本開示は、IL−17Cの少なくとも特定領域を認識するいくつかの抗体または抗体フラグメントに関する。一態様において、本開示の抗体または抗体フラグメントは、IL−17Cに結合して、IL−17Cホモダイマーと複合体を形成する。好ましくは、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。好ましくは、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17Cに結合する。
定義:
用語「IL−17C」は、インターロイキン17Cとして知られているタンパク質を指す。
ヒトIL−17Cは、(UniProt Q9P0M4)のアミノ酸配列を有する:
PVLRPEEVL(配列番号27)は、配列番号1のアミノ酸aa89〜97に対応する。
VLRPEEVL(配列番号28)は、配列番号1のアミノ酸aa90〜97に対応する。
マウスIL−17Cは、(UniProt Q8K4C5)のアミノ酸配列を有する:
カニクイザルIL−17Cは、(XP_005592825.1)のアミノ酸配列を有する:
用語「ホモダイマー」は、例えばジスルフィド結合または非共有結合性の相互作用によって相互に結合する2つの同じ分子を指す。
用語「IL17RA」は、インターロイキン17受容体Aとして知られるタンパク質を指す。ヒトIL17RAは、(UniProt Q96F46)のアミノ酸配列を有する:
用語「IL17RE」は、インターロイキン17受容体Eとして知られるタンパク質を指す。ヒトIL17REは、(UniProt Q8NFR9)のアミノ酸配列を有する:
マウスIL17REは、(UniProt Q8BH06)のアミノ酸配列を有する:
用語「複合体」は、2つ以上の化合物が互いに結合または接触する場合に生じる実体を意味する。本明細書中で、複合体は、抗体または抗体フラグメントとその抗原との間で形成される。
本明細書中で用いられる「IL−17Cのアンタゴニスト」および「IL−17Cアンタゴニスト」は、IL−17Cの活性または機能を阻害するあらゆる分子を指す。用語IL−17Cアンタゴニストは、IL−17Cに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。好ましくは、本開示におけるIL−17Cアンタゴニストは、ヒトIL−17Cに特異的な抗体である。そのような抗体は、あらゆるタイプのものであってよく、例えば、マウス抗体、ラット抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体がある。
本明細書中で用いられる用語「抗体」は、(例えば、結合によって、立体障害によって、空間的分布の安定化によって)抗原と相互作用する、ジスルフィド結合によって相互に結合する少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書中でVHと略される)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書中でVLと略される)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。VH領域およびVL領域はさらに、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域に分割され得、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域に散在する。各VHおよび各VLは、3つのCDRおよび4つのFRで構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(C1q)が挙げられる宿主の組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、およびキメラ抗体を含む。抗体は、あらゆるアイソタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスであり得る。軽鎖および重鎖は双方とも、構造的相同性および機能的相同性の領域に分割される。
本明細書中で用いられるフレーズ「抗体フラグメント」は、抗原と(例えば、結合、立体障害、空間的分布の安定化によって)特異的に相互作用する能力を保持する抗体の1つまたは複数の部分を指す。結合フラグメントの例として、VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価のフラグメント、Fabフラグメント;ヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって結合する2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメント、F(ab)2フラグメント;VHドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;抗体の単腕のVLドメインおよびVHドメインからなるFvフラグメント;VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al.,(1989)Nature 341:544−546);ならびに単離される相補性決定領域(CDR)が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、合成リンカーによって結合することができ、これにより、VL領域およびVH領域が一価の分子を形成するように対形成している単一のタンパク質鎖として形成され得る(単鎖Fv(scFv)として知られている;例えば、Bird et al.,(1988)Science 242:423−426;およびHuston et al.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879−5883)参照)。そのような単鎖抗体もまた、用語「抗体フラグメント」内に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、フラグメントは、無傷抗体と同様にして、有用性の有無に関してスクリーニングされる。抗体フラグメントはまた、単一のドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v−NAR、およびbis−scFv中に組み込まれてもよい(例えばHollinger and Hudson,(2005)Nature Biotechnology 23:1126−1136参照)。抗体フラグメントは、ポリペプチド、例えばフィブロネクチンIII型(Fn3)(フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載する米国特許第6703199号明細書参照)に基づいて、スカフォールド中に融合されてよい。抗体フラグメントは、補足的な軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原−結合部位を形成する一対のタンデムFvセグメント(VH−CH1−VH−CH1)を含む単鎖分子中に組み込まれてよい(Zapata et al.,(1995)Protein Eng.8:1057−1062;および米国特許第5641870号明細書)。
用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合する領域を含む抗体または抗体フラグメントの部分を指す。抗原結合部位は、1つまたは複数の抗体可変ドメインによって提供され得る。好ましくは、抗原結合部位は、抗体または抗体フラグメントの関連するVHおよびVL内に含まれる。
本明細書中で用いられる「ヒト抗体」または「ヒト抗体フラグメント」は、フレームワーク領域およびCDR領域の双方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体および抗体フラグメントを含む。さらに、抗体が定常領域を含有するならば、定常領域もまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系配列もしくはヒト生殖細胞系配列の突然変異バージョン、または、例えば、Knappik et al.,(2000)J Mol Biol 296:57−86に記載されるヒトフレームワーク配列分析に由来する抗体含有コンセンサスフレームワーク配列に由来する。免疫グロブリン可変ドメイン、例えばCDRの構造および位置は、周知のナンバリングスキーム、例えば、Kabatナンバリングスキーム、Chothiaナンバリングスキーム、またはKabatおよびChothiaの組合せを用いて定義されてよい(例えば、Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services(1991),eds.Kabat et al.;Lazikani et al.,(1997)J.Mol.Bio.273:927−948);Kabat et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edit.,NIH Publication no.91−3242 U.S.Department of Health and Human Services;Chothia et al.,(1987)J.Mol.Biol.196:901−917;Chothia et al.,(1989)Nature 342:877−883;およびAl−Lazikani et al.,(1997)J.Mol.Biol.273:927−948参照)。
「ヒト化抗体」または機能的ヒト化抗体フラグメントは、本明細書中で、(i)抗体がヒト生殖細胞系配列に基づく、非ヒト源(例えば、異種免疫系を有する遺伝子導入マウス)に由来するもの、または(ii)可変ドメインのCDRが非ヒト起源である一方、可変ドメインの1つもしくは複数のフレームワークがヒト起源であり、定常ドメイン(もしあれば)がヒト起源である、CDR融合されているものと定義される。
用語「キメラ抗体」または機能的キメラ抗体フラグメントは、本明細書中で、ある種において見出される配列に由来する、またはこれに相当する定常抗体領域、および別の種に由来する可変抗体領域を有する抗体分子と定義される。好ましくは、定常抗体領域は、ヒト、例えばヒト生殖系列もしくはヒト体細胞において見出される配列に由来し、またはこれに相当し、可変抗体領域(例えばVH、VL、CDR、またはFR領域)は、非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、またはハムスターにおいて見出される配列に由来する。
用語「単離された」は、例えば、抗原特異性が異なる他の抗体または抗体フラグメントを実質的に含まない抗体または抗体フラグメントであり得る化合物を指す。さらに、単離された抗体または単離された抗体フラグメントは、他の細胞の物質および/または化学物質を実質的に含み得ない。ゆえに、一部の態様において、提供される抗体は、特異性が異なる抗体から分離された、単離された抗体である。単離された抗体は、モノクローナル抗体であってよい。単離された抗体は、組換えモノクローナル抗体であってよい。しかしながら、標的のエピトープ、アイソフォーム、または変異体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば他の種由来の、他の関連抗原に対する交差反応性を有し得る(例えば種ホモログ)。
本明細書中で用いられる用語「組換え抗体」は、組換え手段によって調製、発現、生成、または分離される全ての抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入もしくは染色体導入された動物(例えばマウス)またはそれから調製されたハイブリドーマから単離される抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離される抗体、組換え体から選択かつ単離される抗体、組合せヒト抗体ライブラリ、および、全てまたは一部のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のDNA配列へのスプライジングを伴う他のあらゆる手段によって調製、発現、生成、または分離される抗体を含む。好ましくは、そのような組換え抗体は、フレームワーク領域およびCDR領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発(または、ヒトIg配列について遺伝子導入した動物が用いられる場合、インビボ体細胞突然変異誘発)を受けてよいので、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系VHおよびVL配列に由来し、かつこれに関連する一方で、ヒト抗体生殖細胞系レパートリ内にインビボで本来存在し得ない配列である。組換え抗体は、モノクローナル抗体であってよい。ある実施形態において、本明細書中に開示される抗体および抗体フラグメントは、米国特許出願第13/321564号明細書または米国特許出願第13/299367号明細書に開示されるYlanthia(登録商標)抗体ライブラリから単離され、これらの出願は双方とも、参照によって本明細書中に組み込まれる。
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して固有の結合特異性および親和性を有する固有の結合部位を示す。
本明細書中で用いられる抗体は、当該抗体が、抗原と1つまたは複数の参照抗原とを識別することができる場合において、そのような抗原「に特異的に結合する」、抗原「に特異的である」、または抗原「を特異的に認識する」。というのも、結合特異性が絶対不変の性質でなく、相対的な特性であるからである。参照抗原は、1つまたは複数の密接に関連した抗原であり得、これ(ら)は、参照点、例えばIL17AまたはIL17Bとして用いられる。その最も一般的な形態において(そして、明確に言及されない場合)、「特異的な結合」は、例えば、以下の方法の1つに従って判定される、注目する抗原と無関係な抗原とを識別する抗体の能力を指すことになる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ELISA試験、RIA試験、ECL試験、IRMA試験、およびペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なELISAアッセイが実行されてよい。スコアリングは、標準的な発色(例えば、セイヨウワサビ過酸化水素を有する二次抗体、および過酸化水素とテトラメチルベンジジン)によって実行されてよい。あるウェル内の反応は、光学密度によって、例えば450nmにてスコアされる。典型的なバックグラウンド(=ネガティブ反応)は、0.1ODであり得る;典型的なポジティブ反応は、1ODであり得る。これは、ポジティブ/ネガティブの差が10倍を超え得ることを意味する。典型的には、結合特異性の判定は、単一の参照抗原ではなく、約3〜5個の無関係な抗原、例えばミルクパウダー、BSA、トランスフェリン等の一組を用いることによって、実行される。加えて、「特異的な結合」は、その標的抗原の様々な部分、例えばIL−17C、もしくはIL−17Cの受容体の様々なドメインもしくは領域、またはIL−17CもしくはIL−17Cの受容体の1つもしくは複数の重要なアミノ酸残基もしくはアミノ酸残基のストレッチを識別する抗体の能力に関係し得る。
用語「結合力」は、タンパク質間の複数の結合相互作用の組合せ強度を説明するのに用いられる。結合力は、単一の結合の強度を説明する親和性とは異なる。したがって、結合力は、結合の合計ではなく結合親和性の組合せ相乗強度(機能的親和性)である。本開示の抗体により、VH/VL対由来の双方の抗原結合部位は同時に、1つのIL−17Cホモダイマーと相互作用する。多くの結合相互作用が同時に存在するので、単一の各結合相互作用が(相対的親和性に応じて)容易に壊れ得る一方で、単一部位の結合が一時的に解かれても、分子は拡散し得ず、当該部位の結合は回復する可能性がある。全体的な効果は、抗体への抗原の相乗的な、強い結合である。
本明細書中で用いられる用語「親和性」は、ポリペプチドとその標的との、単一部位での相互作用の強度を指す。各部位内で、ポリペプチドの結合領域は、弱い非共有結合力を介して、その標的と多数の部位にて相互作用する;相互作用が多いほど、親和性は強い。
本明細書中で用いられる用語「KD」は、解離定数を指し、Kdの、Kaに対する比(すなわちKd/Ka)から得られ、かつモル濃度(M)として表される。例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分についてのKD値は、当該技術において十分に確立された方法を用いて、判定され得る。例えばモノクローナル抗体のような抗原結合部分のKDを判定する方法は、バイオセンサー系、例えばBiacore(登録商標)系を用いた、SET(可溶性の平衡滴定)または表面プラスモン共鳴である。本開示において、IL−17Cに特異的な抗体は典型的に、解離速度定数(KD)(kOff/kon)が5×10−2M未満、10−2M未満、5×10−3M未満、10−3M未満、5×10−4M未満、10−4M未満、5×10−5M未満、10−5M未満、5×10−6M未満、10−6M未満、5×10−7M未満、10−7M未満、5×10−8M未満、10−8M未満、5×10−9M未満、10−9M未満、5×10−10M未満、10−10M未満、5×10−11M未満、10−11M未満、5×10−12M未満、10−12M未満、5×10−13M未満、10−13M未満、5×10−14M未満、10−14M未満、5×10−15M未満、もしくは10−15M未満または以下である。
本明細書中で用いられる用語「二価分子」は、2つの抗原結合部位を有する分子を指す。一部の実施形態において、本発明の二価分子は、二価抗体またはその二価フラグメントである。一部の実施形態において、本発明の二価分子は、二価抗体である。一部の実施形態において、本発明の二価分子は、IgGである。一般に、モノクローナル抗体は、二価基本構造を有する。IgGおよびIgEは、二価単位を1つのみ有する一方、IgAおよびIgMは、複数の二価単位(それぞれ4および10)からなるので、より高次の価数を有する。この二価により、抗原に対する抗体の結合力が増大する。
本明細書中で用いられる用語「二価結合」または「に二価結合する」は、二価分子の双方の抗原結合部位の、その抗原への結合を指す。好ましくは、二価分子の抗原結合部位は双方とも、同じ抗原特異性を共有する。
「交差競合」は、標準的な競合結合アッセイにおける、他の抗体、抗体フラグメント、または抗原結合部分の、特定の抗原への結合に干渉する、抗体、抗体フラグメント、または他の抗原結合部分の能力を意味する。抗体、抗体フラグメント、または他の抗原結合部分が、別の抗体、抗体フラグメント、または抗原結合部分の、特定の抗原への結合に干渉することができるので、本発明に従って交差競合すると言えるかどうかの能力または程度は、標準的な競合結合アッセイを用いて判定され得る。適切な一アッセイは、Biacore技術の使用(例えば、BIAcore 3000機器(Biacore,Uppsala,スウェーデン)を用いる)を伴うものであり、これは、表面プラスモン共鳴技術を用いて、相互作用の程度を測定することができる。交差競合を測定する別のアッセイが、ELISAベースのアプローチを用いるものである。交差競合に基づく「エピトープビニング」抗体の高スループットプロセスが、国際特許出願国際公開第2003/48731号パンフレットに記載されている。調査中の抗体または抗体フラグメントが、表1に記載される抗体の1つの、IL−17Cへの結合を60%以上、特定すると70%以上、さらに特定すると80%以上引き下げるならば、そして表1に記載される抗体の1つが、IL−17Cへの前記抗体または前記抗体フラグメントの結合を60%以上、特定すると70%以上、さらに特定すると80%以上引き下げるならば、交差競合は存在する。
用語「エピトープ」は、本来なら分子と相互作用するが、抗体もしくはそのフラグメント、またはT細胞受容体によって特異的に認識されるあらゆるタンパク質領域を含む。一般に、エピトープは、アミノ酸、炭水化物、または糖側鎖等の分子の、化学的に活性がある表面グルーピングであり、一般に、特定の立体構造特性、および特定の電荷特性を有し得る。当業者によって理解されるように、抗体が特異的に結合し得る実質的に全てのものがエピトープであり得る。エピトープは、抗体が結合する残基を含み得、かつ「線状」または「立体構造」であり得る。用語「線状エピトープ」は、タンパク質と、相互作用する分子(例えば抗体)との相互作用の点の全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列(連続する)に沿って直線的に存在するエピトープを指す。用語「立体構造エピトープ」は、非連続的なアミノ酸が立体的な構造で協働するエピトープを指す。立体構造エピトープにおいて、相互作用の点は、互いに分離される、タンパク質上のアミノ酸残基の全体にわたって存在する。例えば、エピトープは、ペプチドマッピングまたはHDXによって示されるように、アミノ酸のストレッチ内の1つまたは複数のアミノ酸でもあり得るし、X線結晶解析によって示されるように、1つまたは複数の個々のアミノ酸でもあり得る。
