как описано ниже в данном документе. Антитела сравнивали с соответствующими родительскими антителами и с двумя антителами из уровня техники, которые были получены для клинической разработки. Аминокислотная последовательность HeRX1-10G1 (Novartis) раскрыта, например, в публикации WO 2005/068503, а также показана в табл. 3. Аминокислотная последовательность 8.10.3F (Pfizer) раскрыта, например, в публикации WO 2005/030124, а также показана в табл. 3. HeRX1-10G1 и 8.10.3F были синтезированы, используя традиционные методики молекулярной биологии.

- 21 031471

Таблица 3

Название послед-ти:

SDYAWN

HeRX1-10G1

HCDR1 послед-ти:

YSYSGSTSYNPSLKS

HCDR2 послед-ти:

FDYAHAMDY

HCDR3 послед-ти:

QASQS GTS Н

LCDR1 послед-ти:

LCDR2 послед-ти:

QQ NSWPT послед-ти:

послед-ти:

TTvTvSS послед-ти:

послед-ти:

caccaagctggaaatcaagcgtacg

SFSMT

HCDR1 послед-ти:

YSSRSSTSYADSvKG

HCDR2 послед-ти:

DPLLAGATFFDY

HCDR3 послед-ти:

LCDR1 послед-ти:

LCDR2 послед-ти:

LCDR3 послед-ти:

послед-ти:

Последовательность [нуклеиновом кислоты]

- 22 031471

			GQGTLVTVSS
	VL	Ид. № послед-ти: 135	DIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWY QQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTL TISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIKRT
	VH (ДНК)	Ид. № послед-ти: 136	caggtgcaattggtggagagcggcggaggactggtgcagcctggcggaa g cctg ag actgtcttg eg ccg ccag egg cttcaccttcag cag cttcag catg acatgggtccgccaagcccctggaaagggcctggaatgggtgtcctacatc agcagccggtccagcaccatcagctacgccgacagcgtgaagggccggt tcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaa cagcctgcgggacgaggacaccgccgtgtactactgcgccagagatcctct gctggctggcgccaccttcttcgactactggggccagggcaccctggtcaca gteagetea
	VL (ДНК)	Ид. № послед-ти: 137	gatatcgtgctgacccagtctcctggcaccctgtctctgagccctggcgagag agccaccctgagctgcagagccagccagagcgtgtccagcagctacctgg cctggtatcagcagaagcccggccaggcccccagactgctgatctacggc gccagcagcagagccaccggcatccccgacagattcagcggcagcggct ccggcaccgacttcaccctgaccatctctcggctggaacccgaggacttcg ccgtgtactactgccagcagtacggcagcagccctctgaccttcggcggag gcaccaaggtggagatcaagcgtacg

Антитела настоящего раскрытия можно применять в любом формате, т.е. как полноразмерные иммуноглобулины или как фрагменты антител, как описано в данном документе. Полноразмерные антитела можно применять в любом изотипе или классе иммуноглобулинов. С небольшими исключениями антитела настоящего изобретения были исследованы в формате IgG1 и в формате молчащего IgG1, содержащем в себе мутацию D265A на Fc участке. Антитело 8.10.3F исследовали в формате IgG2.

Пример 3. Специфичность к M-CSF согласно результатам количественного анализа ELISA.

Специфичность по отношению к человеческому M-CSF и M-CSF макака-крабоеда исследовали, используя количественный анализ ELISA. В качестве отрицательного контроля использовали БСА (BSA).

Maxisorp™ 384-луночные планшеты покрывали слоем человеческого rbdM-CSF, человеческого sgM-CSF, sgM-CSF макака-крабоеда или мышиным sgM-CSF при концентрации 2 мкг/мл в ФСБ (PBS). После блокирования планшетов, используя 5%-ное обезжиренное порошковое молоко в ФСБ, добавляли Fab-содержащие лизаты B.coli, IgG-содержащие надосадочную жидкость клеточной культуры или очищенный белок IgG или Fab. Связывание Fab или IgG определяли с помощью F(ab)2-специфичного козьего антитела к человеческому IgG, конъюгированному со щелочной фосфатазой (Dianova Кат. № 109-055097; разведение 1:5000), используя флуоресцентный субстрат Attophos (Roche, № 11681982001). Флуоресцентную эмиссию при 535 нм записывали при возбуждении излучением 430 нм.

В условиях альтернативного эксперимента Maxisorp™ 384-луночные планшеты покрывали слоем специфичного к Fd-фрагменту овечьего антитела к человеческому IgG (The Binding Site, № PC075) разведение 1:1000 в ФСБ. После блокирования 5%-ным обезжиренным порошковым молоком в ФСБ добавляли Fab-содержащие лизаты B.coli. Далее захваченным HuCAL®-Fab фрагментам позволяли связываться с 0,5 мкг/мл биотинилированного M-CSF (человеческий sgM-CSF, человеческий rbdM-CSF или мышиный sgM-CSF), что определяли путем инкубации со стрептавидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой, с последующим добавлением флуоресцентного субстрата AttoPhos Roche, № 11681982001). Флуоресцентную эмиссию при 535 нм записывали при возбуждении излучением при 430 нм.

Все антитела, приведенные в табл. 1, 2 и 3, прочно связывались с человеческим M-CSF и M-CSF макака-крабоеда (>35,000 единиц), в то время как ни одно из антител не связывалось с БСА (<1,000 единиц). Следовательно, все антитела высоко специфичны к M-CSF.

Пример 4. Специфичность к M-CSF согласно результатам эксперимента FACS; EC₅₀.

Исследование с использованием FACS проводили с целью определить, связываются ли антитела настоящего раскрытия также с M-CSF, экспрессируемым на клетках. Для этой цели использовали две клеточные линии: стабильно M-CSF-трансфицированные клетки СНО и клеточную линию MDA-MB231, которая эндогенно экспрессирует M-CSF. Наблюдаемые значения K_D (EC₅₀) определяли для обеих клеточных линий. Результаты приведены в табл. 4. Все значения приводятся в [нМ].

- 23 031471

Таблица 4

Значения ЕС₅₀ антител согласно результатам количественного анализа FACS (нМ)

Название антитела	Формат	Клетки СНО	Клетки M DA- MB 231 (n=2)
Blanche	lgG1_D265A	7,5	10
Caline	lgG1_D265A	9,8	14
Camille	lgG1_D265A	6,1	14
Celine	lgG1_D265A	9,7	13
Laurine	lgG1_D265A	11,2	9
Madeleine	lgG1_D265A	6,4	10
Maelle	lgG1_D265A	10,2	8
Meriem	lgG1_D265A	12,3	10
Romaine	lgG1_D265A	16,4	19
Satine	lgG1_D265A	11,3	26
Servane	lgG1_D265A	21,3	n.d.
HeRX1-10G1	igGl	12,6	27
HeRX1-10G1	lgG1_D265A	8,9	23
8.10.3F	igG2	23,2	310
8.10.3F	lgG1_D265A	8,9	16

Антитела настоящего изобретения демонстрируют значения ЕС₅₀, которые, по меньшей мере, также хороши, как и показатели антител HeRX1-10G1 и 8.10.3F, известные из уровня техники, а многие антитела демонстрируют значения EC₅₀ лучше (ниже), чем показатели антител, известных из уровня техники.

Пример 5. Подавление связывания с рецептором.

В этом эксперименте исследовали способность антител блокировать связывание М-CSF человека или макака-крабоеда с рецептором рекомбинантного человеческого М-CSF (представлена как слитый белок Fc).

Использовались следующие комбинации рекомбинантный лиганд/рецептор.