「と同じエピトープに結合する」は、抗体、抗体フラグメント、または他の抗原結合部分の、特定の、そして例示される抗体とエピトープが同じ抗原に結合する能力を意味する。例示される抗体および他の抗体のエピトープは、エピトープマッピング技術を用いて決定され得る。エピトープマッピング技術は、当該技術において周知である。例えば、立体構造エピトープは、例えば水素/重水素交換、X線結晶解析、および二次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間立体構造を判定することによって、容易に同定される。
本発明の組成物は、治療用途に用いられても予防用途に用いられてもよい。したがって、本発明は、本発明の抗体(または機能的抗体フラグメント)、およびそれ用の医薬的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含有する医薬組成物を含む。関連する態様において、本発明は、炎症性障害を処置する方法を提供する。そのような方法は、それを必要とする対象に、本明細書において記載され、または意図される本発明の抗体を含有する医薬組成物の有効量を投与するステップを含有する。
本開示は、処置を必要とする対象に対する、開示されるIL−17C抗体の治療的に有効な量の投与を含む治療法を提供する。本明細書中で用いられる「治療的に有効な量」または「有効量」は、所望される生物学的応答を誘発するのに必要なIL−17C抗体の量を指す。本発明に従えば、治療的に有効な量は、疾患を処置かつ/または予防するのに必要なIL−17C抗体の量である。
用語「炎症性障害」または「炎症性疾患」は、互換的に用いられ、本明細書中で用いられる際、炎症と関連するあらゆる異常を指す。炎症性障害は、慢性的であっても急性的であってもよく、自己免疫疾患が挙げられ得る。
本文脈において用いられる「対象」は、あらゆる哺乳類を指し、齧歯類、例えばマウスまたはラット、および霊長類、例えばカニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル(Macaca mulatta)、またはヒト(Homo sapiens)が挙げられる。好ましくは、対象は、霊長類、最も好ましくはヒトである。
実施形態:
一実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。
一実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)を含む。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)を含む。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上の領域に結合し、当該領域は、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)を含む。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上の領域に結合し、当該領域は、ヒトIL−17Cのアミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)を含む。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ペプチドに結合し、当該ペプチドは、アミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)を含む。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ペプチドに結合し、当該ペプチドは、ヒトIL−17Cのアミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)を含む。更なる実施形態において、ペプチドは、アミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)から本質的になる。別の実施形態において、ペプチドは、アミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)からなる。更なる実施形態において、ペプチドは、アミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)から本質的になる。別の実施形態において、ペプチドは、アミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)からなる。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、配列番号1のアミノ酸aa89〜97の領域に結合する。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、配列番号1のアミノ酸aa90〜97の領域に結合する。
一実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基、ならびにヒトIL−17Cの1つまたは複数の領域aa98〜111(ADTHQRSISPWRY;配列番号29)、aa132〜146(CRGCIDARTGRETAAL;配列番号30)およびaa192〜197(TCVLPRSV;配列番号31)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)内の1つまたは複数のアミノ酸残基、ならびにヒトIL−17Cの1つまたは複数の領域aa98〜111(ADTHQRSISPWRY;配列番号29)、aa132〜146(CRGCIDARTGRETAAL;配列番号30)、およびaa192〜197(TCVLPRSV;配列番号31)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
更なる実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基、およびヒトIL−17Cの領域aa192〜197(TCVLPRSV;配列番号31)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
更なる実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸領域PVLRPEEVL(配列番号27)、およびヒトIL−17Cのアミノ酸領域aa192〜197(TCVLPRSV;配列番号31)を含む。
更なる実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基、ならびにヒトIL−17Cの領域aa98〜111(ADTHQRSISPWRY;配列番号29)、aa132〜146(CRGCIDARTGRETAAL;配列番号30)およびaa192〜197(TCVLPRSV;配列番号31)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマー上のエピトープに結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。別の実施形態において、エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
一実施形態において、IL−17Cに特異的な前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL−17Cの受容体への結合を阻止する。更なる実施形態において、IL−17Cに特異的な前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL17の受容体への結合を阻止し、前記受容体は、IL17REである。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL17REへの結合を阻止する。別の実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cアンタゴニストである。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、前記エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL17REへの結合を阻止する。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
ある実施形態において、IL−17Cに特異的な前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL−17Cの1つまたは複数の受容体への結合を阻止する。代わりの実施形態において、IL−17Cの受容体に特異的な前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL−17Cの受容体への結合を阻止し、IL17の受容体として、IL17REおよびIL17RAが挙げられる。代わりの実施形態において、IL−17Cの受容体に特異的な前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL17REおよびIL17RAへの結合を阻止する。
ある実施形態において、IL−17Cに特異的な前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL17REへの結合を阻止し、IC50濃度は、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、9pM、8pM、7pM、6pM、5pM、4pM、3pM、2pM、または1pM未満である。ある態様において、IC50濃度は、ELISA;SET、FACS、またはMSD(Meso Scale Discovery)によって判定され得る。
一実施形態において、開示される抗体または抗体フラグメントは、ヒトIL−17Cに特異的である。更なる実施形態において、IL−17Cに特異的な、開示される抗体または抗体フラグメントは、別の種のIL−17C、例えばマウス、ラット、アカゲザル、および/またはカニクイザル由来のIL−17Cと交差反応性である。別の実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、ヒトIL−17C、カニクイザルIL−17C、およびマウスIL−17Cに特異的である。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
一実施形態において、開示される抗体または抗体フラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列がコードされるヒトIL−17Cに特異的である。一実施形態において、開示される抗体または抗体フラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的である。更なる実施形態において、前記モノクローナル抗体または前記モノクローナル抗体フラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体である。別の実施形態において、開示される抗体または抗体フラグメントは、配列番号1のアミノ酸配列がコードされるヒトIL−17Cに特異的であり、かつモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである。
一実施形態において、IL−17Cに特異的な、開示される抗体または抗体フラグメントは、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである。
一実施形態において、IL−17Cに特異的な、開示される抗体または抗体フラグメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。ある実施形態において、IL−17Cに特異的な前記抗体または前記抗体フラグメントは、単離された抗体または単離された抗体フラグメントである。別の実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、組換え抗体または組換え抗体フラグメントである。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、組換えヒト抗体または組換えヒト抗体フラグメントである。更なる実施形態において、前記組換えヒト抗体または前記組換えヒト抗体フラグメントは、単離された組換えヒト抗体または単離された組換えヒト抗体フラグメントである。更なる実施形態において、前記組換えヒト抗体もしくは前記組換えヒト抗体フラグメント、または前記単離された組換えヒト抗体または前記単離された組換えヒト抗体フラグメントは、モノクローナルである。
別の実施形態において、本開示は、ヒトIL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL17REへの結合を阻止し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントである。
別の実施形態において、本開示は、ヒトIL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cの、IL17REへの結合を阻止し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントであり、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒト抗体もしくはヒト抗体フラグメント、ヒト化抗体もしくはヒト化抗体フラグメント、またはキメラ抗体もしくはキメラ抗体フラグメントである。
一実施形態において、開示される抗体または抗体フラグメントは、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含む。
一実施形態において、開示される抗体または抗体フラグメントは、IgGアイソタイプのものである。別の実施形態において、前記抗体は、IgG1である。
一実施形態において、前記抗体フラグメントは、二価抗体フラグメントである。
一実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーと複合体を形成し、前記複合体は、分子量が200kDa未満である。より詳細には、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーと複合体を形成し、形成された前記複合体の少なくとも50%は、分子量が200kDa未満である。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーと複合体を形成し、形成された前記複合体の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%は、分子量が200kDa未満である。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、ヒトIL−17C上のエピトープに結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
別の実施形態において、本開示は、表1に記載される抗体と交差競合する抗体または抗体フラグメントに言及する。一実施形態において、本開示は、抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、表1の抗体の1つの、Kabatによって定義される6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントと交差競合する。別の実施形態において、本開示は、ヒトIL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、表1の抗体の1つの、Kabatによって定義される6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントと、交差競合する。
別の実施形態において、本開示は、抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントと交差競合し、HCDR1は、配列番号7のアミノ酸配列であり、HCDR2は、配列番号8のアミノ酸配列であり、HCDR3は、配列番号9のアミノ酸配列であり、LCDR1は、配列番号10のアミノ酸配列であり、LCDR2は、配列番号11のアミノ酸配列であり、LCDR3は、配列番号12のアミノ酸配列である。別の実施形態において、本開示は、抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、配列番号14に従うVHおよび配列番号13に従うVLを含む抗体または抗体フラグメントと交差競合する。
別の実施形態において、本開示は、抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントと交差競合し、HCDR1は、配列番号17のアミノ酸配列であり、HCDR2は、配列番号18のアミノ酸配列であり、HCDR3は、配列番号19のアミノ酸配列であり、LCDR1は、配列番号20のアミノ酸配列であり、LCDR2は、配列番号21のアミノ酸配列であり、LCDR3は、配列番号22のアミノ酸配列である。別の実施形態において、本開示は、抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、配列番号24に従うVHおよび配列番号23に従うVLを含む抗体または抗体フラグメントと交差競合する。
更なる実施形態において、本開示は、抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、配列番号14に従うVHおよび配列番号13に従うVLを含む抗体もしくは抗体フラグメントと、または配列番号24に従うVHおよび配列番号23に従うVLを含む抗体または抗体フラグメントと交差競合する。
ある実施形態において、本開示は、表1に記載される抗体と交差競合して、表1に記載される抗体の1つの特異的な結合を、ELISAベースの交差競合アッセイにおいて少なくとも70%、80%、または90%引き下げる抗体または抗体フラグメントに言及する。ある実施形態において、本開示は、表1に記載される抗体と交差競合して、表1に記載される抗体の1つの、IL−17Cへの特異的な結合を、ELISAベースの交差競合アッセイで少なくとも70%、80%、または90%引き下げるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントに言及する。代表的なアッセイセットアップが、本開示において実施例6に説明されている。
別の実施形態において、本開示は、表1の抗体の1つと同じエピトープに(例えば、結合、安定化、空間的分布によって)結合する抗体または抗体フラグメントに言及する。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、表1の抗体の1つの、Kabatによって定義される6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントと同じエピトープに(例えば、結合、安定化、空間的分布によって)結合する。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、表1の抗体の1つの、Kabatによって定義される6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントと同じエピトープに(例えば、結合、安定化、空間的分布によって)結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸PVLRPEEVL(配列番号27)内に1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントは、表1の抗体の1つの、Kabatによって定義される6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントと同じエピトープに(例えば、結合、安定化、空間的分布によって)結合し、当該エピトープは、ヒトIL−17Cのアミノ酸VLRPEEVL(配列番号28)内の1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当該技術において周知のいくつものエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)Humana Press,Totowa,New Jersey参照。例えば、線状エピトープは、例えば、タンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを固体支持体上に同時に合成し、かつ、支持体に依然として付着しているペプチドを抗体と反応させることによって、判定され得る。そのような技術は、当該技術において知られており、例えば、米国特許第4708871号明細書;Geysen et al.,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:3998−4002;Geysen et al.,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:78−182;Geysen et al.,(1986)Mol.Immunol. 23:709−715に記載されている。同様に、立体構造エピトープは、アミノ酸の空間立体構造を判定することによって、例えば水素/重水素交換、X線結晶解析、および二次元核磁気共鳴によって、容易に同定される。例えば、前掲のEpitope Mapping Protocols参照。また、タンパク質の抗原性領域は、例えば、Oxford Molecular Groupから入手可能なOmigaバージョン1.0ソフトウェアプログラムを用いて算出されるような、標準的な抗原性および疎水性のプロットを用いて、同定され得る。このコンピュータプログラムは、Hopp/Woods法、Hopp et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78:3824−3828;を、抗原性プロファイルを判定するために、そしてKyte−Doolittle技術、Kyte et al.,(1982)J.Mol.Biol. 157:105−132を、疎水性プロットのために使用する。
さらに、エピトープ判定は、本開示の実施例8に記載される方法に従う質量分析によって実行され得る。
特に、本開示は、特定のエピトープに結合する抗体または抗体フラグメントに言及し、前記エピトープへの前記結合は、水素/重水素交換によって判定される。
一実施形態において、本開示は、表1のいずれかの抗体の、Kabatによって定義される6つのCDRを含む抗体または抗体フラグメントに言及する。別の態様において、本開示は、表1の各抗体の、Kabatによって定義される6つのCDRを含む、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。
ある実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cに、約100nM未満、より好ましくは約60nM未満、さらにより好ましくは約30nM未満の親和性で結合することができる。さらに好ましいのは、約10nM未満、より好ましくは約3nM未満の親和性でIL−17Cに結合する抗体または抗体フラグメントである。
ある実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cに、約100nM未満、より好ましくは約60nM未満、さらにより好ましくは約30nM未満の一価親和性で結合することができる。さらに好ましいのは、約10nM未満、より好ましくは約3nM未満の一価親和性でIL−17Cに結合する抗体または抗体フラグメントである。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cに対する二価親和性が、IL−17Cに対する一価親和性よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍、少なくとも10000倍、少なくとも100000倍高い。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントの二価親和性は、IgGフォーマットで判定され、前記抗体または前記抗体フラグメントの一価親和性は、Fabフォーマットで判定される。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cに対する一価親和性を有し、解離速度定数(KD)が、5×10−2M未満、10−2M未満、5×10−3M未満、10−3M未満、5×10−4M未満、10−4M未満、5×10−5M未満、10−5M未満、5×10−6M未満、10−6M未満、5×10−7M未満、10−7M未満、5×10−8M未満、10−8M未満、5×10−9M未満、10−9M未満、5×10−10M未満、10−10M未満、5×10−11M未満、10−11M未満、5×10−12M未満、10−12M未満、5×10−13M未満、10−13M未満、5×10−14M未満、10−14M未満、5×10−15M未満、または10−15M未満であり、二価フォーマットの前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cに対する親和性を有し、解離速度定数(KD)が、一価フォーマットの解離速度定数(KD)よりも少なくとも2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍低い。更なる実施形態において、前記抗体または前記抗体フラグメントの二価親和性は、IgGフォーマットで判定され、前記抗体または前記抗体フラグメントの一価親和性は、Fabフォーマットで判定される。
一実施形態において、本開示は、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列または複数の核酸配列を含む核酸組成物に言及する。別の実施形態において、本開示は、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントをコードする前記核酸配列または前記複数の核酸配列を含むベクターまたは複数のベクターを含むベクター組成物に言及する。別の実施形態において、本開示は、前記ベクター組成物を含む細胞に言及する。更なる実施形態において、前記細胞は、細菌細胞または哺乳類細胞である。
一実施形態において、本開示は、IL−17Cの不所望の存在と関連する障害または症状の処置のための、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントの使用に言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。別の実施形態において、IL−17Cの不所望の存在と関連する前記症状は、炎症性障害または癌である。
一実施形態において、本開示は、炎症性障害の処置のための、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントの使用に言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。他の態様において、本開示は、炎症性障害の処置のための、医薬の調製時の、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントの使用に言及する。更なる実施形態において、本開示は、対象における炎症性障害の処置方法であって、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む処置方法に言及する。
一実施形態において、本開示は、癌の処置のための、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントの使用に言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。他の態様において、本開示は、癌の処置のための、医薬の調製時の、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントの使用に言及する。更なる実施形態において、本開示は、対象における癌の処置方法であって、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に言及する。
一実施形態において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントを含む組成物に言及し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成し、組成物はさらに、1つまたは複数の医薬的に許容可能なキャリアおよび/または希釈剤を含む。一実施形態において、前記組成物は、医薬組成物である。更なる実施形態において、前記組成物は、それを必要とする対象において、IL−17Cに拮抗することができる。更なる実施形態において、前記組成物は、医薬組成物であり、それを必要とする対象において、IL−17Cに拮抗することができる。
更なる実施形態において、前記医薬組成物はさらに、1つまたは複数の医薬的に許容可能なキャリアおよび/または希釈剤を含む。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cの不所望の存在と関連する障害または症状の処置のための、前記医薬組成物の使用に言及する。別の実施形態において、IL−17Cの不所望の存在と関連する前記症状は、炎症性障害または癌である。
本開示の組成物は、好ましくは、炎症性障害または癌の処置のための、本明細書中に開示される、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメント、および医薬的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物である。
別の実施形態において、本開示は、対象における炎症性障害の予防方法に言及し、前記方法は、IL−17Cアンタゴニストを前記対象に投与することを含む。本文脈において用いられる「予防」は、疾患の発症を予防することを意図し、または疾患の発症を遅延させる方法に言及する。
更なる実施形態において、本開示は、炎症性障害の処置のための、IL−17Cに特異的な、単離された抗体または単離された抗体フラグメントを含む組成物の使用に言及し、前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。他の態様において、本開示は、炎症性障害の処置のための、医薬の調製時の、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントの使用に言及する。更なる実施形態において、本開示は、対象における炎症性障害の処置方法であって、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に言及する。
一部の実施形態において、前記対象は、ヒトである。代わりの態様において、前記対象は、齧歯類、例えばラットまたはマウスである。
別の実施形態において、本開示は、癌の処置のための、IL−17Cに特異的な、単離された抗体または単離された抗体フラグメントを含む組成物の使用に言及し、前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。更なる実施形態において、本開示は、癌の処置に用いられる、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントに言及する。別の実施形態において、本開示は、癌の処置のための、医薬の調製時の、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントの使用に言及する。別の実施形態において、本開示は、対象における癌の処置方法であって、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法に言及する。
一部の実施形態において、本開示の、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントは、皮下に投与される。他の態様において、本開示の、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントは、静脈内に、関節内に、または脊髄内に投与される。
そのようなキャリア、希釈剤、および賦形剤は、当該技術において周知であり、当業者であれば、本開示のIL−17C抗体またはIL−17C抗体フラグメントにより対象を処置するのに最も適した製剤および投与経路を見出すであろう。
一実施形態において、本開示は、表1のいずれかの抗体のVHおよびVLを含む、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。
別の実施形態において、本開示は、単離されたモノクローナル抗体またはそのフラグメントをコードする核酸に言及し、当該核酸は、表1のいずれかの抗体のVHおよびVLを含む。
一実施形態において、本開示は、本明細書中に開示される抗体または抗体フラグメントの生成、同定、または選択のための方法に関し、当該方法は、以下のステップを含む:
(a)IL−17Cに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを同定するステップと;
(b)抗原、およびステップ(a)において同定された抗体または抗体フラグメントを混合するステップと;
(c)ステップ(b)によって得られた混合物を、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)にかけて、形成された複合体の分子量を判定するステップと、
(d)前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを選択するステップ。
別の実施形態において、本開示は、抗体または抗体フラグメントの生成、同定、または選択のための方法に関し、前記抗体または前記抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成し、当該方法は、以下のステップを含む:
(a)IL−17Cに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを同定するステップと;
(b)抗原、およびステップ(a)において同定された抗体または抗体フラグメントを混合するステップと;
(c)ステップ(b)によって得られた混合物を、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)にかけて、形成された複合体の分子量を判定するステップと、
(d)前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを選択するステップ。
開示された方法の別の実施形態において、ステップ(b)における前記抗原および前記抗体または前記抗体フラグメントは、等モル量で混合される。
更なる実施形態において、開示された方法のステップ(d)は、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを選択し、前記複合体は、分子量が200kDa未満である。より詳細には、ステップ(d)は、IL−17Cホモダイマーと複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを選択し、形成された前記複合体の少なくとも50%は、分子量が200kDa未満である。更なる実施形態において、ステップ(d)は、IL−17Cホモダイマーと複合体を形成する抗体または抗体フラグメントを選択するステップを含み、形成された前記複合体の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%は、分子量が200kDa未満である。
別の実施形態において、本開示は、IL−17Cホモダイマーに二価結合する能力がある抗体または抗体フラグメントに言及する。別の態様において、抗体または抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記抗体または前記抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する能力がある。
操作かつ修飾された抗体
本開示の抗体または抗体フラグメントは、修飾された抗体または抗体フラグメントであってよい。本開示の一実施形態において、修飾された抗体または抗体フラグメントは、表1に示される抗体に由来する。これにより、表1に示される抗体は、修飾抗体を操作するための開始材料として用いられ得る。
抗体は、一方または双方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内の、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内の、かつ/または1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数の残基を修飾することによって、操作され得る。加えて、または代わりに、抗体は、定常領域内の残基を修飾することによって、例えば抗体のエフェクタ機能を変えるように、操作され得る。
抗体を操作または修飾することによって、親クローンの変異体の向上が達成され得る。一方、例えば親和性を向上させ、免疫原性を引き下げ、そして抗体のエフェクタ機能を増大させるための種々の技術が、当該技術において確立されている。
抗体は主に、6つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域(CDR)内に位置決めされるアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。ゆえに、親和性成熟は、抗体の結合特性を変えるような特定のCDRの修飾を含む。親和性成熟は、超可変領域内の部位特異的突然変異誘発を含み、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含み得る。別のタイプの親和性成熟は、各CDRのライブラリによる、特定の抗体内の特定のCDRの完全な置換を含む。そこで直ちに、修飾抗体は、標準的な抗原結合アッセイ(例えばELISA、FACS、BiaCore、SET分析)で、各抗原に対する親和性の向上について分析されてよい(例えば、Riechmann et al.,(1998)Nature 332:323−327;Jones et al.,(1986)Nature 321:522−525;Queen et al.,(1989)Proc.Natl.Acad.,U.S.A. 86:10029−10033;Winterの米国特許第5225539号明細書、ならびにQueen et al.の米国特許第5530101号明細書;米国特許第5585089号明細書;米国特許第5693762号明細書および米国特許第6180370号明細書参照)。
CDR配列がほとんどの抗体−抗原相互作用に関わっているので、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に融合された、特定の、天然に存在する抗体由来のCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の、天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公開のDNAデータベースまたは公開されている参考文献から得られ得る。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖細胞系DNA配列は、「Vase」ヒト生殖細胞系配列データベース(インターネット上でwww.mrc−cpe.cam.ac.uk/vbaseにて入手可能)において、そしてKabat et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242;Chothia et al.,(1987)J.Mol.Biol. 196:901−917;Chothia et al.,(1989)Nature 342:877−883;Al−Lazikani et al.,(1997)J.Mol.Biol.273:927−948;Tomlinson et al.,(1992)J.fol.Biol.227:776−798;およびCox et al.,(1994)Eur.J Immunol.24:827−836において見出され得る;それぞれの内容は、参照によって本明細書中に明確に組み込まれる。