Таблица 5

Комбинации лиганд/рецептор, используемые в количественном анализе ингибирования рецептора

Человеческий M-CSF
Лиганд	Рекомбинантный человеческий sgM-CSF
Рецептор	Рекомбинантный человеческий CSF1-R-Fc (R&D Systems Кат. № 329-М R)
Мышиный M-CSF
Лиганд Рекомбинантный мышиный sgM-CSF Рекомбинантный рецептор CSF-IR-Fc мышиного M-CSF (R&D Рецептор Systems, Кат. № 3818-МR) М-CSF макака-крабоеда
Лиганд	Рекомбинантный sgM-CSF макака-крабоеда
Рецептор	Рекомбинантный человеческий CSF1-R-Fc (R&D Systems Кат. № 329-М R)

M-CSF в конечной концентрации 12,5 пМ (0,66 нг/мл) предварительно инкубировали с антителом к M-CSF, взятом в различных концентрациях (0,1 пМ - 100 нМ; все разведения в ECL-буфере) в течение 1 ч при комнатной температуре. Комплексы затем переносили в 384-луночный MSD-планшет, на который нанесено 2 мкг/мл соответствующего рецептора. Планшеты затем промывали и инкубировали с конъюгатом стрептавидин/ECL в течение 2 ч, встряхивая при комнатной температуре. Затем в каждую лунку

- 24 031471 добавляли 35 мкл буфера MSD read buffer T с ПАВ и вслед за этим проводили измерения, используя MSD Sector Imager 6000.

Значения IC₅₀ рассчитывали для обоих M-CSF человека и M-CSF макака-крабоеда. Результаты приведены в табл. 6. Все значения приведены в [пМ], n=4 за исключением HeRX1-10G1 в формате IgG1 и 8.10.3F в формате IgG2.

Таблица 6 Значения IC₅₀ антител по результатам количественного анализа на ингибирование связывания рецептора (пМ)

Название антитела	Формат	Человеческий M-CSF	M-CSF макакакрабоеда
Blanche	lgG1_D265A	6,2	6,6
Caline	lgG1_D265A	6,1	6,3
Camille	lgG1_D265A	4,4	5,9
Celine	lgG1_D265A	4,7	6,9
Laurine	lgG1_D265A	4,9	4,3
Madeleine	lgG1_D265A	5,6	5,6
Maelle	lgG1_D265A	5,3	6,4
Meriem	lgG1_D265A	7,0	7,3
Romaine	lgG1_D265A	9,1	9,1
Satine	lgG1_D265A	15,1	13,5
Servane	lgG1_D265A	31,3	11,8
HeRX1-10G1	igGi	26,5	27,6
HeRX1-10G1	lgG1_D265A	28,0	18,0
8.10.3F	igG2	31,4	20,7
8.10.3F	lgG1_D265A	19,2	14,6

Все кандидаты блокировали связывание M-CSF с его рецептором лучше, чем известные из уровня техники антитела HeRX1-10G1 и 8.10.3F. Это особенно очевидно в случае антител, полученных из родительских антител Blanche и Laurine, все из которых показали значения IC₅₀ ниже 10 пМ.

Пример 6. Подавление пролиферации, индуцированной рекомбинантным M-CSF.

Способность антител настоящего раскрытия блокировать биологическую активность рекомбинантного M-CSF оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток, используя M-CSF-зависимую мышиную миелоидную клеточную линию M-NFS-60. Пролиферацию этой клеточной линии можно индуцировать с помощью M-CSF человека, макака-крабоеда, крысы и мыши. Для определения свойств антител к M-CSF индуцировали пролиферацию либо с помощью рекомбинантного растворимого M-CSF, нативного растворимого M-CSF или с помощью трансфектантов, экспрессирующих поверхностноклеточный M-CSF. Были исследованы следующие компоненты (примеры 5-7).