二重特異的分子および多価抗体
別の態様において、本開示は、IL−17Cに特異的な抗原結合部位を含む二重パラトープ的な、二重特異的な、または多特異的な(multispecific or polyspecific)分子を特徴とする。
別の態様において、二重特異的な抗原結合分子は、二重特異的scFv、四価の二重特異的抗体、架橋Fab、または二重特異的IgGからなる群から選択される。
別の態様において、本開示は、IL−17C特異的抗体に由来する少なくとも2つの抗原結合部位を含む多価化合物を提供する。別の態様において、前記抗原結合部位は、タンパク質融合、または共有結合もしくは非共有結合を介して相互に結合し得る。
四価化合物は、例えば、本開示の抗体を、本開示の抗体の定常領域、例えばFcまたはヒンジ領域に結合する抗体と架橋結合させることによって、得られ得る。三量体化ドメインは、例えば、Boreanの欧州特許第1012280B1号明細書に記載されている。五量体化モジュールは、例えば、国際出願PCT/EP97/05897号明細書に記載されている。
本開示の抗体、またはその抗原結合領域は、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子を生成するために、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例えば、別の抗体、または受容体に対するリガンド)に結合してよい。
本開示の二重特異的分子を生成するために、抗体は、1つまたは複数の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド、または結合模擬物に(例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合、またはそれ以外によって)機能的に結合して、二重特異的分子が生じ得る。
本開示の二重特異的分子は、当該技術において知られている方法を用いて、結合特異性を有する構成成分を結合させることによって、調製され得る。例えば、それぞれ結合特異性を有する二重特異的分子が、別々に生じてから、互いに結合し得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドにある場合、種々のカップリング剤または交差結合剤が、共有結合に用いられ得る。架橋結合剤の例として、プロテインA、カルボジイミド、N−スクシンイミジル−S−アセチル−チオアセテート(SATA)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、o−フェニレンジマレイミド(oPDM)、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(sulfo−SMCC)が挙げられる(例えば、Karpovsky et al.,(1984)J.Exp.Med.160:1686;Liu et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648参照)。他の方法として、Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78:118−132;Brennan et al.,(1985)Science 229:81−83)、およびGlennie et al.,(1987)J.Immunol.139:2367−2375)に記載されるものが挙げられる。結合剤は、SATAおよびsulfo−SMCCであり、双方ともPierce Chemical Co.(Rockford,IL)から入手可能である。
結合特異性が抗体にある場合、これらは、2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合し得る。特定の実施形態において、ヒンジ領域は、結合前に、奇数、例えば1つのスルフヒドリル残基を含有するように修飾される。
これ以外にも、双方の結合特異性は、同じベクター内にコードされて、同じ宿主細胞内で発現され、かつ組み立てられ得る。この方法は、二重特異的分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2、またはリガンド×Fabの融合タンパク質である場合に、特に有用である。本開示の二重特異的分子は、1つの単鎖抗体および結合決定因子を含む単鎖分子であってもよいし、2つの結合決定因子を含む単鎖二重特異的分子であってもよい。二重特異的分子は、少なくとも2つの単鎖分子を含んでよい。二重特異的分子を調製する方法は、例えば、米国特許第5260203号明細書;米国特許第5455030号明細書;米国特許第4881175号明細書;米国特許第5132405号明細書;米国特許第5091513号明細書;米国特許第5476786号明細書;米国特許第5013653号明細書;米国特許第5258498号明細書;および米国特許第5482858号明細書に記載されている。
更なる臨床的利益が、2つ以上の抗原の、一抗体内での結合によって与えられ得る(Morrison et al.,(1997)Nature Biotech.15:159−163;Alt et al.(1999)FEBS Letters 454:90−94;Zuo et al.,(2000)Protein Engineering 13:361−367;Lu et al.,(2004)JBC 279:2856−2865;Lu et al.,(2005)JBC 280:19665−19672;Marvin et al.,(2005)Acta Pharmacologica Sinica 26:649−658;Marvin et al.,(2006)Curr Opin Drug Disc Develop 9:184−193;Shen et al.,(2007)J Immun Methods 218:65−74;Wu et al.,(2007)Nat Biotechnol.11:1290−1297;Dimasi et al.,(2009)J Mol Biol.393:672−692;およびMichaelson et al.,(2009)mAbs 1:128−141)。
二重特異的分子、または交差反応性分子の、特定の標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射免疫アッセイ(REA)、FACS分析、バイオアッセイ(例えば増殖阻害)、またはウェスタンブロットアッセイによって確認され得る。これらのアッセイはそれぞれ、一般に、注目する複合体に特異的な標識試薬(例えば抗体)を使用することによって、特に注目する抗原−抗体複合体の存在を検出する。
スカフォールド
「抗原−結合部位」を含む他の抗体/免疫グロブリンフレームワークまたはスカフォールドが、本開示に則して使用され得る。これとして、本開示のCDRが融合し得る非免疫グロブリンベースの抗体およびスカフォールドが挙げられる。
フィブロネクチンスカフォールドは、フィブロネクチンIII型ドメイン(例えば、フィブロネクチンIII型(10個のFn3ドメイン)の第10のモジュール)に基づく。フィブロネクチンIII型ドメインは、7つまたは8つのベータ鎖が2つのβシートの間に分配されており、それら自身は互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、さらにループ(CDRに類似)を含有し、これがベータ鎖を互いに連結して、溶媒曝露される。ベータシートサンドイッチの各エッジに少なくとも3つのそのようなループが存在し、エッジは、ベータ鎖の方向に直角をなすタンパク質の境界である(米国特許第6818418号明細書参照)。これらのフィブロネクチンベースのスカフォールドは、免疫グロブリンではない。しかし、折畳みの全体は、最も小さな機能抗体フラグメントの折畳み、重鎖の可変領域に密接に関係し、これはラクダIgGおよびラマIgGにおける完全な抗原認識単位を含む。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、抗体の抗原結合特性と事実上同様である抗原結合特性、および抗体の抗原結合特性への親和性を模倣する。これらのスカフォールドは、ループランダム化、および抗体のインビボ親和性成熟のプロセスに類似するインビトロシャッフリング戦略に用いられ得る。これらのフィブロネクチンベースの分子は、分子のループ領域が、標準的なクローニング技術を用いて本開示のCDRと置換され得るスカフォールドとして用いられ得る。
新大陸のメンバー、例えばラマ種(アルパカ(Lama paccos)、ラマ(Lama glama)、およびビクーニャ(Lama vicugna))を含むラクダ(camel)およびヒトコブラクダ(dromedary)(フタコブラクダ(Camelus bactrianus)およびヒトコブラクダ(Calelus dromaderius))ファミリのメンバーから得られるラクダ科抗体タンパク質が、ヒト対象について、サイズ、構造の複雑性、および抗原性に関して特徴付けられた。自然界で見出される哺乳類のこの科由来のあるIgG抗体は、軽鎖を欠いているので、他の動物由来の、抗体が2つの重鎖および2つの軽鎖を有する典型的な4つの鎖の四次構造とは、構造的に異なっている。国際公開第1994/04678号パンフレット参照。
アンキリン技術は、様々な標的への結合に用いられ得る、可変領域をもたらすスカフォールドとしての、アンキリン由来繰返しモジュールを有するタンパク質の使用に基づく。アンキリン繰返しモジュールは、2つの逆平行αヘリックスおよびβターンからなる33個のアミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、ほとんどの場合、リボソームディスプレイを用いて最適化される。
アビマーは、天然のA−ドメインに由来する。当該ドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に生来用いられており、ヒトにおいて、250を超えるタンパク質は構造的に、Aドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して結合されるいくつかの異なる「Aドメイン」モノマー(2〜10)からなる。例えば、米国特許出願公開第2004/0175756号明細書;米国特許出願公開第2005/0053973号明細書;米国特許出願公開第2005/0048512号明細書;および米国特許出願公開第2006/0008844号明細書に記載される方法論を用いて、標的抗原に結合することができるアビマーを生成することができる。
アフィボディ親和性リガンドは、プロテインAのIgG結合ドメインの1つのスカフォールドに基づく3つのヘリックスバンドルで構成される小さな、単純なタンパク質である。プロテインAは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の表面タンパク質である。このスカフォールドドメインは、58個のアミノ酸からなり、このうち13個が無作為化されて、多数のリガンド変異体とアフィボディライブラリが生成される(例えば、米国特許第5831012号明細書参照)。アフィボディ分子模倣体抗体;分子量は、150kDaである抗体の分子量に対して、6kDaである。その小さなサイズにも拘らず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位に類似している。
アンチカリンは、Pieris ProteoLab AG社によって開発された製品である。これは、リポカリンに由来し、化学的に影響され易い、または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常関与する、小さな、かつロバストなタンパク質の広範囲にわたるグループである。いくつかの天然のリポカリンは、ヒトの組織または体液中に存在する。タンパク質構造は、剛性のフレームワークの上部に超可変ループを有する免疫グロブリンを思い出させる。しかしながら、抗体またはその組換えフラグメントと対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりも僅かに大きいだけである、160〜180個のアミノ酸残基を有する単ポリペプチド鎖で構成される。結合ポケットを構成する4つのループのセットは、顕著な構造的可塑性を示し、かつ種々の側鎖を許容する。ゆえに、結合部位は、独自のプロセスにおいて再構築されて、親和性および特異性が高い、異なる形状の規定された標的分子を認識することができる。リポカリンファミリの一タンパク質、オオモンシロチョウ(Pieris Brassicae)のビリン−結合タンパク質(BBP)が用いられて、4つのループのセットに突然変異を起こさせることによって、アンチカリンが開発された。アンチカリンを記載する特許出願の一例が、PCT公報国際公開第1999/16873号パンフレットにある。
アフィリン分子は、タンパク質および小分子に対する特異的な親和性について設計される、小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新しいアフィリン分子は、2つのライブラリから非常に迅速に選択され得、それらはそれぞれ、ヒト由来の異なるスカフォールドタンパク質に基づく。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対して少しの構造相同性も示さない。現在では、2つのアフィリンスカフォールドが使用されており、一方が、ヒトの構造的な眼水晶体タンパク質、ガンマクリスタリンであり、他方が、「ユビキチン」スーパーファミリタンパク質である。ヒトスカフォールドは双方とも、非常に小さく、高い温度安定性を示し、かつpH変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高い安定性は主に、タンパク質の拡張ベータシート構造に起因する。ガンマクリスタリン由来タンパク質の例が、国際公開第2001/04144号パンフレットに記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例が、国際公開第2004/106368号パンフレットに記載されている。
タンパク質エピトープ模擬物(PEM)は、タンパク質のベータヘアピン二次構造を模倣する中サイズの、環状の、ペプチド様の分子(MW1〜2kDa)であり、主要な二次構造がタンパク質−タンパク質相互作用に関与する。
抗体の生成
(i)抗体をコードする核酸
本開示は、先に記載される抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、表1において同定される核酸分子である。本開示の一部の他の核酸分子は、表1において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に(例えば、少なくとも65、80%、85%、90%、95%、または99%)同一であるヌクレオチド配列を含む。先に言及される核酸の、従来の、かつ適切な発現ベクター中へのサブクローニング、および適切な発現系における前記発現ベクターの発現は、IL−17Cに特異的に結合するこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを生じさせる。
また、本開示において提供されるのは、先に示される抗体の重鎖または軽鎖由来の少なくとも1つのCDR領域、通常3つ全てのCDR領域をコードするポリヌクレオチドである。一部の他のポリヌクレオチドは、先に示される抗体の重鎖および/または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。組成物が遺伝コードを構成するため、種々の核酸配列が、各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードすることとなる。
ポリヌクレオチド配列は、IL−17Cまたはその結合フラグメントに特異的な抗体をコードする既存の配列(例えば、以下の実施例に記載される配列)の新規の固相DNA合成によって、またはPCR突然変異誘発によって、生産され得る。核酸の直接的化学合成は、当該技術において知られている方法、例えばNarang et al.,(1979)Meth.Enzymol.68:90のホスホトリエステル法;Brown et al.,(1979)Meth.Enzymol. 68:109のリン酸ジエステル法;Beaucage et al.,(1981)Tetra.Lett.,22:1859のジエチルホスホロアミデート法;および米国特許第4458066号明細書の固体支持体法によって達成され得る。PCRによるポリヌクレオチド配列への突然変異の導入は、例えば、PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(Ed.),Freeman Press,NY,NY,1992;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innis et al.(Ed.),Academic Press,San Diego,CA,1990;Mattila et al.,(1991)Nucleic Acids Res.19:967;およびEckert et al.,(1991)PCR Methods and Applications 1:17に記載されるように実行され得る。
また、本開示において提供されるのは、先に記載される抗体または抗体フラグメントを産生する発現ベクターおよび宿主細胞である。種々の発現ベクターが、IL−17C特異的抗体鎖または結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを発現するために使用され得る。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターの双方が、哺乳類の宿主細胞において抗体を産生するのに用いられ得る。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系として、典型的にはタンパク質またはRNAを発現する発現カセットを有するプラスミド、エピソームベクター、およびヒト人工染色体(例えば、Harrington et al.,(1997)Nat Genet 15:345参照)が挙げられる。例えば、哺乳類(例えばヒト)細胞におけるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとして、pThioHis A,B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A,B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSVベクター、および他のタンパク質を発現する、当該技術において知られている他の多数のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、SV40、乳頭腫ウイルス、HBP Epstein Barrウイルス、ワクシニアウイルス、およびSemliki Forestウイルス(SFV)に基づくベクターが挙げられる。Brent et al.,(1995)Annu.Rev.Microbiol.49:807;およびRosenfeld et al.,(1992)Cell 68:143参照。
発現ベクターの選択は、ベクターが発現されることになる、意図された宿主細胞によって決まる。典型的には、発現ベクターは、抗体鎖またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結するプロモータおよび他の調節配列(例えばエンハンサ)を含有する。一部の実施形態において、誘導条件下以外では、挿入された配列の発現を防止する誘導プロモータが使用される。誘導プロモータとして、例えば、アラビノース、lacZ、メタロチオネインプロモータ、またはヒートショックプロモータが挙げられる。形質転換された生体の培養体は、発現産物が宿主細胞によってより都合よく許容される配列をコードするように集団にバイアスをかけることなく、非誘導条件下で拡張され得る。プロモータに加えて、他の調節要素が、抗体鎖またはフラグメントの効率的な発現のために必要とされてもよいし、所望されてもよい。当該要素は典型的に、ATG開始コドンおよび隣接するリボソーム結合部位または他の配列を含む。また、発現効率は、使用される細胞系に適したエンハンサの包含によって、増強され得る(例えば、Scharf et al.,(1994)Results Probl.Cell Differ.20:125;およびBittner et al.,(1987)Meth.Enzymol.,153:516参照)。例えば、SV40エンハンサまたはCMVエンハンサが、哺乳類宿主細胞における発現を増大させるのに用いられてよい。
発現ベクターはまた、挿入された抗体配列によってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するような分泌シグナル配列位置を提供してよい。より多くの場合、挿入された抗体配列は、ベクター内の包含前に、シグナル配列に連結される。抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードする配列を受け入れるのに用いられることになるベクターはまた、定常領域またはその一部をコードしてもよい。そのようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての、可変領域の発現を可能にし、これによって無傷の抗体または抗体フラグメントが産生される。典型的には、そのような定常領域は、ヒトのものである。
抗体鎖を収容し、かつ発現する宿主細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。大腸菌(E.coli)は、本開示のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用である原核生物宿主の一つである。使用に適した他の微生物宿主として、桿菌、例えば枯草菌(Bacillus subtilis)および他のエンテロバクター科、例えばサルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、および種々のシュードモナス(Pseudomonas)属の種が挙げられる。これらの原核生物宿主において、当業者は、発現ベクターを作製することもでき、これは典型的に、宿主細胞に適合する発現制御配列(例えば複製起源)を含有する。また、種々の周知の多くのプロモータが存在するであろう。例えば、ラクトースプロモータ系、トリプトファン(trp)プロモータ系、ベータラクタマーゼプロモータ系、またはファージラムダ由来のプロモータ系がある。プロモータは典型的に、場合によってはオペレータ配列により、発現を制御し、そして、転写および翻訳を開始かつ完了するためのリボソーム結合部位配列等を有する。他の微生物、例えば酵母もまた、本開示のポリペプチドを発現するのに使用され得る。昆虫細胞が、バキュロウイルスベクターと組み合わせて用いられてもよい。
一部の好ましい実施形態において、哺乳類宿主細胞が、本開示の、IL−17Cに特異的な抗体または抗体フラグメントを発現かつ生成するのに用いられる。例えばこれは、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株であってよい。好ましくは、外来性発現ベクターを収容する哺乳類細胞株が用いられ、動物またはヒトのあらゆる正常な致死細胞、または正常もしくは異常な不死細胞(例えば、SP2/0骨髄腫細胞、CHO細胞、HeLa細胞、PER.06細胞、COS細胞、HKB11細胞、NS0細胞)が挙げられる。例えば、無傷の免疫グロブリンを分泌することができる、CHO細胞株、種々のCos細胞株、HeLa細胞、骨髄腫細胞株、形質転換されたB細胞、およびハイブリドーマが挙げられるいくつかの適切な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳類組織細胞培養の使用が、例えば、Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987において一般に考察されている。哺乳類宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起源、プロモータ、およびエンハンサ(例えば、Queen et al.,(1986)Immunol.Rev. 89:49−68参照)、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ配列を含み得る。これらの発現ベクターは、通常、哺乳類の遺伝子に、または哺乳類のウイルスに由来するプロモータを含有する。適切なプロモータは、構成的であり、細胞型特異的であり、時期特異的であり、かつ/または変調可能もしくは調節可能であり得る。有用なプロモータとして、メタロチオネインプロモータ、構成的アデノウイルス主要後期プロモータ、デキサメタゾン誘導可能MMTVプロモータ、SV40プロモータ、MRP pol IIIプロモータ、構成的MPSVプロモータ、テトラサイクリン誘導可能CMVプロモータ(例えばヒト最初期CMVプロモータ)、構成的CMVプロモータ、および当該技術において知られているプロモータ−エンハンサの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
注目するポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主型に応じて変わる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは一般的に、原核生物細胞に利用されるが、リン酸カルシウム処置またはエレクトロポーレーションは、他の細胞宿主に用いられ得る(一般に、前掲のSambrook,et al.参照)。他の方法として、例えば、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、インジェクションおよびマイクロインジェクション、弾道法、ウイロゾーム、免疫リポソーム、ポリカチオン核酸結合体、裸DNA、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質VP22への融合(Elliot and O’Hare,(1997)Cell 88:223)、剤増強DNA吸収、ならびにエキソビボ形質導入が挙げられる。組換えタンパク質の長期の、高収率産生のために、安定した発現が多くの場合所望されることとなる。
(ii)モノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体(mAb)は、従来のモノクローナル抗体の方法論が挙げられる種々の技術、例えばKohler and Milstein,(1975)Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術によって生産され得る。モノクローナル抗体を生産する多くの技術、例えば、B−リンパ球のウイルス性形質転換または発癌性形質転換が使用され得る。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生産は、確立した手順である。融合用の免疫化脾細胞の単離のための免疫化プロトコルおよび免疫化技術が、当該技術において知られている。融合パートナー(例えばマウス骨髄腫細胞)および融合手順もまた知られている。
本開示のキメラ抗体またはヒト化抗体は、先に記載されるように調製されたマウスのモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードするDNAは、標準的な分子生物学技術を用いて、注目するマウスハイブリドーマから得られ得、そして非マウス(例えばヒト)免疫グロブリン配列を含有するように操作され得る。例えば、キメラ抗体を生成するために、マウス可変領域は、当該技術において知られている方法(例えば、Cabilly et al.の米国特許第4816567号明細書参照)を用いて、ヒト定常領域に結合され得る。ヒト化抗体を生成するために、マウスCDR領域は、当該技術において知られている方法を用いて、ヒトフレームワーク中に挿入され得る。例えば、Winter et al.の米国特許第5225539号明細書、ならびにQueen et al.の米国特許第5530101号明細書;米国特許第5585089号明細書;米国特許第5693762号明細書および米国特許第6180370号明細書参照。
ある実施形態において、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保持する遺伝子導入マウスまたはトランスクロモソミックマウスを用いて、生成され得る。これらの遺伝子導入マウスおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書中でそれぞれHuMAbマウスおよびKMマウスと呼ぶマウスを含み、そして一括して本明細書中で「ヒトIgマウス」と呼ぶ。
HuMAbマウス(登録商標)(Medarex,Inc.)は、非再配列ヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖の免疫グロブリン配列を、内在性のμ鎖遺伝子座およびκ鎖遺伝子座を不活化する標的突然変異と共にコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する(例えば、Lonberg,et al.,(1994) Nature 368(6474):856−859参照)。したがって、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の引下げを示し、そして免疫化に応じて、ヒトの導入された重鎖および軽鎖の導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、親和性の高いヒトIgGKモノクローナルを生成する(Lonberg et al.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49−101;Lonberg and Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65−93、およびHarding and Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536−546)。HuMAbマウスの調製および使用、ならびにそのようなマウスによって保持されるゲノム修飾はさらに、Taylor et al.,(1992)Nucleic Acids Research 20:6287−6295;Chen et al.,(1993)International Immunology 5:647−656;Tuaillon et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3720−3724;Choi et al.,(1993)Nature Genetics 4:117−123;Chen et al.,(1993)EMBO J.12:821−830;Tuaillon et al.,(1994)J.Immunol.152:2912−2920;Taylor et al.,(1994)International Immunology 579−591;およびFishwild et al.,(1996)Nature Biotechnology 14:845−851に記載されている。これらの全ての内容は、その全体が参照によって本明細書中に明確に組み込まれる。さらに、米国特許第5545806号明細書;米国特許第5569825号明細書;米国特許第5625126号明細書;米国特許第5633425号明細書;米国特許第5789650号明細書;米国特許第5877397号明細書;米国特許第5661016号明細書;米国特許第5814318号明細書;米国特許第5874299号明細書;および米国特許第5770429号明細書(全てLonberg and Kay);米国特許第5545807号明細書(Surani et al.);PCT公報国際公開第1992/103918号パンフレット、国際公開第1993/12227号パンフレット、国際公開第1994/25585号パンフレット、国際公開第1997/113852号パンフレット、国際公開第1998/24884号パンフレットおよび国際公開第1999/45962号パンフレット(全てLonberg and Kay);ならびにPCT公報国際公開第2001/14424号パンフレット参照。
別の実施形態において、本開示のヒト抗体は、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を有するマウスを用いて、与えられ得る。そのようなマウスは、本明細書中で「KMマウス」と呼び、Ishida et al.のPCT公報国際公開第2002/43478号パンフレットに詳細に記載されている。
さらに、代わりのトランスジェニック動物系、例えばXenomouse(Abgenix,Inc.)が用いられ得る。そのようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第5939598号明細書;米国特許第6075181号明細書;米国特許第6114598号明細書;米国特許第6150584号明細書および米国特許第6162963号明細書に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する、代わりのトランスクロモソミック動物系が、当該技術において入手可能であり、本開示の抗体を与えるのに用いられ得る。例えば、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の双方を有する、「TCマウス」と呼ばれるマウスが用いられ得る;そのようなマウスは、Tomizuka et al.,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722−727に記載されている。さらに、ヒトの重鎖および軽鎖の導入染色体を有するウシが、当該技術に記載されており(Kuroiwa et al.,(2002)Nature Biotechnology 20:889−894)、本開示の抗体を与えるために用いられ得る。
また、好ましくは、本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするファージディスプレイ法を用いて調製され得る。ヒト抗体を単離するそのようなファージディスプレイ法は、当該技術において確立されており、または以下の実施例に記載されている。例えば:米国特許第5223409号明細書;米国特許第5403484号明細書;および米国特許第5571698号明細書(Ladner et al.);米国特許第5427908号明細書および米国特許第5580717号明細書(Dower et al.);米国特許第5969108号明細書および米国特許第6172197号明細書(McCafferty et al.);ならびに米国特許第5885793号明細書;米国特許第6521404号明細書;米国特許第6544731号明細書;米国特許第6555313号明細書;米国特許第6582915号明細書および米国特許第6593081号明細書(Griffiths et al.)参照。
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするリボソームディスプレイ法、mRNAディスプレイ法、細菌ディスプレイ法、および酵母ディスプレイ法を用いて調製され得る。一般に、ヒト抗体ライブラリを提示する真核生物細胞は、当該技術において標準的である(Plueckthun,A.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94(10):4937−42;Lipovsek et al.(2004)Imm.Methods 290(1−2):51−67;He et al.(2007)Nature 4(3):281−288;Gold et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(9):4825−6;Fukuda I,Kojoh K,Tabata N,et al.(2006)Nucleic Acids Res. 34(19):e127;Francisco et al.(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.90:10444−48;Georgiou et al.(1997)Nat.Biotech.15(1):29−34;Boder et al.(2000)Proc Nat Acad Sci,97(20):10701−10705;Weaver−Feldhaus et al.(2004)FEBS Letters 564(1−2):24−34参照)。
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体応答が免疫化直後に生じ得るように、ヒト免疫細胞が再構成されているSCIDマウスを用いて、調製され得る。そのようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許第5476996号明細書および米国特許第5698767号明細書に記載されている。
(iii)フレームワークまたはFc操作
フレームワーク修飾の1タイプは、フレームワーク領域内の、または1つもしくは複数のCDR領域内の、1つまたは複数の残基を突然変異させて、T細胞エピトープを除去することによって、抗体の潜在的免疫原性を引き下げることを包含する。このアプローチは「脱免疫化」とも呼ばれ、Carr et al.による米国特許出願公開第2003/0153043号明細書においてさらに詳細に記載されている。
フレームワークまたはCDR領域内でなされる修飾に加えて、またはその代わりに、本開示の抗体は、Fc領域内に修飾を含むように、典型的には抗体の1つまたは複数の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または抗原依存性の細胞障害を変えるように、操作されてよい。さらに、本開示の抗体は、ここでも抗体の1つまたは複数の機能的特性を変えるように、化学的に修飾されてもよいし(例えば、1つまたは複数の化学的部分が、抗体に付着されてよい)、修飾されてそのグリコシル化を変えてもよい。これらの実施形態はそれぞれ、以下でさらに詳細に記載される。
一実施形態において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変更されるように、例えば、増大または減少するように、修飾される。このアプローチは、Bodmer et al.によって米国特許第5677425号明細書にさらに記載されている。CH1のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを促進するように、または抗体の安定性を増大もしくは減少させるように、変更される。
別の実施形態において、抗体のFcヒンジ領域が、抗体の生物学的半減期を減少させるように突然変異する。より詳細には、1つまたは複数のアミノ酸突然変異が、Fc−ヒンジフラグメントのCH2−CH3ドメインインターフェース領域中に導入されて、抗体のブドウ球菌プロテインA(SpA)結合が、生来のFc−ヒンジドメインSpA結合と比較して、損なわれる。このアプローチは、Ward et al.によって、米国特許第6165745号明細書にさらに詳細に記載されている。
さらに他の実施形態において、Fc領域は、少なくとも1つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基で置換することによって変更されて、抗体のエフェクタ機能が変更される。例えば、1つまたは複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置換されて、抗体は、エフェクタリガンドに対する親和性が変更されるが、親抗体の抗原−結合能力を保持し得る。親和性が変更されているエフェクタリガンドは、例えば、Fc受容体であっても補体のC1成分であってもよい。対応する修飾アイソタイプバージョンは、科学界においてIgG1f LALAとして知られている。先で既に言及されるように、このアプローチは、米国特許第5624821号明細書および米国特許第5648260号明細書(双方ともWinter et al.による)にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、アミノ酸残基から選択される1つまたは複数のアミノ酸は、異なるアミノ酸残基と置換されて、抗体は、C1q結合が変更され得、かつ/または補体依存性細胞障害(CDC)が引き下げられ得、もしくは無効にされ得る。このアプローチは、Idusogie et al.による米国特許第6194551号明細書にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、1つまたは複数のアミノ酸残基は、変更されることによって、補体を固定する抗体の能力を変える。このアプローチは、Bodmer et al.によってPCT公報国際公開第1994/29351号パンフレットにさらに記載されている。