- 25 031471

Таблица 7

Происхождение M-CSF, исследуемых в количественном анализе подавления пролиферации (примеры 5-7)

Рекомбинантный M-CSF

Рекомбинантный человеческий sgM-CSF [конечная конц-я при анализе: 9,5 пМ]

Рекомбинантный мышиный sgM-CSF [конечная конц-я при анализе: 9,5 пМ]

Рекомбинантный sgM-CSF макака-крабоеда [конечная конц-я при анализе: 9,5 пМ]

Рекомбинантный крысиный M-CSF (PromoKine, Кат. № Е60442) [конечная конц-я при анализе: 9,5 пМ]

Секретированный M-CSF

Кондиционированная клеточная культуральная среда от клеток MDA-MB-231, собранная после 3-х дней инкубации [конечная конц-я при анализе: 50%]

Клеточный M-CSF

Клетки СНО, стабильно трансфицированные человеческим M-CSF, зафиксированные с использованием 2,5% глутаральдегида в течение 30 мин при комнатной температуре

Сыворотка

Человеческая сыворотка (Sigma Н45522; инактивированная нагреванием в течение 30 мин при 56°С) [конечная конц-я при анализе: 50%]

Клетки M-NFS-60 культивировали (96-луночный планшет) в RPMI 1640, содержащем стабилизированный глутамин (Pan Biotech, PAN-P04-18500), дополненный 10%-ным FCS, 1 мМ Na-пируватом, 10 мМ HEPES, в присутствии 9,5 пМ (0,5 нг/мл) рекомбинантного M-CSF человека или макака-крабоеда и при повышении концентрации антител. Жизнеспособность клеток определяли после 3 дней культивирования с реагентом CellTiter-Glo® (Promega, Кат. № G-7571). Люминесценцию измеряли, используя стандартный люминометр для определения жизнеспособности клеток (относительно содержания АТФ). Значения IC₅₀ определяли, используя программное обеспечение GraphPad Prism. Результаты приведены в табл. 8. Все значения приводятся в [пМ].

Таблица 8

Значения IC₅₀ для антител по результатам количественного анализа, измеряющего подавление пролиферации, индуцированной рекомбинантным M-CSF [пМ]

Название антитела	Формат	Человеческий M-CSF (n=2)	M-CSF макакакрабоеда (n=2)
Blanche	lgG1_D265A	2,9	3,3
Caline	lgG1_D265A	3,1	4,3
Camille	lgG1_D265A	2,3	2,6
Celine	lgG1_D265A	2,7	3,0
La urine	lgG1_D265A	2,6	2,8
Madeleine	lgG1_D265A	3,0	2,8
Maelle	lgG1_D265A	2,7	2,3
Meriem	lgG1_D265A	3,1	2,8
Romaine	lgG1_D265A	8,4	8,1
Satine	lgG1_D265A	5,3	5,4

- 26 031471

Servane	lgG1_D265A	11,8	13,4
HeRX1- 10G1	lgG1	3,6	4,1
HeRX1- 10G1	lgG1_D265A	3,0	3,5
8.10.3F	igG2	71,1	84,6
8.10.3F	lgG1_D265A	14,9	16,5

Все исследованные антитела блокировали связывание M-CSF с его рецептором. В частности, антитела, полученные из родительских антител Blanche и Laurine, являются более действенными, чем антитела, известные из уровня техники, в частности более действенные чем 8.10.3F.

Пример 7. Подавление пролиферации, индуцированной нативным M-CSF.

Способность антител настоящего раскрытия блокировать биологическую активность нативного человеческого M-CSF оценивали с помощью количественного анализа пролиферации клеток M-NFS-60. В этом случае пролиферацию индуцировали либо с помощью человеческой сыворотки, либо кондиционированной MDA-MB-231 среды. Антитела предварительно инкубировали в течение 30 мин в сыворотке в 96-луночном планшете перед добавлением 1000 клеток M-NFS-60. Конечная концентрация в сыворотке составляла 50%, и клеточную культуральную среду не дополняли, используя FCS. Жизнеспособность клеток определяли после 3 дней, как описано выше. Иммуноглобулины оттитровывали и рассчитывали IC₅₀. Результаты приведены в табл. 9. Все значения приводятся в [пМ].