さらに別の実施形態において、Fc領域は、1つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存的細胞障害活性(ADCC)を媒介し、かつ/またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を増大させる抗体の能力を高めるように、修飾される。このアプローチは、PrestaによってPCT公報国際公開第2000/42072号パンフレットにさらに記載されている。さらに、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、およびFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位がマッピングされ、そして結合が向上した変異体が記載されている(Shields et al.,(2001)J.Biol.Chem.276:6591−6604参照)。
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化抗体が調製され得る(すなわち、抗体がグリコシル化を欠く)。グリコシル化は、例えば「抗原」に対する抗体の親和性を増大させるように、変更され得る。そのような炭水化物修飾は、例えば抗体配列内のグリコシル化の1つまたは複数の部位を変えることによって、達成され得る。例えば、1つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす1つまたは複数のアミノ酸置換がなされることによって、当該部位にてグリコシル化を除去することができる。そのようなアグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大させ得る。そのようなアプローチは、Co et al.によって米国特許第5714350号明細書および米国特許第6350861号明細書にさらに詳細に記載されている。
加えて、または代わりに、グリコシル化のタイプが変更されている抗体、例えば、フコシル残基の量が引き下げられている低フコシル化抗体、またはバイセクティングGlcNac構造体が増大している抗体が調製され得る。そのようなグリコシル化パターンの変更は、抗体のADCC能を増大させることが実証された。そのような炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が変更されている宿主細胞において抗体を発現させることによって、達成され得る。グリコシル化機構が変更されている細胞は、当該技術において記載されており、本開示の組換え抗体を発現することによって、グリコシル化が変更されている抗体を産生する宿主細胞として用いられ得る。例えば、Hang et al.による欧州特許第1176195号明細書は、フコシル基転移酵素をコードするFUT8遺伝子が機能的に破壊されて、細胞株において発現される抗体が低フコシル化を示す細胞株を記載している。PrestaによるPCT公報国際公開第2003/035835号パンフレットは、フコースをAsn(297)結合炭水化物に付着させる能力が低下して、その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化をももたらす変異体CHO細胞株、Lecl3細胞を記載している(Shields et al.,(2002)J.Biol.Chem.277:26733−26740も参照)。Umana et al.によるPCT公報国際公開第1999/54342号パンフレットは、糖タンパク質修飾糖転移酵素(例えば、ベータ(1,4)−Nアセチルグルコサミン転移酵素III(GnTIII))を発現して、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体のADCC活性を増大させるバイセクティングGlcNac構造体の増大を示すように操作された細胞株を記載している(Umana et al.,(1999)Nat.Biotech.17:176−180も参照)。
別の実施形態において、抗体は、その生物学的半減期を増大させるように修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、以下の突然変異の1つまたは複数が導入されてよい:Wardの米国特許第6277375号明細書に記載されているようなT252L、T254S、およびT256F。これ以外にも、生物学的半減期を増大させるために、抗体は、Presta et al.によって米国特許第5869046号明細書および米国特許第6121022号明細書に記載されるように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループからとられるサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、CH1領域またはCL領域内で変えられてよい。
医薬組成物
一部の態様において、本開示は、IL−17Cに特異的な、単離された抗体または単離された抗体フラグメントを含む組成物に言及し、前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントは、IL−17Cホモダイマーに二価結合して、前記単離された抗体または前記単離された抗体フラグメントおよび1つのIL−17Cホモダイマーからなる複合体を形成する。更なる態様において、前記組成物は、医薬組成物である。更なる態様において、前記医薬組成物は、疾患の処置に用いられる。
本開示の医薬組成物は、当該技術において知られている種々の方法によって投与され得る。投与の経路および/またはモードは、所望される結果に応じて変わる。投与が、静脈内投与、筋肉内投与、腹膜内投与、もしくは皮下投与であることが、または標的部位の近位に投与されることが好ましい。医薬的に許容可能なキャリアは、(例えば、注射または点滴による)静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与に適しているべきである。投与の経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、抗体フラグメント、二重特異的分子、および多特異的分子は、酸の作用、および化合物を不活性化する虞がある他の自然条件から化合物を保護する物質で、コーティングされてよい。
医薬的に、キャリアは組成物を増強し、もしくは安定化させ、または組成物の調製をし易くする。医薬的に許容可能なキャリアとして、生理的に適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。
組成物は、滅菌されており、かつ流体であるべきである。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散系の場合では、必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含めることによって、もたらされ得る。
本開示の医薬組成物は、周知の、かつ当該技術においてルーチン的に実行される方法に従って、調製され得る。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,20th ed.,2000;およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978参照。医薬組成物は好ましくは、GMP条件下で調製される。典型的に、IL−17C抗体またはIL−17C抗体フラグメントの治療的に有効な用量または効果的な用量が、本開示の医薬組成物に使用される。抗体または抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の方法によって、医薬的に許容可能な剤型に製剤化される。投薬レジメンは、所望される最適の応答(例えば治療応答)を実現するように調整される。例えば、単回ボーラス投与されてもよいし、いくつかの分割用量が経時的に投与されてもよいし、治療状況の緊急性によって示されると共に、用量が比例して引き下げられても増大されてもよい。投与の簡略化および投薬量の均一性のために投薬量単位形態で親組成物を製剤化することが、とりわけ有利である。本明細書中で用いられる投薬単位形態は、処置されることになる対象にとってのユニタリ投薬量として適した、物理的に不連続な単位を指す;各単位は、必要とされる医薬キャリアを伴って、所望される治療効果を生じさせるように算出された所定の量の活性化合物を含有する。
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者に所望される治療応答を達成するのに有効な活性成分の量、組成物、および投与モードが、患者に毒性であることなく得られるように、変化してよい。選択される投薬量レベルは、使用される本開示の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されることになる特定の化合物の***速度、処置の期間、使用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物および/または材料、ならびに処置されることになる患者の年齢、性別、体重、症状、健康状態および過去の病歴等の因子が挙げられる種々の薬物動態学的因子によって決まる。
医師または獣医は、所望される治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低いレベルにて、医薬組成物に使用される本開示の抗体の服用を始めて、所望される効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増大させてよい。通常、本明細書中に記載されるアレルギー性炎症性障害の処置のための、本開示の組成物の有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の医薬品、そして処置が予防であるか治療であるかが挙げられる、様々な多くの因子に応じて変えてよい。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するように決められる必要がある。抗体の全身投与について、投薬量は、宿主体重の約0.0001〜100mg/kg、より普通には0.01〜15mg/kgに及ぶ。例示的な処置レジームは、2週毎に1回、1ヵ月に1回、または3〜6ヵ月毎に1回の全身投与を伴う。抗体の硝子体内投与について、投薬量は約0.0001〜約10mgに及ぶ。例示的な処置レジームは、2週毎に1回、1ヵ月に1回、または3〜6ヵ月毎に1回の全身投与を伴う。
本開示の抗体または抗体フラグメントは通常、複数回投与される。単回投薬間の間隔は、毎週、毎月、または毎年であってよい。全身投与の一部の方法において、投薬量は、1〜1000μg/mlの、そして一部の方法において、25〜500μg/mlの血漿抗体濃度を達成するように調整される。
これ以外にも、抗体または抗体フラグメントは、徐放製剤として投与されてよく、その場合には、より低い頻度での投与が必要とされる。投薬量および頻度は、患者における抗原−結合部分の半減期に応じて変わる。一般に、ヒト抗体およびヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与の投薬量および頻度は、処置が予防であるか治療であるかに応じて変えてよい。予防的用途において、比較的低い投薬量が、長期間にわたって比較的低頻度にて投与される。一部の患者は、死亡するまで処置を受け続ける。治療用途において、疾患の進行が遅らされ、または終了するまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投薬量が、時折必要とされる。その後、患者は、予防レジームを施されてよい。
抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、抗体または抗体フラグメントは、医薬的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と混合される。
抗体または抗体フラグメントの所望される用量は、モル/体重kgベースで、抗体またはポリペプチドの場合とほぼ同じである。抗体または抗体フラグメントの所望される血漿濃度は、モル/体重kgベースについてである。用量は、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、または少なくとも100μgであってよい。対象に施される服用回数は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12回以上を数えてよい。
本開示の抗体または抗体フラグメントについて、患者に投与される投薬量は、患者の体重について0.0001mg/kgから100mg/kgであってよい。投薬量は、患者の体重について0.0001mg/kg〜20mg/kg、0.0001mg/kg〜10mg/kg、0.0001mg/kg〜5mg/kg、0.0001〜2mg/kg、0.0001〜1mg/kg、0.0001mg/kg〜0.75mg/kg、0.0001mg/kg〜0.5mg/kg、0.0001mg/kg〜0.25mg/kg、0.0001〜0.15mg/kg、0.0001〜0.10mg/kg、0.001〜0.5mg/kg、0.01〜0.25mg/kg、または0.01〜0.10mg/kgであってよい。
本開示の抗体または抗体フラグメントの投薬量は、患者のキログラム(kg)体重を用いて、mg/kgで投与されることになる用量を乗じて算出され得る。
本開示の抗体または抗体フラグメントの投薬量は、患者の体重について150μg/kg以下、125μg/kg以下、100μg/kg以下、95μg/kg以下、90μg/kg以下、85μg/kg以下、80μg/kg以下、75μg/kg以下、70μg/kg以下、65μg/kg以下、60μg/kg以下、55μg/kg以下、50μg/kg以下、45μg/kg以下、40μg/kg以下、35μg/kg以下、30μg/kg以下、25μg/kg以下、20μg/kg以下、15μg/kg以下、10μg/kg以下、5μg/kg以下、2.5μg/kg以下、2μg/kg以下、1.5μg/kg以下、1μg/kg以下、0.5μg/kg以下、または0.5μg/kg以下であってよい。
本開示の抗体または抗体フラグメントの単位用量は、0.1mg〜20mg、0.1mg〜15mg、0.1mg〜12mg、0.1mg〜10mg、0.1mg〜8mg、0.1mg〜7mg、0.1mg〜5mg、0.1〜2.5mg、0.25mg〜20mg、0.25〜15mg、0.25〜12mg、0.25〜10mg、0.25〜8mg、0.25mg〜7mg、0.25mg〜5mg、0.5mg〜2.5mg、1mg〜20mg、1mg〜15mg、1mg〜12mg、1mg〜10mg、1mg〜8mg、1mg〜7mg、1mg〜5mg、または1mg〜2.5mgであってよい。
本開示の抗体または抗体フラグメントの服用は、繰り返されてよく、そして投与は、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヵ月、75日、3ヵ月、または少なくとも6ヵ月の単位で区切られてよい。
特定の患者に有効な量は、処置されることになる症状、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重篤度等の因子に応じて変えてよい(例えば、Maynard,et al.(1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.;Dent(2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice,London,UK参照)。
投与経路は、例えば、局所塗布または皮膚への塗布、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内への注射もしくは点滴、または徐放系もしくは移植片によるものであってよい(例えば、Sidman et al.(1983)Biopolymers 22:547−556;Langer,et al.(1981)J.Biomed.Mater.Res.15:167−277;Langer(1982) Chem.Tech.12:98−105;Epstein,et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688−3692;Hwang,et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030−4034;米国特許第6350466号明細書および米国特許第6316024号明細書参照)。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および局所麻酔薬、例えば注射部位の痛みを和らげるリドカインを含んでもよい。また、例えば、吸入器またはネビュライザ、およびエアロゾル製剤を用いて、肺投与が施されてもよい。例えば、米国特許第6019968号明細書、米国特許第5985320号明細書、米国特許第5985309号明細書、米国特許第5934272号明細書、米国特許第5874064号明細書、米国特許第5855913号明細書、米国特許第5290540号明細書、および米国特許第4880078号明細書;ならびにPCT公報国際公開第1992/19244号パンフレット、国際公開第1997/32572号パンフレット、国際公開第1997/44013号パンフレット、国際公開第1998/31346号パンフレット、および国際公開第1999/66903号パンフレット参照。これらの出願はそれぞれ、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
本開示の組成物はまた、当該技術において知られている種々の方法の1つまたは複数を用いて、1つまたは複数の投与経路を介して投与されてもよい。当業者によって理解されるように、投与経路および/または投与モードは、所望される結果に応じて変わることとなる。本開示の抗体または抗体フラグメントについて選択された投与経路として、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊髄、または他の非経口の投与経路が挙げられる。非経口投与は、通常注射による、経腸投与および局所投与以外の投与モードを意味し得、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外、そして胸骨内の注射および点滴が挙げられるが、これらに限定されない。これ以外にも、本開示の組成物は、局所、表皮、または粘膜の投与経路等の非経口でない経路(non−parenteral route)を介して、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、経直腸的に、舌下的に、または局所的に投与されてよい。
本開示の抗体または抗体フラグメントと組み合わせて施され得る更なる療法(例えば、予防剤または治療剤)は、本開示の抗体または抗体フラグメントから、5分未満、30分未満、1時間、約1時間、約1時間〜約2時間、約2時間〜約3時間、約3時間〜約4時間、約4時間〜約5時間、約5時間〜約6時間、約6時間〜約7時間、約7時間〜約8時間、約8時間〜約9時間、約9時間〜約10時間、約10時間〜約11時間、約11時間〜約12時間、約12時間〜18時間、18時間〜24時間、24時間〜36時間、36時間〜48時間、48時間〜52時間、52時間〜60時間、60時間〜72時間、72時間〜84時間、84時間〜96時間、または96時間〜120時間の間隔をおいて施されてよい。2つ以上の療法が、患者の同じ1度の来院中に施されてもよい。
本開示の抗体または抗体フラグメントおよび他の療法は、周期的に施されてよい。サイクリング療法は、ある期間の第1の療法(例えば、第1の予防剤または治療剤)の施与、その後のある期間の第2の療法(例えば、第2の予防剤または治療剤)の施与、および場合によってはその後のある期間の第3の療法(例えば、予防剤または治療剤)の施与等、そしてこの連続して起こる施与の繰返し、すなわち、複数療法の1つに対する耐性の進行を抑制して、複数療法の1つの副作用を回避し、もしくは軽減し、かつ/または療法の有効性を向上させるためのサイクルを包含する。