Таблица 9

Значения IC₅₀ для антител по результатам количественного анализа, измеряющего подавление пролифе рации рекомбинантным M-CSF [пМ]

Название	Формат	Человеческая	Кондиционированная
антитела	сыворотка	MDA-MB-231 среда
Blanche	lgG1_D265A	18,3	120,5
Caline	lgG1_D265A	17,7	106,9
Camille	lgG1_D265A	17,7	98,5
Celine	lgG1_D265A	23,8	72,4
Laurine	lgG1_D265A	15,6	95,0
Madeleine	lgG1_D265A	20,0	75,4
Maelle	lgG1_D265A	16,0	98,9
Meriem	lgG1_D265A	15,1	76,9
Romaine	lgG1_D265A	25,2	83,3
Satine	lgG1_D265A	31,8	70,8
Servane	lgG1_D265A	93,2	107,0
HeRX1-10G1	lgG1	15,4	90,3
HeRX1-10G1	lgG1_D265A	12,4	59,1
8.10.3F	igG2	349,7	739,0
8.10.3F	lgG1_D265A	201,4	79,5

Все исследованные антитела эффективно блокировали биологическую активность М-CSF, присутствующего в кондиционированной MDA-MB-231 среде. Известное из уровня техники антитело 8.10.3F было менее действенным по сравнению с другими исследованными антителами. Сходным образом все антитела подавляли биологическую активность M-CSF, присутствующего в человеческой сыворотке. Опять же известное из уровня техники антитело 8.10.3F было менее действенным по сравнению с другими исследованными иммуноглобулинами.

Пример 8. Подавление пролиферации, индуцированной поверхностно-клеточным М-CSF.

Способность антител настоящего изобретения блокировать биологическую активность мембраносвязанных изоформ M-CSF исследовали с помощью количественного анализа, в котором пролиферацию клеток M-NFS-60 индуцировали, используя клетки СНО, стабильно экспрессирующие человеческий поверхностно-клеточный M-CSF (клетки CHO_hM-CSF). 2000 клеток CHO_hM-CSF в каждой лунке культивировали в течение ночи при 37°С в 96-луночном планшете для клеточной культуры, дважды промывали, используя ФСБ, и фиксировали, используя 100 мкл 2%-го глутаральдегида в ФСБ на каждую лунку в течение 30 мин при 37°С. После промывания, используя ФСБ, зафиксированные клетки инкубировали с антителами к M-CSF (конечные концентрации IgG составляли 0,05 нМ, 0,5 нМ, 5 нМ, 50 нМ) в течение 30 мин при 37°С. После этого в каждую лунку добавляли по 5000 клеток M-NFS-60 и культивировали в

- 27 031471 течение 72 ч при 37°С перед тем, как определяли жизнеспособность клеток, как описано выше. Результаты приведены на чертеже.

Все специфичные к M-CSF иммуноглобулины эффективно подавляли пролиферацию, индуцированную клетками СНО, экспрессирующими M-CSF. Степень ингибирования повышалась при повышении концентрации IgG. Ингибирование было практически 100%-ным при самой высокой исследованной концентрации IgG (50 нМ). MOR3207 - антитело, специфичное в отношении лизоцима, не подавляло пролиферацию.

Пример 9. Определение сродства (аффинности).

Одновалентное сродство антител настоящего раскрытия определяли с помощью равновесного титрования в растворе (Haenel et al. (2005) Anal Biochem 339, 182-4). Антитела очищали в формате Fab и определяли K_D в отношении M-CSF человека и макака-крабоеда. Результаты приведены в табл. 10. Все значения приводятся в [пМ].

Таблица 10 Одновалентное сродство (значения K_D) антител по результатам . SET-анализа

Название антитела	Человеческий M-CSF	M-CSF макакакрабоеда
Blanche	96	130
Caline	14	16
Camille	18	25
Celine	HO	НО
Laurine	96	150
Madeleine	28	30
Maelle	13	27
Meriem	11	13
Romaine	13	7
Satine	<2	НО
Servane	HO	НО
HeRX1-10G1	>1,000	но
8.10.3F	38	но

Как видно из табл. 10, все исследованные Fab связывались с M-CSF человека и макака-крабоеда. Интересно, что большинство антител демонстрировали значения K_D, равные 30 пМ и ниже, т.е. сродство, которое выше, чем у антител HeRX1-10G1 и 8.10.3F, известных из уровня техники. Значительного различия между сродством к М-CSF человека и к M-CSF макака-крабоеда не наблюдалось.

Пример 10. Специфичность антител.

Специфичность связывания у антител настоящего изобретения исследовали на примере антитела Camille, как описано в работе Frese et al. (2013) MAbs, Feb 14; 5(2) [электронная публикация, предшествующая журнальной]. В целях данного исследования, определяющего профиль специфичности, различные белки и контрольные образцы наносили на поверхность 384-луночных MSD-планшетов, используя концентрацию 1 мкг/мл при 4°С в течение ночи. Планшеты блокировали, используя БСА, и промывали три раза, используя ФСБ с 0,05% (об./об.) Tween 20. Образцы антител разбавляли до 100 нМ и 10 нМ буфером для анализа (ФСБ с 0,5% (мас./об.) БСА, 0,05% (об./об.) Tween 20). В качестве контрольного образца использовали неспецифическое антитело (MOR03207; против лизоцима) и буфер для анализа. Образцы и контрольные образцы инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза и в каждую лунку добавляли по 30 мкл антител обнаружения (ECL-маркированные антитела к человеческому Fab) и инкубировали 1 ч. После промывки добавляли MSD Read Buffer T с ПАВ и детектировали сигналы электорохемолюминисценции, используя прибор Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Гейтерсбург, Мэриленд, США).

Для количественной оценки сигналы образцов антител на определенном белке нормализовали относительно эталонного антитела MOR03027. Результаты приведены в табл. 11.

- 28 031471

Таблица 11

Специфичность антитела Camille

Целевой антиген	Антитело Camille
100 нМ	10 нМ
Пустой образец	1	1
Белок A (Staphylococcus aureus)	1	1
Альбумин сыворотки (человеческий)	1	1
Фибриноген (бычий)	1	1
Гемоглобин (человеческий)	1	1
Трансферрин (бычий)	1	1
Антитрипсин(человеческий)	1	1
Лисоцим (куриный)	0	0
Поверхностноклеточный рецептор 1 (человеческий)	1	1
Цитокин 1 (человеческий)	1	1
Цитокин 2 (человеческий)	2	1
Поверхностноклеточный рецептор 2 (человеческий)	1	1
Μ-CSF (человеческий)	24	244
Поверхностноклеточный рецептор 3 (человеческий)	1	1
Пустой образец	2	1
Пепсиноген (свиной)	1	1
Аминогликозидаза (Aspergillus niger)	1	1
Ингибитор трипсина (соевый)	1	1
Цитохром с (коровий)	1	1
Миоглобин (лошадиный)	1	1
Лектин (Lens culinaris)	1	1
Овальбумин (куриный)	1	1
Трипсиноген(коровий)	1	1
Порошковое молоко (коровье)	1	1
RNase В (коровья)	1	1
RNase А (коровья)	1	1
Антитело к человеческому Fab (Dianova, № 109-005-097)	1	1
Антитело к человеческому Fc (Dianova, № 109-005-098)	1	1
Пустой образец	1	1

Иллюстративное антитело Camille показало высокую специфичность в отношении M-CSF и не проявило неспецифического связывания ни с каким из неродственных белков, исследованных с помощью этого анализа.