ある実施形態において、本開示の抗体または抗体フラグメントは、適切なインビボ分布を確実にするように製剤化されてよい。例えば、血液脳関門(BBB)は、親水性が高い多くの化合物を排除する。本開示の治療化合物は、(所望される場合に)BBBを越えることを確実にするために、例えば、リポソーム内に製剤化されてよい。リポソームを調製する方法について、例えば米国特許第4522811号明細書;米国特許第5374548号明細書;および米国特許第5399331号明細書参照。リポソームは、特定の細胞または器官中に選択的に輸送される1つまたは複数の部分を含むので、標的薬物送達を増強し得る(例えば、V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685参照)。例示的な標的部分として、葉酸塩またはビオチン(例えば、Low et alの米国特許第5416016号明細書参照);マンノシド(Umezawa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗体(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett. 357:140;M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180);界面活性剤プロテインA受容体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233:134);p120(Schreier et al(1994)J.Biol.Chem.269:9090)が挙げられる;また、K.Keinanen;M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273も参照。
本開示は、本開示の抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物を単独で、または他の療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与する/施すためのプロトコルを提供する。本開示の併用療法(例えば、予防剤または治療剤)は、付随的に、または連続して、対象に施されてよい。本開示の併用療法(例えば、予防剤または治療剤)は、周期的に施されてもよい。サイクリング療法は、ある期間の第1の療法(例えば、第1の予防剤または治療剤)の施与、その後のある期間の第2の療法(例えば、第2の予防剤または治療剤)の施与、そしてこの連続して起こる施与の繰返し、すなわち、複数療法(例えば剤)の1つに対する耐性の進行を抑制して、複数療法(例えば剤)の1つの副作用を回避し、もしくは軽減し、かつ/または療法の有効性を向上させるためのサイクルを包含する。
本開示の併用療法(例えば、予防剤または治療剤)は、対象に同時に施されてよい。用語「同時に」は、正確に同時の療法(例えば、予防剤または治療剤)の施与に制限されない。むしろ、本開示の抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物が、別のやり方で投与される場合よりも、対象に順々に、そしてある時間間隔内で投与されて、本開示の抗体が、他の療法と協働して大きな利益を実現し得ることが意味される。例えば、各療法は、対象に同時に施されてもよいし、異なる時点にてあらゆる順序で連続して施されてもよい;しかしながら、同時に施されないならば、所望の治療効果または予防効果を実現するように、十分に近い時間内に施されるべきである。各療法は、対象に別々に、あらゆる適切な形態で、そしてあらゆる適切な経路によって、施されてよい。種々の実施形態において、療法(例えば、予防剤または治療剤)は、対象に、15分未満、30分未満、1時間未満、約1時間未満、約1時間〜約2時間、約2時間〜約3時間、約3時間〜約4時間、約4時間〜約5時間、約5時間〜約6時間、約6時間〜約7時間、約7時間〜約8時間、約8時間〜約9時間、約9時間〜約10時間、約10時間〜約11時間、約11時間〜約12時間、24時間、48時間、72時間、または1週間の間隔をおいて施される。他の実施形態において、2つ以上の療法(例えば、予防剤または治療剤)が、患者の同じ来院中に施される。
併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物に入れられて対象に投与されてよい。これ以外にも、併用療法の予防剤または治療剤は、別個の医薬組成物に入れられて対象に同時に投与されてよい。予防剤または治療剤は、同じ投与経路によって、または異なる投与経路によって、対象に投与されてよい。
実施例1:抗原の生成
ヒト、カニクイザル、およびマウス由来のIL−17Cのアミノ酸配列をアラインした。
リーダー配列なしで、79%の相同性が、全3種の間で共有されている。
抗原の生産および品質管理
異なる種由来のIL−17Cを、異なる事業者から購入し、またはインハウス生産して、必要に応じて可溶化した。ECL(商標)ビオチン化モジュールのビオチン化試薬を、タンパク質100μgあたり4μl加えて、室温にて暗所で穏やかに撹拌しながら60分間インキュベートした。続いて、Zeba(商標)Desaltスピンカラムを用いて、ビオチン化されたタンパク質を精製し、OD280nmを判定した。
ECL(商標)ビオチン化モジュール(GE Healthcare;#1061918)を用いて、抗原をビオチン化した。ビオチン化後、Zeba(商標)Desaltスピンカラム(Pierce;#89889)を用いて、産物を精製した。
高圧サイズ排除クロマトグラフィ(HP−SEC)および動的光散乱法(DLS)による、SDS−PAGEにおける、そして本来の状態における、変性、還元および変性、非還元条件下での分析を含む品質管理に、ビオチン化された、そしてビオチン化されていない、マウス、カニクイザルおよびヒトのIL−17Cをかけた。
Wyatt miniDAWN TreosおよびWyatt Optilab rEX(Wyatt Technology Europe,Dernbach、独国)と組み合わせたDionex UltiMate 3000 Titanium HPLC系(Dionex Corporation,Germering、独国)で、HP−SECを実行した。分離について、Tosoh TSK−Gel G3000SWxlカラムを用いた(Tosoh Bioscience,Stuttgart、独国)。各サンプルについて、15μgのタンパク質をカラム上にロードして、0.5ml/分の流量にて分離を実行し、280nmでのUV吸収を分析して記録した。泳動バッファを、49mMのNaH2PO4、51mMのNa2HPO4、100mMのK2SO4、0.0005%のTween−80で、pH6.8にて構成した。
0.2〜1.0mg/mlのタンパク質濃度で、DynaPro Titanキュベット系(Wyatt Technology Europe,Dernbach、独国)を用いて、全てのDLS実験を実行した。析出または粒子形成の場合、実験前に、サンプルを10.000gで5分間遠心分離した。
マウスおよびヒトのIL−17受容体E/Fcのクローニングおよび生産
KpnIおよびEcoRVを用いて、マウスIL−17受容体E(UniProt Q8BH06、アイソフォーム1)およびヒトIL−17受容体E(UniProt Q8NFR9)の細胞外ドメイン(ECD)を、発現ベクターpMAX_vk_Fc2_His中にクローニングして、C末端Fc2_H融合構築体を生成した。天然のリーダー(AG00158)の他に、Vκ−リーダーを有する第2の構築体を生成した(AG00159)。
双方の構築体を、HKB11細胞内で一過性に発現させた。細胞懸濁液を、トランスフェクションの3日後にスケールアップし、細胞培養体の上澄みを、トランスフェクションの6日後に収穫した。濾過滅菌後、溶液を、プロテインA親和性クロマトグラフィにかけた。バッファ交換をPBSに実行して、サンプルを濾過滅菌した(0.2μmの細孔サイズ)。タンパク質濃度を、UV分光測光法によって判定した。産物の純度を、HP−SECおよびDLSによる、SDS−PAGEにおける、そして本来の状態における、変性、還元および変性、非還元条件下で分析した。
実施例2:Fabフラグメントおよび抗体の生成
抗体生成のために、MorphoSys Ylanthia(登録商標)ライブラリを用いて、ヒトIL−17Cに対するFabフラグメントを選択した。MorphoSys Ylanthia(登録商標)ライブラリ(Tiller et al.mAbs 5:3,1−26;May/June(2013)および米国特許第8728981号明細書)は、市販のファージミドライブラリであり、Fabをファージ表面上に提示するCysDisplay(登録商標)技術を使用する(Lohning et al.,国際公開第2001/05950号パンフレット)。
1.パニング戦略
1つのIL−17Cホモダイマーのみへの二価結合等の特異的な特性を有する抗体を選択するために、溶液パニングを実行した。自然なホモダイマー状態の抗原が、溶液中で最も良く示され得るので、可溶性の抗原上へのパニングが、IL−17Cに二価結合するクローンを同定する可能性を高くする。
反復的な3ラウンドのパニングによって、MorphoSys Ylanthia(登録商標)ライブラリから組換え抗体を生成した。したがって、ビオチン化されたヒトIL−17C、またはビオチン化されたマウスIL−17Cを抗原として用いて、溶液中でファージライブラリとインキュベートした。溶液パニングの前提条件は、生物活性を保存しての抗原のビオチン化であった。溶液パニングの間、Fab提示ファージ、およびビオチン化された抗原を、溶液中でインキュベートして、ファージによる抗原のアクセシビリティを促進した。
各ファージプールについて、ストレプトアビジンビーズ(Dynabeads(登録商標)M−280 Streptavidin;Invitrogen)を、1×Chemiblocker中でブロックした。同時に、各パニングについて、Ylanthia(登録商標)ファージ−抗体を、等容量の2×Chemiblocker/Tween20でブロックした。
次に、ビオチン化された抗原100nMを、プレ吸着され、かつブロックされたファージ粒子に加えて、室温にてインキュベートした。ブロックされたストレプトアビジンビーズを用いて、ファージ−抗原複合体を捕捉して、ストレプトアビジンビーズに結合したファージ粒子を、磁気セパレータで収集した。PBS、Tween20、およびPBSを用いたいくつかの洗浄ステップによって、非特異的に結合したファージを洗浄除去して、DDTを用いて、特異的に結合したファージをストレプトアビジンビーズから溶出した。次に、DTT溶出液を、大腸菌(E.coli)TG1中に移して、ファージ感染のために37℃にてインキュベートした。細菌のペレットを、増殖培地中に再懸濁し、LB/Camアガープレート上にプレーティングして、一晩インキュベートした。コロニーをプレートからこすり取って、ファージレスキュー、選択したクローンのポリクローナル増幅、およびファージ生産に用いた。
ストリンジェンシーを上げて、特異性および親和性が低い抗体を捨てるために、洗浄ステップを長くし、かつ抗原濃度を引き下げて、以降のパニングラウンド2および3を同様に実行した。パニングの3ラウンドを通じて一貫して、または交互に、抗原を用いた。2つの異なる設定内でカルボキシビーズパニングラウンド1〜3に用いる抗原を、表3に示す。
3ラウンドのパニング後、第3ラウンドのアウトプットを用いて、単一コロニーを生じさせて、これらのFab産生コロニーをランダムに選んで384ウェルプレート中に入れた。
2.ヒト、カニクイザル、およびマウスのIL−17Cに特異的なクローンを同定するための、ELISAを介したパニングアウトプットの一次スクリーニング
一次ELISAスクリーニングを介して、IL−17CへのFabの特異性を調査した。粗細菌溶解物中の可溶性Fabフラグメントの迅速な発現を促進するために、以前に記載されるようにして、ペリプラズム抽出物を調製した(Rauchenberger et al.(2003)J.Biol.Chem.278.40:38194−205)。初期ヒットのELISAスクリーニングに、Fab含有大腸菌(E.coli)溶解物を用いた。
ビオチン化された抗原のELISAスクリーニングについて、PBS中に1:1000で希釈したFdフラグメント特異的ヒツジ抗ヒトIgG(結合部位、#PC075)で、Maxisorp(商標)384ウェルプレートをコーティングした。PBS中5%スキムミルク粉末でのブロッキング後、Ylanthia(登録商標)−Fab含有大腸菌(E.coli)溶解物を加えて、抗Fd抗体によってプレートに捕捉した。PBSTによる広範囲な洗浄後、0.5μg/mlのビオチン化されたヒトIL−17Cを加えた。別の洗浄手順の後、捕捉したYlanthia(登録商標)−Fabフラグメントを、ビオチン化されたヒトIL−17Cに結合させ、これを、アルカリホスファターゼに結合するストレプトアビジンとのインキュベーションに続く、AttoPhos蛍光基質(Roche:#11681982001)の付加によって、検出した。535nmの蛍光放射を、430nmの励起により記録した。結合が非特異的なFabフラグメントを発現するクローンを排除するために、ネガティブコントロール抗原としての無関係な抗原のカウンタースクリーニングを同時に実行した。ビオチン化されたヒトIL−17Cのバックグラウンドに対して5倍超の、そして無関係な抗原のバックグラウンドに対して2倍未満のELISAシグナルを、ポジティブヒットとみなした。
ヒトIL−17Cに加えて、カニクイザルおよびマウスのIL−17Cに交差反応的に結合するクローンの更なる選択のために、カニクイザルおよびマウスのビオチン化されたIL−17Cに同じスクリーニングを実行した。マウスおよびカニクイザルのIL−17C抗原にも交差反応性であると同定されたクローンを組み合わせて、別個の圧迫プレート上に収集してから、受容体結合阻害アッセイにおいてスクリーニングにかけた。
合計4608個の個々のFabフラグメントを選んで、大腸菌(E.coli)内で産生させた。そこから、1491のヒットが、ELISAスクリーニングにおいて、細菌溶解調製物中のヒトIL−17Cに特異的に結合すると同定された。ヒトIL−17Cに特異的に結合すると同定された1491のヒットをさらに、カニクイザルおよびマウスのビオチン化されたIL−17C抗原へのELISA結合について試験した。これらのうち、723のFabが、カニクイザルおよびマウスのビオチン化されたIL−17Cに交差反応性であることがわかった。
3.アンタゴニスト活性についての、IL−17C特異的クローンの二次スクリーニング
次のスクリーニングステップにおいて、これらのFabの抑制機能性を調査した。したがって、Fab含有細菌抽出物を、高スループットm/huIL17RE/Fc受容体阻害アッセイにおいて、阻害活性の有無に関してスクリーニングした。
活性を中和するFab含有粗細菌溶解物を高スループットスクリーニングモードで試験するために、MA6000 384ウェルプレート(Meso Scale Discovery,MSD)を、PBS中0.5〜0.6μg/mlの、マウスまたはヒトのIL17RE/Fcキメラタンパク質30μlで、4℃にて一晩コーティングした。その翌日、20〜25μlのFab含有大腸菌(E.coli)溶解物を、1〜2nMの等容量のビオチン化されたマウスIL−17CまたはヒトIL−17Cと、RTにて30分間プレインキュベートして、Fab−抗原複合体を形成した。PBS中5%BSAによる1時間のプレートのブロッキング後に、マウスまたはヒトのIL17RE/Fcでコーティングしたウェルに複合体を加えて、MSD Sector Imagerを用いたストレプトアビジン−ECLを介して、受容体の結合を検出した。
m/huIL−17RE阻害アッセイにおける>60%のシグナル低下を、ポジティブヒットと定義した。合計で、受容体阻害スクリーニングにより、IL−17Cの、各受容体への結合(ヒトまたはマウスのIL17RE/Fc)を阻害する285個のクローンが生じた。
4.固有クローンの同定
IL−17Cの、ヒトまたはマウスそれぞれのIL−17RE受容体への結合を阻止すると同定されたクローンを選んで、別の圧迫プレート上に乗せ、そして各候補の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の配列を決定して、全285クローンの固有配列を同定した。
配列決定したクローンのうち、17個の固有クローンを同定することができた。最も頻度が高い重鎖は、8抗体のVH3−23であり、3抗体がVH3−07鎖を有し、2抗体がVH3−11およびVH1−46を、1抗体がVH3−15またはVH3−21の重鎖をそれぞれ有する。最も頻度が高い軽鎖は、8抗体のVlambda3−1であり、4抗体がVkappa1−12鎖を、2抗体がVlambda2−23を、そして1抗体がVkappa1−06、Vkappa1−51またはVkappa3−15の軽鎖をそれぞれ有する。それぞれのフレームワークおよび重鎖/軽鎖は、米国特許出願第13/321564号明細書または米国特許出願第13/299367号明細書に開示されるように、Ylanthia(登録商標)抗体ライブラリに提供される。これらの出願は双方とも、参照によって本明細書中に組み込まれる。
5.発現ベクター中へのFabコーディングDNAのクローニング、および発現/精製
17個の全固有Ylanthia(登録商標)抗体を、細菌Fab発現ベクター中にサブクローニングした。発現および精製のために、大腸菌(E.coli)を、Fabコーディング発現ベクターで形質転換した。細胞培養体の上澄みを、発現の誘導後に収穫し、Hisタグ特異的親和性クロマトグラフィ(GE Healthcare)を介した精製にかけて、Hisタグ付きFabを精製した。全てのサンプルを濾過滅菌した(0.2μmの細孔サイズ)。Labchip System(Caliper GXII,Perkin Elmer)を用いた、またはSDS−PAGEでの、変性、還元、および非還元条件下で、Fabの純度を分析した。タンパク質濃度を、UV−分光測光法によって判定した。
6.Ylanthia(登録商標)抗体のIgG変換、および発現/精製
17個の固有Ylanthia(登録商標)クローンを、サブクローニング手順によって、FabからIgGフォーマットに変換した。17個の全抗体コーディングベクターを、酵素によって消化して、生じたベクターバックボーンを、Ylanthia(登録商標)哺乳類発現カセットと連結し、さらに各全長IgGベクター中にサブクローニングした。
発現および精製のために、IgGの重鎖および軽鎖の双方をコードするpYMex10真核生物発現ベクターDNAで、真核生物HKB11細胞をトランスフェクションした。細胞培養体の上澄みを、トランスフェクションの3日後に収穫して、標準的なプロテインA親和性クロマトグラフィ(MabSelect SURE,GE Healthcare)にかけて、抗体を精製した。全てのサンプルを濾過滅菌した(0.2μmの細孔サイズ)。Labchip System(Caliper GXII,Perkin Elmer)を用いた、またはSDS−PAGEでの、変性、還元、および非還元条件下で、IgGの純度を分析した。タンパク質濃度を、UV−分光測光法によって判定し、HP−SECを実行して、IgG調製物を本来の状態で分析した。
17個の全固有Ylanthia(登録商標)IgGを、探索スケールで、HKB11細胞において、ヒトIgG1アイソタイプフォーマットで生産した。17個の全IgGは、良好な発現収率(>5mg/L)を示し、3/17個のみが、不所望の凝集傾向に起因して、品質管理分析をパスしなかった。
全体として、14個の個々の抗体は、良好な量が生産され得、SECにおける品質管理をパスした(>90%のモノマー含有量)。14個の精製した全IgG1抗体を、IL−17Cへの結合についてELISAで試験して、更なる機能試験にかけた。
7.IL−17Cホモダイマーに二価結合するIL−17C特異的抗体の、サイズ排除クロマトグラフィを介した同定
可溶性のホモダイマーとして、IL−17Cは、分子量がそれぞれ21,765Daである2つのIL−17Cモノマーで構成される。したがって、ホモダイマーIL−17Cは、総分子量が約44kDaであり、基本的に3つの異なる方法で3つの異なる複合体を形成するように、モノクローナル抗体によって結合され得る(図1)。
抗体の特異性に応じて、3つの複合体:2つのホモダイマーが1つの抗体と結合する複合体(クラスI)、2つのホモダイマーが2つの抗体と結合する複合体(クラスII)、または1つのホモダイマーが1つの抗体と結合する複合体(クラスIII)のうち、主に1つが形成される。したがって、形成される複合体は、分子量が異なり、クラスI複合体は分子量が約270kDaであり、クラスII複合体は分子量が約380kDaであり、そしてクラスIII複合体は分子量が約190kDaである。