Пример 11. Сравнение иллюстративного антитела Camille с антителами, известными из уровня техники.

В следующей таблице приведено сравнение ключевых свойств антитела Camille со свойствами антител HeRX1.10G1 и 8.10.3F, известных из уровня техники.

- 29 031471

Таблица 12

Сравнение антитела Camille с антителами, известными из уровня техники

Критерий	Camille	HeRX1.10 θι	8.10.F3
Связывание	Человеческий M-CSF	18 пМ	>1000 пМ	38 пМ
M-CSF макака-крабоеда	25 пМ	НО	НО
IL-34, GM-CSF, SCF	нет	нет	нет
Мембраносвязанный M-CSF	да	да	да
Функциональность	Анализ связывания рецептора(1С50)	Человеческий M-CSF	4 пМ	27 пМ	31 пМ
M-CSF макака- крабоеда	6 пМ	28 пМ	21 пМ
Анализ выживаемости клеток (IC50)	Человеческий M-CSF	2 пМ	4 пМ	71 пМ
M-CSF макака- крабоеда	3 пМ	4 пМ	85 пМ
Мембраносвязанный M-CSF	да	да	да
MDA-MB-231	99 пМ	90 пМ	739 пМ
Человеческий сывороточный M-CSF	18 пМ	15 пМ	350 пМ

В итоге антитело Camille, так же как и другие антитела настоящего раскрытия, проявляет сродство связывания, значительно более сильное по сравнению с антителами, известными из уровня техники. Это также отражено в исследованиях функциональности, где результаты Camille, по меньшей мере, столь же хороши, но в большинстве исследований лучше, чем у антител HeRX1.10G1 и 8.10.F3, известных из уровня техники.

Пример 12. Эффективность антител в клинических испытаниях.

Многоцентровое, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование проведено с целью оценки безопасности, предварительной клинической активности и иммуногенности внутривенного введения многократных доз антител настоящего изобретения пациентам с активным ревматоидным артритом (РА).

Критериями первичной оценки являются частота нежелательных явлений и профиль безопасности. Критерии вторичной оценки включают величины индекса DAS28, баллы по ACR и критерии ответной реакции EULAR28.

Клинические испытания включали три терапевтические группы. В каждой терапевтической группе пациенты получали либо плацебо, либо антитела настоящего раскрытия (0,3 мг/кг массы тела в терапевтической группе 1, 1,0 мг/кг массы тела в терапевтической группе 2 и 1,5 мг/кг массы тела в терапевтической группе 3). Антитела и плацебо вводили внутривенно, еженедельно, в общей сложности 4 дозы.

Перед введением активность заболевания всех пациентов оценивали согласно принятым рекомендациями на основании расчета величины индекса DAS28 (28-joint Disease Activity Score) (см., например, Ann Rheum Dis (2009) 68, 954-60). Индекс DAS28 является одобренным и широко используемым инструментом для количественной оценки статуса заболевания с РА. Среднее значение индекса DAS28 сопоставимо во всех терапевтических группах.

Антитела настоящего раскрытия демонстрируют благоприятный профиль безопасности во всем диапазоне испытанных доз, и лечение является безопасным.

Через 4 недели и 8 недель после первого введения антител или плацебо определяли индекс DAS28 для всех пациентов. Уменьшение значений индекса DAS28 соотносится со снижением тяжести заболевания.

У всех пациентов, получивших лечение антителами настоящего изобретения, наблюдалось уменьшение значений индекса DAS28, что указывает на снижение тяжести заболевания и эффективность лечения. В отличие от этого у пациентов, получавших плацебо, какого-либо благоприятного эффекта от лечения не наблюдалось.

В качестве другого критерия эффективности использовали критерий ACR20. По критерию ACR оценивают улучшение значения параметра, связанного с болезненностью или отечностью сустава, и улучшение некоторых других параметров. Процедура оценки критерия ACR в высшей степени стандартизирована. Настоящие клинические исследования проводились согласно инструкциям ЕМЕА.

В соответствии с результатами значений индекса DAS28, а также значений критерия ACR, было показано значительное клиническое улучшение состояния пациентов при лечении антителами настоящего раскрытия. Улучшение после 4 недель весьма существенно.

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело или фрагмент антитела, которое специфически связывается с M-CSF, и где указанное антитело или фрагмент антитела способно предотвращать связывание M-CSF с рецептором MCSF при IC₅₀, равной 10 пМ или менее, в количественном анализе ингибирования связывания рецептора, при этом конечная концентрация M-CSF при анализе составляет 12,5 пМ, где указанное антитело или

   - 30 031471 фрагмент антитела включают:

   (a) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 8, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 9, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 10, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 11, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 12, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 13, (b) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 18, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 19, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 20, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 21, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 22, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 23, (c) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 28, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 29, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 30, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 31, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 32, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 33, (d) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 38, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 39, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 40, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 41, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 42, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 43, (e) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 48, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 49, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 50, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 51, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 52, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 53, (f) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 58, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 59, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 60, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 61, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 62, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 63, (g) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 88, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 89, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 90, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 91, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 92, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 93 или (h) участок HCDR1 последовательности SEQ ID NO: 98, участок HCDR2 последовательности SEQ ID NO: 99, участок HCDR3 последовательности SEQ ID NO: 100, участок LCDR1 последовательности SEQ ID NO: 101, участок LCDR2 последовательности SEQ ID NO: 102, участок LCDR3 последовательности SEQ ID NO: 103.
2. 2. Выделенное антитело или фрагмент антитела по п.1, где указанное антитело или фрагмент антитела включают:

   (a) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 15, (b) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 24 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 25, (c) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 35, (d) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 44 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 45, (e) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 54 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 55, (f) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 64 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 65, (g) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 94 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 95 или (h) вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 104 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO: 105.
3. 3. Выделенное антитело согласно любому из пп.1, 2, где указанное антитело относится к подтипу IgG1, который имеет эффекторную функцию, которая снижена по сравнению с подтипом IgG1 дикого типа.
4. 4. Выделенное антитело по п.3, где остаток аспарагиновой кислоты в положении 265 указанного антитела (нумерация в соответствии с указателем ЕС) заменен на остаток аланина.
5. 5. Выделенное антитело или фрагмент антитела согласно любому из пп.1-4, где указанное антитело или фрагмент антитела представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент или поликлональное антитело или его фрагмент.
6. 6. Антитело или фрагмент антитела согласно любому из пп.1-5, где указанное антитело или фрагмент антитела представляет собой человеческое или химерное, в частности гуманизированное, антитело или его фрагмент.

   - 31 031471
7. 7. Антитело или фрагмент антитела согласно любому из пп.1-6, где указанное антитело или фрагмент антитела перекрестно реагирует с M-CSF макака-крабоеда, М-CSF мыши и/или M-CSF крысы.
8. 8. Применение выделенного антитела или фрагмента антитела согласно любому из пп.1-7 для блокирования биоактивности M-CSF.
9. 9. Применение по п.8 для блокирования биоактивности M-CSF при лечении воспалительных расстройств.
10. 10. Фармацевтическая композиция для блокирования биоактивности M-CSF, содержащая выделенное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.
11. 11. Фармацевтическая композиция по п.10 для блокирования биоактивности М-CSF при лечении воспалительных расстройств.
12. 12. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-7.
13. 13. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.12.
14. 14. Выделенная клетка-хозяин, способная экспрессировать антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-7, содержащая вектор по п.13 или нуклеиновую кислоту по п.12.

    □ 50НМ □ 5нМ 0.5 НМ 0.05 НМ

    О