1つのIL−17Cホモダイマーに二価結合し、かつ、分子量が200kDa未満のクラスIII複合体を主に形成する抗体を選択するために、抗体を、ヒトIL−17Cホモダイマーとインキュベートして、サイズ排除クロマトグラフィにかけた。
等モル量の抗原および各抗体を混合することによって、結合モードの分析をした。抗原−抗体相互作用によって生じた複合体を、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)で分析し、各複合体のサイズを、MALSによって判定した。形成された各複合体を、光散乱検出器によって検出した。
検出された複合体の、複合体の理論分子量1:1(約190kDa)、1:2(約270kDa)、および2:2(約380kDa)との比較によって、結合モードを推測した。
2つの抗体(mab_1、mab_8)は、主にクラスIII複合体を形成するので、1つのIL−17Cホモダイマーに二価結合することが見出された(図2、図3)。双方の抗体は、米国特許出願第13/321564号明細書または米国特許出願第13/299367号明細書に開示されるように、Ylanthia(登録商標)抗体ライブラリに提供される、VH3−23重鎖およびVlambda3−1軽鎖を有する。これらの出願は双方とも、参照によって本明細書中に組み込まれる。
対照的に、1つのIL−17Cホモダイマーに二価結合しない他の抗体は、分子量が200kDa未満(クラスIII)の複合体を形成せずに、クラスIおよびクラスIIのような、または他のより大きな複合体を形成すると同定された(図6)。
実施例3:受容体阻害活性についての、IL−17C特異的IgGの特性評価
精製したIL−17C特異的IgGを、mIL−17RE相互作用アッセイで試験した。したがって、MA6000 384ウェルプレート(Meso Scale Discovery,MSD)を、PBS中75ng/mlのマウスIL17RE/Fcキメラタンパク質30μlで、4℃にて一晩、コーティングした。その翌日、抗体段階希釈液(0.001〜100nMの濃度)を、等容量のビオチン化されたIL−17Cと、RTにて30分間プレインキュベートした。PBST中2.5%BSAによる1時間のプレートのブロッキング後に、コーティングしたIL17RE/Fcに、以前に形成された抗体−リガンド複合体を1時間加えて、MSD Sector Imagerを用いたストレプトアビジン−ECLを介して、受容体の結合を検出した。結果を表4に示す。
実施例4:IL−17C駆動NF−κBリポータアッセイにおける機能試験
マウスIL−17REを過剰発現するNIH3T3細胞中でのNF−κBリポータ遺伝子のIL−17C駆動活性化を監視する機能細胞ベースアッセイで、ヒト、マウスおよびカニクイザルのIL−17Cの生物学的活性を阻害する能力について、精製したIL−17C特異的IgGをさらに試験した。
10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/Strep)を補ったDMEM中で、37℃、5%CO2にて、NIH3T3細胞を培養した。アッセイのために、Polyplus jet−PEIトランスフェクション剤を用いて、総量100ngのDNA(20ngのマウスIL−17RE発現構築体、50ngのNF−κBルシフェラーゼリポータ構築体、および30ngのpBluescript)により、NIH3T3細胞を懸濁液中でトランスフェクションした。要するに、5μlの150mM NaCl(ウェルあたり)中にDNAを希釈して、8μ1の150mM NaCl(ウェルあたり)中に0.2μlのjet−PEIを調製した。室温にて5分のインキュベーション後、JetPEI溶液をDNA溶液に加えて、室温にて20〜30分間、さらにインキュベートした。NIH3T3細胞を希釈して、87μlの培地中に約40,000細胞を有するようにした。細胞をDNA−JetPEI混合物(87μlの細胞および13μlのDNA−JetPEI混合物/ウェル)に加えて、最終容量を96ウェルプレート中に移した。
加湿した5%CO2インキュベータ内での37℃において一晩のインキュベーション後、培地を取り出して、5%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する90μl培地で置換した。等容量の、精製した組換えIL−17C(ヒトIL−17C(Novus #NBP1−42910)、マウスmIL−17C(R&D Systems #2306−ml−025)、またはカニクイザルIL−17C(インハウスで生産))と室温にて30分間プレインキュベートしたDPBS中に調製した抗体段階希釈液の10μlを、細胞に加えた。IL−17Cの最終濃度は、0.5ng/mlであった。プレートをCO2インキュベータ内で37℃にてインキュベートした後、100μlのSteadyLite Plus(Perkin Elmer)を加えてから、Envision(Perkin Elmer)で発光を読み出す。
2つの抗体(mab_1、mab_8)は、表5に示すように、IL−17C媒介シグナル伝達を最も効果的に阻害することが見出された。
実施例5:一次ヒトケラチン生成細胞中でのIL−17C駆動DEF4B遺伝子発現の機能試験
更なる機能実験において、ヒトケラチン生成細胞中でのIL−17C媒介ベータデフェンシン2発現を、mab_1およびmab_8の存在下および不在下で分析した。
NHEK(正常なヒト表皮ケラチン生成細胞)を、Lonzaから得て、サプリメント入りケラチン生成細胞増殖培地(KGM−Gold(商標)Bullet kit,Lonza)中で、メーカーのプロトコルに従って、培養した。継代3まで継代培養して、そこで低温保存したNHEKを解凍して直ちに、96ウェル細胞培養プレート内のKGM細胞培地中に、30,000細胞/ウェルとなるように播種した。2日後に、培地を取り出して、ヒドロコルチゾンなしのKGM−Goldに変更してから、hIL−17C(Novus #NBP1−42910)およびhTNFα(Peprotech #300−01A)を加えて、それぞれ10ng/mlの最終濃度にした。
抗体を試験するために、ヒトIL−17Cを最初に、DPBS中に調製した等容量の抗体段階希釈液と室温にて30分間プレインキュベートした。細胞を48時間培養してから、RNeasy 96 Kit(Qiagen)を用いて総RNAを抽出し、Taqman(登録商標)Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems)を用いて逆転写し、ベータデフェンシン2(DEFB4A)の発現を、定量PCR(qPCR)で判定した。要するに、Taqman(登録商標)ユニバーサルPCRマスターミックス/No AmpErase(登録商標)UNG、およびDEF4B用に予めデザインされたAssay−on−demand Gene発現プライマー/プローブセット(#Hs00823638_m1,全てApplied Biosystems)を用いて、10μl PCR反応液を調製した。ViiA7(商標)Real−Time PCR機器(Applied Biosystems)でqPCRを実行した。ハウスキーピング遺伝子、β−アクチン(Taqmanプライマーセット#4310881E)またはGAPDH(Taqmanプライマーセット#4310893E)に対して、遺伝子発現を標準化した。
双方の抗体(mab_1、mab_8)は、ベータデフェンシン2の発現を効果的に引き下げることを示し、ヒトIL−17Cの生物学的活性を中和する能力を確認した(表6)。
実施例6:一価Fabフォーマットおよび二価IgGフォーマットの親和性判定
さらに、一価Fabおよび二価IgGの親和性を、SETによって判定した。したがって、EC50判定のために、精製したFabおよびIgGを、ヒトまたはマウスのIL−17Cについて滴定した。結果により、主にクラスIII複合体を形成するIgG抗体によって発揮される、提唱された結合力効果が確認された。
溶液平衡滴定(SET)を、基本的に、文献に記載されているように実行した(Friquet et al.,(1985)J.Immunol.Meth.77:305−19)。SET法の感度および精度を向上させるために、古典的なELISAからECLベースの技術に変えた(Haenel et al.(2005)Anal Biochem.339.1:182−84)。
表6に示すように、mab_1 IgG抗体およびmab_8 IgG抗体の、判定したEC
50値は、各Fabと比較して、ヒトIL−17C、そしてまたマウスIL−17Cに対して、有意に向上した。このことは、1つのIL−17Cホモダイマーに対する二価結合に基づく高い結合力効果を示している。
実施例7:ELISAベースの交差競合アッセイ
以下の標準的な手順に従うELISAアッセイを用いて、抗IL−17C抗体または別のIL−17C結合剤の交差競合を検出することができる。
ELISAアッセイの一般原則は、ELISAプレートのウェル上への、抗IL−17C抗体のコーティングを包含する。次に、第2の、潜在的に交差競合する、抗IL−17C抗体の過剰量を、溶液中に加える(すなわち、ELISAプレートに結合しない)。続いて、限られた量のIL−17C−Fcを、当該ウェルに加える。
ウェル上にコーティングされている抗体、および溶液中の抗体は、限られた数のIL−17C分子の結合について、競合することとなる。次に、プレートを洗浄して、コーティングした抗体に結合しなかったIL−17C分子を除去し、そしてまた、第2の、溶液相の抗体、および、第2の、溶液相の抗体とIL−17Cとの間で形成されたあらゆる複合体を除去する。次に、結合したIL−17Cの量を、適切なIL−17C検出試薬を用いて測定する。したがって、IL−17Cは、タグ、例えばFc、Flagその他と融合し得、これを適切なタグ特異的剤を介して検出することができる。
コーティングした抗体と交差競合する、溶液中の抗体は、コーティングした抗体が、第2の、溶液相の抗体の不在下で結合することができるIL−17C分子の数と比較して、コーティングした抗体が結合することができるIL−17C分子の数の引下げをもたらすことができる。
このアッセイを、Ab−XおよびAb−Yと呼ばれる2つの抗体について、以下でさらにより詳細に記載する。Ab−Xを、固定する抗体とするように選択する例において、Ab−Xを、ELISAプレートのウェル上にコーティングする。その後、後に加える試薬の非特異的結合を最小限に抑えるのに適したブロッキング溶液で、プレートをブロッキングする。次に、過剰量のAb−YをELISAプレートに加えて、1ウェルあたりのAb−Y IL−17C結合部位のモル数が、ELISAプレートのコーティング中に、1ウェルあたりに用いられるAb−X IL−17C結合部位のモル数よりも少なくとも10倍高くなるようにする。IL−17Cを加えて、1ウェルあたりに加えられるIL−17Cのモル数が、各ウェルをコーティングするのに用いられるAb−X IL−17C結合部位のモル数よりも少なくとも25倍低くなるようにする。適切なインキュベーション期間の後、ELISAプレートを洗浄して、IL−17C抗原に特異的な検出試薬を加えて、コーティングされた抗IL−17C抗体(この場合、Ab−X)によって特異的に結合されるIL−17C分子の量を測定する。アッセイ用のバックグラウンドシグナルは、コーティングされた抗体(この場合、Ab−X)、第2の溶液相の抗体(この場合、Ab−Y)、バッファのみ(すなわち、IL−17Cなし)、および検出試薬が入ったウェルにおいて得られるシグナルと定義される。アッセイ用のポジティブコントロールシグナルは、コーティングされた抗体(この場合、Ab−X)、第2の溶液相の抗体バッファのみ(すなわち、第2の溶液相の抗体なし)、IL−17C検出試薬が入ったウェルにおいて得られるシグナルと定義される。ELISAアッセイは、ポジティブコントロールシグナルが、バックグラウンドシグナルの少なくとも6倍であるようにランされる必要がある。
コーティング抗体としてどの抗体を用いるべきか、そして第2の(競合体)抗体としてどれを用いるべきかの選択に由来するあらゆる人為結果(例えば、IL−17Cに対する、Ab−XとAb−Y間の、有意に異なる親和性)を回避するために、交差ブロッキングアッセイは、2つのフォーマット:1)Ab−Xが、ELISAプレート上にコーティングされる抗体であり、Ab−Yが、溶液中にある競合体抗体である、フォーマット1、および2)Ab−Yが、ELISAプレート上にコーティングされる抗体であり、Ab−Xが、溶液中にある競合体抗体である、フォーマット2でランされることを必要とする。
実施例8:水素/重水素交換質量分析を用いたエピトープ判定
HDX質量分析(HDX MSとも呼ぶ)は、タンパク質の不安定なプロトンが、水溶液中の溶媒のプロトンと交換される原則を利用するものである。反応動態は、温度、pH、各アミノ酸の酸性度、および問題のプロトンの溶媒への曝露の程度に依存する。溶媒を水素ベースの水溶液から重水素ベースの水溶液に置換することによって、重水素は、タンパク質の溶媒露出領域において迅速に組み込まれて、各水素原子を置換する。タンパク質の消化の後、質量分析を用いて、ペプチド質量を分析する。重水素の組込み直後の質量の増加を同定することができる。抗体フラグメントが結合した抗原のペプチド質量を、抗体フラグメントが結合していない抗原のペプチド質量と比較することによって、抗体のエピトープを決定することができる。
したがって、(各抗体と)複合化されていない、そして複合化された抗原サンプルを、種々のインキュベーション時間(例えば0秒、10秒、30秒、2分、10分、30分、1時間)、重水素溶媒に曝す。所定の各時点にて、サンプルを、ペプシンカラム中への注入によって迅速に消化して、特定の重水素パターンを保存するために、低pHおよび低温を用いて、重水素交換条件をクエンチする。生じた重水素化されたペプチドおよび重水素化されていないペプチドを脱塩して、逆相(RP)ナノUPLC分離を用いて分離して、高解像度Q−IMS−TOF質量スペクトロメータ中に注入する。完全な抗原サンプルのペプチド配列カバー率を最大にするように、クロマトグラフィ条件を最適化する。
抗体のエピトープを同定するために、各ペプチドの重水素の組込みの動態速度を、非結合状態および複合化状態で比較する。複合化状態での特定のペプチドの組込み速度の低下は、結合抗体による、周囲の溶媒からのペプチドの遮蔽に由来する。視覚化のために、重水素の差分取込みを、抗原の配列上にプロットする。
液体ハンドリングおよびクロマトグラフィのセットアップ
自動化水素−重水素交換質量分析(HDX MS)実験を、T.E.Wales and J.R.Engen(Mass Spectrom Rev.2006 Jan−Feb;25(1):158−70)によって記載される方法に基づいて、設計する。用いた分析装置は、HDX Manager、ナノUPLCクロマトグラフィ系、および高解像度質量スペクトロメータからなり、Waters Corporation(Milford,MA、米国)によって供給される。要するに、冷蔵サンプルコンパートメントを2℃に維持した、Watersの自動化HDX managerで、液体のハンドリング操作を実行する。HDX Managerは、PAL HTS Liquidハンドラ、2つのWaters M−クラスUPLC Pumpsystems、ならびにサンプルトラッピングおよびクロマトグラフィ分離用の冷蔵コンパートメントで構成される。液体ハンドリング系を用いて、種々の時間についてタンパク質複合体サンプルをインキュベートすることによって、重水素交換を実行する。続いて、サンプルを、6−ポート注入バルブ中に注入して、20℃のWaters Pepsinカラム上で、オンラインで消化する。タンパク質分解ペプチドを、Waters Trappingカラム上に自動的に収集し、Waters C−18逆相カラム中に注入して、分離する。脱塩して分離したタンパク質分解ペプチドを、Synapt G2si質量スペクトロメータのエレクトロスプレーイオン化(ESI)源中に直接注入する。
質量分光解析
Waters Synapt G2si(Q−IMS−TOF)質量スペクトロメータを用いて、タンパク質分解ペプチドを同定する。溶出ピークが同時の場合、イオン移動度分離を用いて、更なる解析度を獲得する。また、断片化MS/MS分析を用いて、より高い解析度を達成することができる。この場合、重水素スクランブリングによる情報の損失を回避するために、電子移動解離(ETD)を用いて、各ペプチドの断片化を初期化する。
タンパク質およびタンパク質:Fab複合体の調製
50μg IL−17Cを、1:1のモル比でFabと混合することによって、タンパク質:Fab複合体を調製して、4℃にて少なくとも2時間インキュベートする。
オンイクスチェンジ実験(on−exchange experiment)のために、IL−17CまたはIL−17C:Fab複合体を、D2Oバッファで希釈する。重水素組込みの動態を洞察するために、D2Oバッファ中でのインキュベーションの種々の時点(例えば0秒、10秒、30秒、2分、10分、30分、および1時間)にて、サンプルを分析する。還元バッファを加えることによって混合物を還元してから、クエンチバッファでクエンチする。混合してクエンチした溶液を、クロマトグラフィ系中に注入すると、LC−MSが自動的に消化し、分離し、かつ分析する。サンプルとコントロールとの間の重水素化の平均変化を、サンプルとコントロールとの重水素取込みレベル間の差異として算出する。
データ処理
WatersのソフトウェアパッケージMassLynx、HDX Manager、BiopharmaLynx、およびDynamixを用いて、質量分光計の生データを評価する。分光計のデータを記録するために、ソフトウェアMassLynxおよびHDX Managerを用いる。続いて、BiopharmaLynxを用いて、全タンパク質分解ペプチドを同定する。この情報を用いて、個々のペプチドそれぞれの重水素取込み量を、WatersのDynamixソフトウェアを用いて評価する。
重水素の取込みレベルを、重水素化サンプルと非重水素化参照ペプチドとの間の質量差異として報告する。処理したデータを手動で評価して、自動化プロセシングステップの誤りおよびエラーを訂正するように調整する。各ペプチドの全体にわたって重水素含有量を非局在化する(すなわち、観察された重水素化レベルを、そのペプチド中のアミノ酸の数で割る)ことによって、タンパク質配列の各残基に、重水素取込みレベルを割り当てる。
複数のペプチドによって残基がカバーされるならば、その残基をカバーする全てのペプチドの、標準化された重水素取込みが、ソフトウェアによって平均される。可能ならば、MS/MS分析由来の追加情報を用いて、分析の解析度を高める。
結果
抗体mab_1およびmab_8について、先に概説したように、水素−重水素交換質量分析(HDX MS)を用いて、エピトープを判定した。双方の抗体、mab_1およびmab_8について、HDX MSエピトープマッピングを介して、ヒトIL−17C上の同じ保護領域を同定した。カバーマップ(図8Aおよび図8B)は明らかに、双方の抗体について、ヒトIL−17C上の主要なエピトープとして、領域PVLRPEEVL(配列番号27、配列番号1のaa89〜97)を同定している。
また、保護が非常に弱いヒトIL−17C上の3つの更なる領域(aa98〜111(ADTHQRSISPWRY;配列番号29)、aa132〜146(CRGCIDARTGRETAAL;配列番号30)およびaa192〜197(TCVLPRSV;配列番号31)を、双方の抗体について同定した。しかしながら、保護のレベルが低いために、これらの領域は、エピトープの必須の部分ではない。
結果は、IL−17C上の領域PVLRPEEVL(配列番号27)に結合する、例示した抗体もまた、1つのIL−17Cホモダイマーへの二価結合を示すことを示している。
実施例9:SECによる更なる抗体の複合体判定
また、更なる抗体を、実施例2、7節に記載する方法に従って、結合特性について分析した。
5つの更なる抗体が、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)において、1つのIL−17Cホモダイマーへの二価結合を示す。5つの全抗体についてのSEC由来の結果を、図4〜図5に例示する。
図6に、1つのIL−17Cホモダイマーに二価結合しない2つの抗体を例示する。双方の抗体は、分子量が200kDa未満の複合体(クラスIII)を形成しないが、とりわけ、クラスIおよびクラスIIのようなより大きな複合体を形成する。